JP2001505776A - バチルス株および抗生物質スクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 以下の修飾：前胞子染色体の移動をブロックするspoIIIE遺伝子の変異；SpoOJ機能の損失が胞子形成をブロックすることを妨害する変異；σ^F因子に依存し、且つ損なわれたSpoOJ機能が前胞子中の増大したトラッピング即ち増大した発現を導く位置に置かれたプロモーターを有する第１リポーター遺伝子；およびσ^F因子に依存し、且つ損なわれたSpoOJ機能が前胞子中の減少したトラッピング即ち減少した発現を導く位置に置かれたプロモーターを有する第２リポーター遺伝子を伴う染色体を有するバチルス株。該株は仮想抗生物質のスクリーニング法に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 バチルス株および抗生物質スクリーニング方法発明の背景 我々は、以前に、前胞子（prespore）をそのより大きな母細胞から分離する非 対称性分裂隔壁を通した前胞子染色体の運搬（transfer）に、バチルスサチルス のSpoIIIE蛋白質が必要であることを示した(１，２)。spoIIIEの変異は胞子形成 におけるブロックを導き、染色体のほんの一部を伴う前胞子を残し、染色体の残 りは母細胞の区画にトラップされる。spoIIIEの変異のさらなる分析は、前胞子 にトラップされたＤＮＡの小さなセグメントが相当に特異的なものでありＤＮＡ 複製の起源であるoriC近傍に中心をおくことを明らかにした(１，３)。これは、 隔壁形成前の前胞子に運命づけられた染色体上の特定の配置（orientation）を 義務づける機構の存在を暗示した。我々は、spoOJ遺伝子がこの配置を特定する のに必要であることを最近示した(４)。しかしながら、特異性はspoOJ変異体に おいて完全に損失されなかったので(３)、胞子形成の開始において染色体の配置 を決定するのに機能する少なくとも一つの二次的な機構があるに違いないらしい 。以下に記載されるSpoOJ機能の阻害剤のアッセイは、特異性のこの変化のいく つかの予測されない特徴を利用する。 spoOJ遺伝子は広範囲の細菌において高度に保存されており(５)、そして多く の異なった細菌中に見いだされる低コピー数のプラスミドの正確な分配（partit ioning）に必要な蛋白質のファミリーに関連する(６，７)。我々の最近の結果は 、SpoOJ蛋白質が成長並びに胞子形成の両方において娘染色体の分離に直接の役 割を有することを示唆する(10)。しかしながら、染色体の区画形成は部分的に損 なわれるが、該遺伝子は休止期には必須ではない(８)。おそらく、これは、この 生体（organism）における二次区画形成系の存在のためであり、おそらくは、上 記実験において我々が検出したのと同じ系である。にもかかわらず、染色体のsp oOJ様遺伝子が必須であるとの報告が少なくとも一つあり(９)、細菌の生存のた めの染色体の区画形成機構の致命的な重要性と一致する。即ち、spoOJファミリ ーの蛋白質は抗菌剤のための良好な標的でありうる。本発明 前胞子の染色体配置に対するspoOJ変異の効果、およびspoIIIE変異体バックグ ラウンドの使用によりこれを検出する能力は、SpoOJ機能の阻害剤に関する極め て特異的な全細胞アッセイの可能性を提供する。前胞子中の染色体の任意の与え られたセグメントの存在は、小さな前胞子区画中においてのみ活性化される転写 因子σ^Fにより制御されるリポーター遺伝子の使用により検出されうる(染色体分 配における不安要因により影響されない方法)。 即ち、本発明は、一つの側面において、以下の修飾を伴う染色体を有するバチ ルス株を提供する： ａ）前胞子染色体の移動をブロックするspoIIIE遺伝子の変異、 ｂ）SpoOJ機能の損失が胞子形成をブロックすることを妨害する変異、並びに ｃ）σ^F因子に依存し、且つ損なわれたSpoOJ機能が前胞子中の増大したトラッピ ング即ち増大した発現を導く位置に置かれたプロモーターを有する第１リポータ ー遺伝子、および／または ｄ）σ^F因子に依存し、且つ損なわれたSpoOJ機能が前胞子中の減少したトラッピ ング即ち減少した発現を導く位置に置かれたプロモーターを有する第２リポータ ー遺伝子。 別の側面において、本発明は、薬剤がバチルス種においてSpoOJ機能を阻害す るか否かを測定する方法を提供するが、該方法は、薬剤存在下において胞子形成 の間に非対称に分裂するように前記のとおりにバチルス株を誘導し、そして第１ および／または第２リポーター遺伝子の発現を観察することからなる。 別の側面において、本発明は、薬剤存在下において胞子形成するように前記の とおりにバチルス株を誘導し、第１および／または第２リポーター遺伝子の発現 を観察し、そしてそれにより薬剤がバチルス種におけるSpoOJ機能を阻害するこ とを決定し、そして細菌を殺傷するために該薬剤を抗生物質として用いることか らなる方法を提供する。 さらに別の側面において、本発明は、バチルス種におけるSpoOJ機能を阻害す る物質に細菌を接触させることからなる細菌殺傷方法を提供する。 好ましくは、第１リポーター遺伝子ｃ）と第２リポーター遺伝子ｄ）の両者が 本発明のバチルス株中に存在する。好ましくは、第１リポーター遺伝子ｃ）と第 ２リポーター遺伝子ｄ）の各々がσ^F依存性ｇｐｒプロモーターに融合される。 好ましくは、第１リポーター遺伝子ｃ）と第２リポーター遺伝子ｄ）の各々が異 なる検出可能酵素を発現する。 本発明の方法において、第１および第２リポーター遺伝子の発現はそれらの産 物のレベルまたは比率の変化を監視することにより観察することが好ましい。好 ましくは、第１および第２リポーター遺伝子は、あらゆる便利な手段、例えば蛍 光光度計または分光光度計によりその活性が観察される酵素として発現される。 好ましくは、バチルス株は、胞子形成するように誘導されて非対称性細胞分裂の 直前に調査される薬剤と接触させる。本発明の方法は、仮想抗生物質薬剤に関す るスクリーニング試験として便利に実行できる。 適切な条件下で胞子形成することができて、遺伝子構築物が作成されうるあら ゆるバチルス種を用いてよい。バチルスサチルスが便利に入手できて、よく特徴 付けられており、そして好ましい。 染色体中の多くの位置に置かれたリポーター遺伝子を用いた実験が示したこと は、spoIIIE変異体において、かなり特異的なＤＮＡセグメントが前胞子区画中 にトラップされることである(１，３)。spoOJ遺伝子の損失は、トラップされた ＤＮＡセグメントの特異性に変化をもたらし、異なる染色体位置におかれたσ^F 依存性リポーター遺伝子の発現レベルの特徴的な変化を導く。図１は、spoIIIE3 6バックグラウンド中の異なる染色体位置におかれたσ^F依存性リポーター遺伝子 （gpr-lacZ）の発現に対するspoOJの作用を示す。β−ガラクトシダーゼの絶対 レベルの日ごとの変化を制御するため、spoIIIE+バックグラウンド中の同じ位置 のリポーターを含む対照株を用いて各実験を行った。各々の活性は対応する対照 の活性と比較して表される。即ち、例えばspoOJ変異をspoIIIE変異と組み合わせ る場合、リポーター遺伝子の発現はsigL位置においては増加するがamyE位置にお いては減少する。spoOJ機能の損失は、したがって、２つのリポーター産物のレ ベルにおいて特徴的に生じる大きな変化により検出することができる。 好ましいアッセイ株（例えば、1238）はいくつかの遺伝的修飾を含む。第１に 、前胞子染色体の移動をブロックするためのspoIIIE遺伝子中の点変異である。s poIIIE36変異は便利であり、よく特徴がわかっており、適切な種類の例である( １， ２)。第２に、SpoOJ機能の損失が胞子形成をブロックすることを妨害する、soj 変異である(８)。隣接するspoOJ遺伝子の発現に過度に影響することなしにsoj機 能を壊滅するあらゆる変異：例えば、Iretonら（８）により構築された大きなイ ンフレームの欠失が適当である。第３に、σ^F依存性ｇｐｒプロモーターに融合 させて、損なわれたSpoOJ機能が前胞子における増大したトラッピング即ちリポ ーター遺伝子産物β−ガラクトシダーゼの増大した合成を導くsigL位置におかれ たリポーター遺伝子lacZである。第４に、第１と同様であるが、SpoOJ機能が損 なわれた場合にトラッピングおよび即ち発現が減じられるamyE位置に置かれ、そ してβ−グルクロニダーゼをコードするgus遺伝子（uidAとも呼ばれる）に基づ いた第２リポーター遺伝子である。SpoOJの阻害剤の不在下においては、この株 の胞子形成細胞はβ−ガラクトシダーゼよりもβ−グルクロニダーゼをかなり多 く生産する。SpoOJの阻害剤はその比率に劇的な変化をもたらすはずであり、減 少したβ−グルクロニダーゼ並びに増加したβ−ガラクトシダーゼを伴う。細胞 の生存、胞子形成能力、σ^Fの活性化、またはひとつまたはその他のリポーター 酵素に影響する非特異的阻害剤は、この特徴的な変化を生じないはずである。 アッセイは高いスループットに基づいて稼働するように容易に適合させること ができ、化合物の大きなライブラリーのスクリーニングを可能にする。株1238は 、標準法に従い(１１，１２)、加水分解されたカゼイン成長培地中で大きなバッ チ培養させて、回収して飢餓培地に再懸濁することにより胞子形成を誘導する。 胞子形成した培養物のサンプルは、次に、可能性のある阻害剤を含むマイクロタ イタープレートの個々のウエルに分配する。適当な時間のインキュベーションの 後、σ^Fの活性化並びに２つのリポーター遺伝子の発現を可能にするため、細胞 を溶解して２つの酵素の産物に関して同時にアッセイした。β−ガラクトシダー ゼおよびβ−グルクロニダーゼの場合、特定の酵素活性をアッセイするのに利用 可能なある範囲の基質がある。これらは、蛍光、化学発光または発色産物を与え ることができ、自動化プレートリーダーを用いて連続時間あるいは固定された時 間の何れかに基づいて測定することができる。可能性のある阻害剤は他のアッセ イ方法または細菌株を用いて異なる組み合わせのリポーター遺伝子と共に詳細に 再調査することができる。それらは、胞子形成細胞の顕微鏡像の特徴的な変化も 生じる べきである(４)。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１０月２８日（１９９８．１０．２８） 【補正内容】 （１）明細書第２頁を次のとおり補正する。 「前胞子の染色体配置に対するspoOJ変異の効果、およびspoIIIE変異体バックグ ラウンドの使用によりこれを検出する能力は、SpoOJ機能の阻害剤に関する極め て特異的な全細胞アッセイの可能性を提供する。前胞子中の染色体の任意の与え られたセグメントの存在は、小さな前胞子区画中においてのみ活性化される転写 因子σ^Fにより制御されるリポーター遺伝子の使用により検出されうる(染色体分 配における不安要因により影響されない方法)。 即ち、本発明は、一つの側面において、以下の修飾を伴う染色体を有するバチ ルス株を提供する： ａ）前胞子染色体の移動をブロックするspoIIIE遺伝子の変異、 ｂ）SpoOJ機能の損失が胞子形成をブロックすることを妨害する変異、並びに ｃ）σ^F因子に依存し、且つ損なわれたSpoOJ機能が前胞子中の増大したトラッピ ング即ち増大した発現を導く位置に置かれたプロモーターを有する第１リポータ ー遺伝子、および／または ｄ）σ^F因子に依存し、且つ損なわれたSpoOJ機能が前胞子中の減少したトラッピ ング即ち減少した発現を導く位置に置かれたプロモーターを有する第２リポータ ー遺伝子。 別の側面において、本発明は、薬剤がバチルス種においてSpoOJ機能を阻害す るか否かを測定する方法を提供するが、該方法は、薬剤存在下において胞子形成 の間に非対称に分裂するように前記のとおりにバチルス株を誘導し、そして第１ および／または第２リポーター遺伝子の発現を観察することからなる。 別の側面において、本発明は、薬剤存在下において胞子形成するように前記の とおりにバチルス株を誘導し、第１および／または第２リポーター遺伝子の発現 を観察し、そしてそれにより薬剤がバチルス種におけるSpoOJ機能を阻害するこ とを決定し、そして細菌を殺傷するかまたは細菌の成長を阻害するために該薬剤 を抗生物質として用いることからなる方法を提供する。 好ましくは、第１リポーター遺伝子ｃ）と第２リポーター遺伝子ｄ）の両者が 本発明のバチルス株中に存在する。好ましくは、第１リポーター遺伝子ｃ）と第 」 （２）明細書第８頁を次のとおり補正する。 「ないし８の何れか１項記載の方法。 10．以下の工程： 請求項１ないし４の何れか１項記載のバチルス株を誘導することにより、薬剤 の存在下で胞子形成させ、 第１および／または第２リポーター遺伝子の発現を観察し、そしてそれにより 薬剤がバチルス種においてSpoOJ機能を阻害するか否かを決定し、そして 細菌を殺傷するかまたは細菌の成長を阻害するために薬剤を抗生物質として用 いること からなる方法。」

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下の修飾： ａ）前胞子染色体の移動をブロックするspoIIIE遺伝子の変異、 ｂ）SpoOJ機能の損失が胞子形成をブロックすることを妨害する変異、並びに ｃ）σ^F因子に依存し、且つ損なわれたSpoOJ機能が前胞子中の増大したトラッピ ング即ち増大した発現を導く位置に置かれたプロモーターを有する第１リポータ ー遺伝子、および／または ｄ）σ^F因子に依存し、且つ損なわれたSpoOJ機能が前胞子中の減少したトラッピ ング即ち減少した発現を導く位置に置かれたプロモーターを有する第２リポータ ー遺伝子 を伴う染色体を有するバチルス株。 ２．ｂ）がsoj変異である、請求項１記載のバチルス株。 ３．第１リポーター遺伝子ｃ）と第２リポーター遺伝子ｄ）の各々がσ^F依存 性因子ｇｐｒプロモーターに融合されている、請求項１または２記載のバチルス 株。 ４．第１リポーター遺伝子ｃ）と第２リポーター遺伝子ｄ）の各々が異なる検 出可能酵素を発現する、請求項１ないし３の何れか１項記載のバチルス株。 ５．薬剤がバチルス種におけるSpoOJ機能を阻害するか否かを測定する方法で あって、該方法は以下の工程： 請求項１ないし４の何れか１項記載のバチルス株を誘導することにより、薬剤 の存在下で、胞子形成の間に非対照分裂させ、そして 第１および／または第２リポーター遺伝子の発現を観察すること からなる。 ６．第１および第２リポーター遺伝子発現産物レベルを監視することにより第 １および第２リポーター遺伝子の発現を観察する、請求項５記載の方法。 ７．蛍光光度計または分光光度計分析機によりその活性を観察する酵素として 第１および第２リポーター遺伝子が発現される、請求項６記載の方法。 ８．胞子形成のためにバチルス株を誘導し、そして非対称性細胞分裂の直前に 薬剤と接触させる、請求項５ないし７の何れか１項記載の方法。 ９．仮想抗生物質薬剤に関するスクリーニング試験として実施する、請求項５ ないし８の何れか１項記載の方法。 10．以下の工程： 請求項１ないし４の何れか１項記載のバチルス株を誘導することにより、薬剤 の存在下で胞子形成させ、 第１および／または第２リポーター遺伝子の発現を観察し、そしてそれにより 薬剤がバチルス種においてSpoOJ機能を阻害するか否かを決定し、そして 細菌を殺傷するために薬剤を抗生物質として用いること からなる方法。 11．バチルス種においてSpoOJ機能を阻害する物質に細菌を接触させることか らなる、細菌殺傷方法。