JP2001510329A - Human monoclonal antibody - Google Patents

Human monoclonal antibody

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Abstract

(57)【要約】 本発明は新規なヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に、その抗体をコードする遺伝子に関する。さらに詳しくは、本発明は呼吸シンシチアルウイルス（ＲＳＶ）の融合（Ｆ）タンパク質と特異的に反応するヒトモノクローナル抗体に関する。かかる抗体は、ヒト患者、特に幼児および小児におけるＲＳＶ感染の治療的および／または予防的処置に有用である。   (57) [Summary] The present invention relates to a novel human monoclonal antibody (mAb) and a gene encoding the antibody. More specifically, the present invention relates to human monoclonal antibodies that specifically react with the fusion (F) protein of respiratory syncytial virus (RSV). Such antibodies are useful for therapeutic and / or prophylactic treatment of RSV infection in human patients, especially infants and children.

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトモノクローナル抗体 発明の分野： 本発明は、新規なヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に、その抗体をコードす る遺伝子に関する。さらに詳細には、本発明は、呼吸シンシチアルウイルス（Ｒ ＳＶ）の融合（Ｆ）タンパク質のエピトープと特異的に反応するヒトモノクロー ナル抗体に関する。かかる抗体はヒト患者、特に幼児および小児のＲＳＶ感染の 治療および／または予防処置に有用である。 発明の背景： 呼吸シンシチアルウイルス（ＲＳＶ）は、子供における下部呼吸疾患の主たる 原因であり、世界中の子供にて、予測できる気管支炎および肺炎の年生の流行性 感冒を引き起こす。そのウイルスは、流行性に富み、何歳であっても感染し得る 。ＲＳＶに対する免疫性は短命であり、したがって再感染が頻繁に生じる。０歳 児ないし２歳児が最も感受性に富み、主たる感染個体群を形成する。この群にお いて、５人のうち１人は感染して下部呼吸（喉頭の下）疾患を発病し、この割合 は再感染においても同じようなものである。年齢、環境および他の関連因子に応 じて、ＲＳＶ感染の患者の１−３％で入院が必要となり、その入院期間は、長期 間（３週間まで）が一般的である。特に幼児におけるＲＳＶ感染の罹患率の高さ も、後の人生の呼吸問題へと発展している。罹患率は、一般に、開発国では極め て低いが、未開発の国、および心臓病／肺病などのある種の危険性のある群では 非常に高く、これらの群の子供には予防的処置が望ましくなる。 ＲＳＶ感染用ワクチンは現在では利用されていない。１９６０年代に試験され た弱毒完全ウイルスワクチンを取りまく厳しい安全性論争ならびに新規な候補サ ブユニットワクチンに付随して免疫病理学が促進される可能性があるため、近未 来においてワクチンは消えていくことになると予測される。現在まで、一の薬物 療法の、リバビリン（Ribavirin）、広域抗ウイルス剤が認可されている。リバ ビリンは、投与、穏やかな毒性および効能が疑わしい問題があるために、最低限 許容されているにすぎない。大部分のケースで、入院した子供は薬物療法を受け ず、極めて費用のかかる集中的な維持管理を受けるだけである。ＲＳＶ感染の治 療用薬物を投与するのに安全、有効かつ容易に投与される薬物の必要性があるの は明らかである。 ＲＳＶに対する受身抗体治療／予防の可能性は動物実験を用いて十分に確立さ れている。ＲＳＶを含む感染物質に対する動物の初期受身伝達研究にはほとんど ネズミｍＡｂが利用されてきた。最近になって、ＦＤＡは、プールされたヒト血 清から単離された静脈内ガンマグロブリン（ＩＶＩＧ）の使用を承認した。この 研究の初期の報告は励みとなった（Groothuis，J.R.ら、Antimicrob.Agents Che mo．３５（７）：１４６９−１４７３（１９９１））。しかし、ＩＶＩＧには一 般的な欠点があり、限定するものではないが、かかる産生物はヒト血液に由来し 、しばしば、有効な用量を得るのに数グラムの抗体を投与する必要がある。 また、モノクローナル抗体が利用されてきた。かかる方法の利点として：投与 するのに必要なグロブリンの量を減少させることにより、特異的抗体を高濃度に できること；直接的血液産物を当てにする必要がないこと；調製物中の抗体のレ ベルをより均一に調節できること；および投与経路を拡張できることが挙げられ る。異種（例えば、ネズミ）からのモノクローナル抗体を利用する受身免疫療法 も示唆されているが（ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０８６９９、公開番号Ｗ Ｏ９５／０４０８１を参照のこと）、外来抗体に拮抗する患者の側に立って望ま しくない免疫応答の危険性を減少させる一の方法は、「ヒト化抗体」を利用する ことである。これらの抗体は実質的にはヒト起源であり、相補性決定領域（ＣＤ Ｒ）だけが非ヒト起源である。この方法の特に有用な例示がＰＣＴ出願のＰＣＴ ／ＧＢ９１／０１５５４（公開番号ＷＯ９２／０４３８１）およびＰＣＴ出願の ＰＣＴ／ＧＢ９３／００７２５（公開番号ＷＯ９３／２０２１０）に開示されて いる。 別のより好ましい方法は、完全なヒトｍＡｂを利用することである。残念なが ら、古典的なハイブリドーマ技法を介してヒトモノクローナル抗体を産生するこ とはほとんど成功していない。実際、許容されるヒト融合パートナーは同定され ておらず、ネズミ骨髄腫融合パートナーはヒト細胞と十分に作用せず、不安定な 低産生能ハイブリドーマ株を生産する。しかしながら、最近の分子生物学および 免疫学の発展により、以下に詳細に記載するような、特に異種感染物質に拮抗す るヒトｍＡｂを単離することが可能となった。 ＲＳＶ感染およびその臨床的特徴についての詳説は、McIntosh，K.およびR.M. Chanock、”Respiratory Syncytial Virus”、３８章、B.N.Fields編、Raven Pr ess（１９９０）およびHall,C.B.、”Textbook of Pediatric Disease”Feigin and Cherry編、W.B.Saunders、１２４７−１２６８頁（１９８７）に記載されて いる。パラミクソウイルス群に属するＲＳＶは、パラミクソウイルス群の属性と 同じ属性を有するマイナス鎖非セグメントＲＮＡウイルスである。しかし、形態 的差異およびヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ活性の欠如に基づき、別の ニューモウイルス群に分類されている。ＲＳＶは多形態性であり、直径が１５０ −３００ｎｍの大きさである。細胞の外膜から発芽させることによりウイルス成 熟体およびビリオンが、短い、密集した間隔で突起物または「スパイク」を有す る膜結合粒子として出現する。ＲＮＡゲノムは、大きさが９．５ｋＤａから１６ ０ｋＤａの範囲にある１０個の独特なウイルスポリペプチドをコードする（Huan g，Y.A.およびG.W.Wertz、J.Virol.４３：１５０−１５７（１９８２））。７個 のタンパク質（Ｆ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｍ、Ｍ２）がＲＳＶビリオンに存在し、少 なくとも３個のタンパク質（Ｆ、ＧおよびＳＨ）が感染細胞の表面上で発現して いる。Ｆタンパク質は最終的に細胞融合に関連するタンパク質と同定されている 。というのも、このタンパク質に特異的な抗体がインビトロにてシンシチア形成 を阻害し、他のＲＳＶウイルスタンパク質の不在下で組換えＦタンパク質を発現 するワクシニアウイルスに感染した細胞がシンシチアを形成したからである。反 対に、Ｇタンパク質に対する抗体はシンシチア形成を遮断しないが、そのウイル スの細胞との結合を妨げた。 ＲＳＶは抗原上２つの異なるサブグループ（ＡおよびＢ）に分類できる（Mufs on，M.A.ら、J.Gen'l.Virol．６６：２１１１−２１２４（１９８５））。この 抗原的二形成は主として表面結合（Ｇ）糖タンパク質（Johnson，R.A.ら、Proc. Nat'l.Acad.Sci.USA ８４：５６２５−５６２９（１９８７）に結合してい る。ＡおよびＢ両方の群の菌株は同時に循環するが、その比率は、各々、年で予 測できないほどに変化する。したがって、効果的な療法は両方のウイルスのサブ グループを標的としなければならず、このことが、後記するように、ｍＡｂ療法 の標的抗原として保存率の高い表面融合（Ｆ）タンパク質を選択する理由である 。 ＲＳＶは世界中に分布している。前記したように、ＲＳＶウイルスの疫学上最 も著しい特徴の一つは、感染と疾患の規則正しいパターンにある。他の呼吸ウイ ルスでは不規則な間隔で流行するか、または風土病／流行病の混合したパターン を示すが、ＲＳＶは大都市で毎年相当な大きさの流行病を引き起こす呼吸器ウイ ルス病原体にすぎない。世界の温暖な地域にて、ＲＳＶ流行病は、主として、晩 秋、冬または春に起こるが、夏に流行したことがない。共同社会の中での感染の 発生および範囲は特徴的であり、容易に診断され、細気管支炎および小児肺炎の 場合には、急性下部気管支管疾患の小児の入院の数が急上昇する。時として、突 発的に発生する他の呼吸器ウイルス物質がＲＳＶと共存することがある。一次Ｒ ＳＶ感染は非常に小さな子供の間で発生し、入学前に実質的にすべての子供が感 染する。１歳までに、幼児の２５−５０％が自然感染の結果として特異的抗体を 有し、この値は４-５歳までに略１００％となる。年齢、性別、社会経済的およ び環境的因子のすべてが、疾患の重篤度に影響を及ぼしている。米国における最 新の集中治療を用いた場合、正常な対象の全死亡率は低い（入院対象の２％以下 ）が、進行の速い心臓病（チアノーゼ先天性心臓病）または呼吸疾患（気管支肺 形成異常）を患っている幼児では極めて高くなりうる。例えば、チアノーゼ先天 性心臓病の幼児の死亡率は３７％と高いことが報告されている。未熟な幼児では 、ＲＳＶ感染のために無呼吸発作が起こるかもしれず、稀に神経性または全身性 損傷を引き起こす。６月齢以下の患者では、重度の下部呼吸管疾患（細気管支炎 および肺炎）が最も一般的である。この疾患から完全に回復したと思われる幼児 は何年間も症候性呼吸異常（再発生ぜん鳴、低肺機能、再発生咳、喘息および気 管支炎）を示すかもしれない。 免疫系統がＲＳＶ感染および再感染に対して拮抗する機構は十分に理解されて いない。しかし、再感染はあらゆる年齢に共通しており、時に、一次感染の回復 後わずか数週間で再感染が起こるため、免疫作用は部分的な保護でしかないこと は明らかである。血清性および分泌性の両方の抗体（ＩｇＡ）が成人ならびに極 めて小さな幼児のＲＳＶ感染に対する応答にて検出されている。しかし、幼児（ 月齢１-８ヶ月）に見られる血清性抗体のウイルスＦまたはＧ糖タンパク質に対 する力価、ならびに中和抗体は、加齢対象に見られる価の１５−２５％である。 このような力価の低さは小さな子供にて重度の感染の発生率の増加の原因となっ ているかもしれない。 ＲＳＶウイルスに対する防御における血清性抗体の役割を裏付ける証拠が、疫 学ならびに動物実験から明らかにされた。自然にウイルスに曝されている成人に おいては、感受性が低血清性抗体レベルとよく関連している。幼児においては、 母方に伝達される力価が重度の病気に対する耐性と関連している（Glezen，W.P. ら、J.Pediatr．９８：７０８−７１５（１９８１））。他の研究は下部呼吸管 の関連する発生率および重篤度が高血清性抗体の存在下で減少することを示し（ McIntosh,K.ら、J.Infect.Dis．１３８：２４−３２（１９７８））、受身的に 投与された血清性中和抗体の高力価が、コットンラット実験で、ＲＳＶ感染に防 御的であることが明らかにされた（Prince，G.A.ら、Virus Res．３：１９３− ２０６（１９８５））。 細胞媒介性免疫を欠く子供は、正常な免疫システムを有する子供とは対照的に 、その感染を止め、何箇月もウイルスを排除することができない。同様に、ＲＳ Ｖウイルスに感染したヌードマウスは予想通りウイルスを排除した。これらのマ ウスはプライム化Ｔ細胞を養子移動することにより治療することができる（Cann on,M.J.ら、immunology６２：１３３−１３８（１９８７））。 要約すれば、細胞性および体液性免疫の両方が感染、再感染およびＲＳＶ疾患 に対する防御と関連し、抗原性バリエーションは限定されるが、数回暴露した後 でさえ、防御的免疫性は完全でないのは明らかである。 本発明は、感染を受身的に処理するか防御するための、ＲＳＶウイルスのＦタ ンパク質に特異的なヒトｍＡｂの使用に関する。ヒトにおける受身抗体療法の使 用は十分に文献記載されており、肝炎およびサイトメガロウイルスなどの他の感 染疾患の治療に用いられている。臨床実験も小児におけるＲＳＶ感染の治療用ヒ ト化抗体の効能を目下評価している最中である。動物における研究で、Ｆおよび Ｇ糖タンパク質の両方に対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体が、予 防的または治療的に投与した場合に、ＲＳＶウイルス感染において受身的防御を 付与しうることが明らかにされた（Princeら、前掲）。これらの研究において、 ＦまたはＧ中和ｍＡｂのマウス、コットンラットまたはサルへの受身的移動は、 肺におけるＲＳＶウイルスの複製を有意に減少させるかまたは完全に妨げる。 中和抗体のＲＳＶウイルスに対する誘導は、ＦおよびＧ表面糖タンパク質に限 定されるようである。これら２つのタンパク質のうち、Ｆタンパク質がＲＳＶウ イルスの種々の菌株に対する保護に関連する交差反応性中和抗体についての主た る標的である。加えて、マウスまたはコットンラットのＦタンパク質での実験的 ワクチン処理も交差的保護をもたらす。Ｆタンパク質関連株とサブユニットのウ イルスの抗原的関連性は、アミノ酸レベルでの高い相同性に反映している。対照 的に、ＲＳＶの２つのサブユニットおよび種々の菌株において、抗原的二形成は 主としてＧ糖タンパク質に関連付けられた。Ｆタンパク質は６８−７０ｋＤａの 推定分子量を有し；そのＮ−末端でシグナルペプチドを有し；そのＣ−末端で膜 アンカー領域を有し；ビリオン構築の前に感染細胞にてタンパク質分解により切 断されてジスルフィド結合したＦ2およびＦ1を生成する。５つの中和エピトープ がＦタンパク質配列中で同定されており、残基２０５−２２５；２５９−２７８ ；２８９−２９９；４８３−４８８および４１７−４３８を地図上で特定した。 Ｆタンパク質の配列転換の頻度を測定する研究で、３０年の期間にわたってオー ストラリア、ヨーロッパおよび米国の各州より単離したＲＳＶウイルスの２３種 の菌株のすべてにおいて、中和エピトープの大部分が保存されていることがわか った。別の研究で、４３人の幼児または小児のサブグループＡまたはサブグルー プＢ菌株による一次感染に対する血清応答で、サブグループＡまたはサブグルー プＢ菌株のＧタンパク質が無関係であるにもかかわらず、同種または異種Ｆ抗原 に対する応答が有意に異なることがわかった。さらには、インビトロでのウイル ス媒介性細胞融合の抗体阻害対感染の阻害は、動物実験にて保護の相関関係にあ り、融合阻害は主としてＦタンパク質特異的抗体に限定される。Ｆタンパク質が 抗体療法のさらに重要な標的であることは明らかである。 ＲＳＶのＦタンパク質のヒトｍＡｂは、十分に、この疾患に対する望ましい選 択肢を保持している。かかるｍＡｂのフラグメントを得ることにおいていくつか の成功例が報告されている（Barbas,C.F.ら、Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA ８９： １０１６４−１０１６８（１９９２）；Crowe,J.E.ら、Proc.Nat'l.Acad.Sci.US A ９１：１３８６−１３９０（１９９４）およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９ ３／０８７８６（公開番号ＷＯ９４／０６４４８（１９９４年３月３１日））） が、かかる結果の成果は単純なものではなく、本明細書に記載されている新規な ヒトｍＡｂが得られた場合、それは免疫治療用組成物を形成するのに、単独でま たは存在する分子と組み合わさって特に有用である。本発明はこのようなヒトｍ Ａｂの群の一のｍＡｂに関するものである。 発明の簡単な記載： 本発明はＲＳＶのＦタンパク質エピトープと特異的に反応性の、ＲＳＶ感染の 中和能を有する、完全にヒトのモノクローナル抗体およびその機能フラグメント に関する。 関連する態様において、本発明は、ヒト抗体配列をランダムに組み合わせてク ローニングすることで産生され、線状ファージＦａｂ表示ライブラリーより単離 されたＲＳＶのＦタンパク質に特異的なＦａｂフラグメントまたはＦ(ａｂ')2フ ラグメントを中和する変法を提供する。 さらに別の態様において、第１のヒトドナーからのヒト重鎖および軽鎖定常領 域ならびに第２のヒトドナーから由来のＲＳＶのＦタンパク質に対するモノクロ ーナル抗体を中和するヒトより誘導された重鎖および軽鎖可変領域またはそのＣ ＤＲを含有する再形成ヒト抗体が提供される。 さらに別の態様において、本発明は、１（またはそれ以上の）改変抗体および 医薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物を提供する。 さらなる態様において、本発明は、ＲＳＶ感染の予防または治療処理のために 本発明の医薬組成物を有効量、ヒトに投与することからなる、ヒトにおけるＲＳ Ｖ疾患の受身免疫療法を提供する。 さらに別の態様において、本発明は、ヒト抗体と、ＲＳＶのＦタンパク質に対 するヒト中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）より誘導される改変抗体（例えば、 遺伝子操作された抗体、ＣＤＲ、ＦａｂまたはＦ(ａｂ')2フラグメントまたはそ のアナログ）の組換え産生の方法およびその産生に有用な成分を提供する。これ らの成分は、同じ物をコードする単離された核酸配列、組換えプラスミドでトラ ンスフェクションされた宿主細胞（好ましくは、哺乳動物細胞）中でその発現の 定方向能を有する選択された調節配列の制御下にある該核酸配列を含有する組換 えプラスミドを包含する。この産生方法は、トランスフェクションされた本発明 の宿主細胞ラインをヒトまたは改変抗体が当該細胞にて発現するような条件下で 培養し、その発現した産物を単離することからなる。 さらに別の態様において、本発明は、生物学的流体をヒト抗体および本発明の 改変抗体と接触させ、そのヒト抗体（または改変抗体）とＲＳＶの間の結合の発 生について検定することからなる、ヒトにおけるＲＳＶの存在を診断する方法を 提供する。 本発明のさらに別の具体例において、少なくとも１回の用量の、本発明のモノ クローナル抗体の免疫療法上有功量を、少なくとも１回の別のモノクローナル抗 体と組み合わせてなる医薬組成物が提供される。特に、別のモノクローナル抗体 はＲＳＶタンパク質抗原の異なるエピトープと反応性であることで目的とする抗 体と区別される抗−ＲＳＶ抗体である。 本発明の他の態様および有利な点は、さらに、詳細な記載およびその好ましい 具体例において記載されている。 図面の簡単な記載： 図１は、Ｈｕ１９Ａモノクローナル抗体の構築に用いられるクローニング方法 を示す。重鎖Ｖ領域を、ＸｈｏＩ−Ｂｓｐ１２０Ｉフラグメントとして、ＰＣＤ 誘導ベクターにクローン化した。完全な軽鎖ＶおよびＣ領域をＳａｃＩ−Ｘｂａ ＩフラグメントとしてＰＣＮ誘導ベクターにクローン化した。詳細を以下に記載 する。 図２は、本発明の種々のモノクローナル抗体の重鎖アミノ酸配列を比較したも のである。構築物Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの重鎖のアミノ酸配列を図示する（各々、 配列番号５、６、７および８）。残基の番号は、成熟過程のアミノ末端から開始 し、ＣＤＲ３で終える、ゲルムリン（germline；ＧＬ）遺伝子Ｄｐ５８（配列番 号４）に基づいている。"＿”は上記配列と同一であることを示す（例えば、Ｂ と比較したＣ）。配列Ａは、Barbasら（Proc.Nat'l.Acad.Sci.（USA）８９、１ ０１６４−１０１６８（１９９２）が利用したクローニング法であるため、位置 ４と５の間にアミノ酸挿入を有する。太文字残基は、リーダー領域に、ＣＤＲ１ −３に対応する。ＣＤＲ２の下線を付した配列は、バージョンＣで突然変異させ たバージョンＡおよびＢのＮ−連結糖鎖形成部位と同じである。”＊”を付した 残基Ｐ１４およびＧ１５は、公開された配列（Barbasら、前掲）にて、各々、Ｌ およびＡと表されている。 図３は、本発明の種々のモノクローナル抗体の軽鎖アミノ酸配列を比較したも のである。構築物Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの軽鎖のアミノ酸配列を図示する（配列番 号１０、１１、１２および１３）。Ｖκ領域中の残基の番号は、成熟過程のアミ ノ末端から開始し、ＣＤＲ３で終える、ゲルムリン（ＧＬ）遺伝子Ｄｐｋ９（配 列番号９）に基づいているが、フレームワーク４に言及するように、Ｈｕ１９Ａ Ｌｃについての実際の番号も図示する。図２に示すように、” ”は上記配列と の同一性を示す。”＊”を付したＨｕ１９Ａのフレームワーク４の位置９７のＧ は、公開された配列ではＥで表されている（引用文献を参照のこと）。配列Ａは 、クローニング法が原因で、残基１と２に２つのアミノ酸欠失を有する。太文字 残基は、リーダー領域に、ＣＤＲ１−３に対応する。κ定常領域はゲルムリン遺 伝子との比較にて構築物ＡおよびＢについて図示する。Ｃ−末端付近のＬ変異は 、バージョンＣに相関した(図３、配列番号１３を参照のこと)。 図４は、Ｈｕ１９ｍＡｂ重鎖および軽鎖を発現するためのプラスミドのＤＮＡ 配列を示す。図４ＡはＨｕ１９ＡＨｃｐｃｄのＤＮＡ配列である（配列番号１４ ）。翻訳開始部、リーダーペプチド、アミノ末端プロセシング部位（配列番号１ ５）、１９Ａ重鎖のカルボキシ末端（配列番号１６）およびＥｃｏＲＩ制限エン ドヌクレアーゼ切断部位を図示する。図４Ｂは、Ｈｕ１９ＡＬｃｐｃｎのＤＮＡ 配列（配列番号１７）であり、軽鎖およびその軽鎖のコード化領域の末端に続く ＸｂａＩ制限部位に関する対応する特徴を示す（配列番号１８、１９）。図４Ｃ は、プラスミドＨｕ１９ＢＨｃｐｃｄの重鎖のコード化領域のＤＮＡ配列（配 列番号２０、２１）である。図４Ｄは、プラスミドＨｕ１９ＢＬｃｐｃｎの軽鎖 のコード化領域のＤＮＡ配列（配列番号２２、２３および２４）である。図４Ｅ は、プラスミドＨｕ１９ＣＨｃｐｃｄの重鎖のコード化領域のＤＮＡ配列（配列 番号２５、２６）である。図４Ｆは、プラスミドＨｕ１９ＤＨｃｐｃｄの重鎖の コード化領域のＤＮＡ配列（配列番号２７、２８）である。図４Ｇは、プラスミ ドＨｕ１９ＣＬｃｐｃｎの軽鎖のコード化領域のＤＮＡ配列（配列番号２９、３ ０）である。図４Ｃ−Ｇ中、太文字の残基は、各々、図４Ａおよび４Ｂに図示す るＨｕ１９ＡＨｃｐｃｄおよびＨｕ１９ＡＬｃの完全なベクター配列との異なる 個所を示す。 図５は、還元条件下、Ｈｕ１９ＢおよびＨｕ１９Ｃのクマシー染色ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥゲルを示す。 図６は、アニオン交換クロマトグラフィーによるＨｕ１９糖変異体の分離を示 す。 図７は、Ｈｕ１９ＢＦａｂ糖変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。 発明の詳細な説明： 本発明は、ＲＳＶのＦ蛋白と反応する、有用なヒトモノクローナル抗体（およ びそのフラグメント）、該抗体およびその変種それをコードする単離核酸、およ びそれらの組み換え法による製造、ならびにかかる抗体およびそれらのフラグメ ントの治療的、予防的および診断的使用を提供する。 Ｉ．定義 本明細書および請求の範囲で用いる下記用語を次のように定義する： 「改変抗体」は、改変された免疫グロブリンコーディング領域によりコードさ れる蛋白をいい、選択宿主細胞における発現により得ることができる。かかる改 変抗体は、作成された抗体（例えば、キメラ、ヒト化、または再形成された、あ るいは免疫学的に編集されたヒト抗体）あるいは免疫グロブリン不変部の全部ま たは一部を欠くそれらのフラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ ’）2等である。 「改変免疫グロブリンコーディング領域」は、本発明の改変抗体またはそのフ ラグメントをコードする核酸配列をいう。 「再形成ヒト抗体」は、第１のヒトモノクローナルドナー抗体由来の最少でも １つのＣＤＲが、第２のヒトアクセプター抗体中のＣＤＲと置換されている改変 抗体をいう。好ましくは、６つのＣＤＲすべてが置換されている。より好ましく は、第１のヒトドナーモノクローナル抗体由来の抗原結合領域（例えば、Ｆｖ、 Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）2）全体が、第２のヒトアクセプターモノクローナ ル抗体中の対応領域と置換されている。最も好ましくは、第１のヒトドナー由来 のＦａｂ領域が第２のアクセプター抗体に作動可能に連結されて、全長モノクロ ーナル抗体が形成される。本明細書においてＨｕ１９Ａ、Ｈｕ１９Ｂ、Ｈｕ１９ ＣおよびＨｕ１９Ｄと命名された再形成ヒトモノクローナル抗体を、図３の配列 １９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃおよび１９Ｄから選択される軽鎖アミノ酸配列ならびに 図２の配列１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃおよび１９Ｄから選択される重鎖アミノ酸配 列、またはそれらの機能的部分配列を含む再形成ヒト抗体と定義する。 「第１免疫グロブリンパートナー」は、ヒト枠組みまたはヒト免疫グロブリン 可変部をコードする核酸配列をいい、その中においてネイティブな（または本来 的に存在する）ＣＤＲコーディング領域がドナーヒト抗体のＣＤＲコーディング 領域と置換されている。ヒト可変部は免疫グロブリン重鎖、軽鎖（または両方） 、それらのアナログまたは機能的フラグメント）であってよい。抗体（免疫グロ ブリン）の可変部に存在するかかるＣＤＲ領域を、当該分野において知られた方 法により決定することができる。例えば、Kabat et al.,（Sequences of Protei ns of Immunological Interest，4th Ed，U．S．Department of Health(1987)） には ＣＤＲの配置に関する規則が開示されている。さらに、ＣＤＲ領域／構造の同定 に有用なコンピュータープログラムが知られている。 「第２融合パートナー」は、第１免疫グロブリンパートナーがイン・フレーム （in frame）で、あるいは所望により慣用的なリンカー配列を用いて融合されて いる（すなわち、作動可能に連結された）、蛋白またはペプチドをコードする別 の核酸配列をいう。好ましくは、融合パートナーは免疫グロブリン遺伝子であり 、 その場合、「第２免疫グロブリンパートナー」という。第２免疫グロブリンパー トナーは、その不変部全体をコードする核酸配列（すなわち、相同的−第１およ び第２の改変抗体が同じ源に由来する）または目的とするさらなる（すなわち、 異種性）抗体をコードする核酸配列を含んでいてもよい。それは免疫グロブリン 重鎖または軽鎖（または１のポリペプチドの部分としての両鎖）であってもよい 。第２免疫グロブリンパートナーは特定の免疫グロブリンクラスまたはイソタイ プに限定されない。さらに、第２免疫グロブリンパートナーは免疫グロブリン不 変部の一部分（すなわち、適当なヒト不変部または枠組み領域の別個の部分）、 例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2中に見出されるものを含んでいてもよい。ま た第２融合パートナーは、宿主細胞の外表面に露出される膜貫通蛋白（例えば、 ファージディスプレイライブラリーの一部としての）をコードする配列、あるい は分析または診断用蛋白、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラク トシダーゼをコードする配列を含んでいてもよい。 用語Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）2を、それらの標準的な 意味とともに使用する（例えば、Harlow et al.，Antibodies A Laboratory Man ual，Cold Spring Harbor Laboratory，(1988)参照）。 本明細書の用語「作成された抗体」は改変抗体の１のタイプ、すなわち、全長 合成抗体（例えば、キメラ、ヒト化、再形成された、あるいは免疫学的に編集さ れたヒト抗体）をいい、その中において選択アクセプター抗体の軽鎖および／ま たは重鎖可変ドメインの一部が、選択エピトープに対して特異性を有する１また はそれ以上のドナー抗体の類似部分により置換されている。例えば、かかる分子 は、未修飾軽鎖（またはキメラ軽鎖）に結合したヒト化重鎖により特徴づけられ る抗体（あるいはその逆のもの）を包含しうる。作成された抗体は、ドナー抗体 結合特異性を保持するための、アクセプター抗体軽鎖および／または重鎖可変ド メインの枠組み領域をコードする核酸配列の変更により特徴づけられてもよい。 これらの抗体は、アクセプター抗体由来の１またはそれ以上の（好ましくは、全 部の）ＣＤＲの本明細書記載のドナー抗体由来のＣＤＲとの置換を含みうる。 「キメラ抗体」は、作成された抗体の１のタイプをいい、異種由来のアクセプ ター抗体の軽鎖および重鎖不変部に結合したドナー抗体由来の本来的な可変部 （軽鎖および重鎖）を含む。 「ヒト化抗体」は、作成された抗体の１のタイプをいい、非ヒトドナー免疫グ ロブリン由来のＣＤＲを有し、分子の残りの免疫グロブリン由来の部分が１（ま たはそれ以上）のヒト免疫グロブリンに由来するものである。さらに、枠組み支 持残基を改変して結合アフィニティーを保存させてもよい（例えば、Queen et a l.，Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA．86:10029-10032(1989)、Hodgson et al.，B io/Technology，9:421(1991)参照）。 「免疫学的に編集された抗体」は、作成された抗体の１のタイプをいい、編集 された抗体で治療される患者の一部における抗体に対する免疫学的応答の可能性 を減じることを目的として、ドナーおよび／またはアクセプター配列において変 化があり、人工物のクローニング、生殖系の増強等の観点から、領域において編 集が行われているものをいう。 用語「ドナー抗体」は、その可変部、ＣＤＲまたは他の機能的フラグメントま たはアナログの核酸配列を第１免疫グロブリンパートナーに提供して、改変免疫 グロブリンコーディング領域を生じさせ、ドナー抗体に特徴的な抗原特異性およ び中和活性を有する改変抗体を生じさせる抗体（モノクローナル、または組み換 え抗体）をいう。本発明における使用に適する１のドナー抗体は、Ｆａｂ Ｈｕ １９と命名されたヒト中和モノクローナル抗体のＦａｂフラグメントである。Ｆ ａｂ Ｈｕ１９は、図２、３、４Ａおよび４Ｂに示す、可変軽鎖ＤＮＡおよびア ミノ酸配列Ｈｕ１９Ａを有するものと定義される。 用語「アクセプター抗体」は、ドナー抗体に対して遺伝学的に無関係な源由来 の抗体（モノクローナル、または組み換え抗体）をいい、その重鎖および／また は軽鎖の枠組み領域および／またはその重鎖および／または軽鎖の不変部をコー ドするすべて（または部分）の核酸配列（すべての核酸配列が好ましい）を第１ 免疫グロブリンパートナーに提供するものをいう。好ましくは、ヒト抗体がアク セプター抗体である。 「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変部である抗体の相補性 決定領域アミノ酸配列と定義される。例えば、Kabat et al.，Sequences of Pro teins of Immunological Interest，4th Ed.，U．S．Department of Health anfd Human Services，National Institutes of Health(1987)参照）免疫グロブ リン可変部には３つの重鎖および３つの軽鎖ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）がある 。よって、本明細書の「ＣＤＲ」は、３つの重鎖ＣＤＲすべて、あるいは３つの 軽鎖ＣＤＲすべて（あるいは適宜、すべての重鎖ならびにすべての軽鎖のＣＤＲ ）をいう。ＣＤＲは、抗原またはエピトープに対する抗体の結合のための接触残 基の大部分を提供する。本発明の目的ＣＤＲはドナー抗体の可変重鎖および軽鎖 配列に由来するものであり、本来的なＣＤＲのアナログを包含し、該アナログは 、それらが由来するドナー抗体と同じ抗原特異性および／または中和能を共有ま たは保持している。 「抗原特異性または中和能を共有」とは、例えば、Ｆａｂ Ｈｕ１９は一定レ ベルの抗原アフィニティーにより特徴づけられるが、適当な構造上の環境におい てＦａｂ Ｈｕ１９の核酸配列によりコードされるＣＤＲがより高いまたは低い アフィニティーを有してもよいことを意味する。それにもかかわらず、かかる環 境下のＦａｂ Ｈｕ１９のＣＤＲは、無処理のＦａｂ Ｈｕ１９が認識するのと同 じエピトープを認識するであろう。「機能的フラグメント」は、部分的な重鎖ま たは軽鎖可変配列（例えば、免疫グロブリン可変部のアミノまたはカルボキシ末 端において少し欠失したもの）であり、当該フラグメントが由来する抗体と同じ 抗原結合特異性および／または中和能を有している。 「アナログ」は、少なくとも１のアミノ酸において修飾されたアミノ酸配列で あり、該修飾は化学的なもの、あるいは少数のアミノ酸（すなわち１０個未満） の置換または再配列であってよく、該修飾は、アミノ酸配列が未修飾配列の生物 学的特徴（例えば、抗原特異性および高いアフィニティー）を保持することを可 能にするものである。例えば、特定のエンドヌクレアーゼ制限部位がＣＤＲコー ディング領域中またはその周辺に作成された場合に、置換により（サイレント） 変異を構築することができる。 アナログは対立遺伝子の変化を生じさせるかもしれない。「対立遺伝子の変化 または修飾」は、本発明アミノ酸またはペプチド配列をコードする核酸配列にお ける変化である。かかる変化または修飾は遺伝学的コードの縮重によるものであ ってもく、あるいは所望の特徴を得るために注意深く作成されたものであっても よい。これらの変化または修飾は、コードされるアミノ酸配列の変化を生じさせ るものであっても、なくてもよい。 用語「エフェクター剤」は、改変抗体、および／またはドナー抗体の天然また は合成軽鎖または重鎖またはドナー抗体の他のフラグメントが慣用的手段により 結合されていてもよい非蛋白性キャリヤ分子をいう。かかる非蛋白性キャリヤー は、診断分野で使用される慣用的キャリヤ、例えばポリスチレンまたは他のプラ スチックビーズ、多糖類、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（Pharmacia）系に使用される 多糖、あるいは医学分野で使用され、ヒトおよび動物への投与が安全な他の非蛋 白性物質を包含しうる。他のエフェクター剤は、重金属原子をキレートするため のマクロサイクル（macrocycle）、または放射性同位元素を包含しうる。かかる エフェクター剤、例えばポリエチレングリコールは、改変抗体の半減期の延長に も有用でありうる。 ＩＩ．コンビナトリアルクローニング（Combinatorial Cloning）： 上記のように、多くの問題が、G．KohlerおよびC．Milsteinのハイブリドーマ 法（Nature 256:495-497(1975)）の、ヒトモノクローナル抗体の生成および単離 への適用を妨げてきた。これらの問題としては、ハイブリドーマ細胞系を形成す るのに使用される適当な融合パートナーミエローマ細胞系を欠いていたこと、な らびに生成されたとしてもかかるハイブリドーマの安定性が乏しいこと等が挙ら れる。末梢循環においてウイルス特異的Ｂ細胞が不足しているため、ＲＳＶの場 合にはこれらの欠点はさらに助長される。 一般的には、コンビナトリアルクローニングはＰＣＴ出願ＷＯ９０／１４４３ ０に開示されている。簡単に説明すると、コンビナトリアルクローニングの目的 は、ヒト細胞、組織または器官の免疫学的遺伝学的能力を細菌細胞集団に移行さ せることである。免疫適格な細胞、組織または器官を用いることが好ましい。特 に有用な源は、脾臓、胸腺、リンパ節、骨髄、扁桃腺および末梢血リンパ球を包 含するが、これらに限らない。所望により、細胞をインビトロでＲＳＶ刺激して もよく、あるいは免疫応答を生じたことが知られているドナーまたはＨＩＶ+で あるが無徴候であるドナーから選択してもよい。 ドナーの細胞からの遺伝学的情報はＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってもよく 、便利には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または類似の方法により増幅され る。ＲＮＡとして単離する場合、好ましくは、増幅前に逆転写酵素により遺伝学 的情報をｃＤＮＡに変換する。増幅を一般化することができ、あるいはより特異 的なものとすることができる。例えば、ＰＣＲプライマーを注意深く選択するこ とにより、免疫グロブリン遺伝子または当該遺伝子クラス中の部分集合の選択的 増幅を行うことができる。 成分遺伝子配列（この場合、種々の重鎖および軽鎖抗体鎖の可変部をコードす る遺伝子）を得たならば、軽鎖および重鎖遺伝子をランダムに組み合わせてラン ダムなコンビナトリアルライブラリーを形成する。コンビナトリアルクローニン グを容易にするための種々の組み換えＤＮＡベクター系が記載されている（上記 ＰＣＴ出願ＷＯ９０／１４４３０、Scott and Smith，Science 249:386-406(199 0)または米国特許第５２２３４０９号参照）。コンビナトリアルライブラリーを 得て、便利には、発現後に、ＲＳＶ Ｆ蛋白でのバイオパンニング（biopanning ）により、あるいは必要ならば後で詳細に説明するエピトープ遮断バイオパンニ ングにより生成物をスクリーニングすることができる。 まず、コンビナトリアルクローニングにｍＡｂのＦａｂフラグメントを用い、 スクリーニングを行い、ついで、所望候補分子の選択後にＦａｂを全長ｍＡｂに 変換することが一般的に好ましい。しかしながら、１本鎖抗体をクローニングお よびスクリーニングに使用することもできる。 ＩＩＩ．抗体フラグメント 本発明は、ＲＳＶのＦ蛋白に対して指向された全長のｍＡｂを誘導するための 、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）2フラグメントの使用を企図する。こ れらのフラグメントは、インビボにおいてＲＳＶにより媒介される症状に対する 防御剤および治療剤として、あるいはインビトロにおいてＲＳＶ診断の一部とし て独立別個に有用であるかもしれないが、本発明においてそれらを再形成された ヒト抗体の成分として使用する。Ｆａｂフラグメントは軽鎖全体および重鎖のア ミノ末端部分を含み、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、さらなるジスルフィド結 合 により結合した２個のＦａｂフラグメントにより形成されるフラグメントである 。ＲＳＶ結合モノクローナル抗体はＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）2フ ラグメントの源を提供するものであり、コンビナトリアルファージライブラリー により得ることができる（例えば、Winter et al.，Ann．Rev．Immunol.，12:43 3-455(1994)またはBarbes et al．Proc．Nat'l．Acad．Sci.（USA）89，10164-1 0168(1992)参照、これらを参照により本明細書に記載されているものとみなす） 。 ＩＶ．目的の抗−ＲＳＶ抗体アミノ酸およびヌクレオチド配列 本明細書記載のＦａｂ Ｈｕ１９または他の抗体は、ドナー抗体の抗原結合特 異性により特徴づけられる種々の可変抗体の設計および取得において有用な可変 重鎖および／または軽鎖ペプチド配列、枠組み配列、ＣＤＲ配列、機能的フラグ メント、およびそれらのアナログ、ならびにそれらをコードする核酸配列のごと き配列を提供しうる。 一例として、かくして本発明は、ＲＳＶヒトＦａｂ Ｈｕ１９Ａ〜Ｄ由来の可 変軽鎖および可変重鎖配列、ならびにそれらに由来する配列を提供する。 可変軽鎖および重鎖ペプチド配列をコードする本発明核酸配列、またはそれら のフラグメントも、ＣＤＲまたは枠組み領域をコードする核酸配列中への突然変 異の導入、および発現のためのプラスミド中への修飾または融合核酸配列の導入 に有用である。例えば、枠組みおよびＣＤＲコーディング領域のヌクレオチド配 列中のサイレント置換を用いて、突然変異したＣＤＲ（および／または枠組み） 領域の導入を容易ならしめる制限酵素部位を作成することができる。これらのＣ ＤＲコーディング配列を本発明再形成ヒト抗体の構築に使用してもよい。 遺伝学的コードの縮重を考慮して、本発明の可変重鎖および軽鎖アミノ酸配列 、およびＣＤＲ配列、ならびにそれらの機能的フラグメントおよびアナログをコ ードする種々のコーディング配列（ドナー抗体の抗原特異性を共有している）を 構築することができる。可変鎖ペプチド配列またはＣＤＲをコードする本発明単 離核酸配列、またはそれらのフラグメントを用いて、改変抗体、例えばキメラま たはヒト化抗体を、あるいは第２免疫グロブリンパートナーに作動可能に連結さ れ る場合には本発明の他の作成された抗体を得ることができる。 本明細書記載の改変抗体および抗体の単離核酸配列コーディング部分のほかに 、他のかかる核酸配列、例えばネイティブ（native）なＣＤＲコーディング配列 に相捕的な配列またはＣＤＲコーディング領域周辺の修飾ヒト枠組み領域に相捕 的な配列も本発明により包含されることに注意すべきである。かかる配列は、遺 伝学的コードの縮重により図２および図３に示すのと同じアミノ酸配列をコード しうるすべての核酸配列を包含する。本発明に包含される他の有用なＤＮＡ配列 としては、厳密なハイブリダイゼーション条件下（T．Maniatis et al.，Molecu lar Cloning(A Laboratory Manual),Cold Spring Harbor Laboratory (1982)，p ages 387-389）において図２および図３の抗体をコードするＤＮＡ配列にハイブ リダイゼーションし、それらの抗体の抗原結合特性を保持しているる配列等があ る。かかる厳密なハイブリダイゼーション条件の一例は、４ＸＳＳＣ、６５℃で のハイブリダイゼーション、ついで、０．１ＸＳＳＣ、６５℃で１時間の洗浄で ある。あるいはまた、厳密なハイブリダイゼーション条件の典型例は、５０％ホ ルムアミド、４ＸＳＳＣ、４２℃である。好ましくは、これらのハイブリダイゼ ーションするＤＮＡ配列は少なくとも１８ヌクレオチドの長さ、すなわちほぼＣ ＤＲのサイズである。 Ｖ．改変免疫グロブリンコーディング領域および改変抗体 改変免疫グロブリンコーディング領域は、キメラ抗体、ヒト化、再形成および 免疫学的に編集されたヒト抗体などの操作された抗体を含む、改変抗体をコード する。所望の改変免疫グロブリンコーディング領域は、ＲＳＶ抗体の抗原特異性 、好ましくは、アクセプター免疫グロブリンパートナー中に挿入された、本発明 により提供されるような親和性抗体の抗原特異性を有するペプチドをコードする Ｆａｂ領域の形態にて、ＣＤＲをコードする領域を含む。 上記したように、アクセプターが免疫グロブリンパートナーである場合、これ は、目的の第２抗体領域、例えばＦｃ領域をコードする配列を含む。免疫グロブ リンパートナーはまた、軽鎖または重鎖定常領域がフレーム中に融合するかまた はリンカー配列により融合する他の免疫グロブリンをコードする配列を含んでも よい。ＲＳＶの機能的フラグメントまたはアナログに対して操作された抗体は、 同じ抗体との増強された結合を誘発するように設計されてもよい。 免疫グロブリンパートナーはまた、非−タンパク質担体分子を含め、免疫グロ ブリンパートナーが慣用手段により機能的に結合していてもよい、上記したよう なエフェクター剤と結合していてもよい。 免疫グロブリンパートナー、例えば、抗体配列と、エフェクター剤との間の融 合および連結は、いずれかの適当な手段、例えば、慣用の共有またはイオン結合 、タンパク質融合、またはヘテロ−二機能的架橋、例えばカルボジイミド、グル タルアルデヒドなどによるものであってもよい。かかる技術は、当該分野で公知 であり、慣用の化学および生物化学の教科書に簡単に記載される。 加えて、第２の免疫グロブリンパートナーおよびエフェクター剤との間に所望 量のスペースを簡単に提供する慣用のリンカー配列もまた、改変免疫グロブリン コーディング領域中に構築してもよい。かかるリンカーの設計は、当業者に周知 である。 さらに、本発明の分子のシグナルペプチドを修飾して発現を増強させてもよい 。例えば、シグナル配列とＦａｂ Ｈｕ１９重鎖配列由来のＣＤＲを有する再形 成ヒト抗体は、Campathリーダー配列(Page，M．J．et al.，BioTechnology 9:64 -68(1991))などの他のシグナル配列で置き換えた元々のシグナルペプチドを有し ていてもよい。 典型的な改変抗体、再形成ヒト抗体は、第２のヒト抗体由来の定常重領域ＣH- 1 −ＣH-3に融合した、Ｆａｂ Ｈｕ１９の抗原特異性を有する、可変の重鎖およ び完全な軽鎖ペプチドまたはタンパク質を含む。 さらなる具体例において、本発明の操作された抗体は、別の物質に結合してい てもよい。例えば、組換えＤＮＡ技術の方法を用い、完全抗体分子のＦｃフラグ メントまたはＣＨ２ ＣＨ３ドメインが酵素または他の検出可能な分子（すなわ ち、ポリペプチドエフェクターまたはレセプター分子）により置き換えられてい る、本発明の操作された抗体を製造してもよい。 本発明の他の望ましいタンパク質は、全長重鎖および軽鎖を有する完全抗体分 子、またはそのいずれかの別々のフラグメント、例えば、ＦａｂまたはＦ（ａ ｂ’）2フラグメントなど、重鎖二量体、またはそのいずれかの最小組換えフラ グメント、例えば、Ｆｖまたは一本鎖抗体（ＳＣＡ）など、または選択されたド ナーＦａｂ Ｈｕ１９と同じ特異性を有する他の分子を含んでいてもよい。 免疫グロブリンパートナーが、免疫グロブリンフレームワークまたは定常領域 のイソタイプまたはクラスなどのドナー抗体と異なる抗体由来である場合にはい つでも、操作された抗体が得られる。操作された抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ ）定常領域、および、例えば、アクセプター抗体、ドナー抗体（例えば本明細書 に記載する抗−ＲＳＶ）由来の１またはそれ以上（好ましくはすべて）のＣＤＲ などの１つの源由来の可変フレームワーク領域を含むことができる。加えて、核 酸またはアミノ酸レベルでのアクセプターｍＡｂ軽鎖および／または重鎖可変ド メインフレームワーク領域、またはドナーＣＤＲ領域の改変、例えば、欠失、置 換もしくは付加を、ドナー抗体抗原結合特異性を保持するため、または、潜在的 な免疫原性を減少するために、作成してもよい。本発明において、好ましい変異 は、Ｈｕ１９ＣおよびＨｕ１９Ｄの重鎖について例示したように（図２）（配列 番号７および８）、Ｈｕ１９ＡおよびＨｕ１９Ｂ重鎖のＣＤＲ２におけるコンセ ンサスＮ−結合グリコシル化部位の改変である。 かかる操作された抗体を、ＲＳＶｍＡｂの可変重鎖および／または軽鎖の１つ （または両方）（所望により記載したように修飾される）または以下に示す重鎖 または軽鎖ＣＤＲの１またはそれ以上を用いるように設計する。本発明の操作さ れた抗体は、中和する、すなわち、それらは望ましくは、インビトロおよびＲＳ Ｖ感染の動物モデルにおいてインビボでウイルス増殖を阻害する。 かかる操作された抗体には、ＲＳＶ抗体機能的フラグメントに融合したヒト重 鎖および軽鎖定常領域を含む再形成ヒト抗体が含まれてもよい。適当なヒト（ま Alamosデータベース、およびSwiss Proteinデータベースなどの慣用のデータベ ースから、ドナー抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の相同性により、選択 されたものでもよい。ドナー抗体のフレームワーク領域への相同性（アミノ酸ベ ースで）により特徴付けられるヒト抗体は、ドナーＣＤＲの挿入のための、重鎖 定常領域および／または重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに適当であっ てもよい。軽鎖定常または可変フレームワーク領域を提供可能な適当なアクセプ ター抗体を、同様な方法で選択してもよい。アクセプター抗体重鎖および軽鎖は 、同じアクセプター抗体起源である必要のないことに注意しなければならない。 望ましくは、異種フレームワークおよび定常領域を、ＩｇＧ（サブタイプ１〜 ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥなどヒト免疫グロブリンクラスおよびイソタ イプから選択する。Ｆｃドメインは、天然の配列に限定されず、機能を改変する 当該分野で公知の変異体を包含する。例えば、変異は、あるＩｇＧ抗体のＦｃド メインについて記載され、これは、Ｆｃ−媒介補体およびＦｃレセプター結合を 減少させ(例えば、A．R．Duncan et al.，Nature 332:563-564(1988);A．R．Dun can and G．Winter，Nature 332:738-740(1988);M.-L．Alegre et al.，J．Immu nol．148:3461-3468(1992);M．-H．Tao et al.，J．Exp．Med．178:661-667(199 3);V．Xu et al.，J．Biol．Chem.，269:3469-2374(1994)を参照)、クリアラン ス速度を改変し(J．-K．Kim et al.，Eur．J．Immunol．24:542-548(1994))、構 造異種性を減少させる(S．Angal et al.，Mol．Immunol．30:105-108(1993))。 また、ＩｇＭのテイル部分セグメントの付加または他の変異（R．I．Smith and S．L．Morrison，Biotechnology 12:683-688(1994);R．I．F．Smith et al.，J ．Immunol．154:2226-2236(1995))、またはＩｇＡのテイル部分セグメントの付 加(I．Kariv et al.，J．Immunol．157:29-38(1996))による、抗体のオリゴマー 化などの他の修飾が可能である。しかしながら、アクセプター抗体はヒト免疫グ ロブリンタンパク質配列のみを含むことを必要としない。例えば、ヒト免疫グロ ブリン鎖の部分をコードするＤＮＡ配列が、ポリペプチドエフェクターまたはリ ポーター分子などの非−免疫グロブリンアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に 融合する、遺伝子を構築してもよい。 それゆえ、改変抗体は、好ましくは天然のヒト抗体またはそのフラグメントの 構造を有し、例えば、ヒトにおけるＲＳＶ媒介疾患の治療などの有効な治療的使 用、または診断的使用に必要な特性の組み合わせを有する。 改変抗体を、ドナー抗体の特異性および高い親和性に影響することなく、可変 ドメインアミノ酸変化によりさらに修飾してもよいことが当業者に理解されるで あろう（例えばアナログなど）。重鎖および軽鎖アミノ酸が、可変ドメインフレ ームワークもしくはＣＤＲのいずれかまたはその両方において、他のアミノ酸に より置換されていてもよいことが理解される。本明細書の実施例において説明す るようなかかる再構築配列の免疫原性編集が特に好ましい。 加えて、可変または定常領域を改変し、上記したように本発明の分子の選択的 特性を増強または減少させてもよい。例えば、二量体化、Ｆｃレセプターへの結 合、または結合能力および活性成分(例えば、Angal et al.，Mol．Immunol，30: 105-108(1993)，Xu et al.，J．Biol．Chem.，269:3469-3474(1994)，Winter et al.，EP307,434-B参照)。 かかる抗体は、以下に開示するように、ＲＳＶ−媒介障害の予防および治療に おいて有用である。 ＶＩ．改変抗体および操作された抗体の製造 得られる本発明の再形成ヒト抗体を組換え宿主細胞、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ または骨髄腫細胞において発現できる。慣用の発現ベクターまたは組換えプラス ミドを、宿主細胞中での複製および発現、および／または宿主細胞からの分泌を 制御可能な慣用の調節制御配列に機能的に結合させて、改変抗体をコードするこ れらの配列を位置させることにより、製造する。調節配列には、プロモーター配 列、例えばＣＭＶプロモーター、および他の公知の抗体由来であり得る、シグナ ル配列が含まれる。同様に、相補的な抗体軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡ配 列を有する第２の発現ベクターを製造できる。好ましくは、この第２のベクター は、各ポリペプチド鎖が機能的に発現可能であることを確実にするように、コー ディング配列および選択マーカーが関係する限りにおける他は、第１に同一であ る。別に、改変抗体の重鎖および軽鎖コーディング配列は単一ベクター上に存在 してもよい。 選択された宿主細胞を、第１および第２のベクターの両方で慣用技術により共 −トランスフェクトし（または単純に単一のベクターでトランスフェクトする） 、組換えまたは合成軽鎖および重鎖の両方を含む本発明のトランスフェクトされ た宿主細胞を作成する。ついで、トランスフェクトされた細胞を、慣用の技術に より培養し、本発明の操作された抗体を製造する。組換え重鎖および軽鎖の両方 の 結合を含む抗体の製造を、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡなどの適当なアッセイにより 培養物中で測定する。同様な慣用の技術を用い、本発明の他の改変抗体および分 子を構築してもよい。 方法において用いるクローニングおよびサブクローニング工程に適当なベクタ ーおよび本発明の組成物の構築は当業者により選択できる。例えば、クローニン グベクターの慣用のｐＵＣシリーズを用いてもよい。用いた１つのベクターは、 Amersham(Buckinghamshire，United Kingdom)またはPharmacia(Uppsala，Sweden )などの供給会社から市販される、ｐＵＣ１９である。加えて、容易に複製可能 であり、多数のクローニング部位および選択遺伝子（例えば、抗生物質耐性）を 有し、容易に扱うことのできるベクターをクローニングに用いてもよい。このよ うに、クローニングベクターの選択は、本発明の限定要因ではない。 同様に、本発明の操作された抗体の発現に用いるベクターは、いずれかの慣用 のベクターから当業者が選択できる。好ましいベクターには、例えば、プラスミ ドｐＣＤまたはｐＣＮが包含される。ベクターはまた、選択された宿主細胞にお いて異種ＤＮＡ配列の複製および発現を調節する、選択された調節配列（ＣＭＶ プロモーターなど）を含む。これらのベクターは、操作された抗体または改変免 疫グロブリンコーディング領域をコードする上記したＤＮＡ配列を含む。加えて 、ベクターは、容易に操作するために、所望の制限部位の挿入により修飾された 選択された免疫グロブリン配列を組み込んでもよい。 発現ベクターはまた、例えば哺乳動物ジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子 （ＤＨＦＲ）などの異種ＤＮＡ配列の発現を増幅するのに適した遺伝子により特 徴付けられてもよい。他の好ましいベクター配列には、ウシ成長ホルモン（ＢＧ Ｈ）およびベータグロブリンプロモーター配列（ベータグロプロ）などのポリＡ シグナル配列が含まれる。本発明に有用な発現ベクターは、当業者に周知の技術 により合成されてもよい。 例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配 列などのかかるベクターの成分を、選択された宿主において組換えＤＮＡの産物 の発現および／または分泌の調節において用いるために、市販のまたは天然源か ら、または公知の方法により合成して、入手してもよい。哺乳動物、細菌、昆虫 、 酵母および真菌発現用に当該分野で公知の多数のタイプの他の適当な発現ベクタ ーをまた、本発明の目的のために選択してもよい。 本発明はまた、操作された抗体またはその改変免疫グロブリン分子のコーディ ング配列を含む組換えプラスミドでトランスフェクトされた細胞系を包含する。 クローニングおよび他のこれらのクローニングベクターの操作に有用な宿主細胞 もまた慣用である。しかしながら、最も望ましくは、イー．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ ）の種々の株由来の細胞を、クローニングベクターの複製および本発明の改変抗 体の構築における他の工程に用いる。 本発明の操作された抗体または改変抗体の発現に適した宿主細胞または細胞系 は、好ましくはＣＨＯ、ＣＯＳ、線維芽細胞（例えば、３Ｔ３）および骨髄細胞 などの哺乳動物細胞であり、より好ましくは、ＣＨＯまたは骨髄細胞である。こ のようにヒトグリコシル化パターンで分子を修飾できるヒト細胞を用いてもよい 。別に、他の真核細胞系を用いてもよい。適当な哺乳動物宿主細胞の選択、トラ ンスフォーメーション、培養、増幅、スクリーニング、および、産物の製造およ び精製のための方法は、当該分野で公知である。例えば、上記で引用したSambro okらを参照のこと。 細菌細胞は、本発明の組換えＦａｂの発現に適した宿主細胞として有用である (1992)を参照)。Ｆａｂが一般にグリコシル化されず、外への発現用に操作でき 、それにより誤った折りたたみを促進する高い濃度を減少するので、細菌細胞中 で発現されるタンパク質の、折りたたまれないかもしくは不適当に折りたたまれ た形態、または、非グリコシル化形態となる傾向は、大きな問題とはならない。 それにもかかわらず、細菌細胞中で産生されるいずれかの組換えＦａｂは、抗原 結合能力の保持についてスクリーニングすべきである。細菌細胞により発現され た分子が、適当な折りたたみ形態で産生され、輸出されている場合、その細菌細 胞は望ましい宿主である。例えば、発現用に用いられる種々のイー．コリ株が、 バイオテクノロジーの分野において宿主細胞として周知である。B．subtilis、S treptomyces、他のバチルスなどの種々の株もまた、本方法において用いてもよ い。 所望の場合、当業者に公知の酵母細胞株、ならびに、DrosophilaおよびLepido pteraなどの昆虫細胞およびウイルス発現システムもまた、宿主細胞として利用 可能である。例えば、Miller et al.，Genetic Engineering，8:277-298，Plenu m Press(1986)および本明細書で引用した参考文献を参照のこと。 本発明のベクターを構築する一般法、本発明の宿主細胞を産生するのに必要な トランスフェクション法、および本発明の改変抗体をかかる宿主細胞から製造す るのに必要な培養法は、すべて慣用技術である。同様に、一度産生された、本発 明の改変抗体は、硫酸アンモニウム沈澱、アフィニティカラム、カラムクロマト グラフィー、ゲル電気泳動などの含め、当該分野の標準的な方法により、細胞培 養内容物から精製してもよい。かかる技術は、当業者の範囲内であり、本発明を 限定するものではない。 米国特許第４８７３３１６号に記載されるものなどのトランスジェニック動物 における発現などの、さらに別の再形成抗体の発現方法を用いてもよい。これは 、トランスジェニック的に動物に組み込まれると、メスが所望の組換えタンパク 質をミルク中に産生するようにする、動物のカゼインプロモーターを用いる発現 系に関する。 所望の方法により一度発現されると、操作された抗体をついで、適当なアッセ イを用いてインビトロ活性について試験する。現在、慣用のＥＬＩＳＡアッセイ フォーマットを用いて、改変抗体のＲＳＶへの結合を定性的および定量的に評価 する。加えて、他のインビトロアッセイおよびインビボ動物モデルを用いて、通 常のクリアランスメカニズムにもかかわらず生体中での改変抗体の残留を評価す るために行われるその後のヒト臨床試験の前に、中和効力を調べてもよい。 ＶＩＩ．治療的／予防的使用 本発明はまた、ＲＳＶ−媒介症状を患うヒトを治療する方法であって、本明細 書で記載する改変抗体またはそのフラグメントの１もしくはそれ以上を含む抗体 の有効量を投与する方法に関する。 本発明の分子の使用により誘導される治療的応答は、ＲＳＶへの結合、その後 のＲＳＶ増殖の遮断により産生される。このように、本発明の分子は、治療的使 用に適した調製物および処方において、ＲＳＶ感染を患う患者にきわめて望まし い。例えば、季節性の症状の発現などを治療する場合、長期治療が望ましい。治 療の用量および期間は、ヒト循環における本発明の分子の相対的持続時間に関連 し、治療される状態および患者の一般的健康状態に応じて当業者により調整でき る。 本発明の改変抗体、抗体およびそのフラグメントを、単独で、または治療剤と して、Ｆタンパク質または他のＲＳＶ標的抗原上の他のエピトープと反応する他 の抗体、特にヒトまたはヒト化ｍＡｂと組み合わせて用いてもよい。 本発明の治療および予防剤の投与方法は、薬剤を宿主にデリバーするいかなる 適当な経路でもよい。本発明の改変抗体、抗体、操作された抗体およびそのフラ グメント、ならびに、医薬組成物は、特に非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内 、静脈内、または鼻腔内投与に有用である。 本発明の治療および予防剤は、医薬上許容される担体中に、活性成分として本 発明の改変抗体を有効量含む医薬組成物として調製してもよい。好ましくは、生 理学的ｐＨに緩衝化され、注射の容易な形態である、抗体を含む水性懸濁液また は溶液が好ましい。非経口投与用の組成物は、一般に、医薬上許容される担体、 好ましくは水性担体中に溶解された。本発明の操作された抗体の溶液またはその カクテルを含む。種々の水性担体を用いることができ、例えば、０．４％塩水、 ０．３％グリシンなどである。これらの溶液は滅菌され、粒子物質を一般に含ま ない。これらの溶液を、慣用の、周知の滅菌技術（例えば濾過）により滅菌して もよい。組成物は、ｐＨ調整および緩衝化剤などの適当な生理学的条件に必要な 医薬上許容される助剤物質を含んでいてもよい。かかる医薬組成物中の本発明の 抗体の濃度は、広範に変化でき、すなわち、重量で約０．５％以下から、一般に 約１％または少なくとも１％から、１５〜２０％までであり、主に液体容積、粘 性等に基づき、選択される投与の方法にしたがって、選択される。 したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水、お よび約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば、約５０ｎｇ〜約８０ｍｇもしくはより好 ましくは約５ｍｇ〜約７５ｍｇの間の本発明の操作された抗体を含むように調製 できる。同様に、静脈注入用の本発明の医薬組成物は、約２５０ｍｌまでの滅菌 リンゲル溶液、および約１〜約７５、好ましくは約５〜約５０ｍｇ／ｍｌの本発 明の操作された抗体を含むように作成できる。非経口投与可能な組成物を調製す るための実際の方法は、当業者に明らかであり、より詳細には、例えば、Reming ton's Pharmaceutical Science，15th ed.，Mack Publishing Company，Easton ．Pennsylvaniaに記載される。 医薬調製物である場合、本発明の治療および予防剤は、単位投与形態にあるの が好ましい。適当な治療上有効用量は、当業者により容易に決定できる。ヒトま たは他の動物における炎症性疾患を有効的に治療するには、７０ｋｇの体重当た り約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇの本発明のタンパク質または抗体の１投与を非経口 で、好ましくは、静中または筋肉内(intramuscularly)で投与すべきである。必 要ならば、かかる投与を、医師により適当であると選択される適当な時間間隔で 繰り返してもよい。 本発明の改変抗体および操作された抗体はまた、ＲＳＶ媒介疾患の決定などの 診断法において、またはかかる疾患の治療の追跡プログレスにおいて用いてもよ い。診断試薬として、これらの改変抗体を、ＥＬＩＳＡ、および、血清、血漿も しくは他の適当な組織中のＲＳＶレベル、または培養物におけるヒト細胞による 放出の測定のための他の慣用のアッセイフォーマットにおいて用いるために、慣 用的に標識してもよい。改変抗体を用いるアッセイの性質は、慣用であり、本開 示を限定するものではない。 本明細書で記載する抗体、改変抗体またはそのフラグメントは、保存用に凍結 乾燥し、使用前に適当な担体中に復元できる。この方法は、慣用の免疫グロブリ ンで有効であることが示されており、当該分野で公知の凍結乾燥および復元技術 を用いることができる。 以下の実施例は、典型的な操作された抗体の構築および適当なベクターおよび 宿主細胞中でのその発現を含む、本発明の種々の態様を示し、本発明の範囲を限 定として示すものではない。すべてのアミノ酸は、慣用の３文字または１文字コ ードで示す。すべての必要な制限酵素、プラスミドおよび他の試薬ならびに材料 を、特記しない限り市販されるものから入手した。すべての一般的なクローニン グライゲーション、および他の組換えＤＮＡ手法は、上記に引用したT． Maniatisら、またはその第２版（１９８９）（同じ出版者による、Sambrookら） （「Sambrookら」）に記載されるように行った。 実施例Ａ Ｈｕ１９ＦａｂのｍＡｂ型Ａへの変換：直接的クローニング 哺乳動物細胞における発現の場合、本明細書中でＨｕ１９Ｆａｂと称するＦａ ｂクローン１９プラスミド（ATCC受託番号69072として、C．Barbas IIIら、Proc ．Nat'l．Acad．Sci．（USA）89，10164-10168(1992)およびPCT出願公開公報第W O94/06448号、出願番号第PCT/US93/08786号に引用された細胞系統クローン１９ ）由来のＨ鎖可変領域ならびにＬ鎖可変および定常領域を、ＣＭＶプロモーター によって抗体鎖の発現が行われるプラスミドＰＣＤＮの誘導体中でクローン化し た。プラスミドＰＣＤ−ＨＣ６８Ｂを全長Ｈ鎖のクローニングおよび発現に用い 、プラスミドＰＣＮ−ＨｕＬＣを全長Ｌ鎖のクローニングおよび発現に用いる（ 図１は、Ｈｕ１９ｍＡｂの型Ａのクローニング方法を示す）。 最初の構築物において、クローニングに用いたＰＣＲプライマーによって導入 されたアミノ末端の配列における変化は、改変されなかった。Ｈ鎖の場合、可変 領域をＨｕ１９Ｆａｂプラスミド（C．Barbas IIIら、Proc．Nat'l．Acad．Sci ．（USA）89，10164-10168(1992)）からＸｈｏ１−Ｂｓｐ１２０Ｉフラグメント として抽出し、ＰＣＤ−ＨＣ６８Ｂ中の同一部位に導入した。Ｘｈｏ１部位はＰ ＣＲプライマーによってアミノ末端に導入し、ＰＣＤ−ＨＣ６８Ｂ中の同一部位 でクローン化すると、フレーム内でＣａｍｐａｔｈリーダー配列が前に位置する （Page，J.M.ら、Biotechnology 9:64-68(1991)）。Ｂｓｐ１２０Ｉ部位はＣＨ １ドメインの始めの天然の高度保持配列であり、ＰＣＤ−ＨＣ６８Ｂ中の同一部 位でクローン化すると、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１〜ＣＨ３領域の残存配列とともに フレーム内に存在する（図１）。得られる構築物Ｈｕ１９ＡＨｃｐｃｄにおいて 、Ｃａｍｐａｔｈリーダーの直後のアミノ酸は、ＥＶＱＬＬＥＥ（図２、配列番 号５、アミノ酸２０−２６）であり、ここに、残基ＬＥはＸｈｏ１クローニング 部位のヌクレオチド配列によってコードされている。プラスミドＨｕ１９ＡＨｃ ｐｃｄの完全なヌクレオチド配列を図４Ａ（配列番号１４）に示す。 注目すべき配列分析は、Ｈｕ１９Ｆａｂプラスミド由来のＨ鎖領域内で、公表 された配列（C．Barbars IIIら、Proc．Nat'l．Acad．Sci．（USA）89，10164-1 0168(1992)、PCT公開公報第WO94/06448号）との塩基の相違を示した。変化は、 位置１５および１６でアミノ酸の相違をコードする（Kabatらのコンセンサス番 号による（Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、NIH P ublication No.91-3242，1991）：Ｈｕ１９ＡＨｃｐｃｄベクターにおけるＰＧ に対する公表された配列におけるＬＡ（本明細書の図２およびWO94/06448の図４ を参照））。この矛盾は、最初の公表された配列における誤りを示すに違いない 。これらの位置でのＰＧは、公表されたヒト抗体の間の最も近接な相同物（Kaba tら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、NIH Public ation No．91-3242，1991）および可能な生殖細胞系親配列（下記、型Ｂ参照） における共通配列である。さらに、Ｈｕ１９Ｆａｂプラスミドを用いて開始した ３回の独立したクローニング由来の配列は、全て、これらの位置でＰＧをコード した。 Ｌ鎖の場合、Ｈｕ１９Ｆａｂプラスミドの可変および定常領域をＳａｃ１/Ｘ ｂａ１フラグメントとしてｐＣＮ−ＨｕＬｃベクター中の同じ部位でクローン化 した。どちらの制限部位も、ＰＣＲ増幅に用いたプライマーによって導入された 制限部位に相当した。Ｓａｃ１部位は、ＰＣＲプライマーによってアミノ末端に 導入され、ｐＣＮ−ＨｕＬＣ中の同一部位でクローン化する場合、フレーム内で Ｃａｍｐａｔｈリーダー配列が前に位置する（Page,J.M.ら、Biotechnology 9:6 4-68(1991)。従って、成熟Ｌ鎖の最初の２個のアミノ酸は欠失する。得られる構 築物Ｈｕ１９ＡＬｃｐｃｎにおいて、リーダーの直後の最初の２個のアミノ酸は ＥＬ（図３、Ａ部分）であり、ここに、ＥＬ残基はＳａｃ１クローニング部位の ヌクレオチド配列によってコードされている。定常領域のカルボキシ末端に用い たＰＣＲプライマーは、成熟Ｌ鎖の位置２０２のアミノ酸をセリンからロイシン へ変化させるヌクレオチド置換を導入する（図３、Ｂ部分）。同じＰＣＲプライ マーによって導入されたＸｂａ１制限部位は、コーディング領域の外側に位置し 、成熟Ｌ鎖の最終的なアミノ酸配列に対して影響を与えない。プラスミドＨｕ１ ９Ａｐｃｎの完全なヌクレオチド配列を図４Ｂに示す。 前記のＨ鎖の場合のように、公表された配列（C．Barbars IIIら、Proc．Nat' l．Acad．Sci．（USA）89，10164-10168(1992)、PCT公開公報第WO94/06448号） とＨｕ１９ＡＬｃｐｃｎベクター中で得られる配列の間にＬ鎖に関する配列の矛 盾がある。１個の塩基の変化の結果、フレームワーク４において、位置９７にて （Kabatら、（Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、NI H Publication No．91-3242，1991）においても共通位置９７）グルタミン酸の 代わりにＨｕ１９ＡＬｃｐｃｎにおいてグリシンであった（本明細書の図３およ びWO94/6448の図４を参照）。グルタミン酸ではなくグリシンは、ヒトＪ生殖細 胞系Ｊミニ遺伝子における該位置でコードされており、ヒト抗体配列の大量のコ レクションの間でグルタミン酸は観察されなかった（Kabatら、Sequences of Pr oteins of Immunological Interest、第５版、NIH Publication No．91-3242，1 991）。また、Ｈ鎖の場合のように、グリシンをコードする配列が、最初のＦａ ｂ１９ベクター由来の３つの異なるクローニングに関して観察された（C．Barba rs IIIら、Proc．Nat'l．Acad．Sci．（USA）89，10164-10168(1992)、PCT公開 公報第WO94/06448号）。これらの結果は、Ｆａｂ１９Ｌ鎖の当初の公表された配 列が誤りであることを立証した。 ベクターのＨｕ１９ＡＨｃｐｃｄおよびＨｕ１９ＡＬｃｐｃｎセットは、ＣＯ Ｓ細胞およびＣＨＯ細胞において抗体Ｈｕ１９Ａを生産するために用いられた。 実施例Ｂ 型Ｂ：エディットされたＦａｂ Ｈｕ１９ ＨおよびＬ鎖のクローニング Ｆａｂ１９Ｈ鎖の可変領域のクローニングにおいて、予測される生殖細胞系配 列に関する非−共通アミノ酸変化は、ＰＣＲプライマーによってアミノ末端に導 入された（C．Barbars IIIら、Proc．Nat'l．Acad．Sci．（USA）89，10164−10 168(1992)）。Ｈ鎖の可能なアミノ末端を決定するために、Ｆａｂ１９Ｈ鎖の可 変領域のペプチド配列を全ての既知のヒト生殖細胞系Ｈ鎖配列と照らし合わせた 。この照合の結果に基づいて、生殖細胞系アミノ末端は、型Ａに存在する配列Ｅ ＶＱＬＬＥＥよりもむしろ、ＱＶＱＬＶＥまたはＥＶＱＬＶＥのいずれかである と予想される。Ｎ末端を修正するために、最初のＦａｂクローン１９Ｈ鎖ペプ チドをスミスクライン・ビーチャム（SmithKline Beecham）で以前にクローン化 したヒトＨ鎖配列と照らし合わせた。そのリーダー配列の始めからＰＣＲ増幅を 経て得られた９７Ｂ２７と称するクローンは、許容できるＮ末端ＱＶＱＬＶＥを 有し、Ｆａｂ１９Ｈ鎖における該領域を置換するために用いられた。特に、Ｈｕ １９ ＦａｂプラスミドにおけるＦａｂ１９Ｈ鎖を、ＣＨ１の始めの天然のＢｓ ｐ１２０Ｉ部位にまたがる定常領域プライマー、および成熟タンパク質のアミノ 酸３および４にてＰｖｕＩＩ部位（クローン９７Ｂ２７における天然の部位に相 当する）を生じた可変領域プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。該プライマーは 、また、型Ａ構築物におけるように、Ｆａｂ１９Ｈ鎖のアミノ末端にてコーディ ング配列に、ＱＬＬＥＥの代わりにアミノ酸３−６のＱＬＶＥのアミノ酸配列を コードする変化を導入した。ＰＣＲフラグメントは、一連のクローニング工程に よって制限酵素ＰｖｕＩＩおよびＢｓｐ１２０Ｉで切断し、そのＰｖｕＩＩ部位 にて９７Ｂ２７と結合した。Ｈｕ１９ＢＨｃｐｃｄと称する得られるクローンは 、リーダーおよびクローン９７Ｂ２７の可変領域の最初の３個のアミノ酸を含有 し、そのアミノ末端にて共通配列ＱＶＱＬＶＥをコードした(図２)。Ｈｕ１９Ｂ Ｈｃｐｃｄのヌクレオチド配列をＨ鎖をコードする領域に関して図４Ｃ（配列番 号２０）に示す。Ｈｕ１９ＡＨｃｐｃｄと異なる配列を太字にする。 Ｆａｂクローン１９Ｌ鎖の可変領域のクローニングにおいて、Ｆａｂ１９Ｌ鎖 の最初の４個のアミノ酸がＥＩＥＬであるように、ＰＣＲプライマーによって、 クローニング目的のためにアミノ末端に変化を導入した。Ｌ鎖の可能なアミノ末 端を決定するために、Ｆａｂ１９Ｌ鎖の可変領域のペプチド配列を全ての既知の ヒト生殖細胞系κ鎖配列と照らし合わせた。この照合結果に基づいて、生殖細胞 系アミノ末端はＤＩＱＭであると予測される。Ｆａｂ１９ Ｌｃのアミノ末端を 予測される生殖細胞系配列に変換するために、Ｆａｂ１９ Ｌ鎖をＳＢで以前に クローン化したヒトκ鎖配列と照らし合わせた。そのリーダー配列の中間部から ＰＣＲ増幅によって得られた細胞系統ＡＧ１−３７から得られたκ鎖であるＡＧ １−３７と称するクローンは、所望のＮ末端を有し、Ｆａｂ１９ Ｌ鎖に修正を 導入するために用いられた。リーダー配列のＮ末端部分は、発現ベクターによっ て提供され、このファミリーのリーダー領域の共通配列であった。該構築物の場 合、Ｌ鎖コーディング領域は、Ｈｕ１９Ｆａｂベクター（図１）からＨｉｎｆＩ ／ＸｂａＩフラグメントとして切り出された。ＨｉｎｆＩは、成熟タンパク質の アミノ酸１８および１９にまたがる部位を認識し、また、クローンＡＧ１−３７ にも存在する。一連のクローニング工程によって、Ｆａｂ１９Ｌ鎖のＨｉｎｆＩ ／Ｘｂａ１フラグメントをクローンＡＧ１−３７中のＨｉｎｆ１部位に連結した 。最終的な構築物は、リーダーおよびＶ領域のアミノ酸１９で開始するＦａｂ１ ９ Ｌ鎖の可変および定常領域に連結したＡＧ１−３７可変領域の最初の１８個 のアミノ酸からなった。Ｈｕ１９ＢＬｃｐｃｎと称する得られるクローンは、可 変領域の最初の４個のアミノ酸をコードする領域においてのみ改変され、型Ａに 存在するＥＩＥＬの代わりに共通配列ＤＩＱＭをコードする（配列番号１１、ア ミノ酸２１−２４）（図３Ａ）。プラスミドＨｕ１９ＢＬｃｐｃｎのヌクレオチ ド配列をＬ鎖をコードする領域に関して図４Ｄ（配列番号２２）に示す。Ｈｕ１ ９ＡＬｃｐｃｎと異なる配列を太字にする。 ベクターのＨｕ１９ＢＨｃｐｃｄおよびＨｕ１９ＢＬｃｐｃｎセットは、ＣＯ Ｓ細胞およびＣＨＯ細胞において抗体Ｈｕ１９Ｂを生産するために用いられた。 実施例Ｃ 型Ｃ＆Ｄ：グリコシル化部位の除去のための Ｈｕ１９Ｂ Ｈ鎖のＣＤＲ２の変異 Ｎ−結合グリコシル化部位は、Ｈ鎖のＣＤＲ２ループ内でコードされる。該グ リコシル化は、真核細胞において生産されるｍＡｂにおいて不均一性および抗原 の結合において干渉の可能性を加える。該グリコシル化部位を除去するために、 ＰＣＲオーバーラップ技術によって２つの異なる残基にて別々に変異を導入した 。第１の変異の場合、成熟Ｈｕ１９Ｂ Ｈ鎖の位置６１にてセリンをアラニンで 置換して、Ｈｕ１９Ｃ Ｈ鎖を作成した。第２の置換の場合、位置５９にてアス パラギンをグルタミンに変化させて、Ｈｕ１９Ｄ Ｈ鎖を作成した。 特に、変異をコードする第１セットのプライマーならびにプラスミドＨｕ１９ Ｂｐｃｄ中のＣＭＶプロモーターおよびＣＨ２定常領域内の配列にアニーリング する第２セットのプライマーを各々、外側の５’および３’プライマーとして用 いるＰＣＲオーバーラップ技術によって、変異を導入した。最終的なＰＣＲ産物 を制限酵素、ＥｃｏＲ１およびＢｓｐ１２０Ｉで消化し、Ｈｕ１９ＢＨｃｐｃｄ ベクター中の同一部位ででクローン化して、Ｈｕ１９ＣＨｃｐｃｄ（Ｓｅｒから Ａｌａへの変異）およびＨｕ１９ＤＬｃｐｃｄ（ＡｓｐからＧｌｎへの変異）を 作成した（図２）。最終的な構築物を配列決定して、変異が存在することを確認 した。Ｈｕ１９ＣＨｃｐｃｄおよびＨｕ１９ＤＨｃｐｃｄにおけるＨ鎖領域のヌ クレオチド配列を図４Ｅおよび４Ｆ（配列番号２５および２７）に示す。Ｈｕ１ ９Ｈｃｐｃｄとの相違を太字にする。 実施例Ｄ 型Ｃ：エディットされた定常領域のクローニング Ｆａｂ１９Ｌ鎖の最初のクローニングにおいて、ＰＣＲプライマーによってカ ルボキシ末端に故意に変化を導入して、天然のＳａｃ１部位を除去した（Barbas ら、前掲）。従って、Ｆａｂ１９Ｌ鎖の位置２０２のアミノ酸は、セリンからロ イシンに変化させた。この変化を以下のように修正した。プラスミドＨｕ１９Ｂ ＬｃｐｃｎをＥｃｏＲ１およびＢｂｓ１、ヒトκ定常領域のアミノ末端に近い天 然の制限部位で切断し、リーダー、可変領域およびκ定常領域の最初の５個のア ミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含有する４０５ｂｐフラグメントを単離 した。コーディング領域に対して遠位にＸｂａＩ部位を有する正常なヒトκ定常 領域を含有するプラスミドＬｃベクター４、ｐｕｃ１８誘導体をＢｂｓ１および Ｘｂａ１で切断し、アミノ酸６で始まる全κ定常領域をコードするヌクレオチド 配列を含有する３２１ｂｐフラグメントを単離した。該フラグメントは、天然の Ｓａｃ１部位をカルボキシ末端の近くに含有し、位置２０２でセリンをコードす る。プラスミドＨｕ１９ＢＬｃｐｃｎもまた、ＥｃｏＲ１およびＸｂａ１で切断 し、プラスミドＨｕ１９ＢＬｃｐｃｎ由来のベクター配列の残りを含有する４９ ４７ｂｐフラグメントを単離した。３つのフラグメントを一緒に連結して、Ｈｕ １９ＣＬｃｐｃｎを作成した。Ｈｕ１９Ｃ Ｌ鎖のアミノ酸配列を図３Ａおよび ３Ｂ（配列番号１１および１２）に示し、Ｌ鎖領域のヌクレオチド配列を図４Ｇ （配列番号２９）に示す。Ｈｕ１９ＡＬｃｐｃｎとの相違を太字にする。ＣＯＳ 細胞およびＣＨＯ細胞において、各々、抗体Ｈｕ１９ＣおよびＨｕ１９Ｄを生産 するために、ベクターＨｕ１９ＣＬｃｐｃｎをＨｕ１９ＣＨｃｐｃｄまたはＨｕ １９ＤＨｃｐｃｄとともに使用した。 実施例Ｅ 哺乳動物細胞におけるＨｕ１９Ｍａｂの生産： 最初の特徴づけのために、Current Protocols in Molecular Biology（F.M．A usubelら編、1998，John Wi1ey & Sons，vol．1，section 9.1）に記載のように 、各型に対するｍＡｂ構築物、Ｈｕ１９Ａ ＨおよびＬ鎖、Ｈｕ１９Ｂ Ｈおよび Ｌ鎖、Ｈｕ１９Ｃ ＨおよびＬ鎖ならびにＨｕ１９Ｃ Ｌ鎖と一緒にＨｕ１９Ｄ Ｈ鎖をＣＯＳ細胞中に発現させた。トランスフェクション後１日目に、培養生育 培地を血清無しの培地と取り替え、それを３日目に替えた。血清無しの培地は特 許登録を有する処方であったが、ＩＴＳTM Ｐｒｅｍｉｘ（インスリン、トラン スフェリン、セレニウム混合物-Collaborative Research，Bedford，MA）および １ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡで補足したＤＭＥＭを用いて満足のいく結果が得られる。 ｍＡｂを３日＋５日目の条件の培地から、例えば、Ｐｒｏｓｅｐ Ａアフィニテ ィー樹脂（Bioprocessing Ltd.，UK）を用いる標準タンパク質Ａアフィニティー クロマトグラフィー法（例えば、Protocols in Molecular Biologyに記載）によ って調製した。 より多量のＨｕ１９ ｍＡｂ（１００−２００ｍｇ）を生産するために、ベク ターを特許登録を有するＣＨＯ細胞系中に導入した。しかしながら、以前に記載 された（P.Heensleyら、J．Biological Chemistry 269:23949-23958(1994)）の ように、ｄｈｆｒ-ＣＨＯ細胞を用いて同様の結果が得られるであろう。簡単に 言うと、全量３０μｇの直線状プラスミドＤＮＡ（Ｈ鎖およびＬ鎖ベクターのＡ 、Ｂ、ＣまたはＤ／Ｃセットの各々１５μｇ）を１ｘ１０7細胞にエレクトロポ レートした。細胞を最初、９６ウェルプレートにおいてヌクレオシド無しの培地 中で選択した。３ないし４週後、生育陽性ウェル由来の培地をＥＬＩＳＡアッセ イを用いてヒト免疫グロブリンに関してスクリーンした。最も高い発現コロニー を、トランスフェクトしたベクターの増幅のための高濃度のメトトレキサート中 で発達させ、選択した。抗体を条件下の培地から、タンパク質Ａアフィニティー クロマトグラフィー（Protein A sepharose，Pharmacia）、次いで、サイズ排除 クロマトグラフィー（Superdex 200，Pharmacia）を用いる標準的手法によって 精製した。 溶出した抗体の濃度および抗原結合活性は、ＥＬＩＳＡによって測定する。フ ラクションを含有する抗体をプールし、さらに、サィズ排除クロマトグラフィー によって精製する。いずれかのかかる抗体に関して予想されるように、ＳＤＳ− ＰＡＧＥによって、主なタンパク質産物は、非−還元条件下で約１５０ｋＤａに 、還元条件下で５０および２５ｋＤａの２つのバンドとして移動した。ＣＨＯ細 胞中に生産された抗体の場合、純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判断すると＞ ９０％であり、濃度は、アミノ酸分析によって正確に測定した。 実施例Ｆ ＦａｂのＨｕ１９Ｂ ｍＡｂからの製造：重鎖ＣＤＲ２においてグリコシル化 を有する試料および有さない試料 ＭＡｂの精製 ｍＡｂ １９Ｂについて本明細書で詳述したと実質的に同様の精製方法を用い て各ｍＡｂを精製した。６日培養物からならし培地を得、濾過滅菌し、線流速（ linear flow rate）９８cm／時で２０mMリン酸ナトリウム、１５０mM塩化ナトリ ウム、ｐＨ７（ＰＢＳ）中で平衡させた２.５×５.１cmプロテインＡ（Protein Ａ）（ファルマシア（Pharmacia）、高速流）に適用した。該カラ ムを平衡緩衝液で洗浄し、１００mMグリシンｐＨ２.５で溶離した。ｍＡｂを含 有する溶出フラクションをすぐに１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ５.０に調節し、 ４.２mg／mLの濃度で、１５０mM NaClを含有する２０mMリン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ７.０中で平衡させたスーパーデクス（Superdex）２００サイズ排除カラム （２.６×７０cm）に適用した。約１５０ｋＤａの見掛分子量でカラムにより保 持された単量体ｍＡｂをプールし、限外濾過により５mg／mLに濃縮し、濾過滅菌 後、４℃で保存した。 ＭＡｂ １９ＢおよびＭＡｂ １９Ｃの電気泳動分析 還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ｍＡｂ １９Ｂは、各々ＩｇＧの重鎖および軽 鎖に相当する５２ｋＤａおよび２８ｋＤａで２つの主要バンド、ならびに、総タ ンパク質の約７％を表す５９ｋＤａの追加のバンドとして分かれた（図５）。Ｓ ＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパク質分解性消化（以下を参照）から取り出した後の ２つの重鎖のＬＣ／質量スペクトル分析は、５９ｋＤａの種類が予測ＶHグリコ シル化部位で炭化水素を含有するｍＡｂ １９Ｂの迫加の糖形態（glycoform）を 表すことを確認した。対照的に、このＶHグリコシル化部位が除去されているｍ Ａｂ １９Ｃの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図５）は、このｍＡｂが、予想され るとおり、低分子量（５２ｋＤａ）重鎖の種類のみを含有することを示した。 ｍＡｂ １９Ｂの炭化水素分析 Ｈｕ１９Ｂ構築物は、重鎖のＣH２ドメインにおける正常なグリコシル化部位 −Ａｓｎ299−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−に加えて、重鎖の可変部におけるＮ結合グリコ シル化のため追加のコンセンサス配列−Ａｓｎ59−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−を含有する 。還元、アルキル化、および、トリプシン消化の後の液体クロマトグラフィー、 エレクトロスプレー質量分析法（ＬＣ−ＥＬＭＳ）による両重鎖バンドの分析は 、５９ｋＤａバンドが、Ａｓｎ299でグリコシル化されることに加えて、Ａｓｎ5 9 でグリコシル化される変異体を含有することを示した。Ａｓｎ59での炭水化物 は、主にビアンテナリー（biantennary）であり、コアは、２つのシアル酸残基 を有するフコシル化炭水化物である。これは、ＣＨＯ発現糖タンパク質（ｓＣＲ −１およびｓＣＤ４など）において見出される共通の炭水化物構造であるが、シ アル酸を全く欠いているＡｓｎ２９９部位で見出される炭水化物とは異なる。ｍＡｂ １９Ｂ糖変異体（glycovariant）の精製 Ｍａｂ １９Ｂ（２mg）を２０mMトリス、ｐＨ８.５に対して透析させ、線流速 ３００cm／時で同緩衝液で平衡させた０.５×５cmモノ（Mono）Ｑカラム（ファ ルマシア）に適用した。該カラムを平衡緩衝液で洗浄し、同緩衝液中０mMから５ ０mMまでのNaCl勾配液２０カラム容量倍で溶離した（図６）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ により決定される糖変異体を含有するフラクションをプールし、ＰＢＳに対して 透析し、濾過滅菌し、４℃で保存した。 タンパク質分解性消化によるＦａｂの調製 ｍＡｂ １９Ｂ（４８mg）を取り出し、希水酸化ナトリウムでｐＨを７.０に調 節した。１０mM ＥＤＴＡを含有する１００mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７. ３）２.５ml；１mM ＥＤＴＡを含有する１０mMリン酸ナトリウム緩衝液中１００ mMシステイン１.３ml；および結晶パパイン（ベーリンガー（Boehringer）、１ ０mg／ml）２０μlを添加した。該試料を３７℃で２０時間インキュベートし、 消化物を線流速６７cm／時でＰＢＳ中で平衡された１.５×２.６cmプロテインＧ カラムに適用した。該カラムをＰＢＳで洗浄し、Ｆａｂを含有する非結合フラク ションを回収し、１０,０００分子量切断膜を装着したアミコン（Amicon）限外 濾過セル中で５mlに濃縮し、線流速２３cm／時でＰＢＳ中で平衡させた２.６× ７０cmスーパーデクス２００（ファルマシア）サイズ排除カラムに適用した。Ｆ Ａｂ（総収量１２mg）がサイズ排除カラム上で単量体として溶出し、非還元ＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥによる分析は、４５ｋＤａで主要バンドおよび４７ｋＤａで糖形態 を示した。 Ｆａｂ糖変異体の分離 切断されたｍＡｂ １９Ｂからのグリコシル化および非グリコシル化Ｆａｂの 混合物を２０mM酢酸ナトリウムｐＨ４.５に対して透析し、３００cm／時で、２ ０mM酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４.５で平衡させた０.５×５cmモノＳカラム（フ ァルマシア）に適用した（４mg）。次いで、該カラムを平衡緩衝液で洗浄し、１ ００mM NaClを含有する平衡緩衝液でアイソクラチック溶離した。グリコシル化 Ｆａｂは、５カラム容量倍後に溶出したが、一方、非グリコシル化ＦＡｂは、よ り長く保持され、６カラム容量倍後に溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判定 されたグリコシル化Ｆａｂのみを含有したフラクションをプールし、出発緩衝液 で１：１に希釈し、３００cm／時で、０.１６×５cmモノＳカラムに再適用した 。該Ｆａｂを再度１００mM NaClで溶離し、グリコシル化Ｆａｂが最も豊富なフ ラクションをプールし、ＰＢＳ ｐＨ７.０に対して透析し、濾過滅菌した。ＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥ分析によると、このフラクションは、グリコシル化された種類に＞ ９０％富んでいた（図７）。該プロセスにより、各々、非グリコシル化Ｆａｂ３ .３mgおよびグリコシル化Ｆａｂ ０.１６mgが得られた。 実施例ＧＨｕ１９ ｍＡｂおよびＦａｂクローン１９タンパク質の組換えＦタンパク質 への結合 種々の抗体構築物の組換えＦタンパク質への結合を標準的な固相ＥＬＩＳＡ法 で測定した。ＰＢＳ ｐＨ７.０中で希釈した抗原をポリスチレン丸底マイクロプ レート（ダイナテク（Dynatech）、イムノロン（Immunolon）II）に１８時間吸 着させた。次いで、ウエルを吸引し、１％トゥイーン２０を含有するＰＢＳ中０ .５％沸騰カゼイン（ＢＣ）（ＰＢＳ／０.０５％ＢＣ）で２時間ブロックした。 抗体（５０μl／ウエル）を０.０２５％トゥイーン２０を含有するＰＢＳ／０. ５％ＢＣ中で濃度を変化させながら希釈し、抗原塗布ウエル中で１時間インキュ ベートした。プレートを、タイターテク（Titertek）３２０マイクロプレート洗 浄器を用いて０.０５％トゥイーン２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、次いで 、１：５０００に希釈したＨＲＰ標識タンパク質Ａ／Ｇ（５０μl）を添加した 。３回洗浄した後、ＴＭＢｌｕｅ基質（ＴＳＩ、＃ＴＭ１０２）を添加し、プレ ートをさらに１５分間インキュベートした。１Ｎ Ｈ2ＳＯ4の添加により反応を 停止させ、バイオテク（Biotek）ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０nmで吸光度 を測定した。 Ｆａｂ１９およびｍＡｂ構築物１９Ｂの抗原結合エピトープを競合ＥＬＩＳＡ 法で試験した。試験抗体構築物を、ＲＳＭＵ１９またはＢ４の濃度を増加させな がら混合し、Ｆタンパク質塗布ウエルに添加した。ｍＡｂｓ ＲＳＭＵ１９およ びＢ４により認識されたエピトープ領域は、Arbiza et al.，J．Gen'l Virol．7 3:2225-34(1992)に従前に記載されている。競合試験において用いたＦａｂ１ ９またはｍＡｂ １９Ｂの濃度を、９０％のＦ抗原への最大結合が得られるよう に従前に決定した。他のｍＡｂの存在下でのＦａｂ１９またはｍＡｂ １９Ｂの 結合を、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを用いて検出した。該反応は、前記に従っ て行った。 Ｆａｂ１９およびｍＡｂ構築物１９Ａまたは１９Ｂは、モル濃度に基づいてｒ Ｆタンパク質への等価な結合を示した。Ｆａｂ１９またはｍＡｂ １９ＢのｒＦ （組換えＦ）タンパク質への結合は、ｍＡｂ Ｂ４により阻害されたが、ＲＳＭ Ｕ１９により阻害されず、これは、これらの構築物により認識されたエピトープ 領域がＦタンパク質の領域ａａ２５５−２７５に局在化することを示す。 表１：ｍＡｂ １９Ｂにより認識されたウイルスＦタンパク質エピトープ *抗原認識に対して重要なアミノ酸残基 ｍＡｂ １９Ｂはまた、天然形態で示されるＦタンパク質の認識を示すＲＳＶ 感染細胞に対する特異的結合を示した。ＴＣＩＤ５０ ＲＳロングウイルス約５ ０個に感染したＶＥＲＯ細胞を、ＣＰＥが＞９０％に達した場合に９０％メタノ ール中で固定し、上記ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて抗原として用いた。ビオ チニル化ｍＡｂ １９Ｂの結合を、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを用いて検出 した。このアッセイでは、ｍＡｂ １９ＢについてのＥＣ５０は、３４＋／−ng ／mlであった。 実施例Ｈ Ｈｕ１９抗体のイン・ビトロ抗ウイルス活性 Beeler et al.（J．of Virology 63:2941-2950(1989)）により記載されたイン ・ビトロ微量中和アッセイの変形法を用いてＦａｂフラグメントのウイルス誘発 細胞融合阻害能を測定した。このアッセイでは、２％ＦＣＳを含有する最少必 須培地（ＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ2で４時間、ＲＳロング株ウイルス（約 １００ ＴＣＩＤ50／ウエル；アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション （American Type Culture Collection）ＡＴＣＣ ＶＲ−２６）５０ulをＶＥＲ Ｏ細胞（５×１０3／ウエル；ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１）０.１mlと混合した。次 いで、ウイルス感染細胞を含有するウエルに試験試料（５０ul）の連続二倍希釈 （デュプリケート）を添加した。対照培養物は、ウイルスのみと一緒にインキュ ベートした細胞（正のウイルス対照）または培地のみと一緒にインキュベートし た細胞を含有した。培養物を、５％ＣＯ2中、３７℃で６日間インキュベートし た。この時点で、ウイルス対照ウエル中の細胞変性効果（ＣＰＥ）は、≧９０％ であった。試験試料の連続希釈物を、ＶＥＲＯ細胞（５×１０3）の添加前に５ ％ＣＯ2中、３７℃で２時間、ＲＳウイルスの１００ ＴＣＩＤ50（各５０ul）と 混合した以外は、上記と同様に中和アッセイを行った。 細胞変性効果についての顕微鏡試験をＥＬＩＳＡにより確認した。培養物から 培地を吸引し、９０％メタノール／０.６％Ｈ2Ｏ2 ５０ulと交換した。１０分後 、固定液を吸引し、プレートを一夜風乾した。ウイルス抗原を、ｍＡｂ Ｂ４の ビオチニル化ヒト／ウシキメラ誘導体（ＲＳＣＨＢ４；１ug／ml）を用い、次い で、１：１０,０００に希釈した（各ロットを滴定して、最適な濃度を決定した ）ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ベーリンガー−マンハイム（Boehringer-Man nheim））を用いて、固定培養物中で検出した。ＴＭＢｌｕｅを用いて該反応を 行い、１Ｎ Ｈ2ＳＯ4の添加により停止させた。４５０nmで吸光度を測定した（ Ｏ.Ｄ.450）。 融合阻害または中和力価を、試験試料の相互希釈、または、ウイルス対照と比 較してＥＬＩＳＡシグナルの５０％減少（ＥＤ50）を生じた抗体の濃度として定 義した。標準ウイルス力価決定によるＥＬＩＳＡにおいて作成した曲線に基づい て、ウエルにおけるＯ.Ｄ.450の５０％減少は、ウイルス力価の≧９０％減少に 相当した。ＥＤ50を決定するために、複製培養物についての平均吸光度（試験試 料の希釈物ごとに）を試料の希釈に対してプロットした。(ウイルス感染細胞の 平均吸光度＋非感染細胞の平均吸光度)／２として定義される５０％ポイントの 計算は、用量滴定の回帰分析に基づいた。 ＳＢ ２０９７６３は、P．R．Tempest et al.，Biotechnology 9，266-271(19 91)に記載されているようにＲＳＭＵ１９のヒト化誘導体である。イン・ビトロ 融合−阻害に対するｍＡｂ １９ＢおよびＳＢ ２０９７６３の共投与の効果を決 定するために、該抗体を単独でおよび組み合わせて力価決定した。抗体相互作用 を、MacSynergyTMIIソフトウエアを用いて分析した。 直接クローニングにより（バージョンＡ）、または、種々の配列修飾の導入後 に（バージョンＢ−Ｄ）得られたｍＡｂ構築物のイン・ビトロ抗ウイルス力価は 、プロトタイプＲＳＶロング株に対する有効な中和および融合阻害活性を示した （表２）。ｍＡｂ １９Ｂは、また、フィラデルフィアＰＡエリアで１９９３／ １９９４期に回収されたＲＳＶの多抗原性変異体を示す臨床単離体を中和するこ とも示した。ｍＡｂ １９Ｂを異なるＦタンパク質エピトープ（ＳＢ ２０９７６ ３、重要な残基ａａ４２９）に対して指向される二次抗体と共投与した場合、感 染細胞培養物におけるウイルス増殖の阻害に対する効果は、累積的であった（デ ータは、示さない）。 ｍＡｂ構築物の抗ウイルス力価は、対応するＦａｂ構築物−Ｆａｂ１９、Ｆａ ｂ１９ＡまたはＢを用いて得られる力価よりも約５〜１０倍低かった（表２）。 Ｆａｂ１９は、イー・コリ（E．Coli）において直接産生された最初のＦａｂタ ンパク質であるが、一方、Ｆａｂ１９ＡおよびＦａｂ１９Ｂは、対応する全長ｍ Ａｂからパパイン切断により誘導された。クローニングにより重鎖のＣＤＲ２ル ープ内でコードされたＮ−結合グリコシル化部位の除去は、ｍＡｂの全抗ウイル ス活性に対して効果を及ぼさなかった（表２；構築物ＣをＡおよびＢと比較した ）。さらに、正常にグリコシル化された抗体に対するｍＡｂ１９Ｂ構築物の豊富 化は、イン・ビトロ融合阻害力価を有意に変えなかった（表４）。しかしながら 、糖変異体Ｆａｂフラグメントについての豊富化は、正常にグリコシル化された Ｆａｂフラグメントと比較してイン・ビトロ抗ウイルス活性を２〜１０倍低下さ せた（表４）。 表２：ＲＳロング株ウイルスに対する１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃおよび１９Ｄ構 築物の抗ウイルス活性 *平均±標準偏差 表３：ＲＳＶの臨床単離体に対するｍＡｂ １９Ｂの融合阻害活性 表４：１９Ｂ糖変異体の抗ウイルス活性 *ｍＡｂまたはＦａｂフラグメントは、未処理であるか、または、モノＱ（Ｍａ ｂ）もしくはモノＳ（Ｆａｂ）カラムに付して、可変部においてグリコシル化さ れた形態と最小にグリコシル化された形態とを分離した。 実施例Ｉ ｍＡｂ１９Ｂのイン・ビボ活性：Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおける予防およ び治療 Ｂａｌｂ／ｃマウス（５匹／グループ）に、ヒトＲＳＶのＡ２株１０5ＰＦＵ での鼻内感染の２４時間前（予防）または４日後（治療）にｍＡｂ １９Ｂ ０. ０６mg／kg〜５mg／kgの範囲の用量で腹腔内接種した。感染後、５日目にマウス を屠殺した。血清を得て、抗体レベルを測定し、肺をホモジナイズして、ウイル ス力価を測定した。ウイルスは、ｍＡｂ １９Ｂ≧１.２５ug、および、対応する 血清濃度≧５ug／mlで予防的に処置されたマウスの肺においては検出不可能であ った（表５）。ｍＡｂを治療的に投与した場合には、完全なウイルスクリアラン スのためにさらに高い用量のｍＡｂ １９Ｂが必要であった（５mg／kg）。 表５：Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるｍＡｂ １９Ｂ予防および治療 実施例ＧからＩまでの結果は、Ｈｕ１９抗体がＡ型およびＢ型の両方の広範囲 の天然ＲＳＶ単離体に対してイン・ビトロで有効な抗ウイルス活性を有すること を確立し、動物モデルにおいてイン・ビボで予防的効力および治療的効力を示す 。かくして、Ｈｕ１９抗体、最も好ましくは、Ｈｕ１９ＣまたはＨｕ１９Ｄは、 ヒトにおける治療的、予防的、および、診断的用途の候補である。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                          Human monoclonal antibody Field of the Invention:   The present invention provides novel human monoclonal antibodies (mAbs) that encode the antibodies. Gene. More specifically, the present invention relates to respiratory syncytial virus (R SV) fusion (F) Human monochrome specifically reacting with epitope of protein For null antibody. Such antibodies are useful for the RSV infection of human patients, especially infants and children. Useful for therapeutic and / or prophylactic treatment. Background of the Invention:   Respiratory syncytial virus (RSV) is the leading lower respiratory disease in children Causal and predictable grade of endemic bronchitis and pneumonia in children worldwide Causes cold. The virus is epidemic and can be transmitted at any age . Immunity to RSV is short-lived, and reinfection occurs frequently. 0 years old Infants and 2-year-olds are the most susceptible and form the main infected population. In this group And one in five people became infected and developed lower respiratory (below the larynx) disease, a proportion Is similar in reinfection. Age, environment and other relevant factors First, 1-3% of RSV-infected patients need to be hospitalized, and the length of hospital stay is long. Between (up to 3 weeks) is common. High prevalence of RSV infection, especially in infants Has evolved into a later life's breathing problem. Morbidity is generally extreme in developing countries Low, but undeveloped countries and certain at-risk groups such as heart disease / lung disease Very high, prophylactic treatment is desirable for these groups of children.   No vaccine for RSV infection is currently available. Tested in the 1960s Severe controversy surrounding new attenuated whole virus vaccines and new candidate Immunopathology may be promoted with the buunit vaccine, It is expected that vaccines will disappear in the future. Until now, one drug Therapy, Ribavirin, a broad-spectrum antiviral has been approved. Riva Villin should be minimally administered because of administration, mild toxicity, and questionable efficacy. It is only acceptable. In most cases, hospitalized children receive medication. Only very expensive and intensive maintenance. Cure for RSV infection There is a need for a drug that is safe, effective and easily administered to administer a therapeutic drug Is clear.   Potential of passive antibody treatment / prevention for RSV is well established using animal studies Have been. Most studies on early passive transmission of animals to infectious agents including RSV Murine mAbs have been used. More recently, the FDA has been using pooled human blood Intravenous gamma globulin (IVIG) isolated from Qing was approved for use. this Earlier reports of the study were encouraging (Groothuis, JR et al., Antimicrob. Agents Che mo. 35 (7): 1469-1473 (1991)). However, IVIG has one There are general disadvantages and, without limitation, such products are derived from human blood. Often, it is necessary to administer several grams of antibody to obtain an effective dose.   Also, monoclonal antibodies have been used. Advantages of such a method: administration High levels of specific antibodies by reducing the amount of globulin needed to What you can do; you do not need to rely on direct blood products; More uniform adjustment of the bell; and extension of the route of administration You. Passive immunotherapy using monoclonal antibodies from xenogeneic (eg, murine) (PCT application, PCT / US94 / 08699, publication number W O95 / 04081), which may be desirable in the context of patients antagonizing foreign antibodies. One way to reduce the risk of a poor immune response is to use "humanized antibodies" That is. These antibodies are of substantially human origin and have complementarity determining regions (CD Only R) is of non-human origin. A particularly useful illustration of this method is the PCT application PCT. / GB91 / 01554 (publication number WO92 / 04381) and PCT application PCT / GB93 / 00725 (publication number WO93 / 20210) I have.   Another more preferred method is to utilize fully human mAbs. Unfortunately Produce human monoclonal antibodies via classical hybridoma technology. And with little success. In fact, an acceptable human fusion partner has been identified Murine myeloma fusion partners do not interact well with human cells and Produce low productivity hybridoma strains. However, recent molecular biology and Due to the development of immunology, especially against heterologous infectious agents, as described in detail below Human mAbs can be isolated.   For a detailed description of RSV infection and its clinical features, see McIntosh, K. and R.M. Chanock, “Respiratory Syncytial Virus”, Chapter 38, B.N.Fields, Raven Pr ess (1990) and Hall, C.B., "Textbook of Pediatric Disease" Feigin. and Cherry, ed., W.B.Saunders, pages 1247-1268 (1987). I have. The RSV belonging to the paramyxovirus group has the attribute of the paramyxovirus group and Minus-strand non-segmented RNA viruses with the same attributes. But the form Differences and lack of hemagglutinin and neuraminidase activity It is classified into the pneumovirus group. RSV is polymorphic and has a diameter of 150 It has a size of -300 nm. By sprouting from the outer membrane of cells, Mature bodies and virions have protrusions or "spikes" at short, close intervals Appear as membrane-bound particles. RNA genomes range in size from 9.5 kDa to 16 Encodes 10 unique viral polypeptides in the 0 kDa range (Huan g, Y.A. and G.W.Wertz, J. Virol. 43: 150-157 (1982)). 7 pieces Proteins (F, G, N, P, L, M, M2) are present in RSV virions, At least three proteins (F, G and SH) are expressed on the surface of infected cells I have. F protein is finally identified as a protein involved in cell fusion . Because antibodies specific for this protein form syncytia in vitro And expresses recombinant F protein in the absence of other RSV viral proteins This is because cells infected with the vaccinia virus formed syncytia. Anti In contrast, antibodies to the G protein do not block syncytial formation, but Cell binding to cells.   RSV can be classified into two different subgroups (A and B) on antigen (Mufs on, M.A. et al., J. Gen'l. Virol. 66: 2111-2124 (1985)). this Antigenic dimorphism is mainly due to surface-associated (G) glycoprotein (Johnson, R.A. et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 84: 5625-5629 (1987). You. The strains in both groups A and B circulate simultaneously, but their proportions are It changes unmeasurably. Therefore, effective therapy is a sub Groups must be targeted, which, as described below, Is the reason for selecting a highly conserved surface fusion (F) protein as a target antigen .   RSV is distributed worldwide. As mentioned above, the epidemiology of RSV virus One of the more striking features is the regular pattern of infection and disease. Other breathing ui Predominantly irregular or endemic / epidemic patterns in Luss However, RSV is a respiratory disease that causes significant epidemics in large cities every year. It's just a ruth pathogen. In temperate regions of the world, RSV epidemics are predominantly in the evening. Occurs in autumn, winter or spring, but has never been prevalent in summer. Infections in the community The incidence and extent are characteristic, easily diagnosed, and in bronchiolitis and pediatric pneumonia In some cases, the number of hospitalizations for children with acute lower bronchial disease soars. Sometimes, sudden Other spontaneously occurring respiratory viral material may coexist with RSV. Primary R SV infections occur in very small children and can be felt by virtually all children before admission. Dye. By the age of one year, 25-50% of infants have developed specific antibodies as a result of natural infection. This value is almost 100% by the age of 4-5. Age, gender, socioeconomic And environmental factors all influence the severity of the disease. The best in the United States With the new intensive care, overall mortality in normal subjects is low (less than 2% of inpatients) ) Is a rapidly progressing heart disease (cyanosis congenital heart disease) or respiratory disease (bronchopulmonary It can be extremely high in infants suffering from dysplasia. For example, cyanosis congenital It has been reported that the mortality rate of infants with sexual heart disease is as high as 37%. In immature infants Apnea attacks may occur due to RSV infection, rarely nervous or systemic Causes damage. In patients younger than 6 months, severe lower respiratory tract disease (bronchiolitis) And pneumonia) are the most common. Infants who seem to have completely recovered from the disease For years with symptomatic respiratory abnormalities (recurrent wheezing, low lung function, recurrent cough, asthma and qi Bronchitis).   The mechanism by which the immune system antagonizes RSV infection and re-infection is well understood Not in. However, re-infections are common to all ages, and sometimes the primary Immunity is only partial protection, as reinfection occurs only a few weeks later Is clear. Both serum and secretory antibodies (IgA) have been It has been detected in the response of small children to RSV infection. However, infants ( (1-8 months of age) against serum F or G glycoprotein of serum antibodies Titers, as well as neutralizing antibodies, are 15-25% of the values found in aging subjects. Such low titers cause an increased incidence of severe infections in small children. May be.   Evidence supporting the role of serum antibodies in protection against RSV virus is And animal studies. For adults naturally exposed to the virus , Sensitivity is often associated with low serum antibody levels. In infants, Maternal transmitted titers are associated with resistance to severe illness (Glezen, W.P. Et al., J. Pediatr. 98: 708-715 (1981)). Another study is the lower respiratory tract Show that the associated incidence and severity of is decreased in the presence of high serum antibodies ( McIntosh, K. et al., J. Infect. Dis. 138: 24-32 (1978)), passively The high titer of the administered serum neutralizing antibody prevents RSV infection in cotton rat experiments. (Prince, G.A., et al., Virus Res. 3: 193- 206 (1985)).   Children lacking cell-mediated immunity are in contrast to children with a normal immune system You can't stop the infection and eliminate the virus for months. Similarly, RS Nude mice infected with the V virus eliminated the virus as expected. These Can be treated by adoptive transfer of primed T cells (Cann on, M.J. et al., Immunology 62: 133-138 (1987)).   In summary, both cellular and humoral immunity are infected, re-infected and RSV disease With limited antigenic variation, but after several exposures Even so, it is clear that protective immunity is not perfect.   The present invention provides RSV virus F-tags for passively treating or defending infections. It relates to the use of protein specific human mAbs. Use of passive antibody therapy in humans The use is well documented and other sensitivities such as hepatitis and cytomegalovirus It is used to treat infectious diseases. Clinical trials were also conducted to treat RSV infection in children. The efficacy of the antibody is currently being evaluated. In studies in animals, F and Polyclonal and monoclonal antibodies to both G-glycoproteins are anticipated. Provides passive protection against RSV virus infection when administered protectively or therapeutically It has been shown that it can be applied (Prince et al., Supra). In these studies, Passive transfer of F or G neutralizing mAbs to mice, cotton rats or monkeys Significantly reduce or prevent RSV virus replication in the lungs.   Induction of neutralizing antibodies against RSV virus is limited to F and G surface glycoproteins. It seems to be specified. Of these two proteins, the F protein is RSV Key for cross-reactive neutralizing antibodies associated with protection against various strains of irs Target. In addition, experimental studies with mouse or cotton rat F protein Vaccine treatment also provides cross protection. F protein-related strains and subunits The antigenic relevance of irs reflects high homology at the amino acid level. Contrast Thus, in the two subunits of RSV and various strains, Primarily associated with G-glycoprotein. F protein is 68-70 kDa Has a predicted molecular weight; has a signal peptide at its N-terminus; a membrane at its C-terminus With anchor region; proteolytic cleavage in infected cells prior to virion construction And the disulfide-bonded FTwoAnd F1Generate 5 neutralizing epitopes Has been identified in the F protein sequence and residues 205-225; 259-278 289-299; 483-488 and 417-438 were identified on the map. A study that measures the frequency of F protein sequence conversion, 23 species of RSV virus isolated from Storia, European and US states Shows that most of the bacterial strains preserve most of the neutralizing epitopes Was. In another study, 43 infants or children in subgroup A or subgroup Response to primary infection with strain B, subgroup A or subgroup Allogeneic or heterologous F antigen despite the unrelated G protein of strain B Response was found to be significantly different. Further, in vitro virus Inhibition of antibody-mediated infection of cell-mediated cell fusion is associated with a protective correlation in animal studies. Thus, fusion inhibition is primarily limited to F protein-specific antibodies. F protein Clearly, it is a more important target for antibody therapy.   The human mAb of the RSV F protein is fully satisfactory for the desired selection for this disease. Holds alternatives. In obtaining fragments of such mAbs, Have been reported (Barbas, C.F. et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89: 10164-10168 (1992); Crowe, J.E. et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. US A 91: 1386-1390 (1994) and PCT application number PCT / US9. 3/08786 (Publication number WO94 / 06448 (March 31, 1994))) However, the consequences of such a result are not simple, and the new When a human mAb is obtained, it can stand alone to form an immunotherapeutic composition. Or in combination with existing molecules. The present invention relates to such a human m. It is for one mAb in the Ab group. Brief description of the invention:   The present invention relates to RSV-infected, specifically reactive with RSV F protein epitopes. Neutralizing fully human monoclonal antibodies and functional fragments thereof About.   In a related aspect, the invention provides a method for combining human antibody sequences in a random fashion. Produced by roning and isolated from filamentous phage Fab display library Fab fragment or F (ab ') specific for the RSV F proteinTwoH Provides a variant to neutralize fragmentation.   In yet another embodiment, the human heavy and light chain constant regions from a first human donor Region and FV protein of RSV from a second human donor And light chain variable regions derived from humans or C A reshaped human antibody containing DR is provided.   In yet another aspect, the invention relates to one (or more) modified antibodies and Provided is a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier.   In a further aspect, the present invention relates to a method for the prevention or treatment of RSV infection. RS in a human, comprising administering to the human an effective amount of a pharmaceutical composition of the present invention. Provide passive immunotherapy of V disease.   In yet another aspect, the invention relates to a method for binding human antibodies to the RSV F protein. Modified antibodies derived from human neutralizing monoclonal antibodies (mAbs) Genetically engineered antibody, CDR, Fab or F (ab ')TwoFragment or its And a component useful for the production thereof. this These components are isolated nucleic acid sequences that encode the same, And its expression in a transfected host cell, preferably a mammalian cell. Recombination containing the nucleic acid sequence under the control of a selected regulatory sequence with directed ability And plasmids. This production method is based on the transfected Under conditions such that human or modified antibodies are expressed in the cells. Culturing and isolating the expressed product.   In yet another aspect, the invention relates to the use of a biological fluid comprising a human antibody and an antibody of the invention. Contacting the modified antibody to initiate binding between the human antibody (or modified antibody) and RSV. A method for diagnosing the presence of RSV in humans comprising assaying for raw provide.   In yet another embodiment of the present invention, at least one dose of a mono-substance of the present invention. An immunotherapeutically effective amount of the clonal antibody is increased by at least one additional monoclonal antibody. There is provided a pharmaceutical composition in combination with the body. In particular, another monoclonal antibody Is a target antigen by reacting with different epitopes of RSV protein antigen. Anti-RSV antibodies distinguished from the body.   Other aspects and advantages of the present invention are described in the detailed description and preferred It is described in a specific example. Brief description of drawings:   FIG. 1 shows the cloning method used to construct the Hu19A monoclonal antibody. Is shown. The heavy chain V region was converted to PCD as an XhoI-Bsp120I fragment. It was cloned into an induction vector. The complete light chain V and C regions were replaced with SacI-Xba It was cloned into a PCN-derived vector as an I fragment. Details are described below I do.   FIG. 2 shows a comparison of the heavy chain amino acid sequences of various monoclonal antibodies of the present invention. It is. 1 depicts the amino acid sequences of the heavy chains of constructs A, B, C and D (each, SEQ ID NOs: 5, 6, 7 and 8). Residue numbers start at the amino terminus of the maturation process Germline (GL) gene Dp58 (SEQ ID NO: No. 4). "_" Indicates that the sequence is the same (for example, B C) compared to C). Sequence A is described in Barbas et al. (Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 89, 1). 016-10168 (1992) is a cloning method used. There is an amino acid insertion between 4 and 5. Bold residues show CDR1 in the leader region. -3. The underlined sequence of CDR2 was mutated with version C The same as the N-linked sugar chain formation site of Versions A and B. "*" Is attached Residues P14 and G15 are the same as in the published sequence (Barbas et al., Supra) at L And A.   FIG. 3 shows a comparison of the light chain amino acid sequences of various monoclonal antibodies of the present invention. It is. The amino acid sequences of the light chains of constructs A, B, C and D are shown (SEQ ID NO: Nos. 10, 11, 12, and 13). The numbering of the residues in the Vκ region The germulin (GL) gene Dpk9 (located at the terminal end and ending with CDR3) Column 9), but as mentioned in Framework 4, Hu19A The actual numbers for Lc are also shown. As shown in FIG. 2, "" is Shows the identity of G at position 97 of Hu19A framework 4 with "*" Is denoted by E in the published sequence (see references). Array A is Has two amino acid deletions at residues 1 and 2 due to the cloning method. Bold Residues correspond to CDRs 1-3 in the leader region. κ constant region is Germulin Constructs A and B are illustrated by comparison with the gene. The L mutation near the C-terminus , Version C (see FIG. 3, SEQ ID NO: 13).   FIG. 4 shows the plasmid DNA for expressing the Hu19 mAb heavy and light chains. Shows the sequence. FIG. 4A shows the DNA sequence of Hu19AHcpcd (SEQ ID NO: 14). ). Translation initiation site, leader peptide, amino-terminal processing site (SEQ ID NO: 1 5) the carboxy terminus of the 19A heavy chain (SEQ ID NO: 16) and the EcoRI restriction enzyme The nuclease cleavage site is illustrated. FIG. 4B shows the DNA of Hu19ALcpcn. Sequence (SEQ ID NO: 17), following the end of the light chain and the coding region of the light chain The corresponding features for the XbaI restriction site are shown (SEQ ID NOs: 18, 19). FIG. 4C Is the DNA sequence of the coding region of the heavy chain of the plasmid Hu19BHcpcd Column numbers 20, 21). FIG. 4D shows the light chain of plasmid Hu19BLcpcn. Are the DNA sequences of the coding regions (SEQ ID NOS: 22, 23 and 24). FIG. 4E Is the DNA sequence of the coding region of the heavy chain of the plasmid Hu19CHcpcd (sequence Nos. 25 and 26). FIG. 4F shows the heavy chain of the plasmid Hu19DHcpcd. This is the DNA sequence of the coding region (SEQ ID NOS: 27 and 28). FIG. DNA sequence of the coding region of the light chain of Hu19CLcpcn (SEQ ID NO: 29, 3). 0). 4C-G, the bolded residues are shown in FIGS. 4A and 4B, respectively. Different from the complete vector sequence of Hu19AHcpcd and Hu19ALc Indicates the location.   FIG. 5 shows Coomassie-stained SDS-P of Hu19B and Hu19C under reducing conditions. 3 shows an AGE gel.   FIG. 6 shows separation of Hu19 sugar mutant by anion exchange chromatography. You.   FIG. 7 shows an SDS-PAGE analysis of the Hu19BFab saccharide variant. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION:   The present invention provides useful human monoclonal antibodies (and others) that react with RSV F protein. And its fragments), the antibodies and variants thereof, the isolated nucleic acids encoding them, and And their recombinant production, as well as such antibodies and their fragments. Provide therapeutic, prophylactic and diagnostic uses of the drug. I. Definition   The following terms, as used herein and in the claims, are defined as follows:   An "altered antibody" is encoded by an altered immunoglobulin coding region. And can be obtained by expression in a selected host cell. Such breaks Modified antibodies are antibodies that have been engineered (eg, chimeric, humanized, or reshaped, Or immunologically edited human antibodies) or the entire immunoglobulin constant region. Or those fragments lacking a portion, such as Fv, Fab, or F (ab ’)TwoAnd so on.   The “modified immunoglobulin coding region” is a modified antibody of the present invention or a fragment thereof. Refers to a nucleic acid sequence that encodes a fragment.   A "reshaped human antibody" comprises at least the first human monoclonal donor antibody-derived antibody Modification wherein one CDR is replaced with a CDR in a second human acceptor antibody Refers to an antibody. Preferably, all six CDRs are substituted. More preferred Is the antigen binding region from the first human donor monoclonal antibody (eg, Fv, Fab or F (ab ')Two) The whole is the second human acceptor monochroma Has been substituted for the corresponding region in the antibody. Most preferably, from a first human donor Fab region is operably linked to a second acceptor antibody to provide a full length monoclonal A local antibody is formed. In the present specification, Hu19A, Hu19B, Hu19 The reshaped human monoclonal antibodies, designated C and Hu19D, were sequenced in FIG. A light chain amino acid sequence selected from 19A, 19B, 19C and 19D; Heavy chain amino acid sequence selected from sequences 19A, 19B, 19C and 19D of FIG. Sequences or reshaped human antibodies comprising their functional subsequences.   "First immunoglobulin partner" refers to a human framework or human immunoglobulin Refers to the nucleic acid sequence encoding the variable region, in which the native (or originally CDR coding region is the CDR coding region of the donor human antibody Has been replaced with the region. Human variable region is immunoglobulin heavy chain, light chain (or both) , Their analog or functional fragments). Antibody (immunoglobulin Such CDR regions present in the variable region of Can be determined by law. For example, Kabat et al., (Sequences of Protei ns of Immunological Interest, 4th Ed, U.S. S. Department of Health (1987)) To Rules regarding the placement of CDRs are disclosed. Further, identification of CDR regions / structures Useful computer programs are known.   "Second fusion partner" means that the first immunoglobulin partner is in-frame (In frame) or optionally using a conventional linker sequence (Ie, operably linked), encoding a protein or peptide Of the nucleic acid sequence. Preferably, the fusion partner is an immunoglobulin gene , In that case, it is referred to as a "second immunoglobulin partner." Second immunoglobulin par The toner is a nucleic acid sequence (ie, homologous—primary and primary) that encodes the entire constant part. And the second modified antibody are from the same source) or further of interest (ie, (Heterologous) antibodies. It is an immunoglobulin It may be a heavy or light chain (or both chains as part of one polypeptide) . The second immunoglobulin partner is a specific immunoglobulin class or isotype. Not limited to In addition, the second immunoglobulin partner is not immunoglobulin. Part of the variable (ie, a suitable human constant or a separate part of the framework region), For example, Fab or F (ab ')TwoIt may include those found therein. Ma The second fusion partner is a transmembrane protein exposed on the outer surface of the host cell (eg, Sequence (as part of a phage display library) Is an analytical or diagnostic protein, such as horseradish peroxidase, β-galacto. It may include a sequence encoding tosidase.   The term Fv, Fc, Fd, Fab, or F (ab ')TwoThe standard Used with meaning (eg, Harlow et al., Antibodies A Laboratory Man ual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).   As used herein, the term “engineered antibody” refers to one type of engineered antibody, ie, full length. Synthetic antibodies (eg, chimeric, humanized, reshaped, or immunologically edited Human antibody), in which the light chain of the selected acceptor antibody and / or Or one of the heavy chain variable domains has one or more specificities for a selected epitope. Has been replaced by an analogous portion of a further donor antibody. For example, such a molecule Is characterized by a humanized heavy chain attached to an unmodified light chain (or chimeric light chain) Antibodies (or vice versa). The prepared antibody is a donor antibody Acceptor antibody light and / or heavy chain variable domain to retain binding specificity It may be characterized by an alteration in the nucleic acid sequence encoding the main framework region. These antibodies may contain one or more (preferably, all) antibodies from the acceptor antibody. (Replacement of some of the) CDRs with CDRs from the donor antibodies described herein.   "Chimeric antibody" refers to one type of antibody that has been prepared, Intrinsic variable region from the donor antibody linked to the light and heavy chain constant regions of the target antibody (Light and heavy chains).   “Humanized antibody” refers to one type of antibody that has been prepared, It has CDRs from Roblin and the remainder of the molecule from immunoglobulin is 1 (or Or more) from human immunoglobulins. Furthermore, framework support Residues may be modified to preserve binding affinity (eg, Queen et a l., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA. 86: 10029-10032 (1989), Hodgson et al., B io / Technology, 9: 421 (1991)).   "Immunologically edited antibody" refers to one type of antibody that has been created. Possible immunological response to antibodies in some patients treated with selected antibodies Changes in the donor and / or acceptor sequence to reduce From the viewpoint of cloning of artificial products, enhancement of the reproductive system, etc. The one where the collection is being held.   The term "donor antibody" refers to its variable region, CDRs or other functional fragments. Or a nucleic acid sequence of an analog or analog to a first immunoglobulin partner, Generates a globulin coding region that provides the antigenic specificity and Antibodies (monoclonal or recombinant) that produce modified antibodies with Antibody). One donor antibody suitable for use in the present invention is Fab Hu 19 is a Fab fragment of a human neutralizing monoclonal antibody designated as 19. F ab Hu19 contains the variable light chain DNA and DNA shown in FIGS. 2, 3, 4A and 4B. It is defined as having the amino acid sequence Hu19A.   The term “acceptor antibody” is derived from a source genetically unrelated to the donor antibody Antibody (monoclonal or recombinant antibody), its heavy chain and / or Encodes the framework region of the light chain and / or the constant parts of its heavy and / or light chains. All (or portions) of the nucleic acid sequences (preferably all nucleic acid sequences) Refers to what is provided to an immunoglobulin partner. Preferably, human antibodies are Scepter antibody.   "CDR" is the complementarity of an antibody that is the hypervariable portion of immunoglobulin heavy and light chains. Defined region amino acid sequence. For example, Kabat et al., Sequences of Pro teins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S.A. S. Department of Health anfd Human Services, see National Institutes of Health (1987)) Immunoglobules There are three heavy and three light chain CDRs (or CDR regions) in the phosphorus variable region . Thus, the "CDRs" herein are all three heavy chain CDRs or three All light chain CDRs (or all heavy chain and all light chain CDRs as appropriate) ). The CDRs represent the contact residues for binding of the antibody to the antigen or epitope. Provides most of the groups. CDRs of the invention are variable heavy and light chains of the donor antibody Derived from the sequence and encompasses the analog of the native CDR, wherein the analog is Share the same antigen specificity and / or neutralizing capacity as the donor antibody from which they are derived. Or holding.   “Sharing antigen specificity or neutralizing ability” means, for example, that Fab Hu19 has a certain level. Characterized by Bell's antigen affinity, but with an appropriate structural environment The CDR encoded by the nucleic acid sequence of Fab Hu19 is higher or lower It means that it may have affinity. Nevertheless, such rings The CDRs of the Fab Hu19 underneath are the same as those recognized by untreated Fab Hu19. Will recognize the same epitope. A “functional fragment” is a fragment of a partial heavy chain. Or a light chain variable sequence (eg, the amino or carboxy terminal of an immunoglobulin variable region). A little at the end) and the same as the antibody from which the fragment was derived. It has antigen binding specificity and / or neutralizing ability.   An “analog” is an amino acid sequence that has been modified at least one amino acid Yes, the modification is chemical or a small number of amino acids (ie less than 10) Wherein the modification is an organism wherein the amino acid sequence is the unmodified sequence. Biological characteristics (eg, antigen specificity and high affinity) To make it work. For example, a particular endonuclease restriction site may (Silent) when created in or around the coding area Mutations can be constructed.   Analogs may cause allelic changes. "Allelic changes Or modification '' refers to a nucleic acid sequence encoding an amino acid or peptide sequence of the invention Change. Such changes or modifications are due to the degeneracy of the genetic code. Or carefully crafted to get the desired characteristics Good. These changes or modifications result in changes in the encoded amino acid sequence. It may or may not be.   The term “effector agent” refers to the natural or modified form of an engineered antibody and / or donor antibody. The synthetic light or heavy chain or other fragment of the donor antibody is synthesized by conventional means. Refers to non-proteinaceous carrier molecules that may be attached. Such a non-protein carrier Is a conventional carrier used in the diagnostic field, such as polystyrene or other plastics. Stick beads, polysaccharides, for example used in the BIAcore (Pharmacia) system Polysaccharides or other non-proteins used in the medical field that are safe for human and animal administration White matter may be included. Other effector agents chelate heavy metal atoms Macrocycles, or radioisotopes. Take Effector agents, such as polyethylene glycol, increase the half-life of engineered antibodies Can also be useful. II. Combinatorial Cloning:   As noted above, a number of issues are addressed by G. Kohler and C.W. Milstein hybridoma Production and isolation of human monoclonal antibodies by the method (Nature 256: 495-497 (1975)) Application has been hindered. These problems include the formation of hybridoma cell lines. Lacked the appropriate fusion partner myeloma cell line used to The poor stability of such hybridomas, even if they were formed, was noted. It is. Due to the lack of virus-specific B cells in the peripheral circulation, In these cases, these disadvantages are further exacerbated.   In general, combinatorial cloning is described in PCT application WO 90/1443. 0. Briefly, the purpose of combinatorial cloning Transfer the immunogenic potential of human cells, tissues or organs to bacterial cell populations It is to let. It is preferable to use immunocompetent cells, tissues or organs. Special Useful sources include the spleen, thymus, lymph nodes, bone marrow, tonsils, and peripheral blood lymphocytes. Including, but not limited to. Optionally, the cells may be stimulated with RSV in vitro. Donor or HIV known to have produced an immune response+so One may select from donors that are but asymptomatic.   The genetic information from the donor cells may be in the form of DNA or RNA , Conveniently amplified by the polymerase chain reaction (PCR) or a similar method. You. When isolated as RNA, it is preferred that the Target information into cDNA. Amplification can be generalized or more specific It can be a typical thing. For example, carefully select PCR primers. Allows selective selection of immunoglobulin genes or subsets of the gene classes Amplification can be performed.   Component gene sequences, which encode the variable regions of the various heavy and light antibody chains Once the light chain and heavy chain genes have been obtained, Form a dumb combinatorial library. Combinatorial clonalin Various recombinant DNA vector systems have been described to facilitate PCT application WO 90/14430, Scott and Smith, Science 249: 386-406 (199 0) or US Pat. No. 5,223,409). Combinatorial library Obtained and conveniently, after expression, biopanning with RSV F protein ) Or, if necessary, an epitope-blocked biopanni as described in more detail below. The product can be screened by screening.   First, the Fab fragment of mAb was used for combinatorial cloning, Screening is performed, and after selecting the desired candidate molecule, the Fab is converted to a full-length mAb. Conversion is generally preferred. However, cloning single-chain antibodies And can also be used for screening. III. Antibody fragment   The present invention is directed to inducing full-length mAbs directed against the RSV F protein. , Fab fragment or F (ab ')TwoThe use of fragments is contemplated. This These fragments are directed against RSV-mediated conditions in vivo. As a protective and therapeutic agent or as part of RSV diagnosis in vitro May be useful separately and independently, but they have been reshaped in the present invention. Used as a component of human antibodies. Fab fragments contain the entire light and heavy chains. F (ab ') containing a mino-terminal portionTwoFragments are further disulfide linked Combination Is a fragment formed by two Fab fragments joined by . RSV binding monoclonal antibodies are Fab fragments and F (ab ')TwoH Combinatorial phage library that provides a source of fragmentation (Eg, Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12:43). 3-455 (1994) or Barbes et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 89, 10164-1 0168 (1992), which are considered to be described herein by reference) . IV. Anti-RSV antibody amino acid and nucleotide sequences of interest   Fab Hu19 or other antibodies described herein may be used to bind antigen-binding characteristics of a donor antibody. Variables useful in the design and acquisition of various variable antibodies characterized by isomerism Heavy and / or light chain peptide sequence, framework sequence, CDR sequence, functional flag And their analogs and the nucleic acid sequences that encode them Can be provided.   By way of example, the present invention thus provides a method for obtaining RSV human Fabs Hu19A-D. Provided are variable light and variable heavy chain sequences, and sequences derived therefrom.   Nucleic acid sequences of the invention encoding variable light and heavy chain peptide sequences, or Fragment is also a mutation in a nucleic acid sequence encoding a CDR or framework region. Introduction of a modified or fusion nucleic acid sequence into a plasmid for expression and for expression Useful for For example, the nucleotide sequence of the framework and CDR coding regions Mutated CDRs (and / or frameworks) using silent substitutions in rows Restriction enzyme sites that facilitate the introduction of the region can be created. These C DR coding sequences may be used in the construction of the reshaped human antibodies of the invention.   Variable heavy and light chain amino acid sequences of the present invention, taking into account the degeneracy of the genetic code , And CDR sequences, and their functional fragments and analogs. Coding sequences (which share the antigen specificity of the donor antibody) Can be built. The present invention encoding a variable chain peptide sequence or CDR Using the isolated nucleic acid sequences, or fragments thereof, modified antibodies, such as chimeras or Or a humanized antibody or operably linked to a second immunoglobulin partner. Re In some cases, other antibodies of the present invention can be obtained.   In addition to the modified antibodies described herein and the isolated nucleic acid sequence coding portion of the antibody, , Other such nucleic acid sequences, eg, native CDR coding sequences Sequence complementary to the modified human framework region around the CDR coding region It should be noted that natural sequences are also encompassed by the present invention. Such sequences are Due to the degeneracy of the genetic code, it encodes the same amino acid sequence as shown in FIGS. And all possible nucleic acid sequences. Other useful DNA sequences encompassed by the present invention Are used under stringent hybridization conditions (T. Maniatis et al., Molecu lar Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), p. ages 387-389), the DNA sequence encoding the antibody of FIGS. Sequences that retain the antigen-binding properties of those antibodies You. One example of such stringent hybridization conditions is 4XSSC at 65 ° C. Hybridization, followed by washing at 0.1 × SSC at 65 ° C. for 1 hour. is there. Alternatively, a typical example of stringent hybridization conditions is a 50% Lumamide, 4XSSC, 42 ° C. Preferably, these hybridases The DNA sequence to be modified is at least 18 nucleotides in length, ie, approximately C DR size. V. Modified immunoglobulin coding region and modified antibody   Modified immunoglobulin coding regions include chimeric antibodies, humanized, reshaped and Encodes modified antibodies, including engineered antibodies, such as immunologically edited human antibodies I do. The desired modified immunoglobulin coding region is determined by the antigen specificity of the RSV antibody. The present invention, preferably inserted into an acceptor immunoglobulin partner Encodes a peptide having the antigenic specificity of an affinity antibody as provided by In the form of a Fab region, it contains a region encoding a CDR.   As mentioned above, if the acceptor is an immunoglobulin partner, Contains a sequence encoding a second antibody region of interest, for example, an Fc region. Immune glob The phosphorus partner may also be used to determine whether the light or heavy chain constant region is fused in frame. May contain sequences encoding other immunoglobulins fused by a linker sequence. Good. Antibodies engineered against functional fragments or analogs of RSV It may be designed to induce enhanced binding with the same antibody.   Immunoglobulin partners also include immunoglobulins, including non-protein carrier molecules. The Bryn partner may be operatively linked by conventional means, as described above May be combined with a suitable effector agent.   Fusion between an immunoglobulin partner, eg, an antibody sequence, and an effector agent Joining and linking may be performed by any suitable means, for example, conventional covalent or ionic bonds. , Protein fusions, or hetero-bifunctional crosslinks such as carbodiimides, glue It may be based on taraldehyde or the like. Such techniques are known in the art. And is easily described in conventional chemistry and biochemistry textbooks.   In addition, there may be a desire between the second immunoglobulin partner and the effector agent. Conventional linker sequences, which simply provide a quantity of space, may also be modified immunoglobulins. It may be constructed in the coding region. The design of such linkers is well known to those skilled in the art. It is.   Furthermore, the signal peptide of the molecule of the present invention may be modified to enhance expression. . For example, a reformulation having CDRs from the signal sequence and the Fab Hu19 heavy chain sequence The adult human antibody is derived from the Campath leader sequence (Page, MJ et al., BioTechnology 9:64). -68 (1991)) with the original signal peptide replaced by another signal sequence. It may be.   A typical modified antibody, a reshaped human antibody, comprises a constant heavy region C derived from a second human antibody.H- 1 -CH-3A variable heavy chain with Fab Hu19 antigen specificity fused to And complete light chain peptides or proteins.   In a further embodiment, the engineered antibodies of the invention are conjugated to another substance. You may. For example, using the method of recombinant DNA technology, the Fc flag Or the CH2 CH3 domain is an enzyme or other detectable molecule (i.e., (Ie, polypeptide effector or receptor molecule) Alternatively, the engineered antibodies of the invention may be produced.   Another desirable protein of the invention is a complete antibody component having full-length heavy and light chains. Offspring, or any separate fragment thereof, such as Fab or F (a b ')TwoFragments, such as fragments, or any minimal recombinant fragment Fragments, such as Fv or single chain antibodies (SCA), or selected Other molecules having the same specificity as the ner Fab Hu19 may be included.   The immunoglobulin partner is an immunoglobulin framework or constant region Yes if derived from a different antibody than the donor antibody, such as isotype or class of At any rate, engineered antibodies are obtained. The engineered antibodies are immunoglobulins (Ig ) Constant regions and, for example, acceptor antibodies, donor antibodies (eg, One or more (preferably all) CDRs from (anti-RSV) described in And the like. In addition, nuclear Acceptor mAb light and / or heavy chain variable at the acid or amino acid level Modification of the main framework region or the donor CDR region, for example, deletion, Replacement or addition to maintain the donor antibody antigen binding specificity, or May be made to reduce immunogenicity. In the present invention, preferred mutations Were sequenced as illustrated for the Hu19C and Hu19D heavy chains (FIG. 2) (sequence Nos. 7 and 8), the consensus in CDR2 of Hu19A and Hu19B heavy chains A modification of the sussus N-linked glycosylation site.   Such engineered antibodies may be linked to one of the RSV mAb variable heavy and / or light chains. (Or both) (optionally modified as described) or heavy chains shown below Alternatively, it is designed to use one or more of the light chain CDRs. Operation of the present invention Antibodies neutralize, ie, they desirably are in vitro and RS Inhibits virus growth in vivo in animal models of V infection.   Such engineered antibodies include human heavy fused to a RSV antibody functional fragment. Reshaped human antibodies comprising a chain and a light chain constant region may be included. Suitable human Conventional databases such as the Alamos database and the Swiss Protein database Selected from homologous nucleotide and amino acid sequences of donor antibodies It may be done. Homology to the framework regions of the donor antibody (amino acid base) Human antibody characterized by the heavy chain for insertion of the donor CDR. Suitable for providing constant regions and / or heavy chain variable framework regions. You may. Appropriate acceptors capable of providing light chain constant or variable framework regions May be selected in a similar manner. The acceptor antibody heavy and light chains are It should be noted that they do not need to be of the same acceptor antibody origin.   Desirably, the heterologous framework and constant region are transferred to an IgG (subtype 1 to subtype 1). 4) human immunoglobulin classes such as IgM, IgA and IgE Choose from Ip. Fc domains are not limited to natural sequences, but modify function Includes variants known in the art. For example, the mutation may be an Fc domain of an IgG antibody. It has been described that it binds Fc-mediated complement and Fc receptor binding. Reduced (eg, AR Duncan et al., Nature 332: 563-564 (1988); can and G. Winter, Nature 332: 738-740 (1988); M.-L. Alegre et al. Immu nol. 148: 3461-3468 (1992); -H. Tao et al. Exp. Med. 178: 661-667 (199 3); Xu et al. Biol. Chem., 269: 3469-2374 (1994)), Clearan Speed (J.-K. Kim et al., Eur. J. Immunol. 24: 542-548 (1994)). It reduces heterogeneity (S. Angel et al., Mol. Immunol. 30: 105-108 (1993)). In addition, the addition or other mutation of the tail portion segment of IgM (RI Smith and S. L. Morrison, Biotechnology 12: 683-688 (1994); I. F. Smith et al., J . Immunol. 154: 2226-2236 (1995)), or the tail segment of IgA. (I. Kariv et al., J. Immunol. 157: 29-38 (1996)). Other modifications are possible, such as However, acceptor antibodies are not It need not include only the Roblin protein sequence. For example, human immunoglobulin A DNA sequence encoding a portion of a brin chain is a polypeptide effector or DNA sequences encoding non-immunoglobulin amino acid sequences such as porter molecules A gene to be fused may be constructed.   Therefore, the modified antibodies are preferably those of naturally occurring human antibodies or fragments thereof. Having a structure and effective therapeutic use, for example, in the treatment of RSV-mediated diseases in humans. Or a combination of properties necessary for diagnostic or diagnostic use.   Modified antibodies can be altered without affecting the specificity and high affinity of the donor antibody It will be appreciated by those skilled in the art that further modifications may be made by domain amino acid changes. Yes (for example, analog). Heavy and light chain amino acids are In the framework and / or CDR, other amino acids It is understood that more substitutions may be made. This will be described in the embodiments of the present specification. Particularly preferred is the immunogenic editing of such reconstructed sequences.   In addition, the variable or constant regions may be modified to allow for selective selection of the molecules of the invention as described above. Properties may be enhanced or reduced. For example, dimerization, binding to Fc receptor Or binding capacity and active ingredients (eg, Angel et al., Mol. Immunol, 30: 105-108 (1993); Xu et al. Biol. Chem., 269: 3469-3474 (1994), Winter et.  al., EP 307, 434-B).   Such antibodies are useful for preventing and treating RSV-mediated disorders, as disclosed below. It is useful in VI. Production of modified and engineered antibodies   The resulting reshaped human antibody of the present invention is transformed into a recombinant host cell, for example, COS, CHO. Alternatively, it can be expressed in myeloma cells. Conventional expression vector or recombinant plus The mid can be replicated and expressed in a host cell and / or secreted from the host cell. The modified antibody may be operably linked to a controllable conventional regulatory control sequence. Manufacture by positioning these sequences. The regulatory sequence contains a promoter Sequence, such as the CMV promoter, and other known antibodies. File array is included. Similarly, DNA sequences encoding complementary antibody light or heavy chains A second expression vector having a sequence can be produced. Preferably, this second vector Should be coded to ensure that each polypeptide chain is functionally expressible. The first is identical except that the coding sequence and the selectable marker are related. You. Separately, the modified antibody heavy and light chain coding sequences are on a single vector May be.   The selected host cell is shared by conventional techniques with both the first and second vectors. -Transfected (or simply transfected with a single vector) Transfected, comprising both recombinant and synthetic light and heavy chains Create a host cell. The transfected cells are then transformed into conventional techniques. To produce the engineered antibody of the present invention. Both recombinant heavy and light chains of The production of antibodies containing binding is determined by a suitable assay such as ELISA or RIA. Measure in culture. Using similar conventional techniques, other modified antibodies and antigens of the present invention may be used. May build children.   Vectors suitable for cloning and subcloning steps used in the method The construction of the compositions of the present invention can be selected by those skilled in the art. For example, clonin The conventional pUC series of vector may be used. One vector used was Amersham (Buckinghamshire, United Kingdom) or Pharmacia (Uppsala, Sweden) ) Is commercially available from a supplier such as pUC19. Plus easy to duplicate And provides multiple cloning sites and selection genes (eg, antibiotic resistance). A vector that has and can be easily handled may be used for cloning. This As such, the choice of cloning vector is not a limiting factor of the present invention.   Similarly, the vectors used to express the engineered antibodies of the present invention may be of any conventional type. The vector can be selected by those skilled in the art. Preferred vectors include, for example, Plasmid PCD or pCN are included. The vector can also be provided to the selected host cell. Selected regulatory sequences (CMV) that regulate the replication and expression of heterologous DNA sequences Promoters). These vectors are engineered antibodies or modified Includes the DNA sequence described above that encodes an epiglobulin coding region. in addition The vector was modified by insertion of the desired restriction site for easy manipulation Selected immunoglobulin sequences may be incorporated.   The expression vector may also include, for example, a mammalian dihydrofolate reductase gene. Genes suitable for amplifying the expression of heterologous DNA sequences such as (DHFR) May be charged. Other preferred vector sequences include bovine growth hormone (BG H) and polyA such as beta globulin promoter sequence (beta glopro) Includes signal sequence. Expression vectors useful in the present invention can be prepared by techniques known to those skilled in the art. May be combined.   For example, replicons, selection genes, enhancers, promoters, signal The components of such a vector, such as a sequence, are transformed into a product of the recombinant DNA in a selected host. Commercial or natural sources for use in regulating the expression and / or secretion of Or by synthesis according to known methods. Mammals, bacteria, insects , Numerous types of other suitable expression vectors known in the art for yeast and fungal expression May also be selected for the purposes of the present invention.   The present invention also provides a code for engineered antibodies or modified immunoglobulin molecules thereof. Cell lines transfected with the recombinant plasmids containing the coding sequences. Useful host cells for cloning and other manipulation of these cloning vectors Is also idiomatic. However, most desirably, e. E. coli )) Were used to replicate the cloning vector and the modified antibodies of the present invention. Used for other steps in body construction.   Suitable host cells or cell lines for expressing engineered or modified antibodies of the invention Are preferably CHO, COS, fibroblasts (eg, 3T3) and bone marrow cells And more preferably CHO or bone marrow cells. This Human cells that can modify the molecule with a human glycosylation pattern, such as . Alternatively, other eukaryotic cell lines may be used. Selection of appropriate mammalian host cells, tiger Transformation, culture, amplification, screening, and product production and Methods for purification and purification are known in the art. For example, Sambro cited above See ok et al.   Bacterial cells are useful as suitable host cells for expressing the recombinant Fab of the present invention. (See 1992)). Fabs are generally not glycosylated and can be manipulated for external expression In bacterial cells because it reduces high concentrations, thereby promoting misfolding Unfolded or improperly folded protein expressed in The tendency to be in a non-glycosylated or non-glycosylated form is not a significant problem. Nevertheless, any recombinant Fab produced in bacterial cells will contain the antigen It should be screened for retention of binding capacity. Expressed by bacterial cells If the molecule is produced and exported in a suitable folded form, Vesicles are a desirable host. For example, various E. coli used for expression. Coli strain Known as host cells in the field of biotechnology. B. subtilis, S Various strains such as treptomyces and other Bacillus may also be used in this method. No.   If desired, yeast cell lines known to those of skill in the art, and Drosophila and Lepido Insect cells such as ptera and viral expression systems can also be used as host cells It is possible. For example, Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277-298, Plenu See m Press (1986) and the references cited herein.   General methods for constructing the vectors of the invention, necessary for producing the host cells of the invention Transfection methods, and the production of the modified antibodies of the invention from such host cells. All the necessary cultivation methods are conventional techniques. Similarly, once produced, The modified antibody was prepared by ammonium sulfate precipitation, affinity column, column chromatography. Cell culture can be performed by standard methods in the art, including chromatography, gel electrophoresis, etc. It may be purified from nutrient contents. Such techniques are within the purview of those skilled in the art, and It is not limited.   Transgenic animals such as those described in US Pat. No. 4,873,316. Still another method for expressing a reshaped antibody, such as expression in E. coli, may be used. this is When transgenically incorporated into an animal, the female can transform the desired recombinant protein. Expression using animal casein promoter to produce quality in milk About the system.   Once expressed by the desired method, the engineered antibody is then purified by a suitable assay. Test for in vitro activity using a. Currently, conventional ELISA assays Qualitatively and quantitatively evaluate the binding of modified antibodies to RSV using formats I do. In addition, using other in vitro assays and in vivo animal models, Assess the persistence of engineered antibodies in vivo despite normal clearance mechanisms Neutralization efficacy may be determined prior to subsequent human clinical trials to be performed. VII. Therapeutic / prophylactic use   The present invention also provides a method of treating a human suffering from a RSV-mediated condition, comprising: Antibodies comprising one or more of the modified antibodies described herein or fragments thereof A method of administering an effective amount of   The therapeutic response elicited by use of the molecules of the invention is binding to RSV, Produced by blocking RSV growth in Thus, the molecules of the invention can be used therapeutically. In preparations and formulations suitable for use in patients with RSV infection. No. For example, when treating the onset of seasonal symptoms, long-term treatment is desirable. Cure The dose and duration of therapy is related to the relative duration of the molecule of the invention in the human circulation And can be adjusted by those skilled in the art depending on the condition being treated and the general health of the patient. You.   The modified antibodies of the present invention, antibodies and fragments thereof, alone or with a therapeutic agent To react with other epitopes on the F protein or other RSV target antigens , Especially human or humanized mAbs.   The method of administration of the therapeutic and prophylactic agents of the present invention can be any method that delivers a drug to a host. An appropriate route may be used. Modified Antibodies, Antibodies, Engineered Antibodies and Flags of the Invention And parenteral administration, ie, subcutaneous, intramuscular It is useful for intravenous or intranasal administration.   The therapeutic and prophylactic agents of the present invention can be used as an active ingredient in a pharmaceutically acceptable carrier. It may be prepared as a pharmaceutical composition containing an effective amount of the modified antibody of the invention. Preferably raw An aqueous suspension containing the antibody, buffered at a physical pH and in an easily injectable form. Is preferably a solution. Compositions for parenteral administration generally comprise a pharmaceutically acceptable carrier, Preferably it was dissolved in an aqueous carrier. Solution of engineered antibody of the invention or its Including cocktails. Various aqueous carriers can be used, for example, 0.4% saline, 0.3% glycine and the like. These solutions are sterile and generally contain particulate matter Absent. These solutions are sterilized by conventional, well-known sterilization techniques (eg, filtration). Is also good. The composition is required for appropriate physiological conditions, such as pH adjustment and buffering agents. It may also contain pharmaceutically acceptable auxiliary substances. In such a pharmaceutical composition of the invention Antibody concentrations can vary widely, ie, from about 0.5% or less by weight, From about 1% or at least 1% to 15-20%, mainly liquid volume, viscosity It is selected according to the method of administration selected based on gender and the like.   Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention for intramuscular injection contains 1 mL of sterile buffered water, And about 1 ng to about 100 mg, for example, about 50 ng to about 80 mg or more. Preferably prepared to contain between about 5 mg to about 75 mg of an engineered antibody of the invention. it can. Similarly, a pharmaceutical composition of the present invention for intravenous infusion may be sterile, up to about 250 ml. Ringer's solution and about 1 to about 75, preferably about 5 to about 50 mg / ml of the present invention. It can be made to include the light engineered antibodies. Preparing parenterally administrable compositions The actual method for doing this will be apparent to those skilled in the art, and more particularly, for example, Reming ton's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton . Described in Pennsylvania.   When a pharmaceutical preparation, the therapeutic and prophylactic agents of the invention may be in unit dosage form. Is preferred. Appropriate therapeutically effective doses can be readily determined by one skilled in the art. Human Or 70 kg body weight to effectively treat an inflammatory disease in another animal. Parenteral administration of about 0.1 mg to about 20 mg of the protein or antibody of the present invention per administration. And preferably should be administered intravenously or intramuscularly. Must If necessary, such administration should be carried out at appropriate time intervals, as determined appropriate by the physician. It may be repeated.   The engineered and engineered antibodies of the present invention may also be used for determining RSV-mediated diseases, It may be used in diagnostics or in the follow-up progress of treatment for such diseases. No. These modified antibodies were used as diagnostic reagents in ELISA and serum and plasma. Or RSV levels in other suitable tissues, or by human cells in culture. For use in other conventional assay formats for measuring release, It may be labeled for use. The nature of assays using modified antibodies is conventional and It does not limit the indication.   The antibodies, modified antibodies or fragments thereof described herein may be frozen for storage. It can be dried and reconstituted in a suitable carrier before use. This method uses conventional immunoglobulin Lyophilization and reconstitution techniques known in the art Can be used.   The following examples illustrate the construction of a typical engineered antibody and suitable vectors and The various aspects of the invention, including their expression in host cells, are shown to limit the scope of the invention. It is not always shown. All amino acids are in conventional three letter or one letter Shown in code. All necessary restriction enzymes, plasmids and other reagents and materials Was obtained from commercial products unless otherwise specified. All common clonin Ligation and other recombinant DNA techniques are described in T.S. Maniatis et al., Or its second edition (1989) (Sambrook et al., By the same publisher). ("Sambrook et al.").                                 Example A          Conversion of Hu19 Fab to mAb type A: direct cloning   For expression in mammalian cells, Fa herein designated Hu19Fab. b Clone 19 plasmid (Cat. Barbas III et al., Proc. . Nat'l. Acad. Sci. (USA) 89, 10164-10168 (1992) and PCT Application Publication No. W Cell line clone 19, cited in WO 94/06448, application no. PCT / US93 / 08786 ) From the CMV promoter Cloned in a derivative of plasmid PCDN in which the expression of the antibody chain takes place Was. Plasmid PCD-HC68B used for cloning and expression of full length heavy chain Use the plasmid PCN-HuLC for cloning and expression of the full-length L chain ( FIG. 1 shows the cloning method for HuA mAb type A).   In the first construct, introduced by the PCR primers used for cloning The changes in the amino terminal sequence that were made were not modified. Variable for H chain The region was defined as the Hu19 Fab plasmid (C. Barbas III et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. . (USA) 89, 10164-10168 (1992)) from the Xho1-Bsp120I fragment. And introduced into the same site in PCD-HC68B. Xho1 site is P The same site in PCD-HC68B was introduced into the amino terminus by CR primer. Cloned with a Campath leader sequence in the frame (Page, J.M. et al., Biotechnology 9: 64-68 (1991)). The Bsp120I site is CH The first naturally occurring high retention sequence of one domain, identical in PCD-HC68B When cloned at the position, together with the remaining sequence of the CH1 to CH3 region of human IgG1, Exists in the frame (FIG. 1). In the resulting construct Hu19AHcpcd , The amino acid immediately after the Campath leader is EVQLLEE (FIG. 2, SEQ ID NO: No. 5, amino acids 20-26), wherein residue LE is an Xho1 clone Encoded by the nucleotide sequence of the site. Plasmid Hu19AHc The complete nucleotide sequence of pcd is shown in FIG. 4A (SEQ ID NO: 14).   Notable sequence analysis was published within the heavy chain region from the Hu19 Fab plasmid. Sequence (C. Barbars III et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 89, 10164-1). 0168 (1992), PCT Publication No. WO94 / 06448). The change is Encodes an amino acid difference at positions 15 and 16 (Consensus No. by Kabat et al.) (Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH P ublication No. 91-3242, 1991): PG in Hu19AHcpcd vector In the published sequence (Figure 2 herein and Figure 4 of WO 94/06448) See)). This discrepancy must indicate an error in the first published sequence . PG at these positions is the closest homologue between published human antibodies (Kaba t et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, NIH Public ation No. 91-3242, 1991) and possible germline parent sequences (see below, type B) Is a common sequence. In addition, it was started with the Hu19 Fab plasmid. Sequences from three independent clonings all encode PG at these positions. did.   For the light chain, the variable and constant regions of the Hu19 Fab plasmid were replaced with Sac1 / X Cloned as the ba1 fragment at the same site in the pCN-HuLc vector did. Both restriction sites were introduced by the primers used for PCR amplification It corresponded to a restriction site. The Sac1 site was added to the amino terminus by PCR primers. When introduced and cloned at the same site in pCN-HuLC, The Campath leader sequence is preceded (Page, J.M. et al., Biotechnology 9: 6. 4-68 (1991). Thus, the first two amino acids of the mature light chain are deleted. Obtained structure In the built Hu19ALcpcn, the first two amino acids immediately after the leader are EL (FIG. 3, part A), where the EL residue is the Sac1 cloning site Encoded by a nucleotide sequence. Used at the carboxy terminus of the constant region PCR primers were used to convert the amino acid at position 202 of the mature L chain from serine to leucine. (FIG. 3, part B). Same PCR ply The Xba1 restriction site introduced by the mer is located outside the coding region. Has no effect on the final amino acid sequence of the mature L chain. Plasmid Hu1 The complete nucleotide sequence of 9Apcn is shown in FIG. 4B.   As in the case of the heavy chain described above, the published sequence (C. Barbars III et al., Proc. Nat ' l. Acad. Sci. (USA) 89, 10164-10168 (1992), PCT Publication No. WO94 / 06448) Sequence conflict for the light chain between the sequence obtained in the Hu19ALcpcn and Hu19ALcpcn vectors There is a shield. As a result of the single base change, in framework 4 at position 97 (Kabat et al., (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, NI H Publication No. 91-3242, 1991). Instead, it was glycine in Hu19ALcpcn (FIG. 3 and FIG. And WO94 / 6448 in FIG. 4). Glycine, but not glutamic acid, was A large amount of human antibody sequence encoded at that position in the vesicular J minigene. Glutamic acid was not observed during collection (Kabat et al., Sequences of Pr. oteins of Immunological Interest, 5th edition, NIH Publication No. 91-3242, 1 991). Also, as in the case of the H chain, the sequence encoding glycine is the first Fa observed for three different clonings from the b19 vector (C. Barba rs III et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 89, 10164-10168 (1992), PCT release Publication No. WO94 / 06448). These results are based on the original published distribution of the Fab 19 light chain. Prove that the column is incorrect.   The Hu19AHcpcd and Hu19ALcpcn sets of vectors are It was used to produce the antibody Hu19A in S cells and CHO cells.                                 Example B     Type B: Cloning of edited Fab Hu19 heavy and light chains   In cloning the variable region of the Fab19 heavy chain, the predicted germline Non-common amino acid changes for a sequence are introduced to the amino terminus by PCR primers. (C. Barbars III et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 89, 10164-10). 168 (1992)). To determine the possible amino termini of the heavy chain, The variable region peptide sequence was matched against all known human germline H chain sequences. . Based on the results of this match, the germline amino terminus Either QVQLVE or EVQLVE, rather than VQLLEE It is expected to be. To correct the N-terminus, the first Fab clone 19 heavy chain peptide was used. Previously cloned Chid in SmithKline Beecham Human H chain sequence. PCR amplification from the beginning of the leader sequence The resulting clone, designated 97B27, has an acceptable N-terminal QVQLVE. And used to replace the region in the Fab19 heavy chain. In particular, Hu The Fab19 heavy chain in the 19 Fab plasmid was replaced with the native Bs at the beginning of CH1. a constant region primer spanning the p120I site, and the amino acid of the mature protein A PvuII site at acids 3 and 4 (corresponding to the natural site in clone 97B27) PCR amplification using the variable region primers that generated The primer is And also at the amino terminus of the Fab19 heavy chain, as in the type A construct. The amino acid sequence of QLVE of amino acids 3-6 in place of QLLEE Code changes were introduced. The PCR fragment is subjected to a series of cloning steps. Therefore, it is cleaved with restriction enzymes PvuII and Bsp120I and its PvuII site At 97B27. The resulting clone, designated Hu19BHcpcd, Contains the first three amino acids of the variable region of the leader and clone 97B27 However, a consensus sequence QVQLVE was encoded at its amino terminus (FIG. 2). Hu19B The nucleotide sequence of Hcpcd is compared to the region encoding the heavy chain in FIG. No. 20). Sequences different from Hu19AHcpcd are in bold.   In the cloning of the variable region of the Fab clone 19L chain, By the PCR primers so that the first four amino acids of Changes were introduced at the amino terminus for cloning purposes. Amino powder capable of L chain To determine the ends, the peptide sequence of the variable region of the Fab 19 light chain was Compared to human germline kappa chain sequence. Based on this matching result, The system amino terminus is predicted to be DIQM. The amino terminus of Fab19 Lc To convert the predicted germline sequence to Fab19 light chain, It was checked against the cloned human kappa chain sequence. From the middle of the leader sequence AG which is a κ chain obtained from cell line AG1-37 obtained by PCR amplification The clone designated 1-37 has the desired N-terminus and has been modified to Fab19 light chain. Used to introduce. The N-terminal part of the leader sequence depends on the expression vector. And a consensus sequence for the leader region of this family. Place of the structure In this case, the L chain coding region was converted from the Hu19 Fab vector (FIG. 1) to HinfI / XbaI fragment. HinfI is a mature protein Recognizes a site spanning amino acids 18 and 19, and clones AG1-37 Also exists. Through a series of cloning steps, the HinfI of the Fab19 light chain The / Xba1 fragment was ligated to the Hinfl site in clone AG1-37. . The final construct is Fab1 starting at amino acid 19 of the leader and V region. The first 18 of the AG1-37 variable regions linked to the variable and constant regions of the 9 light chain Made of amino acids. The resulting clone, designated Hu19BLcpcn, is Only in the region encoding the first four amino acids of the variable region Encodes the consensus sequence DIQM in place of the existing EIEL (SEQ ID NO: 11, Amino acids 21-24) (FIG. 3A). Nucleotide of plasmid Hu19BLcpcn 4D (SEQ ID NO: 22) for the region encoding the L chain. Hu1 Sequences different from 9ALcpcn are in bold.   The Hu19BHcpcd and Hu19BLcpcn set of vectors are It was used to produce the antibody Hu19B in S cells and CHO cells.                                 Example C                 Type C & D: for removal of glycosylation sites Mutation of CDR2 of Hu19B H chain   The N-linked glycosylation site is encoded in the CDR2 loop of the heavy chain. The group Lycosylation is a heterogeneity and antigen in mAbs produced in eukaryotic cells Add the possibility of interference in the coupling of To remove the glycosylation site, Mutations were introduced separately at two different residues by PCR overlap technique . In the case of the first mutation, serine is replaced with alanine at position 61 of the mature Hu19B H chain. Substitutions created the Hu19CH heavy chain. In the case of the second substitution, an as The Hu19DH heavy chain was created by changing paragine to glutamine.   In particular, the first set of primers encoding the mutation and the plasmid Hu19 Anneal to sequences in CMV promoter and CH2 constant region in Bpcd Second set of primers as outer 5 'and 3' primers, respectively. Mutations were introduced by some PCR overlap techniques. Final PCR product Was digested with restriction enzymes EcoR1 and Bsp120I, and Hu19BHcpcd was digested. Cloned at the same site in the vector, Hu19CHcpcd (from Ser) Ala) and Hu19DLcpcd (Asp to Gln). Created (FIG. 2). Sequence the final construct to confirm that the mutation is present did. Numerical value of the H chain region in Hu19CHcpcd and Hu19DHcpcd The nucleotide sequence is shown in FIGS. 4E and 4F (SEQ ID NOS: 25 and 27). Hu1 The difference from 9Hcpcd is shown in bold.                                 Example D               Type C: Cloning of the edited constant region   In the initial cloning of the Fab 19 light chain, PCR primers The native Sac1 site was removed by intentionally introducing changes at the ruboxyl terminus (Barbas Et al., Supra). Therefore, the amino acid at position 202 of the Fab 19 light chain is Changed to Isin. This change was modified as follows. Plasmid Hu19B Lcpcn was ligated to EcoR1 and Bbs1, a protein close to the amino terminus of the human kappa constant region. And the first five members of the leader, variable and kappa constant regions. Isolate the 405 bp fragment containing the nucleotide sequence encoding the amino acid did. Normal human kappa constant with XbaI site distal to coding region Plasmid Lc vector 4, which contains the region, the puc18 derivative was converted to Bbs1 and Nucleotides encoding the entire kappa constant region, cut at Xba1 and beginning at amino acid 6 A 321 bp fragment containing the sequence was isolated. The fragments are naturally occurring Contains a Sac1 site near the carboxy terminus and encodes a serine at position 202 You. Plasmid Hu19BLcpcn was also cut with EcoR1 and Xba1. Containing the rest of the vector sequence from plasmid Hu19BLcpcn. A 47 bp fragment was isolated. The three fragments are ligated together to form Hu 19CLcpcn was created. The amino acid sequence of the Hu19C L chain is shown in FIG. 3B (SEQ ID NOS: 11 and 12) and the nucleotide sequence of the light chain region is shown in FIG. (SEQ ID NO: 29). Differences from Hu19ALcpcn are in bold. COS Produces antibodies Hu19C and Hu19D in cells and CHO cells, respectively In order to achieve this, the vector Hu19CLcpcn was transformed into Hu19CHcpcd or Hu19CHcpcd. Used with 19DHcpcd.                                 Example E                Production of Hu19Mab in mammalian cells:   For initial characterization, Current Protocols in Molecular Biology (F.M.A. Ed. usubel et al., 1998, John Wi1ey & Sons, vol. 1, section 9.1) , MAb constructs for each type, Hu19A H and L chains, Hu19B H and Hu19D together with L19, Hu19C H and L chains and Hu19C L chains The heavy chain was expressed in COS cells. One day after transfection, culture growth The medium was replaced with medium without serum, which was changed on day 3. Medium without serum is special Although the prescription had a license, ITSTM Premix (insulin, tran Spherin, selenium mixture-Collaborative Research, Bedford, MA) and Satisfactory results are obtained with DMEM supplemented with 1 mg / ml BSA. mAbs were harvested from the medium under day 3 + 5 conditions, eg, Prosep A affinity Protein A Affinity Using Bio-Resin (Bioprocessing Ltd., UK) Chromatographic method (for example, described in Protocols in Molecular Biology) Was prepared.   To produce larger amounts of Hu19 mAb (100-200 mg), Was introduced into a patented CHO cell line. However, as previously described (P. Heensley et al., J. Biological Chemistry 269: 23949-23958 (1994)). Like, dhfr-Similar results will be obtained with CHO cells. simply In other words, a total of 30 μg of the linear plasmid DNA (A and H chain vector A) , B, C or 15 μg of each of the D / C sets)7Electroporation on cells Rated. Cells were first plated in 96-well plates in nucleoside-free medium. Selected in. Three to four weeks later, media from growth-positive wells were removed from the ELISA assay. Screened for human immunoglobulin using A. Highest expressing colony In high concentrations of methotrexate for amplification of transfected vectors. Developed and selected. Antibodies were removed from the medium under the conditions by protein A affinity. Chromatography (Protein A sepharose, Pharmacia), then size exclusion By standard techniques using chromatography (Superdex 200, Pharmacia) Purified.   The concentration of the eluted antibody and the antigen binding activity are measured by ELISA. H Antibodies containing fractions are pooled and subjected to size exclusion chromatography. To purify. As expected for any such antibody, SDS- By PAGE, the major protein product is reduced to approximately 150 kDa under non-reducing conditions. Migrated as two bands at 50 and 25 kDa under reducing conditions. CHO fine In the case of antibodies produced in the cells, the purity is determined by SDS-PAGE> 90% and the concentration was accurately determined by amino acid analysis.                                 Example F   Production of Fab from Hu19B mAb: Glycosylation in Heavy Chain CDR2 Samples with and without MAb purification   Using substantially the same purification method as detailed herein for mAb 19B To purify each mAb. A conditioned medium is obtained from the 6-day culture, sterilized by filtration, and the linear flow rate ( linear flow rate) 98mM / h 20mM sodium phosphate, 150mM sodium chloride 2.5 × 5.1 cm Protein A (Protein) equilibrated in PBS, pH 7 (PBS). A) (Pharmacia, high speed flow). The empty The buffer was washed with equilibration buffer and eluted with 100 mM glycine pH 2.5. mAb included Immediately adjust the eluted fraction to pH 5.0 with 1 M sodium hydroxide, 20 mM sodium phosphate buffer containing 150 mM NaCl at a concentration of 4.2 mg / mL Superdex 200 size exclusion column equilibrated in pH 7.0 (2.6 × 70 cm). Approximately 150 kDa apparent molecular weight maintained by column The retained monomer mAbs are pooled, concentrated by ultrafiltration to 5 mg / mL, and sterilized by filtration. Then, it was stored at 4 ° C.   Electrophoretic analysis of MAb 19B and MAb 19C   By reduced SDS-PAGE, mAb 19B was converted to IgG heavy and light chains, respectively. The two major bands at 52 kDa and 28 kDa corresponding to the chains and the total It separated as an additional band of 59 kDa representing about 7% of the protein (FIG. 5). S After removal from DS-PAGE and proteolytic digestion (see below) LC / Mass spectrometry analysis of the two heavy chains shows that the 59 kDa species has a predicted VHGlico The additional glycoform of mAb 19B containing hydrocarbons at the silation site Confirmed to represent. In contrast, this VHM with glycosylation sites removed Reduced SDS-PAGE analysis of Ab 19C (FIG. 5) shows that this mAb As shown in FIG. 7, it contained only the type of low molecular weight (52 kDa) heavy chain.   Hydrocarbon analysis of mAb 19B   The Hu19B construct contains the heavy chain CHNormal glycosylation sites in the two domains -Asn299-Ser-Thr- plus an N-linked glycosylation in the variable region of the heavy chain Additional consensus sequence for silation-Asn59-Tyr-Ser- . Liquid chromatography after reduction, alkylation and tryptic digestion, Analysis of both heavy chain bands by electrospray mass spectrometry (LC-ELMS) , 59 kDa band is Asn299In addition to being glycosylated atFive 9 Contains a glycosylated variant. Asn59Carbohydrates in Is mainly biantennary and the core consists of two sialic acid residues Is a fucosylated carbohydrate having This is due to the CHO-expressed glycoprotein (sCR -1 and sCD4) are common carbohydrate structures found in Differs from the carbohydrates found at the Asn299 site that lacks any arlic acid.Purification of mAb 19B glycovariant   Mab 19B (2 mg) was dialyzed against 20 mM Tris, pH 8.5 and the linear flow rate A 0.5 × 5 cm Mono Q column (Fa) equilibrated with the same buffer at 300 cm / hr. Lumasia). The column is washed with the equilibration buffer, and from 0 mM to 5 mM in the same buffer. Elution was performed with 20 column volumes of NaCl gradient up to 0 mM (FIG. 6). SDS-PAGE Fractions containing the sugar variant determined by Dialyzed, filter sterilized and stored at 4 ° C.   Preparation of Fab by proteolytic digestion   Take out mAb 19B (48 mg) and adjust the pH to 7.0 with dilute sodium hydroxide. Saved. 100 mM sodium phosphate buffer containing 10 mM EDTA (pH 7. 3) 2.5 ml; 100 in 10 mM sodium phosphate buffer containing 1 mM EDTA 1.3 ml of mM cysteine; and crystalline papain (Boehringer, 1 (0 mg / ml) was added. Incubate the sample at 37 ° C. for 20 hours, The digest was 1.5 x 2.6 cm Protein G equilibrated in PBS at a linear flow rate of 67 cm / hr. Applied to the column. The column is washed with PBS and unbound fraction containing Fab Amicon ultra-limited with 10,000 molecular weight cut membrane 2.6 × concentrated in a filtration cell to 5 ml and equilibrated in PBS at a linear flow rate of 23 cm / h. Applied to a 70 cm Superdex 200 (Pharmacia) size exclusion column. F Ab (total yield 12 mg) eluted as a monomer on the size exclusion column and the non-reduced SD Analysis by S-PAGE showed a major band at 45 kDa and a glycoform at 47 kDa. showed that.   Isolation of Fab sugar variants   Glycosylated and non-glycosylated Fab from cleaved mAb 19B The mixture was dialyzed against 20 mM sodium acetate pH 4.5, A 0.5 × 5 cm Mono S column (F) equilibrated with 0 mM sodium acetate buffer pH 4.5 Pharmacia) (4 mg). The column is then washed with the equilibration buffer, Elution was performed isocratic with equilibration buffer containing 00 mM NaCl. Glycosylation Fab eluted after 5 column volumes, whereas non-glycosylated FAb eluted It was retained for a longer time and eluted after 6 column volumes. Determined by SDS-PAGE Fractions containing only the isolated glycosylated Fab were pooled and the starting buffer And reapplied to a 0.16 x 5 cm Mono S column at 300 cm / hr. . The Fab was eluted again with 100 mM NaCl and the glycosylated Fab was the most abundant one. Fractions were pooled, dialyzed against PBS pH 7.0, and filter sterilized. SD According to S-PAGE analysis, this fraction was converted to a glycosylated species> It was 90% rich (FIG. 7). The process allows each of the non-glycosylated Fab3 0.3 mg and 0.16 mg of glycosylated Fab were obtained.                                 Example GRecombinant F protein of Hu19 mAb and Fab clone 19 protein Binding to   Binding of Various Antibody Constructs to Recombinant F Protein Using Standard Solid-Phase ELISA Was measured. Antigen diluted in PBS pH 7.0 was applied to a polystyrene round bottom Rate (Dynatech, Immunolon II) for 18 hours I wore it. The wells were then aspirated and 0% in PBS containing 1% Tween 20. Blocked with 0.5% boiling casein (BC) (PBS / 0.05% BC) for 2 hours. Antibodies (50 μl / well) were added to PBS / 0.05 containing 0.025% Tween 20. Dilute with varying concentrations in 5% BC and incubate in antigen-coated wells for 1 hour. I was vate. Wash plate with Titertek 320 microplate Wash three times with PBS containing 0.05% Tween 20 using a purifier, then HRP-labeled protein A / G (50 μl) diluted 1: 5000 was added. . After washing three times, a TBlue substrate (TSI, # TM102) was added, The plate was incubated for a further 15 minutes. 1N HTwoSOFourThe reaction by adding Stop and absorbance at 450 nm using a Biotek ELISA reader Was measured.   Competitive ELISA for antigen binding epitopes of Fab 19 and mAb construct 19B Method. Test antibody constructs were not used to increase the concentration of RSMU19 or B4. The mixture was mixed and added to the F protein coated well. mAbs RSMU19 and And the epitope region recognized by B4 are described in Arbiza et al., J. Am. Gen'l Virol. 7 3: 2225-34 (1992). Fab1 used in competition test The concentration of 9 or mAb 19B was adjusted so that 90% maximum binding to F antigen was obtained. Was previously determined. Fab19 or mAb 19B in the presence of other mAbs Binding was detected using HRP-labeled goat anti-human IgG. The reaction is performed as described above. I went.   Fab 19 and mAb constructs 19A or 19B are based on molarity It showed equivalent binding to the F protein. RF of Fab 19 or mAb 19B Binding to the (recombinant F) protein was inhibited by mAb B4, but RSM Not inhibited by U19, which is an epitope recognized by these constructs The region is localized to the region aa 255-275 of the F protein.   Table 1: Viral F protein epitope recognized by mAb 19B *Amino acid residues important for antigen recognition   mAb 19B also demonstrates RSV recognition of the F protein displayed in its native form. It showed specific binding to infected cells. TCID50 RS long virus about 5 Zero infected VERO cells are treated with 90% methanol when CPE reaches> 90%. And used as antigen in the above ELISA format. Bio Detection of binding of tinylated mAb 19B using HRP-labeled streptavidin did. In this assay, the EC50 for mAb 19B was 34 +/- ng. / Ml.                                 Example H   In vitro antiviral activity of Hu19 antibody   Inel described by Beeler et al. (J. of Virology 63: 2941-2950 (1989)). Virus induction of Fab fragments using a modified method of the in vitro microneutralization assay The ability to inhibit cell fusion was measured. This assay requires a minimum of 2% FCS. Medium (37 ° C, 5% CO)Two4 hours, RS long strain virus (about 100 TCID50/ Well; American Type Culture Collection (American Type Culture Collection) ATCC VR-26) 50ul to VER O cells (5 × 10Three/ Well; ATCC CCL-81). Next Serial two-fold dilution of test sample (50 ul) into wells containing virus-infected cells (Duplicate) was added. Control cultures are incubated with virus only. Incubate with vaccinated cells (positive virus control) or medium alone Cells. Cultures are grown in 5% COTwoIncubate at 37 ° C for 6 days Was. At this point, the cytopathic effect (CPE) in the virus control wells is ≧ 90% Met. Serial dilutions of the test samples were added to VERO cells (5 × 10Three5) before adding % COTwo100 TCID of RS virus for 2 hours at 37 ° C50(50ul each) A neutralization assay was performed as described above, except for mixing.   Microscopic examination for cytopathic effect was confirmed by ELISA. From culture The medium is aspirated and 90% methanol / 0.6% HTwoOTwo Replaced with 50ul. 10 minutes later The fixative was aspirated and the plates were air-dried overnight. Viral antigen was used for mAb B4 Using a biotinylated human / bovine chimeric derivative (RSCHB4; 1 ug / ml), And diluted 1: 10,000 (Each lot was titrated to determine the optimal concentration. ) HRP labeled streptavidin (Boehringer-Mannheim) nheim)) in fixed cultures. The reaction was performed using TMBlue. Done, 1N HTwoSOFourWas stopped by the addition of The absorbance was measured at 450 nm ( O.D.450).   The fusion inhibition or neutralization titer is 50% reduction in ELISA signal (ED50) Justified. Based on curve generated in ELISA with standard virus titration OD in the well45050% decrease in ≥90% decrease in virus titer Equivalent. ED50To determine the mean absorbance for replicate cultures (test (For each dilution of material) was plotted against the dilution of the sample. (Of virus-infected cells 50% point defined as the average absorbance + the average absorbance of uninfected cells) / 2 Calculations were based on regression analysis of dose titrations.   SB209763 is described in P.S. R. Tempest et al., Biotechnology 9, 266-271 (19 91) A humanized derivative of RSMU19 as described in 91). In vitro Determine the effect of co-administration of mAb 19B and SB209763 on fusion-inhibition The antibodies were titrated alone and in combination to determine. Antibody interaction The MacSynergyTMAnalyzed using II software.   By direct cloning (version A) or after introduction of various sequence modifications (Version BD) The in vitro antiviral titer of the mAb construct obtained was Demonstrated effective neutralizing and fusion inhibitory activity against prototype RSV long strain (Table 2). mAb 19B is also available in the Philadelphia PA area in 1993 / Neutralizing clinical isolates showing multi-antigenic variants of RSV recovered in the 1994 stage Also shown. mAb 19B was linked to a different F protein epitope (SB20976). 3. When co-administered with a secondary antibody directed against key residues aa429), The effect on inhibition of virus growth in stained cell cultures was cumulative (de Data is not shown).   The antiviral titers of the mAb constructs were determined by the corresponding Fab constructs-Fab19, Fa Approximately 5-10 times lower than the titers obtained with b19A or B (Table 2). Fab19 was the first Fab protein produced directly in E. coli. Fab19A and Fab19B have the corresponding full length m It was derived from Ab by papain cleavage. The heavy chain CDR2 Removal of the N-linked glycosylation site encoded in the Had no effect on cell activity (Table 2; construct C was compared to A and B ). Furthermore, the abundance of the mAb19B construct against normally glycosylated antibodies Did not significantly alter the in vitro fusion inhibitory titers (Table 4). However The enrichment for the sugar variant Fab fragment was normally glycosylated 2-10 fold reduction in in vitro antiviral activity compared to Fab fragments (Table 4).   Table 2: 19A, 19B, 19C and 19D structures for RS long strain virus Anti-viral activity of the building *Mean ± standard deviation   Table 3: Fusion inhibitory activity of mAb 19B on RSV clinical isolates   Table 4: Antiviral activity of 19B sugar variants *The mAb or Fab fragment is unprocessed or mono-Q (Ma b) or on a Mono S (Fab) column to obtain glycosylated The separated and minimally glycosylated forms were separated.                                 Example I   In vivo activity of mAb19B: prevention and protection in Balb / c mouse model Treatment   Balb / c mice (5 / group) were challenged with human RSV A2 strain 10FivePFU 24 hours before (prevention) or 4 days (treatment) intranasal infection with mAb 19B 0.2. Inoculations were intraperitoneal at doses ranging from 06 mg / kg to 5 mg / kg. 5 days after infection, mice Was sacrificed. Obtain serum, measure antibody levels, homogenize lungs, The titer was measured. The virus has mAb 19B ≧ 1.25 μg and the corresponding Not detectable in lungs of mice prophylactically treated with serum concentrations ≧ 5 ug / ml (Table 5). When the mAb is administered therapeutically, complete viral clearance A higher dose of mAb 19B was needed for the drug (5 mg / kg).   Table 5: Prevention and treatment of mAb 19B in Balb / c mice  The results from Examples G to I show that the Hu19 antibody shows a wide range of both A and B types. Has effective antiviral activity in vitro against natural RSV isolates To demonstrate prophylactic and therapeutic efficacy in vivo in animal models . Thus, the Hu19 antibody, most preferably Hu19C or Hu19D, It is a candidate for therapeutic, prophylactic and diagnostic uses in humans.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ａ (72)発明者 ディロン，スーザン・ベス アメリカ合衆国19425ペンシルベニア州 チェスター・スプリングズ、トゥラモア・ サークル 1209番 (72)発明者 ポーター，テレンス・グレイアム アメリカ合衆国19012ペンシルベニア州 チェルトナム、リーバイス・ロード7634番 (72)発明者 スウィート，レイモンド・ホイットニー アメリカ合衆国19004ペンシルベニア州 バラ・シンワイド、エッジヒル・ロード 108番──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 1/15 C12N 1/19 1/19 1/21 1/21 C12P 21/08 5/10 C12N 15 / 00 ZNAA C12P 21/08 5/00 A (72) Inventor Dillon, Susan Beth United States 19425 Pennsylvania Chester Springs, Tullamore Circle 1209 (72) Inventor Porter, Terrence Graham United States 19012 Cheltenham, PA 1992 Levi's Road 7634 (72) Inventor Sweet, Raymond Whitney Edgehill Road 108, Barra Singhwide, Pennsylvania, United States 19004

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．呼吸シンシチアルウイルスのＦタンパク質エピトープと特異的に反応し、 Ｈｕ１９Ａ、Ｈｕ１９Ｂ、Ｈｕ１９ＣおよびＨｕ１９Ｄからなる群より選択され るウイルスによる感染の中和能を有する、再形成ヒトモノクローナル抗体および その機能的フラグメント。 ２．配列１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃおよび１９Ｄから選択される図３の軽鎖アミ ノ酸配列および／または配列１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃおよび１９Ｄから選択され る図２の重鎖アミノ酸配列を有してなる、請求項１記載のモノクローナル抗体ま たはその機能的フラグメント。 ３．そのフラグメントが、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ(ａｂ')2からなる群より選択 される請求項１記載のモノクローナル抗体。 ４．（ａ）請求項１に記載のヒトモノクローナル抗体およびその機能的フラグ メントのいずれかをコードする核酸配列； （ｂ）（ａ）のいずれかの配列に相補的な核酸配列；および （ｃ）ストリンジェントな条件下で、（ａ）または（ｂ）とのハイブリッド形 成能を有する１８またはそれ以上のヌクレオチドの核酸配列 からなる群より選択される単離された核酸分子。 ５．図４のヌクレオチド配列を有する請求項１に記載のモノクローナル抗体ま たはその機能的フラグメントをコードする単離された核酸分子。 ６．請求項４に記載の核酸配列を有してなる組換えプラスミド。 ７．請求項５に記載の核酸配列を有してなる組換えプラスミド。 ８．図２または３のタンパク質配列をコードする請求項７記載のプラスミド。 ９．請求項８のプラスミドを有してなる宿主細胞。 １０．時間、温度およびｐＨの適当な条件下、請求項９の宿主細胞を培地中で 培養し、それで産生された抗体を回収することからなる、ＲＳＶに特異的なヒト 抗体の産生方法。 １１．ＲＳＶを有するか疑わしい源を診断上有効量の請求項１のモノクローナ ル抗体と接触させ、そのモノクローナル抗体が該源に結合するかどうかを決定す ることからなる、ＲＳＶの検出方法。 １２．免疫治療的に有効な量の請求項１に記載のモノクローナル抗体をヒトに 投与してなる、ヒトにおけるＲＳＶ疾患に対する受身的免疫治療を提供する方法 。 １３．受身的免疫治療を予防的に提供する請求項１２記載の方法。 １４．医薬上許容される担体中に少なくとも１回用量の免疫治療上有効量の請 求項１に記載のモノクローナル抗体を有してなる医薬組成物。 １５．少なくとも１つの別のモノクローナル抗体と組み合わせて、少なくとも １回用量の免疫治療上有効量の請求項１に記載のモノクローナル抗体を有してな る医薬組成物。 １６．その別のモノクローナル抗体が、ＲＳＶ Ｆタンパク質抗原の種々のエ ピトープと反応性を有することで、請求項１の抗体と区別される抗−ＲＳＶ抗体 である請求項１５記載の医薬組成物。[Claims] 1. Reshaped human monoclonal antibodies and functional fragments thereof that specifically react with the F protein epitope of respiratory syncytial virus and have the ability to neutralize infection by a virus selected from the group consisting of Hu19A, Hu19B, Hu19C and Hu19D . 2. 3 comprising the light chain amino acid sequence of FIG. 3 selected from sequences 19A, 19B, 19C and 19D and / or the heavy chain amino acid sequence of FIG. 2 selected from sequences 19A, 19B, 19C and 19D. The described monoclonal antibody or a functional fragment thereof. 3. The monoclonal antibody according to claim 1, wherein the fragment is selected from the group consisting of Fv, Fab and F (ab ') 2 . 4. (A) a nucleic acid sequence encoding any of the human monoclonal antibodies of claim 1 and a functional fragment thereof; (b) a nucleic acid sequence complementary to any of the sequences of (a); and (c) a stringent. An isolated nucleic acid molecule selected from the group consisting of a nucleic acid sequence of 18 or more nucleotides capable of hybridizing with (a) or (b) under conditions. 5. An isolated nucleic acid molecule encoding the monoclonal antibody or a functional fragment thereof according to claim 1 having the nucleotide sequence of FIG. 6. A recombinant plasmid comprising the nucleic acid sequence according to claim 4. 7. A recombinant plasmid having the nucleic acid sequence according to claim 5. 8. 8. A plasmid according to claim 7, which encodes the protein sequence of Fig. 2 or 3. 9. A host cell comprising the plasmid of claim 8. 10. A method for producing a human antibody specific to RSV, comprising culturing the host cell of claim 9 in a medium under appropriate conditions of time, temperature and pH, and collecting the antibody produced therefrom. 11. A method for detecting RSV comprising contacting a source suspected of having RSV with a diagnostically effective amount of the monoclonal antibody of claim 1 and determining whether said monoclonal antibody binds to said source. 12. A method for providing passive immunotherapy against RSV disease in a human, comprising administering to the human an immunotherapeutically effective amount of the monoclonal antibody of claim 1. 13. 13. The method of claim 12, wherein the passive immunotherapy is provided prophylactically. 14． A pharmaceutical composition comprising an immunotherapeutically effective amount of at least one dose of the monoclonal antibody of claim 1 in a pharmaceutically acceptable carrier. 15. A pharmaceutical composition comprising an immunotherapeutically effective amount of at least one dose of the monoclonal antibody of claim 1 in combination with at least one other monoclonal antibody. 16. The pharmaceutical composition according to claim 15, wherein the other monoclonal antibody is an anti-RSV antibody that is distinguished from the antibody of claim 1 by having reactivity with various epitopes of a RSV F protein antigen.
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