【発明の詳細な説明】
分泌蛋白およびそれらをコードするポリヌクレオチド
本願は、1997年3月11日出願の第60/XXXXXX号(仮出願でない
第08/815381号から仮出願に変更された)の一部継続出願であり、参照
によりそれらすべてを本明細書に記載されているものとみなす。
発明の分野
本発明は新規なポリヌクレオチドおよびかかるポリヌクレオチドによりコード
される蛋白、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよび蛋白に関する治療的、診
断的および研究的有用性を提供する。
発明の背景
蛋白性因子(例えば、リンホカイン、インターフェロン、CSFsおよびイン
ターロイキンのごときサイトカインを含む)の発見を目的とした方法はこの10
年間に急速に成熟した。現在では常套的なハイブリダイゼーションクローニング
および発現クローニング法は、発見された蛋白に直接関連した情報(すなわち、
ハイブリダイゼーションクローニングの場合には蛋白の部分DNA/アミノ酸配
列;発現クローニングの場合には蛋白の活性)に依存するという意味において、
新規ポリペプチドを「直接的に」クローン化する。シグナル配列クローニング(
現在よく認識されている分泌リーダー配列モチーフの存在に基づいてDNA配列
を単離する)、ならびに種々のPCRによるあるいは低い厳密性によるハイブリ
ダイゼーションクローニング法のごとき、より最近の「間接的」クローニング法
は、リーダー配列のクローニングの場合には分泌されるという性質により、ある
いはPCRによる方法の場合には細胞または組織源により、生物学的活性を有す
ることが知られている蛋白に関する多数のDNA/アミノ酸配列を使用可能にす
ることによって現状を進歩させてきた。本発明はこれらの蛋白およびそれらをコ
ードするポリヌクレオチドに指向さ
れるものである。
発明の概要
1の具体例において、本発明は、下記のものからなる群より選択される単離ポ
リヌクレオチドを含む組成物を提供する:
(a)配列番号:1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号:1のヌクレオチド521からヌクレオチド1111までのヌ
クレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(c)配列番号:1のヌクレオチド536からヌクレオチド817までのヌク
レオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(d)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンax318 3
の全長蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(e)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンax318 3
のcDNAインサートによりコードされる全長蛋白をコードしているポリヌクレ
オチド;
(f)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンax318 3
の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(g)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンax318 3
のcDNAインサートによりコードされる成熟蛋白をコードしているポリヌクレ
オチド;
(h)配列番号:2のアミノ酸配列を含む蛋白をコードしているポリヌクレオ
チド;
(i)生物学的活性を有する配列番号:2のアミノ酸配列のフラグメントを含
む蛋白をコードしているポリヌクレオチド(該フラグメントは配列番号:2のア
ミノ酸93からアミノ酸102までのアミノ酸配列を含む);
(j)上記(a)〜(g)のポリヌクレオチドの対立遺伝子変種であるポリヌ
クレオチド;
(k)上記(h)または(i)の蛋白の種相同体をコードしているポリヌクレ
オ
チド;および
(l)厳密な条件下で(a)〜(i)に示すポリヌクレオチドのいずれか1つ
にハイブリダイゼーションしうるポリヌクレオチド。
好ましくは、かかるポリヌクレオチドは、配列番号:1のヌクレオチド521
からヌクレオチド1111までのヌクレオチド配列;配列番号:1のヌクレオチ
ド536からヌクレオチド817までのヌクレオチド配列;受託番号ATCC9
8353として寄託されたクローンax318 3の全長蛋白コーディング配列
のヌクレオチド配列;または受託番号ATCC98353として寄託されたクロ
ーンax318 3の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含む。他
の好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、受託番号ATCC98353
として寄託されたクローンax318 3のcDNAインサートによりコードさ
れる全長または成熟蛋白をコードする。さらなる他の好ましい具体例において、
本発明は、配列番号:2のアミノ酸4からアミノ酸99までのアミノ酸配列を含
む蛋白をコードするポリヌクレオチドを提供する。
他の具体例は配列番号:1のcDNA配列に対応する遺伝子を提供する。
他の具体例において、本発明は、蛋白を含む組成物であって、該蛋白が、
(a)配列番号:2のアミノ酸配列;
(b)配列番号:2のアミノ酸4からアミノ酸99までのアミノ酸配列;
(c)配列番号:2のアミノ酸93からアミノ酸102までのアミノ酸配列を
含む、配列番号:2のアミノ酸配列のフラグメント;および
(d)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンax318 3
のcDNAインサートによりコードされるアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものであり、他の哺乳動物蛋白を
実質的に含まないものである組成物を提供する。好ましくは、かかる蛋白は配列
番号:2のアミノ酸配列または配列番号:2のアミノ酸4からアミノ酸99まで
のアミノ酸配列を含む。
1の具体例において、本発明は、下記のものからなる群から選択される単離ポ
リヌクレオチドを含む組成物を提供する:
(a)配列番号:3のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号:3のヌクレオチド61からヌクレオチド864までを含むポ
リヌクレオチド;
(c)配列番号:3のヌクレオチド826からヌクレオチド1386までを含
むポリヌクレオチド;
(d)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンbg140 1
の全長蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(e)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンbg140 1
のcDNAインサートによりコードされる全長蛋白をコードするポリヌクレオチ
ド;
(f)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンbg140 1
の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(g)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンbg140 1
のcDNAインサートによりコードされる成熟蛋白をコードするポリヌクレオチ
ド;
(h)配列番号:4のアミノ酸配列を含む蛋白をコードするポリヌクレオチド
;
(i)生物学的活性を有する配列番号:4のアミノ酸配列のフラグメントを含
む蛋白をコードするポリヌクレオチド(該フラグメントは配列番号:4のアミノ
酸129からアミノ酸138までのアミノ酸配列を含む);
(j)上記(a)〜(g)のポリヌクレオチドの対立遺伝子変種であるポリヌ
クレオチド;
(k)上記(h)または(i)の蛋白の種相同体をコードするポリメクレオチ
ド;および
(l)厳密な条件下で(a)〜(i)に示すポリヌクレオチドのいずれか1つ
にハイブリダイゼーションしうるポリヌクレオチド。
好ましくは、かかるポリヌクレオチドは、配列番号:3のヌクレオチド61か
らヌクレオチド864までのヌクレオチド配列;配列番号:3のヌクレオチド8
26からヌクレオチド1386までのヌクレオチド配列;受託番号ATCC98
353として寄託されたクローンbg140 1の全長蛋白コーディング配列の
ヌクレオチド配列;または受託番号ATCC98353として寄託されたクロー
ンbg140 1の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含む。他の
好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、受託番号ATCC98353と
して寄託されたクローンbg140 1のcDNAインサートによりコードされ
る全長または成熟蛋白をコードする。さらなる他の好ましい具体例において、本
発明は、配列番号:31のアミノ酸148からアミノ酸249までのアミノ酸配
列を含む蛋白をコードしているポリヌクレオチドを提供する。
他の具体例は、配列番号:3のcDNA配列に対応する遺伝子を提供する。
他の具体例において、本発明は、蛋白を含む組成物であって、該蛋白が、
(a)配列番号:4のアミノ酸配列;
(b)配列番号:31のアミノ酸配列;
(c)配列番号:31のアミノ酸148からアミノ酸249までのアミノ酸配
列;
(d)配列番号:4のアミノ酸129からアミノ酸138までのアミノ酸配列
を含む、配列番号:4のアミノ酸配列のフラグメント;
(e)配列番号:31のアミノ酸163からアミノ酸172までのアミノ酸配
列を含む、配列番号:31のアミノ酸配列のフラグメント;および
(f)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンbg140 1
のcDNAインサートによりコードされるアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものであり、他の哺乳動物蛋白を
実質的に含まないものである組成物を提供する。好ましくは、かかる蛋白は配列
番号:4のアミノ酸配列、配列番号:31のアミノ酸配列、または配列番号:3
1のアミノ酸148からアミノ酸249までのアミノ酸配列を含む。
1の具体例において、本発明は、下記のものからなる群から選択される単離ポ
リヌクレオチドを含む組成物を提供する:
(a)配列番号:5のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号:5のヌクレオチド77からヌクレオチド1624までのヌク
レオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(c)配列番号:5のヌクレオチド390からヌクレオチド789までのヌク
レオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(d)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンbg465 2
の全長蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(e)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンbg465 2
のcDNAインサートによりコードされる全長蛋白をコードしているポリヌクレ
オチド;
(f)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンbg465 2
の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(g)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンbg465 2
のcDNAインサートによりコードされる成熟蛋白をコードしているポリヌクレ
オチド;
(h)配列番号:6のアミノ酸配列を含む蛋白をコードしているポリヌクレオ
チド;
(i)生物学的活性を有する配列番号:6のアミノ酸配列のフラグメントを含
む蛋白をコードしているポリヌクレオチド(該フラグメントは配列番号:6のア
ミノ酸253からアミノ酸262までのアミノ酸配列を含む);
(j)上記(a)〜(g)のポリヌクレオチドの対立遺伝子変種であるポリヌ
クレオチド;
(k)上記(h)または(i)の蛋白の種相同体をコードしているポリヌクレ
オチド;および
(l)厳密な条件下で(a)〜(i)に示すポリヌクレオチドのいずれか1つ
にハイブリダイゼーションしうるポリヌクレオチド。
好ましくは、かかるポリヌクレオチドは、配列番号:5のヌクレオチド77か
らヌクレオチド1624までのヌクレオチド配列;配列番号:5のヌクレオチド
390からヌクレオチド789までのヌクレオチド配列;受託番号ATCC98
353として寄託されたクローンbg465 2の全長蛋白コーディング配列の
ヌクレオチド配列;または受託番号ATCC98353として寄託されたクロー
ンbg465 2の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含む。他の
好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、受託番号ATCC
98353として寄託されたクローンbg465 2のcDNAインサードによ
りコードされる全長または成熟蛋白をコードする。さらなる他の好ましい具体例
において、本発明は、配列番号:6のアミノ酸260からアミノ酸343までの
アミノ酸配列を含む蛋白をコードするポリヌクレオチドを提供する。
他の具体例は配列番号:5のcDNA配列に対応する遺伝子を提供する。
他の具体例において、本発明は、蛋白を含む組成物であって、該蛋白が、
(a)配列番号:6のアミノ酸配列;
(b)配列番号:6のアミノ酸260からアミノ酸343までのアミノ酸配列
:
(c)配列番号:6のアミノ酸253からアミノ酸262までのアミノ酸配列
を含む、配列番号:6のアミノ酸配列のフラグメント;および
(d)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンbg465 2
のcDNAインサートによりコードされるアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものであり、他の哺乳動物蛋白を
実質的に含まないものである組成物を提供する。好ましくは、かかる蛋白は、配
列番号:6のアミノ酸配列または配列番号:6のアミノ酸260からアミノ酸3
43までのアミノ酸配列を含む。
1の具体例において、本発明は、下記のものからなる群から選択される単離ポ
リヌクレオチドを含む組成物を提供する:
(a)配列番号:7のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号:7のヌクレオチド48からヌクレオチド1055までのヌク
レオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(c)配列番号:7のヌクレオチド216からヌクレオチド1055までのヌ
クレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(d)配列番号:7のヌクレオチド494からヌクレオチド958までのヌク
レオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(e)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンbk291 3
の全長蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(f)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンbk291 3
の
cDNAインサートによりコードされる全長蛋白をコードしているポリヌクレオ
チド;
(g)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンbk291 3
の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(h)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンbk291 3
のcDNAインサートによりコードされる成熟蛋白をコードしているポリヌクレ
オチド;
(i)配列番号:8のアミノ酸配列を含む蛋白をコードしているポリヌクレオ
チド;
(j)生物学的活性を有する配列番号:8のアミノ酸配列のフラグメントを含
む蛋白をコードしているポリヌクレオチド(該フラグメントは配列番号:8のア
ミノ酸85からアミノ酸94までのアミノ酸配列を含む);
(k)上記(a)〜(h)のポリヌクレオチドの対立遺伝子変種であるポリヌ
クレオチド;
(l)上記(i)または(j)の蛋白の種相同体をコードしているポリヌクレ
オチド;および
(m)厳密な条件下で(a)〜(j)に示すポリヌクレオチドのいずれか1つ
にハイブリダイゼーションしうるポリヌクレオチド。
好ましくは、かかるポリヌクレオチドは、配列番号:7のヌクレオチド48か
らヌクレオチド1055までのヌクレオチド配列;配列番号:7のヌクレオチド
216からヌクレオチド1055までのヌクレオチド配列;配列番号:7のヌク
レオチド494からヌクレオチド958までのヌクレオチド配列;受託番号AT
CC98353として寄託されたクローンbk291 3の全長蛋白コーディン
グ配列のヌクレオチド配列;または受託番号ATCC98353として寄託され
たクローンbk291 3の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含
む。他の好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、受託番号ATCC98
353として寄託されたクローンbk291 3のcDNAインサートによりコ
ードされる全長または成熟蛋白をコードする。さらなる他の好ましい具体例にお
いて、本発明は、配列番号:8のアミノ酸188からアミノ酸306までのアミ
ノ酸配列を含む蛋白をコードするポリヌクレオチドを提供する。
他の具体例は配列番号:7のcDNA配列に対応する遺伝子を提供する。
他の具体例において、本発明は、蛋白を含む組成物であって、該蛋白が、
(a)配列番号:8のアミノ酸配列;
(b)配列番号:8のアミノ酸188からアミノ酸306までのアミノ酸配列
;
(c)配列番号:8のアミノ酸85からアミノ酸94までのアミノ酸配列を含
む、配列番号:8のアミノ酸配列のフラグメント;および
(d)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンbk291 3
のcDNAインサートによりコードされるアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものであり、他の哺乳動物蛋白を
実質的に含まないものである組成物を提供する。好ましくは、かかる蛋白は、配
列番号:8のアミノ酸配列または配列番号:8のアミノ酸配列188からアミノ
酸306までのアミノ酸配列を含む。
1の具体例において、本発明は、下記のものからなる群から選択される単離ポ
リヌクレオチドを含む組成物を提供する:
(a)配列番号:9のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号:9のヌクレオチド64からヌクレオチド1197までのヌク
レオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(c)配列番号:9のヌクレオチド1からヌクレオチド828までのヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチド;
(d)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンbp537 4
の全長蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(e)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンbp537 4
のcDNAインサートによりコードされる全長蛋白をコードしているポリヌクレ
オチド;
(f)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンbp537 4
の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(g)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンbp53T 4
のcDNAインサートによりコードされる成熟蛋白をコードしているポリヌクレ
オチド;
(h)配列番号:10のアミノ酸配列を含む蛋白をコードしているポリヌクレ
オチド;
(i)生物学的活性を有する配列番号:10のアミノ酸配列のフラグメントを
含む蛋白をコードしているポリヌクレオチド(該フラグメントは配列番号:10
のアミノ酸184からアミノ酸193までのアミノ酸配列を含む);
(j)上記(a)〜(g)のポリヌクレオチドの対立遺伝子変種であるポリヌ
クレオチド;
(k)上記(h)または(i)の蛋白の種相同体をコードしているポリヌクレ
オチド;および
(i)厳密な条件下で(a)〜(i)に示すポリヌクレオチドのいずれか1つ
にハイブリダイゼーションしうるポリヌクレオチド。
好ましくは、かかるポリヌクレオチドは、配列番号:9のヌクレオチド64か
らヌクレオチド1197までのヌクレオチド配列;配列番号:9のヌクレオチド
1からヌクレオチド828までのヌクレオチド配列;受託番号ATCC9835
3として寄託されたクローンbp537 4の全長蛋白コーディング配列のヌク
レオチド配列;または受託番号ATCC98353として寄託されたクローンb
p537 4の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含む。他の好ま
しい具体例において、ポリヌクレオチドは、受託番号ATCC98353として
寄託されたクローンbp537 4のcDNAインサートによりコードされる全
長または成熟蛋白をコードする。さらなる他の好ましい具体例において、本発明
は、配列番号:10のアミノ酸1からアミノ酸255までのアミノ酸配列を含む
蛋白をコードするポリヌクレオチドを提供する。
他の具体例は配列番号:9のcDNA配列に対応する遺伝子を提供する。
他の具体例において、本発明は、蛋白を含む組成物であって、該蛋白が、
(a)配列番号:10のアミノ酸配列;
(b)配列番号:10のアミノ酸1からアミノ酸255までのアミノ酸配列;
(c)配列番号:10のアミノ酸184からアミノ酸193までのアミノ酸配
列を含む、配列番号:10のアミノ酸配列のフラグメント;および
(d)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンbp537 4
のcDNAインサートによりコードされるアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものであり、他の哺乳動物蛋白を
実質的に含まないものである組成物を提供する。好ましくは、かかる蛋白は配列
番号:10のアミノ酸配列または配列番号:10のアミノ酸1からアミノ酸25
5までのアミノ酸配列を含む。
1の具体例において、本発明は、下記のものからなる群から選択される単離ポ
リヌクレオチドを含む組成物を提供する:
(a)配列番号:11のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号:11のヌクレオチド581からヌクレオチド1534までの
ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(c)配列番号:11のヌクレオチド928からヌクレオチド1510までの
ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(d)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンcs431 2
の全長蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(e)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンcs431 2
のcDNAインサートによりコードされる全長蛋白をコードしているポリヌクレ
オチド;
(f)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンcs431 2
の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(g)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンcs431 2
のcDNAインサートによりコードされる成熟蛋白をコードしているポリヌクレ
オチド;
(h)配列番号:12のアミノ酸配列を含む蛋白をコードしているポリヌクレ
オチド;
(i)生物学的活性を有する配列番号:12のアミノ酸配列のフラグメントを
含む蛋白をコードしているポリヌクレオチド(該フラグメントは配列番号:12
のアミノ酸154からアミノ酸163までのアミノ酸配列を含む);
(j)上記(a)〜(g)のポリヌクレオチドの対立遺伝子変種であるポリヌ
クレオチド;
(k)上記(h)または(i)の蛋白の種相同体をコードしているポリヌクレ
オチド;および
(l)厳密な条件下で(a)〜(i)に示すポリヌクレオチドのいずれか1つ
にハイブリダイゼーションしうるポリヌクレオチド。
好ましくは、かかるポリヌクレオチドは、配列番号:11のヌクレオチド58
1からヌクレオチド1534までのヌクレオチド配列;配列番号:11のヌクレ
オチド928からヌクレオチド1510までのヌクレオチド配列;受託番号AT
CC98353として寄託されたクローンcs431 2の全長蛋白コーディン
グ配列のヌクレオチド配列;または受託番号ATCC98353として寄託され
たクローンcs431 2の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含
む。他の好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、受託番号ATCC98
353として寄託されたクローンcs431 2のcDNAインサートによりコ
ードされる全長または成熟蛋白をコードする。さらなる好ましい具体例において
、本発明は、配列番号:12のアミノ酸150からアミノ酸310までのアミノ
酸配列を含む蛋白をコードするポリヌクレオチドを提供する。
他の具体例は配列番号:11のcDNA配列に対応する遺伝子を提供する。
他の具体例において、本発明は、蛋白を含む組成物であって、該蛋白が、
(a)配列番号:12のアミノ酸配列;
(b)配列番号:12のアミノ酸150からアミノ酸310までのアミノ酸配
列;
(c)配列番号:12のアミノ酸154からアミノ酸163までのアミノ酸配
列を含む、配列番号:12のアミノ酸配列のフラグメント;および
(d)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンcs431 2
のcDNAインサートによりコードされるアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものであり、他の哺乳動物蛋白を
実質的に含まないものである組成物を提供する。好ましくは、かかる蛋白は、配
列番号:12のアミノ酸配列または配列番号:12のアミノ酸150からアミノ
酸310までのアミノ酸配列を含む。
1の具体例において、本発明は、下記のものからなる群から選択される単離ポ
リヌクレオチドを含む組成物を提供する:
(a)配列番号:13のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号:13のヌクレオチド29からヌクレオチド2227までのヌ
クレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(c)配列番号:13のヌクレオチド1334からヌクレオチド2227まで
のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(d)配列番号:13のヌクレオチド1からヌクレオチド746までのヌクレ
オチド配列を含むポリヌクレオチド;
(e)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンcw976 1
の全長蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(f)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンcw976 1
のcDNAインサートによりコードされる全長蛋白をコードしているポリヌクレ
オチド;
(g)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンcw976 1
の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(h)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンcw976 1
のcDNAインサートによりコードされる成熟蛋白をコードしているポリヌクレ
オチド;
(i)配列番号:14のアミノ酸配列を含む蛋白をコードしているポリヌクレ
オチド;
(j)生物学的活性を有する配列番号:14のアミノ酸配列のフラグメントを
含む蛋白をコードしているポリヌクレオチド(該フラグメントは配列番号:14
のアミノ酸361からアミノ酸370までのアミノ酸配列を含む);
(k)上記(a)〜(h)のポリヌクレオチドの対立遺伝子変種であるポリヌ
クレオチド;
(l)上記(i)または(j)の蛋白の種相同体をコードしているポリヌクレ
オチド;および
(m)厳密な条件下で(a)〜(j)に示すポリヌクレオチドのいずれか1つ
にハイブリダイゼーションしうるポリヌクレオチド。
好ましくは、かかるポリヌクレオチドは、配列番号:13のヌクレオチド29
からヌクレオチド2227までのヌクレオチド配列;配列番号:13のヌクレオ
チド1334からヌクレオチド2227までのヌクレオチド配列;配列番号:1
3のヌクレオチド1からヌクレオチド746までのヌクレオチド配列;受託番号
ATCC98353として寄託されたクローンcw976 1の全長蛋白コーデ
ィング配列のヌクレオチド配列;または受託番号ATCC98353として寄託
されたクローンcw976 1の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列
を含む。他の好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、受託番号ATCC
98353として寄託されたクローンcw976 1のcDNAインサートによ
りコードされる全長または成熟蛋白をコードする。さらなる好ましい具体例にお
いて、本発明は、配列番号:14のアミノ酸1からアミノ酸239までのアミノ
酸配列を含む蛋白をコードするポリヌクレオチド、または配列番号:14のアミ
ノ酸119からアミノ酸733までのアミノ酸配列を含む蛋白をコードするポリ
ヌクレオチドを提供する。
他の具体例は配列番号:13のcDNA配列に対応する遺伝子を提供する。
他の具体例において、本発明は、蛋白を含む組成物であって、該蛋白が、
(a)配列番号:14のアミノ酸配列;
(b)配列番号:14のアミノ酸1からアミノ酸239までのアミノ酸配列;
(c)配列番号:14のアミノ酸119からアミノ酸733までのアミノ酸配
列;
(d)配列番号:14のアミノ酸361からアミノ酸370までのアミノ酸配
列を含む、配列番号:14のアミノ酸配列のフラグメント;および
(e)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンcw976 1
の
cDNAインサートによりコードされるアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものであり、他の哺乳動物蛋白を
実質的に含まないものである組成物を提供する。好ましくは、かかる蛋白は、配
列番号:14のアミノ酸配列、配列番号:14のアミノ酸1からアミノ酸239
までのアミノ酸配列、または配列番号:14のアミノ酸119からアミノ酸73
3までのアミノ酸配列を含む。
1の具体例において、本発明は、下記のものからなる群から選択される単離ポ
リヌクレオチドを含む組成物を提供する:
(a)配列番号:15のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号:15のヌクレオチド364からヌクレオチド777までのヌ
クレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(c)配列番号:15のヌクレオチド1からヌクレオチド636までのヌクレ
オチド配列を含むポリヌクレオチド;
(d)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンcw1233
3の全長蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(e)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンcw1233
3のcDNAインサートによりコードされる全長蛋白をコードしているポリヌク
レオチド;
(f)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンcw1233
3の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(g)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンcw1233
3のcDNAインサートによりコードされる成熟蛋白をコードしているポリヌク
レオチド;
(h)配列番号:16のアミノ酸配列を含む蛋白をコードしているポリヌクレ
オチド;
(i)生物学的活性を有する配列番号:16のアミノ酸配列のフラグメントを
含む蛋白をコードしているポリヌクレオチド(該フラグメントは配列番号:16
のアミノ酸64からアミノ酸73までのアミノ酸配列を含む);
(j)上記(a)〜(g)のポリヌクレオチドの対立遺伝子変種であるポリヌ
クレオチド;
(k)上記(h)または(i)の蛋白の種相同体をコードしているポリヌクレ
オチド;および
(l)厳密な条件下で(a)〜(i)に示すポリヌクレオチドのいずれか1つ
にハイブリダイゼーションしうるポリヌクレオチド。
好ましくは、かかるポリヌクレオチドは、配列番号:15のヌクレオチド36
4からヌクレオチド777までのヌクレオチド配列;配列番号:15のヌクレオチ
ド1からヌクレオチド636までのヌクレオチド配列;受託番号ATCC983
53として寄託されたクローンcw1233 3の全長蛋白コーディング配列の
ヌクレオチド配列;または受託番号ATCC98353として寄託されたクロー
ンcw1233 3の成熟蛋白コー-ディング配列のヌクレオチド配列を含む。
他の好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、受託番号ATCC9835
3として寄託されたクローンcw1233 3のcDNAインサートによりコー
ドされる全長または成熟蛋白をコードする。さらなる他の好ましい具体例におい
て、本発明は、配列番号:16のアミノ酸1からアミノ酸91までのアミノ酸配
列を含む蛋白をコードするポリヌクレオチドを提供する。
他の具体例は配列番号:15のcDNA配列に対応する遺伝子を提供する。
他の具体例において、本発明は、蛋白を含む組成物であって、該蛋白が、
(a)配列番号:16のアミノ酸配列;
(b)配列番号:16のアミノ酸1からアミノ酸91までのアミノ酸配列;
(c)配列番号:16のアミノ酸64からアミノ酸73までのアミノ酸配列を
含む、配列番号:16のアミノ酸配列のフラグメント;および
(d)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンcw1233
3のcDNAインサートによりコードされるアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものであり、他の哺乳動物蛋白を
実質的に含まないものである組成物を提供する。好ましくは、かかる蛋白は配列
番号:16のアミノ酸配列または配列番号:16のアミノ酸1からアミノ酸91
までのア
ミノ酸配列を含む。
1の具体例において、本発明は、下記のものからなる群から選択される単離ポ
リヌクレオチドを含む組成物を提供する:
(a)配列番号:17のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号:17のヌクレオチド619からヌクレオチド1434までの
ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(c)配列番号:17のヌクレオチド520からヌクレオチド1323までの
ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(d)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンdg1 1の全
長蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(e)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンdgl 1のc
DNAインサートによりコードされる全長蛋白をコードしているポリヌクレオチ
ド;
(f)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンdg1 1の成
熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(g)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンdg1 1のc
DNAインサートによりコードされる成熟蛋白をコードしているポリヌクレオチ
ド;
(h)配列番号:18のアミノ酸配列を含む蛋白をコードしているポリヌクレ
オチド;
(i)生物学的活性を有する配列番号:18のアミノ酸配列のフラグメントを
含む蛋白をコードしているポリヌクレオチド(該フラグメントは配列番号:18
のアミノ酸131からアミノ酸140までのアミノ酸配列を含む);
(j)上記(a)〜(g)のポリヌクレオチドの対立遺伝子変種であるポリヌ
クレオチド;
(k)上記(h)または(i)の蛋白の種相同体をコードしているポリヌクレ
オチド;および
(l)厳密な条件下で(a)〜(i)に示すポリヌクレオチドのいずれか1つ
に
ハイブリダイゼーションしうるポリヌクレオチド。
好ましくは、かかるポリヌクレオチドは、配列番号:17のヌクレオチド61
9からヌクレオチド1434までのヌクレオチド配列;配列番号:17のヌクレ
オチド520からヌクレオチド1323までのヌクレオチド配列;受託番号AT
CC98353として寄託されたクローンdg1 1の全長蛋白コーディング配
列のヌクレオチド配列;または受託番号ATCC98353として寄託されたク
ローンdg1 1の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含む。他の
好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、受託番号ATCC98353と
して寄託されたクローンdg1 1のcDNAインサートによりコードされる全
長または成熟蛋白をコードする。さらなる他の好ましい具体例において、本発明
は、配列番号:18のアミノ酸1からアミノ酸235までのアミノ酸配列を含む
蛋白をコードするポリヌクレオチドを提供する。
他の具体例は配列番号:17のcDNA配列に対応する遺伝子を提供する。
他の具体例において、本発明は、蛋白を含む組成物であって、該蛋白が、
(a)配列番号:18のアミノ酸配列;
(b)配列番号:18のアミノ酸1からアミノ酸235までのアミノ酸配列;
(c)配列番号:18のアミノ酸131からアミノ酸140までのアミノ酸配
列を含む、配列番号:18のアミノ酸配列のフラグメント;および
(d)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンdgl 1のc
DNAインサートによりコードされるアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものであり、他の哺乳動物蛋白を
実質的に含まないものである組成物を提供する。好ましくは、かかる蛋白は、配
列番号:18のアミノ酸配列または配列番号:18のアミノ酸1からアミノ酸2
35までのアミノ酸配列を含む。
1の具体例において、本発明は、下記のものからなる群から選択される単離ポ
リヌクレオチドを含む組成物を提供する:
(a)配列番号:19のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号:19のヌクレオチド2063からヌクレオチド2290まで
の
ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(c)配列番号:19のヌクレオチド2276からヌクレオチド2290まで
のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(d)配列番号:19のヌクレオチド2037からヌクレオチド2405まで
のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(e)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンep234 1
の全長蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(f)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンep234 1
のcDNAインサートによりコードされる全長蛋白をコードしているポリヌクレ
オチド;
(g)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンep234 1
の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(h)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンep234 1
のcDNAインサートによりコードされる成熟蛋白をコードしているポリヌクレ
オチド;
(i)配列番号:20のアミノ酸配列を含む蛋白をコードしているポリヌクレ
オチド;
(j)生物学的活性を有する配列番号:20のアミノ酸配列のフラグメントを
含む蛋白をコードしているポリヌクレオチド(該フラグメントは配列番号:20
のアミノ酸33からアミノ酸42までのアミノ酸配列を含む);
(k)上記(a)〜(h)のポリヌクレオチドの対立遺伝子変種であるポリヌ
クレオチド;
(l)上記(i)または(j)の蛋白の種相同体をコードしているポリヌクレ
オチド;および
(m)厳密な条件下で(a)〜(j)に示すポリヌクレオチドのいずれか1つ
にハイブリダイゼーションしうるポリヌクレオチド。
好ましくは、かかるポリヌクレオチドは、配列番号:19のヌクレオチド20
63からヌクレオチド2290までのヌクレオチド配列;配列番号:19のヌ
クレオチド2276からヌクレオチド2290までのヌクレオチド配列;配列番
号:19のヌクレオチド2037からヌクレオチド2405までのヌクレオチド
配列;受託番号ATCC98353として寄託されたクローンep234 1の
全長蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列;または受託番号ATCC983
53として寄託されたクローンep234 1の成熟蛋白コーディング配列のヌ
クレオチド配列を含む。他の好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、受
託番号ATCC98353として寄託されたクローンep234 1のcDNA
インサートによりコードされる全長または成熟蛋白をコードする。さらなる他の
好ましい具体例において、本発明は、配列番号:20のアミノ酸1からアミノ酸
69までのアミノ酸配列を含む蛋白をコードするポリヌクレオチドを提供する。
他の具体例は配列番号:19のcDNA配列に対応する遺伝子を提供する。
他の具体例において、本発明は、蛋白を含む組成物であって、該蛋白が、
(a)配列番号:20のアミノ酸配列;
(b)配列番号:20のアミノ酸1からアミノ酸69までのアミノ酸配列;
(c)配列番号:20のアミノ酸33からアミノ酸42までのアミノ酸配列を
含む、配列番号:20のアミノ酸配列のフラグメント;および
(d)受託番号ATCC98353として寄託されたクローンep234 1
のcDNAインサートによりコードされるアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものであり、他の哺乳動物蛋白を
実質的に含まないものである組成物を提供する。好ましくは、かかる蛋白は配列
番号:20のアミノ酸配列または配列番号:20のアミノ酸配列のアミノ酸1か
らアミノ酸69までのアミノ酸配列を含む。
ある種の好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは発現調節配列に作動可
能に連結される。本発明はまた、かかるポリヌクレオチド組成物で形質転換され
た、細菌、酵母、昆虫および哺乳動物細胞を包含する宿主細胞を提供する。また
、本明細書開示のポリヌクレオチド配列に対応する遺伝子の、促進、低下、また
は修飾された発現を有する生物が本発明により提供される。
さらに、蛋白の製造方法であって、
(a)かかるポリヌクレオチド組成物で形質転換された宿主細胞の培養物を適
当な培地にて増殖させ;ついで
(b)該培養物から蛋白を精製する
ことからなる方法も提供される。かかる方法により産生される蛋白もまた、本発
明により提供されるものである。好ましい具体例として、かかる方法により製造
される蛋白が成熟形態の蛋白であるものが挙げられる。
本発明の蛋白組成物は、さらに医薬上許容される担体を含んでいてもよい。か
かる蛋白と特異的に反応する抗体を含む組成物も、本発明により提供される。
本発明の蛋白および医薬上許容される担体を含む治療上有効量の組成物を哺乳
動物対象に投与することを含む、医学的状態の予防、治療または改善のための方
法も提供される。
図面の簡単な説明
図1Aおよび1Bは、本明細書開示のクローンの寄託に使用した、pED6お
よびpNOTsベクターをそれぞれ図式的に示したものである。
詳細な説明 単離蛋白およびポリヌクレオチド
本願において開示されているクローンおよび蛋白の各々についてのヌクレオチ
ドおよびアミノ酸配列を以下に報告する。既知方法により寄託クローンの配列決
定を行うことにより各クローンの実際のヌクレオチド配列を容易に決定すること
ができる。次いで、推定アミノ酸配列(全長ならびに成熟の両方)をかかるヌク
レオチド配列から決定することができる。適当な宿主細胞中でクローンを発現さ
せ、蛋白を集め、次いで、その配列を決定することにより、個々のクローンによ
りコードされる蛋白のアミノ酸配列も決定することができる。開示されている各
蛋白について、出願人は、出願時に利用可能な配列の情報を用いて最もよく同定
できる読み枠であると決定されたものを同定した。
本明細書の用語「分泌」蛋白は、適当な宿主細胞において発現された場合、膜
を
通過して輸送されるものをいい、そのアミノ酸配列中のシグナル配列の結果とし
ての輸送も含まれる。「分泌」蛋白は、発現される細胞から全体的に分泌される
蛋白(例えば、可溶性蛋白)または部分的に分泌される蛋白(例えば、受容体)
を包含するが、これらに限らない。また「分泌」蛋白は、小胞体の膜を通過して
輸送されるものを包含するが、これに限らない。クローン「ax318 3」
本発明ポリヌクレオチドはクローンax318 3として同定されている。
ax318 3は、分泌蛋白をコードしているcDNAに選択的な方法(米国特
許第5536637号参照)を用いて成人精巣cDNAライブラリーから単離さ
れ、あるいはコードされる蛋白のアミノ酸配列のコンピューター分析に基づいて
、分泌蛋白または膜貫通蛋白をコードするものと同定された。ax318 3は
全長クローンであり、分泌蛋白(本明細書で「ax318 3蛋白」とも称する
)の全コーディング配列を含んでいる。
今回決定されたax318 3のヌクレオチド配列を配列番号:1に示す。今
回出願人が、上記ヌクレオチド配列に対応したax318 3蛋白の正しい読み
枠および推定アミノ酸配列であると考えるものを配列番号:2に示す。
クローンax318 3を含む寄託物から得ることのできるEcoRI/No
tI制限フラグメントは約1200bpの長さのはずである。
本明細書に開示されたax318 3のヌクレオチド配列を、BLASTN/BLASTX
およひTASTA検索プロトコールを用いてGenBankおよびGenSeqヌクレオチド配列デ
ータベースに対して検索した。ax318 3は、AA255872(zs19a01.s1 NCI CG
AP GCB1 Homo sapiens cDNA clone)、AA625610(zv89h04.s1 Soares NhHMPu S1 H
omo sapiens cDNA clone 766999 3’similar to WP:K10B2.1 CE02008 TRANSDUCI
N BETA CHAIN)、D86043(Humanm RNA for SHPS-1,complete cds)、H23217(ym52f
03.s1 Homo sapiens cDNA clone 51880 3')、U06701(Human clone CCA53 mRNA c
ontainig CCA trinucleotiderepeat)、およびWO5822(za90b02.r1 Soares fetal
lung NbHL 19W Homo sapiens cDNA clone 299787 5')として同定された配列に対
して少なくともある程
度の類似性を示した。ax318 3に関して本明細書で開示した推定アミソ酸
配列を、BLAST検索プロトコールを用いてGenPeptおよびGeneSeqアミノ酸配列デ
ータベースに対して検索した。推定ax318 3蛋白は、D85183(SHPS-1[Ratt
us rattus])、D86043(SHPS-1[Homo sapiens])、R85852(WD-40 domain-containin
g beta-transducin protein)、Y10376(SIRP-betel[Homo sapiens])、およびZ797
57(F55B12.3[Caenorhabditis elegans])として同定された配列に対して少なくと
もある程度の類似性を示した。SHPS−1は、マイトジェンおよび細胞付着に
応答してSH2ドメイン含有蛋白チロシンホスファターゼSHP−2に結合する
糖蛋白である(Fujioka et al.,1996,Mol.Cell.Biol.16(12):6887-6899、
参照により本明細書に記載されているものとみなす)。配列類似性に基づけば、
ax318 3蛋白および各類似蛋白またはペプチドは少なくともある程度活性
を共有している可能性がある。TopPredIIコンピュータープログラムによれば、
ax318 3蛋白配列中の配列番号:2のアミノ酸28周辺に推定上の膜貫通
ドメインが予想される。配列番号:2のアミノ酸15から27までは潜在的なリ
ーダー/シグナル配列でもあり、推定成熟アミノ酸配列はアミノ酸28から開始
する。クローン「bg140 1」
本発明ポリヌクレオチドはクローンbg140 1として同定されている。
bg140 1は、分泌蛋白をコードしているcDNAに選択的な方法(米国特
許第5536637号参照)を用いて成人脳cDNAライブラリーから単離され
、あるいはコードされる蛋白のアミノ酸配列のコンピューター分析に基づいて、
分泌蛋白または膜貫通蛋白をコードするものと同定された。bg140 1は全
長クローンであり、分泌蛋白(本明細書で「bg140 1蛋白」とも称する)
の全コーディング配列を含んでいる。
今回決定されたbg140 1のヌクレオチド配列を配列番号:3に示す。今
回出願人が、上記ヌクレオチド配列に対応するbg140 1蛋白の正しい読み
枠および推定アミノ酸配列と考えるものを配列番号:4に示す。配列番号:3の
塩基対
641から1648までによりコードされるもう1つの可能なbg140 1の
読み枠および推定アミノ酸配列を配列番号:31に示す。配列番号:3のヌクレ
オチド配列中のフレームシフトは、例えば、配列番号:3の位置825近傍の単
一塩基欠失により引き起こされたものである場合、配列番号:4をコードする読
み枠を配列番号:31をコードする読み枠に結合させる可能性がある。
クローンbg140 1を含む寄託物から得ることのできるEcoRI/No
tI制限フラグメントは約2900bpの長さのはずである。
本明細書に開示したbg140 1のヌクレオチド配列を、BLASTA/BLASTXお
よびFASTAサーチプロトコールを用いてGenBankおよびGeneSeqデータベースに対
して検索した。bg140 1は、AA075629(zm89a04.s1 Stratagene ovarian c
ancer(#937219)Homo sapiens cDNA clone 545070 3')、AA113989(zn27h12.r1 St
ratagene neuroepithelium NT2RAMI 937234 Homo sapiens cDNA clone 548711 5
')、N77135(yz85h11.r1 Homo sapiens cDNA clone 289893 5')、R11701(yf49d02
.r1 Homo sapiens cDNA clone 25600 5')、R13178(yf73e04.r1 Homo sapiens cD
NA clone 278555')、およびY14946(Homo sapiens mRNA for SPIN protein)とし
て同定された配列に対して少なくともある程度の類似性を示した。bg140
1に関して本明細書に開示された推定アミノ酸配列を、BLASTX検索プロトコール
を用いてGenPeptおよびGeneSeqアミノ酸配列データベースに対して検索した。
推定bg140 1蛋白は、AF038969(general transcription factor 2-I[Homo
sapiens])、U77948(Burton's tyrosine kinase-associated protein-135;BAP-1
35[Homo sapiens])、およびY14946(SPIN protein[Homo sapiens])として同定さ
れた配列に対して少なくともある程度の類似性を示した。配列類似性に基づけば
、bg140 1蛋白および各類似蛋白またはペプチドは少なくともある程度活
性を共有している可能性がある。クローン「bg465 2」
本発明ポリヌクレオチドはクローンbg465 2として同定されている。
bg465 2は、分泌蛋白をコードしているcDNAに選択的な方法(米国特
許
第5536637号参照)を用いて成人脳cDNAライブラリーから単離され、
あるいはコードされる蛋白のアミノ酸配列のコンピューター分析に基づいて、分
泌蛋白または膜貫通蛋白をコードするものと同定された。bg465 2は全長
クローンであり、分泌蛋白(本明細書で「bg465 2蛋白」とも称する)の
全コーディング配列を含んでいる。
今回決定されたbg465 2のヌクレオチド配列を配列番号:5に示す。今
回出願人が、上記ヌクレオチド配列に対応するbg465 2蛋白の正しい読み
枠および推定アミノ酸配列と考えるものを配列番号:6に示す。
クローンbg465 2を含む寄託物から得ることのできるEcoRI/No
tI制限フラグメントは約2500bpの長さのはずである。
本明細書に開示したbg465 2のヌクレオチド配列を、BLASTA/BLASTXお
よびFASTAサーチプロトコールを用いてGenBankおよびGeneSeqデータベースに対
して検索した。bg465 2は、AA133150(zm25b07.r1 Stratagene pancreas(
#937208)Homo sapiens cDNA clone 526645 5’similar to WP:F07F6.4CE01896 Z
INC FINGER PROTEIN)、AA144842(mr69h01.r1 Stratagene mouse testis(#93730
8)Mus musculus cDNA clone 602737 5')、AA484561(nf06a12.s1 NCI CGAP Li1 H
omo sapiens cDNA clone)、D16939(Human HepG2 3’region cDNA,clone hmd5d0
6)、L24125(Sac charomyces cerevisiae zinc finger protein(GCS1)gene,comp
le tecds)、R18422(yg02h06.r1 Homo sapiens cDNA clone 30950 5')、T32543(E
ST50558 Homo sapiens cDNA 5’end similar to None)、W88569(zh70b12.s1 Soa
res fetal chromosome IV reading frame ORF YDL226c)、Z74274(S.cerevisiae
chromosome IV reading frame ORF YDL226c)、およびZ82199(Human DNA sequen
ce ***SEQUENCING IN PROGRESS*** from clone 316D5;HTGS phase 1)として同定
された配列に対して少なくともある程度の類似性を示した。bg465 2に関
して本明細書で開示した推定アミノ酸配列をBLASTX検索プロトコールを用いてGe
nPeptおよびGeneSeqアミノ酸配列データベースに対して検索した。推定bg46
5 2蛋白は、U23486(similar to S.cerevisiae zinc protein GCS1(SP GCS1
YEAST)[Caenorhabditis elegens])として同定された配列に対して少なくともあ
る程度の類似性を示した。
配列類似性に基づけば、bg465 2蛋白および各類似蛋白またはペプチ下は
少なくともある程度活性を共有している可能性がある。クローン「bk291 3」
本発明ポリヌクレオチドはクローンbk291 3として同定されている。
bk291 3は、分泌蛋白をコードしているcDNAに選択的な方法(米国特
許第5536637号参照)を用いて成人網膜cDNAライブラリーから単離さ
れ、あるいはコードされる蛋白のアミノ酸配列のコンピューター分析に基づいて
、分泌蛋白または膜貫通蛋白をコードするものと同定された。bk291 3は
全長クローンであり、分泌蛋白(本明細書で「bk291 3蛋白」とも称する
)の全コーディング配列を含んでいる。
今回決定されたbk291 3のヌクレオチド配列を配列番号:7に示す。今
回出願人が、上記ヌクレオチド配列に対応するbk291 3蛋白の正しい読み
枠および推定アミノ酸配列と考えるものを配列番号:8に示す。アミノ酸44か
ら56までは推定リーダー/シグナル配列であり、推定成熟アミノ酸配列はアミ
ノ酸57から開始し、あるいはアミノ酸44から56までは膜貫通ドメインであ
る。
クローンbk291 3を含む寄託物から得ることのできるEcoRI/No
tI制限フラグメントは約1500bpの長さのはずである。
本明細書に開示したbk291 3のヌクレオチド配列を、BLASTA/BLASTXお
よびFASTAサーチプロトコールを用いてGenBankおよびGeneSeqデータベースに対
して検索した。bk291 3は、AA135915(zl19f04.r1Soares pregnant uteru
s NbHPU Homo sapiens cDNA clone 502399 5')、AA156738(zl19f04.s1 Soares p
regnant uterus NbHPU Homo sapiens cDNA clone 502399 3’similar to WP:T05
E11.5 CE06364 YEAST YKKO LIKE)、AF017785(Mus musculus MHC Class I H13a m
inor histocpmpatibility peptide(H13)mRNA,partial cds)、N40134(yw73a 1
2.r1 Homo sapiens cDNA clone 257854 5’similar to SW:YKKO YEAST P34248 H
YPOTHETICAL 67.5KD PROTEIN IN APEI/LAP4-CWP1 INTERGENIC REGION)、N42726(
yy11d01.r1 Homo sapiens cDNA clone 270913 5’similar to SW:YKKO YEAST P3
4248 HYPOTHETICAL 67.5
KD PROTEIN IN APE1/LAP4-CWP1 INTERGENIC REGION)、R67144(yi31h04.r1 Homo
sapiens cDNA clone 140887 5’similar to SP:YKKO YEAST P34248 HYPOTHETICA
L 67.5KD PROTEIN IN APE1/LAP4-MBR1 INTERGENIC)、R78822(yi90b05.r1 Homo s
apiens cDNA clone 146481 5')、R79317(yi90b05.s1 Homo sapiens cDNA clone
146481 3')、T23944(Human gene signature HUMGS05889)、およびW04243(za58h1
0.r1 Soares fetal liver spleen INFLS Homo sapiens cDNA clone)として同定
された配列に対して少なくともある程度の類似性を示した。
bk291 3に関する本明細書開示の推定アミノ酸配列をBLASTX検索プロトコ
ールを用いてGenPeptおよびGeneSeqアミノ酸配列データベースに対して検索した
。推定bk291 3蛋白は、X71133(YKL450[Saccharomyces cerevisiae])、Z2
8100(ORF YKL100c[Saccharomyces cerevisiae])、およびZ68751(T05E11.5[Caeno
rhabditis elegans])として同定された配列に対して少なくともある程度の類似
性を示した。配列類似性に基づけば、bk291 3蛋白および各類似蛋白また
はペプチドは少なくともある程度活性を共有している可能性がある。TopPredII
コンピュータープログラムによれば、さらに6個の潜在的な膜貫通ドメインが、
bk291 3蛋白配列中、配列番号:8のアミノ酸70、125、170、2
20、260および280の周辺に存在することが予想される。クローン「bp537 4」
本発明ポリヌクレオチドはクローンbp537 4として同定されている。
bp537 4は、分泌蛋白をコードしているcDNAに選択的な方法(米国特
許第5536637号参照)を用いてヒト胎児腎臓cDNAライブラリーから単
離され、あるいはコードされる蛋白のアミノ酸配列のコンピューター分析に基づ
いて、分泌蛋白または膜貫通蛋白をコードするものと同定された。bp537
4は全長クローンであり、分泌蛋白(本明細書で「bp537 4蛋白」とも称
する)の全コーディング配列を含んでいる。
今回決定されたbp537 4のヌクレオチド配列を配列番号:9に示す。上
記ヌクレオチド配列に対応するbp537 4蛋白の正しい読み枠および推定ア
ミノ
酸配列であると出願人が考えるものを配列番号:10に示す。
クローンbp537 4を含む寄託物から得ることのできるEcoRI/No
tI制限フラグメントは約1500bpの長さのはずである。
本明細書に開示したbp537 4のヌクレオチド配列を、BLASTA/BLASTXお
よびFASTAサーチプロトコールを用いてGenBankおよびGeneSeqデータベースに対
して検索した。bp537 4は、AA007576(zh99b06.r1 Soares fetal liver s
pleen 1NFLS S1 Homo sapiens cDNA clone 429395 5')、AA287563(zs52g02.r1 N
CI CGAP GCAP GCB1 Homo sapiens cDNA 5')、R09093(yf21h09.r1 Homo sapiens
cDNA clone 127553 5')、およびT33088(EST56631 Homo sapiens cDNA 5’end si
milar to None)として同定された配列に対して少なくともある程度の類似性を示
した。
bp537 4に関して本明細書で開示した推定アミノ酸配列をBLASTX検索プロ
トコールを用いてGenPeptおよびGeneSeqアミノ酸配列データベースに対して検索
した。推定bp537 4蛋白は、U34998(Rad9[Coprinus cinereus)として同定
された配列に対して少なくともある程度の類似性を示した。配列類似性に基づけ
ば、bp537 4蛋白および類似性を有する各蛋白またはペプチドは少なくと
もある程度活性を共有している可能性がある。クローン「cs431 2」
本発明ポリヌクレオチドはクローンcs431 2として同定されている。
cs431 2は、分泌蛋白をコードしているcDNAに選択的な方法(米国特
許第5536637号参照)を用いてヒト胎児脳cDNAライブラリーから単離
され、あるいはコードされる蛋白のアミノ酸配列のコンピューター分析に基づい
て、分泌蛋白または膜貫通蛋白をコードするものと同定された。cs431 2
は全長クローンであり、分泌蛋白(本明細書で「cs431 2蛋白」とも称す
る)の全コーディング配列を含んでいる。
今回決定されたcs431 2のヌクレオチド配列を配列番号:11に示す。
今回出願人が、上記ヌクレオチド配列に対応するcs431 2蛋白の正しい読
み枠および推定アミノ酸配列と考えるものを配列番号:12に示す。
クローンcs431 2を含む寄託物から得ることのできるEcoRI/No
tI制限フラグメントは約2300bpの長さのはずである。
本明細書に開示したcs431 2のヌクレオチド配列を、BLASTA/BLASTXお
よびFASTAサーチプロトコールを用いてGenBankおよびGeneSeqデータベースに対
して検索した。cs431 2は、AA021033(ze67h12.s1 Soares retina N2b4HR
Homo sapiens cDNA clone 364103 3’similar to contains Alu repetitive el
ement)、H29349(ym32c02.r1 Homon sapiens cDNA clone 49839 5’similar to S
P:KYES XIPHEP27447 PROTO-ONCOGENE TYROSINE-PROTEIN KINASE YES)、L14577(
Homo sapiens cystathionine beta-synthase cDNA)、Q87430(Human cystathioni
ne beta-synthase cDNA)、およびX92659(H.sapiens intron 4 from p53 gene)
として同定された配列に対して少なくともある程度の類似性を示した。cs43
1 2として本明細書に開示された推定アミノ酸配列を、BALSTX検索プロトコー
−ルを用いてGenPeptおよびGeneSeqアミノ酸配列データベースに対して検索した
。
推定cs431 2蛋白は、L19501(cystathionine beta-synthase[Homo sapien
s])、R71376(Human cystathionine beta-synthase)、U61167(SH3 domain-contai
ning protein SH3P18[Homo sapiens])、およびX82166(Cystathionine beta-synt
hase[Homo sapiens])として同定された配列に対して少なくともある程度の類似
性を示した。配列類似性に基づけば、cs431 2蛋白および類似性を有する
各蛋白またはペプチドは少なくともある程度活性を共有している可能性がある。
TopPredIIコンピュータープログラムによれば、
cs431 2蛋白配列中の配列番号:12のアミノ酸30周辺に潜在的な膜貫
通ドメインが予想される。cs431 2のヌクレオチド配列は、それがAlu
反復エレメントを含む可能性があることを示す。クローン「cw976 1」
本発明ポリヌクレオチドはクローンcw976 1として同定されている。
cw976 1は、分泌蛋白をコードしているcDNAに選択的な方法(米国特
許第5536637号参照)を用いてヒト胎児脳cDNAライブラリーから単離
され、
あるいはコードされる蛋白のアミノ酸配列のコンピューター分析に基づいて、分
泌蛋白または膜貫通蛋白をコードするものと同定された。cw976 1は全長
クローンであり、分泌蛋白(本明細書で「cw976 1蛋白」とも称する)の
全コーディング配列を含んでいる。
今回決定されたcw976 1のヌクレオチド配列を配列番号:13に示す。
今回出願人が、上記ヌクレオチド配列に対応するcw976 1蛋白の正しい読
み枠および推定アミノ酸配列と考えるものを配列番号:14に示す。アミノ酸4
23からアミノ酸435までは推定リーダー/シグナル配列であり、推定成熟ア
ミノ酸配列は436から開始し、あるいはアミノ酸423からアミノ酸435ま
では膜貫通ドメインである。
クローンcw976 1を含む寄託物から得ることのできるEcoRI/No
tI制限フラグメントは約3300bpの長さのはずである。
本明細書に開示したcw976 1のヌクレオチド配列を、BLASTA/BLASTXお
よびFASTAサーチプロトコールを用いてGenBankおよびGeneSeqデータベースに対
して検索した。cw976 1は、AA280747(zs96a09.r1 NCI CGAP GCB1 Homo s
apiens cDNA clone IMAGE:711448 5')、AA323946(EAT26798 Cerebellum II Homo
sapiens cDNA 5’end)、R13665(yf60g06.r1 Homon sapiens cDNA clone 26764
5')、R16892(yf44d06.s2 Homo sapiens cDNA clone 129707 3')、R85177(yo43d0
7.r1 Homo sapiens cDNA clone 180685 5')、およびR89648(ym97c02.r1 Homo sa
piens cDNA clone 166850 5')として同定された配列に対して少なくともある程
度の類似性を示した。配列類似性に基づけば、cw976 1蛋白および類似性
を有する各蛋白またはペプチドは少なくともある程度活性を共有している可能性
がある。TopPredIIコンピュータープログラムによれば、cw976 1蛋白配
列中、配列番号:14のアミノ末端に潜在的な膜貫通ドメインが予測される。クローン「cw1233 3」
本発明ポリヌクレオチドはクローンcw1233 3として同定されている。
cw1233 3は、分泌蛋白をコードしているcDNAに選択的な方法(米国
特
許第5536637号参照)を用いてヒト胎児脳cDNAライブラリーから単離
され、あるいはコードされる蛋白のアミノ酸配列のコンピューター分析に基づい
て、分泌蛋白または膜貫通蛋白をコードするものと同定された。cw1233
3は全長クローンであり、分泌蛋白(本明細書で「cw1233 3蛋白」とも
称する)の全コーディング配列を含んでいる。
今回決定されたcwl233 3のヌクレオチド配列を配列番号:1、5に示
す。今回出願人が、上記ヌクレオチド配列に対応するcw1233 3蛋白の正
しい読み枠および推定アミノ酸配列を配列番号:16に示す。
クローンcw1233 3を含む寄託物から得ることのできるEcoRI/N
otl制限フラグメントは約3000bpの長さのはずである。
本明細書に開示したcw1233 3のヌクレオチド配列を、BLASTA/BLASTX
およびFASTAサーチプロトコールを用いてGenBankおよびGeneSeqデータベースに
対して検索した。cw1233 3は、R6l600(yh16f08.r1 Homo sapiens cDNA
clone 37807 5')、R83929(yp06h11.s1 Homo sapiens cDNA clone 186693 3’sim
ilar to contains Alu repetitive element;contains TAR1 repetitive element
)、R87877(yo45h.r1 Homo sapiens cDNA clone 180921 5')、U14568(***ALU WAR
NING Human Alu-Sb subfamily consensus sequence)として同定された配列に対
して少なくともある程度の類似性を示した。cw1233 3に関して本明細書
で開示する推定アミノ酸配列を、BLASTX検索プロトコールを用いてGenPeptおよ
びGeneSeqアミノ酸配列データベースに対して検索した。推定cw1233 3
蛋白は、AB002317(KIA0319[Homo sapiens])として同定された配列に対して少な
くともある程度の類似性を示した。配列類似性に基づけば、cw1233 3蛋
白および類似性を有する各蛋白またはペプチドは少なくともある程度活性を共有
している可能性がある。cw1233 3のヌクレオチド配列は、それがAlu反
復エレメントを含む可能性があることを示す。クローン「dg1 1」
本発明ポリヌクレオチドはクローンdg1 1として同定されている。
dg1 1は、分泌蛋白をコードしているcDNAに選択的な方法(米国特許第
5536637号参照)を用いて成人胎盤cDNAライブラリーから単離され、
あるいはコードされる蛋白のアミノ酸配列のコンピューター分析に基づいて、分
泌蛋白または膜貫通蛋白をコードするものと同定された。dg1 1は全長クロ
ーンであり、分泌蛋白(本明細書で「dgl 1蛋白」とも称する)の全コーデ
ィング配列を含んでいる。
今回決定されたdg1 1のヌクレオチド配列を配列番号:17に示す。今回
出願人が、上記ヌクレオチド配列に対応するdg1 1蛋白の正しい読み枠およ
び推定アミノ酸配列であると考えるものを配列番号:18に示す。
クローンdg1 1を含む寄託物から得ることのできるEcoRI/NotI
制限フラグメントは約1900bpの長さのはずである。
本明細書に開示したdg1 1のヌクレオチド配列を、BLASTX検索プロトコー
ルを用いてGenPeptおよびGeneSeqアミノ酸配列データベースに対して検索した。
推定dg1 1蛋白は、AA731281(nw57f05.s1 NCI CGAP GCAP GCB1 Homo sapien
s cDNA clone IMAGE 1250721 similar to gb Y00345 cds1 POLYADENYLATE-BINDI
NG PROTEIN(HUMAN))として同定された配列に対して少なくともある程度の類似性
を示した。dg1 1に関して本明細書に開示した推定アミノ酸配列を、BLASTX
検索プロトコールを用いてGenPeptおよびGenSeqアミノ酸配列データベースに対
して検索した。推定dg1 1蛋白は、M81878(hyaluronidase[Clostridium per
fringens])およびU28742(similar to hyaluronoglucosaminidase(SPNAGH CLOPE
,P26831)[Caenorhabditis elegans])として同定された配列に対して少なくと
もある程度の類似性を示した。ヒアルロノグルコサミニダーゼは、例えば、ハチ
毒中に見いだされる分泌蛋白である。配列類似性に基づけば、dg1 1蛋白お
よび類似性を有する各蛋白またはペプチドは少なくともある程度活性を共有して
いる可能性がある。TopPredコンピュータープログラムにより、dg1 1蛋白
配列中の配列番号:18のアミノ酸150付近にさらなる潜在的膜貫通ドメイン
の存在が予測される。クローン「ep234 1」
本発明ポリヌクレオチドはクローンep234 1として同定されている。
ep234 1は、分泌蛋白をコードしているcDNAに選択的な方法(米国特
許第5536637号参照)を用いて成人胎盤cDNAライブラリーから単離さ
れ、あるいはコードされる蛋白のアミノ酸配列のコンピューター分析に基づいて
、分泌蛋白または膜貫通蛋白をコードするものと同定された。ep234 1は
全長クローンであり、分泌蛋白(本明細書で「ep234 1蛋白」とも称する
)の全コーディング配列を含んでいる。
今回決定されたep234 1のヌクレオチド配列を配列番号:19に示す。
今回出願人が上記ヌクレオチド配列に対応するep234 1蛋白の正しい読み
枠および推定アミノ酸配列と考えるものを配列番号:20に示す。アミノ酸59
から71までは推定リーダー/シグナル配列であり、推定成熟アミノ酸配列はア
ミノ酸72から開始し、あるいはアミノ酸59から71までは膜貫通ドメインで
ある。
クローンep234 1を含む寄託物から得ることのできるEcoRI/No
tI制限フラグメントは約2500bpの長さのはずである。
本明細書に開示したep234 1のヌクレオチド配列を、BLASTA/BLASTXお
よびFASTAサーチプロトコールを用いてGenBankおよびGeneSeqデータベースに対
して検索した。ep234 1は、AA044714(zf54d09.r1 Soares retina N2b4HR
Homo sapiens cDNA clone 380753 5')、AA454840(zx79d09.s1 Soares ovary tu
mor NbHOT Homo sapiens cDNA clone 809969 3')、AA470137(zu11e01.s1 Soare
s testis NHT Homo sapiens cDNA clone 731544 3')、H24852(y142c11.r1 Homo
sapiens cDNA clone 160916 5')、N64648(yz87b06.s1 Homo sapiens cDNA clone
290003 3')、R45788(Ha662-fHomo sapiens cDNA clone a662-f)、T70546(yd15b
07.s1 Homo sapiens cDNA clone 108277 3')、W73481(zd54e01.s1 Soares fetal
heart NbHH19W Homo sapiens cDNA clone 344472 3')、およびW73553(zd54e01.
r1 Soares fetal heart)として同定された配列に対して少なくともある程度の類
似性を示した。配列類似性に基づけば、ep234 1蛋白および類似性を有す
る各蛋白またはペプチドは少なくともある程度活性を共有している可能性がある
。TopPredIIコンピュータープログラムによれば、配列番号:20で示されるe
p234 1蛋白中に少なくとも2個の
潜在的な膜貫通ドメインの存在が予測される。
クローンの寄託
クローンax318 3、bg140 1、bg465 2、bk291 3
、bp537 4、cs431 2、cw976 1、cwl233 3、dg
11、およびep234 1は、ブダペスト条約に基づいて1997年3月11
日にAmerican Type Culture Collectionに受託番号ATCC98353として寄
託され、そこから該クローンが入手可能である。寄託材料の公衆の利用に対する
すべての制限は、37C.F.R.§1.808(b)の規定を除き、特許付与
により解除されるであろう。
各クローンはこの複合体寄託物として別々の細菌細胞(E.coli)中にトラン
スフェクションされた。EcoRI/NotI消化(5’部位、EcoRI;3
’部位、NotI)を行い、かかるクローンについて適当な大きさのフラグメン
トを得ることにより各クローンを寄託されているベクターから取ることができる
。各クローンを、図1に示すpED6またはpNotSベクターのいずれかに入
れて寄託した。cDNAクローニングを容易にする新たなポリリンカーを挿入す
ることによりpED6dpc2ベクター(pED6)をpED6dpc1から誘
導した(Kaufman et al.(1991).NAR 19:4485-4490)。DHFRを欠失させ、新
たなポリリンカーを挿入し、M13複製開始点をClaI部位に挿入することに
よりpNOTsベクターをpMT2(Kaufman et al.1989.Mol.Cell.Biol.
9:1741-1750)から誘導した。いくつかの場合、寄託クローンは寄託単離物中で
「フリップ」した(すなわち、逆方向となった)。このような場合であってもや
はり、EcoRIおよびNotI消化によりcDNAインサートを単離できる。
しかしながら、その場合、適当なベクター中での発現のために正しい方向でcD
NAを配置するために、NotIは5’部位を生成し、EcoRIは3’部位を
生成するであろう。cDNAが寄託されているベクターからcDNAを発現させ
てもよい。
個々のクローンを含む細菌細胞を、複合体寄託物から次のようにして得ること
ができる:
個々のクローンに関して知られた配列に対するものになるよう、オリゴズクレ
オチドプローブまたはプローブを設計すべきである。この配列は本明細書中の配
列、またはそれらの配列の組み合わせから誘導することができる。各全長クロー
ンを単離するために使用されたオリゴヌクレオチドプローブ配列を以下に示すが
、それらは目的クローンの単離において最も信頼できるはずである。クローン プローブ配列
ax318 3 配列番号:21
bg140 1 配列番号:22
bg465 2 配列番号:23、配列番号:32
bk291 3 配列番号:24
bp537 4 配列番号:25
cs431 2 配列番号:26
cw976 1 配列番号:27
cw1233 3配列番号:28
dg1 1 配列番号:29
ep234 1 配列番号:30
上に挙げた配列は位置2においてNを含み、その位置は好ましいプローブ/プ
ライマーにおいてヌクレオチドというよりはむしろビオチン化ホスホラミダイト
残基(例えば、ビオチンホスホラミダイト(1−ジメトキシトリチルオキシ−2
−(N−ビオチニル−4−アミノブチル)−プロピル−3−O−(2−シアノエ
チル)−(N,N’−ジイソプロピル)−ホスホラミダイト(Glen Researchカ
タログ番号10-1953))の使用により得られる)により占められる。
好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの設計はこれらのパラメーターに従
うべきである:
(a)もしあったとしても、不明確な塩基(N)が最少である配列の領域とな
るように設計すべきである;
(b)Tmが約80℃(AまたはTについては2℃、GまたはCについては4
℃と仮定)となるように設計すべきである。
好ましくは、オリゴヌクレオチド標識に広く用いられる方法を用い、T4ポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いてオリゴヌクレオチドをγ−32P−ATP(比活性
6000Ci/mmole)で標識すべきである。他の標識方法を用いることも
できる。好ましくは、取り込まれなかった標識をゲル濾過または他の確立されて
いる方法により除去すべきである。プローブ中に取り込まれた放射活性量をシン
チレーションカウンターで測定することにより定量すべきである。好ましくは、
得られたプローブの比活性は約4e+6 dpm/pmoleとなるべきである
。
好ましくは、全長クローンのプールを含む細菌培養物を融解し、100μlの
ストックを100μg/mlのアンピシリンを含有する25mlの滅菌Lブロス
を入れた滅菌培養フラスコへの接種に用いるべきである。好ましくは、培養物を
37℃で増殖させて飽和状態とすべきであり、好ましくは、飽和培養物を新鮮L
ブロスで希釈すべきである。好ましくは、これらの希釈物の一部をプレーティン
グして、150mmのペトリ皿中の100μg/mlのアンピシリンおよび1.
5%の寒天を含有するLブロスを含む固体細菌用培地上で37℃で一晩増殖させ
た場合5000個の明確な、しかもよく分離したコロニーが生じる希釈率および
体積を決定すべきである。明確な、しかもよく分離したコロニーを得るための他
の既知方法を用いることもできる。
次いで、標準的なコロニーハイブリダイゼーション法を用いてコロニーをニト
ロセルロースフィルターに移し、溶解、変性、次いで、焼き付けを行うべきであ
る。
次いで、好ましくは、0.5% SDS、100μg/mlの酵母RNA、お
よび10mMEDTAを含有する6X SSC(20Xストックは175.3g
NaCl/リットル、88.2gクエン酸ナトリウム、NaOHでpH7.0と
する)(150mmフィルター1枚あたり約10ml)中で穏やかに撹拌しなが
ら65℃で1時間インキュベーションする。次いで、好ましくはプローブをハイ
ブリダイゼーションミックスに添加して濃度が1e+6 dpm/mlより大ま
たはこれと等しくなるようにする。次いで、好ましくはフィルターを室温におい
て撹拌せ
ずに500mlの2X SSC/0.5%SDSで洗浄し、好ましくはその後、
室温においておだやかに振盪しながら500mlの2XSSC/0.1%SDS
で洗浄する。65℃、30分ないし1時間、0.1X SSC/0.5% SDS
での3回目の洗浄が最適である。次いで、好ましくはフィルターを乾燥し、十分
時間オートラジオグラフィーに供してX線フィルム上に陽性物を可視化させる。
他の既知ハイブリダイゼーション方法を用いることもできる。
陽性コロニーを拾い、培地中で増殖させ、次いで、標準的手順を用いてプラス
ミドDNAを単離する。次いで、制限分析、ハイブリダイゼーション分析または
DNA配列決定によりクローンを証明することができる。
生物学的活性を示すことのできる本発明蛋白のフラグメントも本発明に含まれ
る。蛋白のフラグメントは直鎖状であってもよく、あるいは例えばH.U.Saragovi
,et al.,Bio/Technology 10,773-778(1992)およびR.S.McDowell,et al.,J
.Amer.Chem.Soc.114,9245-9253(1992)(参照により両文献を本明細書に記
載されているもの-とみなす)に記載されたような既知方法を用いて環化させて
もよい。多くの目的(蛋白結合部位の結合手を増加させることを包含)のために
、かかるフラグメントを免疫グロブリンのごとキャリヤ分子に融合させてもよい
。例えば、蛋白のフラグメント-を「リンカー」を介して免疫グロブリンのFc
部分に融合させてもよい。2価形態の蛋白については、かかる融合をIgG分子
のFc部分に対して行うことができる。他の免疫グロブリンイソタイプを用いて
かかる融合物を得てもよい。例えば、蛋白−IgM融合物は、10価形態の本発
明蛋白を生じるであろう。
また本発明は全長および成熟形態の開示蛋白を提供する。かかる蛋白の全長形
態は、開示クローンのヌクレオチド配列の翻訳により配列表において同定されて
いる。かかる蛋白の成熟形態を、適当な哺乳動物細胞または他の宿主細胞におい
て開示の全長ポリヌクレオチド(好ましくは、ATCCに寄託されたもの)を発
現させることにより得てもよい。蛋白の成熟形態の配列を全長形態のアミノ酸配
列から決定してもよい。
また本発明は、本明細書開示のcDNA配列に対応する遺伝子を提供する。「
対応する遺伝子」は、転写されてmRNAを生じるゲノムの領域であり、そのm
RN
AからcDNAが誘導され、かかる遺伝子の調節された発現に必要なゲノムの隣
接領域(コーディング配列、5’および3’非翻訳領域を含む)、あるいはスプ
ライシングされたエキソン、イントロン、プロモーター、エンハンサー、ならび
にサイレンサーまたはサプレッサーエレメントも包含する。本明細書開示の配列
の情報を用いて対応遺伝子を単離することができる。本明細書開示の配列の情報
を用いて対応遺伝子を単離することができる。かかる方法は、開示された配列の
情報からプローブまたはプライマーを調製して適当なゲノムライブラリーまたは
他のゲノム材料源中の遺伝子の同定および/または増幅を行うことを包含する。
「単離遺伝子」とは、その遺伝子が単離された生物のゲノム中に存在する隣接コ
ーディング配列(存在する場合には)から分離された遺伝子である。
本明細書開示のポリヌクレオチド配列に対応する遺伝子の増強、低下、あるい
は改変された発現を有する生物が提供される。アンチセンスポリヌクレオチドを
用いることにより、あるいは遺伝子から転写されたmRNAを結合および/また
は開裂させるリボザイムを用いることにより、遺伝子発現の望ましい変化が成し
逐げられる(Albert and Morris,1994,Trends Pharmacol.Sci.15(7):250-254;L
avarosky et al.,1997,Biochem Mol.Med.62(1):11-22;and Hampel,1998,Pr
og.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.58:1-39;これらすべてを参照により本明細
書に記載されているものとみなす)。本明細書開示のポリヌクレオチドに対応す
る多コピー遺伝子を有するトランスジェニック動物、好ましくは形質転換細胞お
よびそれらの子孫中で安定に維持される遺伝学的構築物を用いて細胞を形質転換
することにより得られるトランスジェニック動物が提供される。遺伝子発現レベ
ルを上昇または低下させる、あるいは遺伝子発現の時間的または空間的パターン
を変化させる改変された遺伝学的制御領域を有するトランスジェニック動物も提
供される(European Patent No.0 649 464 B1参照;これらすべてを参照により
本明細書に記載されているものとみなす)。さらに、外部配列の挿入により、あ
るいは対応遺伝子の全部または一部の欠失により、本明細書開示のポリヌクレオ
チド配列に対応する遺伝子が不完全または完全に不活性化された生物が提供され
る。挿入により、好ましくは、転置可能エレメントの不正確な切除後の挿入によ
り(Plasterk,1992,Bioessays 14(9):
629-633;Zwaal et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(16):7431-7435;
Clark et al.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(2):719-722;これらすべ
てを参照により本明細書に記載されているものとみなす)、あるいは相同組み換
えにより、好ましくは陽性/陰性遺伝学的選択法により検出される相同組み換え
により(Mansour et al.,1988,Nature 336:348-352;U.S.Patent Nos.5,464,
764;5,487,992;5,627,059;5,631,153;5,614,396;5,616,491;and 5,679,523;こ
れらすべてを参照により本明細書に記載されているものとみなす)、不完全また
は完全な遺伝子不活性化を行うことができる。変化した遺伝子発現を有するこれ
らの生物は、好ましくは真核生物であり、より好ましくは哺乳動物である。かか
る生物は、対応遺伝子に関連した疾患の研究のための非ヒトモデルの開発に、さ
らには対応遺伝子からの蛋白産物と相互作用する分子の同定のためのアッセイ系
の開発に有用である。
本発明蛋白が膜結合(例えば、受容体)である場合、本発明はかかる蛋白の可
溶性形態も提供する。かかる形態において、蛋白の細胞内および膜貫通ドメイン
の一部または全体を取り外して、蛋白が発現された宿主から十分に分泌されるよ
うにする。本発明蛋白の細胞内および膜貫通ドメインを、配列の情報からかかる
ドメインを決定するための既知手法により同定することができる。
本発明蛋白および蛋白フラグメントは、開示蛋白のアミノ酸配列の少なくとも
25%(より好ましくは少なくとも50%、最も好ましくは少なくとも75%)
の長さのアミノ酸配列を有し、開示蛋白に対して少なくとも60%の配列同一性
(より好ましくは少なくとも75%の同一性、最も好ましくは少なくとも90%
または95%の同一性)を有する蛋白を包含する。配列同一性は、配列のギャッ
プを最小にしつつ、重複および同一性を最大にするように配列を並置した場合に
蛋白のアミノ酸配列を比較することにより決定される。いずれの開示蛋白のセグ
メントに対しても少なくとも75%の配列同一性(より好ましくは、少なくとも
85%の同一性、最も好ましくは少なくとも95%の同一性)を有する、好まし
くは8個またはそれ以上(より好ましくは20個またはそれ以上、最も好ましく
は30個またはそれ以上)の連続したアミノ酸を含むセグメントを含有する蛋白
または蛋白フラグメント
も本発明に包含される。
開示ポリヌクレオチドおよび蛋白の種相同体も、本発明により提供される。本
明細書の用語「種相同体」は、蛋白またはポリヌクレオチドの起源とは異なる種
に関する蛋白またはポリヌクレオチドであるが、当業者により決定された場合、
有意な配列類似性を有するものをいう。本明細書に示す配列から適当なプローブ
またはプライマーを作成し、次いで、所望種由来の適当な核酸源をスクリーニン
グすることにより種相同体を単離し同定してもよい。
また本発明は、開示ポリヌクレオチドの対立遺伝子変種、すなわち、本発明ポ
リヌクレオチドによりコードされている蛋白と同一、相同的またはこれに関連し
た蛋白をコードする単離ポリヌクレオチドの自然発生的別形態を包含する。
また本発明は、本明細書開示ポリヌクレオチドの配列に相捕的な配列を有する
ポリヌクレオチドも包含する。
また本発明は、厳密さを減じた条件下で、より好ましくは厳密な条件下で、最
も好ましくは非常に厳密な条件下で、本明細書記載のポリヌクレオチドにハイブ
リダイゼーションしうるポリヌクレオチドも包含する。厳密さの条件の例を下表
に示す。非常に厳密な条件は、例えば、少なくとも条件A〜Fと同程度に厳密で
あり、厳密な条件は、例えば、少なくとも条件G〜Lと同程度に厳密であり、厳
密さを減じた条件は、例えば、少なくとも条件M〜Rと同程度に厳密である。 ‡:ハイブリッド長さは、ハイブリダイゼーションしているポリヌクレオチドの
ハイブリッドしている領域(複数も可)に関して予想される長さである。ポリヌ
クレ
オチドを未知配列の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションさせる場合
、ハイブリッド長さは、ハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドの長さと
仮定する。既知配列のポリヌクレオチドがハイブリダイゼーションする場合、ポ
リヌクレオチド配列を並置し、最適な配列相補性の領域(複数も可)を同定する
ことによりハイブリッド長さを決定することができる。†
:ハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファーにおいてSSPE(1X S
SPEは0.15M NaCl、10mM NaH2PO4、および1.25mM E
DTA,pH7.4である)をSSC(1XSSCは0.15M NaClおよび1
5mMクエン酸ナトリウムである)に置き換えることができる。ハイブリダイゼ
ーション完了後、洗浄を15分間行う。
*TB−TR:長さ50塩基対よりも短いと予想されるハイブリッドについてのハ
イブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度(Tm)よりも5〜10
℃低くすべきである。下記等式によりTmが決定される。長さ18塩基対未満の
ハイブリッドについては、Tm(℃)=2(A+T塩基の数)+4(G+C塩基の数)。長さ18な
いし49塩基対のハイブリッドについては、
Tm(℃)=81.5+16.6(log10[Na])+0.41(%G+C)-(600/N)であり、Nはハイブリッド
の塩基数であり、ハイブリダイゼーションバッファー中のナトリウムイオン濃度
である(1XSSCについての[Na+]=0.165M)。
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのための厳密さの条件のさらなる例
はSambrook,J.,E.F.Fritsch,and T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:A
Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Har
bor,NY,chapters 9 and 11,and Current Protocols in Molecular Biology,
1995,F.M.Ausubel et al.,eds.,John Wiley & Sons,Inc.,sections 2.10
and 6.3-6.4に記載されており、参照により本明細書に記載されているものとみ
なす。
好ましくは、かかるハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドのそれぞれ
が、ハイブリダイゼーションすべき本発明ポリヌクレオチドの少なくとも25%
(より好ましくは、少なくとも50%、最も好ましくは、少なくとも75%)の
長さを有
し、ハイブリダイゼーションすべき本発明ポリヌクレオチドに対して少なくとも
60%の配列同一性(より好ましくは、少なくとも75%の同一性、最も好まし
くは、少なくとも90%または95%の同一性)を有する。配列同一性は、配列
のギャップを最小にしつつ、重複および同一性を最大にするように配列を並置し
た場合に蛋白のアミノ酸配列を比較することにより決定される。
本発明蛋白をコードしている単離ポリヌクレオチドを、Kaufman et al.,Nucl
eic Acids Res.19,4485-4490(1991)に開示のpMT2またはpED発現ベクタ
ーのごとき発現制御配列に作動可能に連結して、蛋白を組み換え的に製造しても
よい。多くの適当な発現制御配列が当該分野において知られている。多くの適当
な発現制御配列が当該分野において知られている。組み換え蛋白発現のための一
般的方法も知られており、R.Kaufman,Methods in Enzymology 185,537-566(1
990)が典型例である。ここで定義する「作動可能に連結」とは、本発明単離ポリ
ヌクレオチドおよび発現制御配列がベクターまたは細胞中に置かれ、連結された
ポリヌクレオチド/発現制御配列で形質転換(トランスフェクション)された宿
主細胞により発現されるようになっていることを意味する。
多くのタイプの細胞は本発明蛋白の発現に適した宿主細胞として作用しうる。
哺乳動物細胞は、例えば、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CH
O)細胞、ヒト腎臓293細胞、ヒト表皮A431細胞、ヒトColo205細
胞、3T3細胞、CV−1細胞、他の形質転換された霊長類細胞系、正常2倍体
細胞、一次組織のインビトロ培養から得られる細胞株、一次エクスプラント、H
eLa細胞、マウス細胞、BHK、HL−60、U937HaKまたはJurkat細
胞を包含する。
別法として、酵母のごとき下等真核細胞または細菌のごとき原核細胞において
蛋白を製造することが可能である。潜在的に適当な酵母株は、Saccharomyces ce
revisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces株、Candida、または異
種蛋白を発現可能な酵母株を包含する。潜在的に適当な細菌株は、Escherichia
coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、または異種蛋白を発現可
能な細菌株を包含する。蛋白が酵母または細菌において生成される場合、その中
で生成され
た蛋白を、例えば適当部位のリン酸化またはグリコシレーションにより修飾して
機能的蛋白を得る必要があるかもしれない。既知化学的または酵素的方法を用い
てかかる共有結合を行ってもよい。
本発明単離ポリヌクレオチドを1種またはそれ以上の昆虫発現ベクター中の適
当な制御配列に作動可能に連結し、昆虫発現系を用いることにより蛋白を得ても
よい。バキュロウイルス/昆虫細胞発現系のための材料および方法は、例えばIn
vitrogen,San Diego,California,USAからのキット形態(MaxBacRキット)で
市販されており、かかる方法は当該分野においてよく知られており、Summersお
よびSmith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)
(参照により本明細書に記載されているものとみなす)に記載のようなものがあ
る。本明細書で用いるように、本発明ポリヌクレオチドを発現可能な昆虫細胞は
「形質転換」されている。
組み換え蛋白の発現に適した培養条件下で形質転換宿主細胞を培養することに
より本発明蛋白を製造してもよい。次いで、得られた発現蛋白を、ゲル濾過およ
びイオン交換クロマトグラフィーのごとき既知精製プロセスを用いてかかる培養
物(すなわち、培地または細胞抽出物)から精製してもよい。また、蛋白の精製
は、蛋白に結合するであろう作用剤を含有するアフィニティーカラム,コンカナ
バリンA−アガロース、ヘパリン−トヨパールRまたはCibacrom blue 3GAセファ
ロースRのごときアフィニティーカラムによる1またはそれ以上のカラム工程;
フェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルのごとき樹脂を用
いる疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いる1またはそれ以上の工程;ある
いは免疫アフィニティークロマトグラフィーを包含する。
別法として、本発明蛋白を精製容易形態として発現させてもよい。例えば、マ
ルトース結合蛋白(MBP)、グルタチオン−S−トンスフェラーゼ(GST)
またはチオレドキシン(TRX)との融合蛋白のごとき融合蛋白として発現させ
てもよい。かかる融合蛋白の発現および精製のためのキットは、それぞれNew En
glan BioLab(Beverly,MA)、Pharmacia(Piscataway,NJ)およびInVitrogenから
市販されている。蛋白にエピトープでタグを付し、次いで、かかるエピトープに
指向された特異的抗体を用いることにより精製することもできる。1のかかるエ
ピトープ(「フラッ
グ」)はKodak(New Haeven,CT)から市販されている。
最後に、疎水性RP−HPLC媒体、例えば懸垂メチルまたは他の脂肪族基を
有するシリカゲルを用いる1またはそれ以上の逆相高品質液体クロマトグラフィ
ー(RP−PLC)工程を用いてさらに蛋白を精製することができる。いくつかま
たはすべての上記精製工程を種々組み合わせて用いて実質的に均一な単離組み換
え蛋白を得ることもできる。かくして精製された蛋白は他の哺乳動物蛋白を実質
的に含まず、本発明において「単離蛋白」と定義される。
本発明蛋白をトランスジェニック動物の生産物として、例えば、蛋白をコード
しているヌクレオチド配列を含む体細胞または生殖細胞により特徴づけられるト
ランスジェニックウシ、ヤギ、ブタ、またはヒツジの乳の成分として発現させて
もよい。
既知の慣用的化学合成により蛋白を製造してもよい。合成的手段による本発明
蛋白の構築方法は当業者に知られている。合成的に構築された蛋白配列は、一次
、二次または三次構造および/またはコンホーメーション特性を共有することに
よって、蛋白活性をはじめとする共通の生物学的特性を有する可能性がある。よ
って、それらを、治療化合物のスクリーニングおよび抗体の生成のための免疫学
的プロセスにおいて、天然の精製蛋白の生物学的活性または免疫学的置換物とし
て使用してもよい。
本明細書に示す蛋白は、精製蛋白のアミノ酸配列に類似したアミノ酸配列によ
り特徴づけられるが、その中に自然にあるいは誘導体化によって修飾されていて
もよい。例えば、ペプチドまたはDNA配列の修飾は既知方法を用いて当業者に
より行われうる。蛋白配列中の目的とされる修飾は、コーディング配列中の選択
アミノ酸残基の変化、置換、交換、挿入または欠失を包含する。例えば、1個ま
たはそれ以上のシステイン残基を欠失させ、あるいは別のアミノ酸と交換して分
子のコンホーメーションを変化させてもよい。かかる変化、置換、交換、挿入ま
たは欠失のための方法は当業者によく知られている(例えば、米国特許第415
8584号参照)。好ましくは、かかる変化、置換、交換、挿入または欠失は蛋
白の所望活性を保持するものである。
全体的または部分的に蛋白活性を保持すると期待され、かくしてスクリーニン
グ
または他の免疫学的方法に有用でありうる蛋白配列の他のフラグメントお上び誘
導体も、本明細書の開示から当業者により作成されうる。かかる修飾は本発明に
より包含されると確信される。用途および生物学的活性
本発明ポリヌクレオチドおよび蛋白は、下記の1またはそれ以上の用途または
生物学的活性(本明細書に引用されたアッセイに関連するものも含む)を示すと
考えられる。本発明蛋白に関して説明された用途または活性は、かかる蛋白の投
与または使用により、あるいはかかる蛋白をコードしているポリヌクレオチドの
投与または使用(例えば、遺伝子治療またはDNA導入に適したベクターのごと
き)により提供されうる。研究用途および有用性
本発明により提供されるポリヌクレオチドは、研究集団によって種々の目的に
使用されうる。分析用に、特徴づけまたは治療用途に、対応蛋白が優先的に発現
される(構成的に、または組織分化もしくは発達の特定段階において、または疾
病状態において発現される)組織のマーカーとして、さらにはサザンゲルの分子
量マーカーとして、染色体の同定または関連遺伝子位置のマッピングのための染
色体マーカーまたはタグとして(標識された場合)、患者の内在性DNAと比較
して潜在的な遺伝病の同定を行うために、ハイブリダイゼーションするプローブ
として用いて新規な関連DNA配列を発見するために、遺伝学的フィンガープリ
ンティングのためのPCRプライマーを得るための情報源として、他の新規ポリ
ヌクレオチドを発見するプロセスにおいて既知配列を差し引くためのプローブと
して、「遺伝子チップ」または他の支持体に結合させるためにオリゴマーを選択
し作成するために、発現パターンの試験のために、DNA免疫法を用いて抗蛋白
抗体を生成させるために、ならびに抗DNA抗体を生成させ、あるいはさらなる
免疫応答を誘導するための抗原として、ポリヌクレオチドを使用することができ
る。別の蛋白に結合または潜在的に結合(例えば、受容体−リガンド相互作用に
おけるように)する蛋白をコードし
ている場合、結合する他の蛋白を同定し、あるいは、または結合相互作用の阻害
剤を同定するための相互作用トラップアッセイ(例えば、Gyuris et al.,Cell
75:791-803(1993)に記載されたような)においてポリヌクレオチドを使用するこ
とができる。
本発明により提供される蛋白は、高処理量スクリーニングのための一群の多数
の蛋白を含む、生物学的活性を決定するためのアッセイに;抗体の生成または他
の免疫応答を誘導するために;生物学的液体中の蛋白(またはその受容体)のレ
ベルを定量的に決定するために設計されたアッセイにおける試薬(標識試薬を包
含)として;対応蛋白が優先的に発現される(構成的に、または組織分化もしく
は発達の特定段階において、または疾病状態において発現される)組織のマーカ
ーとして;ならびに、もちろん関連受容体またはリガンドを単離するために用い
てもよい。蛋白がもう1つの蛋白に結合または潜在的に結合する場合、結合する
他の蛋白を同定し、あるいは、または結合相互作用の阻害剤を同定するために蛋
白を使用することができる。これらの結合相互作用に関与する蛋白を用いて、結
合相互作用に関するペプチドまたは小型分子状阻害剤またはアゴニストのスクリ
ーニングを行うこともできる。
これらの研究用途のいずれかまたはすべては、研究用製品として商品化するた
めに試薬グレードまたはキットのフォーマットへと発展させることができる。
上記使用を実行するための方法は当業者によく知られている。かかる方法を開
示する文献は、"Molecular Cloning:A Laboratory Manual",2nd ed.,Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press,Sambrook,J.,E.F.Fritschand T.Maniatised
s.,1989,および"Methods in Enzymology:Guide to Molecular Cloning Techni
ques",Academic Press,Berger,S.L.and A.R.Kimmel eds.,1987を包含する
が、これらに限らない。
栄養としての用途
本発明ポリヌクレオチドおよび蛋白を栄養源または添加物として使用すること
ができる。かかる用途は、蛋白またはアミノ酸添加物としての用途、炭素源とし
ての
用途、窒素源としての用途および炭水化物源としての用途を包含するが、これら
に限らない。かかる場合、本発明蛋白またはポリヌクレオチドを特定の生物のエ
サとして添加してもよく、あるいは粉末、ピル、溶液、懸濁液またはカプセルの
形態のごとき別個の個体または液体調合物として投与することもできる。微生物
の場合、微生物が培養される培地に本発明蛋白またはポリヌクレオチドを添加す
ることができる。
サイトカインおよび細胞増殖/分化活性
本発明蛋白はサイトカイン活性、細胞増殖活性(誘導もしくは阻害)または細
胞分化活性(誘導もしくは阻害)を示しうるか、またはある種の細胞集団におい
て他のサイトカインの産生を誘導しうる。今日まで見いだされてきた多くの蛋白
性因子(すべての既知サイトカインを包含)は、1またはそれ以上の因子依存的
細胞増殖アッセイにおいて活性を示しており、よって、アッセイはサイトカイン
活性の便利な確認法として役立つ。本発明蛋白の活性は、細胞系(32D、DA
2、DA1G、T10、B9、B9/11、BaF3、MC9/G、M+(pr
eB M+)、2E8、RB5、DA1、123、T1165、HT2、CTL
L2、TF−1、Mo7eおよびCMKを包含するが、これらに限らない)のた
めの多くの常套的な因子依存的細胞増殖アッセイのいずれかにより確認される。
本発明蛋白の活性を、とりわけ、下記方法により測定してもよい:
T細胞または胸腺細胞の増殖についてのアッセイは、
Current Protocols in Immunology,Ed by J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.
H.Margulies,E.M.Shevach,W Strober,Pub.Greene Publishing Associates
and Wiley-Interscience(Chapter 3,In Vitro assays for Mouse Lymphocyte
Function 3.1-3.19;Chapter 7,Immunologic studies in Humans);Takai et al.
,J.Immunol.137:3494-3500,1986;Bertagnolli et al.,J.Immunol.145:17
06-1712,1990;Bertagnolli et al.,Cellular Immunology 133:327-341,1991;
Bertagnolli,et al.,J.Immunol.149:3778-3783,1992;Bowman et al.,J.I
mmunol.152:1756−1761,1994
に記載されたものを包含するが、これらに限らない。
脾臓細胞、リンパ節細胞または胸腺細胞のサイトカイン生成および/または増
殖に関するアッセイは、
Polyclonal T cell stimulation,Kruisbeek,A.M.and Shevach,E.M.In Curr
ent Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan eds.Vol 1pp.3.12.1-3.12.
14,John Wiley and Sons,Toronto.1994;and Measurement of mouse and huma
n Interferon γ,Schreiber,R.D.In Current Protocols in Immunology.J.E
.e.a.Coligan eds.Vol 1pp.6.8.1-6.8.8,John Wiley and Sons,Toronto.1
994
に記載されたものを包含するが、これらに限らない。
造血およびリンパ生成細胞の増殖および分化についてのアッセイは、
Measurement of Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4,Bottoml
y,K.,Davis,L.S.and Lipsky,P.E.In Current Protocols in Immunology.
J.E.e.a.Coligan eds.Vol 1pp.6.3.1-6.3.12,John Wiley and Sons,Toront
o.1991;deVries et al.,J.Exp.Med.173:1205-1211,1991;Moreau et al.,
Nature 336:690-692,1988;Greenberger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.80:2931-2938,1983;Measurement of mouse and human interleukin 6-Norda
n,R.In Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan eds.Vol 1pp
.6.6.1-6.6.5,John Wiley and Sons,Toronto.1991;Smith et al.,Proc.Na
tl.Acad.Sci.U.S.A.83:1857-1861,1986;Measurement of human Interleuki
n 11-Bennett,F.,Giannotti,J.,Clark,S.C.and Turner,K.J.In Curren
t Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan eds.Vol 1 pp.6.15.1 John W
iley and Sons,Toronto.1991;Measurement of mouse and human Interleukin
9-Ciarletta,A.,Giannotti,J.,Clark,S.C.and Turner,K.J.In Current
Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan eds.Vol 1pp.6.13.1,John Wil
ey and Sons,Toronto.1991
に記載されたものを包含するが、これらに限らない。
抗原に対するT細胞クローンの応答についてのアッセイ(特に、増殖およびサ
イトカイン産生を測定することによりAPC−T細胞相互作用ならびに直接的な
T細
胞の効果を同定する)は、
Current Protocols in Immunology,Ed by J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.
H.Margulies,E.M.Shevach,W Strober,Pub.Greene Publishing Associates
and Wiley-Interscience(Chapter 3,In Vitroassays for Mouse Lymphocyte F
unction;Chapter 6,Cytokines and their cellular receptors;Chapter 7,Imm
unologic studies in Humans);Weinberger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 77:6091-6095,1980;Weinberger et al.,Eur.J.Immun.11:405-411,1981;
Takai et al.,J.Immunol.137:3494-3500,1986;Takai et al.,J.Immunol.
140:508-512,1988
に記載されたものを包含するが、これらに限らない。
免疫刺激または抑制活性
また本発明蛋印ま、本明細書記載のアッセイにおける活性(これらに限らない
)を包含する免疫刺激または免疫抑制活性を示すものであってもよい。蛋白は、
種々の欠乏症および障害(重症の免疫欠乏合併症(SCID)を包含)において
有用である可能性があり、例えば、Tおよび/またはBリンパ球の増殖をアップ
レギュレーションまたはダウンレギュレーションすることにおいて、ならびにN
K細胞および他の細胞集団の細胞溶解活性を有効ならしめることにおいて有用で
ありうる。これらの免疫欠乏症は遺伝的なものであってもよく、またウイルス(
例えば、HIV)ならびに細菌または真菌感染により引き起こされるものであっ
てもよく、あるいは自己免疫疾患により引き起こされるものであってもよい。よ
り詳細には、ウイルス、細菌、真菌または他の感染物質により引き起こされる感
染性疾患、例えば、HIV、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ミコバクテリア
、レシュマニア、マラリアおよびカンジダ種のごとき種々の真菌感染症を、本発
明蛋白を用いて治療可能である。もちろん、この点において、免疫系に対するブ
ーストが必要な場合、すなわち、癌の治療において、本発明蛋白を用いてよい。
本発明蛋白を用いて治療してもよい自己免疫疾患は、例えば、多発性硬化症、
全身性の深在性エリトマーデス、リューマチ性関節炎、自己免疫性肺炎、
Guillain-Barre症候群、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病、重症筋
無力症、対宿主移植片疾患および自己免疫性の炎症性の目の疾患を包含する。本
発明のかかる蛋白を、喘息または他の呼吸器系の疾患のごときアレルギー性反応
および症状の治療に用いてもよい。免疫抑制が望まれる他の症状(例えば、喘息
(特にアレルギー性喘息)および関連呼吸器系の問題を包含)を本発明蛋白を用
いて治療してもよい。免疫抑制が望まれる他の状態(例えば、器官移植を包含)
を、本発明蛋白を用いて治療してもよい。
本発明蛋白を用いて、多くのやり方で免疫応答を可能にすることもできる。ダ
ウンレギュレーションは、すでに進行中の免疫応答を阻害またはブロックする形
態のものであってもよく、あるいは免疫応答の誘導を妨害することを含むもので
あってもよい。T細胞応答を抑制することにより、あるいはT細胞中に特異的な
耐性を誘導することにより、あるいはその両方により活性化T細胞の機能を阻害
してもよい。一般的には、T細胞応答の免疫抑制は活性のある、非抗原特異的な
プロセスであり、T細胞を抑制剤に連続的に曝露することを必要とする。耐性と
は、T細胞における非応答性またはアネルギーを意味し、一般的には抗原特異的
であり耐性化剤への曝露を止めた後も持続するという点で免疫抑制とは異なる。
操作上は、耐性化剤の不存在下で特異的抗原に曝露した際のT細胞応答の欠如に
より耐性が示されうる。
1またはそれ以上の抗原機能(Bリンパ球抗原機能(例えばB7のごとき)を
包含するが、これに限らない)をダウンレギュレーションすることまたは妨害す
ること、例えば、活性化T細胞による高レベルのリンホカイン合成の妨害は、組
織、皮膚および器官の移植および対宿主移植片疾患(GVHD)において有用で
あろう。例えば、T細胞機能のブロックは組織移植における組織破壊を減少させ
るはずである。典型的には、組織移植において、移植片の拒絶反応は、組織片が
T細胞により外来のものと認識されることにより開始され、次いで、移植片を破
壊する免疫反応が起こる。免疫細胞上でのB7リンパ球抗原とその本来的なリガ
ンドとの相互作用を阻害またはブロックする分子(別のBリンパ球抗原(例えば
、B7−1、B7−3)の活性を有するモノマー形態のペプチドと混合された、
あるいは単独の、B7−2活性を有する可溶性でモノマー形態のペプチド)の移
植前の投与は、応答的な
同時刺激シグナルを伝達することなく免疫細胞上の本来のリガンドへの分子の結
合を誘導する可能性がある。この点においてBリンパ球抗原機能をブロックする
ことは、T細胞のごとき免疫細胞によるサイトカイン合成を妨害し、かくして、
免疫抑制剤として作用する。そのうえ、同時刺激の欠如はT細胞の反応を失わせ
るのに十分でありうる。Bリンパ球抗原ブロッキング試薬による長期の耐性の誘
導により、これらのブロッキング試薬の繰り返し投与の必要性が回避されうる。
対象において十分な免疫抑制または耐性を達成するためには、Bリンパ球抗原の
組み合わせの機能をブロックすることも必要かもしれない。
器官移植拒絶反応またはGVHDを妨害することにおける個々のブロッキング
試薬の有効性を、ヒトにおける有効性を推定しうる動物モデルを用いて評価する
ことができる。使用可能な適当な系の例は、ラットにおける同種心臓移植片およ
びマウスにおける異種膵臓島細胞移植片を包含し、それらは両方ともインビボで
のCTLA4Ig融合蛋白の免疫抑制効果を試験するために使用された(Lenscho
w et al.,Science 257:789-792(1992)およびTurka et al.,Proc Natl.Acad.
Sci.USA,89:11102-11105(1992)に記載されている)。さらに、GVHDのネズ
ミモデル(Paul ed.,Fundamental Immunology,Ravan Press,New York,1989,
pp.846-847参照)を用いて、インビボでの当該疾患の進行に対するBリンパ球抗
原機能のブロッキング効果を決定することができる。
また、抗原機能をブロックすることは自己免疫疾患の治療にとり治療的に有用
でありうる。多くの自己免疫疾患は、自己組織に対して反応性があり、疾病の病
理に関与するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進するT細胞の不適当な活
性化の結果である。自己反応性T細胞の活性化を妨害することは疾病の徴候を減
少または除去しうる。Bリンパ球抗原の受容体:リガンド相互作用を破壊するこ
とによりT細胞の同時刺激をブロックする試薬の投与を用いてT細胞活性化を阻
害し、疾病プロセスに関与しうる自己抗体またはT細胞由来のサイトカインの産
生を妨害することができる。さらに、ブロッキング試薬は、疾病の長期の寛解を
導く可能性のある自己反応性T細胞の抗原特異的耐性を誘導しうる。自己免疫疾
患の予防または改善におけるブロッキング試薬の有効性を、ヒトの自己免疫疾患
についての十分に特徴
づけられた多くの動物モデルを用いて決定することができる。例は、ネズミの実
験的自己免疫脳炎、MRLlpr/1prマウスまたはNZBハイブリッドマウ
スにおける全身性深在性エリトマトーデス、ネズミ自己免疫コラーゲン関節炎、
NODマウスおよびBBラットにおける糖尿病、およびネズミの実験的重症筋無
力症(Paul ed.,Fundamental Immunology,Raven Press,New York,1989,pp.
840-856)を包含する。
免疫応答をアップレギュレーションするための手段としての抗原機能(好まし
くは、Bリンパ球抗原機能)のアップレギュレーションは治療に有用でもある。
免疫応答のアップレギュレーションは存在している免疫応答を促進する形態また
は最初の免疫応答を除去する形態であってよい。例えば、Bリンパ球抗原機能を
刺激することによる免疫応答の促進は、ウイルス感染の場合に有用でありうる。
さらに、インフルエンザ、通常のかぜ、および脳炎のごとき全身的なウイルス性
疾患を、刺激性形態のBリンパ球抗原を全身投与することにより改善してもよい
。
別法として、T細胞を患者から取り、本発明ペプチドを発現するACPsを付
加したウイルス抗原とともにインビトロにおいてT細胞を同時刺激するか、また
は刺激性形態の本発明可溶性ペプチドと一緒にし、次いで、インビトロで活性化
されたT細胞を患者体内に再導入することにより、感染患者における抗ウイルス
免疫応答を促進してもよい。抗ウイルス免疫応答を促進するもう1つの方法は、
感染細胞を患者から取り、本明細書記載の本発明蛋白をコードする核酸をそれら
にトランスフェクションして細胞がその表面に蛋白全体または一部を発現するよ
うにし、次いで、トランスフェクション細胞を患者体内に再導入することであろ
う。すると、感染細胞はインビボにおいて同時刺激シグナルをT細胞に伝えるこ
とができ、そのことによりT細胞を活性化することができよう。
もう1つの適用例において、抗原機能(好ましくは、Bリンパ球抗原機能)のア
ップレギュレーションまたは促進は腫瘍免疫性の誘導において有用でありうる。
本発明の少なくとも1種のペプチドをコードする核酸でトランスフェクションさ
れた腫瘍細胞(例えば、肉腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、神経芽細胞腫、癌腫
)を対象に投与して対象中の腫瘍特異的耐性を克服することができる。所望なら
ば、腫瘍細
胞をトランスフェクションしてペプチドの組み合わせを発現させることができる
。例えば、患者から得た腫瘍細胞を、B7−2様活性を有するペプチドのみ、ま
たはB7−1様活性および/またはB7−3様活性を有するペプチドと組み合わ
せて発現することを指令する発現ベクターで、エクスビボにおいてトランスフェ
クションすることができる。トランスフェクションされた腫瘍細胞を患者に戻し
て、トランスフェクションされた細胞の表面上にペプチドを発現させる。別法と
して、遺伝子治療法を用いてインビボでのトランスフェクションのために腫瘍細
胞を標的化することができる。
腫瘍細胞表面上におけるBリンパ球抗原の活性を有する本発明ペプチドの存在
は、T細胞に必要な同時刺激シグナルを提供して、T細胞により媒介されるトラ
ンスフェクションされた腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導する。さらに、MHC
クラスIまたはMHCクラスII分子を欠く腫瘍細胞、あるいは十分量のMHC
クラスIまたはMHCクラスII分子を再発現できない腫瘍細胞を、MHCクラ
スIα鎖蛋白およびβ2マイクログロブリン蛋白またはMHCクラスIIα鎖お
よびMHCクラスIIβ鎖蛋白の全体または一部(例えば、末端切断蛋白の細胞
質ドメイン)をコードしている核酸でトランスフェクションして、そのことによ
りクラスIまたはクラスIIMHC蛋白を細胞表面上に発現させることができる
。Bリンパ球抗原(例えば、B7−1、B7−2、B7−3)の活性を有するペ
プチドと組み合わせた適当なクラスIまたはクラスII HMCの発現は、T細
胞により媒介されるトランスフェクションされた腫瘍細胞に対する免疫応答を誘
導する。所望により、不変鎖のごとき、MHCクラスII結合蛋白の発現をブロ
ックするアンチセンス構築物をコードしている遺伝子を、Bリンパ球抗原の活性
を有するペプチドをコードしているDNAとともに同時トランスフェクションし
て腫瘍関連抗原の提示を促進し、腫瘍特異的免疫性を誘導こともできる。よって
、ヒト対象におけるT細胞により媒介される免疫応答の誘導は、対象における腫
瘍特異的耐性を克服するに十分でありうる。
本発明蛋白の活性を、特に、下記方法により測定してもよい:
胸腺細胞または脾臓細胞の細胞毒性に適したアッセイは、
Current Protocols in Immunology,Ed by J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.
H.
Margulies,E.M.Shevach,W Strober,Pub.Greene Publishing Associates an
d Wiley-Interscience(Chapter 3,In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Fun
ction 3.1-3.19;Chapter 7,Immunologic studies in Humans);Herrmann et al.
,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2488-2492,1981;Herrmann et al.,J.Immu
nol.128:1968-1974,1982;Handa et al.,J.Immunol.135:1564-1572,1985;T
akai et al.,J.Immunol.137:3494-3500,1986;Takai et al.,J.Immunol.1
40:508-512,1988;Herrmann et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2488-249
2,1981;Herrmann et al.,J.Immunol.128:1968-1974,1982;Handa et al.,J
.Immunol.135:1564-1572,1985;Takai et al.,J.Immunol.137:3494-3500,
1986;Bowman et al.,J.Virology 61:1992-1998;Takai et al.,J.Immunol.1
40:508-512,1988;Bertagnolli et al.,Cellular Immunology 133:327-341,19
91;Brown et al.,J.Immunol.153:3079-3092,1994
に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない。
T細胞依存性免疫グロブリン応答およびイソタイプスイッチングのためのアッ
セイ(特に、T細胞依存性抗体応答を転調させ、Th1/Th2プロフィールに
影響する蛋白を同定する)は、Maliazewski,J.Immunol.144:3028-3033,1990に記
載されているアッセイを包含するが、これに限らず、さらにB細胞の機能のアッ
セイは、In vitro antibody production,Mond,J.J.and Brunswick,M.In Current
Protocols in Immunology J.E.Coligan eds.Val 1pp.3.8.1-3.8.16,John Wiley
and Sons,Tronto 1994に記載のアッセイを包含する。
混合リンパ球反応(MLR)アッセイ(特に、主としてTh1およひCTL応
答を発生させる蛋白を同定する)は、
Current Protocols in Immunology,Ed by J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.
H.Margulies,E.M.Shevach,W Strober,Pub.Greene Publishing Associates
and Wiley-Interscience(Chapter 3,In Vitro assays for Mouse Lymphocyte
Function 3.1-3.19;Chapter 7,Immunologic studies in Humans);Takai et al.
,J.Immnunol.137:3494-3500,1986;Takai et al.,J.Immunol.140:508-512
,1988;Bertagnolli et al.,J.Immunol.149:3778-3783,1992
に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない。
樹枝状細胞依存的アッセイ(特に、無処理のT細胞を活性化する樹枝状細胞に
より発現される蛋白を同定する)は、
Guery et al.,J.Immunol.134:536-544,1995;Inaba et al.,Journal of Exp
erimental Medicine 173:549-559,1991;Macatonia et al.,Journal of Immuno
logy 154:5071-5079,1995;Porgador et al.,Journal of Exp-erimental Medic
ine 182:255-260,1995;Nair et al.,Journal of Virology 67:4062-4069,1
993;Huang et al.,Science 264:961-965,1994;Macatonia et al.,Journal o
f Experimental Medicine 169:1255-1264,1989;Bhardwaj et al.,Journal of
Clinical Investigation 94:797-807,1994;and Inaba et al.,Journal of Exp
erimental Medicine 172:631-640,1990
に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない。
リンパ球生存/アポトーシスのアッセイ(特に、超抗体誘導後のアポトーシス
を防止する蛋白、ならびにリンパ球のホメオスタシスを調節する蛋白を同定する
)は、Darzynkiewicz et al.,Cytometry 13:795-808,1992;Gorczyca et al.,
Leukemia 7:659-670,1993;Gorczyca et al.,Cancer Research 53:1945-1951,
1993;Itoh et al.,Cell 66:233-243,1991;Zacharchuk,Journal of Immunolog
y 145:4037-4045,1990;Zamai et al.,Cytometry 14:891-897,1993;Gorczyca
et al.,International Journal of Oncology 1:639-648,1992
に記載のアッセイを包含するが、これらに限らない。
初期段階のT細胞のコミットメント(commi tment)および発達のアッセイは、A
ntica et al.,Blood 84:111-117,1994;Fine et al.,Cellular Immunology 155:1
11-122,1994;Galy et al.,Blood 85:2770-2778,1995;Toki et al.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA88:7548-7551,1991に記載のアッセイを包含するが、これら
に限らない。
造血調節活性
本発明蛋白は、造血の調節において有用であり、それゆえ、骨髄およびリンパ
球欠乏症の治療において有用である。コロニー形成細胞または因子依存性細胞系
を支
持する最低限の生物学的活性でさえも、造血の調節への関与を示している。例え
ば、赤血球系前駆細胞のみの増殖を支持すること、あるいは他のサイトカインと
組み合わされて、例えば種々の貧血の治療に有用性を示すこと、あるいは放射線
療法/化学療法と組み合わされて赤芽前駆細胞および/または赤芽細胞の産生を
刺激すること;顆粒球のごとき骨髄細胞および単球/マクロファージの増殖を支
持すること(すなわち、伝統的なCSF活性)、例えば、化学療法と組み合わされ
て、引き続き起こる骨髄抑制を防止することに有用であり;巨核細胞の増殖、次
いで、血小板の増殖を支持すること、またそれにより血小板減少症のごとき種々
の血小板疾患を予防または治療することに有用であり、また一般的には血小板輸
液の代わりにあるいはそれと相補的に使用され;さらに/あるいは造血幹細胞(
成熟して上記のすべての造血細胞となり、それゆえ、種々の幹細胞疾患(通常に
は、移植により治療される疾患であり、例えば、再生不良性貧血および発作性の
夜間ヘモグロビン尿症)において有用性がわかる)の増殖を支持することに有用
であり、さらにはインビボまたはエクスビボでの放射線/化学療法後(すなわち
、骨髄移植と組み合わされる)、あるいは遺伝子治療のために遺伝子操作された
後の幹細胞コンパートメントの正常細胞としての再増殖においても有用である。
本発明蛋白の活性を、特に、下記方法測定してもよい。
種々の造血細胞系の増殖および分化に適したアッセイはすでに引用されている
。
胚の幹細胞の分化のアッセイ(特に、胚の分化造血に影響する蛋白を同定する
)は、Johansson et al.Cellular Biology 15:141-151,1995;Keller et al.,
Molecular and Cellular Biology 13:473-486,1993;McClanahan et al.,Blood
81:2903-2915,1993に記載のアッセイを包含するが、これらに限らない。
幹細胞生存および分化のアッセイ(特に、リンパ-造血を調節する蛋白を同定
する)は、
Methylcellulose colony forming assays,Freshney,M.G.In Culture of Hema
topoietic Cells.R.I.Freshney,et al.eds.Vol pp.265-268,Wiley-Liss
,Inc.,New York,NY.1994;Hirayama et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89
:5907-5911,1992;Primitive hematopoietic colony forming cells with high
proliferative potential,McNiece,I.K.and Briddell,R.A.In Culture of
Hematopoietic Cells.R.I.Freshney,et al.eds.Vol pp.23-39,Wiley-Li
ss,Inc.,New York,NY.1994;Neben et al.,Experimental Hematology 22:353
-359,1994;Cobblestone area forming cell assay,Ploemacher,R.E.In Cul
ture of Hematopoietic Cells.R.I.Freshney,et al.eds.Vol pp.1-21,W
iley-Liss,Inc..,New York,NY.1994;Long term bone marrow cultures in t
he presence of stromal cells,Spooncer,E.,Dexter,M.and Allen,T.In
Culture of Hematopoietic Cells.R.I.Freshney,et al.eds.Vol pp.163-
179,Wiley-Liss,Inc.,New York,NY.1994;Long term culture in itiating
cell assay,Sutherland,H.J.In Culture of Hematopoietic Cells.R.I.Fre
shney,et al.eds.Vol pp.139-162,Wiley-Liss,Inc.,New York,NY.199
4
に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない。
組織増殖活性
本発明蛋白は、骨、軟骨、鍵、靭帯および/または神経組織の成長または再生
、ならびに傷の治癒および組織修復に用いる組成物において、さらに熱傷、裂傷
および潰瘍の治療において有用性を有する。
骨が正常に形成されない環境において軟骨および/または骨の成長誘導する本
発明蛋白は、ヒトおよび他の動物における骨折および軟骨損傷または欠損の治癒
における用途がある。本発明蛋白を用いるかかる調合物は、閉鎖性骨折ならびに
解放性骨折の軽減に有用であり、また人工関節の固定の改善にも有用である。骨
形成剤により誘導されるデノボ骨形成は、先天性の、外傷による、あるいは腫瘍
学的切除により誘発される脳顔面頭蓋の欠損の修復に貢献し、さらに美容整形外
科手術においても有用である。
本発明蛋白を歯周病の治療および他の歯の修復プロセスに用いてもよい。かか
る作用剤は、骨形成細胞を誘引する環境を提供し、骨形成細胞の増殖を刺激し、
あるいは骨形成細胞前駆体の分化を誘導しうる。本発明蛋白は、例えば、骨およ
び/または軟骨修復の刺激により、あるいは炎症または炎症プロセスにより媒介
される組
織破壊のプロセス(コラゲナーゼ活性、破骨細胞活性等)をブロックすることに
より、骨粗鬆症または骨関節炎の治療においても有用でありうる。
本発明蛋白によるものとしてもよい組織発生活性のもう1つのカテゴリーは鍵
/靭帯の形成である。鍵/靭帯様組織または他の組織が正常に形成されない環境
におけるかかる組織の形成を誘導する本発明蛋白は、ヒトおよび他の動物におけ
る鍵または靭帯の裂傷、変形および他の鍵または靭帯の欠損の治癒、に適用され
る。鍵/靭帯様組織誘導蛋白を用いるかかる調合物は、鍵または靭帯組織に対す
るダメージの予防ならびに鍵または靭帯の骨または他の組織への固定の改善に用
いてもよい。本発明組成物により誘導されるデノボ鍵/靭帯様組織形成は、先天
性の、外傷による、あるいは腫瘍学的切除により誘発される脳顔面頭蓋の欠損の
修復に貢献し、さらに鍵または靭帯の付着または修復のための美容整形外科手術
においても有用である。本発明組成物は、鍵−または靭帯−形成細胞を誘引する
ための環境を提供し、鍵−または靭帯−形成細胞の増殖を刺激し、鍵−または靭
帯−形成細胞の前駆体の分化を誘導し、あるいはインビボに戻した場合に組織修
復を行うようにエクスビボでの鍵/靭帯細胞または前駆体の増殖を誘導しうる。
本発明組成物は、鍵炎、手根骨トンネル症候群および他の鍵または靭帯の欠損に
も有用である。本発明組成物は、適当なマトリックスおよび/または当該分野で
よく知られた担体のごとき隔離剤を含んでいてもよい。
本発明蛋白は、神経細胞の増殖ならびに神経および脳組織の再生に、すなわち
、中枢および末梢神経系疾患およびニューロパシーならびに機械的疾患および外
傷性疾患(神経細胞または神経組織に対する変性、死もしくは外傷を包含)の治
療にも有用でありうる。より詳細には、末梢神経傷害、末梢ニューロパシーおよ
び局在化ニューロパシーのごとき末梢神経系の疾病、ならびにアルツハイマー病
、パーキンソン病、ハンチントン病、筋委縮性外側脊髄硬化症およびShy-Drager
症候群のごとき中枢神経系の疾病の治療に蛋白を使用してもよい。本発明により
治療してもよいさらなる症状は、脊髄疾患のごとき機械的疾患および外傷性疾患
、頭部外傷ならびに卒中のごとき脳血管系の疾患を包含する。化学療法または他
の医学的療法により引き起こされる末梢ニューロパシーは、本発明蛋白を用いて
治療可能である。
また本発明蛋印ま、圧迫性潰瘍、血管機能不全に関連した潰瘍、外科的および
外傷による創傷等(これらに限らない)を包含する非治癒性創傷のより好ましく
迅速な閉口の促進にも有用でありうる。
また本発明蛋白は、器官(例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮を包含
)、筋肉(平滑筋、骨格筋または心筋)、および血管(血管内皮を包含)組織の
ごとき他の組織の発生、あるいはかかる組織を構成している細胞の増殖促進のた
めの活性を示しうる。望ましい効果の一部は、線維症性瘢痕を抑制することによ
る正常組織の再生であってもよい。本発明蛋白は脈管形成活性も示しうる。
本発明蛋印ま、腸の保護または再生、および肺または肝臓の線維症、種々の組
織の再灌流傷害、および全身的なサイトカインのダメージにより生じる症状の治
療にも有用でありうる。
本発明蛋白は、前駆体組織または細胞からの上記組織の分化促進または抑制;
あるいは上記組織の増殖抑制にも有用でありうる。
本発明蛋白の活性は、とりわけ、以下の方法により測定してもよい:
組織再生活性のアッセイは、国際公開WO95/16035(骨、軟骨、鍵)
;国際公開WO95/05846(神経、ニューロン);国際公開WO91/0
7491(皮膚、内皮)に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない
。
創傷治癒活性のアッセイは、Winter,Epidermal Wound Healing,pps.71-112
(Maibach,HI and Rovee,DT,eds.),Year Book Medical Publishers,Inc.,C
hicago(Eaglstein and Mertz,J.Invest.Dermatol 71:382-384(1978)により修
飾されている)に記載されたものを包含するが、これらに限らない。
アクチビン/インヒビン活性
また、本発明蛋白はアクチビン−またはインヒビン−関連活性を示しうる。イ
ンヒビン類は、卵胞刺激ホルモン(FSH)の放出抑制能により特徴づけられ、
アクチビン類は、卵胞刺激ホルモン(FSH)の放出刺激能により特徴づけられ
る。よって、本発明蛋白は、単独であるいはインヒビンαファミリーのメンバー
とのヘテロダイマーの形態で、メスの哺乳動物の繁殖力を減少させ、オスの哺乳
動物の精子形
成減少させるインヒビンの能力に基づく不妊薬として有用でありうる。十分な量
の他のインヒビンの投与により、これらの哺乳動物において不妊を誘導すること
ができる。別法として、本発明蛋白は、ホモダイマーとしてあるいはインヒビン
−βグループの他の蛋白のサブユニットとのヘテロダイマーとして、下垂体前葉
細胞からのFSH放出の刺激におけるアクチビン分子の能力に基づいて、繁殖力
を誘導する治療薬として有用でありうる。例えば、米国特許第4798885号
参照。また本発明蛋白は、性的に未成熟な哺乳動物における繁殖の向上に有用で
ある可能性があり、その結果、ウシ、ヒツジおよびブタのごとき家畜の生存期間
中の繁殖力が増大する。
本発明蛋白の活性は、とりわけ、下記方法により測定してもよい:
アクチビン/インヒビン活性のアッセイは、Vale et al.,Endocrinology 91:
562-572,1972; Ling et al.,Nature 321:779-782,1986;Vale et al.,Naure 3
21:776-779,1986;Mason et al.,Nature 318:659-663,1985;Forage et al.,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 83:3091-3095,1986に記載のアッセイを包含するが、
これらに限らない。
化学走性/ケモキネシス活性
本発明蛋白は、哺乳動物細胞、例えば単球、好中球、T細胞、肥満細胞、好酸
球および/または内皮細胞の化学走性またはケモキネシス活性(例えば、ケモカ
インとして作用)を有する可能性がある。化学走性およびケモキネシス蛋白を用
いて所望細胞集団を所望作用部位に動員または誘引することができる。化学走性
またはケモキネシス蛋白は、組織に対する傷害および他の外傷の治療ならびに局
所的な感染の治療に特に有利である。例えば、リンパ球、単球または好中球の腫
瘍または感染部位への誘引は、腫瘍または感染因子に対する免疫応答を改善しう
る。
特定の蛋白またはペプチドは特定の細胞集団に対して化学走性活性を有してお
り、刺激可能な場合には、直接的または間接的にかかる細胞集団の方向または運
動を指令する。好ましくは、蛋白またはペプチドは、細胞の方向づけられた運動
を直接的に刺激する能力を有する。特定の蛋白が細胞集団に対する化学走性活性
を有するか
どうかを、かかる蛋白またはペプチドを細胞化学走性の既知アッセイに用いるこ
とにより容易に決定することができる。
本発明蛋白の活性は、とりわけ、下記方法により測定してもよい:
化学走性活性のアッセイ(化学走性を誘導または妨害する蛋白を同定するアッ
セイ)は、細胞の膜を越えた移動を誘導する蛋白の能力ならびに1の細胞集団の
他の細胞集団への付着を誘導する蛋白の能力を測定するアッセイを含む。移動お
よび付着に適したアッセイは、
Current Protocols in Immunology,Ed by J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H
.Margulies,E.M.Shevach,W.Strober,Pub.Greene Publishing Associates
and Wiley-Interscience(Chapter 6.12,Measurement of alpha and beta Chemo
kines 6.12.1-6.12.28;Taub et al.J.Clin.Invest.95:1370-1376,1995;Lin
d et al.APMIS 103:140-146,1995;Muller et al Eur.J.Immunol.25:1744-1
748;Gruber et al.J.of Immunol.152:5860-5867,1994;Johnston et al.J.
of Immunol.153:1762-1768,1994
に記載のアッセイを包含するが、これらに限らない。
止血および血栓溶解活性
また、本発明蛋白は、止血または血栓溶解活性を示す可能性がある。結果とし
て、かかる蛋白は、種々の凝血疾患(血友病のごとき遺伝性疾患を包含)の治療
に有用であり、あるいは外傷、手術または他の原因により生じた傷害の治療にお
ける凝血および他の止血を促進しうる。本発明蛋白は、血栓の溶解または血栓形
成阻害ならびにそれらにより生じる症状(例えば、心筋梗塞および中枢神経系血
管の梗塞(例えば、卒中)のごとき)の治療および予防に有用でありうる。
本発明蛋白の活性を、とりわけ、下記方法により測定してもよい:
止血および血栓溶解活性のアッセイは、
Linet et al.,J.Clin.Pharmacol.26:131-140,1986;Burdick et al.,Thromb
osis Res.45:413-419,1987;Humphrey et al.,Fibrinolysis 5:71-79(1991);S
chaub,Prostaglandins 35:467-474,1988に記載のアッセイを包含するが、これ
らに限ら
ない。
受容体/リガンド活性
また、本発明蛋白は、受容体、受容体リガンドまたは受容体/リガンド相互作
用の阻害剤もしくはアゴニストとしての活性を示しうる。かかる受容体およびリ
ガンドの例は、サイトカイン受容体およびそれらのリガンド、受容体キナーゼお
よびそれらのリガンド、受容体ホスファターゼおよびそれらのリガンド、細胞−
細胞相互作用に関与する受容体およびそれらのリガンド(細胞付着分子(セレク
チン、インテグリンおよびそれらのリガンドのごとき)ならびに抗原提示、抗原
認識、細胞性および体液性免疫応答の発生に関与する受容体/リガンド対などを
包含)を包含するがこれらに限らない。受容体およびリガンドは、関連する受容
体/リガンド相互作用に対する潜在的なペプチドまたは小型分子阻害剤のスクリ
ーニングにも有用である。本発明蛋白(受容体およびリガンドのフラグメントを
包含するが、これらに限らない)は、それ自体、受容体/リガンド相互作用の阻
害剤として有用でありうる。
本発明蛋白の活性を、とりわけ、下記方法により測定してもよい:
受容体−リガンド活性の適当なアッセイは、Current Protocols in Immunolog
y,Ed by J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach
,W.Strober,Pub.Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(C
hapter 7.28,Measurement of Cellular Adhesion under static conditions 7.
28.1-7.28.22),Takai et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:6864-6868,19
87;Bierer et al.,J.Exp.Med.168:1145-1156,1988;Rosenstein et al.,J
.Exp.Med.169:149-160 1989;Stoltenborg et al.,J.Immunol.Methods 175
:59-68,1994;Stitt et al.,Cell 80:661-670,1995に記載のアッセイを包含す
るが、これらに限らない。
抗炎症活性
本発明蛋白は抗炎症活性を示しうる。抗炎症活性は、刺激応答に関与している
細
胞に刺激を与えることにより、細胞−細胞相互作用(例えば、付着のごとき)を
阻害または促進することにより、炎症プロセスに関与している細胞の化学走性を
阻害または促進することにより、細胞溢出を阻害または促進することにより、あ
るいは炎症応答をより直接的に阻害または促進する他の因子の産生を刺激または
抑制することにより発揮される。かかる活性を示す蛋白を用いて炎症の症状(慢
性もしくは急性症状を包含、感染に関連した炎症(敗血性ショック、敗血症もし
くは全身性炎症応答症候群(SIRS)のごとき)、虚血−再潅流傷害、エンド
トキシンによる致命的傷害、関節炎、補体により媒介される超急性拒否反応、腎
炎、サイトカインもしくはケモカインにより誘導される肺の傷害、炎症性腸疾患
、クローン病またはTNFもしくはIL−1のごときサイトカインの過剰産生か
ら生じる疾病を包含するがこれらに限らない)を治療することができる。本発明
蛋白は、アナフィラキシーおよび抗原性物質もしくは材料に対する過敏症の治療
にも有用でありうる。
カドヘリン/腫瘍侵入抑制活性
カドヘリン(cadherin)はカルシウム依存性付着分子であり、発達中において
、詳細には特定の細胞タイプを決定することにおいて主要な役割を果たしている
と思われる。正常なカドヘリン発現の損失または変化は、腫瘍増殖および転移に
関連した細胞付着特性への変化を誘導しうる。カドヘリンの機能失調は、尋常性
天疱瘡および落葉状天疱瘡(自己免疫性の皮膚水泡疾患)、クローン病、および
いくつかの発達異常のごときヒトの他の疾病にも関与している。
カドヘリンスーパーファミリーは40余りのメンバーを包含し、それぞれが異
なる発現パターンを有している。当該スーパーファミリーのすべてのメンバーは
、共通の保存された細胞外リピート(カドヘリンドメイン)を有するが、分子の
他の部分において構造の相違が見られる。カドヘリンドメインはカルシウムに結
合してそれらの三次構造を形成するので、カルシウムはそれらの付着に必要であ
る。第1のカドヘリンドメインにおける少数のアミノ酸は同種親和性付着のため
の基礎を提供するので、この認識部位の修飾はカドヘリンの特異性を変化させる
可能性があり、その結果、自分自身だけを認識するのではなく、変異分子も異な
るカドヘリンに結
合できるようになる。さらに、いくつかのカドヘリンは他のカドベリンとの異種
親和性付着にも関与している。
カドヘリンスーパーファミリーのメンバーの1つであるE−カドヘリンは上皮
細胞タイプにおいて発現される。病理学的には、E−カドヘリン発現が腫瘍にお
いて失われる場合、悪性細胞は侵入性となり、癌が転移する。E−カドヘドリン
を発現するポリヌクレオチドを癌細胞系にトランスフェクションすることは、変
化した細胞形態を元に戻し、細胞相互および他の基質への付着性を回復させ、細
胞増殖速度を低下させ、足場依存性細胞の増殖を劇的に減少させることにより、
癌に関連した変化を回復させた。よって、E−カドヘドリン発現を再導入するこ
とは、癌腫をより進行していない段階に戻す。他のカドヘドリンも、他の組織タ
イプ由来の癌腫において同じ侵入抑制的役割を有している可能性がある。それゆ
え、カドヘドリン活性を有する本発明蛋白、およびかかる蛋白をコードする本発
明ポリヌクレオチドを用いて癌を治療することができる。かかる蛋白またはポリ
ヌクレオチドを癌細胞に導入することは、正常なカドヘドリン発現を提供するこ
とにより、これらの細胞において観察される癌性の変化を減少または除去しうる
。
癌細胞は、本来のものとは異なる組織タイプのカドヘリンを発現することも知
られており、それゆえこれらの癌細胞は異なる組織に侵入でき、転移できる。カ
ドヘリン活性を有する本発明蛋白、およびかかる蛋白をコードする本発明ポリヌ
クレオチドは、これらの細胞において不適切に発現されたカドヘドリンと置換し
、正常な細胞付着特性を回復させ、細胞の転移傾向を減少させ、あるいは除去し
うる。
さらに、カドヘリン活性を有する本発明蛋白、およびかかる蛋白をコードする
本発明ポリヌクレオチドを用いてカドヘリンを認識しこれに結合するする抗体を
得ることもできる。かかる抗体を用いて不適切に発現された腫瘍細胞カドヘドリ
ンの付着をブロックし、細胞が他の場所で腫瘍を形成しないようにすることもで
きる。かかる抗−カドヘドリン抗体を、癌の等級、病理学的タイプ、および予後
のためのマーカーとして使用できる。すなわち、癌が進行すると、カドヘドリン
発現は低下し、カドヘドリン結合抗体を用いることによりこのカドヘドリン発現
の低下を検出することができる。
カドヘドリン活性を有する本発明蛋白のフラグメント、好ましくはカドヘドリ
ン認識部位のデカペプチド、およびかかる蛋白フラグメントをコードする本発明
ポリヌクレオチドを用いて、カドヘリンに結合させ、望ましくない効果を生じる
カドヘリンの結合を妨げることにより、カドヘリン機能をブロックすることもで
きる。さらに、カドヘリン活性を有する本発明蛋白のフラグメント、好ましくは
癌患者の循環系において安定であることがわかっている末端切断された可溶性カ
ドヘドリンフラグメント、およびかかる蛋白フラグメントをコードするポリヌク
レオチドを用いて正しい細胞−細胞付着を混乱させることもできる。
カドヘドリンの付着および侵入抑制活性のアッセイは、Hortsch et al.J Bio
l Chem 270(32):18809-18817,1995;Miyaki et al.Oncogene 11:2547-2552,19
95;Ozawa et al.Cell 63:1033-1038,1990.に記載されたものを包含するが、こ
れらに限らない。
腫瘍阻害活性
腫瘍の免疫学的治療または予防に関する上記活性のほかに、本発明蛋白は他の
抗腫瘍活性を示しうる。ある蛋白は腫瘍増殖を直接的または間接的に(例えば、
ADCCを介して)阻害しうる。ある蛋白は、腫瘍組織または腫瘍前駆体組織に
作用して、腫瘍増殖を支持するに必要な組織の形成を阻害し(例えば、脈管形成
を阻害することにより)、腫瘍増殖を阻害する他の因子、作用剤または細胞タイ
プの産生を引き起こすことにより、あるいは腫瘍増殖を促進する因子、作用剤ま
たは細胞タイプを除去または阻害することにより腫瘍阻害活性を示しうる。
他の活性
本発明蛋白は、下記のさらなる活性または効果の1つまたはそれ以上を示しう
る:細菌、ウイルス、真菌および他の寄生虫(これらに限らず)を包含する感染
性因子の殺傷;身長、体重、体毛の色、目の色、皮膚または他の組織の色素沈着
、または器官または身体部分のサイズまたは形態(例えば、豊胸またはその逆)
を包含する身体特性への影響(抑制または促進);摂食した脂肪、蛋白または炭
水化物の消化
への影響;食欲、性欲、ストレス、認識(認識の疾患を包含)、鬱(鬱病性疾患
を包含)および暴力的行為(これらに限らず)を包含する行動特性への影響;鎮
痛効果または他の痛み軽減効果の提供;造血系以外の系統における胚の幹細胞の
分化および増殖の促進;ホルモンまたは内分泌活性;酵素の場合、酵素欠乏の修
正および関連疾患の治療;過剰増殖性疾患(例えば、乾癬のごとき)の治療;免
疫グロブリン様活性(例えば、抗体または補体に結合する能力);ならびにワク
チン組成物において抗原として作用してかかる蛋白またはかかる蛋白と交差反応
する他の物質もしくは存在に対する免疫応答を生じさせる能力。投与および用量
本発明蛋白(どのような源からであってもよく、組み換え法および非組み換え
法によるものを包含するが、これらに限らない)を、医薬上許容される担体と混
合して医薬組成物中に用いてもよい。かかる組成物は(蛋白および担体のほかに
)、希釈剤、充填剤、塩類、バッファー、安定化剤、可溶化剤、および当該分野
でよく知られた他の物質を含有していてもよい。用語「医薬上許容される」は、
有効成分の生物学的活性の有効性を妨害しない無毒の物質を意味する。担体の特
性は投与経路に依存する。本発明医薬組成物は、M−CSF、GM−CSF、T
NF、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−
7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、
IL−14、IL−15、IFN、TNF0、TNF1、TNF2、G−CSF
、Meg−CSF、スロンボポイエチン、幹細胞因子、およびエリスロポイエチ
ンのごときサイトカイン、リンホカイン、または他の造血因子を含有していても
よい。医薬組成物はさらに、蛋白活性を増強し、あるいは治療においてその活性
または有用性を補う他の作用剤を含有していてもよい。かかるさらなる因子およ
び/または作用剤を医薬組成物に含有させて、本発明蛋白との相乗効果を発揮さ
せ、あるいは副作用を最小化してもよい。逆に、特定のサイトカイン、リンホカ
イン、他の造血因子、血栓溶解因子または抗血栓因子、または抗炎症剤の処方に
本発明蛋白を含有させて、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶
解因子
または抗血栓因子、または抗炎症剤の副作用を最小化してもよい。
本発明蛋白は、多量体(例えば、ヘテロダイマーまたはホモダイマー)または
それ自体もしくは他の蛋白との複合体となって活性でありうる。結果的に、本発
明医薬組成物は、かかる多量体または複合体形態の本発明蛋白を含むものであっ
てもよい。
本発明医薬組成物は、本発明蛋白と蛋白もしくはペプチド抗原との複合体の形
態であってもよい。蛋白および/またはペプチド抗原は、Bリンパ球ならびにT
リンパ球に対して刺激シグナルを送達するであろう。Bリンパ球はその表面免疫
グロブリン受容体を通して抗原に応答するであろう。Tリンパ球は、MHC蛋白
による抗原提示後、T細胞受容体(TCR)を通して抗原に応答するであろう。
MHCならびに宿主細胞のクラスIおよびクラスIIのMHC遺伝子によりコー
ドされたものを包含する構造上関連した蛋白は、Tリンパ球に対するペプチド抗
原の提示に役立つであろう。抗原成分は、精製MHC−ペプチド複合体のみとし
て、または直接T細胞にシグナルを送ることのできる同時刺激分子とともに供給
されうる。あるいはまた、B細胞上の表面免疫グロブリンならびにT細胞上のT
CRおよび他の分子に結合しうる抗体を、本発明医薬組成物と混合することもで
きる。
本発明医薬組成物はリポソーム形態であってもよく、その中で本発明蛋白はさ
らに他の医薬上許容される担体、脂質のごとき両親媒性作用剤(水溶液中でミセ
ルのような凝集体形態、不溶性単層、液状結晶またはラメラ層として存在)と混
合されている。リポソーム処方に適する脂質は、モノグリセリド、ジグリセリド
、スルファチジド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等を包含するが
、これらに限らない。かかるリポソーム処方の製造は当業者のレベルの範囲内で
あり、例えば、米国特許第4235871、4501728、4837028、
および4737323号(参照によりそれらすべてを本明細書に記載されている
ものとみなす)に記載されたようなものである。
本明細書の用語「治療上有効量」とは、有意な患者の利益、例えば、かかる症
状の徴候の改善、治癒、治癒速度の増大を示すに十分な医薬組成物または方法の
各有効成分の合計量を意味する。単独で投与される個々の有効成分について用い
る場合、
該用語は当該成分のみをいう。有効成分の組み合わせに用いる場合、逐次投与あ
るいは同時投与にかかわらず治療効果を生じる有効成分量の合計量をいう。
本発明の治療方法の実施において、治療上有効量の本発明蛋白を治療すべき症
状を有する哺乳動物に投与する。本発明方法に従って、単独またはサイトカイン
、リンホカインもしくは他の造血因子のごとき他の治療薬とともに本発明蛋白を
投与してもよい。1種またはそれ以上のサイトカイン、リンホカインまたは他の
造血因子と共投与する場合、本発明蛋白をサイトカイン、リンホカイン、他の造
血因子、血栓溶解因子もしくは抗血栓因子と同時または逐次投与してもよい。逐
次投与する場合、担当医師は、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血
栓溶解因子もしくは抗血栓因子と本発明蛋白との組み合わせにおける適切な投与
順序を決定するであろう。
本発明医薬組成物中または本発明の実施に用いる本発明蛋白の投与を種々の慣
用的方法、例えば、経口的摂食、吸入、または皮内、皮下、または静脈注射で行
うことができる。患者への静脈注射が好ましい。
治療上有効量の本発明蛋白を経口投与する場合、本発明蛋白は錠剤、カプセル
、粉末、溶液またはエリキシルの形態であろう。錠剤形態で投与する場合、本発
明医薬組成物はゼラチンのごとき固体担体またはアジュバントをさらに含有して
いてもよい。錠剤、カプセル、および粉末は、約5ないし95%の本発明蛋白、
好ましくは約25ないし90%の本発明蛋白を含有する。液体形態で投与する場
合、水、ペトロレウム、動物または植物起源の油脂、例えばピーナッツ油、鉱油
、大豆油、またはゴマ油、または合成油脂を添加してもよい。液体形態の医薬組
成物は、生理食塩溶液、デキストロースまたは他の糖類溶液、またはグリコール
類(例えばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレング
リコール)をさらに含有していてもよい。液体形態で投与する場合、医薬組成物
は、約0.5ないし90重量%の本発明蛋白、好ましくは約1ないし50%の本
発明蛋白を含有する。
治療上有効量の本発明蛋白を静脈、皮内または皮下注射により投与する場合、
本発明蛋白はパイロジェン不含で、非経口的に許容される水溶液の形態であろう
。適切なpH、等張性、安定性を有するかかる非経口的に許容される蛋白溶液の
調製は、
当業者の範囲内である。静脈、皮内、または皮下注射用の好ましい医薬組成物は
、本発明蛋白のほかに、注射用塩化ナトリウム、リンゲル溶液、注射用デキスト
ロース、注射用デキストロースおよび塩化ナトリウム溶液、注射用乳酸含有リン
ゲル溶液、または当該分野で知られている他の担体を含有すべきである。本発明
医薬組成物は、安定化剤、保存料、バッファー、抗酸化剤、または当業者に知ら
れた他の添加物を含んでいてもよい。
本発明医薬組成物中の本発明蛋白の量は、治療すべき症状の性質および重さ、
ならびに患者がすでに受けていた治療の性質による。最終的には、担当医師が、
各患者を治療すべき本発明蛋白量を決定するであろう。まず、担当医師は、低用
量の本発明蛋白を投与し、患者の応答を観察する。最適治療効果が得られるまで
、より高用量の本発明蛋白を投与してもよく、最適治療効果が得られた時点で用
量をさらに増加させない。本発明方法を実施するための種々の医薬組成物は、体
重1kgあたり約0.01μgないし約100mgの本発明蛋白(好ましくは、
体重1kgあたり約0.1μgないし約10mg、より好ましくは体重1kgあ
たり0.1μgないし約1mgの本発明蛋白を含有すべきである。
本発明組成物を用いる静脈投与による治療の期間は、治療すべき疾病の重さな
らびに各患者の状態および応答により変化させられるであろう。本発明蛋白の各
適用期間は、連続静脈投与の場合12ないし24時間の範囲であると考えられる
。最終的には、担当医師が、本発明医薬組成物を用いる静脈投与による治療の期
間を決定するであろう。
本発明蛋白を用いて動物を免役して、本発明蛋白と特異的に反応するポリクロ
ーナルおよびモノクローナル抗体を得てもよい。蛋白全体またはそのフラグメン
トを免疫原として用いてかかる抗体を得てもよい。ペプチド免疫源はカルボキシ
末端にシステイン残基をさらに含んでいてもよく、キーホールリムペット・ヘモ
シアニン(KLH)のごときハプテンに結合する。かかるペプチドを合成する方
法は当該分野において知られており、例えば、R.P.Merrifield,J.Amer.Che
m.Soc.85,2149-2154(1963);J.L.Krstenansky,et.al.,FEBS Lett.211
,10(1987)に記載のごときものがある。本発明蛋白に結合するモノクローナル抗
体は、本発明蛋
白の免疫検出用の有用な診断薬でありうる。本発明蛋白に結合する中和抗体は、
本発明蛋白に関連した症状の治療薬として有用でありうるし、さらに本発明蛋白
の異常発現が関与しているいくつかの形態の癌の治療におけるある種の腫瘍の治
療において有用でありうる。癌細胞または白血球細胞の場合、本発明蛋白に対す
る中和モノクローナル抗体は、本発明蛋白により媒介されうる癌細胞の転移蔓延
の検出および予防に有用でありうる。
骨、軟骨、腱または靭帯の再生に有用な本発明組成物に関して、治療方法は、
組成物を局所的、全身的、またはインプラントもしくはデバイスのごとく局部的
に投与することを包含する。投与する場合、本発明に使用する治療組成物は、も
ちろん、パイロジェン不含の生理学的に許容される形態である。さらに、望まし
くは、組成物をカプセル封入するかまたは粘性形態として注射して骨、軟骨また
は組織ダメージ部位に送達してもよい。局所投与は傷の治癒および組織修復に適
する。上記組成物中に含有されていてもよい本発明蛋白以外の治療上有用な作用
剤を、代替的または付加的に、本発明方法における組成物と同時または逐次投与
してもよい。好ましくは、骨および/または軟骨形成のためには、組成物は、蛋
白含有組成物を骨および/または軟骨ダメージ部位に送達し、骨および軟骨の発
生のための構造を提供し、さらに最適には体内に吸収されうるマトリックスを含
有するであろう。かかるマトリックスは、他の移植される医学的器具に現在使用
されている材料からできていてもよい。
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容上の外
観および界面特性に基づく。組成物の特別な適用により適当な処方が決定されよ
う。組成物用として可能なマトリックスは生分解性で、化学的に知られた硫酸カ
ルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリグリコ
ール酸およびポリ無水物であってもよい。他の使用可能な材料は生分解性で、生
物学的によく知られたもの、例えば、骨または皮膚のコラーゲンである。さらに
マトリックスは純粋な蛋白または細胞外マトリックス成分を含んでいてもよい。
他の可能なマトリックスは、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミ
ネート、または他のセラミックスのごとき生分解性でなく、化学的に知られたも
のである。マトリッ
クスは上記タイプの材料の組み合わせ、例えばポリ乳酸およびヒドロキシアパタ
イトあるいはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムを含んでいてもよい。バイオ
セラミックスを、組成物中、例えばカルシウム−アルミネート−ホスフェート中
において変更してもよく、加工して孔サイズ、粒子サイズ、粒子形状および生分
解性を変化させてもよい。
150ないし800ミクロンの範囲の直径を有する多孔性粒子形態の乳酸およ
びグリコール酸の50:50(モル重量)のコポリマーが現在のところ好ましい
。いくつかの適用例においては、カルボキシメチルセルロースまたは自己由来の
血餅のごとき隔離剤を用いてマトリックスからの蛋白組成物の解離を防止するこ
とが有用であろう。
隔離剤の好ましいファミリーは、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒド
ロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル
メチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースを包含するアルキルセル
ロース(ヒドロキシアルキルセルロースを包含)のごときセルロース性材料であ
り、カルボキシメチルセルロース(CMC)のカチオン性の塩が最も好ましい。
他の好ましい隔離剤は、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ(エチレン
グリコール)、ポリオキシエチレンオキシド、カルボキシビニルポリマーおよび
ポリ(ビニルアルコール)を包含する。本発明に有用な隔離剤の量は、全処方重
量に対して0.5〜20重量%、好ましくは1〜10重量%であり、この量は、
ポリマーマトリックスからの蛋白の脱離を防止し、組成物の適切な取り扱いを可
能にする量であるが、前駆細胞がマトリックスから浸潤し、そのことにより前駆
細胞の骨形成活性を促進する機会を蛋白に付与するようにするには、あまり多く
ないようにする。
さらなる組成物において、本発明蛋白が骨および/または軟骨の欠損、傷、ま
たは組織の治療に有益な他の作用剤と混合されていてもよい。これらの作用剤は
、上皮増殖因子(EGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、形質転換増殖因
子(TGF−αおよびTGF−β)、およびインスリン様増殖因子(IGF)を
包含する。
また、目下のところ、治療組成物は獣医学的用途にも価値がある。詳細には、
ヒトのほかに、家畜およびサラブレッドのウマが本発明蛋白を用いるかかる治療
に望
ましい患者である。
組織の再生に使用される蛋白含有医薬組成物の投与規則は、蛋白の作用を変化
させる種々の要因、例えば形成が望まれる組織重量、ダメージ部位、ダメージを
受けた組織の状態、傷のサイズ、必要な組織のタイプ(例えば、骨)、患者の年
齢、性別、および食事、感染の重さ、投与期間、ならびに他の臨床的要因を考慮
して医師が決定するであろう。用量は、復元に使用するマトリックスのタイプお
よび医薬組成物中の他の蛋白の含有に応じて変更されてもよい。例えば、IGF
I(インスリン様増殖因子I)のごとき他の既知増殖因子の最終組成物への添
加も用量に影響しうる。組織/骨の増殖および/または修復を、例えばX線、組
織形態学的調査およびテトラサイクリン標識により定期的に評価することにより
経過をモニターすることができる。
本発明ポリヌクレオチドを遺伝子治療に用いることもできる。かかるポリヌク
レオチドをインビボまたはエクスビボで細胞に導入して哺乳動物対象中で発現さ
せることができる。核酸を細胞または生物に導入するための他の知られた方法に
より本発明ポリヌクレオチドを投与してもよい(ウイルスベクターに入れて、あ
るいは裸のDNAの形態として等があるが、これらに限らない)。
本発明蛋白存在下で細胞をエクスビボにおいて培養して増殖させ、あるいはか
かる細胞に対する所望効果を生じさせ、あるいはかかる細胞中に所望活性を生じ
させてもよい。次いで、処理された細胞を、治療目的で、インビボにおいて導入
することができる。
本明細書に引用した特許および文献を、参照により全体が本明細書に記載され
ているものとみなす。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Secreted proteins and polynucleotides encoding them
No. 60 / XXXXXX filed on Mar. 11, 1997 (not a provisional application)
No. 08 / 815,381 (which has been changed to a provisional application).
And all are considered to be as described herein.
Field of the invention
The present invention relates to novel polynucleotides and the use of such polynucleotides.
Proteins, and therapeutic and diagnostic methods for these polynucleotides and proteins
Provides catastrophic and research utility.
Background of the Invention
Protein factors such as lymphokines, interferons, CSFs and
The method aimed at the discovery of cytokines such as
Matured rapidly over the years. Nowadays conventional hybridization cloning
And expression cloning methods provide information directly related to the discovered protein (ie,
In the case of hybridization cloning, the partial DNA / amino acid sequence of the protein
Column; in the case of expression cloning, the activity of the protein).
The new polypeptide is cloned "directly". Signal sequence cloning (
DNA sequence based on the presence of the currently well-recognized secretory leader sequence motif
And hybridization by various PCRs or with low stringency
More recent "indirect" cloning methods, such as the dicing cloning method
Is secreted in the case of cloning of the leader sequence.
Or biological activity depending on the cell or tissue source in the case of the PCR method.
Access to numerous DNA / amino acid sequences for proteins known to be
Has improved the status quo. The present invention provides these proteins and their
To the polynucleotide to be loaded
It is what is done.
Summary of the Invention
In one embodiment, the present invention provides an isolated polypeptide selected from the group consisting of:
Provide a composition comprising a renucleotide:
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) nucleotides from nucleotide 521 to nucleotide 1111 of SEQ ID NO: 1
A polynucleotide comprising a nucleotide sequence;
(C) the nucleotide sequence from nucleotide 536 to nucleotide 817 of SEQ ID NO: 1
A polynucleotide comprising a reotide sequence;
(D) Clone ax318 3 deposited under accession number ATCC 98353
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the full-length protein coding sequence of
(E) Clone ax318 3 deposited under accession number ATCC 98353
Polynucleotide encoding the full-length protein encoded by the cDNA insert of
Otide;
(F) Clone ax318 3 deposited under accession number ATCC 98353
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the mature protein coding sequence of
(G) Clone ax318 3 deposited under accession number ATCC 98353
Encoding a mature protein encoded by a cDNA insert
Otide;
(H) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
Tide;
(I) Including a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 having biological activity
A polynucleotide encoding the protein (the fragment is the fragment of SEQ ID NO: 2)
Amino acid sequence from amino acid 93 to amino acid 102);
(J) Polynucleic acid which is an allelic variant of the polynucleotide of (a) to (g) above
Nucleotides;
(K) a polynucleotide encoding a species homolog of the protein of (h) or (i) above
Oh
Tide; and
(L) any one of the polynucleotides (a) to (i) under strict conditions
A polynucleotide capable of hybridizing to
Preferably, such a polynucleotide is nucleotide 521 of SEQ ID NO: 1.
A nucleotide sequence from SEQ ID NO: 1 to nucleotide 1111;
Nucleotide sequence from nucleotide 536 to nucleotide 817; accession number ATCC9
Full length protein coding sequence of clone ax3183 deposited as 8353
Or a nucleotide sequence deposited under accession number ATCC 98353.
Ax3183 contains the nucleotide sequence of the mature protein coding sequence. other
In a preferred embodiment, the polynucleotide has accession number ATCC 98353.
Encoded by the cDNA insert of clone ax3183 deposited as
Encodes the full-length or mature protein to be derived. In still other preferred embodiments,
The present invention includes the amino acid sequence from amino acid 4 to amino acid 99 of SEQ ID NO: 2.
A polynucleotide encoding the protein.
Another embodiment provides a gene corresponding to the cDNA sequence of SEQ ID NO: 1.
In another embodiment, the present invention provides a composition comprising a protein, wherein the protein comprises:
(A) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(B) an amino acid sequence from amino acid 4 to amino acid 99 of SEQ ID NO: 2;
(C) the amino acid sequence from amino acid 93 to amino acid 102 of SEQ ID NO: 2
A fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; and
(D) Clone ax318 3 deposited under accession number ATCC 98353
Amino acid sequence encoded by the cDNA insert of
Comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:
A composition is provided that is substantially free. Preferably, such a protein has the sequence
The amino acid sequence of No. 2 or the amino acids 4 to 99 of SEQ ID No. 2
Including the amino acid sequence of
In one embodiment, the present invention provides an isolated polypeptide selected from the group consisting of:
Provide a composition comprising a renucleotide:
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3;
(B) a polynucleotide comprising nucleotides 61 to 864 of SEQ ID NO: 3
Renucleotide;
(C) contains from nucleotide 826 to nucleotide 1386 of SEQ ID NO: 3;
Polynucleotide;
(D) clone bg140 1 deposited under accession number ATCC 98353
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the full-length protein coding sequence of
(E) clone bg140 1 deposited under accession number ATCC 98353
Encoding a full-length protein encoded by a cDNA insert
Do;
(F) clone bg140 1 deposited under accession number ATCC 98353
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the mature protein coding sequence of
(G) clone bg140 1 deposited under accession number ATCC 98353
Encoding a mature protein encoded by a cDNA insert
Do;
(H) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
;
(I) including a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 having biological activity
A polynucleotide encoding the protein (the fragment is the amino acid of SEQ ID NO: 4)
Including the amino acid sequence from acid 129 to amino acid 138);
(J) Polynucleic acid which is an allelic variant of the polynucleotide of (a) to (g) above
Nucleotides;
(K) a polynucleotide encoding a species homolog of the protein of (h) or (i) above
C; and
(L) any one of the polynucleotides (a) to (i) under strict conditions
A polynucleotide capable of hybridizing to
Preferably, such a polynucleotide is nucleotide 61 of SEQ ID NO: 3.
Nucleotide sequence from SEQ ID NO: 3 to nucleotide 864;
Nucleotide sequence from 26 to nucleotide 1386; accession number ATCC 98
353, the full length protein coding sequence of clone bg1401
Nucleotide sequence; or claw deposited under accession number ATCC 98353
Bg1401 contains the nucleotide sequence of the mature protein coding sequence. other
In a preferred embodiment, the polynucleotide has accession number ATCC 98353.
Encoded by the cDNA insert of clone bg1401
Encodes a full-length or mature protein. In still other preferred embodiments, the book
The invention provides an amino acid sequence from amino acid 148 to amino acid 249 of SEQ ID NO: 31.
A polynucleotide encoding a protein comprising the sequence is provided.
Another embodiment provides a gene corresponding to the cDNA sequence of SEQ ID NO: 3.
In another embodiment, the present invention provides a composition comprising a protein, wherein the protein comprises:
(A) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
(B) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31;
(C) amino acid sequence from amino acid 148 to amino acid 249 of SEQ ID NO: 31
Column;
(D) amino acid sequence from amino acid 129 to amino acid 138 of SEQ ID NO: 4
A fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, comprising:
(E) amino acid sequence from amino acid 163 to amino acid 172 of SEQ ID NO: 31
A fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, including the sequence;
(F) clone bg140 1 deposited under accession number ATCC 98353
Amino acid sequence encoded by the cDNA insert of
Comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:
A composition is provided that is substantially free. Preferably, such a protein has the sequence
No. 4 amino acid sequence, No. 31 amino acid sequence, or No. 3
Includes the amino acid sequence from one amino acid 148 to one amino acid 249.
In one embodiment, the present invention provides an isolated polypeptide selected from the group consisting of:
Provide a composition comprising a renucleotide:
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5;
(B) the nucleotide sequence from nucleotide 77 to nucleotide 1624 of SEQ ID NO: 5
A polynucleotide comprising a reotide sequence;
(C) the nucleotide sequence from nucleotide 390 to nucleotide 789 of SEQ ID NO: 5
A polynucleotide comprising a reotide sequence;
(D) clone bg465 2 deposited under accession number ATCC 98353
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the full-length protein coding sequence of
(E) clone bg465 2 deposited under accession number ATCC 98353
Polynucleotide encoding the full-length protein encoded by the cDNA insert of
Otide;
(F) clone bg465 2 deposited under accession number ATCC 98353
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the mature protein coding sequence of
(G) clone bg465 2 deposited under accession number ATCC 98353
Encoding a mature protein encoded by a cDNA insert
Otide;
(H) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
Tide;
(I) including a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 having biological activity
A polynucleotide encoding a protein (the fragment is the fragment of SEQ ID NO: 6)
Amino acid sequence from amino acid 253 to amino acid 262);
(J) Polynucleic acid which is an allelic variant of the polynucleotide of (a) to (g) above
Nucleotides;
(K) a polynucleotide encoding a species homolog of the protein of (h) or (i) above
Otide; and
(L) any one of the polynucleotides (a) to (i) under strict conditions
A polynucleotide capable of hybridizing to
Preferably, such a polynucleotide is nucleotide 77 of SEQ ID NO: 5.
A nucleotide sequence from SEQ ID NO: 5 to nucleotide 1624;
Nucleotide sequence from 390 to nucleotide 789; accession number ATCC 98
The full length protein coding sequence of clone bg4652 deposited as 353
Nucleotide sequence; or claw deposited under accession number ATCC 98353
Bg4652 contains the nucleotide sequence of the mature protein coding sequence. other
In a preferred embodiment, the polynucleotide has accession number ATCC.
By the cDNA insert of clone bg4652 deposited as 98353
Encodes the entire encoded or mature protein. Still other preferred embodiments
In another embodiment, the present invention provides a method for preparing amino acid sequence from amino acid 260 to amino acid 343 of SEQ ID NO: 6.
Provided is a polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence.
Another embodiment provides a gene corresponding to the cDNA sequence of SEQ ID NO: 5.
In another embodiment, the present invention provides a composition comprising a protein, wherein the protein comprises:
(A) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;
(B) amino acid sequence from amino acid 260 to amino acid 343 of SEQ ID NO: 6
:
(C) amino acid sequence from amino acid 253 to amino acid 262 of SEQ ID NO: 6
A fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, comprising:
(D) clone bg465 2 deposited under accession number ATCC 98353
Amino acid sequence encoded by the cDNA insert of
Comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:
A composition is provided that is substantially free. Preferably, such a protein is
Amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or amino acid 260 to amino acid 3 of SEQ ID NO: 6
Includes up to 43 amino acid sequences.
In one embodiment, the present invention provides an isolated polypeptide selected from the group consisting of:
Provide a composition comprising a renucleotide:
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7;
(B) the nucleotide sequence from nucleotide 48 to nucleotide 1055 of SEQ ID NO: 7
A polynucleotide comprising a reotide sequence;
(C) nucleotides from nucleotide 216 to nucleotide 1055 of SEQ ID NO: 7
A polynucleotide comprising a nucleotide sequence;
(D) the nucleotide sequence from nucleotide 494 to nucleotide 958 of SEQ ID NO: 7
A polynucleotide comprising a reotide sequence;
(E) clone bk291 3 deposited under accession number ATCC 98353
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the full-length protein coding sequence of
(F) clone bk291 3 deposited under accession number ATCC 98353
of
Polynucleotide encoding full-length protein encoded by cDNA insert
Tide;
(G) clone bk291 3 deposited under accession number ATCC 98353
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the mature protein coding sequence of
(H) clone bk291 3 deposited under accession number ATCC 98353
Encoding a mature protein encoded by a cDNA insert
Otide;
(I) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8
Tide;
(J) including a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 having biological activity
A polynucleotide encoding the protein (the fragment is the fragment of SEQ ID NO: 8)
Amino acid sequence from amino acid 85 to amino acid 94);
(K) a polynucleotide that is an allelic variant of the polynucleotide of (a) to (h) above
Nucleotides;
(L) A polynucleotide encoding a species homolog of the protein of (i) or (j) above
Otide; and
(M) any one of the polynucleotides (a) to (j) under strict conditions
A polynucleotide capable of hybridizing to
Preferably, such a polynucleotide is nucleotide 48 of SEQ ID NO: 7.
A nucleotide sequence from SEQ ID NO: 7 to nucleotide 1055;
216 to nucleotide 1055; nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7
Nucleotide sequence from leotide 494 to nucleotide 958; accession number AT
Full length protein coding of clone bk2913 deposited as CC98353
Nucleotide sequence of the amino acid sequence; or deposited under accession number ATCC 98353.
Containing the nucleotide sequence of the mature protein coding sequence of clone bk2913.
No. In another preferred embodiment, the polynucleotide has accession number ATCC 98.
With the cDNA insert of clone bk2913 deposited as
Encodes the full-length or mature protein to be loaded. In yet another preferred embodiment
Accordingly, the present invention relates to the amino acid sequence from amino acid 188 to amino acid 306 of SEQ ID NO: 8.
The present invention provides a polynucleotide encoding a protein containing a nucleic acid sequence.
Another embodiment provides a gene corresponding to the cDNA sequence of SEQ ID NO: 7.
In another embodiment, the present invention provides a composition comprising a protein, wherein the protein comprises:
(A) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8;
(B) amino acid sequence from amino acid 188 to amino acid 306 of SEQ ID NO: 8
;
(C) contains the amino acid sequence of amino acid 85 to amino acid 94 of SEQ ID NO: 8
A fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8;
(D) clone bk291 3 deposited under accession number ATCC 98353
Amino acid sequence encoded by the cDNA insert of
Comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:
A composition is provided that is substantially free. Preferably, such a protein is
Amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 or amino acid sequence 188 of SEQ ID NO: 8
Includes the amino acid sequence up to acid 306.
In one embodiment, the present invention provides an isolated polypeptide selected from the group consisting of:
Provide a composition comprising a renucleotide:
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9;
(B) the nucleotide sequence from nucleotide 64 to nucleotide 1197 of SEQ ID NO: 9
A polynucleotide comprising a reotide sequence;
(C) the nucleotide sequence from nucleotide 1 to nucleotide 828 of SEQ ID NO: 9
A polynucleotide comprising a nucleotide sequence;
(D) Clone bp5374 deposited under accession number ATCC 98353
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the full-length protein coding sequence of
(E) Clone bp5374 deposited under accession number ATCC 98353
Polynucleotide encoding the full-length protein encoded by the cDNA insert of
Otide;
(F) Clone bp5374 deposited under accession number ATCC 98353
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the mature protein coding sequence of
(G) Clone bp53T4 deposited under accession number ATCC 98353
Encoding a mature protein encoded by a cDNA insert
Otide;
(H) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10
Otide;
(I) a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 having biological activity
A polynucleotide encoding the protein containing the fragment (the fragment is SEQ ID NO: 10
Amino acid sequence from amino acid 184 to amino acid 193 of
(J) Polynucleic acid which is an allelic variant of the polynucleotide of (a) to (g) above
Nucleotides;
(K) a polynucleotide encoding a species homolog of the protein of (h) or (i) above
Otide; and
(I) any one of the polynucleotides (a) to (i) under strict conditions
A polynucleotide capable of hybridizing to
Preferably, such a polynucleotide is nucleotide 64 of SEQ ID NO: 9.
A nucleotide sequence from SEQ ID NO: 9 to nucleotide 1197;
Nucleotide sequence from 1 to nucleotide 828; accession number ATCC 9835
No. 3 of the full-length protein coding sequence of clone bp5374 deposited as No. 3.
Leotide sequence; or clone b deposited under accession number ATCC 98353
p5374 contains the nucleotide sequence of the mature protein coding sequence. Other favored
In a preferred embodiment, the polynucleotide has the accession number ATCC 98353.
The entirety encoded by the cDNA insert of the deposited clone bp5374.
Encodes a long or mature protein. In yet another preferred embodiment, the present invention
Contains the amino acid sequence from amino acid 1 to amino acid 255 of SEQ ID NO: 10
A polynucleotide encoding a protein is provided.
Another embodiment provides a gene corresponding to the cDNA sequence of SEQ ID NO: 9.
In another embodiment, the present invention provides a composition comprising a protein, wherein the protein comprises:
(A) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10;
(B) an amino acid sequence from amino acid 1 to amino acid 255 of SEQ ID NO: 10;
(C) the amino acid sequence from amino acid 184 to amino acid 193 of SEQ ID NO: 10
A fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, comprising the sequence;
(D) Clone bp5374 deposited under accession number ATCC 98353
Amino acid sequence encoded by the cDNA insert of
Comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:
A composition is provided that is substantially free. Preferably, such a protein has the sequence
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or the amino acids 1 to 25 of SEQ ID NO: 10
Includes up to 5 amino acid sequences.
In one embodiment, the present invention provides an isolated polypeptide selected from the group consisting of:
Provide a composition comprising a renucleotide:
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11;
(B) the sequence from nucleotide 581 to nucleotide 1534 of SEQ ID NO: 11
A polynucleotide comprising a nucleotide sequence;
(C) the sequence from nucleotide 928 to nucleotide 1510 of SEQ ID NO: 11
A polynucleotide comprising a nucleotide sequence;
(D) Clone cs431 2 deposited under accession number ATCC 98353
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the full-length protein coding sequence of
(E) Clone cs431 2 deposited under accession number ATCC 98353
Polynucleotide encoding the full-length protein encoded by the cDNA insert of
Otide;
(F) Clone cs431 2 deposited under accession number ATCC 98353
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the mature protein coding sequence of
(G) Clone cs431 2 deposited under accession number ATCC 98353
Encoding a mature protein encoded by a cDNA insert
Otide;
(H) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12
Otide;
(I) a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 having biological activity
A polynucleotide encoding the protein comprising the fragment (SEQ ID NO: 12
(Including the amino acid sequence from amino acid 154 to amino acid 163);
(J) Polynucleic acid which is an allelic variant of the polynucleotide of (a) to (g) above
Nucleotides;
(K) a polynucleotide encoding a species homolog of the protein of (h) or (i) above
Otide; and
(L) any one of the polynucleotides (a) to (i) under strict conditions
A polynucleotide capable of hybridizing to
Preferably, such a polynucleotide is nucleotide 58 of SEQ ID NO: 11.
A nucleotide sequence from 1 to nucleotide 1534; the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11
Nucleotide sequence from nucleotide 928 to nucleotide 1510; accession number AT
Full length protein coding of clone cs4312 deposited as CC98353
Nucleotide sequence of the amino acid sequence; or deposited under accession number ATCC 98353.
Containing the nucleotide sequence of the mature protein coding sequence of clone cs4312
No. In another preferred embodiment, the polynucleotide has accession number ATCC 98.
The cDNA insert of clone cs4312 deposited as 353
Encodes the full-length or mature protein to be loaded. In a further preferred embodiment
The invention relates to the amino acids from amino acid 150 to amino acid 310 of SEQ ID NO: 12.
A polynucleotide encoding a protein comprising an acid sequence is provided.
Another embodiment provides a gene corresponding to the cDNA sequence of SEQ ID NO: 11.
In another embodiment, the present invention provides a composition comprising a protein, wherein the protein comprises:
(A) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(B) amino acid sequence from amino acid 150 to amino acid 310 of SEQ ID NO: 12
Column;
(C) amino acid sequence from amino acid 154 to amino acid 163 of SEQ ID NO: 12
A fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, including the sequence;
(D) Clone cs431 2 deposited under accession number ATCC 98353
Amino acid sequence encoded by the cDNA insert of
Comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:
A composition is provided that is substantially free. Preferably, such a protein is
Amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or amino acid 150 to amino acid of SEQ ID NO: 12
Includes amino acid sequence up to acid 310.
In one embodiment, the present invention provides an isolated polypeptide selected from the group consisting of:
Provide a composition comprising a renucleotide:
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13;
(B) nucleotides from nucleotide 29 to nucleotide 2227 of SEQ ID NO: 13
A polynucleotide comprising a nucleotide sequence;
(C) from nucleotide 1334 to nucleotide 2227 of SEQ ID NO: 13
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of
(D) nucleotides from nucleotide 1 to nucleotide 746 of SEQ ID NO: 13
A polynucleotide comprising an otide sequence;
(E) Clone cw9761 deposited under accession number ATCC 98353
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the full-length protein coding sequence of
(F) clone cw9761 deposited under accession number ATCC 98353
Polynucleotide encoding the full-length protein encoded by the cDNA insert of
Otide;
(G) Clone cw9761 deposited under accession number ATCC 98353
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the mature protein coding sequence of
(H) Clone cw9761 deposited under accession number ATCC 98353
Encoding a mature protein encoded by a cDNA insert
Otide;
(I) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14
Otide;
(J) a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 having biological activity
A polynucleotide encoding the protein comprising the fragment (SEQ ID NO: 14
Amino acid sequence from amino acid 361 to amino acid 370);
(K) a polynucleotide that is an allelic variant of the polynucleotide of (a) to (h) above
Nucleotides;
(L) A polynucleotide encoding a species homolog of the protein of (i) or (j) above
Otide; and
(M) any one of the polynucleotides (a) to (j) under strict conditions
A polynucleotide capable of hybridizing to
Preferably, such a polynucleotide is nucleotide 29 of SEQ ID NO: 13.
SEQ ID NO: 13 to nucleotide 2227;
Nucleotide sequence from nucleotide 1334 to nucleotide 2227; SEQ ID NO: 1
Accession number 3 from nucleotide 1 to nucleotide 746;
Full length protein code for clone cw9761 deposited as ATCC 98353
Nucleotide sequence of the coding sequence; or deposited under accession number ATCC 98353
Sequence of the mature protein coding sequence of the clone cw9761 isolated
including. In another preferred embodiment, the polynucleotide has accession number ATCC.
With the cDNA insert of clone cw9761 deposited as 98353
Encodes the entire encoded or mature protein. In a further preferred embodiment
Thus, the present invention relates to amino acids 1 to 239 of SEQ ID NO: 14.
A polynucleotide encoding a protein comprising an acid sequence, or an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14
Polypeptide encoding a protein comprising the amino acid sequence from amino acid 119 to amino acid 733
Provide nucleotides.
Another embodiment provides a gene corresponding to the cDNA sequence of SEQ ID NO: 13.
In another embodiment, the present invention provides a composition comprising a protein, wherein the protein comprises:
(A) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14;
(B) the amino acid sequence of amino acid 1 to amino acid 239 of SEQ ID NO: 14;
(C) the amino acid sequence from amino acid 119 to amino acid 733 of SEQ ID NO: 14
Column;
(D) the amino acid sequence from amino acid 361 to amino acid 370 of SEQ ID NO: 14
A fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, including the sequence;
(E) Clone cw9761 deposited under accession number ATCC 98353
of
Amino acid sequence encoded by cDNA insert
Comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:
A composition is provided that is substantially free. Preferably, such a protein is
Amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; amino acids 1 to 239 of SEQ ID NO: 14
Or amino acid 119 to amino acid 73 of SEQ ID NO: 14
Includes up to 3 amino acid sequences.
In one embodiment, the present invention provides an isolated polypeptide selected from the group consisting of:
Provide a composition comprising a renucleotide:
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15;
(B) nucleotides from nucleotide 364 to nucleotide 777 of SEQ ID NO: 15
A polynucleotide comprising a nucleotide sequence;
(C) nucleotides from nucleotide 1 to nucleotide 636 of SEQ ID NO: 15
A polynucleotide comprising an otide sequence;
(D) Clone cw1233 deposited under accession number ATCC 98353
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of 3 full length protein coding sequences;
(E) Clone cw1233 deposited under accession number ATCC 98353
Polynucleic acid encoding full length protein encoded by cDNA insert 3
Leotide;
(F) Clone cw1233 deposited under accession number ATCC 98353
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the mature protein coding sequence of 3;
(G) Clone cw1233 deposited under accession number ATCC 98353
Polynucleic acid encoding mature protein encoded by cDNA insert of No. 3
Leotide;
(H) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16
Otide;
(I) a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 having biological activity
A polynucleotide encoding the protein comprising the fragment (SEQ ID NO: 16
(Including the amino acid sequence from amino acid 64 to amino acid 73);
(J) Polynucleic acid which is an allelic variant of the polynucleotide of (a) to (g) above
Nucleotides;
(K) a polynucleotide encoding a species homolog of the protein of (h) or (i) above
Otide; and
(L) any one of the polynucleotides (a) to (i) under strict conditions
A polynucleotide capable of hybridizing to
Preferably, such a polynucleotide is nucleotide 36 of SEQ ID NO: 15.
A nucleotide sequence from 4 to nucleotide 777; the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15
Nucleotide sequence from nucleotide 1 to nucleotide 636; accession number ATCC 983
53 of the full-length protein coding sequence of clone cw12333 deposited as
Nucleotide sequence; or claw deposited under accession number ATCC 98353
Cw12333 contains the nucleotide sequence of the mature protein coding sequence.
In another preferred embodiment, the polynucleotide has accession number ATCC 9835.
The cDNA insert of clone cw12333 deposited as
Encodes the full-length or mature protein to be encoded. In still other preferred embodiments
Thus, the present invention provides an amino acid sequence from amino acid 1 to amino acid 91 of SEQ ID NO: 16.
A polynucleotide encoding a protein comprising the sequence is provided.
Another embodiment provides a gene corresponding to the cDNA sequence of SEQ ID NO: 15.
In another embodiment, the present invention provides a composition comprising a protein, wherein the protein comprises:
(A) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16;
(B) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 from amino acid 1 to amino acid 91;
(C) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 from amino acid 64 to amino acid 73:
A fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16;
(D) Clone cw1233 deposited under accession number ATCC 98353
Amino acid sequence encoded by cDNA insert 3
Comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:
A composition is provided that is substantially free. Preferably, such a protein has the sequence
Amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 or amino acids 1 to 91 of SEQ ID NO: 16
A
Contains the amino acid sequence.
In one embodiment, the present invention provides an isolated polypeptide selected from the group consisting of:
Provide a composition comprising a renucleotide:
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17;
(B) from nucleotide 619 to nucleotide 1434 of SEQ ID NO: 17
A polynucleotide comprising a nucleotide sequence;
(C) the sequence of SEQ ID NO: 17 from nucleotide 520 to nucleotide 1323
A polynucleotide comprising a nucleotide sequence;
(D) All of clone dg11 deposited under accession number ATCC 98353
A polynucleotide comprising a nucleotide sequence of a long protein coding sequence;
(E) c of clone dgl 1 deposited under accession number ATCC 98353
Polynucleotide encoding full-length protein encoded by DNA insert
Do;
(F) Synthesis of clone dg11 deposited under accession number ATCC 98353
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of a mature protein coding sequence;
(G) c of clone dg11 deposited under accession number ATCC 98353
Polynucleotide encoding mature protein encoded by DNA insert
Do;
(H) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18
Otide;
(I) a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 having biological activity
A polynucleotide encoding the protein (the fragment is SEQ ID NO: 18
Amino acid sequence from amino acid 131 to amino acid 140);
(J) Polynucleic acid which is an allelic variant of the polynucleotide of (a) to (g) above
Nucleotides;
(K) a polynucleotide encoding a species homolog of the protein of (h) or (i) above
Otide; and
(L) any one of the polynucleotides (a) to (i) under strict conditions
To
A polynucleotide capable of hybridizing.
Preferably, such a polynucleotide is nucleotide 61 of SEQ ID NO: 17.
A nucleotide sequence from 9 to nucleotide 1434; the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17
Nucleotide sequence from nucleotide 520 to nucleotide 1323; accession number AT
Full length protein coding sequence for clone dg11 deposited as CC98353
The nucleotide sequence of the sequence; or the nucleotide sequence deposited under accession number ATCC 98353.
Contains the nucleotide sequence of the mature protein coding sequence of lawn dg11. other
In a preferred embodiment, the polynucleotide has accession number ATCC 98353.
And the entire cDNA encoded by the cDNA insert of clone dg11 deposited
Encodes a long or mature protein. In yet another preferred embodiment, the present invention
Contains the amino acid sequence from amino acid 1 to amino acid 235 of SEQ ID NO: 18
A polynucleotide encoding a protein is provided.
Another embodiment provides a gene corresponding to the cDNA sequence of SEQ ID NO: 17.
In another embodiment, the present invention provides a composition comprising a protein, wherein the protein comprises:
(A) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;
(B) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 from amino acid 1 to amino acid 235;
(C) amino acid sequence from amino acid 131 to amino acid 140 of SEQ ID NO: 18
A fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, including the sequence;
(D) c of clone dgl 1 deposited under accession number ATCC 98353
Amino acid sequence encoded by DNA insert
Comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:
A composition is provided that is substantially free. Preferably, such a protein is
Amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 or amino acids 1 to 2 of SEQ ID NO: 18
Includes up to 35 amino acid sequences.
In one embodiment, the present invention provides an isolated polypeptide selected from the group consisting of:
Provide a composition comprising a renucleotide:
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19;
(B) from nucleotide 2063 to nucleotide 2290 of SEQ ID NO: 19
of
A polynucleotide comprising a nucleotide sequence;
(C) from nucleotide 2276 to nucleotide 2290 of SEQ ID NO: 19
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of
(D) from nucleotide 2037 to nucleotide 2405 of SEQ ID NO: 19
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of
(E) clone ep234 1 deposited under accession number ATCC 98353
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the full-length protein coding sequence of
(F) Clone ep234 1 deposited under accession number ATCC 98353
Polynucleotide encoding the full-length protein encoded by the cDNA insert of
Otide;
(G) Clone ep234 1 deposited under accession number ATCC 98353
A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the mature protein coding sequence of
(H) clone ep234_1 deposited under accession number ATCC 98353
Encoding a mature protein encoded by a cDNA insert
Otide;
(I) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20
Otide;
(J) a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 having biological activity
A polynucleotide encoding the protein (including the fragment having SEQ ID NO: 20).
(Including the amino acid sequence from amino acid 33 to amino acid 42);
(K) a polynucleotide that is an allelic variant of the polynucleotide of (a) to (h) above
Nucleotides;
(L) A polynucleotide encoding a species homolog of the protein of (i) or (j) above
Otide; and
(M) any one of the polynucleotides (a) to (j) under strict conditions
A polynucleotide capable of hybridizing to
Preferably, such a polynucleotide is nucleotide 20 of SEQ ID NO: 19.
A nucleotide sequence from 63 to nucleotide 2290;
Nucleotide sequence from nucleotide 2276 to nucleotide 2290;
No .: nucleotides 19 from nucleotide 2037 to nucleotide 2405
Sequence; of clone ep234_1 deposited under accession number ATCC 98353
Nucleotide sequence of the full length protein coding sequence; or accession number ATCC 983
53, which corresponds to the mature protein coding sequence of clone ep2341 deposited as
Contains nucleotide sequences. In another preferred embodiment, the polynucleotide is a recipient.
CDNA of clone ep2341, deposited under accession number ATCC 98353
Encodes the full-length or mature protein encoded by the insert. Yet another
In a preferred embodiment, the invention relates to the amino acids 1 to amino acids of SEQ ID NO: 20.
A polynucleotide encoding a protein comprising up to 69 amino acid sequences is provided.
Another embodiment provides a gene corresponding to the cDNA sequence of SEQ ID NO: 19.
In another embodiment, the present invention provides a composition comprising a protein, wherein the protein comprises:
(A) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20;
(B) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 from amino acid 1 to amino acid 69;
(C) the amino acid sequence from amino acid 33 to amino acid 42 of SEQ ID NO: 20
A fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20;
(D) clone ep234_1 deposited under accession number ATCC 98353
Amino acid sequence encoded by the cDNA insert of
Comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:
A composition is provided that is substantially free. Preferably, such a protein has the sequence
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20;
Amino acid sequence from amino acid to amino acid 69.
In certain preferred embodiments, the polynucleotide is operable with an expression control sequence.
Noh is linked to Noh. The present invention also provides a method for transforming such a polynucleotide composition.
Also provided are host cells, including bacterial, yeast, insect and mammalian cells. Also
Promotes, reduces, or enhances a gene corresponding to a polynucleotide sequence disclosed herein.
Is provided by the present invention for organisms having modified expression.
Further, a method for producing a protein,
(A) culturing a host cell culture transformed with such a polynucleotide composition;
Grown in the appropriate medium;
(B) purifying the protein from the culture
There is also provided a method comprising: The protein produced by such a method is also
It is provided by Ming. As a preferred specific example, it is produced by such a method.
And the protein to be produced is a mature form of the protein.
The protein composition of the present invention may further contain a pharmaceutically acceptable carrier. Or
Compositions comprising antibodies specifically reactive with such proteins are also provided by the present invention.
Administering a therapeutically effective amount of a composition comprising a protein of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
For preventing, treating or ameliorating a medical condition, including administering to an animal subject
A law is also provided.
BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
1A and 1B show pED6 and pED6 used for depositing the clones disclosed herein.
And pNOTs vectors are shown schematically.
Detailed description Isolated proteins and polynucleotides
Nucleotides for each of the clones and proteins disclosed herein
And amino acid sequences are reported below. Sequencing of the deposited clone by a known method
To easily determine the actual nucleotide sequence of each clone
Can be. The deduced amino acid sequence (both full length and mature) is then
It can be determined from the leotide sequence. Express the clone in a suitable host cell.
And collect the protein, then determine its sequence to determine
The amino acid sequence of the encoded protein can also be determined. Each disclosed
For proteins, applicants best identify using sequence information available at the time of filing
Those determined to be possible reading frames were identified.
As used herein, the term "secreted" protein refers to a membrane when expressed in a suitable host cell.
To
This refers to what is transported through and is the result of the signal sequence in that amino acid sequence.
All transportation is included. "Secreted" proteins are secreted entirely by the cells in which they are expressed
Proteins (eg, soluble proteins) or partially secreted proteins (eg, receptors)
But not limited to these. Also, "secreted" proteins pass through the membrane of the endoplasmic reticulum
Includes, but is not limited to, transported.Clone “ax318 3”
The polynucleotide of the present invention has been identified as clone "ax3183".
ax3183 is a method selective for cDNA encoding secreted proteins (US
No. 5,536,637) from an adult testis cDNA library.
Or computer analysis of the amino acid sequence of the encoded protein
Encoding a secretory or transmembrane protein. ax318 3
It is a full-length clone and is a secreted protein (also referred to herein as "ax3183 protein").
) Contains the entire coding sequence.
The nucleotide sequence of ax3183 determined this time is shown in SEQ ID NO: 1. now
Applicants have determined that the correct reading of ax318_3 protein corresponding to the above nucleotide sequence
The frame and what is considered to be the deduced amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 2.
EcoRI / No obtainable from the deposit containing clone ax3183
The tI restriction fragment should be approximately 1200 bp long.
The nucleotide sequence of ax318_3 disclosed herein can be obtained using BLASTN / BLASTX
GenBank and GenSeq nucleotide sequence data using the TASTA search protocol.
Search against the database. ax3183 is AA255872 (zs19a01.s1 NCI CG
AP GCB1 Homo sapiens cDNA clone), AA625610 (zv89h04.s1 Soares NhHMPu S1 H
omo sapiens cDNA clone 766999 3'similar to WP: K10B2.1 CE02008 TRANSDUCI
N BETA CHAIN), D86043 (Humanm RNA for SHPS-1, complete cds), H23217 (ym52f
03.s1 Homo sapiens cDNA clone 51880 3 '), U06701 (Human clone CCA53 mRNA c
ontainig CCA trinucleotiderepeat), and WO5822 (za90b02.r1 Soares fetal)
lung NbHL 19W Homo sapiens cDNA clone 299787 5 ')
And at least some
The degree of similarity was shown. putative amisoic acid disclosed herein for ax318_3
Sequences were sequenced using GenPept and GeneSeq amino acid sequences using the BLAST search protocol.
Search against the database. The putative ax3183 protein is D85183 (SHPS-1 [Ratt
us rattus]), D86043 (SHPS-1 [Homo sapiens]), R85852 (WD-40 domain-containin
g beta-transducin protein), Y10376 (SIRP-betel [Homo sapiens]), and Z797
57 (F55B12.3 [Caenorhabditis elegans])
Also showed some similarity. SHPS-1 is involved in mitogen and cell attachment
Binds in response to SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase SHP-2
Glycoprotein (Fujioka et al., 1996, Mol. Cell. Biol. 16 (12): 6887-6899,
Are deemed to be described herein by reference). Based on sequence similarity,
ax318_3 protein and each similar protein or peptide are at least partially active
May have shared. According to the TopPredII computer program,
Putative transmembrane around amino acid 28 of SEQ ID NO: 2 in ax318 3 protein sequence
Domain is expected. Amino acids 15 to 27 of SEQ ID NO: 2 are potential
Putative mature amino acid sequence starting at amino acid 28
I do.Clone "bg140 1"
The polynucleotide of the present invention has been identified as clone "bg1401".
bg1401 is a method selective for cDNA encoding a secreted protein (US
No. 5,536,637) from an adult brain cDNA library.
Or based on computer analysis of the amino acid sequence of the encoded protein,
It was identified as encoding a secreted or transmembrane protein. bg140 1 is all
Long clone and secreted protein (also referred to herein as "bg140-1 protein")
Contains the entire coding sequence.
The nucleotide sequence of bg1401 determined this time is shown in SEQ ID NO: 3. now
Applicants have read the correct reading of the bg1401 protein corresponding to the above nucleotide sequence.
The frame and what is considered the deduced amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 3
Base pairs
Another possible bg140 1 encoded by 641 to 1648
The reading frame and deduced amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 31. SEQ ID NO: 3
The frame shift in the otide sequence may be, for example,
If it was caused by a single nucleotide deletion, read
The reading frame may be linked to the reading frame encoding SEQ ID NO: 31.
EcoRI / No obtainable from the deposit containing clone bg1401
The tI restriction fragment should be approximately 2900 bp in length.
The nucleotide sequence of bg1401 disclosed herein can be substituted with BLASTA / BLASTX and
Against GenBank and GeneSeq databases using FAST and FASTA search protocols
And searched. bg1401 is AA075629 (zm89a04.s1 Stratagene ovarian c
ancer (# 937219) Homo sapiens cDNA clone 545070 3 '), AA113989 (zn27h12.r1 St
ratagene neuroepithelium NT2RAMI 937234 Homo sapiens cDNA clone 548711 5
'), N77135 (yz85h11.r1 Homo sapiens cDNA clone 289893 5'), R11701 (yf49d02
.r1 Homo sapiens cDNA clone 25600 5 '), R13178 (yf73e04.r1 Homo sapiens cD
NA clone 278555 '), and Y14946 (Homo sapiens mRNA for SPIN protein).
Showed at least some similarity to the identified sequences. bg140
The deduced amino acid sequence disclosed herein with respect to No. 1 was compared with the BLASTX search protocol.
Was used to search the GenPept and GeneSeq amino acid sequence databases.
The putative bg140 1 protein is AF038969 (general transcription factor 2-I [Homo
sapiens]), U77948 (Burton's tyrosine kinase-associated protein-135; BAP-1
35 [Homo sapiens]), and Y14946 (SPIN protein [Homo sapiens]).
Showed at least some similarity to the given sequence. Based on sequence similarity
, Bg1401 protein and each similar protein or peptide are at least partially active
May share a gender.Clone “bg465 2”
The polynucleotide of the present invention has been identified as clone "bg4652".
bg4652 is a method selective for cDNA encoding secreted proteins (US
Forgiveness
No. 5,536,637) from an adult brain cDNA library;
Alternatively, based on computer analysis of the amino acid sequence of the encoded protein,
It was identified as encoding a secretory or transmembrane protein. bg465 2 is full length
A clone of a secreted protein (also referred to herein as "bg4652 protein").
Contains the entire coding sequence.
The nucleotide sequence of bg4652 determined this time is shown in SEQ ID NO: 5. now
Applicants have read the correct reading of the bg4652 protein corresponding to the above nucleotide sequence.
The frame and what is considered the deduced amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 6.
EcoRI / No obtainable from the deposit containing clone bg4652
The tI restriction fragment should be approximately 2500 bp in length.
The nucleotide sequence of bg4652 disclosed herein can be modified using BLASTA / BLASTX and
Against GenBank and GeneSeq databases using FAST and FASTA search protocols
And searched. bg4652 was obtained from AA133150 (zm25b07.r1 Stratagene pancreas (
# 937208) Homo sapiens cDNA clone 526645 5'similar to WP: F07F6.4CE01896 Z
INC FINGER PROTEIN), AA144842 (mr69h01.r1 Stratagene mouse testis (# 93730
8) Mus musculus cDNA clone 602737 5 '), AA484561 (nf06a12.s1 NCI CGAP Li1 H
omo sapiens cDNA clone), D16939 (Human HepG2 3 'region cDNA, clone hmd5d0
6), L24125 (Sac charomyces cerevisiae zinc finger protein (GCS1) gene, comp
le tecds), R18422 (yg02h06.r1 Homo sapiens cDNA clone 30950 5 '), T32543 (E
ST50558 Homo sapiens cDNA 5'end similar to None), W88569 (zh70b12.s1 Soa
res fetal chromosome IV reading frame ORF YDL226c), Z74274 (S. cerevisiae
chromosome IV reading frame ORF YDL226c), and Z82199 (Human DNA sequen
ce *** SEQUENCING IN PROGRESS *** from clone 316D5; HTGS phase 1)
Showed at least some similarity to the given sequence. About bg465 2
Using the BLASTX search protocol, the deduced amino acid sequence disclosed herein
Searches were made against the nPept and GeneSeq amino acid sequence databases. Estimated bg46
52 protein is U23486 (similar to S. cerevisiae zinc protein GCS1 (SP GCS1
YEAST) [Caenorhabditis elegens])
It showed some degree of similarity.
Based on sequence similarity, the bg4652 protein and each similar protein or peptide
It may share at least some activity.Clone "bk291 3"
The polynucleotide of the present invention has been identified as clone "bk2913".
bk2913 is a method selective for cDNA encoding a secretory protein (US
No. 5,536,637) from an adult retinal cDNA library.
Or computer analysis of the amino acid sequence of the encoded protein
Encoding a secretory or transmembrane protein. bk291 3
It is a full-length clone and is a secreted protein (also referred to herein as "bk291 3 protein").
) Contains the entire coding sequence.
The nucleotide sequence of bk2913 determined this time is shown in SEQ ID NO: 7. now
Applicants have read the correct reading of the bk2913 protein corresponding to the above nucleotide sequence.
The frame and what is considered the deduced amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 8. Amino acid 44
To 56 are putative leader / signal sequences, and the predicted mature amino acid sequence is
Starting from amino acid 57 or amino acids 44 to 56 are transmembrane domains.
You.
EcoRI / No obtainable from the deposit containing clone bk2913
The tI restriction fragment should be approximately 1500 bp in length.
The nucleotide sequence of bk2913 disclosed herein can be modified using BLASTA / BLASTX and
Against GenBank and GeneSeq databases using FAST and FASTA search protocols
And searched. bk291 3 is AA135915 (zl19f04.r1Soares pregnant uteru
s NbHPU Homo sapiens cDNA clone 502399 5 '), AA156738 (zl19f04.s1 Soares p
regnant uterus NbHPU Homo sapiens cDNA clone 502399 3'similar to WP: T05
E11.5 CE06364 YEAST YKKO LIKE), AF017785 (Mus musculus MHC Class I H13a m
inor histocpmpatibility peptide (H13) mRNA, partial cds), N40134 (yw73a 1
2.r1 Homo sapiens cDNA clone 257854 5'similar to SW: YKKO YEAST P34248 H
YPOTHETICAL 67.5KD PROTEIN IN APEI / LAP4-CWP1 INTERGENIC REGION), N42726 (
yy11d01.r1 Homo sapiens cDNA clone 270913 5'similar to SW: YKKO YEAST P3
4248 HYPOTHETICAL 67.5
KD PROTEIN IN APE1 / LAP4-CWP1 INTERGENIC REGION), R67144 (yi31h04.r1 Homo
sapiens cDNA clone 140887 5'similar to SP: YKKO YEAST P34248 HYPOTHETICA
L 67.5KD PROTEIN IN APE1 / LAP4-MBR1 INTERGENIC), R78822 (yi90b05.r1 Homo s
apiens cDNA clone 146481 5 '), R79317 (yi90b05.s1 Homo sapiens cDNA clone
146481 3 '), T23944 (Human gene signature HUMGS05889), and W04243 (za58h1
0.r1 Soares fetal liver spleen INFLS Homo sapiens cDNA clone)
Showed at least some similarity to the given sequence.
The deduced amino acid sequence disclosed herein for bk291_3 was compared with the BLASTX search protocol.
Against the GenPept and GeneSeq amino acid sequence databases
. The putative bk2913 protein is X71133 (YKL450 [Saccharomyces cerevisiae]), Z2
8100 (ORF YKL100c [Saccharomyces cerevisiae]), and Z68751 (T05E11.5 [Caeno
rhabditis elegans]) at least some similarity to the sequence identified as
Showed sex. Based on sequence similarity, bk2913 protein and each similar protein or
The peptides may share at least some activity. TopPredII
According to computer programs, six additional potential transmembrane domains
amino acids 70, 125, 170, and 2 of SEQ ID NO: 8 in the protein sequence of bk2913
It is expected to be around 20, 260 and 280.Clone "bp5374"
The polynucleotide of the present invention has been identified as clone "bp5374".
bp5374 is a method selective for cDNA encoding secreted proteins (US
No. 5,536,637) from a human fetal kidney cDNA library.
Isolated or based on computer analysis of the amino acid sequence of the encoded protein.
And encoding a secretory protein or a transmembrane protein. bp537
4 is a full-length clone, which is a secretory protein (also referred to herein as "bp5374 protein").
) Contains the entire coding sequence.
The nucleotide sequence of bp5374 determined this time is shown in SEQ ID NO: 9. Up
The correct reading frame and deduced reading frame for the bp5374 protein corresponding to the nucleotide sequence
Mino
SEQ ID NO: 10 shows what the applicant considers to be the acid sequence.
EcoRI / No obtainable from the deposit containing clone bp5374
The tI restriction fragment should be approximately 1500 bp in length.
The nucleotide sequence of bp5374 disclosed herein is matched to BLASTA / BLASTX and
Against GenBank and GeneSeq databases using FAST and FASTA search protocols
And searched. bp5374 is AA007576 (zh99b06.r1 Soares fetal liver s
pleen 1NFLS S1 Homo sapiens cDNA clone 429395 5 '), AA287563 (zs52g02.r1 N
CI CGAP GCAP GCB1 Homo sapiens cDNA 5 '), R09093 (yf21h09.r1 Homo sapiens
cDNA clone 127553 5 '), and T33088 (EST56631 Homo sapiens cDNA 5'end si
show at least some similarity to sequences identified as (milar to None)
did.
The deduced amino acid sequence disclosed herein for bp5374 was compared to a BLASTX search program.
Search against GenPept and GeneSeq amino acid sequence databases using protocol
did. The putative bp5374 protein was identified as U34998 (Rad9 [Coprinus cinereus])
Showed at least some similarity to the given sequence. Based on sequence similarity
For example, the bp5374 protein and each protein or peptide having similarity should be at least
May also share some activity.Clone "cs431 2"
The polynucleotide of the present invention has been identified as clone "cs4312".
cs4312 is a method selective for cDNA encoding a secretory protein (US
No. 5,536,637) from a human fetal brain cDNA library.
Or based on computer analysis of the amino acid sequence of the encoded protein
Thus, it was identified as encoding a secretory protein or a transmembrane protein. cs431 2
Is a full-length clone and is a secreted protein (also referred to herein as "cs4312 protein").
) Contains the entire coding sequence.
The nucleotide sequence of cs4312 determined this time is shown in SEQ ID NO: 11.
This time, the applicant has determined that the correct reading of the cs4312 protein corresponding to the above nucleotide sequence.
The sequence considered as the open frame and deduced amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 12.
EcoRI / No obtainable from the deposit containing clone cs4312
The tI restriction fragment should be approximately 2300 bp in length.
The nucleotide sequence of cs4312 disclosed herein can be modified using BLASTA / BLASTX and
Against GenBank and GeneSeq databases using FAST and FASTA search protocols
And searched. cs431 2 is AA021033 (ze67h12.s1 Soares retina N2b4HR
Homo sapiens cDNA clone 364103 3'similar to contains Alu repetitive el
ement), H29349 (ym32c02.r1 Homon sapiens cDNA clone 49839 5'similar to S
P: KYES XIPHEP27447 PROTO-ONCOGENE TYROSINE-PROTEIN KINASE YES), L14577 (
Homo sapiens cystathionine beta-synthase cDNA), Q87430 (Human cystathioni
ne beta-synthase cDNA), and X92659 (H. sapiens intron 4 from p53 gene)
Showed at least some similarity to the sequence identified as cs43
The deduced amino acid sequence disclosed herein as No. 12 was compared to the BALSTX search protocol.
-Searched against GenPept and GeneSeq amino acid sequence databases using
.
The putative cs431 2 protein is L19501 (cystathionine beta-synthase [Homo sapien
s]), R71376 (Human cystathionine beta-synthase), U61167 (SH3 domain-contai
ning protein SH3P18 [Homo sapiens]), and X82166 (Cystathionine beta-synt
hase [Homo sapiens]) at least some similarity to the sequence identified as
Showed sex. Based on sequence similarity, has cs431 2 protein and similarity
Each protein or peptide may share at least some activity.
According to the TopPredII computer program,
Potential transmembrane around amino acid 30 of SEQ ID NO: 12 in the cs431 2 protein sequence
Domain is expected. The nucleotide sequence of cs4312 is
Indicates that it may contain repeating elements.Clone "cw9761"
The polynucleotide of the present invention has been identified as clone "cw9761".
cw9761 is a method selective for cDNA encoding secreted proteins (US
No. 5,536,637) from a human fetal brain cDNA library.
And
Alternatively, based on computer analysis of the amino acid sequence of the encoded protein,
It was identified as encoding a secretory or transmembrane protein. cw976 1 is full length
A clone of a secreted protein (also referred to herein as "cw9761 protein").
Contains the entire coding sequence.
The nucleotide sequence of cw9761 determined this time is shown in SEQ ID NO: 13.
This time, the applicant has read the correct reading of the cw9761 protein corresponding to the above nucleotide sequence.
SEQ ID NO: 14 shows what is considered the open frame and deduced amino acid sequence. Amino acid 4
From 23 to amino acid 435 is a putative leader / signal sequence,
The amino acid sequence starts at 436 or extends from amino acid 423 to amino acid 435.
Is a transmembrane domain.
EcoRI / No obtainable from the deposit containing clone cw9761
The tI restriction fragment should be approximately 3300 bp in length.
The nucleotide sequence of cw9761 disclosed herein can be substituted with BLASTA / BLASTX and
Against GenBank and GeneSeq databases using FAST and FASTA search protocols
And searched. cw9776 1 is AA280747 (zs96a09.r1 NCI CGAP GCB1 Homo s
apiens cDNA clone IMAGE: 711448 5 '), AA323946 (EAT26798 Cerebellum II Homo
sapiens cDNA 5'end), R13665 (yf60g06.r1 Homon sapiens cDNA clone 26764
5 '), R16892 (yf44d06.s2 Homo sapiens cDNA clone 129707 3'), R85177 (yo43d0
7.r1 Homo sapiens cDNA clone 180685 5 '), and R89648 (ym97c02.r1 Homo sa
piens cDNA clone 166850 5 ').
The degree of similarity was shown. Based on sequence similarity, cw9761 protein and similarity
May have at least some activity sharing
There is. According to the TopPredII computer program, cw976 1 protein sequence
In the row, a potential transmembrane domain is predicted at the amino terminus of SEQ ID NO: 14.Clone "cw1233 3"
The polynucleotide of the present invention has been identified as clone "cw12333".
cw12333 is a method selective for cDNAs encoding secreted proteins (US
Special
No. 5,536,637) from a human fetal brain cDNA library.
Or based on computer analysis of the amino acid sequence of the encoded protein
Thus, it was identified as encoding a secretory protein or a transmembrane protein. cw1233
3 is a full-length clone, which is a secretory protein (also referred to herein as "cw1233 protein").
) Is included.
The nucleotide sequence of cwl2333 determined this time is shown in SEQ ID NOs: 1 and 5.
You. The present applicant has determined that the cw1233 3 protein
A new reading frame and deduced amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 16.
EcoRI / N obtainable from the deposit containing clone cw12333
The otl restriction fragment should be approximately 3000 bp long.
The nucleotide sequence of cw1233 33 disclosed herein can be used in BLASTA / BLASTX
GenBank and GeneSeq databases using the FASTA and FASTA search protocols
Searched against. cw1233 33 is R61600 (yh16f08.r1 Homo sapiens cDNA)
clone 37807 5 '), R83929 (yp06h11.s1 Homo sapiens cDNA clone 186693 3'sim
ilar to contains Alu repetitive element; contains TAR1 repetitive element
), R87877 (yo45h.r1 Homo sapiens cDNA clone 180921 5 '), U14568 (*** ALU WAR
NING Human Alu-Sb subfamily consensus sequence)
Showed at least some similarity. CW1233 3 in this specification
Using the BLASTX search protocol, the deduced amino acid sequence disclosed in
And GeneSeq amino acid sequence database. Estimated cw1233 3
The protein has a small number relative to the sequence identified as AB002317 (KIA0319 [Homo sapiens]).
It showed at least some similarity. Based on sequence similarity, cw1233 3 protein
White and similar proteins or peptides share at least some activity
You may have. The nucleotide sequence of cw1233 is identical to that of Alu
Indicates that it may contain a return element.Clone "dg11"
The polynucleotide of the present invention has been identified as clone "dg11".
dg11 is a method that is selective for cDNAs encoding secreted proteins (US Pat.
5,536,637) from an adult placenta cDNA library;
Alternatively, based on computer analysis of the amino acid sequence of the encoded protein,
It was identified as encoding a secretory or transmembrane protein. dg11 1 is full length black
And the entire code of secreted protein (also referred to herein as "dgl1 protein").
Includes a printing array.
The nucleotide sequence of dg11 determined this time is shown in SEQ ID NO: 17. this time
Applicant has determined that the correct reading frame and dg11 protein corresponding to the nucleotide sequence
And SEQ ID NO: 18 which is deemed to be the predicted amino acid sequence.
EcoRI / NotI obtainable from the deposit containing clone dg11
The restriction fragment should be about 1900 bp in length.
The nucleotide sequence of dg11 disclosed herein can be used in a BLASTX search protocol.
To the GenPept and GeneSeq amino acid sequence databases.
The putative dg11 protein was AA731281 (nw57f05.s1 NCI CGAP GCAP GCB1 Homo sapien
s cDNA clone IMAGE 1250721 similar to gb Y00345 cds1 POLYADENYLATE-BINDI
(NG PROTEIN (HUMAN)) at least some similarity to the sequence identified
showed that. The deduced amino acid sequence disclosed herein for dg11 was compared to BLASTX
Search for GenPept and GenSeq amino acid sequence databases using a search protocol.
And searched. The putative dg11 protein is M81878 (hyaluronidase [Clostridium per
fringens]) and U28742 (similar to hyaluronoglucosaminidase (SPNAGH CLOPE
, P26831) At least a sequence identified as [Caenorhabditis elegans])
Also showed some similarity. Hyaluronoglucosaminidase, for example,
It is a secreted protein found in poisons. Based on sequence similarity, dg11 protein and
And similar proteins or peptides share at least some activity
Could be. Dg11 protein by TopPred computer program
Additional potential transmembrane domain around amino acid 150 of SEQ ID NO: 18 in the sequence
Is expected.Clone "ep234 1"
The polynucleotide of the present invention has been identified as clone "ep2341".
Ep2341 is a method selective for cDNA encoding secreted proteins (US
No. 5,536,637) from an adult placenta cDNA library.
Or computer analysis of the amino acid sequence of the encoded protein
Encoding a secretory or transmembrane protein. ep234 1 is
It is a full-length clone and is a secreted protein (also referred to herein as "ep234-1 protein").
) Contains the entire coding sequence.
The nucleotide sequence of ep2341 determined this time is shown in SEQ ID NO: 19.
Applicants have now correctly read the ep234_1 protein corresponding to the above nucleotide sequence.
The frame and the deduced amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 20. Amino acid 59
To 71 are predicted leader / signal sequences, and the predicted mature amino acid sequence is
Starting from amino acid 72 or amino acids 59 to 71 are transmembrane domains
is there.
EcoRI / No obtainable from the deposit containing clone ep2341
The tI restriction fragment should be approximately 2500 bp in length.
The nucleotide sequence of ep234_1 disclosed herein can be obtained from BLASTA / BLASTX and
Against GenBank and GeneSeq databases using FAST and FASTA search protocols
And searched. ep2341 is AA044714 (zf54d09.r1 Soares retina N2b4HR
Homo sapiens cDNA clone 380753 5 '), AA454840 (zx79d09.s1 Soares ovary tu
mor NbHOT Homo sapiens cDNA clone 809969 3 '), AA470137 (zu11e01.s1 Soare
s testis NHT Homo sapiens cDNA clone 731544 3 '), H24852 (y142c11.r1 Homo
sapiens cDNA clone 160916 5 '), N64648 (yz87b06.s1 Homo sapiens cDNA clone
290003 3 '), R45788 (Ha662-f Homo sapiens cDNA clone a662-f), T70546 (yd15b
07.s1 Homo sapiens cDNA clone 108277 3 '), W73481 (zd54e01.s1 Soares fetal
heart NbHH19W Homo sapiens cDNA clone 344472 3 '), and W73553 (zd54e01.
(r1 Soares fetal heart)
Showed similarity. Based on sequence similarity, has ep234-1 protein and similarities
Proteins or peptides may share at least some activity
. According to the TopPredII computer program, e represented by SEQ ID NO: 20
p234 At least two proteins in one protein
The presence of a potential transmembrane domain is predicted.
Depositing clones
Clone ax318 3, bg140 1, bg465 2, bk291 3
, Bp5374, cs431 2, cw9761, cwl233 3, dg
11 and ep2341 are based on the Budapest Treaty on March 11, 1997.
The American Type Culture Collection received a deposit number ATCC 98353 on the day.
From which the clone is available. For public use of deposited materials
All restrictions are at 37 CFR. F. R. Grant of patent except for the provisions of § 1.808 (b)
Will be released by
Each clone is transfected into separate bacterial cells (E. coli) as this complex deposit.
Sfected. EcoRI / NotI digestion (5 'site, EcoRI; 3
'Site, NotI) to obtain an appropriately sized fragment for such a clone.
Each clone can be taken from the deposited vector
. Each clone was inserted into either the pED6 or pNotS vector shown in FIG.
And deposited. Insert a new polylinker to facilitate cDNA cloning
Thus, the pED6dpc2 vector (pED6) is derived from pED6dpc1.
(Kaufman et al. (1991). NAR 19: 4485-4490). DHFR is deleted and new
Insertion of the M13 replication origin into the ClaI site.
From the pNOTs vector, pMT2 (Kaufman et al. 1989. Mol. Cell. Biol.
9: 1741-1750). In some cases, the deposited clone is
"Flip" (ie, in the opposite direction). Even in such a case,
The cDNA insert can be isolated by digestion with EcoRI and NotI.
However, in that case the cD in the correct orientation for expression in a suitable vector
To place the NA, NotI creates a 5 'site and EcoRI creates a 3' site.
Will generate. Expression of cDNA from vector where cDNA is deposited
You may.
Obtaining bacterial cells, including individual clones, from the complex deposit as follows
Can:
Make sure that the oligonucleotides are against the known sequence for the individual clones.
Otide probes or probes should be designed. This sequence is
It can be derived from a sequence, or a combination of those sequences. Each full length claw
The oligonucleotide probe sequences used to isolate the
, They should be the most reliable in isolating the clone of interest.clone Probe sequence
ax318 3 SEQ ID NO: 21
bg140 1 SEQ ID NO: 22
bg465 2 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 32
bk291 3 SEQ ID NO: 24
bp537 4 SEQ ID NO: 25
cs431 2 SEQ ID NO: 26
cw9776 1 SEQ ID NO: 27
cw1233 3 SEQ ID NO: 28
dg11 SEQ ID NO: 29
ep234 1 SEQ ID NO: 30
The sequence listed above contains an N at position 2, which position is a preferred probe / pump.
Biotinylated phosphoramidites rather than nucleotides in primers
Residues such as biotin phosphoramidite (1-dimethoxytrityloxy-2
-(N-biotinyl-4-aminobutyl) -propyl-3-O- (2-cyanoe
Tyl)-(N, N'-diisopropyl) -phosphoramidite (Glen Research
Obtained by the use of the catalog number 10-1953))).
Preferably, the design of the oligonucleotide probe follows these parameters.
Should be:
(A) The region of the sequence where the number of unclear bases (N), if any, is minimal
Should be designed to:
(B) Tm of about 80 ° C. (2 ° C. for A or T, 4 ° C. for G or C)
(Assume ° C).
Preferably, a method widely used for oligonucleotide labeling is used,
Oligonucleotides are converted to γ-32P-ATP (specific activity
6000 Ci / mmole). Other labeling methods may be used
it can. Preferably, the unincorporated label is gel filtered or otherwise established.
Should be removed by any method The amount of radioactivity incorporated into the probe
It should be quantified by measuring with a titration counter. Preferably,
The specific activity of the probe obtained should be about 4e + 6 dpm / pmole
.
Preferably, a bacterial culture containing a pool of full-length clones is thawed and 100 μl of
Stock was added to 25 ml of sterile L-broth containing 100 μg / ml ampicillin
Should be used to inoculate sterile culture flasks containing. Preferably, the culture is
It should be grown at 37 ° C. to saturation, and preferably, the saturated culture should be fresh L
Should be diluted with broth. Preferably, some of these dilutions are plated
100 μg / ml ampicillin in a 150 mm Petri dish and
Grow overnight at 37 ° C. on solid bacterial culture medium containing L broth containing 5% agar
Dilution rate yields 5000 distinct and well-separated colonies
The volume should be determined. Others to get clear, well-separated colonies
Can also be used.
The colonies are then nitted using standard colony hybridization techniques.
Transfer to a low cellulose filter for dissolution, denaturation and baking.
You.
Then, preferably, 0.5% SDS, 100 μg / ml yeast RNA,
6X SSC containing 20 mM EDTA and 17 mM EDTA
NaCl / liter, 88.2 g sodium citrate, pH 7.0 with NaOH
) (About 10 ml per 150 mm filter) with gentle stirring.
Incubate at 65 ° C for 1 hour. Then, preferably, the probe is
Add to the hybridization mix at a concentration greater than 1e + 6 dpm / ml.
Or equal to this. The filter is then preferably kept at room temperature.
Stir
Wash with 500 ml of 2X SSC / 0.5% SDS, preferably
500 ml of 2 × SSC / 0.1% SDS with gentle shaking at room temperature
Wash with. 65 ° C., 30 minutes to 1 hour, 0.1 × SSC / 0.5% SDS
The third wash with is best. The filter is then preferably dried,
Subject to time autoradiography to visualize positives on X-ray film.
Other known hybridization methods can also be used.
Positive colonies are picked, grown in medium, and then positively added using standard procedures.
Isolate the mid DNA. Then, restriction analysis, hybridization analysis or
Clones can be verified by DNA sequencing.
A fragment of the protein of the present invention that can exhibit biological activity is also included in the present invention.
You. Protein fragments may be linear or, for example, H.U.Saragovi
, Et al., Bio / Technology 10, 773-778 (1992) and R.S. McDowell, et al., J.
. Amer. Chem. Soc. 114, 9245-9253 (1992) (both references are incorporated herein by reference).
Cyclization using known methods as described in
Is also good. For many purposes, including increasing the number of protein binding sites
Such fragments may be fused together with the immunoglobulin to a carrier molecule.
. For example, a fragment of a protein can be linked to the immunoglobulin Fc via a “linker”.
It may be fused to parts. For a bivalent form of the protein, such a fusion would
For the Fc portion of Using other immunoglobulin isotypes
Such a fusion may be obtained. For example, a protein-IgM fusion is a 10-valent form of the present invention.
Will produce light protein.
The invention also provides the full length and mature forms of the disclosed proteins. Full length form of such a protein
Is identified in the sequence listing by translation of the nucleotide sequence of the disclosed clone.
I have. The mature form of such a protein can be found in a suitable mammalian cell or other host cell.
To release the disclosed full-length polynucleotides (preferably those deposited with the ATCC).
It may be obtained by exposing. Amino acid sequence of full-length form
It may be determined from the column.
The present invention also provides a gene corresponding to the cDNA sequence disclosed herein. "
A "corresponding gene" is a region of the genome that is transcribed to produce mRNA,
RN
CDNA derived from A, next to the genome required for regulated expression of such gene
Flanking regions (including coding sequences, 5 'and 3' untranslated regions) or sp
Licensed exons, introns, promoters, enhancers, and
And a silencer or suppressor element. Sequences disclosed herein
The corresponding gene can be isolated using this information. Sequence information disclosed herein
Can be used to isolate the corresponding gene. Such methods involve the use of the disclosed sequences.
Prepare a probe or primer from the information and select an appropriate genomic library or
Identifying and / or amplifying genes in other sources of genomic material.
An “isolated gene” is an adjacent gene found in the genome of the organism from which the gene was isolated.
The gene is separated from the coding sequence (if present).
Enhance, decrease, or increase the gene corresponding to the polynucleotide sequence disclosed herein.
Provides an organism having an altered expression. Antisense polynucleotide
Or to bind and / or bind mRNA transcribed from the gene.
The desired change in gene expression is achieved by using a ribozyme that cleaves
(Albert and Morris, 1994, Trends Pharmacol. Sci. 15 (7): 250-254; L
avarosky et al., 1997, Biochem Mol. Med.62 (1): 11-22; and Hampel, 1998, Pr
og. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 58: 1-39; all of which are incorporated herein by reference.
Document). Corresponding to the polynucleotide disclosed herein.
Transgenic animals, preferably transformed cells and
And transforming cells with genetic constructs that are stably maintained in their progeny
A transgenic animal obtained by the method. Gene expression level
Time or spatial pattern of gene expression
Transgenic animals with altered genetic control regions that alter
(See European Patent No. 0 649 464 B1; all of which are incorporated by reference).
As described herein). Furthermore, insertion of an external sequence
Alternatively, the deletion of all or part of the corresponding gene results in the polynucleotides disclosed herein.
An organism in which the gene corresponding to the peptide sequence is incompletely or completely inactivated is provided.
You. Insertion, preferably by insertion after incorrect resection of the transposable element.
(Plasterk, 1992, Bioessays 14 (9):
629-633; Zwaal et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (16): 7431-7435;
Clark et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (2): 719-722; all of these
Are considered as described herein by reference) or homologous recombination
Homologous recombination, preferably detected by positive / negative genetic selection
(Mansour et al., 1988, Nature 336: 348-352; U.S. Patent Nos. 5, 464,
764; 5,487,992; 5,627,059; 5,631,153; 5,614,396; 5,616,491; and 5,679,523;
All of which are incorporated herein by reference), incomplete or
Can perform complete gene inactivation. This with altered gene expression
These organisms are preferably eukaryotes, more preferably mammals. Heel
Organisms have been involved in developing non-human models to study diseases associated with the corresponding gene.
Have an assay system for identifying molecules that interact with protein products from the corresponding gene.
Useful for development.
When the protein of the present invention is membrane-bound (eg, a receptor), the present invention
Soluble forms are also provided. In such a form, the intracellular and transmembrane domains of the protein
And remove all or part of the protein so that it is sufficiently secreted from the host where the protein was expressed.
To do. Intracellular and transmembrane domains of the protein of the present invention are determined from sequence information.
The domain can be identified by a known method for determining the domain.
The proteins and protein fragments of the present invention have at least the amino acid sequence of the disclosed protein.
25% (more preferably at least 50%, most preferably at least 75%)
At least 60% sequence identity to the disclosed proteins.
(More preferably at least 75% identity, most preferably at least 90%
Or 95% identity). Sequence identity is a measure of sequence gap.
When sequences are juxtaposed to maximize overlap and identity while minimizing
It is determined by comparing the amino acid sequences of the proteins. Seg of any disclosed protein
At least 75% sequence identity (more preferably at least 75%
85% identity, most preferably at least 95% identity).
8 or more (more preferably 20 or more, most preferably
Is a protein containing a segment containing 30 or more contiguous amino acids
Or protein fragment
Are also included in the present invention.
Species homologs of the disclosed polynucleotides and proteins are also provided by the invention. Book
The term "species homolog" as used herein refers to a species different from the source of the protein or polynucleotide.
A protein or polynucleotide, but as determined by one skilled in the art,
Those having significant sequence similarity. Suitable probes based on the sequences shown in this specification
Alternatively, prepare primers and then screen for an appropriate nucleic acid source from the desired species.
Species homologs may be isolated and identified by ligation.
The present invention also relates to allelic variants of the disclosed polynucleotides,
Identical, homologous or related to the protein encoded by the oligonucleotide.
Spontaneous variants of the isolated polynucleotides encoding the described proteins.
Also, the present invention has a sequence complementary to the sequence of the polynucleotide disclosed herein.
Also encompasses polynucleotides.
The invention also relates to the use of the present invention under reduced stringency conditions, more preferably under stringent conditions.
The polynucleotides described herein may also be hybridized, preferably under very stringent conditions.
Also encompasses polynucleotides that can be redistributed. The following table shows examples of strictness conditions.
Shown in The very strict conditions are, for example, at least as strict as conditions A to F.
Yes, the strict conditions are, for example, at least as strict as the conditions GL,
The condition for reducing the density is, for example, at least as strict as the conditions M to R. ‡: The hybrid length is the length of the hybridizing polynucleotide.
Expected length for hybridized region (s). Polinu
Cle
When hybridizing otide to a target polynucleotide of unknown sequence
The hybrid length is the length of the polynucleotide to be hybridized.
Assume. If a polynucleotide of known sequence hybridizes,
Align nucleotide sequences to identify the region (s) of optimal sequence complementarity
This allows the hybrid length to be determined.†
: SSPE (1 × S
SPE is 0.15M NaCl, 10mM NaHTwoPOFour, And 1.25 mM E
DTA, pH 7.4) with SSC (1 × SSC is 0.15 M NaCl and 1
5 mM sodium citrate). Hybridization
After the completion of the washing, the washing is performed for 15 minutes.
* TB-TR: For hybrids that are expected to be shorter than 50 base pairs in length
The hybridization temperature is the melting temperature of the hybrid (Tm5) than 10)
C should be lowered. T by the following equationmIs determined. Less than 18 base pairs in length
For hybrids, Tm(° C.) = 2 (number of A + T bases) +4 (number of G + C bases). Length 18
For a 49 base pair hybrid,
Tm(℃) = 81.5 + 16.6 (logTen[Na]) + 0.41 (% G + C)-(600 / N), where N is a hybrid
Number of bases, and the sodium ion concentration in the hybridization buffer
([Na for 1 × SSC]+] = 0.165M).
Further examples of stringency conditions for polynucleotide hybridization
Is Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T.W. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Har
bor, NY, chapters 9 and 11, and Current Protocols in Molecular Biology,
1995, F.M. Ausubel et al., Eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10
and 6.3-6.4 and are considered to be hereby incorporated by reference.
Eggplant
Preferably, each of such hybridizing polynucleotides
Is at least 25% of the polynucleotide of the invention to be hybridized
(More preferably at least 50%, most preferably at least 75%)
With length
And at least for the polynucleotide of the present invention to be hybridized.
60% sequence identity (more preferably, at least 75% identity, most preferably
Or at least 90% or 95% identity). Sequence identity
Align sequences to maximize overlap and identity while minimizing gaps in
Is determined by comparing the amino acid sequences of the proteins.
The isolated polynucleotide encoding the protein of the present invention is described in Kaufman et al., Nucl.
eic Acids Res. PMT2 or pED expression vector disclosed in 19, 4485-4490 (1991)
Operably linked to an expression control sequence such as
Good. Many suitable expression control sequences are known in the art. Many fit
Various expression control sequences are known in the art. One for recombinant protein expression
General methods are also known. Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537-566 (1
990) is a typical example. "Operably linked," as defined herein, refers to the isolated polypeptide of the present invention.
The nucleotides and expression control sequences are placed and ligated into a vector or cell.
A hotel transformed (transfected) with a polynucleotide / expression control sequence
It is meant to be expressed by the main cell.
Many types of cells can serve as suitable host cells for expression of the proteins of the present invention.
Mammalian cells include, for example, monkey COS cells, Chinese hamster ovary (CH
O) cells, human kidney 293 cells, human epidermal A431 cells, human Colo205 cells
Vesicles, 3T3 cells, CV-1 cells, other transformed primate cell lines, normal diploid
Cells, cell lines obtained from in vitro culture of primary tissues, primary explants, H
eLa cells, mouse cells, BHK, HL-60, U937HaK or Jurkat cells
Vesicles.
Alternatively, in lower eukaryotic cells such as yeast or prokaryotic cells such as bacteria.
It is possible to produce proteins. A potentially suitable yeast strain is Saccharomyces ce
revisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces strain, Candida, or different
Includes yeast strains capable of expressing the seed protein. A potentially suitable bacterial strain is Escherichia
capable of expressing E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, or heterologous proteins
Functional bacterial strains. If the protein is produced in yeast or bacteria,
Generated by
Modified by, for example, phosphorylation or glycosylation of appropriate sites
You may need to obtain a functional protein. Using known chemical or enzymatic methods
Such covalent bonding may be performed.
The isolated polynucleotides of the present invention can be used in one or more insect expression vectors to
The protein can be obtained by operably linking to an appropriate control sequence and using an insect expression system.
Good. Materials and methods for baculovirus / insect cell expression systems are described, for example, in In
Kit form from vitrogen, San Diego, California, USA (MaxBacRKit)
Commercially available, such methods are well known in the art and include Summers and
And Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)
(Such as described herein by reference)
You. As used herein, an insect cell capable of expressing the polynucleotide of the present invention is
"Transformed".
Culturing transformed host cells under culture conditions suitable for expressing the recombinant protein
The protein of the present invention may be produced more. Next, the obtained expressed protein was subjected to gel filtration and filtration.
Such cultures using known purification processes, such as ion exchange chromatography
(I.e., medium or cell extract). Also, protein purification
Is an affinity column containing an agent that will bind to proteins
Valine A-agarose, heparin-ToyopearlROr Cibacrom blue 3GA Sepha
LoinROne or more column steps with an affinity column such as
Use resin such as phenyl ether, butyl ether or propyl ether
One or more steps using hydrophobic interaction chromatography;
Or immunoaffinity chromatography.
Alternatively, the protein of the invention may be expressed in an easily purified form. For example,
Lactose binding protein (MBP), glutathione-S-tonspherase (GST)
Or expressed as a fusion protein such as a fusion protein with thioredoxin (TRX)
You may. Kits for expression and purification of such fusion proteins are available from New En
from glan BioLab (Beverly, MA), Pharmacia (Piscataway, NJ) and InVitrogen
It is commercially available. Tag a protein with an epitope, and then tag such epitope
Purification can also be achieved by using directed, specific antibodies. It takes 1
Pitope (`` flat
G) is commercially available from Kodak (New Haeven, CT).
Finally, a hydrophobic RP-HPLC medium such as a pendant methyl or other aliphatic group is added.
One or more reversed-phase high quality liquid chromatography using silica gel with
-(RP-PLC) step to further purify the protein. Some
Or a substantially homogeneous isolation and recombination using various combinations of the above purification steps
You can also get protein. The protein thus purified is substantially different from other mammalian proteins.
And is defined as "isolated protein" in the present invention.
The protein of the present invention may be used as a product of a transgenic animal.
Characterized by somatic or germ cells containing the nucleotide sequence
Expressed as an ingredient in milk of transgenic cows, goats, pigs, or sheep
Is also good.
The protein may be produced by known conventional chemical synthesis. The present invention by synthetic means
Methods for constructing proteins are known to those skilled in the art. Synthetically constructed protein sequences are primary
Sharing secondary or tertiary structure and / or conformational properties
Thus, they may have common biological properties, including protein activity. Yo
For the screening of therapeutic compounds and the immunology for the production of antibodies.
Process to replace the biologically active or immunological replacement of the naturally occurring purified protein
May be used.
The protein shown in the present specification has an amino acid sequence similar to that of the purified protein.
Which are modified naturally or by derivatization
Is also good. For example, modification of a peptide or DNA sequence can be accomplished by one of ordinary skill in the art using known methods.
More can be done. The desired modification in the protein sequence depends on the choice in the coding sequence.
Includes amino acid residue changes, substitutions, exchanges, insertions or deletions. For example, up to one
Or more cysteine residues have been deleted or exchanged for another amino acid.
The conformation of the child may be changed. Such changes, replacements, exchanges, insertions, etc.
Methods for deletion or deletion are well known to those skilled in the art (see, for example, US Pat.
No. 8584). Preferably, such changes, substitutions, exchanges, insertions or deletions
It retains the desired activity of white.
Expected to retain protein activity in whole or in part, thus screening
The
Or other fragments of the protein sequence that may be useful for other immunological methods
Conductors can also be made by those skilled in the art from the disclosure herein. Such modifications are
It is believed to be more encompassed.Applications and biological activities
The polynucleotides and proteins of the present invention may have one or more of the following uses or
Exhibiting biological activity (including those associated with the assays cited herein)
Conceivable. The uses or activities described for the proteins of the invention may be attributed to the administration of such proteins.
Supply or use, or a polynucleotide encoding such a protein.
Administration or use (e.g., per vector suitable for gene therapy or DNA transfer)
C).Research applications and usefulness
The polynucleotide provided by the present invention can be used for various purposes depending on the research population.
Can be used. Preferential expression of the corresponding protein for analysis, characterization or therapeutic use
(Constitutively, at a specific stage of tissue differentiation or development, or
(Expressed in disease states)
As a quantity marker, it can be used to identify chromosomes or map related gene locations.
Compared to the patient's endogenous DNA as a chromosome marker or tag (if labeled)
Probes to identify potential genetic diseases
Genetic fingerprinting to discover new related DNA sequences
As a source of information for obtaining PCR primers for
Probes to subtract known sequences in the process of nucleotide discovery
And select the oligomer to bind to a “gene chip” or other support
To test for expression patterns, use DNA immunization to
To generate antibodies, as well as to generate anti-DNA antibodies, or
Polynucleotides can be used as antigens to induce an immune response
You. Binds or potentially binds another protein (e.g.,
Code for a protein that
If so, identify other proteins that bind, and / or inhibit binding interactions
Interaction trap assays to identify agents (eg, Gyuris et al., Cell
75: 791-803 (1993)).
Can be.
The proteins provided by the present invention are a family of multiple proteins for high-throughput screening.
For assays to determine biological activity, including proteins of interest; production of antibodies or other
A protein (or its receptor) in a biological fluid
Reagents (including labeling reagents) in assays designed to quantitatively determine
The corresponding protein is preferentially expressed (constitutively or with tissue differentiation or
Are expressed at specific stages of development or in disease states)
As well as, of course, to isolate the relevant receptor or ligand
You may. Bind when a protein binds or potentially binds to another protein
Proteins to identify other proteins and / or inhibitors of binding interactions
White can be used. Using proteins involved in these binding interactions,
Of peptide or small molecular inhibitor or agonist for binding interaction
Training can also be performed.
Any or all of these research uses may be commercialized as research products.
Can be developed to reagent grade or kit format.
Methods for performing the above uses are well known to those skilled in the art. Open this method
References shown are "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spr.
ing Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., E.F. Fritschand T. Maniatised
s., 1989, and "Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techni
ques ", including Academic Press, Berger, S.L. and A.R. Kimmel eds., 1987
However, it is not limited to these.
Nutritional uses
Use of the polynucleotide and protein of the present invention as a nutrient source or additive
Can be. Such uses include the use as a protein or amino acid additive, and the use as a carbon source.
Of
Use, use as a nitrogen source and use as a carbohydrate source.
Not limited to In such a case, the protein or polynucleotide of the present invention may be
Or as a powder, pill, solution, suspension or capsule.
It can also be administered as a separate individual in liquid form or as a liquid formulation. Microorganism
In the case of, the protein or polynucleotide of the present invention is added to the medium in which the microorganism is cultured.
Can be
Cytokines and cell proliferation / differentiation activity
The protein of the present invention has cytokine activity, cell growth activity (induction or inhibition) or cell activity.
Can show blast differentiation activity (induction or inhibition) or in certain cell populations
To induce the production of other cytokines. Many proteins found to date
Sex factors (including all known cytokines) are dependent on one or more factors
Showing activity in cell proliferation assays, and thus the assay
Serves as a convenient way to confirm activity. The activity of the protein of the present invention is determined in cell lines (32D, DA
2, DA1G, T10, B9, B9 / 11, BaF3, MC9 / G, M + (pr
eB M +), 2E8, RB5, DA1, 123, T1165, HT2, CTL
L2, TF-1, Mo7e and CMK, but not limited to)
It is confirmed by any of a number of conventional factor-dependent cell proliferation assays.
The activity of the protein of the invention may be measured, inter alia, by the following method:
Assays for T cell or thymocyte proliferation are:
Current Protocols in Immunology, Ed by J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.
H. Margulies, E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates
and Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte
Function 3.1-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al.
, J. et al. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Bertagnolli et al., J. Am. Immunol. 145: 17
06-1712, 1990; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133: 327-341, 1991;
Bertagnolli, et al. Immunol. 149: 3778-3783, 1992; Bowman et al., J. Am. I
mmunol. 152: 1756-1761, 1994
But not limited thereto.
Cytokine production and / or expansion of spleen cells, lymph node cells or thymocytes
Assays for breeding
Polyclonal T cell stimulation, Kruisbeek, A.M. and Shevach, E.M. In Curr
ent Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1pp. 3.12.1-3.12.
14, John Wiley and Sons, Toronto. 1994; and Measurement of mouse and huma
n Interferon γ, Schreiber, R.D. In Current Protocols in Immunology. J.E
.e.a. Coligan eds. Vol 1pp. 6.8.1-6.8.8, John Wiley and Sons, Toronto. 1
994
But not limited thereto.
Assays for proliferation and differentiation of hematopoietic and lymphogenic cells
Measurement of Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Bottoml
y, K., Davis, L.S. and Lipsky, P.E. In Current Protocols in Immunology.
J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1pp. 6.3.1-6.3.12, John Wiley and Sons, Toronto
o. 1991; deVries et al. Exp. Med. 173: 1205-1211, 1991; Moreau et al.,
Nature 336: 690-692, 1988; Greenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A. 80: 2931-2938, 1983; Measurement of mouse and human interleukin 6-Norda
n, R. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1pp
. 6.6.1-6.6.5, John Wiley and Sons, Toronto. 1991; Smith et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 1857-1861, 1986; Measurement of human Interleuki
n 11-Bennett, F., Giannotti, J., Clark, S.C. and Turner, K. J. In Curren
t Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 pp. 6.15.1 John W
iley and Sons, Toronto. 1991; Measurement of mouse and human Interleukin
9-Ciarletta, A., Giannotti, J., Clark, S.C. and Turner, K.J. In Current
Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1pp. 6.13.1, John Wil
ey and Sons, Toronto. 1991
But not limited thereto.
Assays for the response of T cell clones to antigens (particularly proliferation and
APC-T cell interaction as well as direct
T thin
Vesicle effect)
Current Protocols in Immunology, Ed by J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.
H. Margulies, E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates
and Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitroassays for Mouse Lymphocyte F
unction; Chapter 6, Cytokines and their cellular receptors; Chapter 7, Imm
unologic studies in Humans); Weinberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 77: 6091-6095, 1980; Weinberger et al., Eur. J. Immun. 11: 405-411, 1981;
Takai et al. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Takai et al., J. Am. Immunol.
140: 508-512, 1988
But not limited thereto.
Immunostimulatory or suppressive activity
In addition, the activity of the protein of the present invention in the assay described in the present specification (including but not limited to these)
), And may exhibit immunostimulatory or immunosuppressive activity. Protein is
In various deficiencies and disorders, including severe immunodeficiency complications (SCID)
May be useful, for example, to increase the proliferation of T and / or B lymphocytes
In regulating or down-regulating, and N
Useful in enhancing the cytolytic activity of K cells and other cell populations
It is possible. These immunodeficiencies can be genetic and can include viral (
HIV, as well as those caused by bacterial or fungal infections.
Or may be caused by an autoimmune disease. Yo
More specifically, the susceptibility caused by viruses, bacteria, fungi or other infectious agents
Infectious diseases such as HIV, hepatitis virus, herpes virus, mycobacteria
A variety of fungal infections such as Leishmania, Malaria and Candida species
It can be treated with myoprotein. Of course, in this regard, the immune system
When a protein is required, that is, in the treatment of cancer, the protein of the present invention may be used.
Autoimmune diseases that may be treated using the protein of the present invention include, for example, multiple sclerosis,
Systemic deep elitomades, rheumatoid arthritis, autoimmune pneumonia,
Guillain-Barre syndrome, autoimmune thyroiditis, insulin-dependent diabetes, severe muscle
Includes asthenia, graft versus host disease and autoimmune inflammatory eye diseases. Book
Such proteins can be used to treat allergic reactions such as asthma or other respiratory disorders
And may be used for the treatment of symptoms. Other conditions for which immunosuppression is desired (eg, asthma
(Especially allergic asthma) and related respiratory problems)
And may be treated. Other conditions for which immunosuppression is desired (including, for example, organ transplantation)
May be treated using the protein of the present invention.
The proteins of the present invention can also be used to enable an immune response in a number of ways. Da
Unregulation can block or block an immune response already in progress
Or includes interfering with the induction of an immune response.
There may be. By suppressing the T cell response, or
Inhibits activated T cell function by inducing resistance or both
May be. Generally, immunosuppression of T cell responses is an active, non-antigen specific
Process, which requires continuous exposure of T cells to the inhibitor. Resistance and
Means non-responsive or anergic in T cells, generally antigen-specific
In that it persists after exposure to the tolerizing agent has ceased.
Operationally, the lack of a T cell response when exposed to a specific antigen in the absence of a resistance agent
More resistance may be shown.
One or more antigen functions (eg, B lymphocyte antigen function (eg, B7)
Including, but not limited to, down-regulating
For example, blocking high levels of lymphokine synthesis by activated T cells
Useful in tissue, skin and organ transplantation and graft versus host disease (GVHD)
There will be. For example, blocking T cell function reduces tissue destruction in tissue transplantation
Should be. Typically, in tissue transplants, graft rejection is
Initiated by T cells being recognized as foreign and then breaking the graft
A destructive immune response occurs. B7 Lymphocyte Antigen on Immune Cells and Its Native Riga
A molecule that inhibits or blocks interaction with another B lymphocyte antigen (eg,
, B7-1, B7-3), in the form of a monomer having the activity of
Or a single, soluble, monomeric peptide having B7-2 activity)
Pre-plant administration is responsive
Binding of molecules to their native ligands on immune cells without transmitting costimulatory signals
May induce a match. Block B lymphocyte antigen function in this regard
It interferes with cytokine synthesis by immune cells, such as T cells, and thus
Acts as an immunosuppressant. Moreover, the lack of costimulation causes the T cell to lose its response.
May be sufficient to Induction of long-term resistance by B lymphocyte antigen blocking reagent
By way of guidance, the need for repeated administration of these blocking reagents may be avoided.
To achieve sufficient immunosuppression or tolerance in a subject, the B lymphocyte antigen
It may also be necessary to block the function of the combination.
Individual blocking in preventing organ transplant rejection or GVHD
Evaluate the effectiveness of the reagents using animal models that can predict their effectiveness in humans
be able to. Examples of suitable systems that can be used include allografts in rats and allografts.
Xenogeneic pancreatic islet cell grafts in mice and
Was used to test the immunosuppressive effect of the CTLA4Ig fusion protein (Lenscho
w et al., Science 257: 789-792 (1992) and Turka et al., Proc Natl. Acad.
Sci. USA, 89: 11102-11105 (1992)). In addition, GVHD mice
Mimodel (Paul ed., Fundamental Immunology, Ravan Press, New York, 1989,
pp. 846-847) using B lymphocyte anti-disease against the progression of the disease in vivo.
The blocking effect of the original function can be determined.
In addition, blocking antigen function is therapeutically useful for treating autoimmune diseases
It can be. Many autoimmune diseases are responsive to self-
Inappropriate activity of T cells to promote the production of cytokines and autoantibodies involved in
It is the result of sexualization. Interfering with the activation of self-reactive T cells reduces the symptoms of the disease.
Less or may be eliminated. Disrupting B lymphocyte antigen receptor: ligand interaction
Inhibit T cell activation using administration of a reagent that blocks T cell costimulation
Production of autoantibodies or T cell-derived cytokines that can harm and participate in the disease process
Can interfere with life. In addition, blocking reagents can provide long-term remission of disease
It may induce antigen-specific resistance of autoreactive T cells that may lead. Autoimmune disease
The effectiveness of blocking reagents in the prevention or amelioration of
Fully featured about
It can be determined using a number of animal models attached. An example is a rat fruit
Experimental autoimmune encephalitis, MRLlpr / 1pr mouse or NZB hybrid mouse
Deep-seated lupus erythematosus, murine autoimmune collagen arthritis,
Diabetes in NOD mice and BB rats, and murine experimental myasthenia
Strength (Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp.
840-856).
Antigen function as a means of up-regulating the immune response (preferred
Alternatively, up-regulation of B lymphocyte antigen function) is also therapeutically useful.
Up-regulation of the immune response may be
May be in a form that eliminates the initial immune response. For example, B lymphocyte antigen function
Enhancing the immune response by stimulating may be useful in the case of a viral infection.
In addition, systemic viral such as influenza, common cold, and encephalitis
Disease may be ameliorated by systemic administration of a stimulatory form of B lymphocyte antigen
.
Alternatively, T cells are taken from a patient and tagged with ACPs that express a peptide of the invention.
Co-stimulate T cells in vitro with added viral antigens, or
Is combined with a stimulating form of the soluble peptide of the invention and then activated in vitro
Re-introduced T cells into the patient, the anti-virus in infected patients
It may enhance the immune response. Another method of promoting an antiviral immune response is
Infected cells are taken from the patient and the nucleic acid encoding the protein of the invention described herein is
To allow cells to express all or part of the protein on their surface.
And then reintroduce the transfected cells into the patient.
U. The infected cells then transmit a costimulatory signal to the T cells in vivo.
Could thereby activate T cells.
In another application, antigen function (preferably B lymphocyte antigen function)
Pre-regulation or promotion may be useful in inducing tumor immunity.
Transfected with a nucleic acid encoding at least one peptide of the invention
Tumor cells (eg, sarcomas, melanomas, lymphomas, leukemias, neuroblastomas, carcinomas)
) Can be administered to a subject to overcome tumor-specific resistance in the subject. If desired
If the tumor
Cells can be transfected to express a combination of peptides
. For example, tumor cells obtained from a patient can be prepared using only a peptide having B7-2-like activity, or
Or a peptide having B7-1-like activity and / or B7-3-like activity
Expression vector that directs expression
Action. Return the transfected tumor cells to the patient
To express the peptide on the surface of the transfected cells. Alternative
Tumor cells for transfection in vivo using gene therapy.
Vesicles can be targeted.
Existence of the peptide of the present invention having B lymphocyte antigen activity on the surface of tumor cells
Provides the necessary co-stimulatory signals for T cells to provide T cell-mediated trafficking.
Induces an immune response against the transfected tumor cells. In addition, MHC
Tumor cells lacking class I or MHC class II molecules, or sufficient MHC
Tumor cells that cannot reexpress class I or MHC class II molecules are
I α chain protein and βTwoMicroglobulin protein or MHC class II α chain or
Or all or part of the MHC class II β chain protein (eg,
Transfection with the nucleic acid encoding the
Class I or class II MHC proteins can be expressed on the cell surface
. A marker having the activity of a B lymphocyte antigen (eg, B7-1, B7-2, B7-3)
Expression of the appropriate class I or class II HMC in combination with the peptide is
Elicits an immune response to transfected tumor cells mediated by vesicles
Lead. If desired, expression of MHC class II binding proteins, such as invariant chains, can be blocked.
The gene coding for the antisense construct to be detected can be linked to the activity of the B lymphocyte antigen.
Co-transfection with DNA encoding a peptide having
To promote the presentation of tumor-associated antigens and induce tumor-specific immunity. Therefore
Induction of an immune response mediated by T cells in a human subject can be caused by tumors in the subject.
It may be sufficient to overcome tumor-specific resistance.
The activity of the protein of the invention may be measured, inter alia, by the following method:
Suitable assays for thymocyte or spleen cell cytotoxicity include:
Current Protocols in Immunology, Ed by J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.
H.
Margulies, E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates an
d Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Fun
ction 3.1-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Herrmann et al.
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2488-2492, 1981; Herrmann et al., J. Am. Immu
nol. 128: 1968-1974, 1982; Handa et al., J. Am. Immunol. 135: 1564-1572, 1985; T
akai et al. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Takai et al., J. Am. Immunol. 1
40: 508-512, 1988; Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2488-249
2, 1981; Herrmann et al., J. Mol. Immunol. 128: 1968-1974, 1982; Handa et al., J
. Immunol. 135: 1564-1572, 1985; Takai et al., J. Am. Immunol. 137: 3494-3500,
1986; Bowman et al., J. Am. Virology 61: 1992-1998; Takai et al., J. Am. Immunol. 1
40: 508-512, 1988; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133: 327-341,19
91; Brown et al., J. Amer. Immunol. 153: 3079-3092, 1994
Including but not limited to the assays described in
Updates for T cell-dependent immunoglobulin response and isotype switching
Say (especially to modulate the T cell dependent antibody response to a Th1 / Th2 profile
Influencing proteins are identified in Maliazewski, J. Immunol. 144: 3028-3033, 1990.
Includes, but is not limited to, the assays described, and further enhances B cell function.
Say, In vitro antibody production, Mond, J.J. and Brunswick, M. In Current
Protocols in Immunology J.E.Coligan eds.Val 1pp.3.8.1-3.8.16, John Wiley
and Sons, Tronto 1994.
Mixed lymphocyte reaction (MLR) assays (especially primarily Th1 and CTL
Identify the protein that produces the answer)
Current Protocols in Immunology, Ed by J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.
H. Margulies, E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates
and Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte
Function 3.1-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al.
, J. et al. Immnunol. 137: 3494-3500, 1986; Takai et al., J. Am. Immunol. 140: 508-512
, 1988; Bertagnolli et al., J. Med. Immunol. 149: 3778-3783, 1992
Including but not limited to the assays described in
Dendritic cell-dependent assays (especially for dendritic cells that activate untreated T cells)
To identify more expressed proteins)
Guery et al. Immunol. 134: 536-544, 1995; Inaba et al., Journal of Exp
erimental Medicine 173: 549-559, 1991; Macatonia et al., Journal of Immuno
logy 154: 5071-5079, 1995; Porgador et al., Journal of Exp-erimental Medic
ine 182: 255-260, 1995; Nair et al., Journal of Virology 67: 4062-4069, 1
993; Huang et al., Science 264: 961-965, 1994; Macatonia et al., Journal
f Experimental Medicine 169: 1255-1264, 1989; Bhardwaj et al., Journal of
Clinical Investigation 94: 797-807, 1994; and Inaba et al., Journal of Exp
erimental Medicine 172: 631-640, 1990
Including but not limited to the assays described in
Lymphocyte survival / apoptosis assays (especially apoptosis after superantibody induction)
Identify Proteins That Prevent Lysis and that Regulate Lymphocyte Homeostasis
) Is Darzynkiewicz et al., Cytometry 13: 795-808, 1992; Gorczyca et al.,
Leukemia 7: 659-670, 1993; Gorczyca et al., Cancer Research 53: 1945-1951,
1993; Itoh et al., Cell 66: 233-243, 1991; Zacharchuk, Journal of Immunolog.
y 145: 4037-4045, 1990; Zamai et al., Cytometry 14: 891-897, 1993; Gorczyca
et al., International Journal of Oncology 1: 639-648, 1992
But not limited thereto.
Early stage T cell commitment and developmental assays are described in A
ntica et al., Blood 84: 111-117, 1994; Fine et al., Cellular Immunology 155: 1
11-122, 1994; Galy et al., Blood 85: 2770-2778, 1995; Toki et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 88: 7548-7551, 1991.
Not limited to
Hematopoietic regulatory activity
The proteins of the present invention are useful in regulating hematopoiesis and are therefore
Useful in the treatment of bulb deficiency. Colony forming cells or factor-dependent cell lines
Support
Even the minimal biological activity it has implicated in regulating hematopoiesis. example
For example, to support the growth of erythroid progenitor cells alone, or with other cytokines
Combined to show usefulness, for example in the treatment of various anemias, or radiation
Erythroid progenitor cells and / or erythroblast production in combination with therapy / chemotherapy
Stimulating; supports proliferation of bone marrow cells such as granulocytes and monocytes / macrophages
(Ie, traditional CSF activity), for example, combined with chemotherapy
To prevent subsequent myelosuppression; megakaryocyte proliferation,
To support the growth of platelets, and thus various factors such as thrombocytopenia
Is useful for preventing or treating platelet disease in patients with
Used instead of or in addition to the fluid; and / or hematopoietic stem cells (
Matures into all of the above hematopoietic cells, and therefore various stem cell diseases (usually
Are diseases that are treated by transplantation, such as aplastic anemia and paroxysmal
Useful for supporting the growth of hemoglobinuria at night)
And even after radiation / chemotherapy in vivo or ex vivo (ie,
Or combined with bone marrow transplantation) or genetically engineered for gene therapy
It is also useful in later repopulation of the stem cell compartment as normal cells.
In particular, the activity of the protein of the present invention may be measured by the following method.
Assays suitable for proliferation and differentiation of various hematopoietic cell lines have already been cited
.
Assays for embryonic stem cell differentiation, specifically identifying proteins that affect embryonic hematopoiesis
) Is based on Johansson et al. Cellular Biology 15: 141-151, 1995; Keller et al.,
Molecular and Cellular Biology 13: 473-486, 1993; McClanahan et al., Blood
81: 2903-2915, 1993, including, but not limited to.
Assays for stem cell survival and differentiation, specifically identifying proteins that regulate lympho-hematopoiesis
Do)
Methylcellulose colony forming assays, Freshney, M.G. In Culture of Hema
topoietic Cells. R.I. Freshney, et al. eds. Vol pp. 265-268, Wiley-Liss
, Inc., New York, NY. 1994; Hirayama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89
: 5907-5911、1992; Primitive hematopoietic colony forming cells with high
proliferative potential, McNiece, I.K. and Briddell, R.A. In Culture of
Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, et al. eds. Vol pp. 23-39, Wiley-Li
ss, Inc., New York, NY. 1994; Neben et al., Experimental Hematology 22: 353
-359, 1994; Cobblestone area forming cell assay, Ploemacher, R.E. In Cul
ture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, et al. eds. Vol pp. 1-21, W
iley-Liss, Inc .., New York, NY. 1994; Long term bone marrow cultures in t
he presence of stromal cells, Spooncer, E., Dexter, M. and Allen, T .; In
Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, et al. eds. Vol pp. 163-
179, Wiley-Liss, Inc., New York, NY. 1994; Long term culture in itiating
cell assay, Sutherland, H.J. In Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Fre
shney, et al. eds. Vol pp. 139-162, Wiley-Liss, Inc., New York, NY. 199
Four
Including but not limited to the assays described in
Tissue proliferation activity
The protein of the present invention may be used to grow or regenerate bone, cartilage, keys, ligaments and / or nerve tissue.
And compositions used for wound healing and tissue repair, further including burns, lacerations
And has utility in the treatment of ulcers.
Book that induces cartilage and / or bone growth in an environment where bone is not formed normally
Inventive proteins cure healing of fractures and cartilage damage or defects in humans and other animals
There are applications in Such formulations using the protein of the present invention include closed fractures and
It is useful for reducing open fractures and improving fixation of artificial joints. Bone
De novo bone formation induced by plasticizers can be congenital, traumatic or tumor
Contributes to the repair of craniofacial deficits induced by radiological resection and further
It is also useful in general surgery.
The proteins of the present invention may be used in the treatment of periodontal disease and other tooth restoration processes. Heel
Agents provide an environment to attract osteogenic cells, stimulate the growth of osteogenic cells,
Alternatively, it can induce osteogenic cell precursor differentiation. For example, the protein of the present invention
And / or mediated by inflammatory or inflammatory processes
Pair
Blocking the process of tissue destruction (collagenase activity, osteoclast activity, etc.)
It may also be useful in treating osteoporosis or osteoarthritis.
Another category of tissue developmental activity that may be attributed to the proteins of the invention is the key.
/ Ligament formation. Environments where key / ligament-like or other tissues are not formed properly
The protein of the present invention that induces the formation of such a tissue in humans is useful in humans and other animals.
Applied to healing of key or ligament lacerations, deformations and other key or ligament defects
You. Such a formulation using a key / ligament-like tissue-inducing protein may be used for key or ligament-like tissue.
To prevent key or ligament fixation to bone or other tissue
May be. The de novo key / ligament-like tissue formation induced by the composition of the present invention
Sexual, traumatic, or oncological resection-induced craniofacial defects
Cosmetic surgery for contributing to the repair and also for attaching or repairing keys or ligaments
It is also useful in The composition of the present invention attracts key- or ligament-forming cells
Provide an environment for stimulating the proliferation of key- or ligament-forming cells,
Induction of precursors of band-forming cells or tissue repair when returned to vivo.
Ex vivo can induce the growth of key / ligament cells or progenitors ex vivo.
The compositions of the present invention can be used to treat keratitis, carpal tunnel syndrome and other key or ligament defects.
Is also useful. The composition of the present invention may comprise a suitable matrix and / or
It may include a sequestering agent, such as a well-known carrier.
The protein of the present invention is used for proliferation of nerve cells and regeneration of nerve and brain tissue,
, Central and peripheral nervous system diseases and neuropathy and mechanical diseases and
Treatment of traumatic diseases (including degeneration, death or trauma to nerve cells or nerve tissue)
Can also be useful for treatment. More specifically, peripheral nerve injury, peripheral neuropathy and
Diseases of the peripheral nervous system such as neuropathy and localized neuropathy, and Alzheimer's disease
, Parkinson's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral spinal sclerosis and Shy-Drager
Proteins may be used in the treatment of diseases of the central nervous system, such as the syndrome. By the present invention
Additional conditions that may be treated include mechanical disorders such as spinal cord disorders and traumatic disorders
And cerebrovascular diseases such as head trauma and stroke. Chemotherapy or other
Peripheral neuropathy caused by medical therapy of
It is treatable.
In addition, the protein of the present invention, pressure ulcer, ulcer associated with vascular dysfunction, surgical and
More preferred for non-healing wounds, including (but not limited to) wounds due to trauma
It may also be useful for promoting quick closure.
The protein of the present invention includes organs (eg, pancreas, liver, intestine, kidney, skin, endothelium).
), Muscle (smooth, skeletal or cardiac) and vascular (including vascular endothelium) tissue
To promote the development of other tissues or the proliferation of cells that make up such tissues.
Activity. Part of the desired effect is to reduce fibrotic scarring.
Regeneration of normal tissue. The proteins of the present invention may also exhibit angiogenic activity.
The protein of the present invention, protection or regeneration of intestine, and fibrosis of lung or liver, various groups
Treatment of tissue reperfusion injury and symptoms caused by systemic cytokine damage
Can also be useful for treatment.
A protein of the present invention, which promotes or suppresses differentiation of the above-mentioned tissue from precursor tissue or cells;
Alternatively, it may be useful for suppressing the growth of the tissue.
The activity of the protein of the invention may be measured, inter alia, by the following method:
Assay for tissue regeneration activity is described in WO 95/16035 (bone, cartilage, key)
International Publication WO95 / 05846 (nerves, neurons); International Publication WO91 / 05
7491 (skin, endothelium), including but not limited to
.
Assays for wound healing activity are described in Winter, Epidermal Wound Healing, pps. 71-112
(Maibach, HI and Rovee, DT, eds.), Year Book Medical Publishers, Inc., C
hicago (Eaglstein and Mertz, J. Invest. Dermatol 71: 382-384 (1978))
(Decorated), but are not limited thereto.
Activin / inhibin activity
Also, the protein of the present invention may exhibit activin- or inhibin-related activity. I
Inhibins are characterized by their ability to inhibit the release of follicle stimulating hormone (FSH),
Activins are characterized by their ability to stimulate the release of follicle stimulating hormone (FSH).
You. Therefore, the protein of the present invention may be used alone or as a member of the inhibin α family.
In the form of a heterodimer with a female mammal, which reduces the fertility of a female mammal
Animal sperm shape
It may be useful as an infertility drug based on the ability of inhibin to reduce growth. Enough amount
Inducing infertility in these mammals by administration of other inhibins
Can be. Alternatively, the protein of the present invention can be used as a homodimer or as inhibin.
-Anterior pituitary gland as a heterodimer with subunits of other proteins
Based on the ability of activin molecules to stimulate FSH release from cells,
May be useful as a therapeutic agent that induces For example, US Pat. No. 4,798,885.
reference. Further, the protein of the present invention is useful for improving reproduction in sexually immature mammals.
Possible, resulting in the survival of livestock such as cattle, sheep and pigs
Increases fertility inside.
The activity of the protein of the invention may be measured, inter alia, by the following method:
Assays for activin / inhibin activity are described in Vale et al., Endocrinology 91:
562-572, 1972; Ling et al., Nature 321: 779-782, 1986; Vale et al., Naure 3.
21: 776-779, 1986; Mason et al., Nature 318: 659-663,1985; Forage et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 3091-3095, 1986, including
Not limited to these.
Chemotaxis / chemokinesis activity
The protein of the present invention can be used for mammalian cells such as monocytes, neutrophils, T cells, mast cells, and eosinophils.
Chemotactic or chemokinetic activity of spheres and / or endothelial cells (eg,
Acting as in). Uses chemotaxis and chemokinesis proteins
And recruit or attract the desired cell population to the desired site of action. Chemotaxis
Alternatively, chemokinesis proteins may be used to treat and localize tissue injuries and other trauma.
It is particularly advantageous for treating localized infections. For example, tumors of lymphocytes, monocytes or neutrophils
Attraction to tumor or infected site may improve immune response to tumor or infectious agent
You.
Certain proteins or peptides have chemotactic activity for specific cell populations.
Direct or indirect, if stimulated, the direction or kinetics of such cell populations.
Command movement. Preferably, the protein or peptide has a directed movement of the cell.
Have the ability to directly stimulate Specific proteins have chemotactic activity on cell populations
Do you have
Whether such proteins or peptides can be used in known assays for cell chemotaxis.
And can be determined more easily.
The activity of the protein of the invention may be measured, inter alia, by the following method:
Assay for chemotaxis activity (an assay to identify proteins that induce or interfere with chemotaxis)
Say) describes the ability of proteins to induce cell translocation across the membrane as well as the ability of one cell population to
Includes assays that measure the ability of a protein to induce adhesion to other cell populations. Moving
Suitable assays for
Current Protocols in Immunology, Ed by J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H
. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates
and Wiley-Interscience (Chapter 6.12, Measurement of alpha and beta Chemo
kines 6.12.1-6.12.28; Taub et al. J. Clin. Invest. 95: 1370-1376, 1995; Lin
d et al. APMIS 103: 140-146, 1995; Muller et al Eur. J. Immunol. 25: 1744-1
748; Gruber et al. J. of Immunol. 152: 5860-5867, 1994; Johnston et al. J.
of Immunol. 153: 1762-1768, 1994
But not limited thereto.
Hemostasis and thrombolytic activity
Further, the protein of the present invention may exhibit hemostatic or thrombolytic activity. As a result
Thus, such proteins are useful in the treatment of various clotting disorders, including genetic disorders such as hemophilia.
Or in the treatment of injury caused by trauma, surgery or other causes.
Blood clots and other hemostasis. The protein of the present invention may be used to dissolve or form thrombus.
Growth inhibition and the symptoms resulting therefrom (eg, myocardial infarction and central nervous system blood)
It may be useful in the treatment and prevention of vascular infarcts (eg, stroke).
The activity of the protein of the invention may be measured, inter alia, by the following method:
Assays for hemostatic and thrombolytic activity
Linet et al. Clin. Pharmacol. 26: 131-140,1986; Burdick et al., Thromb
osis Res. 45: 413-419, 1987; Humphrey et al., Fibrinolysis 5: 71-79 (1991); S
chaub, Prostaglandins 35: 467-474, 1988.
Limited to
Absent.
Receptor / ligand activity
Further, the protein of the present invention may be a receptor, a receptor ligand or a receptor / ligand interaction.
May exhibit activity as inhibitors or agonists. Such receptors and
Examples of gand are cytokine receptors and their ligands, receptor kinases and
And their ligands, receptor phosphatases and their ligands, cells
Receptors involved in cell interactions and their ligands (cell adhesion molecules (SELEC
, Integrin and their ligands) and antigen presentation, antigens
Receptor / ligand pairs involved in the development of cognitive, cellular and humoral immune responses
Inclusive), but not limited to. Receptors and ligands are related receptors
Screening of potential peptide or small molecule inhibitors for body / ligand interactions
It is also useful for training. The protein of the present invention (receptor and ligand fragments
Include, but are not limited to, blocking the receptor / ligand interaction itself.
May be useful as a harmful agent.
The activity of the protein of the invention may be measured, inter alia, by the following method:
Suitable assays for receptor-ligand activity are described in Current Protocols in Immunolog.
y, Ed by J. E. Coligan, A.S. M. Kruisbeek, D.S. H. Margulies, E. M. Shevach
, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (C
hapter 7.28, Measurement of Cellular Adhesion under static conditions 7.
28.1-7.28.22), Takai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6864-6868, 19
87; Bierer et al., J. Amer. Exp. Med. 168: 1145-1156, 1988; Rosenstein et al., J
. Exp. Med. 169: 149-160 1989; Stoltenborg et al., J. Am. Immunol. Methods 175
: 59-68, 1994; Stitt et al., Cell 80: 661-670, 1995.
But not limited to these.
Anti-inflammatory activity
The protein of the present invention can exhibit anti-inflammatory activity. Anti-inflammatory activity is involved in the stimulus response
Fine
By stimulating cells, cell-cell interactions (eg, attachment)
Inhibit or promote the chemotaxis of cells involved in the inflammatory process
By inhibiting or promoting, by inhibiting or promoting cell extravasation,
Or stimulates the production of other factors that more directly inhibit or promote the inflammatory response or
Exhibited by suppressing. Inflammation symptoms (predominantly
Infections related to infections (including septic shock, sepsis,
Or systemic inflammatory response syndrome (SIRS)), ischemia-reperfusion injury, endo
Fatal injury from toxins, arthritis, hyperacute rejection mediated by complement, kidney
Inflammation, lung injury induced by cytokines or chemokines, inflammatory bowel disease
, Crohn's disease or overproduction of cytokines such as TNF or IL-1?
(Including but not limited to diseases resulting from them). The present invention
Proteins are used to treat anaphylaxis and hypersensitivity to antigenic substances or materials
Can also be useful.
Cadherin / tumor invasion inhibitory activity
Cadherin is a calcium-dependent adhesion molecule,
Plays a major role in determining specific cell types, in particular
I think that the. Loss or alteration of normal cadherin expression is associated with tumor growth and metastasis.
It can induce a change to the relevant cell adhesion properties. Cadherin dysfunction is vulgaris
Pemphigus and pemphigus foliaceus (autoimmune cutaneous blistering disease), Crohn's disease, and
It is also involved in other human diseases, such as some developmental abnormalities.
The cadherin superfamily contains over 40 members, each of which is distinct.
Expression patterns. All members of the superfamily
Have a common conserved extracellular repeat (cadherin domain), but
There are structural differences in other parts. Cadherin domain binds to calcium
Calcium is necessary for their attachment as they combine to form their tertiary structure.
You. Few amino acids in the first cadherin domain are due to homophilic attachment
Modification of this recognition site alters the specificity of cadherin as it provides the basis for
May not only recognize themselves, but also
Cadherin
Can be combined. In addition, some cadherins are heterologous to other cadaverins
It is also involved in affinity attachment.
E-cadherin, one of the members of the cadherin superfamily,
It is expressed in cell types. Pathologically, E-cadherin expression is
If lost, the malignant cells become invasive and the cancer metastasizes. E-cadhedrine
Transfection of a polynucleotide that expresses
Restores cell morphology, restores adherence to cells and to other substrates,
By reducing the rate of cell growth and dramatically reducing the growth of anchorage-dependent cells,
The changes associated with cancer were reversed. Thus, re-introducing E-cadhedrin expression
Returns the carcinoma to a less advanced stage. Other cadherins are also used in other tissue
It may have the same invasive inhibitory role in Ip-derived carcinomas. Soy sauce
, A protein of the present invention having cadherin activity, and a gene encoding such a protein
The bright polynucleotides can be used to treat cancer. Such protein or poly
Introducing nucleotides into cancer cells may provide normal cadherin expression.
Can reduce or eliminate the cancerous changes observed in these cells
.
Cancer cells are also known to express cadherin in a different tissue type than originally intended.
Therefore, these cancer cells can invade different tissues and metastasize. Mosquito
The protein of the present invention having doherin activity, and the polynucleotide of the present invention encoding such a protein
Nucleotide replaces cadherin, which is inappropriately expressed in these cells.
Restores normal cell adhesion properties and reduces or eliminates cell propensity to metastasize
sell.
Further, the protein of the present invention having cadherin activity, and encoding such a protein
Antibodies that recognize and bind to cadherin using the polynucleotides of the present invention
You can also get. Tumor cell cadherds inappropriately expressed using such antibodies
Can block cell adhesion and prevent cells from forming tumors elsewhere.
Wear. Such anti-cadhedrin antibodies can be used to evaluate cancer grade, pathological type, and prognosis.
Can be used as a marker for In other words, when the cancer progresses, cadherin
The expression is reduced and this cadherin expression can be
Can be detected.
A fragment of the protein of the present invention having cadherin activity, preferably cadherin
Of the present invention encoding such protein fragments
Use polynucleotides to bind to cadherin, producing undesirable effects
By blocking cadherin binding, it can also block cadherin function.
Wear. Furthermore, a fragment of the protein of the present invention having cadherin activity, preferably
Truncated soluble mosquitoes known to be stable in the circulatory system of cancer patients
Dohedrin fragments and polynucs encoding such protein fragments
Reotide can also be used to disrupt correct cell-cell attachment.
Assays for cadherin adhesion and entry inhibitory activity are described in Hortsch et al. J Bio
l Chem 270 (32): 18809-18817, 1995; Miyaki et al. Oncogene 11: 2547-2552, 19
95; Ozawa et al. Cell 63: 1033-1038, 1990.
Not limited to these.
Tumor inhibitory activity
In addition to the activities described above for immunological treatment or prevention of tumors, the protein of the present invention
Can exhibit antitumor activity. Certain proteins directly or indirectly affect tumor growth (eg,
(Via ADCC). Certain proteins are found in tumor or progenitor tissue
Act to inhibit the formation of tissue necessary to support tumor growth (eg, angiogenesis)
Other factors, agents or cell types that inhibit tumor growth
Factors, agents or agents that cause the production of tumors or promote tumor growth
Alternatively, tumor-inhibiting activity may be exhibited by removing or inhibiting cell types.
Other activities
The proteins of the present invention may exhibit one or more of the following additional activities or effects:
: Infections, including but not limited to bacteria, viruses, fungi and other parasites
Sex factor killing; height, weight, hair color, eye color, skin or other tissue pigmentation
Or the size or form of an organ or body part (eg, breast augmentation or vice versa)
Effects on body characteristics (suppression or promotion), including: fat, protein or charcoal consumed
Hydrate digestion
Effects; appetite, libido, stress, cognition (including cognitive disorders), depression (depressive disorders)
Impacts on behavioral characteristics, including (but not limited to) violent behavior;
Providing pain or other pain-relieving effects; of embryonic stem cells in non-hematopoietic lineages
Promotes differentiation and proliferation; hormonal or endocrine activity;
Treatment of positive and related disorders; Treatment of hyperproliferative disorders (eg, psoriasis);
An immunoglobulin-like activity (eg, the ability to bind antibodies or complement);
Such a protein acting as an antigen in a chin composition or cross-reacting with such a protein
Ability to generate an immune response to other substances or entities thatAdministration and dose
The protein of the invention (from any source, recombinant and non-recombinant)
Methods, including, but not limited to, those described above) with a pharmaceutically acceptable carrier.
They may be used together in a pharmaceutical composition. Such compositions comprise (in addition to the protein and carrier,
), Diluents, fillers, salts, buffers, stabilizers, solubilizers, and the like.
It may contain other substances well known in the above. The term "pharmaceutically acceptable"
A non-toxic substance that does not interfere with the effectiveness of the biological activity of the active ingredient. Characteristics of carrier
Sex depends on the route of administration. The pharmaceutical composition of the present invention comprises M-CSF, GM-CSF, T
NF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-
7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13,
IL-14, IL-15, IFN, TNF0, TNF1, TNF2, G-CSF
, Meg-CSF, thrombopoietin, stem cell factor, and erythropoietin
Contain cytokines, lymphokines, or other hematopoietic factors, such as
Good. The pharmaceutical composition further enhances the protein activity or its activity in therapy.
Or it may contain other agents that supplement its usefulness. Such additional factors and
A synergistic effect with the protein of the present invention by containing
Or minimize side effects. Conversely, certain cytokines
In the formulation of other hematopoietic, thrombolytic or antithrombotic, or anti-inflammatory drugs
By containing the protein of the present invention, cytokines, lymphokines, other hematopoietic factors, thrombolytics
Solution factor
Alternatively, the side effects of antithrombotic factors or anti-inflammatory agents may be minimized.
The protein of the present invention may be a multimer (for example, a heterodimer or a homodimer) or
It may be active by itself or in a complex with other proteins. As a result,
The pharmaceutical composition comprises such a multimeric or complexed form of the protein of the present invention.
You may.
The pharmaceutical composition of the present invention may be in the form of a complex of the protein of the present invention and a protein or peptide antigen.
It may be in a state. Protein and / or peptide antigens can be
It will deliver a stimulus signal to the lymphocytes. B lymphocytes have their surface immunity
Will respond to antigen through globulin receptors. T lymphocytes are MHC proteins
Will respond to the antigen through the T cell receptor (TCR).
MHC and host cell class I and class II MHC genes
Structurally related proteins, including those that have been loaded, are peptide-antigens against T lymphocytes.
It will help to present the original. The antigen component was a purified MHC-peptide complex only.
Or with co-stimulatory molecules that can send signals directly to T cells
Can be done. Alternatively, surface immunoglobulins on B cells and T cells on T cells
Antibodies that can bind CR and other molecules can also be mixed with the pharmaceutical compositions of the present invention.
Wear.
The pharmaceutical composition of the present invention may be in the form of liposome, in which the protein of the present invention is contained.
And other pharmaceutically acceptable carriers, amphipathic agents such as lipids (mice in aqueous solution).
Agglomerate form, such as insoluble monolayer, liquid crystal or lamellar layer)
Have been combined. Suitable lipids for liposome formulations are monoglycerides, diglycerides
, Sulfatizide, lysolecithin, phospholipids, saponins, bile acids, etc.
However, it is not limited to these. The preparation of such liposome formulations is within the level of ordinary skill in the art.
And, for example, U.S. Pat. Nos. 4,235,871, 4501728, 4837028,
And 4737323, all of which are described herein by reference.
Is considered).
As used herein, the term "therapeutically effective amount" refers to a significant patient benefit, e.g.,
Sufficient pharmaceutical composition or method to show improvement in symptoms of the condition, healing, increased rate of healing
It means the total amount of each active ingredient. Used for individual active ingredients administered alone
If
The term refers only to the component. When used in a combination of active ingredients,
Or, it refers to the total amount of active ingredients that produce a therapeutic effect regardless of simultaneous administration.
In practicing the treatment method of the present invention, a disease to be treated with a therapeutically effective amount of the protein of the present invention.
Administered to a mammal having a morphology. According to the method of the present invention, alone or with a cytokine
The protein of the invention together with other therapeutic agents such as lymphokines or other hematopoietic factors.
It may be administered. One or more cytokines, lymphokines or other
When co-administered with hematopoietic factors, the protein of the present invention may be administered with cytokines, lymphokines, and other
It may be administered simultaneously or sequentially with blood, thrombolytic or antithrombotic factors. Gradually
When administering the next dose, the attending physician will ask for cytokines, lymphokines, other hematopoietic factors, blood
Appropriate administration of thrombolytic factor or antithrombotic factor in combination with the protein of the present invention
Will determine the order.
The administration of the protein of the present invention in the pharmaceutical composition of the present invention or used in the practice of the present invention can be carried out by various conventional methods.
Administration methods, e.g., oral feeding, inhalation, or intradermal, subcutaneous, or intravenous injection.
I can. Intravenous injection into a patient is preferred.
When a therapeutically effective amount of the protein of the present invention is orally administered, the protein of the present invention may be in the form of a tablet or capsule.
, Powder, solution or elixir form. When administered in tablet form,
The pharmaceutical composition may further comprise a solid carrier such as gelatin or an adjuvant.
May be. Tablets, capsules, and powders contain about 5 to 95% of a protein of the present invention,
It preferably contains about 25-90% of the protein of the invention. Place to administer in liquid form
Oil, water, petroleum, oils of animal or vegetable origin, such as peanut oil, mineral oil
, Soybean oil, sesame oil, or synthetic fats and oils may be added. Pharmaceutical group in liquid form
The composition can be a saline solution, dextrose or other saccharide solution, or glycol
(Eg, ethylene glycol, propylene glycol or polyethylene glycol)
Recall). Pharmaceutical compositions when administered in liquid form
Is about 0.5 to 90% by weight of the protein of the present invention, preferably about 1 to 50%
Contains invention proteins.
When a therapeutically effective amount of the protein of the present invention is administered by intravenous, intradermal or subcutaneous injection,
The protein of the present invention may be in the form of a pyrogen-free, parenterally acceptable aqueous solution
. Of such a parenterally acceptable protein solution having the appropriate pH, isotonicity, and stability.
The preparation is
It is within the purview of those skilled in the art. Preferred pharmaceutical compositions for intravenous, intradermal, or subcutaneous injection are
, In addition to the protein of the present invention, sodium chloride for injection, Ringer's solution, dext for injection
Loose, dextrose and sodium chloride solution for injection, lactate-containing phosphorus for injection
It should contain a gel solution, or other carrier known in the art. The present invention
Pharmaceutical compositions may contain stabilizers, preservatives, buffers, antioxidants, or
Other additives may be included.
The amount of the protein of the invention in the pharmaceutical composition of the invention depends on the nature and severity of the condition to be treated,
As well as the nature of the treatment the patient has already received. Ultimately, your doctor
Each patient will determine the amount of the protein of the invention to be treated. First, the doctor in charge
Administer an amount of the protein of the invention and observe the patient's response. Until optimal therapeutic effects are obtained
Higher doses of the protein of the present invention may be administered and may be used once optimal therapeutic effect is obtained.
Do not increase the volume further. Various pharmaceutical compositions for performing the methods of the present invention include
About 0.01 μg to about 100 mg of the protein of the present invention (preferably,
About 0.1 μg to about 10 mg / kg body weight, more preferably 1 kg / kg body weight
0.1 to about 1 mg of the protein of the present invention.
The duration of treatment by intravenous administration using the composition of the present invention depends on the severity of the disease to be treated.
And will vary depending on the condition and response of each patient. Each of the proteins of the present invention
The duration of application will range from 12 to 24 hours for continuous intravenous administration
. Ultimately, the attending physician will determine the stage of treatment by intravenous administration using the pharmaceutical composition of the present invention.
Will decide between.
Immunizing an animal with the protein of the present invention to specifically react with the protein of the present invention;
And monoclonal antibodies may be obtained. Whole protein or its fragment
Such antibodies may be obtained using immunoglobulin as an immunogen. Carboxy peptide immunogen
It may further contain a cysteine residue at the end, and can be used for keyhole rimpet hemoglobin.
Binds to haptens such as cyanine (KLH). Those who synthesize such peptides
The method is known in the art and is described, for example, in R. P. Merrifield, J .; Amer. Che
m. Soc. 85, 2149-2154 (1963); L. Krstenansky, et. al., FEBS Lett. 211
, 10 (1987). Monoclonal antibodies that bind to the protein of the present invention
The body is
It can be a useful diagnostic for immunodetection of white. Neutralizing antibodies that bind to the protein of the present invention,
It may be useful as a therapeutic agent for a symptom related to the protein of the present invention.
Cure of certain tumors in the treatment of some forms of cancer involving abnormal expression of
May be useful in therapy. In the case of cancer cells or white blood cells,
Neutralizing monoclonal antibody is a metastatic spread of cancer cells that can be mediated by the protein of the present invention.
May be useful for the detection and prevention of
For compositions of the invention useful for regenerating bone, cartilage, tendons or ligaments, the method of treatment comprises:
The composition can be administered locally, systemically, or locally as an implant or device.
Administration. When administered, the therapeutic composition used in the present invention comprises
Of course, it is a pyrogen-free, physiologically acceptable form. In addition,
Alternatively, the composition may be encapsulated or injected as a viscous form to provide bone, cartilage or
May be delivered to the site of tissue damage. Local administration is suitable for wound healing and tissue repair
I do. Therapeutically useful action other than the protein of the present invention which may be contained in the above composition
The agent is, alternatively or additionally, administered simultaneously or sequentially with the composition in the method of the present invention.
May be. Preferably, for bone and / or cartilage formation, the composition comprises
Delivering the white-containing composition to the site of bone and / or cartilage damage, and developing the bone and cartilage;
Provides a structure for living, and optimally contains a matrix that can be absorbed into the body
Will have. Such matrices are currently used for other implanted medical devices
It may be made from the materials that have been used.
The choice of matrix material depends on its biocompatibility, biodegradability, mechanical properties, cosmetic
Based on appearance and interface properties. The appropriate formulation will be determined by the particular application of the composition.
U. Possible matrices for the composition are biodegradable, chemically known sulfuric acid
Lucium, tricalcium phosphate, hydroxyapatite, polylactic acid, polyglyco
It may be oleic acid and polyanhydride. Other available materials are biodegradable,
Well-known in nature, for example, bone or skin collagen. further
The matrix may contain pure proteins or extracellular matrix components.
Other possible matrices include sintered hydroxyapatite, bioglass, aluminum
Not biodegradable, such as silicates or other ceramics,
It is. Matri
Mixtures are a combination of the above types of materials, such as polylactic acid and hydroxyapata.
It may contain light or collagen and tricalcium phosphate. Bio
Ceramics in a composition such as calcium-aluminate-phosphate
The pore size, particle size, particle shape and yield
The resolution may be changed.
Lactic acid in the form of porous particles having a diameter in the range of 150 to 800 microns and
A 50:50 (molar weight) copolymer of biglycolic acid is presently preferred.
. In some applications, carboxymethylcellulose or autologous
Prevent the dissociation of the protein composition from the matrix using a sequestering agent such as a clot
And would be useful.
Preferred families of sequestrants are methylcellulose, ethylcellulose,
Roxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl
Alkyl cells containing methylcellulose and carboxymethylcellulose
Cellulosic materials such as loin (including hydroxyalkylcellulose)
Most preferred is a cationic salt of carboxymethylcellulose (CMC).
Other preferred sequestering agents are hyaluronic acid, sodium alginate, poly (ethylene
Glycol), polyoxyethylene oxide, carboxyvinyl polymer and
Poly (vinyl alcohol). The amount of sequestrant useful in the present invention depends on the total formulation weight.
0.5 to 20% by weight, preferably 1 to 10% by weight, based on the amount,
Prevents protein desorption from the polymer matrix and allows for proper handling of the composition
The amount of progenitor cells that infiltrate the matrix
To give the protein a chance to promote the osteogenic activity of cells, not much
Not to be.
In a further composition, the protein of the present invention comprises a bone and / or cartilage defect, wound,
Alternatively, it may be mixed with other agents that are beneficial in treating the tissue. These agents are
, Epidermal growth factor (EGF), platelet-derived growth factor (PDGF), transformed growth factor
(TGF-α and TGF-β) and insulin-like growth factor (IGF)
Include.
At present, the therapeutic compositions are also valuable for veterinary use. For details,
In addition to humans, livestock and thoroughbred horses are treated with the protein of the present invention.
Hope
Good patient.
Rules of administration of protein-containing pharmaceutical compositions used for tissue regeneration alter the effect of proteins
Factors, such as tissue weight, damage site, and damage desired to be formed.
The condition of the tissue received, the size of the wound, the type of tissue required (eg, bone), the patient's year
Consider age, gender and diet, severity of infection, duration of administration, and other clinical factors
And your doctor will decide. The dose depends on the type of matrix used for reconstitution.
And depending on the content of other proteins in the pharmaceutical composition. For example, IGF
Addition of other known growth factors, such as I (insulin-like growth factor I) to the final composition
Addition can also affect dosage. Tissue / bone growth and / or repair,
By regular assessment by morphological survey and tetracycline labeling
The progress can be monitored.
The polynucleotide of the present invention can also be used for gene therapy. Such polynuks
Leotide is introduced into cells in vivo or ex vivo and expressed in a mammalian subject.
Can be made. Other known methods for introducing nucleic acids into cells or organisms
The polynucleotide of the present invention may be administered more (in a viral vector,
Or in the form of naked DNA, but is not limited thereto).
Culturing and growing the cells ex vivo in the presence of the protein of the invention, or
Produce the desired effect on such cells or produce the desired activity in such cells.
May be. The treated cells are then introduced in vivo for therapeutic purposes.
can do.
The patents and publications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.
It is assumed that
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
A61P 19/00 A61P 19/10
19/04 21/04
19/10 25/16
21/04 25/28
25/16 29/00
25/28 35/00
29/00 C07K 14/47
35/00 C12N 15/00 ZNAA
C07K 14/47 5/00 C
C12N 5/10 A61K 37/24
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(GH,GM,KE,LS,M
W,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY
,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL,AM
,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,
CA,CH,CN,CU,CZ,DE,DK,EE,E
S,FI,GB,GE,GH,GM,GW,HU,ID
,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,
LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MD,M
G,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT
,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL,
TJ,TM,TR,TT,UA,UG,UZ,VN,Y
U,ZW
(72)発明者 ラバリー,エドワード・アール
アメリカ合衆国01876マサチューセッツ州
トゥークスベリー、グリーン・メドー・ド
ライブ90番
(72)発明者 レイシー,リサ・エイ
アメリカ合衆国01720マサチューセッツ州
アクトン、スクール・ストリート124番
(72)発明者 マーバーグ,デイビッド
アメリカ合衆国01720マサチューセッツ州
アクトン、オーチャード・ドライブ2番
(72)発明者 トレーシー,モーリス
アメリカ合衆国02167マサチューセッツ州
チェスナット・ヒル、ウォルコット・ロー
ド93番
(72)発明者 スパルディング,ビッキー
アメリカ合衆国01821マサチューセッツ州
ビラリカ、メドーバンク・ロード11番
(72)発明者 アゴスティノ,マイケル・ジェイ
アメリカ合衆国01810マサチューセッツ州
アンドーバー、ウォルコット・アベニュー
26番──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 19/00 A61P 19/10 19/04 21/04 19/10 25/16 21/04 25/28 25 / 16 29/00 25/28 35/00 29/00 C07K 14/47 35/00 C12N 15/00 ZNAA C07K 14/47 5/00 C C12N 5/10 A61K 37/24 (81) Designated country EP (AT , BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA , GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT , AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, GM, GW, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT , RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, UZ, VN, YU, ZW. Lacey, Lisa A, United States 01720 School Street 124, Acton, Massachusetts United States 01720 (72) Inventor Marberg, David Ame, Green Meadow Drive 90 (72), Tooksbury, USA United States 01720 Acton, MA Orchard Drive No. 2 (72) Inventor Tracy, Maurice United States 02167 Chesnut Hill, Walt. Meadowbank Road No. 11 (72) Inventor Augustino, Michael Jay No. 26, Walcott Avenue, Andover, Mass. 18018 USA