【発明の詳細な説明】
カプリレートとのインキュベーションによるウイルスの不活性化 発明の分野
本発明は、治療用タンパク質の溶液中の包膜（enveloped）ウイルスの不活性
化のための方法に関する。発明の背景
アルブミンおよびIgG製品の製造において、Cohn分画化が伝統的に使用され、
これがウイルスの不活性化またはクリアランスとある程度関連していることが、
いくつかの研究によって実証された（Wellsら(1986)、Yeiら(1992)、Uemuraら(1
994)およびJohnston(1996)）。アルブミンの製造においては、低温殺菌法（液体
の６０℃での加熱）が含まれ、肝炎ウイルスおよびＨＩＶを不活性化することに
よるウイルスの安全性の確保が得られた。クロマトグラフィー技術の人気が高ま
り、Cohn分画法から離れるにつれて（Stoltz、1993、Yapら、1993、Veronら、19
93）、低温殺菌段階に次ぐ第２のウイルス不活性化段階を導入して、Cohn分画化
したアルブミン製品と同等の安全性を保証する必要性が生じた。現在のところ、
実行することのできる、利用可能な不活性化／クリアランス技術は数種があるの
みである。ウイルスの濾過によっては、分子サイズに基づいてウイルスがタンパ
ク質から分離され、従ってＡ型肝炎ウイルスおよびパルボウイルスを分子量のよ
り小さいタンパク質から除去することが可能である。しかしながら、大きな分子
量のタンパク質（例えばIgGおよび第VIII因子）は孔の大きさが大きいフィルタ
ーを通しての濾過に制限され、小さいウイルスは除去されない。溶媒および界面
活性剤などの膜撹乱剤の使用は、毒性のある物質を除去するために（クロマトグ
ラフィー段階などの）更なる処理が必要とされる（Horowitzら、1984）。
本明細書において開示される発明は、製剤の一部として現在アルブミン溶液中
に含有され、本発明において低ｐＨおよび昇温で殺ウイルス能を有することが示
された脂肪酸であるカプリレートの使用を記載する。
アルブミンの低温殺菌は、早くも１９４８年に、主としてアルブミンの静脈内
投与を介して伝染した肝炎ウイルスの不活性化のために最初に導入された。Hink
とその共同研究者（1957）は、アルブミン分子に安定性を付与するために、脂肪
酸であるアセチルトリフォファント（tryphophante）ナトリウムおよびカプリル
酸ナトリウム、並びに塩化ナトリウムを添加した。Boyerら（1946）は、昇温で
、カプリレートを含む種々の異なる脂肪酸塩の濃度を変えてアルブミンの混濁度
(turbidity)を調べた。カプリレートは、アルブミンの安定性に対して明らかな
効果を有し、混濁度は塩濃度に対するアルブミンの比率によって最も影響された
。これらの研究において使用されたカプリレートの濃度は、８ｍＭもの低濃度か
ら最大１５０ｍＭまでの範囲であった。YuおよびFinlayson（1984）の行った研
究は、５％w/vアルブミン溶液中の４ｍＭのカプリレートが低温殺菌中のアルブ
ミンの凝集を最小限にするために特に効果的であったことを示すこの初期の研究
を裏付けた。
不飽和アルコールおよびモノグリセリド、およびこれらの殺ウイルス能に関す
る初期の研究（Snipesら、1977、JordanおよびSeet、1978）の後、Sandsら（197
9）は脂肪酸誘導体の殺ウイルス能を探求した。これらの研究は、水性媒体中に
おけるバクテリオファージの不活性化に焦点をあてたものであり、抗ウイルス効
果を決定する上で、アルキル鎖の長さ（１２から１４）および不飽和度および不
飽和による幾何学形状が重要なパラメーターであることを示した。脂肪酸（モノ
ー不飽和）の殺ウイルス能は、Horowitzら（1989）によって更に調べられ、彼ら
は第VIII因子溶液中のシンドビスウイルスおよび水痘性口内炎ウイルス（ＶＳＶ
）の不活性化を証明した。これらの研究において、殺ウイルス能は、脂肪酸濃度
（0.3％まで）および酸の鎖長に依存し、ほとんどの場合、鎖長１６を越えると4
log10TCID50のlog減少係数が達成された。アルブミン、IgGおよびある種の凝固
因子に接種（spike）されたVSVを使用して、オレイン酸ナトリウム活性が詳細に
研究された。IgGおよび凝固因子においては１時間以内に完全な不活性化が証明
されたが、アルブミンと血漿ではウイルスが若干保護された。３７℃まで昇温し
、低濃度のタンパク質（1.5mg／mL）を使用すると、ウイルスの不活性化の程度
が増加した。
SengおよびLundblad（1990）は、目的のタンパク質が安定なｐＨにおける、非
沈殿条件下でのカプリル酸の使用を記載した。この研究の前提は、非イオン化形
態の脂肪酸であるカプリル酸はウイルスの脂質エンベロープまたはウイルス中に
包埋されたタンパク質と相互作用し、これによって回復不能な障害を引き起こす
ということであった。溶液中で形成される酸の量は、ｐＨを低くすることおよび
／または添加するカプリレートの量を増加させることによって操作される。典型
的には、カプリレートを添加して0.002から0.07％w/wの範囲の酸濃度を達成させ
る。ウイルスの不活性化に対する温度の影響は、これらの研究においては検討さ
れなかった。0.07％を越えるカプリル酸の濃度は、溶解点を越えるものと考えら
れ、溶液からタンパク質を沈殿させるために使用されてきた（SteinbuchおよびA
udran、1969、Pejaudierら、1972、Habeeb、1984）。発明の概要
本発明者等は、溶解度レベルを越える濃度の（エマルジョンとして存在する）
カプリル酸が、選択されたｐＨおよび温度範囲内で包膜ウイルスの不活性化にお
いて有利な結果を達成できることを見いだした。
従って、本発明は治療用タンパク質の溶液中の脂質包膜ウイルスを不活性化す
る方法にあり、該方法は少なくとも約６ｍＭの濃度のカプリレートと共に、約4.
０から約6.0の範囲のｐＨで１５℃より高い温度で上記溶液をインキュベーショ
ンすることを含み、ｐＨおよびカプリレート濃度はカプリル酸濃度が0.07％w/w
より高くなるように選択される。
本発明の好ましい実施形態において、インキュベーション温度は１５℃から約
４５℃であり、好ましくは約２５℃から約４５℃である。
本発明の更に好ましい実施形態において、カプリレート濃度は約６ｍＭから約
１００ｍＭの範囲内である。
本発明の更に他の好ましい実施形態において、溶液のｐＨは約ｐＨ４から約ｐ
Ｈ６の範囲内である。
本発明の方法は、広範囲の治療用タンパク質の任意のものと共に使用すること
ができ、特にアルブミンに適用可能である。
本発明の特に好ましい実施形態において、本方法は１０％（w/w）アルブミン
、１６ｍＭカプリレートを含有する溶液を、ｐＨ4.5において４５℃でインキュ
ベ
ートすることを含む。
本発明の他の好ましい実施形態において、本方法は２０−２５％（w/w）アル
ブミン、３０−４０ｍＭカプリレートを含有する溶液を、約ｐＨ5.2において４
５℃でインキュベートすることを含む。
更なる態様において、本発明は、本発明の第一の態様の方法に従って調製され
た治療用タンパク質の溶液にある。
本発明はまた、治療用タンパク質が本発明の第一の態様の方法に従って処理さ
れた、治療用タンパク質を含有する組成物にある。
本明細書全体を通して、文意から他の意味が要求されていない限り、用語「含
有する（comprise）」、または「含有する（comprises）」若しくは「含有して
いる（comprising）」などの変形は、言及された１つの要素若しくは整数または
要素若しくは整数のグループを包含することを意味するが、いかなる他の要素若
しくは整数または要素若しくは整数のグループの除外を意味するものではないと
理解されるだろう。発明の詳細な説明
本発明の性質を明確に理解できるように、以下の実施例および図面を参照しな
がらその好ましい実施形態を以下に説明する。図面の簡単な説明
図１：アルブミン中のシンドビスウイルスの不活性化に対するｐＨおよびカプ
リレートの影響（●−８ｍＭカプリレート、ｐＨ６−７、１５℃；○−３２ｍＭ
カプリレート、ｐＨ６−７、１５℃；▼−３２ｍＭカプリレート、ｐＨ4.5、４
５℃；▽−８ｍＭカプリレート、ｐＨ4.5、４５℃；■−３２ｍＭカプリレート
、ｐＨ６−７、４５℃）
図２：アルブミン中においてカプリレートと共にインキュベーションした結果
としてのＢＶＤＶの不活性化（●−pH4.5、カプリレートあり、３０℃；○−7.0
、カプリレートあり、３０℃；▼−ｐＨ4.5、カプリレートなし、３０℃；▽−
ｐＨ7.0、カプリレートなし、３０℃；■−ｐＨ4.5、カプリレートあり、０℃；
□−ｐＨ7.0、カプリレートあり、０℃；◆−ｐＨ4.5、カプリレートなし、０℃
：◇−ｐＨ7.0、カプリレートなし、０℃）
図３：種々の温度で１４ｍＭカプリレートで処理したアルブミン中のウシウイ
ルス性下痢ウイルスの不活性化（●−2-8℃：○−２５℃；▼−３０℃；▽−４
０℃：■−４０℃：□−４５℃）
図４：種々の濃度のカプリレートで処理したアルブミン中のシンドビスウイル
スの不活性化（●−３ｍＭカプリレート；○−８ｍＭカプリレート；▼−１６ｍ
Ｍカプリレート；▽−２６ｍＭカプリレート）
図５：１２ｍＭカプリレートの存在下におけるＨＡＶの不活性化実施例１：
それぞれ８ｍＭおよび３２ｍＭのカプリレートを含有する５％w/vおよび２０
％w/vのアルブミン調製物の溶液を0.5ＭのHClでｐＨ4.5に調整した。５％および
２０％の対照サンプルをとり、カプリレート単独の影響および低ｐＨのウイルス
撲滅に対する影響を判断した。溶液を、１５℃および４５℃で、最大２４時間イ
ンキュベートした。溶液に最初にシンドビスウイルス（MRM３９株）を加え（spi
ke）、時間０、１２時間後および最後に２４時間後にサンプルをとり、ウイルス
カ価をアッセイした。ウイルス不活性化の速度論（kinetics）を図１に示す。
図１は、シンドビスウイルスが（ｉ）カプリレート不添加ではｐＨ4.5におい
て、 （ｉｉ）カプリレート存在下では１５℃において、不活性化されなかった
ことを示す。ひとたびカプリレートが添加され、温度を４５℃に上げると、５lo
gより大きくウイルスが不活性化された。不活性化の速度論は、ｐＨ6.0と比較し
てより低いｐＨ4.5で、かつ最も高い３２ｍＭのカプリレート濃度において増大
した（ウイルスを最も迅速に殺した）。実施例２：
高力価のウシウイルス性下痢症ウイルス、ＢＶＤＶをおよそ１０％w/wのアル
ブミン濃縮物中に加えた。カプリレート（１６ｍＭ）と共に、またはカプリレー
トなしでｐＨ4.5で３０℃または０℃においてインキュベーションした。図２に
、低ｐＨにおけるカプリレートの存在および温度の上昇がこの包膜ウイルスを不
活性化するために重要であることを示す。カプリレートの存在または不存在下に
お
いて０℃でインキュベーションしてもこのウイルスを不活性化しなかった。実施例３：
およそ１４ｍＭのカプリレートを含有するアルブミン（１０％w/v）を、0.5Ｍ
のHClでｐＨ4.5に調整した。ウシウイルス性下痢症ウイルス、BVDV（NADL、株、
ATCC）をアルブミンに加え、次いでサンプルを２５から４５℃の範囲の温度でイ
ンキュベートした。対照サンプルは2-8℃に維持した。それぞれの温度でインキ
ュベーションした後のそれぞれのアルブミンサンプルの混濁度を測定してアルブ
ミンの安定性を評価した。凝集物の量もHPLCによって測定した。この実験の結果
を図３および表１に示す。BVDVの不活性化速度に対して温度の顕著な影響があり
、３５℃以上の温度では、ほとんど瞬間的な不活性化（＜0.5時間）が見られた
。凝集物の量は、３５℃までは安定にみえるが、この温度を超えると増加した。
混濁度は、温度の増加に伴って増加する傾向を示した。これらの双方の結果は、
より高温において安定化が始まるが、３５℃未満ではこれらのパラメーターの変
化は重要ではないことを表している。
実施例４：
アルブミン（５％、１０％および２０％w/v）のサンプルをｐＨ4.4に調整し、
カプリレートを添加して３ｍＭ（２０％）から２６ｍＭの範囲のカプリレート濃
度とした。サンプルにシンドビスウイルス（ＭＲＭ３９株）を加え、３０℃でイ
ンキュベートした。１０時間までの数回の時点でサンプルをとり、シンドビスウ
イルスの力価をアッセイした。この実験の速度論を図４に示す。
カプリレート濃度が増加すると共にシンドビスウイルスの不活性化の速度およ
び程度が上昇するという有意な傾向があり、３ｍＭでは有意な死滅は見られず、
１６ｍＭ以上では力価の４logを越える減少が見られ、これらは１時間以内に生
じた。実施例５：
アルブミンのサンプルをｐＨ4.5に調整し、カプリレートを添加して最終濃度
１２ｍＭとした。
サンプルにＡ型肝炎ウイルス、ＨＡＶ（ＨＭ１７５Ａ．２株）を加え、４５℃
でインキュベートした。１０時間および２４時間後にサンプルをとり、ＨＡＶ力
価をアッセイした。この実験の結果を図５に示す。２４時間後にウイルスの1log
のみが不活性化され、この不活性化技術が主として包膜ウイルスを標的とする証
拠が得られた。
当業者に認識されるように、本発明は以前には実行可能でかつ殺ウイルス性と
考えられていなかったアルブミン溶液中のウイルスの不活性化のための条件を開
示するものである。本発明者らが開発した条件は、ｐＨ4.5において0.1から0.50
％の範囲のカプリル酸濃度を与えるおよそ7.2ｍＭから４０ｍＭの濃度のカプリ
レートを含み、SengおよびLundbladの使用した0.07％よりかなり上まわる。包膜
ウイルスを不活性化するためのカプリレートの使用もまた、本研究において、１
５℃においてはアルブミン溶液中におけるシンドビスの有意な不活性化は見られ
ないが、４５℃では同じ濃度のカプリル酸および同じｐＨで４log減少係数が達
成され、温度依存性であることが見いだされた。同様のパターンの温度依存性が
アルブミン溶液中に加えられたウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）で見
られた。
広く記載された本発明の精神または範囲から離れることなく、特定の実施形態
で示した本発明に対し、多くの変化および／または修飾を行っても良いことは当
業者には理解されるだろう。従って、本発明の実施形態は、全ての点において説
明的なものであって制限的なものではないと考えるべきものである。 BACKGROUND OF THE INVENTION Field of the Invention The incubation inactivation invention of the virus due to the caprylate relates to a method for the inactivation of enveloped (enveloped) virus in a solution of a therapeutic protein. BACKGROUND OF THE INVENTION Several studies have demonstrated that Cohn fractionation has traditionally been used in the production of albumin and IgG products, and this has been linked to some extent to virus inactivation or clearance (Wells et al.). (1986), Yei et al. (1992), Uemura et al. (1994) and Johnston (1996)). In the production of albumin, pasteurization (heating of the liquid at 60 ° C.) was included to ensure the safety of the virus by inactivating hepatitis virus and HIV. As chromatographic techniques became more popular and moved away from the Cohn fractionation method (Stoltz, 1993, Yap et al., 1993, Veron et al., 1993), a second virus inactivation step was introduced following the pasteurization step, A need has arisen to ensure the same safety as Cohn fractionated albumin products. At present, there are only a few deactivation / clearance techniques available that can be implemented. Virus filtration separates the virus from proteins based on molecular size, thus allowing the removal of hepatitis A virus and parvovirus from smaller molecular weight proteins. However, large molecular weight proteins (eg, IgG and Factor VIII) are limited to filtration through filters with large pore sizes and small viruses are not removed. The use of solvents and membrane disruptors such as surfactants requires further processing (such as chromatography steps) to remove toxic substances (Horowitz et al., 1984). The invention disclosed herein uses the use of caprylate, a fatty acid currently contained in albumin solutions as part of a formulation and which has been shown in the present invention to have virucidal activity at low pH and elevated temperatures. Describe. Albumin pasteurization was first introduced as early as 1948, primarily for the inactivation of hepatitis virus transmitted via intravenous administration of albumin. Hink and co-workers (1957) added the fatty acids sodium acetyltryphophante and sodium caprylate, as well as sodium chloride, to confer stability on the albumin molecule. (1946) examined the turbidity of albumin at elevated temperatures with varying concentrations of various fatty acid salts, including caprylate. Caprylate had a clear effect on albumin stability, with turbidity being most affected by the ratio of albumin to salt concentration. The caprylate concentrations used in these studies ranged from as low as 8 mM up to 150 mM. A study performed by Yu and Finlayson (1984) showed that 4 mM caprylate in a 5% w / v albumin solution was particularly effective in minimizing albumin aggregation during pasteurization. Supports early studies. After early studies on unsaturated alcohols and monoglycerides, and their virucidal potential (Snipes et al., 1977, Jordan and Seet, 1978), Sands et al. (1979) explored the virucidal potential of fatty acid derivatives. These studies have focused on the inactivation of bacteriophages in aqueous media, and in determining the antiviral effect, the length of the alkyl chain (12 to 14) and the degree of unsaturation and unsaturation It is shown that the geometric shape according to is an important parameter. The virucidal potential of fatty acids (mono-unsaturated) was further examined by Horowitz et al. (1989), who demonstrated inactivation of Sindbis virus and varicella stomatitis virus (VSV) in factor VIII solution. In these studies, virucidal capacity was dependent on fatty acid concentration (up to 0.3%) and acid chain length, and in most cases a log reduction factor of 4 log 10 TCID 50 was achieved above chain length 16. Sodium oleate activity was studied in detail using VSV inoculated with albumin, IgG and certain clotting factors. Complete inactivation was demonstrated within one hour for IgG and clotting factors, while albumin and plasma provided some protection for the virus. Heating to 37 ° C. and using low concentrations of protein (1.5 mg / mL) increased the degree of virus inactivation. Seng and Lundblad (1990) described the use of caprylic acid under non-precipitating conditions at a pH at which the protein of interest is stable. The premise of this work was that caprylic acid, a non-ionized form of the fatty acid, interacts with the lipid envelope of the virus or proteins embedded in the virus, thereby causing irreparable damage. The amount of acid formed in the solution is manipulated by lowering the pH and / or increasing the amount of caprylate added. Typically, caprylate is added to achieve an acid concentration ranging from 0.002 to 0.07% w / w. The effect of temperature on virus inactivation was not considered in these studies. Caprylic acid concentrations above 0.07% were considered to be above the melting point and have been used to precipitate proteins from solution (Steinbuch and Audran, 1969, Pejaudier et al., 1972, Habeeb, 1984). SUMMARY OF THE INVENTION The present inventors have found that caprylic acid (present as an emulsion) at a concentration above the solubility level can achieve advantageous results in inactivating enveloped viruses within a selected pH and temperature range. Was. Accordingly, the invention is a method of inactivating a lipid enveloped virus in a solution of a therapeutic protein, the method comprising at least a concentration of about 6 mM caprylate at a pH in the range of about 4.0 to about 6.0. Including incubating the solution at a temperature above 15 ° C., the pH and caprylate concentration are selected such that the caprylic acid concentration is above 0.07% w / w. In a preferred embodiment of the present invention, the incubation temperature is from 15 ° C to about 45 ° C, preferably from about 25 ° C to about 45 ° C. In a further preferred embodiment of the invention, the caprylate concentration is in the range from about 6 mM to about 100 mM. In yet another preferred embodiment of the invention, the pH of the solution is in the range from about pH 4 to about pH6. The method of the present invention can be used with any of a wide variety of therapeutic proteins, and is particularly applicable to albumin. In a particularly preferred embodiment of the invention, the method comprises incubating a solution containing 10% (w / w) albumin, 16 mM caprylate at 45 ° C. at pH 4.5. In another preferred embodiment of the invention, the method comprises incubating a solution containing 20-25% (w / w) albumin, 30-40 mM caprylate at 45 ° C. at about pH 5.2. In a further aspect, the invention resides in a solution of a therapeutic protein prepared according to the method of the first aspect of the invention. The invention also resides in a composition comprising a therapeutic protein, wherein the therapeutic protein has been treated according to the method of the first aspect of the invention. Throughout this specification the term "comprise" or variations such as "comprises" or "comprising" are used unless the meaning in the text requires otherwise. Will be understood to mean encompassing one element or integer or group of elements or integers referred to, but not excluding any other element or integer or group of elements or integers . DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION For a clear understanding of the nature of the present invention, preferred embodiments thereof will be described below with reference to the following examples and drawings. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1: Effect of pH and caprylate on the inactivation of Sindbis virus in albumin (● -8 mM caprylate, pH 6-7, 15 ° C .; ○ -32 mM caprylate, pH 6-7, 15 (° C; ▼ -32 mM caprylate, pH4.5, 45 ° C; ▽ -8 mM caprylate, pH4.5, 45 ° C; ■ -32 mM caprylate, pH6-7, 45 ° C) Figure 2: Caprylate in albumin Inactivation of BVDV as a result of incubation with (● -pH 4.5, with caprylate, 30 ° C .; ○ -7.0, with caprylate, 30 ° C .; ▼ -pH 4.5, without caprylate, 30 ° C .; Δ -PH7.0, without caprylate, 30 ° C; ■ -pH4.5, with caprylate, 0 ° C; □ -pH7.0, with caprylate, 0 ° C; ◆ -pH4.5, caprylate , 0 ° C .: Δ-pH 7.0, without caprylate, 0 ° C.) FIG. 3: Inactivation of bovine viral diarrhea virus in albumin treated with 14 mM caprylate at various temperatures (● −2-8 ° C .: ○ -25 ° C; ▼ -30 ° C; ▽ 40 ° C: ■ -40 ° C: □ -45 ° C) Figure 4: Inactivation of Sindbis virus in albumin treated with various concentrations of caprylate (● -3 mM caprylate; o-8 mM caprylate; ▼ -16 mM caprylate; Δ-26 mM caprylate) Figure 5: Inactivation of HAV in the presence of 12 mM caprylate Example 1: 8 mM and 32 mM caprylate respectively A solution of the 5% w / v and 20% w / v albumin preparations containing was adjusted to pH 4.5 with 0.5M HCl. 5% and 20% control samples were taken to determine the effect of caprylate alone and the effect on low pH virus eradication. The solution was incubated at 15 ° C and 45 ° C for up to 24 hours. Sindbis virus (strain MRM39) was first added (spike) to the solution, samples were taken at time 0, 12 hours and finally 24 hours and assayed for virus titer. The kinetics of virus inactivation is shown in FIG. FIG. 1 shows that Sindbis virus was not inactivated at (i) pH 4.5 without caprylate and (ii) at 15 ° C. in the presence of caprylate. Once caprylate was added and the temperature was raised to 45 ° C, the virus was inactivated by more than 5 log. The kinetics of inactivation increased at the lower pH 4.5 compared to pH 6.0 and at the highest 32 mM caprylate concentration (killed the virus most quickly). Example 2: A high titer of bovine viral diarrhea virus, BVDV, was added in approximately 10% w / w albumin concentrate. Incubation at 30 ° C. or 0 ° C. with or without caprylate (16 mM) at pH 4.5. FIG. 2 shows that the presence of caprylate at low pH and increased temperature are important for inactivating this enveloped virus. Incubation at 0 ° C. in the presence or absence of caprylate did not inactivate the virus. Example 3 Albumin (10% w / v) containing approximately 14 mM caprylate was adjusted to pH 4.5 with 0.5 M HCl. Bovine viral diarrhea virus, BVDV (NADL, strain, ATCC) was added to albumin, and samples were then incubated at a temperature ranging from 25 to 45 ° C. Control samples were maintained at 2-8 ° C. The stability of the albumin was evaluated by measuring the turbidity of each albumin sample after incubation at each temperature. The amount of aggregates was also measured by HPLC. The results of this experiment are shown in FIG. There was a significant effect of temperature on the inactivation rate of BVDV, with temperatures above 35 ° C. showing almost instantaneous inactivation (<0.5 h). The amount of aggregates appeared stable up to 35 ° C., but increased above this temperature. The turbidity tended to increase with increasing temperature. Both of these results indicate that at higher temperatures, stabilization begins, but below 35 ° C., changes in these parameters are not significant. Example 4: Samples of albumin (5%, 10% and 20% w / v) were adjusted to pH 4.4 and caprylate was added to give caprylate concentrations ranging from 3 mM (20%) to 26 mM. Sindbis virus (MRM39 strain) was added to the sample and incubated at 30 ° C. Samples were taken at several time points up to 10 hours and assayed for Sindbis virus titer. The kinetics of this experiment is shown in FIG. There is a significant tendency for the rate and extent of inactivation of Sindbis virus to increase with increasing caprylate concentration, with no significant killing at 3 mM and a decrease in titer of more than 4 logs above 16 mM. These occurred within one hour. Example 5: A sample of albumin was adjusted to pH 4.5 and caprylate was added to a final concentration of 12 mM. Hepatitis A virus, HAV (HM175A.2 strain) was added to the sample and incubated at 45 ° C. Samples were taken after 10 and 24 hours and assayed for HAV titer. The result of this experiment is shown in FIG. After 24 hours, only one log of the virus was inactivated, providing evidence that this inactivation technique targets primarily enveloped viruses. As will be appreciated by those skilled in the art, the present invention discloses conditions for inactivation of virus in albumin solutions that were not previously considered viable and virucidal. The conditions developed by the inventors include caprylate at a concentration of approximately 7.2 mM to 40 mM, giving caprylic acid concentrations at pH 4.5 ranging from 0.1 to 0.50%, well above the 0.07% used by Seng and Lundblad. Go around. The use of caprylate to inactivate enveloped viruses was also observed in this study at 15 ° C without significant inactivation of Sindbis in albumin solution, but at 45 ° C at the same concentration of capryl. A 4 log reduction factor was achieved at the acid and the same pH and was found to be temperature dependent. A similar pattern of temperature dependence was seen with bovine viral diarrhea virus (BVDV) added in albumin solution. It will be understood by those skilled in the art that many changes and / or modifications may be made to the invention as set forth in particular embodiments without departing from the spirit or scope of the broadly described invention. . Accordingly, the embodiments of the present invention are to be considered in all respects as illustrative and not restrictive.
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項
【提出日】平成１０年８月３日（１９９８．８．３）
【補正内容】
請求の範囲
１．少なくとも約６ｍＭの濃度のカプリレートと共に約4.0から約6.0の範囲のｐ
Ｈで１５℃より高い温度でアルブミン溶液をインキュベートすることを含み、ｐ
Ｈおよびカプリレート濃度はカプリル酸濃度が0.07％w/wより高くなるように選
択される、アルブミン溶液中の脂質包膜ウイルスの不活性化方法。
２．インキュベーション温度が１５℃から約４５℃である、請求項１に記載の方
法。
３．インキュベーション温度が約２５℃から約４５℃である、請求項２に記載の
方法。
４．カプリレートの濃度が約６ｍＭから約１００ｍＭの範囲である、請求項１か
ら３のいずれか１項に記載の方法。
５．溶液のｐＨが約ｐＨ４から約ｐＨ６の範囲である、請求項１から４のいずれ
か１項に記載の方法。
６．１０％（w/w）アルブミン、１６ｍＭカプリレートを含有するｐＨが約4.5の
溶液を４５℃でインキュベートすることを含む、請求項１から５のいずれか１項
に記載の方法。
７．２０−２５％（w/w）アルブミン、３０−４０ｍＭカプリレートを含有する
ｐＨが約5.2の溶液を４５℃でインキュベートすることを含む、請求項１から５
のいずれか１項に記載の方法。
８．請求項１から７のいずれか１項に記載の方法に従って処理されたアルブミン
を含む組成物。[Procedure of Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Date of Submission] August 3, 1998 (1998.8.3) [Details of Amendment] Claims 1. Incubating the albumin solution at a temperature greater than 15 ° C. with a pH in the range of about 4.0 to about 6.0 with caprylate at a concentration of at least about 6 mM, wherein the pH and caprylate concentrations are 0.07% w / w caprylate. A method for inactivating a lipid enveloped virus in an albumin solution, selected to be higher than w. 2. 2. The method of claim 1, wherein the incubation temperature is between 15C and about 45C. 3. 3. The method of claim 2, wherein the incubation temperature is from about 25C to about 45C. 4. 4. The method of any one of claims 1 to 3, wherein the concentration of caprylate ranges from about 6 mM to about 100 mM. 5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the pH of the solution ranges from about pH 4 to about pH 6. 6. The method according to any one of the preceding claims, comprising incubating a solution containing 10% (w / w) albumin, 16 mM caprylate at a pH of about 4.5 at 45 ° C. 7. The method according to any one of claims 1 to 5, comprising incubating a solution having a pH of about 5.2 containing 20-25% (w / w) albumin, 30-40 mM caprylate at 45 ° C. Method. 8. A composition comprising albumin processed according to the method of any one of claims 1 to 7.
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(72)発明者 バートリーニ，ジョセフ
オーストラリア国 3147 ヴィクトリア
州，アッシュバートン，ラエ コート ４
(72)発明者 ジョンストーン，デイビッド
オーストラリア国 3337 ヴィクトリア
州，ウェスト メルトン，フリートウッド
サーキット 17────────────────────────────────────────────────── ───
Continuation of front page
(72) Inventor Batorini, Joseph
Australia 3147 Victoria
Ashburton, Lae Court 4
(72) Inventor John Stone, David
Australia 3337 Victoria
Fleetwood, West Melton State
Circuit 17