JP2001512973A

JP2001512973A - Improved assay for β-amyloid processing

Info

Publication number: JP2001512973A
Application number: JP53664798A
Authority: JP
Inventors: コーデル，バーバラ; スカーディナ，ジャン・メアリアン; ミシャク，ロナルド・ピー; ハギンス，ジョン; プリュス，レベッカ; ラウトマン，ギー
Original assignee: Scios LLC
Current assignee: Scios LLC
Priority date: 1997-02-24
Filing date: 1998-02-03
Publication date: 2001-08-28
Also published as: AU6260098A; EP0973923A1; WO1998037215A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、β−アミロイドプロセシング経路のインヒビターの同定に有用な真核細胞系の設計、構築および使用に関する。特に、本発明は、4.2kDaβ−アミロイドタンパク質を同定または定量し得るイン・ビトロ分析に関する。本発明は、更にβ−アミロイドプロセシング経路のインヒビターの同定に有用な真核細胞系の設計、構築および使用のためのDNAおよびタンパク質分子を提供する。 SUMMARY The present invention relates to the design, construction and use of eukaryotic cell lines useful for identifying inhibitors of the β-amyloid processing pathway. In particular, the invention relates to an in vitro assay that can identify or quantify a 4.2 kDa β-amyloid protein. The present invention further provides DNA and protein molecules for the design, construction and use of eukaryotic cell lines useful for identifying inhibitors of the β-amyloid processing pathway.

Description

【発明の詳細な説明】 β−アミロイドのプロセシングの改良されたアッセイ発明の分野本発明は、β−アミロイドのプロセシングインヒビターの同定に有用な真核細胞系の設計、構築、使用に関する。特に、本発明は4.2kDaβ−アミロイドタンパク質を同定または定量することのできるインビトロアッセイに関する。本発明はまた、β−アミロイドのプロセシングインヒビターの同定に有用な真核細胞系およびインビトロアッセイの設計、構築および使用のためのDNAおよびタンパク質分子を提供する。関連出願の参考文献本出願は、1997年２月24日にされた、名称“β−アミロイドのプロセシングの改良されたアッセイ”の米国特許出願第08／804,971号についての1997年４月２日にされた一部継続出願である、名称“β−アミロイドのプロセシングの改良されたアッセイ”の出願の一部継続出願である。また、本出願は、1997年２月24日にされた米国特許出願第08／804,971号、名称“β−アミロイドのプロセシングの改良されたアッセイ”の一部継続出願でもある。発明の背景アルツハイマー病は重大な健康問題になっている。米国の人口の５％以上、および米国の85歳以上の人口の15％以上が、何らかのアルツハイマー病に悩まされていると見積もられている(Cross，Eur．J．Pharmacol．82：77-80(1982)；Terr y，et al.，Ann．Neurol．14：497-506(1983))。現在、この病気の進行を遅らせることも、本当に効果的な医薬の介入もしくはこの病気を診断する方法もない（ Schehr，Bio／Technology 12：140-144(1994)；Cordell，Ann．Rev．Pharmacol ．Toxicol．34：69-89(1994)，引用することで援用する）。アルツハイマー病の患者は、次第に精神的および肉体的不能になっていく。アルツハイマー病の特徴は、患者におけるβ−アミロイド斑の形成または沈着である。成熟β−アミロイド斑は、神経作用の縮退にしばしば付随する。β−アミロイド沈着は、アルツハイマー病に冒されている人だけに付随するものではなく、他のアミロイドーシス、例えば脳障害またはダウン症に冒されている人にも付随する（Cordell，Ann．Rev．Pharmacol．Toxicol．34：69-89(1994)；Pierce et al.，Journal of Neuroscience，16:1083-1090(1996)；Roberts，Lancet 33 8：1422-1423(1991)；Motte and Williams，Acta Neuropathol 77：535-546(198 9)；Mann and Esiri，Journal of the Neurological Sciences 89：169-179(198 9)；Masters，Proc．Natl．Acad．Sci.，82：4245-4249(1985)）。神経炎患者の斑から単離されたβ−アミロイドタンパク質は、4.2kDaβ−アミロイドタンパク質と命名された自己凝集成分、または以下のいずれかのように命名されたもの：Ａ４タンパク質(Ponte et al.，Nature 311：525-527(1988)，引用することで援用する)、β−アミロイドペプチド(Schehr，Bio／Technology 12 ：140-144(1994)，引用することで援用する)、4.2kDaβ−アミロイドポリペプチド(Neve et al.，Neuron 1：669-677(1988)，引用することで援用する)、４ＫペプチドまたはＡβ(Haass et al.，Nature 359：322-325(1992)，引用することで援用する)、アミロイドＢ−タンパク質またはアミロイドＡ４（Tanzi et al.，N ature 331：528-530(1988)，引用することで援用する）、４kDアミロイドβタンパク質、βＡＰまたは４kDタンパク質（Shoji et al.，Science 258：126-129(1 992)，引用することで援用する）、4.2〜4.5kdアミロイドタンパク質サブユニット(Wolf et al.，EMBO 9.7：2079-2084(1990)，引用することで援用する)、βタンパク質(Weidmann et al.，Cell 57：115-126(1989))、β−アミロイドコアタンパク質（Cordell，米国特許第5,221,607号，引用することで援用する）、各々Ａβ１−39ペプチド、Ａβ１−40ペプチド、Ａβ１−41ペプチド、Ａβ１−42ペプチドとされるペプチド組成物（Glenner and Wong，Biochem．B iophys．Res．Comm．120：885-890(1984)に記載、引用することで援用する）、( Schehr，Nature Biotechnology 15：19-20(1997)，引用することで援用する)、およびＡβ１−43ペプチド（Shoji et al.，Science 258：126-129(1992)；Selk oe，Science 275：630-631(1997)，引用することで援用する）である。Ａβ１− 39ペプチド、Ａβ１−40ペプチド、Ａβ１−41ペプチド、Ａβ１−42ペプチド、Ａβ１−43ペプチドはそれぞれ39、40、41、42、43アミノ酸を含む。 4.2kDaβ−アミロイドタンパク質をコードするcDNAの特性付けは、4.2kDaβ− アミロイドタンパク質がより大きな前駆体タンパク質、つまりβ−アミロイド前駆体タンパク質（APP）の一部として転写されるということを示している(Lemair e et al.，Nucleic Acid Research 17：517-22(1989))。３個の主要なAPPタンパク質のアイソフォーム、APP₆₉₅、APP₇₅₁およびAPP₇₇₀が特性付けされている（Co rdell，Ann．Rev．Pharmacol．Toxicol．34：69-89(1994)）。アイソフォームAP P₆₉₅、APP₇₅₁およびAPP₇₇₀はそれぞれ、695、751および770のアミノ酸からなる（Weidmann et al.，Cell 57：115-126(1989)，引用することで援用する）。これらのアイソフォームは最初のAPP RNA転写産物からのスプライシングの違いによる。APP₆₉₅アイソフォームは、Kunitz型プロテイナーゼインヒビタードメインを含まないという点で、より長いアイソフォームとは異なる(Lemaire et al.，N ucleic Acids Research 172：517-522(1989)，引用することで援用する)；Mulla n，米国特許第5,455,169号，引用することで援用する）；Ponte et al.，Nature 331：525-527(1988)，引用することで援用する）。APP₆₉₅アイソフォームに対応するmRNAは、脳で優先的に発現していることが示されているという点でもより長いアイソフォームとは異なる（Neve et al .，Neuron 1：669-677(1988)）。いくつかのAPPの突然変異が報告されている（Ashall and Goate，Trends in B iochemical Sciences，19：42-46(1994)，引用することで援用する）；Hardy an d Allsop，Trends in Pharmalogical Sciences，12：383-388(1991)，引用することで援用する）。特性付けされたAPP変異体の例は、“スウェーデンFAD二重突然変異体”（Mullan et al.，Nature Genetics 1:345-347(1992)，引用することで援用する）；“ロンドン突然変異体”（Van Broeckhoven，et al.，Science 2 48：1120-1123(1990)，引用することで援用する）；Levy，Science 24：1124-11 26(1990)，引用することで援用する）；バリン⁷¹⁷→イソロイシン突然変異体（G oate et al.，Nature 349：704-706(1991)，引用することで援用する）；Hardy et al.，Lancet 337：1342-1343(1991)，引用することで援用する）；バリン⁷¹⁷ →グリシン突然変異体（Harlan et al.，Nature 353：844-846(1991)）；バリン⁷¹⁷ →フェニルアラニン突然変異体（Murrell et al.，Science 254：97-99(1991 )，引用することで援用する）を包含する。それぞれのAPPアイソフォームにおいて、4.2kDaβ−アミロイドタンパク質はA PPアイソフォームのカルボキシル末端から99残基から始まる内部領域に相当する（Shoji et al.，Science 258：126-129(1992)）。APPプロセシングの二つの主要経路が報告されている（Higaki et al.，Neuron 14：651-659（1995）参照，引用することで援用する）。一つ目の経路は、タンパク分解によるトランケートされた８〜12kDaのカルボキシル末端断片の形成をもたらす(Caporaso et al.，P roc．Natl．Acad．Sci．USA 89：2252-2256(1992)，引用することで援用する)。８〜12kDaカルボキシル末端断片は非アミロイドジェニックであると報告されている（Seubert et al.，Natu re 361：260-263(1993)，引用することで援用する）。この経路におけるAPPのタンパク分解プロセシングは、様々な細胞内および細胞膜で起こることが示唆されている(Higaki et al.，Neuron 14：651-659(1995))。８〜12kDaカルボキシル末端断片は、おそらく８〜12kDaカルボキシル末端断片内の細胞膜貫通によって細胞に結合したままであると報告されている(Cordell，Ann．Rev．Pharmacol．Tox icol．34：69-89(1994))。第２のプロセシング経路は、エンドソーム／リソソーム系と関連し、4.2kDaβ−アミロイドタンパク質の産生はこの経路のためであると報告されている（Higaki et al.，Neuron 14：651-659（1995）参照）。 4.2kDaβ−アミロイドタンパク質を生産することのできる細胞系が報告されている(Naidu et al.，Journal of Biological Chemistry 270：1369-1374(1995) ，引用することで援用する；Higaki et al.，Neuron 14：651-669(1995)，引用することで援用する)。NaiduらとHigakiらは、β−アクチンプロモーターにより β−アミロイド前駆体タンパク質の695アミノ酸アイソフォームをコードするヒトcDNAをチャイニーズハムスター卵巣繊維芽細胞に安定的にトランスフェクションすることによって、CP-6細胞系を確立したと報告している。Busciglioらは、C OS細胞系（SV40初期プロモーターの一部を含むサル細胞系）を、サイトメガロウィルスプロモーター制御下の発現プラスミドを一過性トランスフェクションし、 β−アミロイド前駆体タンパク質の695アミノ酸アイソフォームを過剰発現させたと報告している（Busciglio et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．90：2092-2096 (1993)，引用することで援用する）。さらにHaassらは、肝臓細胞系を安定的にトランスフェクションして、β−アミロイド前駆体タンパク質の695アミノ酸アイソフォームを過剰発現させたと報告している（Haass et al. ，Nature 359：322-325(1992)）。 Cordellらは、米国特許第5,221,607号において、チャイニーズハムスター細胞に２個の異なるタンパク質を安定発現させることを報告している。これらのタンパク質は、それぞれ99アミノ酸のアミロイドタンパク質およびβ−アミロイドコアタンパク質に相当する、99および42アミノ酸である。どちらの場合も、β−アクチンプロモーターを用いることによりタンパク質発現が促進された。また、どちらの場合も、選択可能なマーカー（バクテリアネオマイシン遺伝子）は第２の異なるプロモーター（SV40初期プロモーター）に遺伝子的に連結されていた。 β−アミロイド前駆体タンパク質の695アミノ酸アイソフォームをコードするヒトcDNAを用いてトランスフェクションした細胞系は、β−アミロイドプロセシング経路の推定のインヒビターをスクリーニングするのに使われている（Higaki et al.，Neuron 14：651-669(1995)）。Higakiらは、10cmディッシュで実施した阻害アッセイを報告している(Higaki et al.，Neuron 14：651-669(1995))。阻害アッセイにおいて、Higakiらが使ったCP-6細胞は、インヒビター200μl、ロイペプチン200μl、E64200μl、クロロキン100μlを補充した成長培養液と、30m M NH₄Cl、30mM NH₄−アセテート、30mMメチルアミン、10μMモネンシン(monesin )、10μMブレフェルジンＡの１：１の混合液を含む10cmディッシュで増殖させたものである（Higaki et al.，Neuron 14：651-669(1995)）。別の阻害アッセイにおいて、特許出願PCT／US93／01014（引用することで援用する）はAPP₇₅₁アイソフォームをコードするcDNAを含むベクターで安定的にトランスフェクションしたヒト初期胚細胞系を記載する。このトランスフェクションした細胞系は、22kDaの前アミロイド中間体の潜在的インヒビターをスクリーニングするのに使われた。 4.2kDaβ−アミロイドタンパク質の中に位置するエピトープに特異的な抗体または抗血清が報告されている(Ponte and Cordell，米国特許第5,220,013号，引用することで援用する；Majocha et al.，米国特許第5,231,000号；アミロイド β抗体cat．nos．0490-1916，0490-1858，0490-1857，ANAWA Biomedical Servic es & Products，Wangen Switzerland；マウスモノクローナル抗−β−アミロイドペプチド(1-28)，Zymed Laboratories，South San Francisco，California；マウス抗−βアミロイドモノクローナルcat no．RDI-BAMYLOID，Research Diagn ostics，Inc．Flanders，New Jersey)。例えば、Naiduらは4.2kDaβ−アミロイドタンパク質のカルボキシル末端に位置するエピトープに反応する抗血清を報告し、Busciglioらは4.2kDaβ−アミロイドタンパク質の短いペプチド領域(28−30 アミノ酸)に対する抗体を含む血清を報告している(Naidu et al.，Journal of B iological Chemistry 270：1369-1374(1995)；およびBusciglio et al.，Proc． Natl．Acad．Sci．90：2092-2096(1993))。また、4.2kDaβ−アミロイドタンパク質に位置するエピトープに反応するモノクローナル抗体が報告されている(Haa ss et al.，Nature 359：322-325(1992))。Haassらは、4.2kDaβ−アミロイドタンパク質の短いペプチド領域（アミノ酸１〜16）に含まれるエピトープに反応するモノクローナル抗体、6C6、および4.2kDaβ−アミロイドタンパク質の短いペプチド領域に含まれる異なるエピトープに反応するモノクローナル抗体、266、を報告している（Haass et al.，Nature 359：322-325(1992)）。さらに、特許出願PCT／US93／01014には、APP₇₅₁アイソフォーム中に見出される様々な領域に対する多数の抗体が記載されている。 CP-6（Naidu et al.，Journal of Biological Chemistry 270：1369- 1374(1995)；およびHigaki et al.，Neuron 14：651-669(1995)）のような細胞系に関する重要な問題は、このような細胞系により産生される4.2kDaβ−アミロイドタンパク質のレベルが自動化測定に必要な量よりも低いということである。 CP-6などの細胞系における発現レベルが不十分なために、正確かつ日常の測定に必要な細胞の容量は、日常の高処理能スクリーニングには適さない。本発明は、高処理能スクリーニングに十分なレベルでAPPタンパク質を発現する細胞系を提供する。インヒビターの高処理能スクリーニングは、典型的には約 250μlの容量で細胞を含むことのできる96穴マイクロタイターディッシュを用いて行われる。96穴マイクロタイタープレートの容量と表面積には制限があるので、高レベルで所望のタンパク質を発現できる細胞系は高く評価される。発明の要旨本発明はβ−アミロイドのプロセシングインヒビターの同定に有用な真核細胞系の設計、構築および使用に関する。より特定的には、本発明は4.2kDaβ−アミロイドタンパク質を同定または定量し得るインビトロアッセイに関する。本発明はまた、β−アミロイドプロセシングのインヒビターの同定に有用な真核細胞系およびインビトロアッセイの設計、構築および使用のためのDNAおよびタンパク質分子を提供する。本発明の対象は、外来性遺伝子構造体を有する真核細胞系であり、この外来性遺伝子構造体は、サイトメガロウィルスプロモーターをコードする配列、強力リボゾーム結合部位をコードする配列、β−アミロイド前駆体タンパク質をコードする配列、選択可能なマーカーをコードする配列、およびポリアデニル化シグナルをコードする配列からなる。本発明の他の対象は、21-N-1、21-N-2、21-N-3、21-N-4、21-N-5、 21-N-6、21-N-7、21-N-8および21-N-9またはその誘導体よりなる群から選択される真核細胞系である。本発明の別の対象は、タンパク質mg当たり30ng以上の4.2kDaβ−アミロイドタンパク質分子を産生することができる真核細胞系である。本発明の別の対象は、CP-7細胞系より多い量の4.2kDaβ−アミロイドタンパク質分子を産生する真核細胞系である。本発明の別の対象は、CP-6細胞系より多い量の4.2kDaβ−アミロイドタンパク質分子を産生する真核細胞系である。本発明の別の対象は、CP-7細胞系より多い量のＡβ１−40ペプチド分子を産生する真核細胞系である。本発明の別の対象は、CP-7細胞系より多い量のＡβ１−42ペプチド分子を産生する真核細胞系である。本発明の別の対象は、外来性遺伝子構造体を有する真核細胞系であり、外来性遺伝子構造体はサイトメガロウィルスプロモーターをコードする配列、リボゾーム結合部位をコードする配列、β−アミロイド前駆体タンパク質をコードする配列、選択可能なマーカーをコードする配列およびポリアデニル化シグナルをコードする配列からなる。本発明の別の対象は、順に、サイトメガロウィルスプロモーター、リボゾーム結合部位、β−アミロイド前駆体タンパク質分子、選択可能なマーカーおよびポリアデニル化シグナルをコードする実質的に精製された核酸分子である。本発明のさらなる対象は、順に、サイトメガロウィルスプロモーター、強力リボゾーム結合部位、β−アミロイド前駆体タンパク質分子、選択可能なマーカーおよびポリアデニル化シグナルをコードする実質的に精製された核酸分子である。本発明の別の対象は、サイトメガロウィルスプロモーターをコードする配列、強力リボゾーム結合部位をコードする配列、β−アミロイド前駆体タンパク質をコードする配列、選択可能なマーカーをコードする配列およびポリアデニル化シグナルをコードする配列からなる外来性遺伝子構造体を有する真核細胞系にインヒビターを投与し、β−アミロイドのプロセシング経路の阻害を表示するタンパク質分子を定量することからなる、β−アミロイドのプロセシング経路インヒビターを同定する方法である。本発明の他の対象は、（ａ）β−アミロイドプロセシングのインヒビターとβ −アミロイドプロセシング経路の阻害を表示するタンパク質分子を産生する真核細胞系を、標識アミノ酸を含む培地中においてインキュベートし、真核細胞系は β−アミロイド前駆体タンパク質分子を安定的に発現する外来性遺伝子構造体を有し、外来性遺伝子構造体はサイトメガロウィルスプロモーターをコードする配列、強力リボゾーム結合部位をコードする配列、β−アミロイド前駆体タンパク質をコードする配列、選択可能なマーカーをコードする配列およびポリアデニル化シグナルをコードする配列からなり、（ｂ）真核細胞系と培養液を分離し、（ｃ）真核細胞系と培養液からタンパク質分子を分離し、そして（ｄ）タンパク質分子を定量することからなるβ−アミロイドプロセシング経路のインヒビターを同定する方法である。更に本発明の対象は、（ａ）β−アミロイドプロセシングインヒビターとβ− アミロイドプロセシング経路の阻害を表示するタンパク質分子を産生する真核細胞系をインキュベートし、真核細胞系は外来性遺伝子構造体を有し、外来性遺伝子構造体はサイトメガロウィルスプロモーターをコードする配列、強いリボゾーム結合部位をコードする配列、β−アミロイド前駆体タンパク質をコードする配列、選択可能なマーカーをコードする配列およびポリアデニル化シグナルをコードする配列からなり、そして(ｂ) インキュベーション工程によって産生されたタンパク質分子を定量することからなる、β−アミロイドプロセシングのインヒビターを同定する高処理能アッセイである。図面の簡単な記述図１は、選択されたプラスミドのサイトメガロウィルスプロモーター由来の極初期遺伝子転写エンハンサー／プロモーターおよびSV40ウィルス由来ポリアデニル化シグナル間の領域を図示する。図２は、pCMV-IRES-βAPP695の構築方法を図示する。図３は、RIAを用いた典型的な標準曲線を示す。図４は、APP産物の予期されるパターンを示す（SEQ ID NO：1）。図５は、抗体BA＃1、108.1、1702.1、1101.1により認識されるエピトープを図示する（SEQ ID NO：2）。図６は、全4.2kDaβ−アミロイドタンパク質の競合ELISA法、Ａβ１−40ペプチドのサンドイッチELISA法およびＡβ１−42ペプチドのサンドイッチELISA法の標準曲線を表す。図７は、21-N-3（N3）および21-N-9（N9）細胞系における4.2kDaβ−アミロイドタンパク質の安定性を示す。図８は、21-N-9細胞による4.2kDaβ−アミロイドタンパク質産生におけるインヒビター化合物の効果を示す。発明の詳述Ｉ．発明の概要本発明はβ−アミロイドプロセシングのインヒビターの同定に有用な真核細胞系の設計、構築および使用に関する。より特定的には、本発明は、4.2kDaのβ− アミロイドタンパク質を同定または定量し得るインビトロアッセイに関する。本発明はまた、β−アミロイドプロセシングのインヒビターの同定に有用な真核細胞系およびインビトロアッセイの設計、構築および使用のためのDNAおよびタンパク質分子を提供する。 II．薬剤および定義ここで用いる薬剤は、天然に生じた分子か、またはさもなくば、所望する場合、“実質的に精製された”分子であり、これは、除去されたかまたは通常より低濃度で存在する分子を含有する、天然に生じた調剤中に存在するかまたは存在するであろう一つまたはそれ以上の分子である。本発明の薬剤は、その構造的特性について、核酸が別の核酸分子とハイブリダイズし得るかまたはタンパク質が抗体により結合され得る（または結合に関して別の分子と競合する）ような“生物学的に活性”であるのが好ましい。また、そのような特性は、触媒作用的であり、故に化学反応や応答を媒介する薬剤の能力を包含する。本発明の薬剤は、細胞系、核酸分子、タンパク質および有機分子からなる。ここで用いる、用語“4.2kDaβ−アミロイドタンパク質”は、制限されることなく、以下のすべてを示す：Ａ４タンパク質、β−アミロイドペプチド、4.2kDa β−アミロイドポリペプチド、４ＫペプチドもしくはＡβ、アミロイドＢ−タンパク質、アミロイドＡ４、４ｋDのアミロイドβ−タンパク質、βＡＰ、４kDタンパク質、4.2〜4.5kdアミロイドタンパク質サブユニット、βタンパク質、β− アミロイドコアタンパク質。さらに、ここで用いる用語は、Wongら(Wong et al. ，Proc．Nat．Acad．Sci．82：8729-8732(1985)，引用することで援用する)、およびMasterら（Master et al.，Proc．Nat．4245-4249(1985)，引用することで援用する）によって同定された約４kDaタンパク質またはペプチドを指し、これは、アミノ酸配列分析によりわずかに異なるアミノ末端を有する四つのペプチドの混合物として定義され、三つの小さいペプチドのアミノ末端は最も長いペプチドの内部にある。ここで用いる、用語“Ａβ１−39ペプチド”、“Ａβ１−40ペプチド”、“Ａ β１−41ペプチド”、“Ａβ１−４２ペプチド”および“Ａβ１−43ペプチド” は、4.2kDaのβ−アミロイドタンパク質のあるペプチド成分を示す。Ａβ１−39 ペプチドは39のアミノ酸からなり、Ａβ１−40ペプチドは40のアミノ酸からなり、Ａβ１−41ペプチドは41のアミノ酸からなり、Ａβ１−42ペプチドは42のアミノ酸からなり、Ａβ１−43ペプチドは43のアミノ酸からなる。これらのペプチドはＮ末端で異種である。ここで用いる、用語“タンパク質分子”または“ペプチド分子”は、５個以上のアミノ酸を含む全ての分子を包含する。タンパク質は、制限されることなく、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、リン酸化、オリゴマー化のような翻訳後修飾を含む修飾を受けることが当業界で知られている。従って、ここで用いる用語“タンパク質分子”または“ペプチド分子”は、生物学的または非生物学的過程によって修飾された全てのタンパク質分子を包含する。用語“アミノ酸”は、すべての自然界に存在するＬアミノ酸を意味する。この定義は、ノルロイシン、オルニチン、ホモシステインを含むことを意味する。ここで用いる、用語“外来性遺伝子構造体”は、自然界に存在するかそうでないかに関わらず、任意の生物に挿入することができる任意の起源の任意のDNAである。ここで用いる、用語“トランスフェクション”または“形質転換”は、真核細胞のDNA含量を変化させるあらゆる方法を意味する。これは、制限されることなく、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン処理トランスフェクション、ポリブレントランスフェクション、プロトプラスト融合トランスフェクション、エレクトロポレーショントランスフェクション、リポソームトランスフェクション、直接マイクロインジェクショントランスフェクションまたは当該分野で公知の制御されたDNA取り込みに影響を与える他の方法を包含する(Sambrook，et al.，Molecular Cloning 3：16.30-16.31 （1989）参照，引用することで援用する)。ここで用いる、用語“安定的発現”は、所望の時間枠を越えて、所望のタンパク質分子を産生できる真核細胞または真核細胞系を意味する。ここで用いる、用語“β−アミロイド前駆体タンパク質の効率的発現”は、CP -6またはCP-7細胞系より多い量のβ−アミロイド前駆体タンパク質の発現レベルを意味する。ここで用いる、全ての真核細胞または全ての真核細胞系に関して“安定的に形質転換された”または“安定的にトランスフェクションされた”は、同一の外来性遺伝子構造体を含む子孫を生じ得る、外来性遺伝子構造体を有する全ての真核細胞または全ての真核細胞系を意味する。ここで用いる、用語“β−アミロイド前駆体タンパク質”または“APPタンパク質”は、アイソフォームAPP₆₉₅、APP₇₅₁、APP₇₇₀またはその突然変異体を意味する。APPの突然変異体は、制限されることなく、スウェーデンFAD二重突然変異体、ロンドン突然変異体、バリン⁷¹⁷→イソロイシン突然変異体、バリン⁷¹⁷→グリシン突然変異体およびバリン⁷¹⁷→フェニルアラニン突然変異体を包含する。ここで用いる、用語“β−アミロイド前駆体タンパク質またはその誘導体”は、β−アミロイド前駆体タンパク質またはβ−アミロイド前駆体タンパク質の内部に含まれる任意の連続するアミノ酸配列と一致する５アミノ酸より長い全てのタンパク質またはペプチド断片に対応するタンパク質もしくはペプチド断片である。ここで用いる、用語“β−アミロイド前駆体をコードする配列のmRNA”または “APP mRNA”は、β−アミロイド前駆体をコードする配列の全てもしくは任意の一部分が特異的にハイブリダイズし得る全てのメッセンジャーRNAを意味する。ここで用いる、用語“β−アミロイド前駆体をコードする配列”または“App をコードする配列”は、APP₆₉₅、APP₇₅₁、APP₇₇₀またはその突然変異体をコードする全てのDNA分子を意味する。APPの突然変異体は、制限されることなく、スウェーデンFAD二重突然変異体、ロンドン突然変異体、バリン⁷¹⁷→イソロイシン突然変異体、バリン⁷¹⁷→グリシン突然変異体、バリン⁷¹⁷→フェニルアラニン突然変異体を含む。ここで用いる、用語“内部リボゾームエントリー部位をコードする配列”または“IRESをコードする配列”は、一つのプロモーターから二つ以上のタンパク質をコードする配列の翻訳を可能にする全ての核酸配列である。ここで用いる、用語“コードする配列”は、特定の特徴を有する配列を意味する。この“コードする配列”は、制限されることなく、転写され得ない、転写され得る、翻訳され得ない、または翻訳され得る。ここで用いる、用語“インヒビター”は、β−アミロイド前駆体タンパク質のプロセシングに影響する全ての分子を意味する。ここで用いる、用語“β−アミロイド前駆体経路”は、β−アミロイド前駆体タンパク質を修飾する生物学的過程における全ての生物学的過程または工程を意味する。ここで用いる、用語“培地”は、所望の細胞を維持できる任意の組成物を意味する。ここで用いる、用語“強力リボゾーム結合部位をコードする配列”または“強いKozakコード配列”は、−３位（ATG開始コドンとの相対値）にプリン、＋４位(ATG開始コドンとの相対値)にグアニンを有する全てのリボゾーム結合部位をコードする配列またはKozakコード配列である。ここで用いる、用語“弱いリボゾーム結合部位をコードする配列”または“弱いKozakコード配列”は、−３位（ATG開始コドンとの相対値）にプリン、＋４位 (ATG開始コドンとの相対値)にグアニンを有さない全てのリボゾーム結合部位をコードする配列またはKozakコード配列である。ここで用いる、用語“高処理能アッセイ”は、約500μlより少ない反応容量で全手を実行し得るアッセイを意味する。ここで用いる、用語、二核酸分子は、二分子が互いに逆平行すなわち逆相補的な二本鎖核酸構造を形成することが可能な場合、特異的にハイブリダイズすることができるという。（Ａ）細胞系本発明の実施態様は、外来性遺伝子構造体を有する真核細胞系であり、外来性遺伝子構造体はサイトメガロウィルスプロモーターをコードする配列、強力リボゾーム結合部位をコードする配列、β−アミロイド前駆体タンパク質をコードする配列、選択可能なマーカーをコードする配列およびポリアデニル化シグナルをコードする配列からなる。本発明の別の実施態様は、外来性遺伝子構造体を有する真核細胞系であり、外来性遺伝子構造体はサイトメガロウィルスプロモーターをコードする配列、リボゾーム結合部位をコードする配列、β−アミロイド前駆体タンパク質をコードする配列、選択可能なマーカーをコードする配列およびポリアデニル化シグナルをコードする配列からなる。本発明の真核細胞系は、β−アミロイド前駆体タンパク質を発現できる外来性遺伝子構造体を有する任意の細胞系とすることができる。本発明の好ましい実施態様において、真核細胞系はチャイニーズハムスター卵巣細胞系、チャイニーズハムスター卵巣細胞系Ｋ１、ジヒドロホレートレダクターゼ欠損ハムスター細胞系、ヒト腎臓細胞系、ラット神経膠細胞系、ヒト神経膠細胞系、ラット神経芽細胞腫細胞系よりなる群から選択される。本発明のより好ましい実施態様において、真核細胞系はチャイニーズハムスター卵巣細胞系である。本発明の更に好ましい実施態様において、真核細胞系はチャイニーズハムスター卵巣細胞系Ｋ１である。本発明の外来性遺伝子構造体を有する真核細胞系は、外来性遺伝子構造体を用いて形質転換またはトランスフェクションされた全ての細胞系とすることができる。本発明の好ましい実施態様において、本発明の外来性遺伝子構造体を有する真核細胞系は、外来性遺伝子構造体をもちいて安定的に形質転換または安定的にトランスフェクションされた全ての細胞系とすることができる。ある実施態様において、外来性遺伝子構造体は、自然に生じるまたはそうでないに関わらず、全ての生物に挿入することができる任意の起源の任意のDNAである。好ましくは、外来性遺伝子構造体は、自然に生じるまたはそうでないに関わらず、真核細胞へ安定して導入することができる任意の起源の任意のDNAである。 β−アミロイド前駆体タンパク質をコードする配列は、APPタンパク質または誘導体をコードする。好ましい実施態様において、β−アミロイド前駆体タンパク質は、三つの主要なAPPタンパク質のアイソフォーム、APP₆₉₅、APP₇₅₁およびA PP₇₇₀よりなる群、並びに“スウェーデンFAD二重突然変異体”、“ロンドン突然変異体”、バリン⁷¹⁷→イソロイシン突然変異体、バリン⁷¹⁷→グリシン突然変異体、バリン⁷¹⁷→フェニルアラニン突然変異体よりなる群から選択されたAPPタンパク質をコードする。更に好ましい実施態様において、β−アミロイド前駆体タンパク質をコードする配列は APP₆₉₅タンパク質アイソフォームをコードし得る。選択可能なマーカーをコードする配列は、外来性遺伝子構造体を有する細胞の同定を容易にするタンパク質をコードする任意の配列とすることができる。好ましい実施態様において、選択可能なマーカーをコードする配列は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする配列、ジヒドロホレートレダクターゼをコードする配列、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする配列、アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼをコードする配列、アデノシンデアミナーゼをコードする配列、アデニル酸デアミナーゼをコードする配列、UMPシンセターゼをコードする配列、グルタミンシンセターゼをコードする配列、アスパラギンシンセターゼをコードする配列、オルニチンデカルボキシラーゼをコードする配列、チミジンキナーゼをコードする配列、アミノグリコシダーゼホスホトランスフェラーゼをコードする配列、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼをコードする配列およびCADをコードする配列よりなる群から選択される(例えば、Sambrook et al.，In Molecular Cloning：A Laboratory Manual，16.8-16.15，Cold Spring Harbor Press(1989)参照，引用することで援用する；Old and Primrose，In Principles of Gene Manipulation，307-310 （1994）参照，引用することで援用する)。更に好ましい実施態様において、選択可能なマーカーはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子によりコードされる。本発明のプロモーターをコードする配列は、トランスフェクションされた真核細胞系において、高レベルのβ−アミロイド前駆体をコードする配列のmRNAまたは4.2kDaβ−アミロイドタンパク質の安定的な発現を可能にするのに必要な転写エンハンサー配列を含む任意のプロモーターである。好ましい実施態様において、プロモーターをコードする配列は、極初期遺伝子ヒトサイトメガロウィルスプロモーターと連結転写エンハンサーエレメントである（Boshart et al.，Cell 41：521-530(1985)，引用することで援用する）。本発明の更に好ましい実施態様において、プロモーターをコードする配列は、Boshar t et al.，Cell 41：521-530（1985）の図３に示されているように−601位から −14位に相当する。真核遺伝子の発現において、RNAポリメラーゼIIは終止シグナルが存在する部位を越えて転写する。ポリアデニル化部位の配列エレメントが認識され、そしてポリアデニル化が起こる。その結果、部位特異的切断およびポリアデニル化によって成熟mRNAの3'末端が形成される。二つの異なるエレメントが正確で効率的なポリアデニル化にしばしば必要とされる。（１）ポリアデニル化部位の下流に位置するGUまたはＵに富む配列および（２）WickensとStephenson、Sambrookらによって記載された６ヌクレオチドの高保存配列（Wickens and Stephenson，Scie nce 226：1045-1051(1984)，引用することで援用する，Sambrook et al.，16：6 ，In Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press（1 989），引用することで援用する）。本発明のポリアデニル化シグナルをコードする配列は、正確で効率的なポリアデニル化に必要とされる任意のコード配列である。好ましい実施態様において、ポリアデニル化シグナルをコードする配列はSV40由来である。更に好ましい実施態様において、本発明のポリアデニル化シグナルをコードする配列は、Wickens とStephensonによって記載されている(Wickens and Stephenson，Science 226： 1045-1051(1984))。より好ましい実施態様において、ポリアデニル化シグナルは転写終結シグナルを含む。本発明のβ−アミロイド前駆体タンパク質は、任意のβ−アミロイド前駆体タンパク質またはその誘導体である。本発明の好ましい実施態様において、 β−アミロイド前駆体タンパク質またはその誘導体は、アイソフォームAPP₆₉₅、 APP₇₅₁、APP₇₇₀またはその突然変異体よりなる群から選択される。β−アミロイド前駆体タンパク質の潜在的な突然変異体は、制限されることなく、スウェーデンFAD二重突然変異体、ロンドン突然変異体、バリン⁷¹⁷→イソロイシン突然変異体、バリン⁷¹⁷→グリシン突然変異体、バリン⁷¹⁷→フェニルアラニン突然変異体を含む。更に好ましい実施態様において、本発明のβ−アミロイド前駆体タンパク質はAPP₆₉₅である。本発明の実施態様は、真核細胞系CP-6またはCP-7より多い量の4.2kDaのβ−アミロイドタンパク質を産生する真核細胞系を提供する。本発明の実施態様は、真核細胞系CP-7より多い量の4.2kDaのβ−アミロイドタンパク質を産生する真核細胞系を提供する。好ましい実施態様において、本発明の真核細胞系は真核細胞系CP-7の２倍より多い4.2kDaのβ−アミロイドタンパク質を産生する。より好ましい実施態様において、本発明の真核細胞系は真核細胞系CP-7の４倍より多い4.2kDaのβ−アミロイドタンパク質を産生する。更により好ましい実施態様において、本発明の真核細胞系は真核細胞系CP-7の６倍より多い4.2kDaのβ−アミロイドタンパク質を産生する。特に好ましい実施態様において、本発明の真核細胞系は（ｉ）真核細胞系CP-7 の８倍より多い4.2kDaのβ−アミロイドタンパク質を産生し、または（ii）真核細胞系CP-7の10倍より多い4.2kDaのβ−アミロイドタンパク質を産生し、または（iii）高処理能アッセイに適する。本発明の実施態様は、真核細胞系CP-7より多い量のＡβ１−40ペプチドを産生する真核細胞系を提供する。好ましい実施態様において、本発明の真核細胞系は、真核細胞系CP-7の２倍より多いＡβ１−40ペプチドを産生する。より好ましい実施態様において、本発明の真核細胞系は、真核細胞系CP-7 の３倍より多いＡβ１−40ペプチドを産生する。更に好ましい実施態様において、本発明の真核細胞系は、真核細胞系CP-7の3.5倍より多いＡβ１−40ペプチドを産生する。本発明の実施態様は、真核細胞系CP-7より多い量のＡβ１−42ペプチドを産生する真核細胞系を提供する。好ましい実施態様において、本発明の真核細胞系は真核細胞系CP-7の２倍より多いＡβ１−42ペプチドを産生する。より好ましい実施態様において、本発明の真核細胞系は、真核細胞系CP-7の３倍より多いＡβ１ −42ペプチドを産生する。更に好ましい実施態様において、本発明の真核細胞系は、真核細胞系CP-7の４倍より多いＡβ１−42ペプチドを産生する。特に好ましい実施態様において、本発明の真核細胞系は、真核細胞系CP-7の６倍より多いＡ β１−42ペプチドを産生する。本発明の実施態様は、RIAによる測定または定量により、タンパク質mg当たり約30ngより多い4.2kDaのβ−アミロイドタンパク質を産生する真核細胞系を提供する。本発明のより好ましい実施態様において、本発明の真核細胞系は、RIAによる測定または定量により、タンパク質mg当たり約40ngより多い4.2kDaβ−アミロイドタンパク質を産生する。本発明の更に好ましい実施態様において、本発明の真核細胞系は、RIAによる測定または定量により、タンパク質mg当たり約50ng より多い4.2kDaのβ−アミロイドタンパク質を産生する。本発明の特に好ましい実施態様において、本発明の真核細胞系は、RIAによる測定または定量により、タンパク質mg当たり約60ngより多い4.2kDaβ−アミロイドタンパク質を産生する。本発明の更に好ましい実施態様において、本発明の真核細胞系は、RIAによる測定または定量により、タンパク質mg当たり約65ngより多い4.2kDaβ−アミロイドタンパク質を産生する。本発明の特に好ましい実施態様において、本発明の真核細胞系は、RIAによる測定または定量により、タンパク質mg当たり約70ngより多い4.2kDaβ−アミロイドタンパク質を産生する。本発明の実施態様は、RT-PCRによる検出により、CP-7を指示する細胞系より相対的に多い量のAPP mRNAを生産する真核細胞系を提供する。好ましい実施態様において、本発明の真核細胞系の分泌率は、細胞を96穴プレート（表面積〜0.4cm²）でウェル当たり0.5〜１×10⁵細胞の密度で培養する場合、４時間で培養液100μl当たり約４ngの4.2kDaβ−アミロイドタンパク質（合計）と見積もられる。好ましい実施態様において、本発明の真核細胞系の分泌率は、細胞を96穴プレート（表面積〜0.4cm²）でウェル当たり0.5〜１×10⁵細胞の密度で培養する場合、４時間で培養液100μl当たり約５ngの4.2kDaのβ−アミロイドタンパク質(合計)と見積もられる。真核リボゾームによる翻訳開始のコンセンサス配列は、GCCGCCA^-3／GCCA¹UGG⁴ (SEQ ID NO：3)，(Kozak，M.J．Cell．Biol．108：229-241(1989)，引用することで援用する；Sambrook et al.，16．16，In Molecular Clonjng：A Laborator y Manual，Cold Spring Harbor Press(1989)，引用することで援用する)である。実際的な目的のために、真核リボゾームによる翻訳開始は−３と＋４と標識された位置を考慮することにより、“強力”または“弱い”と考えられると報告されている。故に、−３位がプリン（ＡかＧ）、＋４位がグアニンである。弱いリボゾーム結合部位をコードする配列または弱いKozakをコードする配列の実例は、Higakiらにより利用されたようなCP-6細胞に存在するβ−アクチンプロモーターとAPP₆₉₅をコードする配列の間に見出される（5'-CCCCGATGC-3'）（SEQ ID NO ：4）(Higaki et al.，Neuron 14：651-669(1995))。本発明のリボゾーム結合部位をコードする配列は、真核リボゾームにより翻訳を開始される任意の配列である。本発明の好ましい実施態様において、本発明のリボゾームをコードする配列は強力リボゾーム結合部位をコードする配列である。更に好ましい実施態様において、本発明のリボゾーム結合部位をコードする配列は、次の配列の中に見い出された：5'-TTTTCAAAGCTTACCATGCTGCCCGGTTTGCACTG -3'(NO：5)。本発明のIRESをコードする配列は、単一のmRNA転写産物および単一のプロモーターから、β−アミロイド前駆体タンパク質またはその誘導体をコードする配列および選択可能なマーカーをコードする配列の翻訳を促進する任意の配列である。本発明の好ましい実施態様において、IRESをコードする配列はヒトのβ−アミロイド前駆体タンパク質の695アイソフォームおよびバクテリアのネオマイシントランスフェラーゼをコードする配列の翻訳を促進する。本発明の更に好ましい実施態様において、本発明のIRESをコードする配列は、脳心筋炎ウィルスのIRES である(Ghattas et al.，Molecular and Cellular Biology 11．12：5848-5859 （1991），引用することで援用する)。本発明の特に好ましい実施態様において、一つのサイトメガロウィルスプロモーターをコードする配列はβ−アミロイド前駆体タンパク質をコードする配列と選択可能なマーカーをコードする配列を共発現することができる。（Ｂ）核酸分子本発明の対象は、順に、サイトメガロウィルスプロモーター、リボゾーム結合部位、β−アミロイド前駆体タンパク質、選択可能なマーカーおよびポリアデニル化シグナルをコードする実質的に精製された核酸分子である。本発明の別の対象は、順に、サイトメガロウィルスプロモーター、強力リボゾーム結合部位、β−アミロイド前駆体タンパク質、選択可能なマーカーおよびポリアデニル化シグナルをコードする実質的に精製された核酸分子である。本発明の別の対象は、順に、サイトメガロウィルスプロモーター、リボゾーム結合部位、β−アミロイド前駆体タンパク質、IRES、選択可能なマーカーおよびポリアデニル化シグナルをコードする実質的に精製された核酸分子である。本発明の別の対象は、順に、サイトメガロウィルスプロモーター、強力リボゾーム結合部位、β−アミロイド前駆体タンパク質、IRES、選択可能なマーカーおよびポリアデニル化シグナルをコードする実質的に精製された核酸分子である。また、上述した本発明のどの外来性遺伝子構造体も、本発明の核酸分子であると理解される。さらに、本発明のどの外来性遺伝子構造体も、実質的に精製されおよび／または生物学的に活性でありうると理解される。当業者には、高分子(例えば、DNA分子、プラスミドなど)の構築、操作および単離、並びに組換え体の生成、クローンのスクリーニングおよび単離の特定の条件および手法を記載する標準手法の資料（例えばSambrook et al.，In Molecula r Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press(1989)，引用することで援用する）が良く知られている。（Ｃ）抗体本発明の一つの態様は、抗体、一本鎖抗原結合分子、または全てのβ−アミロイド前駆体タンパク質またはその誘導体およびそれらのアナログ、融合または断片に特異的に結合する他のタンパク質に関する。ここで用いる抗体またはペプチドは、結合がβ−アミロイド前駆体タンパク質またはその誘導体およびそれらのアナログ、融合または断片でないものの存在により競合的に阻害されない場合、全てのβ−アミロイド前駆体タンパク質またはその誘導体およびそれらのアナログ、融合または断片には“特異的に結合”すると言う。当業者には、抗体の構築、操作、単離に対して特定の条件および手法を記載する標準手法資料が良く知られている(例えば、Harlow and Lane，In Antibodies ：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press（1988）参照，引用することで援用する)。任意のβ−アミロイド前駆体タンパク質またはその誘導体およびそのアナログ、融合または断片と特異的に結合する抗体はそのような技術を用いて調製することができる。 β−アミロイド前駆体タンパク質またはその誘導体およびそのアナログ融合または断片と特異的に結合する抗体または抗血清の好ましい例は、次のものを含む：モノクローナル抗体1101.1（1101.1は1997年４月25日、アメリカンティッシュタイプコレクション，Rockville，Marylandに寄託され、ATCC No HB12347が付与された）、1702.1（1702.1は1997年６月３日、アメリカンティッシュタイプコレクション，Rockville，Marylandに寄託され、ATCC No HB12363が付与された）、 108.1（108.1は1997年６月３日、アメリカンティッシュタイプコレクション，Ro ckville，Marylandに寄託され、ATCC No HB12362が付与された）、抗血清ＢＡ＃１、ＢＡ＃２、アミロイドβ抗体cat．nos．0490-1916，0490-1858，0490-1857 （ANAWA Biomedical Services & Products，Wangen Switzerland）；マウスモノクローナル抗−β−アミロイドペプチド（１−28）(Zymed Laboratories，South San Francisco，California)；マウス抗−βアミロイドモノクローナルcat no ．RDI-BAMYLOID，Research Diagnostics，Inc．Flanders，New Jersey）。β− アミロイド前駆体タンパク質またはその誘導体およびそのアナログ、融合または断片と特異的に結合する抗体または抗血清の特に好ましい例は、次から選別される：モノクローナル抗体1101.1、1702.1、108.1、抗血清ＢＡ＃１、ＢＡ＃２。（Ｄ）表示タンパク質分子本発明の一つの態様は、表示タンパク質分子に関する。本発明の実施態様において、β−アミロイドのプロセシング経路の阻害を表示するタンパク質分子は、全てのタンパク質分子である。本発明の好ましい実施態様において、β−アミロイドのプロセシング経路の阻害を表示するタンパク質分子は、あらゆるβ−アミロイド前駆体タンパク質やその誘導体である。本発明のより好ましい実施態様において、β−アミロイドのプロセシング経路の阻害を表示するタンパク質分子は、4.2kDaのβ−アミロイドタンパク質、Ａβ１−39ペプチド、Ａβ１−40ペプチド、Ａβ１−41ペプチド、Ａβ１−42ペプチド、Ａβ１−43ペプチド、トランケートされたカルボキシル末端８−12kDaの残り、Cordellらによって記載された99 アミノ酸タンパク質、米国特許第5,221,607号、PCT／US93／01014に記載された2 2kDaの前アミロイド中間体、ここに記載されるペプチド12−39、12−40、12−42 、12−43を包含する、報告されたα−セクレターゼ、γ−セクレターゼおよび３Ｂの産物を包含する３kDaのペプチドよりなる群から選択される。本発明のより好ましい実施態様において、β−アミロイドのプロセシング経路の阻害を表示するタンパク質分子は、4.2kDaのβ−アミロイドタンパク質、Ａβ １−39ペプチド、Ａβ１−40ペプチド、Ａβ１−41ペプチド、Ａβ１−42ペプチド、Ａβ１−43ペプチドよりなる群から選択される。本発明の別のより好ましい実施態様において、β−アミロイドのプロセシング経路の阻害を表示するタンパク質分子は、4.2kDaのβ−アミロイドタンパク質、Ａβ１−40ペプチド、Ａβ１ −42ペプチドよりなる群から選択される。本発明の別のより好ましい実施態様において、β−アミロイドのプロセシング経路の阻害を表示するタンパク質分子は、4.2kDaのβ−アミロイドタンパク質である。組成の変化またはAPP産物のパターンは、α−、β−、γ−セクレターゼのインヒビターを示す。 III．本発明の薬剤の使用本発明の実施態様は、外来性遺伝子構造体を有する真核細胞系にインヒビターを投与し、外来性遺伝子構造体はサイトメガロウィルスのプロモーターをコードする配列、強力リボゾーム結合部位をコードする配列、β−アミロイド前駆体タンパク質をコードする配列、選択可能なマーカーをコードする配列およびポリアデニル化シグナルをコードする配列からなり；そして、β−アミロイドプロセシング経路の阻害を表示するタンパク質分子を定量することからなるβ−アミロイドのプロセシング経路のインヒビターの同定方法である。本発明の他の実施態様は、（ａ）β−アミロイドのプロセシングのインヒビターと真核細胞系を共にインキュベートして、標識アミノ酸を含有する培地中でβ −アミロイドのプロセシング経路の阻害を示すタンパク質分子を生成させ、真核細胞系は外来性遺伝子構造体を有し、外来性遺伝子構造体はサイトメガロウィルスのプロモーターをコードする配列、強力リボゾーム結合部位をコードする配列、β−アミロイド前駆体タンパク質をコードする配列、選択可能なマーカーをコードする配列およびポリアデニル化シグナルをコードする配列からなり、外来性遺伝子構造体はβ−アミロイド前駆体タンパク質分子を安定的に発現し得るものであり；（ｂ）真核細胞系と培地を分離し；（ｃ）真核細胞と培地から培地からタンパク質分子を分離し；そして（ｄ）タンパク質分子を定量することからなる β−アミロイドのプロセシング経路のインヒビターの同定方法である。本発明の別の実施態様は、（ａ）β−アミロイドのプロセシングインヒビターと真核細胞系とをインキュベートして、β−アミロイドのプロセシング経路の阻害を示すタンパク質分子を生成させ、真核細胞系は外来性遺伝子構造体を有し、外来性遺伝子構造体はサイトメガロウィルスのプロモーターをコードする配列、強力リボゾーム結合部位をコードする配列、β−アミロイド前駆体タンパク質をコードする配列、選択可能なマーカーをコードする配列およびポリアデニル化シグナルをコードする配列からなり；そして（ｂ）インキュベーション工程にて生成したタンパク質分子を定量することからなるβ−アミロイドのプロセシングのインヒビターを同定する高処理能アッセイである。他の特に好ましい実施態様において、本発明の高処理能アッセイは約300μlより少ない容量にて実施または開始することができる。他の特に更に好ましい実施態様において、本発明の高処理能アッセイは約250μlより少ない容量にて実施または開始することができる。他の特により更に好ましい実施態様において、本発明の高処理能アッセイは約200μlの容量にて実施または開始することができる。本発明の高処理能アッセイの容量は高処理能アッセイの過程で変化し得ると理解される。ここで用いる、用語、特定の容量にて「実施する」または特定の容量にて「開始する」は、すべての高処理能アッセイは、アッセイが特定の容量を超えている間、いずれの一時的段階においても使用しない全ての試薬、細胞系または生物材料もしくは化学物質を包含する。しかし、本発明の高処理能アッセイにより使用される試薬、細胞系または他の生物材料もしくは化学物質の全容量は特定の容量を超え得ると理解される。他の特に好ましい実施態様において、本発明の高処理能アッセイは、約１cm^-2 未満の表面積で実施することができる。他の特により好ましい実施態様において、本発明の高処理能アッセイは、約0.6cm^-2未満の表面積で実施することができる。他の特に更により好ましい実施態様において、本発明の高処理能アッセイは、約0.4cm^-2未満の表面積で実施することができる。ここで用いる、「表面積」は真核細胞系と物理的に接触する面積を指す。本発明のインヒビターの不存在下での真核細胞のインキュベーションは、任意の期間、そして細胞の増殖または維持の任意の適する条件下とし得る。本発明の β−アミロイドのプロセシングのインヒビターとの真核細胞のインキュベーションは、任意の期間、そして細胞の増殖または維持の任意の適する条件下とし得る。本発明の高処理能アッセイの好ましい実施態様において、β−アミロイドのプロセシング経路の阻害を表示するタンパク質分子を生成させるβ−アミロイドのプロセシングのインヒビターと真核細胞系とのインキュベーションは、約１時間〜約20時間の間で実施することができる。本発明の高処理能アッセイのより好ましい実施態様において、β−アミロイドのプロセシング経路の阻害を表示するタンパク質分子を生成させるβ−アミロイドプロセシングのインヒビターと真核細胞系のインキュベーションは、約２時間〜約10時間の間で実施することができる。本発明の高処理能アッセイの特に好ましい実施態様において、β−アミロイドのプロセシング経路の阻害を表示するタンパク質分子を生成させるβ−アミロイドのプロセシングのインヒビターと真核細胞系とのインキュベーションは、約３時間〜約５時間の間で実施することができる。診断研究所および組織培養において使用される任意の従来の96穴ポリスチレンマイクロタイターディッシュを本発明に使用することができる。ポリスチレンの合成法は当該分野で公知であり、例えばByrdson，J.A， Plastics Materials，第５版，Butterworth Heinemann，London(1991)、ここで引用することにより援用する；Maxisorboプレート(Nunc，Rochester，New York) などのようなプラスチックおよびポリマーについての論文に開示されている。本発明のβ−アミロイドのプロセシング経路の阻害を表示するタンパク質分子のレベルは、当該分野に公知の任意の技術を用いて測定または定量することができる。例えば、幅広く列挙した任意のイムノアッセイ（Harlow and Lane，Antib odies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press(1988)，引用することにより援用；Fackrell，J．Clin．Immunoassay 8：213-219(1985)，引用することにより援用；Yolken，R.H.，Rev．Infect．Dis．4：35(1982)，引用することにより援用；Collins，W.P.，In Alternative Immunoassays，John Wiley & Son s，NY(1985)，引用することにより援用；Ngo，T.T．et．al.，In Enzyme Mediat ed Immunoassay，Plenum Press，NY（1985），引用することにより援用）をこの目的に使用することができる。最も簡単なイムノアッセイは、単に予め決められた標的分子に結合し得る抗体を標的分子を含有していると疑わしい試料とインキュベートすることを包含する。標的分子の存在は、標的分子に結合した全ての抗体の存在およびその濃度に応じて決定される。初めに存在する未結合の抗体から標的に結合した抗体の分離を容易にするために、典型的には固相を使用する。従って、例えば試料を固体担体に結合させ、そして抗体とインキュベーションした後に担体を洗浄して全ての未結合の抗体を除去することができる。より高度なイムノアッセイにおいて、標的分子の濃度を、抗体を担体に結合させ、次いで担体を標的分子を含有していると疑わしい試料と接触させることにより決定する。固定した抗体に結合し始めた標的分子は、多くの方法において検出することができる。例えば、標的分子の二次エピトープに結合し得る標識した二次抗体の存在下に担体をインキュベートすることができる。従って、担体上への標識抗体の固定は標的の存在を必要とし、そしてこれが試料中の標的の濃度に応じたものである。別のアッセイにおいて、標的は試料および周知の量の標識した標的と一緒にインキュベートする。試料中の標的分子の存在は、抗体結合部位について標識した標的分子と競合する。従って、抗体に結合することができる標識した標的分子の量は、試料中の標的分子の濃度に逆比例する。一般的に、イムノアッセイ法は、放射線標識（“RIA”）または酵素標識（“E LISA”）のいずれかを用いる。RIAは、使用が簡単、敏感および容易であるという利点を有する。放射線標識は、比較的小さな原子寸法の標識であり、通常は反応速度に影響を与えない。しかしながら、そのようなアッセイは、ラジオアイソトープの減衰により、試薬は保管期間が短く、特別な操作および処理を要求し、並びに複合体および高価な分析装置の使用を必要とするという欠点を有する。RI Aは、Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology，Work， T.S．et．al.，North Holland Publishing Company，NY（1978）に記載され、特に章の名称“An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques ”，Chard，T．に記載されており、ここで引用することにより援用する。ELISA は、比色、pH、気体放出等の多数の検出方法がアッセイの定量に使用できるような無数の別個の酵素を用いて、あまり高価でない装置で実施することができるという利点を有する。更に、酵素試薬は、比較的長い保管期間を有し、RIAの使用に伴う放射線汚染の危険性がない。ELISAは、ELISA and Other Solid Phase Imm unoassay(Kemeny，D.M．et．al.，Eds.)， John Wiley & Sons，NY（1988）に記載され、ここで引用することにより援用する。レベル（即ち、β−アミロイドプロセシング経路の阻害を表示するタンパク質分子の濃度等）またはパターン（即ち、β−アミロイドプロセシング経路の阻害を表示するタンパク質分子の発現速度、分解速度、安定性等）は測定または定量し得ると理解される。下記の実施例は、本発明を説明し、そして当業者がこれを製造および使用するのを助けるためにある。実施例は、いかなる意味でも本発明の範囲を制限するものではない。実施例１ヒトAPP₆₉₅のクローニングヒトAPP₆₉₅アイソフォームをコードするDNA領域を5'および3'プライマーを用いて増幅させる。5'プライマーの配列は、5'-TTTTCAAAGCTTACCATGCTGCCCGGTTTGC ACTG-3'（SEQ ID NO：5）である。5'プライマーはHind III、制限エンドヌクレアーゼ部位(下線)および有効なリボゾーム結合のための開始ATG(下線／斜体)に関して−３位(斜体)にあるプリン(アデノシン)を含有する。3'プライマーの配列は、5'-AGGCTGCTCTAGAGGGGGTCTAGTTCTGCAT-3'（SEQ ID NO：6）である。3'プライマーには、終止コドンから５ヌクレオチド離れたXba Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位（下線）がある。終止配列は、cDNA（下線／斜体）内に位置する終止配列と一致する。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を、5'および3'プライマーと鋳型としてのプラスミドβ−アクチン−β−APP₆₉₅(SCiOS、Nova，Mountain View，Calif ornia)を組み合わせて実施する。PCR生成物をHind IIIおよびXbaＩで消化し、そして予めHind IIIおよびXbaＩで切断したpBluescript-SK（Stratagene，La Joll a，California）に連結する。挿入物は、シークエンスして確認する。実施例２ APP₆₉₅の高レベル発現を可能にする発現ベクターの構築標準モレキュラークローニング法を使用して、細胞を形質転換させるDNAベクターを構築する。これは細菌の複製起点およびpUC19（Yanisch-Peronet．al.，G ene 33：103-119(1985)，ここで引用することにより援用する）由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子、サイトメガロウィルス由来の極初期遺伝子転写エンハンサー／プロモーター（Boshart，M．et．al.，Cell 41：521-530（1985），ここで引用することにより援用する）、有効なリボゾーム結合に対して5'末端にコザックコンセンサス配列を包含するよう修飾したヒトAPP₆₉₅をコードする配列（Kozak，N ature 308：241-246（1984），ここで引用することにより援用する）、脳心筋炎ウイルス由来の内部リボゾームエントリー部位（IRES）(Jang，et．al.，J．Vir ology 63：1651-1660(1989)，ここで引用することにより援用する)、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（neo）のE．coli遺伝子（Blazquez et．al.， Mol．Microbiol．5：1511-1518（1991），ここで引用することにより援用する）およびSV40ウィスル由来のポリアデニル化シグナル（Wickens and Stephenson， Sicence 266：1045-1051（1984），ここで引用することにより援用する）を含有する。サイトメガロウィルス由来の極初期遺伝子転写エンハンサー／プロモーターとSV40ウィスル由来のポリアデニル化シグナルの間にあるプラスミドの領域の図表の表示は、図１に提示する。クローニング工程は本質的に次の通りである：SalＩで消化することによりヒトAPP₆₉₅挿入物をpBluescript-SKから取り出し、次に充填[fill-in]反応により平滑末端を生成させる。次いで生じたDNAをXbaＩで消化する。挿入物をアガロースゲル電気泳動により単離し、次に切り取ったゲルのバンドからDNAを精製する。プラスミドpCMV-IRESをNotlで消化する。消化したDNAを次いで充填させて平滑末端を生成させる。次に充填されたDNAを XbaＩで消化する。ヒトAPP₆₉₅挿入物（上記した）を消化したプラスミドと連結し、pCMV-IRES-βAPP₆₉₅を生成した。構築法は図２で図式により説明されるとおりである。実施例３チャイニーズハムスター卵巣細胞の安定したトランスフェクションチャイニーズハムスター卵巣細胞を、16または32μgのpCMV-IRES-βAPP₆₉₅のいずれかを用いてリポソーム媒介DNAトランスフェクションによってトランスフェクションし、そして次のようにヒトAPP₆₉₅およびneoの転写単位の安定な組込みにつき選択する。CHO-K1細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション、12 301，Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，USA）を通常通りに培地：[ DMEM／NUT MIX F-12(Gibco 041-01331M，Gaithersburg，Maryland)；１％非−必須アミノ酸；2.5mM Ｌ−グルタミン；0.5mMピルベート酸；１％ペニシリン；１％ストレプトマイシン；10％ウシ胎仔血清(Gibco 011-06290(オーストラリア))] 中で培養した。細胞を150cm²プレート上でトランスフェクションの前に、70％集密の期待される密度がトランスフェクションの日まで得られるように４日間継代培養する。DNAを、リポフェクタミン試薬（GIBCO／RBRL，Gaithersburg，Maryla nd）と混合する。次いで細胞を、製品指示書（GIBCO／RBRL，Gaithersburg，Mar yland、ここで引用することにより援用する）に従って一晩トランスフェクションさせ、翌日に新しい洗浄培地を注ぐ。トランスフェクションの３日後、細胞を１mg／mlジェネティシン[geneticin]含有培地中に置き、３〜４週間増殖させる。生存した細胞から生じたコロニーを緩やかなトリプシン処理によって収集し、 96穴ディッシュの個々のウェルに移し、ジェネティシンを含まない培地中で培養する。細胞を膨張させ、APPmRNAの発現につき評価する。実施例４ APPmRNA発現の解析 RNAを、個々の単離物から生じた細胞からRNA Now（Biogenex，San Ramon，Car ifornia）を用いて抽出し、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によってヒトAPP転写物の存在を解析する。逆転写反応をランダムヘキサマーを用いてプライムさせ、PCR増幅はヒトAPPmRNAの600bp断片を増幅するよう設計したプライマー（5'プライマー：5'-GGTGGAAGAAGAAGAAGCC-3'（SEQ ID NO：7）；3'プライマー：5'-GTGACGAGGCCGAGGAGGAAC-3'(SEQ ID NO：8)）を使用して実施する。コロニーは、CP-6細胞と比較したAPPの存在および相対量について記録される(表１参照)。CP-6は、β−アクチンプロモータ制御下でヒトAPP₆₉₅を発現するCHO細胞系である(Higaki et．al.，Neuron 14：651-669(1995))。表１において、PCRの結果はRT-PCRによって検出したAPPmRNAの相対量を示し、 NDは未測定値を示す。実施例５ 4.2kDaβ−アミロイドタンパク質のラジオイムノアッセイ解析細胞系を、ラジオイムノアッセイ(RIA)とその後の分析培地から4.2kDaβ−アミロイドタンパク質を濃縮する逆相クロマトグラフィーにより、4.2kDaβ−アミロイドタンパク質の産生について分析する。ウサギＢＡ＃１抗血清およびヨウ素化Ａβ１−40ペプチドをRIAにおいて使用する。細胞を、１％FCSおよびＡβペプチド濃縮物を含有するRIAアッセイ培地(EMEM（Gibco 041-01090M，Gaithersbrug ，Maryland），１％非必須アミノ酸，２mM Ｌ−グルタミン，１％ペニシリン，１％ストレプトマイシン)中にて５時間インキュベートする。インキュベーション後、RIAアッセイ培地を細胞から取り除き、10分間1,500rpmで遠心分離し、次いで−20℃で凍結させて保存する。1.5〜２mlの培地を、使用するLichrolutカートリッジ(Merck，New Jersey)またはSepak C18カートリッジ（Waters Corp.，MA ）に通し、最初に２mlの0.1％TFA中の５％CH₃CNで洗浄し、次いで２mlの0.1％TF A中の25％CH₃CNで洗浄する。4.2kDaβ−アミロイドタンパク質を、２mlの0.1％T FA中の50％CH₃CNで溶出し、スピードバック［speedvac］遠心分離により乾燥させ、次いで−20℃で凍結させて保存する。濃縮ペプチドは、250μlの水中0.1％トリトン−Ｘ100＋0.1％BSA中に再度溶解させる。 RIAを次のように実施する：Ａβ１−40ペプチドを、クロラミンＴ法（Amersha m，Arlington Height，Illinois）を使用して¹²⁵Ｉで標識し、0.1％TFA中における20％〜50％CH₃CNの線状勾配を用いるC18カラム(Vydac，Hesperia，California )において逆相HPLCにより精製する。標識したペプチドは40％CH₃CNで溶出させ、−20℃で保存する。 12×75mmガラス管に次の記載順に緩衝液Ａ（0.1Ｍリン酸ナトリウム，pH7.4＋ 0.1％BSA＋0.1％トリトン−Ｘ100）中において１：150に希釈した100μl ＢＡ＃１抗血清またはPBS中の１％ウシ血清アルブミン、競合するリガンドの不存在下で標識ペプチドの30％が結合するのに必要な濃度×２、50μlの未知の試料、緩衝液ＡにおいてまたはPBS中の１％ウシ血清アルブミン中において0.4〜100nMの範囲の濃度(0.1〜25nMの最終濃度を生じ、標準は20％イソプロパノールに溶解した１mg／ml原液から調製し次いで−20℃で保存する)に希釈したペプチド標準（Ａβ１−40ペプチド，Bachem，King of Prussia，Pennsylvania）、全結合（緩衝液ＡまたはPBS中の１％ウシ血清アルブミンを全結合に使用する）または非特異的結合（全置換／非特異的結合を測定するために緩衝液ＡまたはPBS中の１％ウシ血清アルブミン中の10μM Ａβ１−40ペプチドを使用する）および8,000〜1 0,000cpm／管を与えるよう緩衝液Ｃ中にて希釈した50μlの肝LC精製された¹²⁵Ｉ −Ａβ１−40ペプチドを添加する。溶液は全量200μlになる。次いで溶液をボルテックスし、そして一晩４℃でインキュベートする。インキュベーション後、50μlの正常ウサギ血清、次に800μlの緩衝液ＡまたはPBS中の１％ウシ血清アルブミンに溶解した15.8％ポリエチレングリコール（MW6,000〜8 ,000）を試料に添加する。次に試料を４℃で10分間インキュベートする。インキュベーションの次に、試料を3,200rpmで20分間遠心分離(Sorvall T600B)する。試料をペレット化した後、上澄をアスピレートして、ペレットの放射能をガンマカウンターにおいて測定する。 RIAを使用する典型的な標準曲線を図３に示す。これら２つのトランスフェクションから生じた細胞から得られた結果は表１にまとめられたとおりであり、それはそれぞれ２回分析した２つの培地試料の平均を示す。５個の最も陽性なクローンを4.2kDaβ−アミロイドタンパク質の分泌および安定性における異なる培地の効果について更に評価する。これらの結果を表２にまとめる。21，Ｎ−Ｏと称するトランスフェクション由来のある細胞系は、CP-7細胞の 10倍の4.2kDaβ−アミロイドタンパク質を生成すると目算され、サブクローニングに選択される。表２は、pCMV-IRES-β-APP₆₉₅でトランスフェクションした選択CHO-K1細胞のクローンにおける4.2kDaβ−アミロイドタンパク質レベルについてインキュベーション培地の効果を示す。 ^* Ａβ＝4.2kDaβ−アミロイドタンパク質培地の比較のために、細胞を６穴プレート（9.5cm²／ウェル）でコンフルエントまで培養する。次いで培地を、１％ウシ胎児血清（FCS）、0.2％ウシ血清アルブミン（BSA）または添加物質なし（SFM）のいずれかを含有する1.5mlのRIAアッセイ培地と置き換える。５時間後、培地を収集し、4.2kDaβ−アミロイドタンパク質をRIA測定のために濃縮する(上記したように)。0.5Ｎ NaOH中に一晩可溶化した後に細胞のタンパク質を測定する。更に、21-N-0の９個のサブクローンにより産生された4.2kDaβ−アミロイドタンパク質レベルをRIAによって評価し、データを表３に示す。 ^* Ａβ＝4.2kDaβ−アミロイドタンパク質 RIAにより評価された21-N-0細胞のサブクローンにより産生された4.2kDaβ− アミロイドタンパク質レベルを表３に示す。分析は、次にように実施する：コンフルエント25cm²フラスコの細胞を１％FCS含有RIAアッセイ培地で５時間上述のようにインキュベートする。4.2kDaβ−アミロイドタンパンク質を、RIAを行う前に1.5mlの培地から濃縮する。0.5Ｎ NaOH中で一晩細胞を可溶化した後に細胞のタンパク質を測定する。表３の値は２回の測定の平均である。実施例６パルス標識および免疫沈降によるAPPプロセシングの解析 4.2kDaβ−アミロイドタンパク質およびＣ−末端断片へのAPPプロセシングのレベルおよびパターンを、４個の選択したサブクローンのパルス標識および免疫沈降並びに親の21-N-O細胞系とCP-7細胞において観察されるものを比較した結果によって研究する。 APP産生、そのプロセシングパターンおよび4.2kDaβ−アミロイドタンパク質分泌のレベルを、Higaki et．al.，Neuron 14：651-659(1995)に記載の手法を用いるパルス−標識および免疫沈降によって監視する。本質的に、細胞を、最初にシステインおよびメチオニンを欠乏させ、次いで35Ｓ−メチオニンと35Ｓ−システインを含有する培地で４時間インキュベートする。培地中に分泌された4.2kDa β−アミロイドタンパク質をＢＡ＃２ウサギ抗血清を用いて免疫沈降させる。細胞と結合したAPPペプチドは、ヒトAPPのＣ−末端近くのエピトープを認識するＢＡ＃２ウサギ抗血清を使用して、細胞溶解液から免疫沈降される。期待されるAP P生成物のパターンを図４に示す。培地中に存在するペプチドは４kDaおよび３kD a生成物を包含する。４kDa生成物はＡβ１−39ペプチド、Ａβ１−40ペプチド、Ａβ１−41ペプチド、Ａβ１−42ペプチドを包含する。３kDaペプチドは、α− およびγ−セクレターゼの産物である３Ａ、および12−39、12−40、12−42および12−43を含む３Ｂを包含する。Ｃ−末端断片は、APPの膜および細胞内100アミノ酸Ｃ−末端の含有部分を包含する。APP生成物の組成またはパターンにおける変化は、α−、β−、γ−セクレターゼのインヒビターを表示する。可溶化した免疫沈降物をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、放射性タンパク質をホスホリメージャー［phosphorimager］を用いて定量する。各ピークの面積は、対照の細胞系であるCP-7(Scios Nova，Mountain View，Cali fornia)から得られる値と比較して細胞のタンパク質の量および標識パターンを標準化する。 21-N-O細胞の選択したサブクローンによって産生される4.2kDaβ−アミロイドタンパク質およびＣ−末端断片のレベルは、パルス標識および免疫沈降によって評価される。これらの結果を表４にまとめ、そして２個のサブクローン、21-N-3 および21-N-9（21-N-9はアメリカンタイプカルチャーコレクション，Rockville Maryland，に1997年３月26日付けで寄託し、ATCC No CRL12329として受託された）を4.2kDaβ−アミロイドタンパク質産生の発展および更に特徴付けに用いる。 ^* Ａβ＝4.2kDaβ−アミロイドタンパク質表４に示される4.2kDaβ−アミロイドタンパク質およびＣ−末端断片に対応する免疫沈降し得る放射能は、ホスホリメージャーを用いて定量され、そして細胞のタンパク質の量に標準化する。表４における単位は、面積（mm²）／μgタンパク質である。実施例７ 4.2kDaβ−アミロイドタンパク質の酵素リンクイムノアッセイ(ELISA)分析 4.2kDaβ−アミロイドタンパク質を、トレーサーとしてビオチン化Ａβ１−28 および4.2kDaβ−アミロイドタンパク質のアミノ酸13とアミノ酸22の間に位置するエピトープに結合し、1101.1と命名したモノクローナル抗体を用いる競合ELIS Aで測定する（図５参照）。全4.2kDaβ−アミロイドタンパク質を次のように測定する：96穴マイクロタイターMaxisorbプレート（Nunc，Rochester New York）を200μl／ウェルの0.1Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液で希釈した2.4μg／ml Fc特異的ヤギ抗−マウスIgG(Sig ma，M-3534，St．Louis，Missouri)でコートし、37℃で２時間インキュベートする。次いで、ウェルをリン酸緩衝液塩液（PBS）またはPBS／0.05％トゥイーンポリオキシエチレンソルビタン−20（４×250μl）で洗浄する。ウェルを洗浄後、 200μl PBS、0.05％トゥイーン、PBS中の１％BSA（PBS/トゥイーン／BSA）または１％ウシ血清アルブミンを各ウェルに添加して37℃で１時間インキュベートする。溶液をプレートから取り除き、プレートにウェルあたり100μlのモノクローナル抗体1101.1（PBS／トゥイーン／BSA中2.5μg／mlの濃度）を添加する。各ウェルに100μl／ウェルの細胞上澄み液（試料を含むかまたは含まない）または緩衝液Ａ中に0.4〜100nMの範囲の濃度(0.1〜25nMの最終濃度を生じ、標準は20％イソプロパノールに溶解した１mg／ml原液から調製し、−20℃で保存する)に希釈した100μl／ウェルのＡβ１−40ペプチドまたはＡβ１−42のペプチド（Bachem， King of Prussia，Pennsylvania）の何れかを添加する。次いで試料をELISAアッセイ培地［DMEM(Gibco 041-01965M)，１％非必須アミノ酸，2.5mM Ｌ−グルタミン，0.5Ｍピルベート酸，１％ペニシリン，１％ストレプトマイシン，0.2％ウシ血清アルブミン（BSA ，シグマA3296、プロテアーゼを含まないまたはCalbiochem 126609）］中で希釈し、そして４℃で一晩インキュベートする。各試料に、50μl／ウェルの、PBS／トゥイーン／BSA中における８〜12ng／ml の濃度のビオチン化Ａβ１−28トレーサー（Neosystem）を添加し、試料を４℃ で１時間インキュベートする。次いで試料を含有するマイクロタイターディッシュを逆さにしてペーパータオル上で乾かす。200μl／ウェルのPBS／トゥイーン／BSA中にて１：3,000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Zymed，South San Francisco，California 43-4323）を乾燥マイクロタイターディッシュに添加する。次いで試料を４℃で１時間インキュベートする。試料をインキュベートした後、ウェルをPBS＋0.05％トゥイーン20(PBS／トゥイーン)で洗浄する(５×200μl)。洗浄の次に、200μl／ウェルのテトラメチルベンジジン(TMB)（Sigma T-5525）をウェルに添加する。次いでマイクロタイターディッシュを15分間〜１時間室温でインキュベートする。試料のインキュベーションは100μl／ウェルの2.5Ｍ H₂SO₄で反応を停止させることによって終了させる。試料の吸光度₄₅₀を測定する。実施例８Ａβ１−40ペプチドおよびＡβ１−42ペプチドの酵素リンクイムノアッセイ（EL ISA）Ａβ１−40ペプチドおよびＡβ１−42ペプチドを、捕集抗体としてmAb 1101.1 およびウサギ抗血清ＢＡ＃１、Ａβ１−40ペプチドのＣ−末端に結合するmAb 17 02.1またはＡβ１−42ペプチドのＣ−末端に結合するmAb 108.1のいずれかを用いるサンドイッチELISAによって測定する。RIAおよびELISAに使用する抗体により認識されるＡβペプチドのエピトープを表５に示す。１．Ａβ１−40ペプチドのサンドイッチELISA 各ウェルに、100μl／ウェルの分析すべき細胞の上澄み、または100μlの0.01 37ng／ウェル〜10ng／ウェルの範囲の濃度のＡβ１−40ペプチドもくしはＡβ１ −42ペプチド（Bchem，King of Prussia，Pennsylvania）の何れかを添加する。標準を、細胞培養培地と同じであるELISAアッセイ培地［DMEM（Gibco 041-01965 M），１％非必須アミノ酸，2.5mM Ｌ−グルタミン，0.5Ｍピルベート酸，１％ペニシリン，１％ストレプトマイシン，0.2％ウシ血清アルブミン(シグマA3296、プロテアーゼを含まないまたはCalbiochem 126609)］中において調製する。ウェルを４℃で一晩インキュベートする。一晩のインキュベーション後、プレートを PBS／トゥイーンで洗浄し(３×ウェル当たり250μl)、そして100μl／ウェルのP BS／トゥイーン＋0.1％BSAにて１：2,000〜１：4,000に希釈したＢＡ＃１ウサギ抗血清を各ウェルに添加する。次いでマイクロタイタープレートを37℃で２時間インキュベートする。インキュベーション後、ウェルをPBＳ／トゥイーンで洗浄し（３×250μl）、マウス血清タンパク質と予め吸着させ、PBS／トゥイーン／B SAにて１：3,000または１：5,000に希釈した100μl／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ロバまたはヤギ抗−ウサギIgGを添加する。次にマイクロタイタープレートを37℃で２時間インキュベートし、そしてPBS／トゥイーンで洗浄する(３×ウェル当たり250μl)。各ウェルに、100μl／ウェルの新規調製または予め作成したTMB基質(Sigma T-5525，St．Louis，Missouri)（１個の１mg錠を１ml のDMSOに溶解させ、次いで９mlのリン酸−クエン酸緩衝液（２mMの二塩基性リン酸ナトリウム，0.1Ｍクエン酸，pH5.0）を添加することにより調製）を添加し；使用する直前に10mlの基質溶液に対して２μlの新鮮な30％H₂O₂を添加する。約７分後(発色に必要なため)、100μl／ウェルの2.5Ｍ H₂SO₄を添加して反応を停止させ、450nmで吸光度を読みとる。２．Ａβ１−42ペプチドのサンドイッチELISA PBSに希釈した４μg／mlの精製mAb 1101.1の溶液を100μl／ウェル含有する96 穴マイクロタイタープレートを、一晩４℃でインキュベートする。このインキュベーション後、マイクロタイタープレートをPBS／トゥイーンで洗浄し(３×ウェル当たり250μl)、ウェルを125μl／ウェルのBSA中0.5％BSAで１時間37℃でブロックする。次いでブロックしたウェルをPBS／トゥイーンで洗浄し（３×ウェル当たり250 μl）、そして100μl／ウェルの培地またはアッセイ培地で希釈したペプチド標準（Ａβ１−42ペプチド，Bchem，King of Prussia，Pennsylvania）を各ウェルに添加する。プレートを覆い、次に４℃で一晩インキュベートする。一晩のインキュベーションの後、マイクロタイタープレートをPBS／トゥイーンで洗浄し(３ ×ウェル当たり250μl)、そしてPBS／トゥイーン＋0.1％BSA中において0.5mg／m lアリコート〜0.75μg／mlに希釈した100μl／ウェルのビオチン化mAb 108.1を各ウェルに添加する。次にプレートを37℃で２時間または室温で４時間インキュベートする。このインキュベーションの後、マイクロタイターディッシュをPBS ／トゥイーンで洗浄し（３×ウェル当たり250μl）、PBS／トゥイーン／BSAにて１：10,000または１：20,000に希釈した100μl／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを添加する。次に試料を、PBS／トゥイーンで洗浄する(３×ウェル当たり250μl)前に、室温で15分または30分間インキュベートする。洗浄したウェルに、１個の１mg錠を１mlのDMSOに溶解させ、次いでそれに９mlのリン酸−クエン酸緩衝液(0.2Ｍの二塩基性リン酸ナトリウム，0.1Ｍクエン酸，pH5.0)を添加することにより調製した100μl／ウェルの新規調製TMB基質を添加し、そして使用する直前に10mlの基質溶液に対して２μlの新鮮な30％H₂O₂を添加する。約７分後(発色に必要なため)、100μl／ウェルの2.5Ｍ H₂SO₄を添加して反応を停止させ、450nmで吸光度を読みとる。 21-N-3および21-N-9の細胞により産生した種々の形態の4.2kDaβ−アミロイドタンパク質を、全4.2kDaβ−アミロイドタンパク質、Ａβ１−40ペプチドおよびＡβ１−42ペプチドに対して選択的なELISAを用いて定量する。これらの３つのアッセイに対する典型的な標準曲線を図６に示す。4.2kDaβ−アミロイドタンパク質は、DMEMおよび0.2％BSAを用いてアッセイ培地中で収集し、濃縮工程なしに直接アッセイする。異なる細胞系で測定したペプチドレベルを表５に示す。21-N -3および21-N-9は共に、CP-7細胞の10〜15倍の4.2kDaβ−アミロイドタンパク質を分泌した。これらの細胞系における分泌速度は、細胞を96穴プレート(約４cm² の表面積)においてウェル当たり0.5〜１×10⁵細胞の密度で培養する場合、４時間で100μlの培地当たり約５ngの（全）4.2kDaβ−アミロイドタンパク質と目算される。２つの細胞系を、培養において時間とともに分泌される4.2kDaβ−アミロイドタンパク質の量を測定し、次に凍結保存物からこれらの細胞系を再度確かめることにより、これらの安定性について分析する(図７)。4.2kDaβ−アミロイドタンパク質産生のインヒビターの同定のためのこれら細胞系の使用は、CP-6細胞系を使用して既に同定した化合物を用いて立証される（図８）。表５は、細胞系から分泌された4.2kDaβ−アミロイドタンパク質の異なる形態の評価を示す。 ^* Ａβ＝4.2kDaβ−アミロイドタンパク質表５においてデータを得るために、細胞を５×10⁵細胞／ウェルの密度で６穴ディッシュにおいて培養する。翌日の培地を２mlの0.2％BSA含有DMEMアッセイ培地と置き換える。４時間後、培地を収集して、−20℃で保存し、上述の３つのEL ISAを用いて4.2kDaβ−アミロイドタンパク質についてアッセイする。図５は、抗体、1101.1、ＢＡ＃１および108.1により認識される4.2kDaβ−アミロイドタンパク質のエピトープを図で説明している。上述の方法におけるmAb 108.1をmAb 1702.1（1.75μg／ml）に置き換えることにより、Ａβ１−40についてサンドイッチELISAを実施する。実施例９ 4.2kDaβ−アミロイドタンパク質生成におけるインヒビターの効果推定のインヒビターをDMSO中に溶解し、0.2％BSA含有RIAアッセイ培地にて希釈する。21-N-9細胞を推定のインヒビターの存在下に５時間インキュベートする。５時間後、培地を収集し、そして4.2kDaβ−アミロイドタンパク質レベルを上述のような先の濃縮なしにRIAにより測定する。結果を図８に示す。提供されたデータは２回の分析の平均である。実施例 10 高処理能アッセイ 21-N-9細胞（約４×10⁵細胞／mlの濃度の200μl原液）を96穴マイクロタイタープレート（Costar）中の培養培地（DMEM／NUT MIX F-12(Gibco／ BRL，Gaithersbrug，Maryland)）に植え付ける。マイクロタイタープレートを５％CO₂中において37℃で一晩インキュベートする。次いで細胞をPBSで洗浄する( １×200μl)で洗浄する。ウェルに、10μlの20×インヒビター溶液（DMSOに溶解）および190μlのアッセイ培地（MEM(Gibco／BRL，Gaithersbrug，Maryland)，１％非必須アミノ酸，2.5mM Ｌ−グルタミン，0.5mMピルベート，１％ペニシリン，１％ストレプトマイシンおよび0.2％ウシ血清アルブミン(BSA，Calbiochem ，La Lolla，California)）を添加する。次いでマイクロタイタープレートを５％CO₂、37℃で４時間インキュベートする。4.2kDaβ−アミロイドタンパク質のレベルを、実施例７に示された手法を用いて評価する。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Improved assay for β-amyloid processing Field of the invention The present invention provides eukaryotic cells useful for identifying β-amyloid processing inhibitors. On the design, construction and use of cell systems. In particular, the present invention relates to a 4.2 kDa β-amyloid protein In vitro assays capable of identifying or quantifying proteins. The present invention Also useful are eukaryotic cell lines and the identification of β-amyloid processing inhibitors. And proteins for the design, construction and use of and in vitro assays Provide molecules. Related application references This application filed February 24, 1997 with the name “β-amyloid processing April 2, 1997 for US Patent Application No. 08 / 804,971 to "Improved Assay". An improvement in the processing of β-amyloid, which is a continuation-in-part application Application was filed on February 24, 1997. No. 08 / 804,971, filed under the title "Processing of β-Amyloid Part of a continuation of the "Improved Assays". Background of the Invention Alzheimer's disease has become a serious health problem. More than 5% of the US population And over 15% of the US and 85-year-olds are afflicted with some form of Alzheimer's disease (Cross, Eur. J. Pharmacol. 82: 77-80 (1982); Terr. y, et al., Ann. Neurol. 14: 497-506 (1983)). Currently slowing the progress of this disease There is no really effective drug intervention or a way to diagnose this disease ( Schehr, Bio / Technology 12: 140-144 (1994); Cordell, Ann. Rev. Pharmacol . Toxicol. 34: 69-89 (1994), Incorporated by quoting). Patients with Alzheimer's disease are increasingly mental and physical It becomes physically impossible. Alzheimer's disease is characterized by the formation or deposition of β-amyloid plaques in patients. It is. Mature β-amyloid plaques are often associated with degenerate neural effects. β-a Miloid deposition is not only associated with people affected by Alzheimer's disease. And also those who are affected by other amyloidosis, such as brain damage or Down syndrome (Cordell, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34: 69-89 (1994); Pierce et al., Journal of Neuroscience, 16: 1083-1090 (1996); Roberts, Lancet 33. 8: 1422-1423 (1991); Motte and Williams, Acta Neuropathol 77: 535-546 (198 9); Mann and Esiri, Journal of the Neurological Sciences 89: 169-179 (198 9); Masters, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 4245-4249 (1985)). Β-amyloid protein isolated from plaques of neuritis patients has a 4.2 kDa β-amido protein. A self-aggregating component named Lloyd protein, or one that: Named: A4 protein (Ponte et al., Nature 311: 525-527 (1988), cited Β-amyloid peptide (Schehr, Bio / Technology 12). : 140-144 (1994), incorporated by reference), 4.2 kDa β-amyloid polypeptide. (Neve et al., Neuron 1: 669-677 (1988), incorporated by reference). Peptide or Aβ (Haass et al., Nature 359: 322-325 (1992), by reference. Amyloid B-protein or amyloid A4 (Tanzi et al., N. 331: 528-530 (1988), incorporated by reference), 4 kD amyloid beta tan Protein, βAP or 4 kD protein (Shoji et al., Science 258: 126-129 (1 992), incorporated by reference), 4.2-4.5 kd amyloid protein subunit (Wolf et al., EMBO 9.7: 2079-2084 (1990), Protein) (Weidmann et al., Cell 57: 115-126 (1989)), β-A Myloid core protein (Cordell, US Patent No. 5,221,607, incorporated by reference). Aβ1-39 peptide, Aβ1-40 peptide, Aβ1-41 peptide , Aβ1-42 peptide (Glenner and Wong, Biochem. B) iophys. Res. Comm. 120: 885-890 (1984), incorporated by reference), ( Schehr, Nature Biotechnology 15: 19-20 (1997), incorporated by reference), And Aβ1-43 peptide (Shoji et al., Science 258: 126-129 (1992); Selk oe, Science 275: 630-631 (1997), which is incorporated by reference). Aβ1- 39 peptides, Aβ1-40 peptide, Aβ1-41 peptide, Aβ1-42 peptide, The Aβ1-43 peptide contains 39, 40, 41, 42, 43 amino acids, respectively. Characterization of the cDNA encoding the 4.2 kDa β-amyloid protein was performed using the 4.2 kDa β-amyloid protein. Amyloid protein is a larger precursor protein, pre-β-amyloid Is shown to be transcribed as part of the precursor protein (APP) (Lemair e et al., Nucleic Acid Research 17: 517-22 (1989)). Three major APP tampa Plastic isoform, APP₆₉₅, APP₇₅₁And APP₇₇₀Is characterized (Co rdell, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34: 69-89 (1994)). Isoform AP P₆₉₅, APP₇₅₁And APP₇₇₀Consists of the amino acids 695, 751 and 770, respectively (Weidmann et al., Cell 57: 115-126 (1989), incorporated by reference). This These isoforms differ in splicing from the first APP RNA transcript According to APP₆₉₅Isoforms are Kunitz-type proteinase inhibitor domains Differs from the longer isoforms in that they do not contain ucleic Acids Research 172: 517-522 (1989), incorporated by reference); n, US Patent No. 5,455,169, by reference. Ponte et al., Nature 331: 525-527 (1988), incorporated by reference. Do). APP₆₉₅MRNA corresponding to the isoform is expressed preferentially in the brain. Is also different from the longer isoforms (Neve et al ., Neuron 1: 669-677 (1988)). Several APP mutations have been reported (Ashall and Goate, Trends in B iochemical Sciences, 19: 42-46 (1994), incorporated by reference); Hardy an d Allsop, Trends in Pharmalogical Sciences, 12: 383-388 (1991), cited. Incorporated by that). An example of a characterized APP variant is “Swedish FAD Double Impact Mutants ”(Mullan et al., Nature Genetics 1: 345-347 (1992), quoting "London mutant" (Van Broeckhoven, et al., Science 2). 48: 1120-1123 (1990), incorporated by reference); Levy, Science 24: 1124-11. 26 (1990), incorporated by reference);⁷¹⁷→ Isoleucine mutant (G oate et al., Nature 349: 704-706 (1991), incorporated by reference); Hardy et al., Lancet 337: 1342-1343 (1991), incorporated by reference);⁷¹⁷ → Glycine mutant (Harlan et al., Nature 353: 844-846 (1991)); valine⁷¹⁷ → Phenylalanine mutant (Murrell et al., Science 254: 97-99 (1991) ), Incorporated by reference). In each APP isoform, the 4.2 kDa β-amyloid protein is A Corresponds to the internal region starting at residue 99 from the carboxyl terminus of the PP isoform (Shoji et al., Science 258: 126-129 (1992)). The Two Lords of APP Processing Routes have been reported (see Higaki et al., Neuron 14: 651-659 (1995), Incorporated by quoting). The first route is truncation by proteolysis Resulting in the formation of a modified 8-12 kDa carboxyl-terminal fragment (Caporaso et al., P. roc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2252-2256 (1992), incorporated by reference). 8-12 kDa carboxyl terminus Fragments have been reported to be non-amyloidogenic (Seubert et al., Natu re 361: 260-263 (1993), incorporated by reference). APPs on this route Proteolytic processing is suggested to occur in a variety of cells and cell membranes (Higaki et al., Neuron 14: 651-659 (1995)). 8-12kDa carboxyl powder End fragments are probably narrowed by transmembrane transduction within the 8-12 kDa carboxyl terminal fragment. It has been reported to remain attached to cells (Cordell, Ann. Rev. Pharmacol. Tox icol. 34: 69-89 (1994)). The second processing pathway is endosome / lysosome Production of 4.2 kDa β-amyloid protein is associated with this pathway (See Higaki et al., Neuron 14: 651-659 (1995)). A cell line capable of producing 4.2 kDa β-amyloid protein has been reported (Naidu et al., Journal of Biological Chemistry 270: 1369-1374 (1995) Higaki et al., Neuron 14: 651-669 (1995), cited. To use it.) Naidu et al. And Higaki et al. Human encoding the 695 amino acid isoform of the β-amyloid precursor protein Stably transfect cDNA into Chinese hamster ovary fibroblasts Reports that the CP-6 cell line has been established. Busciglio et al., C An OS cell line (a monkey cell line containing part of the SV40 early promoter) was Transiently transfected an expression plasmid under the control of the virus promoter, Overexpressing 695 amino acid isoform of β-amyloid precursor protein (Busciglio et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 2092-2096). (1993), incorporated by reference). In addition, Haass et al. Transfected with β-amyloid precursor protein Overexpressed the 695 amino acid isoform (Haass et al. , Nature 359: 322-325 (1992)). Cordell et al. In U.S. Pat. Report stable expression of two different proteins. These tongues The proteins are amyloid protein and β-amyloid protein each having 99 amino acids. 99 and 42 amino acids, corresponding to a protein. In both cases, Use of the Kuching promoter promoted protein expression. Also, In both cases, the selectable marker (bacterial neomycin gene) is the second It was genetically linked to a different promoter (SV40 early promoter). Encodes a 695 amino acid isoform of β-amyloid precursor protein A cell line transfected with human cDNA is a β-amyloid process Used to screen inhibitors of putative pathways (Higaki et al., Neuron 14: 651-669 (1995)). Higaki and colleagues conducted a 10 cm dish (Higaki et al., Neuron 14: 651-669 (1995)). In the inhibition assay, CP-6 cells used by Higaki et al. Growth medium supplemented with 200 μl of ipeptin, 200 μl of E64, 100 μl of chloroquine, and 30 m M NH_FourCl, 30 mM NH_Four-Acetate, 30 mM methylamine, 10 μM monensin ), Grown in 10 cm dishes containing a 1: 1 mixture of 10 μM Brefeldin A (Higaki et al., Neuron 14: 651-669 (1995)). In another inhibition assay, patent application PCT / US93 / 01014 (incorporated by reference) To) APP₇₅₁Stably transfect with a vector containing the cDNA encoding the isoform. The transfected human early embryo cell line is described. This transfection Cell line is a potential 22 kDa pre-amyloid intermediate Used to screen for inhibitors. 4.2 Antibodies specific for epitopes located in the kDa β-amyloid protein Or antisera have been reported (Ponte and Cordell, US Pat. No. 5,220,013, Majocha et al., US Pat. No. 5,231,000; amyloid β antibody cat. nos. 0490-1916, 0490-1858, 0490-1857, ANAWA Biomedical Servic es & Products, Wangen Switzerland; mouse monoclonal anti-β-amyloid Depeptide (1-28), Zymed Laboratories, South San Francisco, California; Mouse anti-β amyloid monoclonal cat no. RDI-BAMYLOID, Research Diagn ostics, Inc. Flanders, New Jersey). For example, Naidu et al. 4.2 kDa β-amyloid Report of antiserum that reacts with an epitope located at the carboxyl-terminus of the protein However, Busciglio et al., Reported the short peptide region of the 4.2 kDa β-amyloid protein (28-30 (Naidu et al., Journal of B.) iological Chemistry 270: 1369-1374 (1995); and Busciglio et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 2092-2096 (1993)). In addition, 4.2 kDa β-amyloid protein Monoclonal antibodies reactive with epitopes located in proteins have been reported (Haa ss et al., Nature 359: 322-325 (1992)). Haass et al. Reported that 4.2 kDa β-amyloid Reacts to epitopes contained in the short peptide region of the protein (amino acids 1-16) Short pairs of monoclonal antibodies, 6C6, and 4.2 kDa β-amyloid protein A monoclonal antibody reactive to different epitopes contained in the peptide region, 266, (Haass et al., Nature 359: 322-325 (1992)). In addition, patents The application PCT / US93 / 01014 contains the APP₇₅₁Various areas found in isoforms A number of antibodies have been described. CP-6 (Naidu et al., Journal of Biological Chemistry 270: 1369- 1374 (1995); and cells such as Higaki et al., Neuron 14: 651-669 (1995)). An important problem with the system is the 4.2 kDa β-amylo produced by such cell lines. That is, the level of the id protein is lower than required for an automated measurement. Insufficient expression levels in cell lines such as CP-6 allow accurate and routine measurements The required cell volume is not suitable for routine high throughput screening. The present invention expresses APP protein at a level sufficient for high-throughput screening. Cell lines. High-throughput screening of inhibitors typically involves about Using a 96-well microtiter dish capable of containing cells in a volume of 250 μl Done. The capacity and surface area of a 96-well microtiter plate are limited. Cell lines that can express the desired protein at high levels are highly appreciated. Summary of the Invention The present invention relates to eukaryotic cells useful for the identification of β-amyloid processing inhibitors. On the design, construction and use of the system. More specifically, the invention relates to a 4.2 kDa β-amid It relates to an in vitro assay capable of identifying or quantifying Lloyd protein. The present invention Are also eukaryotic cell lines useful for identifying inhibitors of β-amyloid processing And proteins for the design, construction and use of and in vitro assays Provide quality molecules. The subject of the present invention is a eukaryotic cell line having an exogenous genetic construct, The gene construct consists of a sequence encoding the cytomegalovirus promoter, a strong Sequence encoding the bososome binding site, encoding β-amyloid precursor protein Sequence, a sequence encoding a selectable marker, and a polyadenylation signal Consists of an array that encodes files. Other objects of the present invention are 21-N-1, 21-N-2, 21-N-3, 21-N-4, 21-N-5, Selected from the group consisting of 21-N-6, 21-N-7, 21-N-8 and 21-N-9 or derivatives thereof. Eukaryotic cell line. Another object of the present invention is to provide 30 ng or more of 4.2 kDa β-amyloid It is a eukaryotic cell line that can produce protein molecules. Another subject of the invention is the use of 4.2 kDa β-amyloid protein in higher amounts than the CP-7 cell line. A eukaryotic cell line that produces quality molecules. Another subject of the invention is the use of 4.2 kDa β-amyloid protein in higher amounts than the CP-6 cell line. A eukaryotic cell line that produces quality molecules. Another object of the invention is to produce higher amounts of Aβ1-40 peptide molecules than the CP-7 cell line Eukaryotic cell line. Another object of the invention is to produce higher amounts of Aβ1-42 peptide molecules than the CP-7 cell line Eukaryotic cell line. Another subject of the invention is a eukaryotic cell line having an exogenous genetic construct, The gene construct is a sequence encoding the cytomegalovirus promoter, ribosome Sequence coding for the β-amyloid precursor protein Sequence, a sequence encoding a selectable marker, and a polyadenylation signal. Consists of arrays to be loaded. Another object of the invention is a cytomegalovirus promoter, ribosome Binding sites, β-amyloid precursor protein molecules, selectable markers and markers A substantially purified nucleic acid molecule encoding a rearenylation signal. The present invention Further targets are, in order, cytomegalovirus promoter, strong ribosome Binding sites, β-amyloid precursor protein molecules, selectable markers and markers A substantially purified nucleic acid molecule encoding a rearenylation signal. Another object of the invention encodes the cytomegalovirus promoter Sequence, sequence encoding a strong ribosome binding site, β-amyloid precursor protein The sequence encoding the protein, the sequence encoding the selectable marker and the polyadenylate A eukaryotic cell line having an exogenous gene construct consisting of a sequence encoding a Administer inhibitors to show inhibition of β-amyloid processing pathway Β-amyloid processing pathway consisting of quantifying protein molecules This is a method for identifying inhibitors. Other objects of the invention are (a) inhibitors of β-amyloid processing and β-amyloid processing -Eukaryotes producing protein molecules displaying inhibition of the amyloid processing pathway The cell line is incubated in a medium containing the labeled amino acid, and the eukaryotic cell line is An exogenous gene construct that stably expresses β-amyloid precursor protein molecule The exogenous gene construct contains a coding sequence for the cytomegalovirus promoter. Sequence, sequence encoding a strong ribosome binding site, β-amyloid precursor protein Quality coding sequence, selectable marker coding sequence and polyadenyl (B) separating the eukaryotic cell line from the culture solution, c) separating protein molecules from the eukaryotic cell line and the culture medium; Inhibitors of the β-amyloid processing pathway consisting of quantifying molecules It is a method of identification. The present invention further relates to (a) β-amyloid processing inhibitor and β-amyloid processing inhibitor. Eukaryotic cells produce protein molecules that display inhibition of the amyloid processing pathway Incubate the cell system, the eukaryotic cell line has the foreign gene construct, The child structure is a sequence encoding the cytomegalovirus promoter, a strong ribosome Sequence coding for the β-amyloid precursor protein Sequence, a sequence encoding a selectable marker, and a polyadenylation signal. (B) From quantifying protein molecules produced by the incubation process High-throughput assay for identifying inhibitors of β-amyloid processing It is. Brief description of drawings FIG. 1 shows the plasmid derived from the cytomegalovirus promoter of the selected plasmid. Early gene transcription enhancer / promoter and polyadenylate from SV40 virus The region between the phosphorylation signals is illustrated. FIG. 2 illustrates the construction method of pCMV-IRES-βAPP695. FIG. 3 shows a typical standard curve using RIA. FIG. 4 shows the expected pattern of the APP product (SEQ ID NO: 1). FIG. 5 shows the epitopes recognized by antibodies BA # 1, 108.1, 1702.1, 1101.1. (SEQ ID NO: 2). FIG. 6 shows the competitive ELISA method for all 4.2 kDa β-amyloid proteins, Aβ1-40 peptide. Of sandwich ELISA of Pide and sandwich ELISA of Aβ1-42 peptide Represents a standard curve. FIG. 7 shows the 4.2 kDa β-amyloid in 21-N-3 (N3) and 21-N-9 (N9) cell lines. 4 shows the stability of the protein. FIG. 8 shows an example of the 4.2 kDa β-amyloid protein production by 21-N-9 cells. 4 shows the effect of the inhibitor compound. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION I. Summary of the Invention The present invention relates to eukaryotic cells useful for identifying inhibitors of β-amyloid processing. On the design, construction and use of the system. More specifically, the present invention relates to a 4.2 kDa β- It relates to an in vitro assay that can identify or quantify amyloid protein. Book The invention also relates to inhibitors of β-amyloid processing. Design, construction and use of eukaryotic cell lines and in vitro assays useful for Provide DNA and protein molecules for use. II. Drugs and definitions As used herein, a drug may be a naturally occurring molecule or, if desired, , "Substantially purified" molecules, which have been removed or Present or present in naturally occurring preparations containing molecules present in concentrations One or more molecules that will be The agent of the present invention is characterized in that its nucleic acid hybridizes to another nucleic acid molecule due to its structural properties. Or the protein can be bound by the antibody (or It is preferably "biologically active" (competing with another molecule). Also, Such a property is the ability of a drug to be catalytic and thus mediate a chemical reaction or response. Is included. The agents of the present invention consist of cell lines, nucleic acid molecules, proteins and organic molecules. As used herein, the term “4.2 kDa β-amyloid protein” is restricted. Without showing all of the following: A4 protein, β-amyloid peptide, 4.2 kDa β-amyloid polypeptide, 4K peptide or Aβ, amyloid B-tan Protein, amyloid A4, 4 kD amyloid β-protein, βAP, 4 kD protein Protein, 4.2-4.5 kd amyloid protein subunit, β protein, β- Amyloid core protein. Further, the terms used herein include Wong et al. (Wong et al. , Proc. Nat. Acad. Sci. 82: 8729-8732 (1985), incorporated by reference) And Master et al. (Master et al., Proc. Nat. 4245-4249 (1985), by reference). Refer to the about 4 kDa protein or peptide identified by Are four peptides with slightly different amino termini by amino acid sequence analysis Mixing And the amino terminus of the three small peptides is the longest peptide In the department. As used herein, the terms “Aβ1-39 peptide”, “Aβ1-40 peptide”, “A “β1-41 peptide”, “Aβ1-42 peptide” and “Aβ1-43 peptide” Indicates a certain peptide component of the 4.2 kDa β-amyloid protein. Aβ1-39 The peptide consists of 39 amino acids and the Aβ1-40 peptide consists of 40 amino acids Aβ 1-41 peptide consists of 41 amino acids, Aβ 1-42 peptide has 42 amino acids. Aβ1-43 peptide consists of 43 amino acids. These peptides Is heterologous at the N-terminus. As used herein, the term “protein molecule” or “peptide molecule” includes five or more And all molecules containing the amino acids Proteins are, without limitation, Post-translation, such as disulfide bond formation, glycosylation, phosphorylation, and oligomerization It is known in the art to receive modifications, including modifications. Therefore, for use here The terms “protein molecule” or “peptide molecule” refer to biological or non-biological Includes all protein molecules that have been modified by The term "amino acid" It means all naturally occurring L amino acids. This definition defines norleucine, It includes ornithine and homocysteine. As used herein, the term “foreign gene construct” is naturally occurring or not. Regardless of any DNA of any origin that can be inserted into any organism is there. As used herein, the term “transfection” or “transformation” refers to eukaryotic cells. Any method of altering the DNA content of a vesicle. This is not to be limited Calcium phosphate transfection, DEAE-dextran treated trans Transfection, polybrene transfection, pro Toplast fusion transfection, electroporation transfection Liposome transfection, direct microinjection tracing Affect transfection or controlled DNA uptake as known in the art. (Sambrook, et al., Molecular Cloning 3: 16.30-16.31). (1989), incorporated by reference). As used herein, the term “stable expression” refers to the expression of a desired protein over a desired time frame. A eukaryotic cell or eukaryotic cell line that can produce a cytoplasmic molecule. As used herein, the term “efficient expression of β-amyloid precursor protein” refers to CP Expression level of β-amyloid precursor protein in higher amounts than -6 or CP-7 cell lines Means As used herein, “stable form” for all eukaryotic cells or all eukaryotic cell lines. “Transformed” or “stably transfected” are the same foreign All eukaryotes with exogenous genetic constructs that can give rise to offspring containing the sex genetic construct A cell or any eukaryotic cell line is meant. As used herein, the term “β-amyloid precursor protein” or “APP protein” “Quality” is isoform APP₆₉₅, APP₇₅₁, APP₇₇₀Or its mutant means I do. APP mutants, without limitation, Swedish FAD double mutation Body, london mutant, valine⁷¹⁷→ Isoleucine mutant, valine⁷¹⁷→ G Lysine mutant and valine⁷¹⁷→ Includes phenylalanine mutants. As used herein, the term “β-amyloid precursor protein or derivative thereof” , Β-amyloid precursor protein or β-amyloid precursor protein All longer than 5 amino acids that match any contiguous amino acid sequence contained in A protein or peptide fragment corresponding to the protein or peptide fragment You. As used herein, the term “mRNA of a sequence encoding β-amyloid precursor” or “APP mRNA” refers to all or any of the sequences encoding the β-amyloid precursor. It means all messenger RNAs that can specifically hybridize in part. As used herein, the term “sequence encoding β-amyloid precursor” or “App An array that encodes the APP₆₉₅, APP₇₅₁, APP₇₇₀Or code its mutant Means all DNA molecules that APP mutants, without limitation, Sweden FAD double mutant, London mutant, Valine⁷¹⁷→ Isoleucine thrust Natural mutant, valine⁷¹⁷→ Glycine mutant, valine⁷¹⁷→ suddenly phenylalanine Includes variants. As used herein, the term "sequence encoding an internal ribosome entry site" or Means "sequence coding for IRES" All nucleic acid sequences that allow translation of the sequence encoding As used herein, the term "encoding sequence" refers to a sequence that has particular characteristics. You. This "coding sequence" is not restricted and cannot be transcribed. Can be translated, not translated, or translated. As used herein, the term “inhibitor” refers to the term β-amyloid precursor protein. All molecules that affect processing are meant. As used herein, the term “β-amyloid precursor pathway” refers to β-amyloid precursor All biological processes or steps in the biological process of modifying proteins To taste. As used herein, the term "medium" refers to any composition capable of maintaining a desired cell. I do. As used herein, the term "sequence encoding a strong ribosome binding site" or Is the "strong Kozak coding sequence" at position -3 (relative to the ATG start codon) All ribosome binding sites with guanine at position +4 (relative to ATG start codon) The sequence encoding the position or the Kozak coding sequence. As used herein, the term "sequence encoding a weak ribosome binding site" or "weak Kozak coding sequence "is purine at position -3 (relative to the ATG start codon), position +4 (Relative value to ATG start codon) in all ribosome binding sites without guanine The coding sequence or Kozak coding sequence. As used herein, the term “high throughput assay” refers to a reaction volume of less than about 500 μl. Means an assay that can be performed in all hands. As used herein, the term binucleic acid molecule refers to an antiparallel or anticomplementary relationship between two molecules. If it is possible to form a unique double-stranded nucleic acid structure, It can be said. (A) Cell line An embodiment of the present invention is a eukaryotic cell line having an exogenous genetic construct, The gene construct is a sequence encoding the cytomegalovirus promoter, a strong ribosome. A sequence encoding a some binding site, encoding a β-amyloid precursor protein Sequence, a sequence encoding a selectable marker, and a polyadenylation signal. Consists of an array to code. Another embodiment of the present invention is a eukaryotic cell line having an exogenous genetic construct, The native gene construct is a sequence encoding the cytomegalovirus promoter, A sequence encoding a some binding site, encoding a β-amyloid precursor protein Sequence, a sequence encoding a selectable marker, and a polyadenylation signal. Consists of an array to code. The eukaryotic cell line of the present invention is capable of expressing an exogenous β-amyloid precursor protein. It can be any cell line that has a genetic construct. Of the present invention In a preferred embodiment, the eukaryotic cell line is a Chinese hamster ovary cell line, Chinese hamster ovary cell line K1, dihydrofolate reductase deficient Muster cell line, human kidney cell line, rat glial cell line, human glial cell line, Selected from the group consisting of mitotic neuroblastoma cell lines. More preferred implementation of the present invention In embodiments, the eukaryotic cell line is a Chinese hamster ovary cell line. The present invention In a further preferred embodiment, the eukaryotic cell line is a Chinese hamster ovary cell line. Vesicle system K1. The eukaryotic cell line having the foreign gene structure of the present invention uses the foreign gene structure. And all transformed or transfected cell lines You. In a preferred embodiment of the present invention, having the foreign gene construct of the present invention Eukaryotic cell lines are used for stable transformation or stable use of exogenous genetic constructs. All transfected cell lines can be used. In certain embodiments, the exogenous genetic construct is naturally occurring or otherwise. Any DNA of any origin that can be inserted into any organism, You. Preferably, the exogenous genetic construct is involved in a naturally occurring or otherwise. And any DNA of any origin that can be stably introduced into eukaryotic cells . The sequence encoding the β-amyloid precursor protein is an APP protein or Encode the derivative. In a preferred embodiment, the β-amyloid precursor protein Proteins are the three major APP protein isoforms, APP₆₉₅, APP₇₅₁And A PP₇₇₀Group consisting of "Swedish FAD double mutant", "Sudden London Variant ", valine⁷¹⁷→ Isoleucine mutant, valine⁷¹⁷→ Glycine mutation Body, valine⁷¹⁷→ APP tan selected from the group consisting of phenylalanine mutants Codes Parkin. Even better In a preferred embodiment, the sequence encoding the β-amyloid precursor protein is APP₆₉₅It can encode a Protein Isoform. The sequence encoding the selectable marker may be located in cells having the foreign gene construct. It can be any sequence that encodes a protein that facilitates identification. Like In a preferred embodiment, the sequence encoding the selectable marker is neomycin. A sequence encoding phosphotransferase, dihydrofolate reductase Coding sequence, xanthine-guanine phosphoribosyltransferase Sequence encoding aspartate transcarbamoylase, Sequence coding for denocin deaminase, coding for adenylate deaminase Sequence, sequence encoding UMP synthetase, encoding glutamine synthetase Sequence, a sequence encoding asparagine synthetase, ornithine decarboxylate A sequence encoding an enzyme, a sequence encoding a thymidine kinase, an aminoglycoside A sequence encoding the enzyme phosphotransferase, hygromycin B phospho Group consisting of a sequence encoding transferase and a sequence encoding CAD (Eg, Sambrook et al., In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 16.8-16.15, Cold Spring Harbor Press (1989). Incorporated; Old and Primrose, In Principles of Gene Manipulation, 307-310. (1994), incorporated by reference). In a further preferred embodiment, the selection Selectable marker is encoded by the neomycin phosphotransferase gene Is done. The sequence encoding the promoter of the present invention may be a transfected eukaryotic In cell lines, high levels of β-amyloid precursor coding mRNA or Is the transcription required to enable stable expression of the 4.2 kDa β-amyloid protein Any promoter containing an enhancer sequence. In a preferred embodiment, the sequence encoding the promoter is an immediate-early gene gene. Totomegalovirus promoter and linked transcriptional enhancer element (Boshart et al., Cell 41: 521-530 (1985), incorporated by reference). Departure In an even more preferred embodiment, the sequence encoding the promoter is Boshar t et al., Cell 41: 521-530 (1985), as shown in FIG. It corresponds to the -14th place. In eukaryotic gene expression, RNA polymerase II is the site where the termination signal is present. Transcribe beyond the rank. Sequence elements at the polyadenylation site are recognized, and Polyadenylation occurs. As a result, site-specific cleavage and polyadenylation This forms the 3 'end of the mature mRNA. Two different elements are accurate and efficient Often required for polyadenylation. (1) Position downstream of the polyadenylation site GU or U-rich sequences to be placed and (2) Wickens and Stephenson, Sambrook et al. Thus, the described highly conserved sequence of 6 nucleotides (Wickens and Stephenson, Scie nce 226: 1045-1051 (1984), incorporated by reference, Sambrook et al., 16: 6. , In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1 989), cited.) The sequence encoding the polyadenylation signal of the present invention provides an accurate and efficient polyadenylation signal. Any coding sequence required for denylation. In a preferred embodiment, The sequence encoding the polyadenylation signal is from SV40. Further preferred implementation In one embodiment, the sequence encoding the polyadenylation signal of the invention comprises Wickens (Wickens and Stephenson, Science 226: 1045-1051 (1984)). In a more preferred embodiment, the polyadenylation signal is Contains transcription termination signal. The β-amyloid precursor protein of the present invention may comprise any β-amyloid precursor protein. A precursor protein or a derivative thereof. In a preferred embodiment of the present invention, β-amyloid precursor protein or a derivative thereof has the isoform APP₆₉₅, APP₇₅₁, APP₇₇₀Or a mutant thereof. β-amyloid Potential mutants of the precursor protein are, without limitation, Swedish FAD double mutant, London mutant, Valine⁷¹⁷→ Isoleucine mutation Body, valine⁷¹⁷→ Glycine mutant, valine⁷¹⁷→ Phenylalanine mutant including. In a further preferred embodiment, the β-amyloid precursor protein of the invention Quality is APP₆₉₅It is. An embodiment of the present invention provides a 4.2 kDa β-ad with higher amounts than the eukaryotic cell line CP-6 or CP-7. A eukaryotic cell line that produces a myloid protein is provided. An embodiment of the present invention is directed to a 4.2 kDa β-amyloidota greater than the eukaryotic cell line CP-7. A eukaryotic cell line that produces a protein is provided. In a preferred embodiment, the present invention Eukaryotic cell line is 4.2 kDa β-amyloid protein, which is more than twice the eukaryotic cell line CP-7 Produce quality. In a more preferred embodiment, the eukaryotic cell line of the invention is a eukaryotic cell Produces a 4.2 kDa β-amyloid protein that is more than four times that of line CP-7. Even more In a preferred embodiment, the eukaryotic cell line of the present invention is more than 6 times the eukaryotic cell line CP-7. Produce 4.2-kDa β-amyloid protein. In a particularly preferred embodiment, the eukaryotic cell line of the invention comprises (i) the eukaryotic cell line CP-7 Produces a 4.2 kDa β-amyloid protein that is more than 8 times greater than (ii) eukaryotic Produces 4.2-kDa β-amyloid protein that is more than 10 times greater than cell line CP-7, or (Iii) Suitable for high throughput assays. Embodiments of the present invention produce higher amounts of Aβ1-40 peptide than the eukaryotic cell line CP-7. To provide eukaryotic cell lines. In a preferred embodiment, the eukaryotic cell line of the invention Produces Aβ1-40 Peptide More Than Twice as Eukaryotic Cell Line CP-7 I do. In a more preferred embodiment, the eukaryotic cell line of the invention comprises the eukaryotic cell line CP-7. Produces more than three times the Aβ1-40 peptide. In a further preferred embodiment The eukaryotic cell line of the invention has 3.5 times more Aβ1-40 peptide than eukaryotic cell line CP-7 To produce Embodiments of the present invention produce higher amounts of Aβ1-42 peptide than the eukaryotic cell line CP-7. To provide eukaryotic cell lines. In a preferred embodiment, the eukaryotic cell line of the invention It produces more than twice the Aβ 1-42 peptide than the eukaryotic cell line CP-7. More favorable fruit In embodiments, the eukaryotic cell line of the invention comprises more than three times Aβ1 as the eukaryotic cell line CP-7. Produces -42 peptide. In a further preferred embodiment, the eukaryotic cell line of the invention Produces more than four times the Aβ 1-42 peptide than the eukaryotic cell line CP-7. Especially preferred In a preferred embodiment, the eukaryotic cell line of the invention has more than 6-fold greater A than eukaryotic cell line CP-7. Produces β1-42 peptide. An embodiment of the present invention relates to the determination or quantification by RIA Provides a eukaryotic cell line that produces more than about 30 ng of 4.2 kDa β-amyloid protein I do. In a more preferred embodiment of the present invention, the eukaryotic cell line of the present invention is Measured or quantified by more than about 40 ng of 4.2 kDa β-amino acid per mg of protein. Produces Lloyd protein. In a further preferred embodiment of the present invention, the invention Eukaryotic cell line is approximately 50 ng / mg protein as determined or quantified by RIA Produces more 4.2 kDa β-amyloid protein. Particularly preferred of the present invention In embodiments, the eukaryotic cell line of the present invention comprises, Produces more than about 60ng of 4.2kDa β-amyloid protein per mg protein . In a further preferred embodiment of the present invention, the eukaryotic cell line of the present invention is 4.2 kDa β-amylo greater than about 65 ng / mg protein by measurement or quantification Produces id protein. In a particularly preferred embodiment of the present invention, The eukaryotic cell line has about 70 ng / mg protein as determined or quantified by RIA. Produces a large 4.2 kDa β-amyloid protein. Embodiments of the present invention are more sensitive to cell lines that indicate CP-7 by detection by RT-PCR. Provide a eukaryotic cell line that produces relatively high amounts of APP mRNA. In a preferred embodiment, the secretion rate of the eukaryotic cell line of the present invention is such that (Surface area ~ 0.4cm^Two) At 0.5-1 × 10 per well^FiveWhen culturing at cell density Approximately 4 ng of 4.2 kDa β-amyloid protein per 100 μl of culture in 4 hours (total ) Is estimated. In a preferred embodiment, the secretion rate of the eukaryotic cell line of the invention is Place cells in a 96-well plate (surface area ~ 0.4 cm^Two) At 0.5-1 × 10 per well^FiveCell density About 5 ng of 4.2 kDa β-amyloid per 100 μl of culture in 4 hours. Protein (total). The consensus sequence for translation initiation by eukaryotic ribosomes is GCCGCCA^-3/ GCCA¹UGG^Four (SEQ ID NO: 3), (Kozak, M.J. Cell. Biol. 108: 229-241 (1989)). Sambrook et al., 16.16, In Molecular Clonjng: A Laborator. y Manual, Cold Spring Harbor Press (1989), incorporated by reference). . For practical purposes, translation initiation by eukaryotic ribosomes is labeled -3 and +4. Was considered “strong” or “weak” due to the location considered. Have been. Therefore, position -3 is purine (A or G) and position +4 is guanine. Weak An example of a sequence encoding a bososome binding site or a sequence encoding a weak Kozak is Β-actin promoter present in CP-6 cells as used by Higaki et al. ー and APP₆₉₅(5′-CCCCGATGC-3 ′) (SEQ ID NO: : 4) (Higaki et al., Neuron 14: 651-669 (1995)). The sequence encoding the ribosome binding site of the present invention is translated by a eukaryotic ribosome. Is an arbitrary sequence to be started. In a preferred embodiment of the present invention, The sequence encoding the ribosome is the sequence encoding the strong ribosome binding site. . In a further preferred embodiment, the arrangement encoding the ribosome binding site of the present invention. The sequence was found in the following sequence: 5'-TTTTCAAAGCTTACCATGCTGCCCGGTTTGCACTG -3 '(NO: 5). The sequence encoding the IRES of the present invention contains a single mRNA transcript and a single promoter. A sequence encoding a β-amyloid precursor protein or a derivative thereof And any sequence that facilitates translation of the sequence encoding the selectable marker. . In a preferred embodiment of the invention, the sequence encoding IRES is human β-amido. 695 isoform of Lloyd precursor protein and bacterial neomycin Promotes translation of the transferase-encoding sequence. More preferred of the present invention In one embodiment, the sequence encoding the IRES of the invention comprises the encephalomyocarditis virus IRES. (Ghattas et al., Molecular and Cellular Biology 11.12: 5848-5859 (1991), incorporated by reference). In a particularly preferred embodiment of the present invention, one cytomegalovirus promoter And the sequence encoding the β-amyloid precursor protein A sequence encoding a selectable marker can be co-expressed. (B) nucleic acid molecule The subject of the present invention is, in order, cytomegalovirus promoter, ribosome binding Site, β-amyloid precursor protein, selectable marker and polyadenylation A substantially purified nucleic acid molecule that encodes a nucleic acid signal. Another subject of the present invention is, in order, a cytomegalovirus promoter, a strong ribosome Binding site, β-amyloid precursor protein, selectable markers and A substantially purified nucleic acid molecule encoding a rearenylation signal. Another object of the invention is a cytomegalovirus promoter, ribosome Binding site, β-amyloid precursor protein, IRES, selectable marker and A substantially purified nucleic acid molecule that encodes a polyadenylation signal. Another subject of the present invention is, in order, a cytomegalovirus promoter, a strong ribosome Binding site, β-amyloid precursor protein, IRES, selectable markers and And a substantially purified nucleic acid molecule encoding a polyadenylation signal. Further, any of the exogenous gene constructs of the present invention described above is a nucleic acid molecule of the present invention. Is understood. Further, any exogenous gene construct of the present invention may be substantially purified. It is understood that they may be biologically active. One skilled in the art will appreciate the construction, manipulation, and manipulation of macromolecules (e.g., DNA molecules, plasmids, etc.). Isolation, and specific conditions for recombinant production, clone screening and isolation. References describing standard procedures and procedures (eg, Sambrook et al., In Molecula r Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989), cited Is well known. (C) Antibody One embodiment of the present invention relates to antibodies, single-chain antigen binding molecules, or all β-amylo Id precursor protein or derivatives thereof and analogs, fusions or fragments thereof For other proteins that specifically bind to the piece. Antibodies or peptides used here Can bind to β-amyloid precursor protein or Compete for the presence of its derivatives and their analogs, not fusions or fragments If not completely inhibited, all β-amyloid precursor proteins or their induction Say "specifically binds" to conductors and their analogs, fusions or fragments . One skilled in the art will describe certain conditions and techniques for constructing, manipulating, and isolating antibodies. Standard method materials are well known (eg, Harlow and Lane, In Antibodies : Refer to A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press (1988) Incorporated in). Any β-amyloid precursor protein or derivative thereof and Antibodies that specifically bind to its analogs, fusions or fragments use such techniques. Can be prepared. β-amyloid precursor protein or its derivative and its analog fusion Preferred examples of antibodies or antisera that specifically bind to a fragment or fragment include: : Monoclonal antibody 1101.1 (1101.1 was from April 25, 1997, American Tissue Type Collection, deposited at Rockville, Maryland, granted ATCC No HB12347 ), 1702.1 (1702.1 was collected on June 3, 1997, American Tissue Type Collection) , Rockville, Maryland, ATCC No HB12363) 108.1 (108.1 June 3, 1997, American Tissue Type Collection, Ro ckville, Maryland, ATCC No HB12362), antiserum BA # 1, BA # 2, amyloid β antibody cat. nos. 0490-1916, 0490-1858, 0490-1857 (ANAWA Biomedical Services & Products, Wangen Switzerland); Clonal anti-β-amyloid peptide (1-28) (Zymed Laboratories, South) San Francisco, California); mouse anti-β amyloid monoclonal cat no . RDI-BAMYLOID, Research Diagnostics, Inc. Flanders, New Jersey). β- Amyloid precursor protein or its derivative and Particularly preferred are antibodies or antisera that specifically bind to its analogs, fusions or fragments. Good examples are selected from: monoclonal antibodies 1101.1, 1702.1, 108.1, anti- Serum BA # 1, BA # 2. (D) Display protein molecule One aspect of the invention pertains to display protein molecules. Embodiments of the present invention And protein molecules that exhibit inhibition of the β-amyloid processing pathway, All protein molecules. In a preferred embodiment of the present invention, β-amylo Protein molecules that display inhibition of the id processing pathway are Lloyd precursor protein and its derivatives. In a more preferred embodiment of the present invention Thus, protein molecules that exhibit inhibition of the β-amyloid processing pathway are , 4.2 kDa β-amyloid protein, Aβ1-39 peptide, Aβ1-40 peptide Aβ1-41 peptide, Aβ1-42 peptide, Aβ1-43 peptide, truncated The rest of the carboxyl-terminal 8-12 kDa, which is described in 99 by Cordell et al. Amino acid protein, 2 described in US Pat. No. 5,221,607, PCT / US93 / 01014 2 kDa pre-amyloid intermediate, peptides 12-39, 12-40, 12-42 described herein Α-secretase, γ-secretase and 3 It is selected from the group consisting of a 3 kDa peptide encompassing the product of B. In a more preferred embodiment of the present invention, the β-amyloid processing pathway Is a 4.2 kDa β-amyloid protein, Aβ 1-39 peptide, Aβ1-40 peptide, Aβ1-41 peptide, Aβ1-42 peptide And Aβ1-43 peptide. Another more preferred of the present invention In one embodiment, a protein displaying inhibition of the β-amyloid processing pathway Protein molecules include a 4.2 kDa β-amyloid protein, Aβ1-40 peptide, Aβ1 Selected from the group consisting of -42 peptides It is. In another more preferred embodiment of the present invention, the process of β-amyloid A protein molecule displaying inhibition of the signaling pathway is a 4.2 kDa β-amyloid protein. Quality. The change in composition or the pattern of the APP product is based on the α-, β-, γ-secretor 2 shows an inhibitor of ose. III. Use of the Agent of the Invention An embodiment of the present invention provides an inhibitor for eukaryotic cell lines having an exogenous genetic construct. The exogenous gene construct encodes the cytomegalovirus promoter Sequence, a sequence encoding a strong ribosome binding site, a β-amyloid precursor A sequence encoding a protein, a sequence encoding a selectable marker and a polymerase. Consisting of a sequence encoding a denylation signal; and β-amyloid process Β-amyloid comprising quantifying protein molecules that exhibit inhibition of the signaling pathway This is a method for identifying an inhibitor of the processing pathway of a protein. Another embodiment of the present invention provides (a) an inhibitor of β-amyloid processing. -And eukaryotic cell lines are incubated together to form β-cells in a medium containing labeled amino acids. Generating a protein molecule that exhibits inhibition of the amyloid processing pathway; The cell line has an exogenous genetic construct, and the exogenous genetic construct is cytomegalowill Sequence coding for the promoter of the host, sequence coding for the strong ribosome binding site A sequence encoding β-amyloid precursor protein and a selectable marker And a sequence encoding the polyadenylation signal. Gene structure is capable of stably expressing β-amyloid precursor protein molecule (B) separating the medium from the eukaryotic cell line; (c) separating the medium from the eukaryotic cell and the medium. Separating the protein molecules; and (d) quantifying the protein molecules This is a method for identifying an inhibitor of the β-amyloid processing pathway. Another embodiment of the present invention provides (a) a β-amyloid processing inhibitor. And eukaryotic cell lines to inhibit the β-amyloid processing pathway. Produce harmful protein molecules, the eukaryotic cell line has an exogenous genetic construct, The foreign gene construct is a sequence encoding the cytomegalovirus promoter, A sequence encoding a strong ribosome binding site, β-amyloid precursor protein The coding sequence, the sequence coding for the selectable marker and the polyadenylation sequence. And (b) raw in the incubation step. Β-amyloid processing consists of quantifying the protein molecules formed High-throughput assay to identify inhibitors. In another particularly preferred embodiment, the high-throughput assay of the invention comprises about 300 μl. It can be implemented or started with less volume. Other particularly more preferred implementations In one embodiment, the high-throughput assays of the invention are performed in volumes less than about 250 μl. Or you can start. In another particularly even more preferred embodiment, the present invention The bright high-throughput assay can be performed or started in a volume of about 200 μl. Understand that the capacity of the high-throughput assay of the present invention can vary during the course of the high-throughput assay Is done. As used herein, the term “implement” or “ "Start" means that all high-throughput assays require that the assay exceed a certain All reagents, cell lines or Includes biological materials or chemicals. However, the high throughput assay of the present invention The total volume of reagents, cell lines or other biological materials or chemicals used It is understood that the capacity can be exceeded. In another particularly preferred embodiment, the high throughput assays of the present invention comprise about 1 cm^-2 It can be performed with less surface area. Other particularly more preferred implementations In one embodiment, the high-throughput assay of the present invention comprises about 0.6 cm^-2With less surface area Can be In other particularly even more preferred embodiments, the high throughput of the invention Capacity assay is about 0.4cm^-2It can be performed with less surface area. Used here , "Surface area" refers to the area of physical contact with a eukaryotic cell line. Incubation of eukaryotic cells in the absence of an inhibitor of the invention is optional. And any suitable conditions for cell growth or maintenance. Of the present invention Incubation of eukaryotic cells with inhibitors of beta-amyloid processing Can be for any length of time and under any suitable conditions for cell growth or maintenance. . In a preferred embodiment of the high-throughput assay of the invention, β-amyloid Β-amyloid generates protein molecules that exhibit inhibition of the processing pathway Incubation of processing inhibitors with eukaryotic cell lines is approximately 1 hour It can be carried out for up to about 20 hours. More preferred for high throughput assays of the invention In a preferred embodiment, the method is indicative of inhibition of the β-amyloid processing pathway. Inhibitors of β-amyloid processing to generate protein molecules and eukaryotic cells Incubation of the vesicle system can be performed between about 2 hours to about 10 hours. . In a particularly preferred embodiment of the high throughput assay of the present invention, β-amyloid -Amyloid Generates Protein Molecules Displaying Inhibition of the Protein Processing Pathway Incubation of inhibitors of eukaryotic processing with eukaryotic cell lines is approximately 3 Between about 5 hours and about 5 hours. Any conventional 96-well polystyrene used in diagnostic laboratories and tissue culture Microtiter dishes can be used in the present invention. Polystyrene Synthetic methods are known in the art and are described, for example, in Byrdson, J.A. Plastics Materials, 5th edition, Butterworth Heinemann, London (1991), where Incorporated by reference; Maxisorbo plate (Nunc, Rochester, New York) Such articles are disclosed in articles on plastics and polymers such as. Protein molecules displaying inhibition of the β-amyloid processing pathway of the invention Can be measured or quantified using any technique known in the art. Wear. For example, any of the broadly listed immunoassays (Harlow and Lane, Antib odies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988), quoting Incorporated by Fackrell, J .; Clin. Immunoassay 8: 213-219 (1985) And Yolken, R.H., Rev. Infect. Dis. 4:35 (1982), quoting Incorporated by Collins, W.P., In Alternative Immunoassays, John Wiley & Son. s, NY (1985), incorporated by reference; Ngo, T.T. et. al., In Enzyme Mediat ed Immunoassay, Plenum Press, NY (1985), incorporated by reference). Can be used for purpose. The simplest immunoassay is simply an antibody that can bind to a predetermined target molecule Incubating with a sample suspected of containing the target molecule . The presence of the target molecule depends on the presence and concentration of all antibodies bound to the target molecule. Will be determined. Separation of target-bound antibodies from initially unbound antibodies For ease, a solid phase is typically used. Thus, for example, if the sample is And after washing with the antibody the carrier is washed to Bound antibodies can be removed. In more advanced immunoassays, the concentration of the target molecule is determined by binding the antibody to the carrier. And then contact the carrier with the sample suspected of containing the target molecule. To be determined. Target molecules that have begun to bind to immobilized antibodies can be Can be detected. For example, it can bind to a secondary epitope on the target molecule. The carrier can be incubated in the presence of a labeled secondary antibody. Therefore The immobilization of the labeled antibody on the carrier requires the presence of the target, which is It depends on the target concentration. In another assay, the target is a sample and a well-known Incubate with the amount of labeled target. The presence of the target molecule in the sample Compete with labeled target molecules for body binding sites. Therefore, binding to the antibody The amount of labeled target molecule that can form is inversely proportional to the concentration of the target molecule in the sample. In general, immunoassays involve radiolabeling ("RIA") or enzyme labeling ("E LISA ”). RIA is simple, sensitive and easy to use Have the advantage. Radiolabels are labels of relatively small atomic size, usually Does not affect the response speed. However, such an assay is Due to the attenuation of the tope, the reagent has a short shelf life, requires special handling and processing, And the disadvantage of requiring the use of complex and expensive analytical equipment. RI A: Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, Work, T.S. et. al., North Holland Publishing Company, NY (1978) The chapter title “An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques” ", Chard, T., which is incorporated herein by reference. Allows many detection methods such as colorimetry, pH, outgassing, etc. to be used for assay quantification. Can be performed on less expensive equipment, using a myriad of separate enzymes. This has the advantage of: In addition, enzyme reagents have a relatively long shelf life and use of RIA There is no danger of radiation contamination associated with ELISA is ELISA and Other Solid Phase Imm unoassay (Kemeny, D.M. et. al., Eds.), John Wiley & Sons, NY (1988), incorporated herein by reference. You. Level (ie, a protein displaying inhibition of the β-amyloid processing pathway) Inhibition of the β-amyloid processing pathway The expression rate, degradation rate, stability, etc. of protein molecules that display It is understood that it is possible. The following examples illustrate the invention and those skilled in the art will make and use it. There is to help. The examples do not limit the scope of the invention in any way. Not. Example 1 Human APP₆₉₅Cloning Human APP₆₉₅Use 5 'and 3' primers for DNA regions encoding isoforms And amplify. The sequence of the 5 'primer is 5'-TTTTCAAAGCTTACCATGCTGCCCGGTTTGC ACTG-3 '(SEQ ID NO: 5). 5 'primer is Hind III, restriction endonucleus Aase site (underlined) and starting ATG for efficient ribosome binding (underlined / italicized) Containing a purine (adenosine) at position -3 (italic). 3 'primer sequence Is 5'-AGGCTGCTCTAGAGGGGGTCTAGTTCTGCAT-3 '(SEQ ID NO: 6). 3 'plastic The imer has an Xba I restriction endonuclease 5 nucleotides away from the stop codon. There is a site (underlined). The termination sequence is the termination sequence located in the cDNA (underlined / italicized). Matches. Polymerase chain reaction (PCR) using 5 'and 3' primers and template Plasmid β-actin-β-APP₆₉₅(SCiOS, Nova, Mountain View, Calif ornia) in combination. The PCR product was digested with Hind III and XbaI and PBluescript-SK (Stratagene, La Joll) previously digested with Hind III and XbaI a, California). Inserts are confirmed by sequencing. Example 2 APP₆₉₅Of an expression vector that enables high-level expression of Use standard molecular cloning techniques to transform the DNA vector into cells. Build a ter. This is based on the bacterial origin of replication and pUC19 (Yanisch-Peronet. Al., G. ene 33: 103-119 (1985), hereby incorporated by reference). Tamase gene, cytomegalovirus-derived immediate-early gene transcription enhancer / Promoter (Boshart, M. et. Al., Cell 41: 521-530 (1985), cited herein. Kozak KO at the 5 'end for effective ribosome binding Human APP modified to include a consensus sequence₆₉₅(Kozak, N ature 308: 241-246 (1984), which is incorporated herein by reference), encephalomyocarditis Internal ribosome entry site (IRES) from virus (Jang, et. Al., J. Vir. ology 63: 1651-1660 (1989), which is incorporated herein by reference), aminoglycols. E. coli coside phosphotransferase (neo) coli gene (Blazquez et. al., Mol. Microbiol. 5: 1511-1518 (1991), incorporated herein by reference.) And the polyadenylation signal from SV40 virus (Wickens and Stephenson, Science 266: 1045-1051 (1984), incorporated herein by reference). I do. Immediate early gene transcription enhancer / promoter from cytomegalovirus And the region of the plasmid between the polyadenylation signal from the SV40 virus and The display of the chart is presented in FIG. The cloning process is essentially as follows: digestion with SalI APP₆₉₅Remove the insert from pBluescript-SK and then use the fill-in reaction Generate blunt ends. The resulting DNA is then digested with XbaI. Agaro insert Isolate by sgel electrophoresis and then purify DNA from excised gel bands . Digest plasmid pCMV-IRES with Notl. Digested DNA is then filled and blunt Generate the ends. Next, the filled DNA Digest with XbaI. Human APP₆₉₅Ligation of insert (described above) with digested plasmid And pCMV-IRES-βAPP₆₉₅Generated. The construction method is described graphically in FIG. It is. Example 3 Stable transfection of Chinese hamster ovary cells Convert Chinese hamster ovary cells to 16 or 32 μg of pCMV-IRES-βAPP₆₉₅of Transfection by liposome-mediated DNA transfection using either And the human APP as follows₆₉₅Stable integration of transcription units for neo and neo Select only for CHO-K1 cells (American Type Culture Collection, 12 301, Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA) as usual: DMEM / NUT MIX F-12 (Gibco 041-01331M, Gaithersburg, Maryland); 1% not required Sub-amino acid; 2.5 mM L-glutamine; 0.5 mM pyruvate; 1% penicillin; 1 % Streptomycin; 10% fetal calf serum (Gibco 011-06290 (Australia)) Cultured in 150cm cells^Two70% collection before transfection on the plate Passage for 4 days to obtain the dense expected density until the day of transfection Incubate. DNA was purified using Lipofectamine reagent (GIBCO / RBRL, Gaithersburg, Maryla). nd). The cells are then transferred to the product instructions (GIBCO / RBRL, Gaithersburg, Mar. yland, incorporated by reference herein) overnight transfection And pour fresh wash media the next day. Three days after transfection, remove cells Place in medium containing 1 mg / ml geneticin and grow for 3-4 weeks . The colonies arising from the surviving cells were collected by mild trypsinization, Transfer to individual wells of a 96-well dish and grow in media without Geneticin I do. The cells are expanded and evaluated for APP mRNA expression. Example 4 Analysis of APP mRNA expression RNA was obtained from cells generated from individual isolates using RNA Now (Biogenex, San Ramon, Car ifornia) and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) Analyze the presence of human APP transcript. Reverse transcription reaction using random hexamer PCR amplification was performed using primers designed to amplify a 600 bp fragment of human APP mRNA. Mer (5 'primer: 5'-GGTGGAAGAAGAAGAAGCC-3' (SEQ ID NO: 7); 3 'ply Mer: 5'-GTGACGAGGCCGAGGAGGAAC-3 '(SEQ ID NO: 8)). Ko Ronnie is recorded for the presence and relative amount of APP compared to CP-6 cells (Table 1). reference). CP-6 is a human APP under the control of the β-actin promoter.₆₉₅Expressing CHO cells (Higaki et. Al., Neuron 14: 651-669 (1995)). In Table 1, the results of PCR indicate the relative amount of APP mRNA detected by RT-PCR, ND indicates an unmeasured value. Example 5 4.2 kDa β-amyloid protein radioimmunoassay analysis Cell lines were isolated from radioimmunoassay (RIA) and subsequent assay media for 4.2 kDa β- Reverse-phase chromatography to concentrate myloid protein yielded a 4.2 kDa β- Analyze for production of Lloyd protein. Rabbit BA # 1 antiserum and iodine The modified Aβ1-40 peptide is used in the RIA. Cells were washed with 1% FCS and Aβ pep RIA assay medium containing tide concentrate (EMEM (Gibco 041-01090M, Gaithersbrug Maryland), 1% non-essential amino acids, 2 mM L-glutamine, 1% penicillin, Incubate in 1% streptomycin) for 5 hours. Incubation After that, the RIA assay medium was removed from the cells and centrifuged at 1,500 rpm for 10 minutes. Then, freeze and store at -20 ° C. Use 1.5-2 ml of medium for Lichrolut car Tridge (Merck, New Jersey) or Sepak C18 cartridges (Waters Corp., MA ) And first 5% CH in 2 ml 0.1% TFA_ThreeWash with CN, then 2 ml of 0.1% TF 25% CH in A_ThreeWash with CN. 4.2 kDa β-amyloid protein in 2 ml of 0.1% T 50% CH in FA_ThreeElute with CN and dry by speedvac centrifugation. And then store frozen at -20 ° C. Concentrated peptide is 0.1% in 250 μl of water Redissolve in Triton-X100 + 0.1% BSA. RIA is performed as follows: Aβ1-40 peptide is purified using the chloramine T method (Amersha m, Arlington Height, Illinois)¹²⁵Label with I and place in 0.1% TFA 20% to 50% CH_ThreeC18 column using a linear gradient of CN (Vydac, Hesperia, California) )). Labeled pep Pide is 40% CH_ThreeElute with CN and store at -20 ° C. Buffer A (0.1 M sodium phosphate, pH 7.4+) was placed in a 12 x 75 mm glass tube in the following order. 100 μl BA # diluted 1: 150 in 0.1% BSA + 0.1% Triton-X100) 1 antiserum or 1% bovine serum albumin in PBS, in the absence of competing ligand Concentration required to bind 30% of the labeled peptide at 2, × 50 μl of unknown sample, buffer 0.4-100 nM in buffer A or in 1% bovine serum albumin in PBS A range of concentrations (resulting in a final concentration of 0.1-25 nM, standards were dissolved in 20% isopropanol Peptide standard (prepared from a 1 mg / ml stock solution and stored at -20 ° C). Aβ1-40 peptide, Bachem, King of Prussia, Pennsylvania), total binding (loose Buffer A or 1% bovine serum albumin in PBS for total binding) or non-specific Differential binding (1% in buffer A or PBS to determine total displacement / non-specific binding) 10 μM Aβ1-40 peptide in bovine serum albumin) and 8,000-1 50 μl of liver LC purified in buffer C to give 0.00000 cpm / tube was purified¹²⁵I -Add the Aβ1-40 peptide. The total volume of the solution is 200 μl. The solution is then vortexed and incubated at 4 ° C. overnight. ink After incubation, 50 μl of normal rabbit serum, then 800 μl of buffer A or PBS 15.8% polyethylene glycol dissolved in 1% bovine serum albumin (MW 6,000-8 , 000) to the sample. The sample is then incubated at 4 ° C. for 10 minutes. ink Following incubation, the samples are centrifuged (Sorvall T600B) at 3,200 rpm for 20 minutes. After pelleting the sample, the supernatant is aspirated to determine the radioactivity of the pellet by gamma. Measure at the counter. A typical standard curve using RIA is shown in FIG. These two transfects The results obtained from the cells resulting from the treatment are summarized in Table 1 and It represents the average of two media samples, each analyzed twice. 5 Secretion and stability of 4.2kDa β-amyloid protein Will be further evaluated for the effect of the different media. Table 2 summarizes these results. You. One cell line derived from the transfection, referred to as 21, NO is a CP-7 cell line. It is estimated to produce 10-fold 4.2 kDa β-amyloid protein, Selected. Table 2 shows that pCMV-IRES-β-APP₆₉₅Of selected CHO-K1 cells transfected with Incubation of 4.2 kDa β-amyloid protein levels in clones 3 shows the effect of the medium for the treatment. ^* Aβ = 4.2 kDa β-amyloid protein For comparison of media, cells were plated in 6-well plates (9.5 cm^Two/ Well) with confluence And cultivate until The medium was then diluted with 1% fetal calf serum (FCS), 0.2% bovine serum 1.5 ml RIA containing either Bumin (BSA) or no additive (SFM) Replace with Say's medium. Five hours later, the medium was collected and the 4.2 kDa β-amyloid protein The concentrate is concentrated for RIA measurement (as described above). Solubilized in 0.5N NaOH overnight After that, measure the protein of the cells. In addition, the 4.2 kDa β-amyloidota produced by the nine subclones of 21-N-0. Protein levels were assessed by RIA and the data are shown in Table 3. ^* Aβ = 4.2 kDa β-amyloid protein 4.2 kDa β- produced by a subclone of 21-N-0 cells assessed by RIA Amyloid protein levels are shown in Table 3. The analysis is performed as follows: Fluent 25cm^TwoFlask cells as above for 5 hours in RIA assay medium containing 1% FCS Incubate as Perform RIA on 4.2 kDa β-amyloid protein Prior to concentration from 1.5 ml of medium. In 0.5N NaOH After solubilizing the cells overnight, measure the protein of the cells. The values in Table 3 are for two measurements. It is a constant average. Example 6 Analysis of APP processing by pulse labeling and immunoprecipitation 4.2 APP processing to kDa β-amyloid protein and C-terminal fragment Levels and patterns were determined by pulse labeling and immunization of the four selected subclones. Sedimentation and comparison of those observed in parental 21-N-O cell line and CP-7 cells Study by. APP production, its processing pattern and 4.2 kDa β-amyloid protein The level of secretion is determined by Higaki et. al., Neuron 14: 651-659 (1995) Monitor by pulse-labeling and immunoprecipitation. Essentially, cells first Depletion of cysteine and methionine, followed by 35S-methionine and 35S-cis. Incubate in medium containing tein for 4 hours. 4.2kDa secreted into the medium β-amyloid protein is immunoprecipitated with BA # 2 rabbit antiserum. Fine Vesicle-bound APP peptide recognizes an epitope near the C-terminus of human APP Immunoprecipitated from cell lysate using A # 2 rabbit antiserum. Expected AP The pattern of the P product is shown in FIG. The peptides present in the medium are 4 kDa and 3 kD a product. The 4 kDa product is Aβ1-39 peptide, Aβ1-40 peptide, Aβ1-41 peptide and Aβ1-42 peptide are included. The 3 kDa peptide is α- And 3A, which is the product of γ-secretase, and 12-39, 12-40, 12-42 and And 3B including 12-43. The C-terminal fragment was found in the APP membrane and in the intracellular Includes C-terminal moieties of noic acid. In the composition or pattern of the APP product Changes indicate inhibitors of α-, β-, γ-secretase. The solubilized immunoprecipitates were separated by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, Radioactive protein is quantified using a phosphorimager. The area of each peak was determined using the control cell line CP-7 (Scios Nova, Mountain View, California). fornia) and the amount of cellular protein and labeling pattern Standardize. 4.2 kDa β-amyloid produced by selected subclones of 21-N-O cells Protein and C-terminal fragment levels were determined by pulse labeling and immunoprecipitation. Be evaluated. These results are summarized in Table 4, and two subclones, 21-N-3 And 21-N-9 (21-N-9 is the American Type Culture Collection, Rockville Deposited with Maryland, on March 26, 1997 and accepted as ATCC No CRL12329 ) Is used for the development and further characterization of the 4.2 kDa β-amyloid protein production. ^* Aβ = 4.2 kDa β-amyloid protein Corresponding to the 4.2 kDa β-amyloid protein and C-terminal fragment shown in Table 4. Immunoprecipitable radioactivity is quantified using a phosphorimer and Normalize to the amount of protein in The unit in Table 4 is the area (mm^Two) / Μg tamper Quality. Example 7 4.2 kDa β-amyloid protein enzyme linked immunoassay (ELISA) analysis 4.2 kDa β-amyloid protein was used as a tracer for biotinylated Aβ 1-28 And 4.2 kDa β-amyloid protein located between amino acids 13 and 22 ELIS using a monoclonal antibody named 1101.1 that binds to an epitope Measure with A (see FIG. 5). Measure total 4.2 kDa β-amyloid protein as follows: 96-well microtie 200 µl / well of 0.1 M Maxisorb plate (Nunc, Rochester New York) 2.4 μg / ml Fc-specific goat anti-mouse IgG diluted with sodium bicarbonate buffer (Sig ma, M-3534, St. Louis, Missouri) and incubate at 37 ° C for 2 hours You. The wells are then placed in phosphate buffered saline (PBS) or PBS / 0.05% Tween Po. Wash with Lioxyethylene Sorbitan-20 (4 × 250 μl). After washing the wells, 200 μl PBS, 0.05% Tween, 1% BSA in PBS (PBS / Tween / BSA) or Add 1% bovine serum albumin to each well and incubate at 37 ° C for 1 hour You. Remove the solution from the plate and add 100 μl / well Antibody 1101.1 (2.5 μg / ml in PBS / Tween / BSA) is added. Each way 100 μl / well cell supernatant (with or without sample) or buffer Concentrations in solution A ranging from 0.4 to 100 nM (resulting in final concentrations of 0.1 to 25 nM, standard is 20% Prepare from a 1 mg / ml stock solution in propanol and store at -20 ° C). 100 μl / well of Aβ1-40 peptide or Aβ1-42 peptide (Bachem, King of Prussia, Pennsylvania). The samples were then Say's medium [DMEM (Gibco 041-01965M), 1% non-essential amino acid, 2.5 mM L-glutami , 0.5M pyruvate Acid, 1% penicillin, 1% streptomycin, 0.2% bovine serum albumin (BSA , Sigma A3296, protease free or diluted in Calbiochem 126609)] And incubate at 4 ° C. overnight. For each sample, add 8-12 ng / ml in 50 μl / well in PBS / Tween / BSA A concentration of biotinylated Aβ 1-28 tracer (Neosystem) was added and the samples were incubated at 4 ° C. And incubate for 1 hour. Then the microtiter dish containing the sample Turn over and dry on a paper towel. 200 μl / well PBS / Tween / Horseradish peroxidase-conjugated streptoa diluted 1: 3,000 in BSA Dry virgin (Zymed, South San Francisco, California 43-4323) Add to the dish. The sample is then incubated at 4 ° C. for 1 hour. After incubating the samples, the wells were washed with PBS + 0.05% Tween 20 (PBS / Tween). (5 × 200 μl). Following the wash, 200 μl / well of tetramethyl Anzidine (TMB) (Sigma T-5525) is added to the wells. Then microtiter Incubate the dish for 15 minutes to 1 hour at room temperature. Incubation of sample 100 μl / well of 2.5 MH_TwoSO_FourTerminate by stopping the reaction with You. Sample absorbance₄₅₀Is measured. Example 8 Enzyme-linked immunoassay of Aβ1-40 peptide and Aβ1-42 peptide (EL ISA) Aβ1-40 peptide and Aβ1-42 peptide were used as mAb 1101.1 And rabbit antiserum BA # 1, mAb 17 binding to the C-terminus of Aβ1-40 peptide 02.1 or mAb 108.1 binding to the C-terminus of the Aβ 1-42 peptide. Measured by sandwich ELISA. Depending on the antibody used for RIA and ELISA Shows the epitope of Aβ peptide It is shown in FIG. 1. Aβ1-40 peptide sandwich ELISA Each well contains 100 μl / well of cell supernatant to be analyzed or 100 μl of 0.01 Aβ1-40 peptide or Aβ1 at concentrations ranging from 37 ng / well to 10 ng / well Add any of the -42 peptides (Bchem, King of Prussia, Pennsylvania). Standards were used in an ELISA assay medium [DMEM (Gibco 041-01965) that was the same as the cell culture medium. M), 1% non-essential amino acid, 2.5 mM L-glutamine, 0.5 M pyruvate, 1% Nicilin, 1% streptomycin, 0.2% bovine serum albumin (Sigma A3296, Protease free or prepared in Calbiochem 126609)]. We Incubate at 4 ° C overnight. After overnight incubation, remove the plate Wash with PBS / Tween (250 μl per 3 × well) and 100 μl / well P BA # 1 rabbit diluted 1: 2,000 to 1: 4,000 with BS / Tween + 0.1% BSA Antiserum is added to each well. Then place the microtiter plate at 37 ° C for 2 hours Incubate. After incubation, wash wells with PBS / Tween (3 × 250 μl), pre-adsorbed with mouse serum protein, PBS / Tween / B 100 μl / well horseradish peru diluted 1: 3,000 or 1: 5,000 in SA Add oxidase-conjugated donkey or goat anti-rabbit IgG. Next, the microtiter Incubate plate at 37 ° C for 2 hours and wash with PBS / Tween (3 × 250 μl per well). Add 100 μl / well of new preparation or Prepared TMB substrate (Sigma T-5525, St. Louis, Missouri) (1 mg tablet 1 ml Of DMSO, then 9 ml of phosphate-citrate buffer (2 mM dibasic phosphate). Sodium citrate, 0.1 M citric acid, pH 5.0). Immediately before use, 2 μl of fresh 30% H for 10 ml of substrate solution_TwoO_TwoIs added. about 7 After one minute (necessary for color development), 100 μl / well of 2.5 M H_TwoSO_FourStop the reaction by adding And read the absorbance at 450 nm. 2. Aβ1-42 peptide sandwich ELISA 96 containing 100 μl / well of a solution of 4 μg / ml purified mAb 1101.1 diluted in PBS Incubate the well microtiter plate overnight at 4 ° C. This incube After incubation, the microtiter plate is washed with PBS / Tween (3x wells). 250 μl per well), blot wells with 125 μl / well 0.5% BSA in BSA for 1 hour at 37 ° C. Click. The blocked wells were then washed with PBS / Tween (3 × 250 per well) μl), and the peptide standard diluted in 100 μl / well of medium or assay medium Quasi (Aβ1-42 peptide, Bchem, King of Prussia, Pennsylvania) in each well To be added. Cover the plate and then incubate at 4 ° C. overnight. Overnight Inn After incubation, the microtiter plate is washed with PBS / Tween (3 × 250 μl per well) and 0.5 mg / m in PBS / Tween + 0.1% BSA aliquots of 100 μl / well of biotinylated mAb 108.1 diluted to 0.75 μg / ml Add to each well. The plate is then incubated at 37 ° C for 2 hours or at room temperature for 4 hours. Beate. After this incubation, place the microtiter dish in PBS. / Wash with Tween (250μl per 3x well) and with PBS / Tween / BSA 100 μl / well of horseradish peroxy diluted 1: 10,000 or 1: 20,000 Add the enzyme conjugated streptavidin. The samples are then washed with PBS / Tween (3 × 250 μl per well) prior to washing Incubate at warm for 15 or 30 minutes. One 1mg tablet in the washed well Dissolve in 1 ml of DMSO, then add 9 ml of phosphate-citrate buffer (0.2 M Basic sodium phosphate, 0.1 M citric acid, pH 5.0) Add 100 μl / well of freshly prepared TMB substrate prepared by addition Immediately before use, add 2 μl of fresh 30% H to 10 ml of substrate solution._TwoO_TwoIs added. After about 7 minutes (necessary for color development), 100 μl / well of 2.5 M H_TwoSO_FourTo add Stop and read the absorbance at 450 nm. Various forms of 4.2 kDa β-amyloid produced by 21-N-3 and 21-N-9 cells The protein was expressed as a whole 4.2 kDa β-amyloid protein, Aβ1-40 peptide and Quantification is performed using an ELISA selective for the Aβ1-42 peptide. These three A typical standard curve for the assay is shown in FIG. 4.2 kDa β-amyloid protein The protein is collected in the assay medium using DMEM and 0.2% BSA and without concentration step Assay directly. The peptide levels measured in the different cell lines are shown in Table 5. 21-N -3 and 21-N-9 are both 10-15 times 4.2 kDa β-amyloid protein of CP-7 cells Secreted. The rate of secretion in these cell lines was determined using a 96 well plate (approximately 4 cm^Two 0.5-1 × 10 per well^FiveWhen culturing at the density of cells, 4 o'clock Approximately 5 ng (total) 4.2 kDa β-amyloid protein per 100 μl medium Is done. The two cell lines were transformed with a 4.2 kDa β-amino acid secreted over time in culture. Determine the amount of Lloyd protein and then reconfirm these cell lines from the cryopreservation By analyzing the results, the stability is analyzed (FIG. 7). 4.2 kDa β-amyloid The use of these cell lines to identify inhibitors of protein production is This is demonstrated using compounds already identified using the vesicle system (FIG. 8). Table 5 shows the different forms of the 4.2 kDa β-amyloid protein secreted from the cell line. The evaluation is shown. ^* Aβ = 4.2 kDa β-amyloid protein To obtain the data in Table 5, cells were 5x10^Five6 wells at a density of cells / well Culture in dish. The next day's medium was replaced with 2 ml of 0.2% BSA-containing DMEM Replace with earth. After 4 hours, the medium was collected, stored at -20 ° C, and the three ELs described above. Assay for 4.2 kDa β-amyloid protein using ISA. FIG. 4.2 kDa β-amyloidota recognized by the antibodies 1101.1, BA # 1 and 108.1 The protein epitopes are illustrated graphically. MAb 108.1 mAb in the above method By replacing 1702.1 (1.75 μg / ml) with Aβ1-40 Perform a switch ELISA. Example 9 4.2 Effect of inhibitors on kDa β-amyloid protein production The putative inhibitor was dissolved in DMSO and diluted in RIA assay medium containing 0.2% BSA. Excuse me. Incubate 21-N-9 cells for 5 hours in the presence of putative inhibitor . After 5 hours, the medium was collected and the 4.2 kDa β-amyloid protein level was increased. Measure by RIA without prior concentration as described above. FIG. 8 shows the results. sponsored Data is the average of two analyses. Example 10 High throughput assays 21-N-9 cells (about 4 × 10^Five200 μl stock solution at a concentration of cells / ml) in a 96-well microtiter Medium (DMEM / NUT MIX F-12 (Gibco / BRL, Gaithersbrug, Maryland). 5 microtiter plates % CO_TwoIncubate at 37 ° C overnight. The cells are then washed with PBS ( 1 × 200 μl). In a well, add 10 μl of 20x inhibitor solution (dissolved in DMSO ) And 190 μl of assay medium (MEM (Gibco / BRL, Gaithersbrug, Maryland), 1% non-essential amino acids, 2.5 mM L-glutamine, 0.5 mM pyruvate, 1% penicillium , 1% streptomycin and 0.2% bovine serum albumin (BSA, Calbiochem , La Lolla, California)). The microtiter plate is then % CO_TwoIncubate at 37 ° C for 4 hours. 4.2 kDa β-amyloid protein The level is evaluated using the technique described in Example 7.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号０８／９０４，２９６ (32)優先日平成９年７月31日(1997．7．31) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者コーデル，バーバラアメリカ合衆国カリフォルニア州94306. パロアルト．ベンロモンドドライブ4051 (72)発明者スカーディナ，ジャン・メアリアンアメリカ合衆国カリフォルニア州94070. サンカルロス．パールアベニュー225 (72)発明者ミシャク，ロナルド・ピーアメリカ合衆国カリフォルニア州94303. パロアルト．グリーアロード3095 (72)発明者ハギンス，ジョンイギリス国ケント州シー・ティー15・５ディー・エフ．ニアードーヴァー．サットン．チャーチヒル．ザリトリート (72)発明者プリュス，レベッカフランス国エフ―67000ストラスブール. リュードゥズーリク31 (72)発明者ラウトマン，ギーフランス国エフ―67100ストラスブール. リューデュキルケンセル４──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) // C12P 21/08 C12N 15/00 ZNAA (31) Priority claim number 08 / 904,296 (32) Priority Date July 31, 1997 (July 31, 1997) (33) Priority country United States (US) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB , GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU , AZ BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, GM, GW, HU, ID, IL, IS, JP , KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Cordell, Barbara, USA 94306, Palo Alto. Ben Lomond Drive 4051 (72) Inventor Skadina, Jean-Maryen United States 94070, California. San Carlos. Pearl Avenue 225 (72) Inventor Mishak, Ronald P. California, USA 94303. Palo Alto. Greer Road 3095 (72) Inventor Haggins, John 15.5 CTE, Kent, UK DF. Near Dover. Sutton. Church Hill. The Retreat (72) Inventor Plus, Rebecca France F-67,000 Strasbourg. Ryduzurik 31 (72) Inventor Lautmann, Guy France F-67100 Strasbourg, Rue Du Kirkensel 4

Claims

[Claims] 1. The exogenous gene construct encodes a sequence encoding a cytomegalovirus promoter, a sequence encoding a strong ribosome binding site, a sequence encoding a β-amyloid precursor protein, a sequence encoding a selectable marker, and a polyadenylation signal. A eukaryotic cell line having an exogenous genetic construct consisting of a sequence. 2. The eukaryotic cell line according to claim 1, wherein the exogenous gene construct is capable of stably expressing a β-amyloid precursor protein molecule. 3. The eukaryotic cell line of claim 1, wherein the exogenous gene construct further comprises a sequence encoding an internal ribosome entry site. 4. The eukaryotic cell line of claim 1, wherein the sequence encoding the β-amyloid precursor protein encodes a 695 amino acid isoform of a human β-amyloid precursor protein molecule. 5. The eukaryotic cell line of claim 1, wherein the sequence encoding the β-amyloid precursor protein encodes a 751 amino acid isoform of a human β-amyloid precursor protein molecule. 6. The eukaryotic cell line is a group consisting of a Chinese hamster ovary cell line, a hamster cell line lacking dihydrofolate reductase, a human kidney cell line, a rat glioma cell line, a human glioma cell line, and a rat neuroblastoma cell line. The eukaryotic cell line according to claim 1, which is selected from: 7. The eukaryotic cell line according to claim 6, wherein the eukaryotic cell line is a Chinese hamster ovary cell line. 8. The eukaryotic cell line according to claim 7, wherein the eukaryotic cell line is a Chinese hamster ovary cell line K1. 9. A sequence encoding a selectable marker, a sequence encoding neomycin phosphotransferase, a sequence encoding dihydrofolate reductase, a sequence encoding xanthine-guanine phosphoribosyltransferase, a sequence encoding aspartate transcarbamoylase, Sequence encoding adenosine deaminase, sequence encoding adenylate deaminase, sequence encoding UMP synthetase, sequence encoding glutamine synthetase, sequence encoding asparagine synthetase, sequence encoding ornithine decarboxylase, thymidine kinase A sequence encoding aminoglycosidase phosphotransferase; a sequence encoding hygromycin B phosphotransferase; Eukaryotic cell line according to claim 1 wherein is selected from the group consisting of sequences encoding CAD. Ten. The eukaryotic cell line according to claim 9, wherein the sequence encoding the selectable marker is a sequence encoding bacterial neomycin phosphotransferase. 11． The eukaryotic cell line according to claim 3, wherein the sequence encoding an internal ribosome site is a sequence encoding an internal ribosome entry site of encephalomyocarditis virus linked to a sequence encoding a β-amyloid precursor protein. 12． 12. The eukaryotic cell line of claim 11, wherein the sequence encoding the β-amyloid precursor protein encodes a 695 amino acid isoform of a human β-amyloid precursor protein molecule. 13. 12. The eukaryotic cell line of claim 11, wherein the sequence encoding the β-amyloid precursor protein encodes a 751 amino acid isoform of a human β-amyloid precursor protein molecule. 14. A sequence encoding a selectable marker, a sequence encoding neomycin phosphotransferase, a sequence encoding dihydrofolate reductase, a sequence encoding xanthine-guanine phosphoribosyltransferase, a sequence encoding aspartate transcarbamoylase, Sequence encoding adenosine deaminase, sequence encoding adenylate deaminase, sequence encoding UMP synthetase, sequence encoding glutamine synthetase, sequence encoding asparagine synthetase, sequence encoding ornithine decarboxylase, thymidine kinase. A coding sequence, a sequence coding for an aminoglycosidase phosphotransferase, a sequence coding for hygromycin B phosphotransferase, and 12. The eukaryotic cell line according to claim 11, which is selected from the group consisting of sequences encoding CAD. 15． 15. The eukaryotic cell line of claim 14, wherein the sequence encoding a selectable marker is a sequence encoding bacterial neomycin phosphotransferase. 16． The sequence encoding the strong ribosome binding site is ligated to the sequence encoding the β-amyloid precursor protein and the sequence encoding the cytomegalovirus promoter, and provides for efficient expression of the sequence encoding the β-amyloid precursor protein. The eukaryotic cell line according to claim 1. 17． 17. The eukaryotic cell line of claim 16, wherein the sequence encoding a β-amyloid precursor protein encodes a 695 amino acid isoform of a human β-amyloid precursor protein molecule. 18． 17. The eukaryotic cell line of claim 16, wherein the sequence encoding the β-amyloid precursor protein encodes a 751 amino acid isoform of a human β-amyloid precursor protein molecule. 19.21-N-1, 21-N-2, 21-N-3, 21-N-4, 21-N-5, 21-N-6, 21-N-7, 21-N-8 and A eukaryotic cell line or a derivative thereof selected from the group consisting of 21-N-9. 20. 20. The eukaryotic cell line according to claim 19, wherein the eukaryotic cell line is selected from the group consisting of 21-N-9 and 21-N-3. twenty one. 21. The eukaryotic cell line according to claim 20, wherein the eukaryotic cell line is 21-N-9. twenty two. The eukaryotic cell line of claim 1, wherein the eukaryotic cell line produces more 4.2 kDa β-amyloid protein molecules than the CP-6 cell line. twenty three. A eukaryotic cell line that can produce more than 30 ng of 4.2 kDa β-amyloid protein molecule per mg protein. twenty four. 24. The eukaryotic cell line of claim 23, wherein the eukaryotic cell line is capable of producing more than 50 ng of a 4.2 kDa β-amyloid protein molecule per mg protein. twenty five. 25. The eukaryotic cell line of claim 24, wherein the eukaryotic cell line is capable of producing more than 60 ng of 4.2 kDa β-amyloid protein molecule per mg protein. 26. 26. The eukaryotic cell line of claim 25, wherein said eukaryotic cell line is capable of producing more than 65 ng of 4.2 kDa β-amyloid protein molecule per mg protein. 27. 26. The eukaryotic cell line of claim 25, wherein the eukaryotic cell line is capable of producing more than 70 ng of a 4.2 kDa β-amyloid protein molecule per mg protein. 28. 24. The eukaryotic cell line of claim 23, wherein the eukaryotic cell line produces more 4.2 kDa β-amyloid protein molecules than the CP-7 cell line. 29. 29. The eukaryotic cell line of claim 28, wherein the eukaryotic cell line produces more than three times as many 4.2 kDa β-amyloid protein molecules as the CP-7 cell line. 30. 30. The eukaryotic cell line of claim 29, wherein the eukaryotic cell line produces more than 6-fold more 4.2 kDa β-amyloid protein molecules than the CP-7 cell line. 31. 31. The eukaryotic cell line of claim 30, wherein the eukaryotic cell line produces more than eight times as many 4.2 kDa β-amyloid protein molecules as the CP-7 cell line. 32. 32. The eukaryotic cell line of claim 31, wherein the eukaryotic cell line produces more than 8 times 4.2 kDa β-amyloid protein molecule than the CP-7 cell line. 33. 24. The eukaryotic cell line of claim 23, wherein the eukaryotic cell line produces more Aβ1-40 peptide molecules than the CP-7 cell line. 34. 34. The eukaryotic cell line of claim 33, wherein the eukaryotic cell line produces more than twice as many Aβ1-40 peptide molecules as the CP-7 cell line. 35. 35. The eukaryotic cell line of claim 34, wherein the eukaryotic cell line produces more than three times more of the Aβ1-40 peptide molecule than the CP-7 cell line. 36. 36. The eukaryotic cell line of claim 35, wherein the eukaryotic cell line produces 3.5 times more Aβ1-40 peptide molecule than the CP-7 cell line. 37. 24. The eukaryotic cell line of claim 23, wherein the eukaryotic cell line produces more Aβ1-42 peptide molecules than the CP-7 cell line. 38. 38. The eukaryotic cell line of claim 37, wherein the eukaryotic cell line produces more than twice as much Aβ1-42 peptide molecule as the CP-7 cell line. 39. 39. The eukaryotic cell line of claim 38, wherein the eukaryotic cell line produces more than four times more Aβ1-42 peptide molecules than the CP-7 cell line. 40. 40. The eukaryotic cell line of claim 39, wherein the eukaryotic cell line produces more than 6-fold Aβ1-42 peptide molecules than the CP-7 cell line. 41. A sequence encoding a cytomegalovirus promoter, a sequence encoding a ribosome binding site, a sequence encoding a β-amyloid precursor protein, a sequence encoding a selectable marker, and a sequence encoding a polyadenylation signal A eukaryotic cell line having an exogenous genetic construct comprising: 42. A substantially purified nucleic acid molecule that encodes, in order, a cytomegalovirus promoter; a ribosome binding site; a β-amyloid precursor protein molecule; a selectable marker; and a polyadenylation signal. 43. A substantially purified nucleic acid molecule encoding in order the cytomegalovirus promoter; a strong ribosome binding site; a β-amyloid precursor protein molecule; a selectable marker; and a polyadenylation signal. 44. nucleic acid molecule consisting of pCMV-IRES-βAPP _695. 45. An inhibitor is administered to a eukaryotic cell line having an exogenous gene structure, and the exogenous gene structure encodes a sequence encoding a cytomegalovirus promoter, a sequence encoding a strong ribosome binding site, and a β-amyloid precursor protein A method for identifying an inhibitor of a β-amyloid processing pathway, comprising quantifying a protein molecule comprising a sequence, a sequence encoding a selectable marker and a sequence encoding a polyadenylation signal, the protein molecule exhibiting inhibition of the β-amyloid processing pathway. 46. 46. The method for identifying an inhibitor of [beta] -amyloid processing according to claim 45, further comprising incubating the eukaryotic cell line with the inhibitor. 47. Furthermore, the sequence encoding the internal ribosome site is linked to the sequence encoding the β-amyloid precursor protein to translate the sequence encoding the β-amyloid precursor protein and a selectable marker from a single messenger RNA transcript. 47. The method for identifying an inhibitor of β-amyloid processing according to claim 46, which comprises promoting. 48. The sequence encoding the strong internal ribosome site is ligated to the sequence encoding the β-amyloid precursor protein and the sequence encoding the cytomegalovirus promoter to provide for efficient expression of the sequence encoding the β-amyloid precursor protein. A method for identifying an inhibitor of β-amyloid processing according to claim 46. 49. Cell line selected from the group consisting of Chinese hamster ovary cell line, hamster cell line deficient in dihydrofolate reductase, human kidney cell line, rat glioma cell line, human glioma cell line and rat neuroblastoma cell line 47. The method for identifying an inhibitor of β-amyloid processing according to claim 46. 50. 50. The method for identifying an inhibitor of β-amyloid processing according to claim 49, wherein the eukaryotic cell line is a Chinese hamster ovary cell line. 51. 51. The method for identifying an inhibitor of β-amyloid processing according to claim 50, wherein the eukaryotic cell line is a Chinese hamster ovary cell line K1. 52. 47. The method for identifying an inhibitor of β-amyloid processing according to claim 46, wherein the protein molecule is encoded by a sequence encoding a β-amyloid precursor protein or a derivative thereof. 53. 46. The protein molecule is selected from the group consisting of a 4.2 kDa β-amyloid protein molecule, an Aβ1-39 peptide molecule, an Aβ1-40 peptide molecule, an Aβ1-41 peptide molecule, an Aβ1-42 peptide molecule and an Aβ1-43 peptide molecule. The method for identifying an inhibitor of β-amyloid processing described above. 54. 53. The method for identifying an inhibitor of β-amyloid processing according to claim 52, wherein the protein molecule is a 4.2 kDa β-amyloid protein molecule. 55. The method for identifying an inhibitor of β-amyloid processing according to claim 54, wherein the level of the 4.2-kDa β-amyloid protein molecule is measured by immunoreplacement of the 4.2-kDa β-amyloid protein molecule using an antibody. 56. 56. The method for identifying an inhibitor of β-amyloid processing according to claim 55, wherein the antibody is a β-amyloid 1101.1 4.2 kDa-specific monoclonal antibody. 57. The eukaryotic cell line has an exogenous gene structure, the exogenous gene structure is a sequence encoding a cytomegalovirus promoter, a sequence encoding a strong ribosome binding site, a sequence encoding a β-amyloid precursor protein, selection A composition comprising a eukaryotic cell line and an inhibitor of the β-amyloid processing pathway, consisting of a sequence encoding a possible marker and a sequence encoding a polyadenylation signal. 58. The medium is incubated with a eukaryotic cell line having an exogenous gene construct, which encodes a sequence encoding a cytomegalovirus promoter, a sequence encoding a strong ribosome binding site, and a β-amyloid precursor protein. A composition comprising a medium comprising a protein molecule that exhibits inhibition of the β-amyloid processing pathway, consisting of the sequence, a sequence encoding a selectable marker, and a sequence encoding a polyadenylation signal. 59. 59. The composition of claim 58, wherein the medium having protein molecules that exhibit inhibition of the [beta] -amyloid processing pathway is essentially free of eukaryotic cell lines. 60. The medium is supplemented with a biotinylated 4.2 kDa β-amyloid protein molecule, the medium is incubated with a eukaryotic cell line and an inhibitor of the β-amyloid processing pathway, and the eukaryotic cell line has an exogenous gene construct, The construct consists of a sequence encoding a cytomegalovirus promoter, a sequence encoding a strong ribosome binding site, a sequence encoding a β-amyloid precursor protein, a sequence encoding a selectable marker, and a sequence encoding a polyadenylation signal. , A composition comprising a medium having protein molecules that exhibit inhibition of the β-amyloid processing pathway. 61. 61. The composition of claim 60, wherein the composition further comprises an antibody capable of specifically binding to a 4.2 kDa [beta] -amyloid protein molecule. 62. 62. The composition of claim 61, wherein the antibody is a β-amyloid 1101.1 4.2 kDa-specific monoclonal antibody. 63. 63. The composition of claim 61 or 62, wherein the antibody is bound to a solid phase. 64. (A) Incubating an inhibitor of β-amyloid processing with a eukaryotic cell line to produce a protein molecule displaying inhibition of the β-amyloid processing pathway in a medium containing labeled amino acids, wherein the eukaryotic cell line is exogenous. A sequence encoding a cytomegalovirus promoter, a sequence encoding a strong ribosome binding site, a sequence encoding a β-amyloid precursor protein, a sequence encoding a selectable marker And a sequence encoding a polyadenylation signal, wherein the exogenous gene construct is capable of stably expressing a β-amyloid precursor protein molecule; (b) separating the medium from the eukaryotic cell line; (c) ) Separating the protein molecules from the eukaryotic cell line and the medium; and (d) quantifying the protein molecules Inhibitor identification method of which is β- amyloid processing pathway from. 65. 65. The method for identifying an inhibitor of the β-amyloid processing pathway according to claim 64, wherein the protein molecules are separated by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. 66. The method for identifying an inhibitor of the β-amyloid processing pathway according to claim 65, wherein the labeled amino acid is selected from the group consisting of ³⁵ S-methionine, ³⁵ S-cysteine, and a mixture of ³⁵ S-methionine and ³⁵ S-cysteine. 67. 66. The method for identifying an inhibitor of the β-amyloid processing pathway according to claim 65, wherein the protein molecule is immunoprecipitated using an antibody specific to β-amyloid precursor protein. 68. 66. The method for identifying an inhibitor of the β-amyloid processing pathway according to claim 65, wherein a protein molecule from a eukaryotic cell line is immunoprecipitated by an antibody specific for epitope diagnosis against the C-terminal region of human β-amyloid precursor protein. . 69. 68. The method for identifying an inhibitor of the β-amyloid processing pathway according to claim 67, wherein the protein molecule from the culture medium is immunoprecipitated using an antibody specific for human β-amyloid precursor protein. 70. 66. The method for identifying an inhibitor of the β-amyloid processing pathway according to claim 65, wherein the identification is performed by a phosphorimer. 71. 67. The method for identifying an inhibitor of the β-amyloid processing pathway according to claim 66, wherein the identification is performed by autoradiography. 72. (A) incubating the eukaryotic cell line with an inhibitor of β-amyloid processing to produce a protein molecule that is indicative of inhibition of the β-amyloid processing pathway, wherein the eukaryotic cell line has an exogenous gene construct; The exogenous gene construct encodes a sequence encoding a cytomegalovirus promoter, a sequence encoding a strong ribosome binding site, a sequence encoding a β-amyloid precursor protein, a sequence encoding a selectable marker, and a polyadenylation signal. (B) a high-throughput assay for identifying inhibitors of β-amyloid processing consisting of quantifying the protein produced during the incubation step. 73. 73. The high-throughput assay for identifying inhibitors of β-amyloid processing according to claim 72, wherein the incubation is initiated in a volume of less than about 300 μl. 74. 74. The high throughput assay for identifying inhibitors of β-amyloid processing according to claim 73, wherein the incubation is started in a volume of less than about 250 μl. 75. 75. The high-throughput assay for identifying inhibitors of β-amyloid processing according to claim 74, wherein the incubation is started in a volume of less than about 200 μl. 76. 73. The high-throughput assay for identifying inhibitors of β-amyloid processing according to claim 72, wherein the incubation is performed in a 96-well microtiter plate. 77. 73. The high-throughput assay for identifying inhibitors of β-amyloid processing according to claim 72, wherein the incubation is performed with a contact area of less than about 0.6 cm ^-2 . 78. 78. The high-throughput assay for identifying inhibitors of [beta] -amyloid processing according to claim 77, wherein the incubation is performed with a contact area of less than about 0.4 cm- ² . 79. 79. Identify the inhibitor of β-amyloid processing according to claim 78, wherein the protein molecule is encoded by a sequence encoding a β-amyloid precursor protein or encoded by a fragment of a sequence encoding a β-amyloid precursor protein. High throughput assay. 80. 73. The protein molecule is selected from the group consisting of a 4.2 kDa β-amyloid protein molecule, an Aβ1-39 peptide molecule, an Aβ1-40 peptide molecule, an Aβ1-41 peptide molecule, an Aβ1-42 peptide molecule, and an Aβ1-43 peptide molecule. A high-throughput assay for identifying inhibitors of β-amyloid processing as described. 81. 81. The high throughput assay for identifying an inhibitor of β-amyloid processing according to claim 80, wherein the protein molecule is a 4.2 kDa β-amyloid protein molecule. 82. The high-throughput assay for identifying inhibitors of β-amyloid processing according to claim 81, wherein the level of the 4.2-kDa β-amyloid protein molecule is measured by immunosubstitution of the 4.2-kDa β-amyloid protein molecule using an antibody. 83. 83. The high-throughput assay for identifying inhibitors of β-amyloid processing according to claim 82, wherein the antibody is a β-amyloid 1101.1 4.2 kDa-specific monoclonal antibody. 84. A composition comprising a medium having β-amyloid 108.1 42 kDa-specific monoclonal antibody, β-amyloid 110 1.1 4.2 kDa-specific monoclonal antibody and a protein molecule displaying inhibition of the β-amyloid processing pathway, wherein the medium is eukaryotic. Incubated with the cell line and an inhibitor of the β-amyloid processing pathway, the eukaryotic cell line has an exogenous gene construct, which contains a sequence encoding the cytomegalovirus promoter, a strong ribosome binding site. A coding sequence, a sequence encoding a β-amyloid precursor protein, a sequence encoding a selectable marker and a sequence encoding a polyadenylation signal, comprising a β-amyloid 108.1 42 kDa-specific monoclonal antibody and β-amyloid 1101.1 4.2 k Da-specific monochroma Composition that specifically binds to a protein molecule that displays the inhibition of antibody β- amyloid processing pathway. 85. Eukaryotic cell line ATCC No CRL 12329 or derivatives thereof. 86. A monoclonal antibody selected from the group consisting of monoclonal antibody 108.1 or a derivative thereof, monoclonal antibody 1101.1 or a derivative thereof, and monoclonal antibody 1702.1 or a derivative thereof.