JP2001516206A - Method for selecting germ-line competent cells in chicken embryos and use of said cells in the production of chimeras - Google Patents

Method for selecting germ-line competent cells in chicken embryos and use of said cells in the production of chimeras

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JP2001516206A JP53710598A JP53710598A JP2001516206A JP 2001516206 A JP2001516206 A JP 2001516206A JP 53710598 A JP53710598 A JP 53710598A JP 53710598 A JP53710598 A JP 53710598A JP 2001516206 A JP2001516206 A JP 2001516206A
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Abstract

(57)【要約】 生殖系列コンピテント細胞により発現されたエピトープが細胞表面に結合した細胞をステージＸ（E-G & K）のニワトリ胚から分離することからなる、ステージＸ（E-G & K）のニワトリ胚で生殖系列コンピテント細胞を選択する方法が記載される。エピトープは、たとえば、ＥＭＡ−１またはＳＳＥＡ−１であってよい。選択した生殖系列コンピテント細胞を用いたキメラニワトリ胚およびキメラニワトリの製造方法も記載される。   (57) [Summary] Germline competent in stage X (EG & K) chick embryos, comprising separating cells with epitopes expressed by germline competent cells on the cell surface from stage X (EG & K) chicken embryos A method for selecting cells is described. The epitope may be, for example, EMA-1 or SSEA-1. Also described are methods for producing chimeric chicken embryos and chimeric chickens using selected germline competent cells.

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称：ニワトリ胚で生殖系列コンピテント細胞を選択する方法およびキメ ラの産生における該細胞の使用 この出願は、１９９７年２月２８日に出願した米国仮出願第６０／０３９,４ ８８号の利益を主張する。発明の技術分野 本発明は、生殖系列コンピテント細胞の選択方法および鳥類種で生殖系列キメ ラを産生する方法に関する。発明の背景 家禽産業は伝統的に、所望の特性を有するニワトリ、七面鳥その他の家禽を提 供するための交雑に依存している。各世代で起こる遺伝子再配列は、通常、親集 団中で優秀な個体の属性が小さな比率しか占めない子孫を生じる結果となる。理 想的には飼育家はゲノムの操作にさらに制御を加えることを望むであろう。 これまでに発生の胚段階でゲノムを操作して有利な特性を家禽に導入すること を試みる多くの研究がなされている。前核または新たに受精した卵子にＤＮＡを 導入する方法が用いられているが、これら方法は多くの点で不利である。各卵子 または接合子を得るために鳥類種を殺さなければならないので、これらの方法は 高価である；受精に入る余分の（supernumary）精子の雌雄前核を同定すること が困難である；外来ＤＮＡは新たに受精した接合子に注入したときに高率でゲノ ムに組み込まれることはない；そして操作した卵子をフィステル化（fistulated ）メンドリに戻したり代理卵中で維持するのが技術的に困難である。それゆえ、 もっと最近の方法では新たに生まれた卵に含まれる胞胚葉の操作を含んでいる。 ニワトリ胚の受精は、生殖器の漏斗状器官での排卵後１５分以内で起こる。胚 は卵黄の表面に位置するが、続く１８〜２３時間、卵形成が卵黄の周囲の卵白、 膜および卵殻の分泌によって完成されるように発生をする。最初の細胞分裂は、 卵が卵殻腺（shell gland）に入る受精約５時間後に起こる。続く１３〜１８時 間の間に胚の分裂は速やかに続けられ、４０,０００〜６０,０００個の細胞を含 む胚を生成する（Eyal-Giladi & Kochav，1976;Kochavら、1980;Wattら、1993） 。卵形成が完了すると、卵は放卵時に卵殻腺から放出される。放卵時、４０,０ ００〜６０,０００個の細胞を含む胚構造をステージＸ（E-G & K）の胚と称する 。 ステージＸ（E-G & K）の胚から回収した細胞の集団から１０００個の細胞ま での試料を同じ発生ステージのレシピエント胚に移すと、ドナー細胞は、得られ たキメラの体細胞組織および生殖系列の両者に寄与する（Petitteら、1990;Cars ienceら、1993，Fraserら、1993;Thoravalら、1994;Kagamiら、1995;Etchesら、 1996a;Kinoら、1997）。しかしながら、生殖系列および体細胞組織に寄与する細 胞の同定はなされていない。ステージＸ（E-G & K）の胚からの細胞を注入した 後の体細胞および生殖系列キメラの産生は、ステージＸ（E-G & K）の胚中の各 細胞が外胚葉、中胚葉、内胚葉および生殖系列に寄与しうること、それゆえステ ージＸ（E-G & K）の胚からの細胞が多能性であることを示している。しかしな がら、幾つかの間接的な証拠は、ステージＸ（E-G & K）の胚中の細胞のある種 の集団が異なる機能特性の細胞を含んでいることを示唆している。たとえば、Ｅ ＭＡ−１エピトープは生殖系列に委託された原生殖細胞にのみ発現されると考え られているが、ステージＸＩ（E-G & K）の胚中の同細胞上で発現される（Urven ら、1988;Karageneら、1995）。エピトープＳＳＥＡ−１はマウス胚の幹細胞に よって発現されるが、ステージＸIII（E-G & K）の胚中の同細胞により発現され る（PetitteおよびKaragene，1996）。ステージＸ（E-G & K）のニワトリ胚中の 形態学的に認識できない原生殖細胞の存在を支持する証拠は、ステージＸの胞胚 葉の混濁部ではなく中心板（central disc）に由来する培養中の委託原生殖細胞 の存在から推論することができる（GinsburgおよびEyal-Giladi，1987）。生殖 系列に運命付けられた細胞の存在もまた、ステージＸ（E-G & K）の胚の混濁部 よりもむしろ中心板から採取した細胞から一層頻繁に体細胞および生殖系列キメ ラが産生されるという観察から推論できる（Petitteら、1993）。ウズラでは、 ＱＨ−１エピトープはウズラで生殖系列に委託された細胞によって発現されると 考えられているが、放卵の時点で胚細胞中で発現される（Pardanaudら、1987） 。これらデータは原生殖細胞の前駆体がス テージＸ（E-G & K）の胚中に存在することを示す間接的な証拠を提供している が、（１）これら細胞が生殖系列に委託されるのか否か、（２）これら細胞が体 細胞系統および生殖細胞系統の両者に入る能力を保持しているのか否か、および （３）いかなる手段によりこれら細胞を同定できるのかは未だ明らかではない。 ニワトリなどの鳥類種のキメラの産生は、生殖系列コンピテント細胞のステー ジＸ（E-G & K）の胚中での位置が同定されるならば、および生殖系列に委託さ れた細胞の集団がステージＸ（E-G & K）の胚を含む細胞の全集団から単離でき るならば、大いに促進されるであろう。たとえば、レシピエント胚中の内生の生 殖系列コンピテント細胞を摘出して、ドナー胚のもの以外は生殖系列への寄与を 除去することが可能であろう。現在の技術を用いた場合、レシピエント胚に放射 線を照射することにより内生の寄与を低減することはできるが除去することはで きない（Carsienceら、1993）。放射線照射はレシピエント胚の増殖を約２４時 間妨害するが、ドナーに由来するキメラへの寄与は増大し続ける（Carsienceら 、1993）。このアプローチは有用であることがわかっているが、ドナーに由来す る生殖系列への寄与の程度は予測不能であり一貫性もない。生殖系列への予測可 能で一貫性のある寄与の欠如は、ドナー細胞集団が遺伝的に独特で稀なドナー細 胞を少数しか含まない場合には重要である。稀な細胞の例としては、遺伝的に修 飾した細胞（Brazolotら、1991;Fraserら、1993参照）または絶滅した低温保存 ストックに由来する細胞（Kinoら、1997参照）が挙げられる。 キメラニワトリの産生はまた、ステージＸ（E-G & K）の胚中に生殖系列コン ピテント細胞によって発現された細胞表面エピトープが同定されるならば促進さ れるであろう。これらエピトープの同定は、生殖系列コンピテント細胞の同定方 法の開発を容易にするであろう。発明の要約 本発明者は、ニワトリのステージＸ（E-G & K）の胚中の生殖系列コンピテン ト細胞により発現される細胞表面エピトープを同定した。とりわけ本発明者は、 ステージＸ（E-G & K）のニワトリ胚中およびそれに由来する培養細胞中でＥＭ Ａ−１およびＳＳＥＡ−１エピトープを同定した。これらエピトープの同定は、 インビトロで分化することなく増殖することが可能であり、かつレシピエント胚 中に注入した後に生殖系列に入る能力を保持したステージＸ（E-G & K）のニワ トリ胚中の細胞の同定および単離を容易にした。これら細胞は本明細書中では「 生殖系列コンピテント細胞」と称する。ドナー胚から単離した生殖系列コンピテ ント細胞をレシピエント胚に導入してキメラ胚を生成させた。キメラ化（chimer ism）の程度は、ドナー細胞を、レシピエント胚の中心領域から細胞を摘出し、 ドナー細胞の注入前に放射線照射したレシピエント胚に注入した場合に増大した 。 本発明は、概して、ステージＸ（E-G & K）のニワトリ胚中の生殖系列コンピ テント細胞を選択する方法であって、ステージＸ（E-G & K）のニワトリ胚から 生殖系列コンピテント細胞によって発現されたエピトープが細胞表面に結合した 細胞を分離することを含む方法に関する。とりわけ、生殖系列コンピテント細胞 は、ステージＸ（E-G & K）のニワトリ胚から得た細胞を、生殖系列コンピテン ト細胞により発現されたエピトープに直接または間接的に結合する物質と反応さ せることにより単離できる。好ましい態様において、生殖系列コンピテント細胞 により発現されるエピトープはＥＭＡ−１またはＳＳＥＡ−１エピトープである 。 本発明はまた、ニワトリの生殖系列コンピテント細胞に富む細胞調製物の製造 方法であって、（ａ）ステージＸ（E-G & K）のニワトリ胚からの細胞を用意し 、ついで（ｂ）生殖系列コンピテント細胞により発現されたエピトープが細胞表 面に結合した細胞を選択することを含む方法にも関する。 本発明の方法を用いて同定および単離した生殖系列コンピテント細胞は、該細 胞中に組換え発現ベクターを導入することにより遺伝的に修飾することができる 。それゆえ、本発明の方法はさらに、外来遺伝子および該遺伝子の転写および翻 訳に必要な要素を含む組換え発現ベクターで生殖系列コンピテント細胞をトラン スフェクトすることを含む。 本発明はさらに、本発明の方法を用いて得られた生殖系列コンピテント細胞ま たは遺伝的に修飾した生殖系列細胞を含む細胞培養液に関する。 本発明はさらに、生殖系列コンピテント細胞を含む胚中の領域を同定する方法 であって、 （ａ）該胚を、生殖系列コンピテント細胞により発現されたエピトープに直接ま たは間接的に結合する物質であって検出可能なマーカーで標識したもので処理し 、ついで （ｂ）該検出可能なマーカーにより生成した検出可能な変化を検出して該胚中の 生殖系列コンピテント細胞を含む領域を同定する ことを含む方法に関する。 好ましい態様において、生殖系列コンピテント細胞によって発現されるエピト ープはＥＭＡ−１またはＳＳＥＡ−１エピトープであり、該エピトープに結合す る物質は抗体である。 本発明に従って同定される生殖系列細胞は、キメラニワトリ胚を生成するのに 用いることができる。それゆえ、本発明は、（ａ）ステージＸ（E-G & K）のニ ワトリ胚から生殖系列コンピテント細胞により発現されたエピトープが細胞表面 に結合した細胞を単離し、（ｂ）場合により、該細胞を、外来遺伝子および該遺 伝子の転写および翻訳に必要な要素を含む組換え発現ベクターでトランスフェク トし、（ｃ）該細胞を、胚の中心板部分を除去したレシピエントのステージＸ（ E-G & K）のニワトリ胚中に導入し、ついで（ｄ）該レシピエント胚をインキュ ベートしてキメラ胚を生成することを含む、キメラニワトリ胚の製造方法を提供 する。キメラ胚は、キメラニワトリを生成する時期まで増殖させてよい。 本発明はさらに、本発明の方法によって生成したキメラ胚およびキメラニワト リを提供する。 さらに、本発明は、本発明の方法を行うためのキットに関する。 本発明の他の目的、特徴および利点は以下の記載から明らかとなるであろう。 しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は本発明の好ましい態様を示すも のではあるが説明の例示のためにのみ用いたものであることが理解されなければ ならない。なぜなら、この詳細な説明から当業者には本発明の精神および範囲内 での種々の変更および改変が明らかであるからである。図面の簡単な説明 つぎに、本発明が図面に関連して記載されるであろう。これら図面において： 図１は、ステージＸの胚の構造を該胚の卵黄表面に垂直な断面図として示す； 図２は、ステージＸの胞胚葉細胞上のＥＭＡ−１エピトープの発現を示す位相 差照明（illumination）顕微鏡写真を示す； 図３は、図２の蛍光顕微鏡写真を示す； 図４は、ステージＸの胞胚葉細胞上のＳＳＥＡ−１エピトープの発現を示す位 相差照明顕微鏡写真を示す； 図５は、図４の蛍光顕微鏡写真を示す； 図６は、ステージＸの全マウントのＳＳＥＡ−１エピトープの発現を示す位相 差照明顕微鏡写真を示す； 図７は、図６の蛍光顕微鏡写真を示す； 図８は、ステージＸの胞胚葉細胞上のＨＮＫ−１／ＮＣ−１発現を示す位相差 照明顕微鏡写真を示す；および 図９は、図８の蛍光顕微鏡写真を示す。発明の簡単な説明 １．生殖系列コンピテント細胞の選択 上記に記載したように、本発明は、ステージＸ（E-G & K）のニワトリ胚から 生殖系列コンピテント細胞によって発現されたエピトープが細胞表面に結合した 細胞を分離することを含む、ステージＸ（E-G & K）のニワトリ胚中の生殖系列 コンピテント細胞を選択する方法に関する。本発明はまた、ニワトリの生殖系列 コンピテント細胞に富む細胞調製物の製造方法であって、（ａ）ステージＸ（E- G & K）のニワトリ胚からの細胞を用意し、ついで（ｂ）生殖系列コンピテント 細胞により発現されたエピトープが細胞表面に結合した細胞を選択することを含 む方法にも関する。好ましい態様において、生殖系列コンピテント細胞によって 発現されるエピトープは、ＥＭＡ−１またはＳＳＥＡ−１エピトープである。 ステージＸ（E-G & K）の胚とは、放卵時に卵殻腺から放出される胚であり、 ４０,０００〜６０,０００個の細胞を含むことを特徴とする（Eyal-Giladi & Ko chav，1976;Kochavら、1980;Wattら、1993）。ステージＸ（E-G & K）の胚の構 造は図１に示してある。形態学的にみてステージＸ（E-G & K）の胚中の細胞は いずれも分化細胞の特徴を示していない。中心板は透明部および境界領域を含み 、混濁部により囲まれている。透明部は胚芽下液（subgerminal fluid）層の上 部に位置し、胚芽下液は胚を下部卵黄から隔てている。混濁部は周囲の卵 黄と直接接している。 ステージＸ（E-G & K）の胚は常法を用いて卵から単離できる。たとえば、Car sienceら(1993)により記載されているように、卵黄から卵白を分離することによ り新たに産み落とされてインキュベートしていない卵から胚を単離できる。 生殖系列コンピテント細胞の選択に先立ち、ステージＸ（E-G & K）のニワト リ胚からの細胞を常法を用いて胚から解離させるのが好ましい。たとえば、トリ プシンなどの細胞外マトリックスを消化する物質で処理することにより、胞胚葉 細胞を胚から浮遊させる。 生殖系列コンピテント細胞によって発現されたエピトープが細胞表面に結合し た細胞は、該エピトープに直接または間接的に結合する物質を用いて選択できる 。本発明の一つの態様において、該エピトープはＥＭＡ−１またはＳＳＥＡ−１ であり、該物質はＥＭＡ−１またはＳＳＥＡ−１エピトープに特異的な抗体であ る。それゆえ、本発明は、ステージＸ（E-G & K）のニワトリ胚中の生殖系列コ ンピテント細胞を選択する方法であって、ステージＸ（E-G & K）のニワトリ胚 から得られた細胞を生殖系列コンピテント細胞によって発現されたエピトープに 特異的な１またはそれ以上の抗体と反応させ、該抗体と該エピトープが細胞表面 に結合した生殖系列コンピテント細胞との間でコンジュゲートを形成させ、つい で該コンジュゲートを単離して生殖系列コンピテント細胞を含む細胞調製物を得 ることを含む方法を提供する。この方法は２以上の抗体、たとえば、ＥＭＡ−１ に対する一つの抗体およびＳＳＥＡ−１に対する一つの抗体を用いることができ る。 「抗体」なる語は、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を含む。 抗体の調製には通常の方法を用いることができる。たとえば、ＥＭＡ−１および ＳＳＥＡ−１エピトープを用いることにより、ポリクローナル抗血清またはモノ クローナル抗体を標準法を用いて製造できる。哺乳動物（たとえば、マウス、ハ ムスター、またはラット）を、哺乳動物において抗体応答を惹起するＥＭＡ−１ またはＳＳＥＡ−１エピトープの免疫原形態で免疫することができる。エピトー プに免疫原性を付与する技術としては、担体へ結合させることまたは当該技術分 野で公知の他の技術が挙げられる。免疫の進行は血漿または血清における抗体の 力価を検出することによりモニターできる。標準ＥＬＩＳＡまたは他のイムノア ッセイ法を抗原としての免疫原とともに用いて抗体レベルを評価することができ る。免疫後、抗血清が得られ、所望ならポリクローナル抗体を血清から単離する 。 モノクローナル抗体を産生するには、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫動物か ら回収し、ミエローマ細胞と標準体細胞融合法により融合させてこれら細胞を不 死化させ、ハイブリドーマ細胞を得る。かかる技術は当該技術分野でよく知られ ている［たとえば、ハイブリドーマ法は、最初にKohlerおよびMilstein（Nature 256，495-497(1975)）によって開発された］。コンビナトリアル抗体ライブラ リー（combinatorial antibody libraries）のスクリーニングなどの他の技術を 用いることもできる［Huseら、Science 246，1275(1989)］。上記エピトープに 特異的に反応する抗体の産生についてハイブリドーマ細胞を免疫化学的にスクリ ーニングすることができ、これらモノクローナル抗体を単離することができる。 「抗体」なる語はまた、生殖系列コンピテント細胞により発現されるエピトー プに特異的に反応する抗体フラグメントをも含む。抗体は通常の方法を用いてフ ラグメント化することができ、これらフラグメントを上記有用性についてスクリ ーニングする。たとえば、Ｆ(ab')2フラグメントは抗体をペプシンで処理するこ とにより得られる。得られたＦ(ab')2フラグメントは、ジスルフィド結合を還元 処理してＦab'フラグメントを得ることができる。 キメラ抗体誘導体、すなわち、非鳥類可変領域と鳥類定常領域とを組み合わせ た抗体分子もまた本発明の範囲に含まれる。キメラ抗体は、たとえば、マウス、 ラットその他の種の抗体からの抗原結合ドメインを鳥類の定常領域とともに含む 。生殖系列コンピテント細胞によって発現されるエピトープを認識する免疫グロ ブリン可変領域を含むキメラ抗体を製造するため標準法を用いることができる( たとえば、Morrisonら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．81，6851(1985);Taked aら、Nature 314，452(1985)，Cabillyら、米国特許第４,８１６,５６７号;Boss ら、米国特許第４,８１６,３９７号;Tanaguchiら、ヨーロッパ特許公開ＥＰ１７ １４９６；ヨーロッパ特許公開第０１７３４９４号、英国特許ＧＢ２１７７０９ ６Ｂを参照)。 同様に、組換えＤＮＡ技術を用いて特異的に結合する抗体をコードする遺伝子 の可変領域を導入することにより結合性のパートナーを構築することができる。 一つの態様として、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからの 可変領域をコードする遺伝子を、該可変領域に対するヌクレオチドプライマーを 用いて増幅させる。これらプライマーは当業者により合成することもできるし、 または市販のものを購入することもできる。これらプライマーは重鎖または軽鎖 の可変領域を増幅するのに用いることができ、ついでこれら可変領域をそれぞれ ImmunoZAPTM HまたはImmunoZAPTM L（Stratacyte）などのベクター中に挿入する ことができる。ついで、これらベクターを発現のために大腸菌中に導入する。こ れら方法を用い、ＶHおよびＶLドメインの融合を含む一本鎖タンパク質を大量に 産生できる(Birdら、Science 242:423-426，1988を参照)。 エピトープに対する抗体はまた、市販のものから得ることもできる。たとえば 、ＳＳＥＡ−１およびＥＭＡ−１に対するモノクローナル抗体がImmunotech，ウ エストブルック、メイン、米国から入手できる。 抗体は、種々の酵素、蛍光物質、ルミネセンス物質および放射性物質を含む検 出可能なマーカーで標識できる。適当な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキ シダーゼ、ビオチン、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、または アセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適当な蛍光物質の例としては、ウンベ リフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン 、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライドまたはフィ コエリトリンが挙げられ、適当なルミネセンス物質の例としてはルミノールが挙 げられ、適当な放射性物質の例としては、Ｓ−３５、Ｃｕ−６４、Ｇａ−６７、 Ｚｒ−８９、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０５、Ｐｄ−１０９、Ｉｎ１ １１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ１３１、Ｒｅ−１８６、Ａｕ−１９８、Ａｕ −１９９、Ｐｂ−２０３、Ａｔ−２１１、Ｐｂ−２１２およびＢｉ−２１２が挙 げられる。抗体はまた、リガンド結合ペアの一方のパートナーで標識またはコン ジュゲートすることもできる。代表的な例としては、アビジン−ビオチンおよび リボフラビン−リボフラビン結合タンパク質が挙げられる。上記代表的な標識で 抗体をコンジュゲートまたは標識する方法は、常法を用いて容易に行うことがで きる。 抗体は本明細書に記載する検出可能なマーカーで標識することもできるし、ま たは間接法を用いることもできる。間接法では、エピトープに対して反応性の抗 体に対して特異性を有する第二の抗体を導入することにより、一次抗原−抗体反 応を増幅させる。一例として、ＥＭＡ−１またはＳＳＥＡ−１エピトープに対す る特異性を有する抗体がマウスＩｇＧ抗体であれば、第二の抗体は本明細書に記 載する検出可能なマーカーで標識したラットまたはウサギ抗マウスガンマ−グロ ブリンであってよい。 抗体は、アガロース、セルロース、デキストラン、セファデックス、セファロ ース、カルボキシメチルセルロース、ポリスチレン、濾紙、イオン交換樹脂、プ ラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ガラスビーズ、ポリアミン−メチ ルビニル−エーテル−マレイン酸コポリマー、アミノ酸コポリマー、エチレン− マレイン酸コポリマー、ナイロン、絹などの担体に結合させてよい。担体は、た とえば、チューブ、テストプレート、ビーズ、ディスク、球状などの形状であっ てよい。 抗体はマトリックスにコンジュゲートすることができる。マトリックスの例と しては、直接的な磁性分離を可能にするマグネチックビーズ（Kernshead 1992） 、プレートなどの平たい表面（panning surfaces）（Lebkowski，J.S．ら(1994) ）、密度遠心分離のための濃密な粒子（Van Vlasselaer，P.，Density Adjusted Cell Sorting(DACS)，A Novel Method to Remove Tumor Cells from Periphera l Blood and Bone Marrow Stem Cell Transplants（1995）3rd International S ymposium on Recent Advances in Hematopoietic Stem Cell Transplantation-C linical Progress，New Technologies and Gene Therapy，サンジエゴ、カリフ ォルニア）、吸着カラム（Berensonら、1986，Journal of Immunological Metho ds 91:11-19）、および吸着膜（Nortonら、1994）が挙げられる。これら抗体は また、補体や細胞毒などの細胞障害剤に結合させて標的生殖系列コンピテント細 胞を溶解または殺傷することもできる。 抗体はマトリックスに直接結合させることができる。たとえば、臭化シアンを 用い、抗体を磁性粒子の表面に化学的に結合させることができる。これら磁性粒 子を生殖系列コンピテント細胞によって発現されたエピトープが細胞表面に結合 した生殖系列コンピテント細胞を含む試料と反応させた場合には、抗体が結合し た磁性粒子と生殖系列コンピテント細胞との間でコンジュゲートが生成する。 別法として、これら抗体を、抗体を用いてマトリックスに間接的にコンジュゲ ートすることができる。たとえば、ＳＳＥＡ−１またはＭＥＡ−１エピトープに 対する抗体に対する特異性を有する第二の抗体でマトリックスをコーティングで きる。一例として、ＳＳＥＡ−１またはＭＥＡ−１エピトープに対する抗体がマ ウスＩｇＧ抗体であれば、第二の抗体はウサギ抗マウスＩｇＧであってよい。こ れら抗体はまた、マトリックスに間接的にコンジュゲートされた抗体試薬中に導 入することもできる。抗体試薬の例としては、２特異的抗体、四量体抗体複合体 、およびビオチン化抗体が挙げられる。 ２特異的抗体は、生殖系列コンピテント細胞によって発現されたエピトープに 特異的な抗体の可変領域、およびマトリックスの表面上の少なくとも一つの抗原 に特異的な可変領域を含む。２特異的抗体は、ハイブリッドハイブリドーマを生 成することにより調製できる。ハイブリッドハイブリドーマは、Staerz & Bevan （1986，PNAS（USA）83:1453）およびStaerz & Bevan（1986，Immunology Today ，7:241）に開示されているものなどの当該技術分野で公知の手順を用いて調製 できる。２特異的抗体はまた、Staerzら（1985，Nature，314:628）およびPerez ら（1985 Nature 316:354）によって記載されたものなどの手順を用いた化学的 手段により、または組換え免疫グロブリン遺伝子構築物の発現により構築できる 。 四量体免疫複合体は、マトリックスの表面上の少なくとも一つの抗原に結合し 得る第一のモノクローナル抗体と、生殖系列コンピテント細胞によって発現され たエピトープに特異的な第二のモノクローナル抗体とを混合することにより調製 できる。これら第一のモノクローナル抗体および第二のモノクローナル抗体は、 第一の動物種からのものである。これら第一のモノクローナル抗体および第二の モノクローナル抗体を、該第一の動物種の抗体のＦｃフラグメントに対して向け られた第二の動物種のモノクローナル抗体のほぼ等モル量と反応させる。第一の モノクローナル抗体および第二のモノクローナル抗体はまた、第一の動物種の抗 体のＦｃフラグメントに対して向けられた第二の動物種のモノクローナル抗体の Ｆ(ab')2フラグメントのほぼ等モル量と反応させてもよい（Lansdorpの米国特許 第４,８６８,１０９号；四量体抗体複合体およびその製造法の記載について参照 のため本明細書中に引用する）。 抗体はビオチン化することができ、（ストレプト）アビジンで標識したマトリ ックスに間接的にコンジュゲートできる。たとえば、ビオチン化抗体を、（スト レプト）アビジンで共有結合により標識した磁性鉄−デキストラン粒子と組み合 わせて用いることができる(Miltenyi，S．ら、Cytometry 11:231，1990)。抗体 とマトリックスとを特異的に架橋するための多くの他の間接法もまた当業者には 明らかであろう。 本発明の好ましい態様において、細胞−抗体コンジュゲートを磁性粒子を用い た磁性分離により分離する。適当な磁性粒子としては、フェロ流体（ferrofluid s）中の粒子および他のコロイド状磁性溶液が挙げられる。フェロ流体の例およ びその製造法は、Kemshead J．T．(1992)のHematotherapy，1:35-44，３６〜３ ９頁、およびZioloら、Science（1994）257:219（これら文献を参照のため本明 細書中に引用する）に記載されている。デキストラン−鉄複合体のコロイド粒子 は本発明の方法に使用できる（Molday，R.S.およびMcKenzie，L.L．FEBS Lett． 170:232，1984;Miltenyiら、Cytometry 11:231，1990;およびMolday，R.S．およ びMacKenzie，D.，J．Immunol．Methods 52:353，1982;Thomasら、J．Hematothe r．2:297(1993);および米国特許第４,４５２,７３３号（これら文献はすべて参 照のため本明細書中に引用する）を参照）。磁性粒子はまた、Mitenyi Biotech から入手可能なマイクロビーズなどの市販のものから入手できる。 本発明の磁性分離法に従い、回収すべき生殖系列コンピテント細胞を含む試料 を上記抗体試薬の一つと反応させ、該抗体が試料中に存在する標的生殖系列コン ピテント細胞に結合して標的細胞と抗体試薬との間で細胞コンジュゲートが形成 されるようにする。反応条件は、標的細胞と抗体試薬との間で所望の結合レベル が得られるように選択する。抗体試薬の濃度は、試料中の標的細胞の推定濃度に 依存して選択する。っいで、磁性粒子を加え、混合物を選択された温度にてイン キュベートする。ついで、試料を、磁性フィルター装置で分離する準備をする。 この磁性分離手順は、Miltenyiら、1990に記載された磁性フィルターおよび方法 を用いて行うのが好ましい。Miltenyi Biotechから入手可能なMiniMACSシステム などの市販の磁性分離システムもまた、本発明の磁性分離法に用いることができ る。 磁性的に標識した細胞コンジュゲートを含む試料を、磁場の存在下、磁性フィ ルターに通す。磁性的に標識したコンジュゲートは高勾配磁性カラム中に保持さ れ、磁性的に標識されていない物質は緩衝液で洗浄後にカラムから流れ去る。 生殖系列コンピテント細胞により発現されたエピトープに対する抗体はまた、 胚中の生殖系列コンピテント細胞を検出および定量するために用いることもでき る。とりわけ、これら抗体を免疫組織化学的分析に用いて、生殖系列コンピテン ト細胞を胚中の特定の領域として位置決定する（localise）ことができる。 光学および電子顕微鏡を用いた抗原の位置決定のために当該技術分野で公知の 細胞化学的方法を、生殖系列コンピテント細胞の検出のために用いることができ る。一般に、検出可能なマーカーで標識した抗体を用い、該検出可能なマーカー の存在に基づいて胚中の生殖系列コンピテント細胞の位置決定を行うことができ る。また、抗体をフェリチンやコロイド金などの高電子密度物質に結合させるこ とができ、該物質は電子顕微鏡により容易に視覚化できる。 本発明の方法を適用するのに適した試薬は、必要な物質を適当な容器中にパッ ケージングした便利なキットにパッケージングできる。そのようなキットは、本 明細書に記載した方法により試料中の生殖系列コンピテント細胞を選択するのに 必要なすべての試薬、および場合により本発明の方法を行うのに有用な適当な支 持体を含んでいてよい。 II．生殖系列コンピテント細胞の修飾 本発明の方法に従ってステージＸ（E-G & K）の胚から単離した生殖系列コン ピテント細胞は、細胞中へのＤＮＡのランダムなまたは部位特異的な組み込みに より遺伝的に修飾することができる。それゆえ、本発明は、外来遺伝子および該 遺伝子の転写および翻訳に必要な要素を含む組換え発現ベクターを導入すること を含む、本発明の方法によって単離した生殖系列コンピテント細胞の遺伝的修飾 に関する。生殖系列コンピテント細胞中に導入することができる外来遺伝子の例 としては、血管作用性腸管ペプチド、成長ホルモン、インシュリン様成長因子Ｉ 、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＧＨ受容体、プロラクチン、性腺刺激ホルモン、性腺刺激 ホルモン放出ホルモンが挙げられる（Etchesら、1993およびその引用文献）。こ れら遺伝子の転写および翻訳に必要な要素の選択は、当業者により容易に行われ る。必要な制御配列は、天然の遺伝子および／またはそのフランキング領域によ り提供されてよい。 生殖系列コンピテント細胞中へのＤＮＡの導入は、レトロウイルスベクターを 用いて行うことができる（Shuman，Experientia，47:897-904，1991;Petropoulo sら、Journal of Virology，66:3391-3397，1992;Salterら、Manipulation of t he Avian Genome，pp.135-150，1993）。相同組換えによりゲノム内の特定の組 み込みを促進すべく設計されたものを含む大きなＤＮＡ配列（２０００塩基対を 超えるもの）は、リポソーム媒体遺伝子導入により導入できる。 遺伝的に修飾した生殖系列コンピテント細胞は、インビトロで培養して遺伝的 に修飾した生殖系列コンピテント細胞の集団を与えることができる。ステージＸ の胚からの未知の細胞型の細胞増殖を支持するために設計した培養システム（Pa inら、1996参照）を、トランスフェクトした（およびトランスフェクトしていな い）生殖系列コンピテント細胞の増殖を支持するために用いることができる。イ ンビトロ培養法はまた、トランスフェクトした生殖系列コンピテント細胞の選択 を容易にするために用いることもできる。たとえば、マウスにおいてトランスフ ェクトしていない胚幹細胞からトランスフェクトした細胞を選択するのに用いた 方法（Mansourら、Nature，366:248-252，1988）を本発明において用いることが できる。 単一の生殖系列コンピテント細胞を常法を用いてクローニングし、遺伝的に修 飾したドナー細胞の均一な集団を与えることができる。 III．生殖系列キメラの産生 本発明の方法を用いて選択した生殖系列コンピテント細胞は、キメラニワトリ 胚を産生するために用いることができる。キメラニワトリ胚を産生するには、本 明細書に記載した方法を用い、ドナーのステージＸ（E-G & K）のニワトリ胚か ら生殖系列コンピテント細胞によって発現されたエピトープが細胞表面に結合し た生殖系列コンピテント細胞を単離する。好ましい態様において、該エピトープ はＥＭＡ−１またはＳＳＥＡ−１である。単離した生殖系列コンピテント細胞を 、本明細書に記載した外来遺伝子および該遺伝子の転写および翻訳に必要な要素 を含む組換え発現ベクターでトランスフェクトしてよい。 これら生殖系列コンピテント細胞を、中心板部分を除去したレシピエントのス テージＸ（E-G & K）のニワトリ胚中に導入する。細胞の導入は、レシピエント 胚の胚芽下腔中への注入などの従来法を用いて行う。レシピエント胚の中心板部 分の除去は、物理的方法を用いるか、または毒素または補体にコンジュゲートし たエピトープに対する抗体を用いてレシピエント生殖系列コンピテント細胞を殺 すことにより行う。中心板部分の除去に先立って、レシピエント胚を任意に放射 線に暴露してよい（たとえば、60Ｃｏ源からの４９０〜６８０ラドのγ放射線照 射）。ドナー生殖系列コンピテント細胞をレシピエント胚中に導入後、レシピエ ント胚をインキュベートしてキメラ胚を産生させる。 ドナー生殖系列コンピテント細胞を含むレシピエント胚は、好ましくは発生の ４日目に代理培養系に移して、配偶子合体から餌化に到るまでのニワトリ胚の発 生を支持する適当な環境を付与するようにする。適当な代理培養系は、Etchesら (1996b)に記載されている。 本明細書に記載する方法は、ドナー細胞系からレシピエントへの伝達率を改善 するものであり、より多数のキメラを提供する。このことは、純系を遺伝的に優 秀な系で置き換える商業的な育種プログラムを容易にするものである。 本発明の方法は、七面鳥、ダチョウ、ウズラ、キジ、アヒル、およびガチョウ を含む他の鳥類種にも適用できることが理解されるであろう。 VI．生殖系列特異的分子の同定 本発明は、生殖系列細胞に結合した分子（遺伝子およびタンパク質を含む）の 単離および同定を提供する。そのような生殖系列特異的分子は、本発明の方法を 用いて細胞の集団から生殖系列細胞を同定および分離するためのマーカーとして 用いることができる。 生殖系列特異的分子は、当該技術分野で公知の種々の技術を用いて単離するこ とができる。生殖系列特異的分子の検出方法には、生殖系列細胞を制限エンドヌ クレアーゼで消化した後に得られた断片の分析、オリゴヌクレオチドのディファ レンシャル（differential）ハイブリダイゼーション、直接ＰＣＲシークエンシ ング、オリゴヌクレオチドのディファレンシャルハイブリダイゼーションおよび 変性剤濃度勾配ゲル電気泳動が含まれる。 一つの例として、生殖系列特異的分子はオリゴヌクレオチドのディファレンシ ャルハイブリダイゼーションにより検出することができる。とりわけ、生殖系列 細胞を本発明の方法を用いて単離することができ、該細胞から伝令ＲＮＡを得る ことができる。ｃＤＮＡライブラリーを、対照細胞のプールから調製したｍＲＮ Ａから構築することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、標準プロトコールに従 ってOligo-dTプライマーおよび逆転写酵素を用いて合成できる。たとえば、ｃＤ ＮＡをpSPORT R(Gibco BRL)などのプラスミドベクター中にクローニングできる 。ファージ呈示ランダムライブラリーなどの市販のｃＤＮＡライブラリーを用い ることもできる。生殖系列細胞のｍＲＮＡを用い、生殖系列細胞からのｍＲＮＡ には特異的にハイブリダイズするが対照細胞から単離したｍＲＮＡにはハイブリ ダイズしない配列についてライブラリーをプローブすることができる。 本発明の方法に用いることのできるハイブリダイゼーション条件は当該技術分 野で知られており、たとえば、Sambrook J，Fritch EF，Maniatis TのMolecular Cloning，A Laboratory Manual，1989．(Nolan C,編)，コールド・スプリング ・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨー ク（参照のため本明細書中に引用する）に記載されている。ハイブリダイゼーシ ョン生成物は当該技術分野で公知の技術を用いてアッセイすることができる。 他の例として、サブトラクティブハイブリダイゼーションを用いることもでき る。サブトラクティブハイブリダイゼーションは、生殖系列コンピテント細胞に 特異に発現される遺伝子を同定し富ませることができる。サブトラクティブハイ ブリダイゼーションは、本発明の生殖系列コンピテント細胞とステージＸの胚中 に存在する他の細胞などのように、密接に関連した２つのＤＮＡ（またはＲＮＡ ）集団の間でハイブリダイズさせることにより行うことができる。サブトラク ティブハイブリダイゼーションにより、両細胞型に共通するハイブリダイズした 配列を除去することができる。引き続き、ハイブリダイズしなかった配列を差し 引き（subtracted）ｃＤＮＡライブラリーとして保存することができる。当該技 術分野で知られたサブトラクティブハイブリダイゼーション法、たとえば、Chri stian E．GruberおよびWu-BoLi，“An Improved Subtractive Hybridization Me thod using Phagemid Vectors”，Molecular Biology Current Innovations and Future Trends Part 1，A.M．Griffen H.G．およびGriffen(編)，1995（参照の ため本明細書中に引用する）に記載のものなどを用いることができる。 他の例において、生殖系列特異的分子は変性剤濃度勾配ゲルを用いて検出する ことができる。生殖系列特異的細胞の選択したヌクレオチドセグメントに関連す る制限エンドヌクレアーゼ断片またはＰＣＲ断片は、変性剤の勾配（上昇する温 度、上昇するホルムアミド、尿素など）を含むポリアクリルアミドゲル上で分離 することができる。生殖系列特異的な細胞断片および対照の断片はゲル中の異な る位置で変性し、その結果、移動距離に差異を生ずるであろう。分離した断片は 、制限断片についてはＤＮＡハイブリダイゼーションにより、またはＰＣＲ断片 については直接ＤＮＡ染色により、検出することができる。 従って、本発明は、上記いずれかの方法を用いて生殖系列特異的分子を検出す る方法を提供する。 生殖系列特異的分子の発現を制御するプロモーターなどの制御配列もまた、単 離することができる。 本発明の生殖系列特異的分子の同定はまた、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）などにおいて本発明の核酸分子を増幅するためのプライマーとして用い ることのできるヌクレオチド配列を同定および単離、または合成することをも可 能とする。 従って、本発明は、本発明の生殖系列特異的核酸分子の存在を決定する方法で あって、試料を、該核酸分子または前もって決定されたそのオリゴヌクレオチド 断片をポリメラーゼ連鎖反応で増幅しうるプライマーで処理して、増幅配列の生 成を可能とする条件下で増幅配列を生成させ、ついで増幅配列についてアッセイ することを含む方法を包含する。 ポリメラーゼ連鎖反応とは、Innisら、Academic Press，1990、Mullisらの米 国特許第４,８６３,１９５号およびMullisの米国特許第４,６８３,２０２号（こ れら文献をすべて参照のため本明細書中に引用する）に一般に記載されているよ うに、標的核酸配列を増幅する方法をいう。核酸鋳型の増幅の条件は、M.A．Inn isおよびD.H．GelfandのPCR Protocols，A Guide to Methods and Applications ，M.A．Innis，D.H．Gelfand，J.J．SninskyおよびT.J．White編、３〜１２頁、 アカデミックプレス1989（参照のため本明細書中に引用する）に記載されている 。 増幅生成物は、当該技術分野で公知の技術を用い、それぞれのサイズに基づい て単離および識別できる。たとえば、増幅後、臭化エチジウムで染色した後に紫 外（ＵＷ）光の照射下、ＤＮＡ試料をアガロースゲル上で分離および可視化する ことができる。ＤＮＡは所望のレベルまで増幅することができ、さらに伸長反応 を行って放射性標識またはビオチン標識したヌクレオシド三リン酸などの検出可 能なマーカーを有するヌクレオチド誘導体を導入することができる。プライマー もまた上記検出可能なマーカーで標識することができる。検出可能なマーカーは 、制限および電気泳動分離または当該技術分野で知られた他の方法により分析す ることができる。 ＰＣＲを用いた本発明の方法において採用できる条件は、試料中のＤＮＡおよ び適当な相補的ハイブリダイゼーションプライマーの存在下でハイブリダイゼー ションおよび増幅反応が進行することを可能にするようなものである。ポリメラ ーゼ連鎖反応に適した条件は当該技術分野で一般に知られている。たとえば、M. A．InnisおよびD.H．GelfandのPCR Protocols，A Guide to Methods and Applic ations，M.A．Innis，D.H．Gelfand，J.J．SninskyおよびT.J．White編、３〜１ ２頁、アカデミックプレス1989（参照のため本明細書中に引用する）を参照のこ と。好ましくは、ＰＣＲには、好熱菌のテルムス・アクアティクス（Thermus aq uatics）から得られたポリメラーゼ（Taqポリメラーゼ、GeneAmp Kit，Perkin E lmer Cetus）または他の熱安定性ポリメラーゼを用いてＤＮＡ鋳型鎖を増幅させ ることができる。たとえば、本発明の核酸を発現するこ とがわかっている細胞型または組織からＲＮＡを単離し、本明細書に記載したハ イブリダイゼーション（たとえば、標準ノーザン分析）またはＰＣＲ法を用いて 試験することができる。これら技術は、正常または異常な別のスプライシングに よる転写サイズの差異を検出するのに用いることができる。 単離した分子は、生殖系列コンピテント細胞を選択するための本発明の方法に 用いることのできる抗体を調製するのに用いることができる。抗体の調製には、 上記に詳細に記載した通常の方法を用いることができる。 以下の非制限的実施例は本発明を説明するものである。 実施例 実施例に記載した試験において以下の材料および方法を用いた：ステージＸの胚からの生殖系列コンピテント細胞の摘出 ドナー胚は、Ｉ遺伝子座がホモ接合性の劣性（ii）であるバード（Barred）プ リマスロックから得た。レシピエント胚は、Ｉ遺伝子座がホモ接合性の優性（II ）であるホワイトレグホンから得た。バードプリマスロックおよびホワイトレグ ホンの綿毛の色は、それぞれ黒色および黄色である。これら表現型は、ヒナが孵 化したときに羽毛の色でキメラ化（chimerism）を決定するのを容易にする：黒 色の綿毛を有するヒナは体細胞キメラと称され、黄色の綿毛を有するヒナは推定 キメラと称した。生殖系列へのドナー由来細胞およびレシピエント由来細胞の寄 与は、キメラをバードプリマスロックと交配させることによって評価し、生殖系 列のキメラ化の程度は、ホワイトレグホンである子孫の数に対するバードロック である子孫の数の比として表した。 ドナー細胞を、Carsienceら(1993)によって記載されているように、新たに産 み落とされインキュベートしていない卵から単離したステージＸの胞胚葉（Eyal -GiladiおよびKochav，1976）から得た。簡単に説明すると、卵白を卵黄から分 離し、胚を単離し、細胞外マトリックスをトリプシンで消化することにより胞胚 葉細胞を浮遊させた。ついで、細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有す るＤＭＥＭ（ダルベッコ変性イーグル培地）で洗浄および再浮遊させた。２〜５ μｌの培地中の１００〜５００個の細胞をレシピエント胚の胚芽下腔に注入した 。 レシピエント胚は、中心板部分を除去するかまたは胚の外縁（lateral edge） 部分を除去することにより物理的に傷つけたが、対照の胚は完全なままであった 。物理的に傷つけた胚の約半分とすべての対照胚とを放卵後１時間以内でかつ物 理的に傷つける２時間前に60Ｃｏ源からの４９０〜６８０ラドのｇ放射線照射に 暴露した。 ドナー細胞を、放射線照射したが物理的に傷つけなかったレシピエント胚のす べて、および放射線照射に暴露したかまたは暴露していない物理的に傷つけた胚 の約半分に注入した。注入後、４日目に胚を代理卵殼に移し、Etchesら(1996b) に記載された期間までインキュベートした。培養皿の調製 ＳＮＬ７６／７マウス繊維芽フィーダー細胞（A．Bradley、ベイラー・カレッ ジ・オブ・メディスン、ヒューストン、テキサス、米国から贈呈されたもの）を 、０.１％滅菌ウシ皮膚ゼラチン（Sigma、セントルイス、ミズーリ、米国）コー ティング培養皿（Nunc、デンマーク）上に１.２５×１０5細胞／ｃｍ2の密度に て植え付けた。フィーダー細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ Cansera）レクスデール、ＯＮ、カナダ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Gibco）、 １００ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Gibc o）を添加したダルベッコ変性イーグル培地中、ｐＨ７.２、３７℃にて５％ＣＯ2 中で２４時間保持した。細胞の解離 ステージＸの胞胚葉を、滅菌濾紙リング（rings）を用い、バードプリマスロ ックの胚から、１ｇ／Ｌ Ｄ−グルコースを含有するダルベッコリン酸緩衝食塩 水（ＰＢＳ−Ｇ）を入れたペトリ皿に単離した（Petitteら、1990）。胞胚葉全 体から注意深く余分の卵黄を洗い落とし、２〜３ｍｌのＰＢＳ−Ｇと２％（ｖ／ ｖ）ニワトリ血清（ＣｈＳ）とを入れた１５ｍｌ遠心管にパスツールピペットを 使って穏やかに移した。胞胚葉を２／ｍｌ（two per ml）にてプールした。ＰＢ Ｓ−Ｇ＋２％ＣｈＳを除去し、等容量のカルシウムおよびマグネシウム不含リン 酸緩衝食塩水（ＣＭＦ−ＰＢＳ）＋２％ＣｈＳで置き換えた。ついで、胞胚葉を 氷上で１０分間インキュベートした。ＣＭＦ−ＰＢＳを０.０２％ＥＤＴＡ（ｗ ／ｖ）中の０.０５％トリプシン（ｗ／ｖ）（Gibco）で置換し、胞胚葉を再び氷 上で１０分間インキュベートした。トリプシンを、２％ＣｈＳ、４％（ｖ／ｖ） ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシ ンを添加したＯｐｔ−変性イーグル培地Ｉ(Optimem)(Gibco)(ｐＨ７.２)の１.０ ｍｌで置換した。１０ｍｌピペットで吸引することにより、胞胚葉をプールし、 ゆっくりと分散させた。細胞浮遊液の試料を用いて血球計で細胞濃度を決定した 。解離した細胞を１０００ｒｐｍにて４分間遠心分離にかけた。上澄み液を除去 し、細胞を適当な容量のOptimem中に再浮遊させた。分散した胞胚葉細胞をＳＮ Ｌフィーダー細胞上に１×１０5細胞／ｃｍ2の濃度にてプレーティングし、５％ ＣＯ2中、３７℃にて１、３、７または１８時間インキュベートした。免疫組織化学の測定 培養した胞胚葉細胞および全マウントを４％パラホルムアルデヒド（Sigma） 中、４℃にて１０分間固定した。ついで、調製物を、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アル ブミン（ＰＢＳ−ＢＳＡ）（Boehringer Mannheim、ラバル、ＰＱ、カナダ）と ５％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Sigma）とを添加したＰＢＳ中、４℃にて４時間浸漬 し、非特異的な結合部位を飽和させた。ブロック溶液を、少なくとも１２時間ゆ すりながら、ＰＢＳ−ＢＳＡ中に１：３に希釈したＳＳＥＡ−１、ＰＢＳ−ＢＳ Ａ中に１：１０に希釈したＥＭＡ−１または１：２に希釈したＨＮＫ−１／ＮＣ −１（C．Stern、コロンビアユニバーシティ、ニューヨーク、米国から贈呈され たもの）からの上澄み液で置換した。ＳＳＥＡ−１およびＥＭＡ−１抗体上澄み 液を、Department of Pharmacology and Molecular Sciences，John Hopkins Un iversity School of Medicine、ボルチモア、メリーランド、およびDepartment of Biological Sciences，University of Iowa、アイオワシティー、アイオワに よって維持されたDevelopmental Studies Hybridoma Bankから、ＮＩＣＨＤから の契約Ｎ０１−ＨＤ−６−２９１５の下に入手した。調製物をＰＢＳ−ＢＳＡで ２回洗浄し、１：５０に希釈したアフィニティー精製ヤギ抗マウスＩｇＭ−ＦＩ ＴＣコンジュゲート（Jackson ImmunoResearch、ウエストグローブ、ペンシルベ ニア、米国）とともに暗所にて４℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳ Ａで２回洗浄した後、ＰＢＳで１：１に希釈したグリセリンとともに マウントし、水銀ランプで励起するエピ蛍光（epifluorescent）光学を備えたNi kon Diaphot-TMD倒立（inverted）顕微鏡で、４７０〜４９０ｎｍで発光させる ためにフィルターを用いて観察した。マグネチックビーズを用いた細胞の選択 解離した細胞調製物を、モノクローナル抗体ＳＳＥＡ−１、ＥＭＡ−１または ＮＣ−１（Immunotech、ウェストブルック、メイン、米国）とともに４℃にて４ ５分間インキュベートした。インキュベートする前に、トリプシンの代わりにＰ ＢＳ−ＣｈＳを用いた他は上記と同様にして胞胚葉細胞を単離した。引き続き、 細胞調製物をＰＢＳ−ＢＳＡで洗浄し、ラット抗マウスＩｇＭをコンジュゲート したマイクロビーズ（Miltenyi Biotec、サニーベイル、カリフォルニア、米国 ）を含む１００μｌのＰＢＳ−ＢＳＡとともに４℃にて３０分間インキュベート した。ついで、混合物を５００μｌのＰＢＳ−ＢＳＡで再び洗浄し、再浮遊させ た。スチールウール分離カラム（タイプＭＳ＋：Miltenyi Biotech）をMiniMACS マグネチックシステム（Miltenyi Biotech）に挿入し、ＰＢＳ−ＢＳＡで濯いだ 。細胞浮遊液をカラムに通した。結合しなかった（陰性の）細胞は、ＰＢＳ−Ｂ ＳＡで流し去った。超常磁性ビーズで標識した細胞は磁場中にて磁性を示し、カ ラムのスチールウール繊維に結合するが、非標識の細胞はカラムを通過する（Mi ltenyiら、1990）。最後にカラムを磁場から除去し、結合した（陽性の）細胞を ＰＢＳ−ＢＳＡで濯いで溶出する。マグネチックセルソーティングを行う前後に 免疫組織化学を行った。 結果： 中心領域および側部領域を摘出し放射線を照射したまたは照射していない胚に 由来するトリの生殖能を表１および表２に示す。卵および精子の産生並びに接合 子の受精能は胚の処理方法によって影響されないことが明らかである。それゆえ 、中心領域を摘出した後に残留する生殖系列コンピテント細胞は、増殖して雄で は精原細胞、雌では卵原細胞の正常な定数でもって生殖系列を占める能力を有す ると結論付けることができる。 バードプリマスロックドナー細胞を、放射線照射および胚の中心または側部領 域からの約５００個の細胞の摘出により傷つけたホワイトレグホンレシピエント 胚中に注入した後に産生された体細胞および生殖系列細胞のキメラの数を表３〜 ６に示す。体細胞キメラは、黒色の（ドナー由来）色素形成を伴って孵化する（ 表３〜６の第２欄を参照）。推定キメラは黒色の（ドナー由来）色素形成を有し ない。本発明者らの以前の研究は、推定キメラは通常、生殖系列キメラではない ことを示している。胚を放射線照射し、約５００個の細胞を胚の中心領域中に注 入した場合（表３）には、９の体細胞キメラのうち５がドナー由来の子孫を生成 した（すなわち、それらは生殖系列キメラであった）。これと比較して、放射線 照射したレシピエント胚の側部領域中に５００個の細胞を注入することにより生 成した８の体細胞キメラのうち１のみがドナー由来の子孫を生成した（表４）。 これらデータは、生殖系列コンピテント細胞がステージＸの胚の中心に位置する との提唱と一致し、支持を与えている。 胚の中心から約５００個の細胞を摘出することにより傷つけたレシピエント胚 の中心領域へのバードプリマスロックドナー細胞の注入は、９の体細胞キメラか ら３の生殖系列キメラを生成した（表５）。これと比較して、胚の側部領域から 細胞を除去したレシピエントの側部領域中へのバードプリマスロック細胞の注入 は、１０の体細胞キメラのうち１のみの生殖系列キメラを生成した（表６）。こ れらデータもまた、生殖系列コンピテント細胞が胚の中心領域に位置するとの仮 説と一致している。さらに、放射線照射により傷つけた後と中心領域から細胞を 物理的に除去することにより傷つけた後とでは、生成する生殖系列キメラの比率 が同じである。レシピエント胚の放射線照射は、レシピエント胚の発生の速度を 遅くすることによって生殖系列キメラ化の割合を改善するものと思われる。ドナ ー細胞は放射線照射されていないので増殖するが、レシピエント胚中では細胞分 裂が抑制され、その結果、キメラ中でのドナー レシピエント細胞の比率が増大 する（Carsienceら、1993）。胚の中心からの細胞の除去もまた、生殖系列キメ ラ化の比率を増大させる（０.６％から１１.３％、表７）。この場合、この増大 は、レシピエントの中心からの生殖系列細胞の除去およびその後の同領域へのド ナー生殖系列コンピテント細胞の再導入によるものである。この解釈は、胚の側 部領域からの細胞除去後の生殖系列移行が非常に低い比率であることによって支 持されている（表７）。エピトープを発現する細胞の免疫蛍光検出による生殖系列コンピテント細胞の同 定 エピトープを発現する細胞の免疫蛍光による同定 ＥＭＡ−１およびＳＳＥＡ−１によって認識される表面抗原を発現する細胞の 標識は、ステージＸのバードプリマスロックの全胚で検出することができた（図 ２および図３）。蛍光染色されない細胞、弱く蛍光染色された細胞および高度に 蛍光染色された細胞の混合物が、１、３、７および１８時間後に培養液中で観察 された。１８時間培養した細胞の約８％、１５％および４８％が、ＥＭＡ−１（ 図４および図５）、ＳＳＥＡ−１（図６および図７）およびＨＮＫ−１／ＮＣ− １（図８および図９）に対してそれぞれ高い染色を示した。ＳＮＬマウス繊維芽 細胞の培養液を陰性対照として用いた。試薬対照は、一次抗体をＰＢＳ−ＢＳＡ で置換することで構成されていた。陰性対照および試薬対照中のいずれの細胞も 染色されないことはなかった。 エピトープを発現する細胞のマグネチックビーズを用いた選択 ＳＳＥＡ−１エピトープを発現するステージＸの胞胚葉細胞の３倍の富化（en richment）をＳＳＥＡ−１コーティングマイクロビーズを用いて達成した。免疫 蛍光は、ＳＳＥＡ−１染色細胞のパーセントが分離後に１４％から４５％に増加 したことを確認した。ＥＭＡ−１陽性細胞の免疫磁性単離の結果、精製前の該細 胞の８％から精製後の２８％へと３倍の富化となった。ＮＣ−１エピトープを発 現する細胞の選択は、２倍の増加となった。ＮＣ−１陽性細胞のパーセントは、 分離後に４８％から８９％に増加した。すべての場合において、分離後の細胞の 生存率は、トリパンブルー排除による測定で９４％よりも大きいことがわかった 。 ＥＭＡ−１、ＳＳＥＡ−１およびＮＣ−１を含むＭＡＣＳカラムからの陽性お よび陰性フラクションを用いた、体細胞および生殖系列キメラ化の比率および雄 および雌キメラの生殖系列伝達の比率を、それぞれ表８および表９に示す。これ らの実験において体細胞および生殖系列の両キメラ化の比率は低く、磁性カラム 中の細胞の操作が該細胞がレシピエント胚へ寄与する全体的な能力を低減させる ことを示していた。これら実験の予備的証拠は、ＳＳＥＡ−１およびＮＣ−１を 用いて選択した陽性フラクションおよび陰性フラクションの体細胞組織および生 殖系列組織への寄与がほぼ等しいことを示している。しかしながら、ＥＭＡ−１ 抗体により選択した細胞は、３のキメラのうち２において生殖系列に有意の寄与 を生じた（表８）。これらデータは、生殖系列コンピテント細胞がＥＭＡ−１エ ピトープを用いて選択できることを示している。ＭＡＣＳを用いたＥＭＡ−１陽 性細胞の富化が８％から２８％であったので（上記参照）、注入した細胞の約７ ２％はＥＭＡ−１陽性ではなかった。 要約すると、これらデータは、生殖系列コンピテント細胞の集団がステージＸ （E-G & K）の胚の中心領域に存在すること、および生殖系列コンピテント細胞 が、生殖系列コンピテント細胞によって特異的に発現されるエピトープを認識す るＥＭＡ−１などの抗体を用いた磁性的に活性化したセルソーティングなどの技 術を用いて単離できるという結論を支持している。 本発明を現在のところ好ましい実施例と考えられるものを参照して記載したが 、本発明はこれら開示された実施例に限定されないことが理解されなければなら ない。逆に、本発明は、添付の請求の範囲の精神および範囲内に含まれる種々の 改変および等価な配置（arrangement）を包含することを意図するものである。 すべての刊行物、特許および特許出願は、これら個々の刊行物、特許および特 許出願が特別かつ個々にその全体が参照のために引用されるのと同じ程度にその 全体が本明細書中に参照のために引用される。 以下に本明細書および図面の詳細な凡例において言及した文献の完全な引用を 掲げた。表１ ．放射線照射したまたは約５００個の細胞を摘出したステージＸの胚に由来 するメンドリの卵産生を開始した平均日齢および日齢範囲および受精率 表２．放射線照射したまたは約５００個の細胞を摘出したステージＸの胚に由来 するオンドリの精子の平均濃度および受精率 表３．体細胞キメラおよび推定キメラをバードプリマスロックへ交配する試験か らのレシピエント由来子孫およびドナー由来子孫の数 グループ １− 放射線 照射により傷つけ５００個のドナー細胞を中心部に注入したレシピエント胚 表４．体細胞キメラおよび推定キメラをバードプリマスロックへ交配する試験か らのレシピエント由来子孫およびドナー由来子孫の数 グループ ２− 放射線 照射により傷つけ５００個のドナー細胞を側部に注入したレシピエント胚 表５．細胞キメラおよび推定キメラをバードプリマスロックへ交配する試験から のレシピエント由来子孫およびドナー由来子孫の数 グループ ３− 中心領域 から５００個の細胞を物理的に除去することにより傷つけ５００個のドナー細胞 を中心部に注入したレシピエント胚 表６．細胞キメラおよび推定キメラをバードプリマスロックへ交配する試験から のレシピエント由来子孫およびドナー由来子孫の数 グループ ４− 側部領域 から５００個の細胞を物理的に除去することにより傷つけ５００個のドナー細胞 を側部に注入したレシピエント胚 表７．羽毛の黒色色素形成の％として表した体細胞キメラ化の割合およびドナー 由来の子孫数／放射線照射したまたは約５００個の細胞を摘出したステージＸの 胚に由来するキメラからの子孫の全数として表した生殖系列伝達の割合 表８．ＥＭＡ−１、ＳＳＥＡ−１およびＮＣ−１エピトープを用いて磁性的活性 化セルソーティング（ＭＡＣＳ）により選択した細胞を注入することにより作成 した雄の体細胞キメラおよび生殖系列キメラの比率 表９．ＥＭＡ−１、ＳＳＥＡ−１およびＮＣ−１エピトープを用いて磁性的活性 化セルソーティング（ＭＡＣＳ）により選択した細胞を注入することにより作成 した雌の体細胞キメラおよび生殖系列キメラの比率 図面の凡例の詳細 図１．卵黄の表面に垂直な胚の断面図として表した産卵時の胚の構造。 図２．ＳＮＬフィーダー細胞とともに１８時間培養したステージＸの胞胚葉細 胞上のＥＭＡ−１エピトープの発現を表す、顕微鏡野の位相差照明顕微鏡写真（ 倍率３００×）。 図３．ＳＮＬフィーダー細胞とともに１８時間培養したステージＸの胞胚葉細 胞上のＥＭＡ−１エピトープの発現を表す、図１と同じ顕微鏡野の蛍光顕微鏡写 真（倍率３００×）。 図４．１８時間培養後のＳＳＥＡ−１エピトープの発現を表す、顕微鏡野の位 相差照明顕微鏡写真。 図５．１８時間培養後のＳＳＥＡ−１エピトープの発現を表す、図４と同じ顕 微鏡野の蛍光顕微鏡写真。 図６．ステージＸの全マウント上のＳＳＥＡ−１発現を表す、顕微鏡野の位相 差照明顕微鏡写真（倍率３００×）。 図７．ステージＸの全マウント上のＳＳＥＡ−１発現を表す、図１と同じ顕微 鏡野の蛍光顕微鏡写真（倍率３００×）。 図８．１８時間培養後のステージＸの胞胚葉細胞上のＨＮＫ−１／ＮＣ−１発 現を表す、顕微鏡野の位相差照明顕微鏡写真。 図９．１８時間培養後のステージＸの胞胚葉細胞上のＨＮＫ−１／ＮＣ−１発 現を表す、同じ顕微鏡野の蛍光顕微鏡写真。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Title of the invention: Method for selecting germ-line competent cells in chicken embryos and texture Use of the cells in the production of la   This application is related to US Provisional Application No. 60 / 039,4, filed February 28, 1997. Claim the benefit of No. 88.TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION   The present invention relates to a method for selecting germline competent cells and germline And a method for producing la.Background of the Invention   The poultry industry traditionally provides chickens, turkeys and other poultry with the desired characteristics. Relies on crosses to serve. Gene rearrangements that occur in each generation are usually This results in offspring that have a small proportion of the attributes of the best individual in the group. Reason Ideally, breeders would want to add more control over the manipulation of the genome.   Manipulating the genome at an embryonic stage so far to introduce advantageous properties into poultry There have been many studies trying to. DNA into pronuclei or newly fertilized eggs Introducing methods have been used, but these methods are disadvantageous in many respects. Each egg Or these birds have to kill bird species to get zygotes, Expensive; identifying the pronucleus of the supernumary sperm entering fertilization Foreign DNA is highly genomic when injected into newly fertilized zygotes. The engineered egg is fistulated. ) It is technically difficult to return to hens and maintain them in surrogates. therefore, More recent methods involve manipulation of the blastoderm contained in newly born eggs.   Fertilization of the chicken embryo occurs within 15 minutes after ovulation in the funnel of the genital tract. Embryo Is located on the surface of the yolk, but for the next 18 to 23 hours, oogenesis is the albumen around the yolk, It develops as completed by the secretion of membranes and eggshells. The first cell division Occurs about 5 hours after fertilization when the egg enters the shell gland. 13:00 to 18:00 In the meantime, the division of the embryo continues rapidly, containing 40,000 to 60,000 cells. Generate embryos (Eyal-Giladi & Kochav, 1976; Kochav et al., 1980; Watt et al., 1993) . When oogenesis is complete, the eggs are released from the shell glands upon oviposition. 40,0 when spawning An embryo structure containing 00 to 60,000 cells is referred to as a stage X (E-G & K) embryo .   Up to 1000 cells from a population of cells recovered from stage X (E-G & K) embryos When the sample from the step is transferred to a recipient embryo at the same developmental stage, donor cells are obtained. Contribute to both the somatic tissue and the germline of the chimera (Petitte et al., 1990; Cars ience et al., 1993; Fraser et al., 1993; Thoraval et al., 1994; Kagami et al., 1995; Etches et al. 1996a; Kino et al., 1997). However, details that contribute to germline and somatic tissues The vesicles have not been identified. Cells from stage X (E-G & K) embryos were injected Subsequent production of somatic cells and germline chimeras was observed in each stage X (E-G & K) embryo. That cells can contribute to the ectoderm, mesoderm, endoderm and germ line, and Cells from embryos of E. X (E-G & K) are shown to be pluripotent. But However, some indirect evidence suggests that certain types of cells in stage X (E-G & K) embryos Suggest that these populations contain cells with different functional characteristics. For example, E MA-1 epitope is thought to be expressed only in germline committed germ cells But is expressed on the same cells in stage XI (E-G & K) embryos (Urven Et al., 1988; Karagene et al., 1995). Epitope SSEA-1 is expressed on mouse embryonic stem cells But is expressed by the same cells in stage XIII (E-G & K) embryos (Petitte and Karagene, 1996). In stage X (E-G & K) chicken embryo Evidence supporting the presence of morphologically unrecognizable primordial germ cells is due to stage X blastocysts. Contracted primordial germ cells in culture derived from the central disc rather than the leaf opacity (Ginsburg and Eyal-Giladi, 1987). Reproduction The presence of cells destined to lineage is also apparent in the turbid part of stage X (E-G & K) embryos Rather than somatic and germ-line textures from cells taken from the center plate, Can be inferred from the observation that LA is produced (Petitte et al., 1993). In quail, The QH-1 epitope is expressed by germline committed cells in quail Is thought to be expressed in embryonic cells at the time of oviposition (Pardanaud et al., 1987) . These data indicate that progenitor cell precursors Provides indirect evidence for the presence in the embryo of tage X (E-G & K) However, (1) whether these cells are committed to the germline, (2) Whether it retains the ability to enter both cell and germ cell lines, and (3) It is not yet clear by what means these cells can be identified.   The production of chimeras in bird species such as chickens depends on the status of germline competent cells. If the location of di-X (E-G & K) in the embryo is identified, and Cell population can be isolated from the entire population of cells, including stage X (E-G & K) embryos Would be greatly facilitated. For example, endogenous raw in the recipient embryo Multilineage competent cells are excised to contribute to the germline except for the donor embryo. It would be possible to remove it. Radiation to recipient embryos using current technology Irradiation can reduce the endogenous contribution but cannot remove it. No (Carsience et al., 1993). Irradiation increases the growth of recipient embryos around 24 hours While the contribution to donor-derived chimeras continues to increase (Carsience et al. , 1993). Although this approach has proven useful, it is The degree of germline contribution is unpredictable and inconsistent. Germline predictable The lack of competent and consistent contributions indicates that the donor cell population is genetically unique and rare This is important if you only have a small number of cells. Examples of rare cells include genetically modified Decorated cells (see Brazolot et al., 1991; Fraser et al., 1993) or extinct cryopreservation Stock-derived cells (see Kino et al., 1997).   The production of chimeric chickens is also due to the germline expression in stage X (E-G & K) embryos. Facilitated if cell surface epitopes expressed by the competent cells are identified Will be. Identification of these epitopes depends on how to identify germline competent cells. It will facilitate the development of the law.Summary of the Invention   The inventor has determined that germline competence in stage X (E-G & K) embryos of chickens Cell surface epitopes expressed by the cells were identified. In particular, the inventor EM in stage X (E-G & K) chicken embryos and cultured cells derived therefrom A-1 and SSEA-1 epitopes were identified. Identification of these epitopes It is capable of growing in vitro without differentiating, and the recipient embryo Stage X (E-G & K) chicks that retain the ability to enter the germ line after injection Facilitated identification and isolation of cells in avian embryos. These cells are referred to herein as " Germline competent cells ". Germline competents isolated from donor embryos Cell lines were introduced into recipient embryos to generate chimeric embryos. Chimerization ism) to remove donor cells from the central region of the recipient embryo, Increased when injected into recipient embryos irradiated prior to donor cell injection .   The present invention generally relates to germline compilation in stage X (E-G & K) chicken embryos. A method for selecting tent cells, from a stage X (E-G & K) chicken embryo Epitopes expressed by germ-line competent cells bound to the cell surface A method comprising separating the cells. Above all, germ-line competent cells Uses cells from stage X (E-G & K) chicken embryos as germline competency Reacts with substances that bind directly or indirectly to epitopes expressed by Can be isolated. In a preferred embodiment, germline competent cells Is an EMA-1 or SSEA-1 epitope .   The present invention also provides for the preparation of cell preparations enriched in chicken germline competent cells. The method comprises: (a) providing cells from a stage X (E-G & K) chicken embryo And (b) the epitope expressed by the germ-line competent cells is The present invention also relates to a method comprising selecting cells bound to a surface.   Germ-line competent cells identified and isolated using the methods of the present invention are Can be genetically modified by introducing a recombinant expression vector into the cell . Therefore, the method of the present invention further comprises a foreign gene and transcription and translation of said gene. Transform germline competent cells with a recombinant expression vector that contains the necessary translational elements. Including sfecting.   The invention further relates to germ-line competent cells obtained using the method of the invention. Or a cell culture containing genetically modified germline cells.   The invention further provides a method of identifying a region in an embryo containing germline competent cells And (A) directing the embryo directly to epitopes expressed by germ-line competent cells; Or a substance that binds indirectly and is labeled with a detectable marker. Then (B) detecting a detectable change generated by the detectable marker and detecting the detectable change in the embryo; Identify regions containing germline competent cells And a method comprising:   In a preferred embodiment, the epitope expressed by the germ-line competent cells Is an EMA-1 or SSEA-1 epitope and binds to that epitope The substance is an antibody.   Germline cells identified in accordance with the present invention are useful for generating chimeric chicken embryos. Can be used. Therefore, the present invention relates to (a) the stage X (E-G & K) Epitopes expressed by germ-line competent cells from chicken embryos (B) optionally, isolating the cells from the foreign gene and the Transfected with a recombinant expression vector that contains the necessary elements for gene transcription and translation. (C) removing the cells from the recipient's Stage X (X E-G & K) into a chicken embryo, and (d) incubating the recipient embryo A method for producing a chimeric chicken embryo, comprising producing a chimeric embryo by baiting I do. Chimeric embryos may be propagated until the time of generation of the chimeric chicken.   The present invention further provides a chimeric embryo and a chimeric chicken produced by the method of the present invention. To provide   Furthermore, the present invention relates to a kit for performing the method of the present invention.   Other objects, features and advantages of the present invention will become apparent from the following description. However, the detailed description and specific examples illustrate preferred embodiments of the present invention. However, if it is not understood that it has been used only for illustrative purposes, No. Because of this detailed description, those skilled in the art will be within the spirit and scope of the invention. Various changes and modifications in are apparent.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   The invention will now be described with reference to the drawings. In these drawings:   Figure 1 shows the structure of a stage X embryo as a cross section perpendicular to the yolk surface of the embryo;   FIG. 2 is a phase showing the expression of the EMA-1 epitope on stage X blastoderm cells. Illustrated difference illumination micrographs;   FIG. 3 shows the fluorescence micrograph of FIG. 2;   FIG. 4 shows the location of SSEA-1 epitope expression on stage X blastoderm cells. The phase contrast illumination micrograph is shown;   FIG. 5 shows the fluorescence micrograph of FIG. 4;   FIG. 6 is a phase showing the expression of the SSEA-1 epitope on all mounts of stage X. The difference illumination micrograph is shown;   FIG. 7 shows the fluorescence micrograph of FIG. 6;   FIG. 8 is a phase contrast showing HNK-1 / NC-1 expression on stage X blastoderm cells. Illumination micrographs are shown; and   FIG. 9 shows a fluorescence micrograph of FIG.BRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION 1. Selection of germline competent cells   As described above, the present invention relates to the preparation of stage X (E-G & K) chicken embryos. Epitopes expressed by germ-line competent cells bound to the cell surface Germline in stage X (E-G & K) chick embryos, including separating cells The present invention relates to a method for selecting competent cells. The invention also relates to chicken germline A method for producing a cell preparation enriched in competent cells, comprising: (a) Stage X (E- G & K) from chicken embryos, and then (b) germline competent Includes selecting cells in which the epitope expressed by the cell has bound to the cell surface. How to use it. In a preferred embodiment, by germline competent cells The epitope expressed is an EMA-1 or SSEA-1 epitope.   Stage X (E-G & K) embryos are embryos that are released from the shell glands during oviposition, It contains 40,000 to 60,000 cells (Eyal-Giladi & Ko chav, 1976; Kochav et al., 1980; Watt et al., 1993). Stage X (E-G & K) embryo structure The structure is shown in FIG. Morphologically, cells in stage X (E-G & K) embryos None show the characteristics of differentiated cells. Center plate includes transparent area and border area , And are surrounded by a turbid part. The transparent part is above the subgerminal fluid layer Located in the lower part, the subgerminal fluid separates the embryo from the lower yolk. The cloudy area is the surrounding egg In direct contact with yellow.   Stage X (E-G & K) embryos can be isolated from eggs using conventional methods. For example, Car By separating egg white from egg yolk as described by sience et al. (1993). Embryos can be isolated from newly laid unincubated eggs.   Prior to selection of germ-line competent cells, stage X (E-G & K) chickens Preferably, cells from the germ are dissociated from the embryo using conventional methods. For example, birds The blastoderm is treated with a substance that digests the extracellular matrix, such as psin. The cells are suspended from the embryo.   Epitopes expressed by germ-line competent cells bind to the cell surface Cells can be selected using substances that bind directly or indirectly to the epitope. . In one embodiment of the invention, the epitope is EMA-1 or SSEA-1 Wherein the substance is an antibody specific for the EMA-1 or SSEA-1 epitope. You. Therefore, the present invention relates to the germline colonization in stage X (E-G & K) chicken embryos. A method for selecting competent cells, comprising a stage X (E-G & K) chicken embryo Cells obtained from germline competent cells Reacting with one or more specific antibodies, wherein the antibodies and the epitope Form a conjugate with the germ-line competent cells bound to Isolating the conjugate to obtain a cell preparation containing germline competent cells Providing a method comprising: This method involves the use of two or more antibodies, eg, EMA-1 And one antibody to SSEA-1 can be used. You.   The term "antibody" includes polyclonal antisera or monoclonal antibodies. Conventional methods can be used for preparing the antibody. For example, EMA-1 and By using the SSEA-1 epitope, polyclonal antisera or Clonal antibodies can be produced using standard methods. Mammals (eg, mouse, c EMA-1 that elicits an antibody response in mammals Alternatively, it can be immunized with an immunogenic form of the SSEA-1 epitope. Epito Techniques for imparting immunogenicity to a carrier include binding to a carrier or a technique known in the art. Other techniques known in the art can be mentioned. The progress of immunity depends on the antibody in plasma or serum. It can be monitored by detecting the titer. Standard ELISA or other immunoa Antibody assay can be used with the immunoassay as an antigen to assess antibody levels. You. After immunization, antiserum is obtained and, if desired, polyclonal antibodies are isolated from the serum .   To produce monoclonal antibodies, antibody-producing cells (lymphocytes) must be And fused with myeloma cells by standard somatic cell fusion techniques to dissociate these cells. The cells are killed to obtain hybridoma cells. Such techniques are well known in the art. [For example, the hybridoma method was first described by Kohler and Milstein (Nature  256, 495-497 (1975)). Combinatorial antibody library Other techniques such as screening of combinatorial antibody libraries It can also be used [Huse et al., Science 246, 1275 (1989)]. To the above epitope Hybridoma cells are screened immunochemically for the production of specifically reactive antibodies. And these monoclonal antibodies can be isolated.   The term “antibody” also refers to an epitope expressed by germline competent cells. Antibody fragments that specifically react with the antibody. Antibodies can be purified using standard methods. Fragments, and screen these fragments for their usefulness. Training. For example, F (ab ')TwoFragments can be obtained by treating the antibody with pepsin. And is obtained by Obtained F (ab ')TwoFragments reduce disulfide bonds Upon processing, Fab 'fragments can be obtained.   Chimeric antibody derivative, ie, combining non-avian variable region and avian constant region Antibody molecules are also included within the scope of the present invention. Chimeric antibodies include, for example, mice, Containing antigen-binding domains from rat and other species antibodies along with avian constant regions . Immunoglobulin recognizing epitopes expressed by germline competent cells Standard methods can be used to produce chimeric antibodies comprising a Blin variable region ( See, for example, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851 (1985); Taked a et al., Nature 314,452 (1985); Cabilly et al., U.S. Patent No. 4,816,567; Boss. Et al., U.S. Pat. No. 4,816,397; Tanaguchi et al., European Patent Publication EP17. 1496; EP-A-0173494; British Patent GB 217709. 6B).   Similarly, a gene encoding an antibody that specifically binds using recombinant DNA technology A binding partner can be constructed by introducing a variable region of In one embodiment, from a hybridoma producing the monoclonal antibody of interest A gene encoding a variable region, a nucleotide primer for the variable region; And amplify. These primers can be synthesized by those skilled in the art, Alternatively, a commercially available product can be purchased. These primers are heavy or light chains Can be used to amplify the variable regions of ImmunoZAPTM H or ImmunoZAPTM Insert into a vector such as L (Stratacyte) be able to. These vectors are then introduced into E. coli for expression. This Using these methods, VHAnd VLLarge quantities of single-chain proteins containing domain fusions (See Bird et al., Science 242: 423-426, 1988).   Antibodies to the epitope can also be obtained from commercial sources. For example , SSEA-1 and EMA-1 were developed by Immunotech, U.S.A. Available from Estbrook, Maine, USA.   Antibodies contain various enzymes, fluorescent materials, luminescent materials and radioactive materials. Can be labeled with a marker that can be issued. Examples of suitable enzymes include horseradish peroki A sidase, biotin, alkaline phosphatase, β-galactosidase, or Acetylcholinesterase is an example of a suitable fluorescent substance. Riferon, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine , Dichlorotriazinylamine fluorescein, dansyl chloride or Coerythrin is mentioned, and luminol is an example of a suitable luminescent substance. Examples of suitable radioactive materials include S-35, Cu-64, Ga-67, Zr-89, Ru-97, Tc-99m, Rh-105, Pd-109, In1 11, I-123, I-125, I131, Re-186, Au-198, Au -199, Pb-203, At-211, Pb-212 and Bi-212. I can do it. Antibodies can also be labeled or conjugated with one partner of a ligand binding pair. Can also be conjugated. Representative examples include avidin-biotin and Riboflavin-riboflavin binding protein. With the typical signs above Conjugation or labeling of antibodies can be easily performed using standard methods. Wear.   Antibodies can be labeled with a detectable marker described herein, or Alternatively, an indirect method can be used. In the indirect method, antibodies reactive with the epitope By introducing a second antibody having specificity for the body, the primary antigen-antibody Amplify the response. As an example, for EMA-1 or SSEA-1 epitopes If the antibody having specificity is a mouse IgG antibody, the second antibody is described herein. Rat or rabbit anti-mouse gamma-glo labeled with a detectable marker May be Bling.   Antibodies include agarose, cellulose, dextran, Sephadex, and Cephalo Carboxymethylcellulose, polystyrene, filter paper, ion-exchange resin, Plastic film, plastic tube, glass beads, polyamine-methyl Ruvinyl-ether-maleic acid copolymer, amino acid copolymer, ethylene- It may be bound to a carrier such as a maleic acid copolymer, nylon, silk and the like. The carrier is Examples include tubes, test plates, beads, discs, and spheres. May be.   Antibodies can be conjugated to a matrix. Matrix example and Magnetic beads that enable direct magnetic separation (Kernshead 1992) Panning surfaces of plates, plates, etc. (Lebkowski, J.S. et al. (1994) ), Dense particles for density centrifugation (Van Vlasselaer, P., Density Adjusted)  Cell Sorting (DACS), A Novel Method to Remove Tumor Cells from Periphera l Blood and Bone Marrow Stem Cell Transplants (1995) 3rd International S ymposium on Recent Advances in Hematopoietic Stem Cell Transplantation-C linical Progress, New Technologies and Gene Therapy, San Diego, Caliphate ), An adsorption column (Berenson et al., 1986, Journal of Immunological Metho). ds 91: 11-19), and adsorption membranes (Norton et al., 1994). These antibodies are It also binds to cytotoxic agents such as complement and cytotoxins, and Vesicles can also be lysed or killed.   The antibodies can be bound directly to the matrix. For example, cyan bromide When used, antibodies can be chemically attached to the surface of the magnetic particles. These magnetic particles Epitopes expressed by germline competent cells bind offspring to the cell surface Antibody reacts with a sample containing germline competent cells A conjugate is formed between the magnetic particles and the germ-line competent cells.   Alternatively, these antibodies can be conjugated to the matrix indirectly using the antibodies. Can be For example, for SSEA-1 or MEA-1 epitopes The matrix is coated with a second antibody that has specificity for the antibody Wear. As an example, antibodies against SSEA-1 or MEA-1 epitopes are If a mouse IgG antibody, the second antibody may be a rabbit anti-mouse IgG. This These antibodies are also introduced into antibody reagents conjugated indirectly to the matrix. You can also enter. Examples of antibody reagents include bispecific antibodies, tetrameric antibody conjugates , And biotinylated antibodies.   Bispecific antibodies bind to epitopes expressed by germline competent cells The variable region of a specific antibody and at least one antigen on the surface of the matrix Contains a variable region specific to Bispecific antibodies produce hybrid hybridomas Can be prepared. Hybrid hybridomas from Staerz & Bevan (1986, PNAS (USA) 83: 1453) and Staerz & Bevan (1986, Immunology Today , Prepared using procedures known in the art, such as those disclosed in it can. Bispecific antibodies have also been described by Staerz et al. (1985, Nature, 314: 628) and Perez. (1985 Nature 316: 354). Can be constructed by means or by expression of a recombinant immunoglobulin gene construct. .   The tetrameric immune complex binds to at least one antigen on the surface of the matrix The first monoclonal antibody obtained and expressed by germ-line competent cells Prepared by mixing with a second monoclonal antibody specific for the selected epitope it can. These first and second monoclonal antibodies, From the first animal species. These first monoclonal antibody and second A monoclonal antibody is directed against an Fc fragment of an antibody of the first animal species. React with approximately equimolar amounts of the monoclonal antibody of the second animal species obtained. First The monoclonal antibody and the second monoclonal antibody may also Of monoclonal antibodies of a second animal species directed against the Fc fragment of the body F (ab ')TwoMay be reacted with approximately equimolar amounts of fragments (Lansdorp, U.S. Pat. No. 4,868,109; see description of tetrameric antibody conjugates and methods for producing them For this purpose).   Antibodies can be biotinylated and matrix labeled with (strept) avidin. Can be indirectly conjugated to For example, a biotinylated antibody can be Combined with magnetic iron-dextran particles covalently labeled with (lept) avidin (Miltenyi, S. et al., Cytometry 11: 231, 1990). antibody Many other indirect methods to specifically crosslink the matrix with the matrix are also known to those skilled in the art. It will be obvious.   In a preferred embodiment of the present invention, the cell-antibody conjugate is Separated by magnetic separation. Suitable magnetic particles include ferrofluid s) and other colloidal magnetic solutions. Examples of ferrofluids and And its manufacturing method are described in Kemshead J. T. (1992) Hematotherapy, 1: 35-44, 36-3 9 and Ziolo et al., Science (1994) 257: 219. Cited in the handbook). Dextran-iron complex colloid particles Can be used in the method of the present invention (Molday, R.S. and McKenzie, L.L. FEBS Lett. 170: 232, 1984; Miltenyi et al., Cytometry 11: 231, 1990; and Moldday, R.S. And And MacKenzie, D., J. Immunol. Methods 52: 353, 1982; Thomas et al. Hematothe r. 2: 297 (1993); and U.S. Patent No. 4,452,733 (all of which are incorporated by reference). (Referred to herein for reference)). Magnetic particles are also available from Mitenii Biotech It can be obtained from commercial sources such as microbeads available from.   Sample containing germ-line competent cells to be recovered according to the magnetic separation method of the present invention Is reacted with one of the above antibody reagents, and the antibody is Cell conjugates between target cells and antibody reagent by binding to Pitent cells To be done. The reaction conditions depend on the desired binding level between the target cells and the antibody reagent. Is selected so that The concentration of the antibody reagent depends on the estimated concentration of target cells in the sample. Select depending on. Then, add the magnetic particles and inject the mixture at the selected temperature. Cubate. Next, the sample is prepared to be separated by a magnetic filter device. This magnetic separation procedure is based on the magnetic filter and method described in Miltenyi et al., 1990. It is preferable to carry out using. MiniMACS system available from Miltenyi Biotech Commercial magnetic separation systems such as can also be used in the magnetic separation method of the present invention. You.   The sample containing the magnetically labeled cell conjugate is subjected to magnetic filtration in the presence of a magnetic field. Pass through Luther. Magnetically labeled conjugate is retained in a high gradient magnetic column The non-magnetically labeled material flows off the column after washing with buffer.   Antibodies to epitopes expressed by germline competent cells also Can also be used to detect and quantify germ-line competent cells in embryos You. In particular, these antibodies can be used for immunohistochemical analysis to provide germline competence. Can be localized as a specific region in the embryo.   Known in the art for antigen localization using light and electron microscopy Cytochemical methods can be used for the detection of germ-line competent cells. You. Generally, using an antibody labeled with a detectable marker, the detectable marker Can determine the location of germline competent cells in the embryo based on the presence of You. In addition, antibodies can be bound to high electron density substances such as ferritin and colloidal gold. The material can be easily visualized by electron microscopy.   Reagents suitable for applying the method of the present invention pack the necessary materials in suitable containers. Can be packaged in a convenient kit that has been caged. One such kit is a book To select germline competent cells in a sample by the method described in the specification All necessary reagents and, if appropriate, suitable supports useful in performing the method of the invention. It may include a carrier. II. Modification of germ-line competent cells   Germline colonies isolated from stage X (E-G & K) embryos according to the method of the invention Pitent cells allow random or site-specific integration of DNA into cells. It can be more genetically modified. Therefore, the present invention relates to a foreign gene and the foreign gene. Introduction of a recombinant expression vector containing elements necessary for gene transcription and translation Genetic modification of germ-line competent cells isolated by the method of the invention, comprising: About. Examples of foreign genes that can be introduced into germ-line competent cells Vasoactive intestinal peptide, growth hormone, insulin-like growth factor I , IGF-I receptor, GH receptor, prolactin, gonadotropin, gonadotropic Hormone releasing hormones (Etches et al., 1993 and references therein). This The selection of the elements necessary for the transcription and translation of these genes is readily made by those skilled in the art. You. The necessary control sequences may depend on the native gene and / or its flanking regions. May be provided.   Introduction of DNA into germ-line competent cells involves retroviral vector (Shuman, Experientia, 47: 897-904, 1991; Petropoulo) s et al., Journal of Virology, 66: 3391-3397, 1992; Salter et al., Manipulation of t. he Avian Genome, pp. 135-150, 1993). Specific sets in the genome by homologous recombination Large DNA sequences, including those designed to facilitate Over) can be introduced by liposome vehicle gene transfer.   Genetically modified germline competent cells can be cultured in vitro to A modified germline competent cell population can be provided. Stage X Culture system (Pa) designed to support cell growth of unknown cell types from embryos in et al., 1996) was transfected (and untransfected). I) can be used to support the growth of germ-line competent cells. I In vitro culture also provides for the selection of transfected germ-line competent cells. Can also be used to facilitate For example, in mice Used to select transfected cells from untransfected embryonic stem cells The method (Mansour et al., Nature, 366: 248-252, 1988) can be used in the present invention. it can.   Single germ-line competent cells can be cloned using standard methods and genetically modified. A uniform population of decorated donor cells can be provided. III. Production of germline chimeras   Germ-line competent cells selected using the method of the present invention are chimeric chickens. It can be used to produce embryos. To produce a chimeric chicken embryo, Using the method described in the specification, chick embryos from donor stage X (E-G & K) Epitopes expressed by germ-line competent cells bind to the cell surface The isolated germline competent cells are isolated. In a preferred embodiment, the epitope Is EMA-1 or SSEA-1. Isolated germline competent cells , A foreign gene described herein and elements necessary for transcription and translation of the gene May be transfected with a recombinant expression vector containing   These germ-line competent cells were transferred to the recipient's heart from which the central plate had been removed. Introduce into chick embryos of tage X (E-G & K). Transfer of cells to the recipient This is performed using a conventional method such as injection of the embryo into the subgerminal cavity. Center plate of recipient embryo Removal can be accomplished using physical methods or conjugated to toxins or complement. Killed recipient germline competent cells using antibodies to the selected epitope By doing Arbitrary emission of recipient embryos prior to removal of center plate May be exposed to radiation (for example,60490-680 rad gamma irradiation from Co source Shooting). After introducing the donor germline competent cells into the recipient embryo, The embryo is incubated to produce a chimeric embryo.   Recipient embryos containing donor germline competent cells are preferably On the fourth day, transfer to a surrogate culture system to develop chicken embryos from gametocoagulation to feeding. Provide an appropriate environment to support the life. Suitable surrogate culture systems are described in Etches et al. (1996b).   The methods described herein improve the rate of transmission from a donor cell line to a recipient To provide a greater number of chimeras. This makes the pure line genetically superior. It facilitates commercial breeding programs to replace with excellent lines.   The method of the present invention comprises turkey, ostrich, quail, pheasant, duck, and goose. It will be appreciated that it can be applied to other bird species, including VI. Identification of germline-specific molecules   The present invention relates to the identification of molecules (including genes and proteins) bound to germline cells. Provides isolation and identification. Such germline-specific molecules can be used in the methods of the invention. As a marker to identify and separate germline cells from a population of cells Can be used.   Germline-specific molecules can be isolated using a variety of techniques known in the art. Can be. For germline-specific molecules, germline cells are restricted Analysis of the fragments obtained after digestion with creatase, Differential hybridization, direct PCR sequencing Differential hybridization of oligonucleotides and Denaturing gradient gel electrophoresis is included.   In one example, germline-specific molecules are oligonucleotide differentials. Can be detected by a signal hybridization. Above all, germline Cells can be isolated using the method of the present invention to obtain messenger RNA from the cells be able to. A cDNA library was prepared using mRN prepared from a pool of control cells. A can be constructed from cDNA libraries are prepared according to standard protocols. Can be synthesized using Oligo-dT primers and reverse transcriptase. For example, cD NA can be cloned into a plasmid vector such as pSPORT R (Gibco BRL) . Using a commercially available cDNA library such as a phage display random library You can also. Using mRNA from germline cells, mRNA from germline cells Specifically hybridizes to mRNA but does not hybridize to mRNA isolated from control cells. The library can be probed for sequences that do not soy.   Hybridization conditions that can be used in the method of the present invention are those described in the art. Known in the field, for example, the Molecular of Sambrook J, Fritch EF, Maniatis T  Cloning, A Laboratory Manual, 1989. (Nolan C, ed.), Cold Spring ・ Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (Cited herein by reference). Hybridization The reaction product can be assayed using techniques known in the art.   As another example, subtractive hybridization can be used. You. Subtractive hybridization is performed on germ-line competent cells. Differentially expressed genes can be identified and enriched. Subtractive high Hybridization was performed between the germline competent cells of the invention and stage X embryos. Two closely related DNAs (or RNAs), such as other cells present in And) hybridizing between populations. Subtract Hybridization common to both cell types by active hybridization Sequences can be removed. Subsequently, insert the unhybridized sequence. It can be stored as a subtracted cDNA library. The technique Subtractive hybridization methods known in the art, such as Chri stian E. Gruber and Wu-BoLi, “An Improved Subtractive Hybridization Me thod using Phagemid Vectors ”, Molecular Biology Current Innovations and  Future Trends Part 1, A.M. Griffen H.G. And Griffen (eds.), 1995 (see Therefore, those described in the present specification) can be used.   In other instances, germline-specific molecules are detected using denaturing gradient gels be able to. Related to selected nucleotide segments in germline-specific cells The restriction endonuclease fragment or the PCR fragment is subjected to a denaturing agent gradient (increased temperature). On polyacrylamide gels containing increasing amounts of formamide, urea, etc. can do. Germline-specific cell fragments and control fragments Denaturation at different locations, resulting in differences in travel distance. The separated fragments , For restriction fragments by DNA hybridization or PCR fragment Can be detected by direct DNA staining.   Accordingly, the present invention provides for detecting germline-specific molecules using any of the methods described above. Provide a way to   Regulatory sequences, such as promoters that control the expression of germline-specific molecules, are also simply Can be released.   The identification of germline-specific molecules of the invention can also be performed, for example, by the polymerase chain reaction ( PCR) and the like as a primer for amplifying the nucleic acid molecule of the present invention. Identify and isolate or synthesize nucleotide sequences that can Noh.   Accordingly, the present invention provides a method for determining the presence of a germline-specific nucleic acid molecule of the present invention. Wherein the sample is the nucleic acid molecule or its predetermined oligonucleotide. The fragments are treated with primers that can be amplified by the polymerase chain reaction to generate amplified sequences. Generate amplified sequences under conditions that allow for The method comprising:   The polymerase chain reaction refers to rice from Innis et al., Academic Press, 1990, Mullis et al. No. 4,863,195 and Mullis U.S. Pat. All of these references are incorporated herein by reference). Thus, it refers to a method for amplifying a target nucleic acid sequence. The conditions for the amplification of the nucleic acid template are described in M.A. Inn is and D.H. Gelfand's PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications , M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky and T.J. White, 3-12 pages, Academic Press 1989 (cited herein for reference) .   Amplification products are prepared based on their size using techniques known in the art. Can be isolated and identified. For example, after amplification, after staining with ethidium bromide, Separate and visualize DNA samples on agarose gel under external (UW) light irradiation be able to. DNA can be amplified to the desired level, and further extended To detect radiolabeled or biotin-labeled nucleoside triphosphates Nucleotide derivatives having functional markers can be introduced. Primer Can also be labeled with the detectable markers described above. The detectable marker is Analysis by restriction, electrophoretic separation or other methods known in the art. Can be   Conditions that can be employed in the method of the present invention using PCR include DNA in a sample and DNA. And hybridization in the presence of appropriate complementary hybridization primers And allow the amplification and amplification reactions to proceed. Polymer Suitable conditions for the Rose chain reaction are generally known in the art. For example, M. A. Innis and D.H. Gelfand's PCR Protocols, A Guide to Methods and Applic ations, M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky and T.J. White Edition, 3-1 See page 2, Academic Press 1989, which is incorporated herein by reference. When. Preferably, the PCR includes a thermophilic bacterium, Thermus aq. uatics) (Taq polymerase, GeneAmp Kit, Perkin E) lmer Cetus) or other thermostable polymerase to amplify the DNA template strand Can be For example, expression of the nucleic acid of the invention RNA is isolated from a known cell type or tissue and Using hybridization (eg, standard Northern analysis) or PCR Can be tested. These techniques can be used for alternative splicing, normal or abnormal. It can be used to detect the difference in transfer size due to.   The isolated molecule can be used in a method of the invention to select for germline competent cells. It can be used to prepare antibodies that can be used. For antibody preparation, The usual methods described in detail above can be used.   The following non-limiting examples illustrate the invention.                                  Example   The following materials and methods were used in the tests described in the examples:Extraction of germ-line competent cells from stage X embryos   Donor embryos were obtained from a Barred plant in which the I locus was homozygous recessive (ii). Obtained from Remus Rock. Recipient embryos have a dominant homozygous I locus (II ) Obtained from White Leghorn. Bird Plymouth Rock and White Leg The fluff color of Hong is black and yellow, respectively. These phenotypes indicate that chicks Feather color makes it easier to determine chimerism when blackened: black Chicks with colored fluff are called somatic chimeras, and chicks with yellow fluff are presumed It was called chimera. Transfer of donor- and recipient-derived cells to the germline Feeding was assessed by crossing the chimera with Bird Plymouth Rock and the reproductive system The degree of chimerism of the rows was bird-locked to the number of offspring that were White Leghorn Expressed as a ratio of the number of offspring.   Donor cells were newly generated as described by Carsience et al. (1993). Stage X blastoderm (Eyal) isolated from eggs that have been dropped and not incubated -Giladi and Kochav, 1976). Briefly, egg white is separated from yolk Blastocysts by detaching, isolating the embryo, and digesting the extracellular matrix with trypsin. Leaf cells were suspended. The cells are then containing 10% fetal bovine serum (FBS). Was washed and resuspended in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium). 2-5 100-500 cells in μl medium were injected into the subgerminal cavity of recipient embryos .   Recipient embryos should have their center plate removed or the outer edge of the embryo Physically injured by removing parts, but control embryos remained intact . Approximately half of the physically injured embryos and all control embryos should be 2 hours before it hurt physically60Irradiation of 490-680 rad g from Co source Exposed.   Donor cells were harvested from irradiated recipient embryos that were not physically damaged. All and physically damaged embryos exposed or not exposed to radiation About half of the mixture. Four days after injection, embryos were transferred to surrogate eggshells, and Etches et al. (1996b) Incubated until the period described in.Preparation of culture dishes   SNL76 / 7 mouse fibroblast feeder cells (A. Bradley, Baylor College) Gifts from The Of Medicine, Houston, Texas, USA) , 0.1% sterile bovine skin gelatin (Sigma, St. Louis, MO, USA) 1.25 x 10 on a culturing dish (Nunc, Denmark)FiveCells / cmTwoThe density of And planted. Feeder cells were transformed with 10% (v / v) fetal bovine serum (FBS) ( Cansera) Lexdale, ON, Canada), 2 mM L-glutamine (Gibco), 100 IU / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin (Gibc o) in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 5% CO at pH 7.2 and 37 ° C.Two For 24 hours.Cell dissociation   The blastoderm of Stage X is removed from the bird primrose using a sterile filter paper ring. Dulbecco's phosphate buffered saline containing 1 g / L D-glucose Isolated in Petri dishes containing water (PBS-G) (Petitte et al., 1990). Whole blastoderm Carefully wash excess yolk off the body and add 2-3 ml of PBS-G and 2% (v / v) Place Pasteur pipette into 15 ml centrifuge tube containing chicken serum (ChS) Transfer gently. The blastoderm was pooled at 2 / ml (two per ml). PB Remove SG + 2% ChS, equal volume of calcium and magnesium free phosphorus Replaced with acid buffered saline (CMF-PBS) + 2% ChS. Then the blastoderm Incubated on ice for 10 minutes. CMF-PBS was added to 0.02% EDTA (w / V) and replace with 0.05% trypsin (w / v) (Gibco) in Incubated for 10 minutes. Trypsin in 2% ChS, 4% (v / v) FBS, 100 IU / ml penicillin and 100 μg / ml streptomyces Of Opti-modified Eagle's medium I (Optimem) (Gibco) (pH 7.2) to which Replaced with ml. The blastoderm is pooled by aspirating with a 10 ml pipette, Dispersed slowly. Cell concentration was determined with a hemocytometer using a sample of the cell suspension . The dissociated cells were centrifuged at 1000 rpm for 4 minutes. Remove supernatant And the cells were resuspended in an appropriate volume of Optimem. Disperse blastoderm cells into SN 1 × 10 on L feeder cellsFiveCells / cmTwoPlating at a concentration of 5% COTwoIncubated at 37 ° C. for 1, 3, 7, or 18 hours.Measurement of immunohistochemistry   Cultured blastoderm cells and whole mounts were 4% paraformaldehyde (Sigma) And fixed at 4 ° C. for 10 minutes. The preparation was then added to 1 mg / ml bovine serum Bumin (PBS-BSA) (Boehringer Mannheim, Laval, PQ, Canada) Immersion in PBS supplemented with 5% (v / v) goat serum (Sigma) at 4 ° C. for 4 hours To saturate nonspecific binding sites. Allow the blocking solution to stand for at least 12 hours. SSEA-1, PBS-BS diluted 1: 3 in PBS-BSA while rubbing EMA-1 diluted 1:10 or HNK-1 / NC diluted 1: 2 in A -1 (Gift from C. Stern, Columbia University, New York, USA Was replaced with the supernatant from the above. SSEA-1 and EMA-1 antibody supernatant The solution to the Department of Pharmacology and Molecular Sciences, John Hopkins Un iversity School of Medicine, Baltimore, Maryland, and Department of Biological Sciences, University of Iowa, Iowa City, Iowa From Developmental Studies Hybridoma Bank, maintained by NICHD Under the contract N01-HD-6-2915. Preparation with PBS-BSA Affinity purified goat anti-mouse IgM-FI, washed twice and diluted 1:50 TC conjugate (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) (Near USA) at 4 ° C. in the dark for 2 hours. PBS-BS A, then washed twice with glycerin diluted 1: 1 with PBS Mounted and Ni with epifluorescent optics excited by a mercury lamp Emit 470-490 nm with kon Diaphot-TMD inverted microscope Observation using a filter.Cell selection using magnetic beads   The dissociated cell preparation was purified using the monoclonal antibody SSEA-1, EMA-1 or 4 at 4 ° C. with NC-1 (Immunotech, Westbrook, Maine, USA) Incubated for 5 minutes. Before incubating, try replacing P with trypsin. The blastodermal cells were isolated in the same manner as described above except that BS-ChS was used. Continued Wash cell preparation with PBS-BSA and conjugate rat anti-mouse IgM Microbeads (Miltenyi Biotec, Sunnyvale, California, USA ) With 100 μl of PBS-BSA for 30 minutes at 4 ° C did. The mixture was then washed again with 500 μl of PBS-BSA and resuspended. Was. MiniMACS steel wool separation column (type MS +: Miltenyi Biotech) Insert into magnetic system (Miltenyi Biotech) and rinse with PBS-BSA . The cell suspension was passed through the column. Unbound (negative) cells were identified as PBS-B SA washed away. Cells labeled with superparamagnetic beads show magnetic properties in a magnetic field and Cells that bind to the steel wool fibers of the ram but are unlabeled pass through the column (Mi ltenyi et al., 1990). Finally, the column is removed from the magnetic field and the bound (positive) cells Elute by rinsing with PBS-BSA. Before and after magnetic cell sorting Immunohistochemistry was performed. result:   Excision of the central and lateral areas to the irradiated or unirradiated embryo Tables 1 and 2 show the fertility of the birds derived therefrom. Egg and sperm production and conjugation It is clear that the fertility of the offspring is not affected by the method of processing the embryo. therefore The remaining germline competent cells after removal of the central region can proliferate and grow in males. Has the ability to occupy the germline with the normal number of spermatogonia and, in females, the oocyte Can be concluded.   Irradiate the bird primus rock donor cells with the central or lateral region of the embryo. Leghorn recipient injured by removal of about 500 cells from the area Table 3 shows the number of somatic and germline cell chimeras produced after injection into the embryo. 6 is shown. Somatic cell chimeras hatch with black (donor-derived) pigmentation ( See the second column of Tables 3-6). Putative chimera has black (donor-derived) pigmentation Absent. Our previous work indicates that putative chimeras are usually not germline chimeras It is shown that. Irradiate the embryo and inject approximately 500 cells into the central region of the embryo 5 (Table 3), 5 out of 9 somatic chimeras produced donor-derived progeny (Ie, they were germline chimeras). Radiation compared to this Injection of 500 cells into the lateral area of the irradiated recipient embryo Only one of the eight somatic chimeras generated produced progeny from the donor (Table 4). These data indicate that germ-line competent cells are located at the center of stage X embryos Consistent with the proposal, it has given support.   Recipient embryo damaged by removing about 500 cells from the center of the embryo Injection of bird primus rock donor cells into the central region of the Three germline chimeras were generated (Table 5). In comparison, from the side area of the embryo Injection of bird plymouth rock cells into the lateral area of the recipient with cells removed Produced only one germline chimera out of 10 somatic chimeras (Table 6). This These data also assume that germ-line competent cells are located in the central region of the embryo. Consistent with theory. In addition, cells were injured by irradiation and from the central area. The percentage of germline chimeras produced between after injury by physical removal Are the same. Irradiation of recipient embryos can increase the rate of development of recipient embryos It appears that slowing improves the rate of germline chimerism. Donna -The cells proliferate because they have not been irradiated, but in the recipient embryo Inhibition of cleavage, resulting in an increased proportion of donor recipient cells in the chimera (Carsience et al., 1993). Removal of cells from the center of the embryo is also The rate of lamination is increased (0.6% to 11.3%, Table 7). In this case, this increase Removal of germline cells from the center of the recipient and subsequent This is due to re-introduction of germ line competent cells. This interpretation is on the embryo side Very low rates of germline transfer after cell removal from the head (Table 7).Identification of germ-line competent cells by immunofluorescence detection of epitope-expressing cells Set Identification of epitope-expressing cells by immunofluorescence   Of cells expressing surface antigens recognized by EMA-1 and SSEA-1 The label was detectable in all embryos of stage X Bird Plymouth Rock (Fig. 2 and FIG. 3). Non-fluorescent cells, weakly fluorescent cells and highly A mixture of fluorescently stained cells is observed in the culture after 1, 3, 7, and 18 hours Was done. About 8%, 15% and 48% of the cells cultured for 18 hours contain EMA-1 ( 4 and 5), SSEA-1 (FIGS. 6 and 7) and HNK-1 / NC- 1 (FIGS. 8 and 9) showed high staining. SNL mouse fibroblast Cell cultures were used as negative controls. Reagent control: primary antibody was PBS-BSA Was replaced by Both cells in negative and reagent controls There was no staining. Selection of cells expressing epitopes using magnetic beads   3-fold enrichment of stage X blastoderm cells expressing the SSEA-1 epitope richment) was achieved using SSEA-1 coated microbeads. Immunity Fluorescence increased from 14% to 45% of the percentage of SSEA-1 stained cells after separation I confirmed that. As a result of immunomagnetic isolation of EMA-1 positive cells, There was a 3-fold enrichment from 8% of the cells to 28% after purification. Generates NC-1 epitope The selection of cells to appear was a two-fold increase. The percentage of NC-1 positive cells is It increased from 48% to 89% after separation. In all cases, the cells Viability was found to be greater than 94% as measured by trypan blue exclusion .   Positive and negative from MACS columns containing EMA-1, SSEA-1 and NC-1 Somatic and germline chimerism ratios and males using negative and negative fractions And the ratio of germline transmission for female chimeras are shown in Tables 8 and 9, respectively. this In these experiments, the ratio of both somatic and germline chimerism was low and the magnetic column Manipulation of cells in reduces the overall ability of the cells to contribute to recipient embryos It was showing that. Preliminary evidence for these experiments indicates that SSEA-1 and NC-1 Of the positive and negative fractions selected in This shows that the contribution to the breeding line tissue is almost equal. However, EMA-1 Cells selected by antibody showed significant contribution to germline in 2 of 3 chimeras (Table 8). These data indicate that germ-line competent cells were It shows that selection can be made using a pitope. EMA-1 using MACS Since the enrichment of sex cells was between 8% and 28% (see above), about 7% of the injected cells 2% were not EMA-1 positive.   In summary, these data indicate that a population of germ-line competent cells (E-G & K) in the central region of the embryo, and germ-line competent cells Recognizes epitopes specifically expressed by germ-line competent cells Techniques such as magnetically activated cell sorting using antibodies such as EMA-1 He supports the conclusion that it can be isolated using surgery.   Although the present invention has been described with reference to what is presently considered to be the preferred embodiment, It should be understood that the invention is not limited to these disclosed embodiments. Absent. On the contrary, the invention is intended to cover various aspects within the spirit and scope of the appended claims. It is intended to cover alterations and equivalent arrangements.   All publications, patents and patent applications are owned by these individual publications, patents and patents. To the same extent as if the license application was special and individually cited in its entirety for reference. Which is incorporated herein by reference in its entirety.   The full citations of the references mentioned below in this specification and in the Detailed Legend of the Drawings are set forth below. Raised.Table 1 . From stage X embryos that have been irradiated or from which about 500 cells have been removed Age and age range and fertilization rate of egg production of a rooster hen Table 2. From stage X embryos that have been irradiated or from which about 500 cells have been removed Mean rooster sperm concentration and fertilization rate Table 3. Test to cross somatic and putative chimeras to Bird Plymouth Rock? Of recipient-derived and donor-derived progeny of group 1-radiation Recipient embryos injected into the center with 500 donor cells injured by irradiation Table 4. Test to cross somatic and putative chimeras to Bird Plymouth Rock? Of recipient-derived and donor-derived progeny of group 2-Radiation Recipient embryos with 500 donor cells laterally injected by irradiation Table 5. From crossing cell chimeras and putative chimeras to Bird Plymouth Rock Of recipient-derived and donor-derived progeny of group 3-Central region 500 donor cells damaged by physically removing 500 cells from Embryo injected into the center of the recipient Table 6. From crossing cell chimeras and putative chimeras to Bird Plymouth Rock Of recipient-derived and donor-derived progeny of group 4-lateral region 500 donor cells damaged by physically removing 500 cells from Embryos injected laterally Table 7. Percentage of somatic chimerism expressed as% of feather black pigmentation and donor Number of offspring of origin / stage X from which irradiated or about 500 cells were removed Percentage of germline transmission expressed as total number of offspring from embryo-derived chimeras Table 8. Magnetic activity using EMA-1, SSEA-1 and NC-1 epitopes Created by injecting cells selected by automated cell sorting (MACS) Of male somatic and germline chimeras Table 9. Magnetic activity using EMA-1, SSEA-1 and NC-1 epitopes Created by injecting cells selected by automated cell sorting (MACS) Of female somatic and germline chimeras in females Drawing legend details   FIG. Embryo structure during spawning as a cross section of the embryo perpendicular to the yolk surface.   FIG. Stage X blastoderm cells cultured for 18 hours with SNL feeder cells Phase contrast illumination micrograph of a microscopic field showing expression of the EMA-1 epitope on the vesicle ( Magnification 300x).   FIG. Stage X blastoderm cells cultured for 18 hours with SNL feeder cells 1. Fluorescence micrograph of the same microscope field as in FIG. 1, showing the expression of the EMA-1 epitope on the vesicle True (300x magnification).   Figure 4. Position of the microscopic field showing the expression of the SSEA-1 epitope after 18 hours of culture. Phase contrast illumination micrograph.   FIG. 5. Same expression as in FIG. 4, showing the expression of the SSEA-1 epitope after 18 hours of culture. Fluorescence micrograph of microscopic field.   FIG. Phase of the microscope field, showing SSEA-1 expression on all mounts of stage X Differential illumination micrograph (300 × magnification).   FIG. 1. Same micrograph as in FIG. 1, showing SSEA-1 expression on all mounts of stage X. Fluorescent micrograph of a mirror field (300 × magnification).   Figure 8. HNK-1 / NC-1 development on stage X blastoderm cells after 18 hours of culture A phase contrast illumination micrograph of the microscope field showing the present.   Figure 9. HNK-1 / NC-1 development on stage X blastoderm cells after 18 hours of culture Fluorescent micrograph of the same microscope field showing the present.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, M W, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY) , KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM , AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, E S, FI, GB, GE, GH, GM, GW, HU, ID , IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, M G, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT , RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, V N, YU, ZW

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．生殖系列コンピテント細胞により発現されたエピトープが細胞表面に結合 した細胞をステージＸ（E-G & K）のニワトリ胚から分離することからなる、ス テージＸ（E-G & K）のニワトリ胚で生殖系列コンピテント細胞を選択する方法 。 ２．該エピトープに結合する物質をニワトリ胚細胞と反応させ、該物質と、該 エピトープが細胞表面に結合した生殖系列コンピテント細胞との間でコンジュゲ ートを生成させ、ついで該コンジュゲートを単離して生殖系列コンピテント細胞 を含む細胞調製物を得る、ことを含む、請求項１に記載の方法。 ３．該エピトープに結合する該物質が抗体である、請求項２に記載の方法。 ４．該抗体がマグネチックビーズに直接または間接的にコンジュゲートしてい る、請求項３に記載の方法。 ５．該エピトープがＥＭＡ−１である、請求項１に記載の方法。 ６．該エピトープがＳＳＥＡ−１である、請求項１に記載の方法。 ７．（ａ）ステージＸ（E-G & K）のニワトリ胚から単離した生殖系列コンピ テント細胞を用意し、（ｂ）該生殖系列コンピテント細胞を、胚の中心板部分を 除去したレシピエントのステージＸ（E-G & K）のニワトリ胚中に導入し、つい で（ｃ）該レシピエント胚をインキュベートしてキメラ胚を産生する、ことから なる、キメラニワトリ胚の製造方法。 ８．生殖系列コンピテント細胞の単離を、該生殖系列コンピテント細胞により 発現されるエピトープに結合する物質とステージＸ（E-G & K）のニワトリ胚細 胞とを反応させ、該物質と該エピトープが細胞表面に結合した該生殖系列コンピ テント細胞との間でコンジュゲートを生成させ、ついで該コンジュゲートを除去 して生殖系列コンピテント細胞を含む細胞調製物を単離することにより行う、請 求項７に記載の方法。 ９．該生殖系列コンピテント細胞をレシピエント中に導入する前に、該細胞を 、外来遺伝子および該遺伝子の転写および翻訳に必要な要素を含む組換え発現ベ クターでトランスフェクトすることをさらに含む、請求項７に記載の方法。 １０．該エピトープに結合する該物質が抗体である、請求項７に記載の方法。 １１．該エピトープがＥＭＡ−１である、請求項７に記載の方法。 １２．該エピトープがＳＳＥＡ−１である、請求項７に記載の方法。 １３．レシピエント胚の中心板部分を物理的方法を用いて除去する、請求項７ に記載の方法。 １４．レシピエント胚の中心板部分を、毒素に結合させた生殖系列コンピテン ト細胞に結合する抗体を用いて除去する、請求項７に記載の方法。 １５．中心板部分を除去する前にレシピエント胚を放射線照射する、請求項７ に記載の方法。 １６．（ａ）生殖系列コンピテント細胞によって発現されるエピトープに直接 または間接的に結合する物質で胚を処理し、その際、該物質は検出可能なマーカ ーで標識されており、ついで（ｂ）該検出可能なマーカーにより産生された検出 可能な変化を検出して、生殖系列コンピテント細胞を含む胚中の領域を同定する 、ことからなる、生殖系列コンピテント細胞を含む胚中の領域の同定方法。 １７．該物質が抗体である、請求項１６に記載の方法。 １８．該エピトープがＥＭＡ−１である、請求項１６に記載の方法。 １９．該エピトープがＳＳＥＡ−１である、請求項１６に記載の方法。[Claims]   1. Epitopes expressed by germ-line competent cells bind to the cell surface The isolated cells from stage X (E-G & K) chicken embryos. Method for selecting germ-line competent cells in chick embryos of tage X (E-G & K) .   2. Reacting a substance that binds to the epitope with chicken embryo cells, Conjugation between germ-line competent cells with the epitope bound to the cell surface The conjugate is then isolated and germline competent cells are isolated. 2. The method of claim 1, comprising obtaining a cell preparation comprising:   3. 3. The method according to claim 2, wherein the substance that binds to the epitope is an antibody.   4. The antibody is conjugated directly or indirectly to magnetic beads. 4. The method of claim 3, wherein   5. 2. The method according to claim 1, wherein said epitope is EMA-1.   6. 2. The method of claim 1, wherein said epitope is SSEA-1.   7. (A) Germline compilation isolated from stage X (E-G & K) chicken embryo A tent cell is prepared, and (b) the germ-line competent cells are Introduced into the stage X (E-G & K) chicken embryo of the removed recipient (C) incubating the recipient embryo to produce a chimeric embryo, A method for producing a chimeric chicken embryo.   8. The isolation of the germ-line competent cells is performed by the germ-line competent cells. Substances that bind to the expressed epitope and stage X (E-G & K) chicken embryo cells Germline cells in which the substance and the epitope are bound to the cell surface. Generate conjugate with tent cells, then remove conjugate By isolating a cell preparation containing germ-line competent cells The method of claim 7.   9. Prior to introducing the germ-line competent cells into a recipient, the cells are , A recombinant expression vector containing a foreign gene and elements necessary for the transcription and translation of the gene. 8. The method of claim 7, further comprising transfecting with a vector.   10. The method according to claim 7, wherein the substance that binds to the epitope is an antibody.   11. The method according to claim 7, wherein the epitope is EMA-1.   12. 8. The method of claim 7, wherein said epitope is SSEA-1.   13. 8. The method of claim 7, wherein the center plate portion of the recipient embryo is removed using a physical method. The method described in.   14． A germline competency with the central plate of the recipient embryo The method according to claim 7, wherein the antibody is removed by using an antibody that binds to a cell.   15. 8. The recipient embryo is irradiated before removing the center plate portion. The method described in.   16. (A) direct to epitopes expressed by germline competent cells Alternatively, treating the embryo with a substance that binds indirectly, wherein the substance is a detectable marker And (b) detection produced by the detectable marker. Detect possible changes to identify regions in the embryo that contain germline competent cells A method for identifying a region in an embryo containing germ-line competent cells.   17． 17. The method according to claim 16, wherein said substance is an antibody.   18. 17. The method of claim 16, wherein said epitope is EMA-1.   19. 17. The method of claim 16, wherein said epitope is SSEA-1.
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