【発明の詳細な説明】
発明の名称
ブチロフィリン遺伝子プロモータおよびその利用
発明の属する分野
本発明は、一般にブチロフィリン遺伝子プロモータに関する。より詳細には、
本発明は遺伝子組替え動物の乳による非同族タンパク質の生産および発ガン性物
質を検出するためのブチロフィリン遺伝子プロモータの利用法に関する。これに
よって、出願人はアメリカ合衆国シリアルNO.60/022、563の論文の
内容を引用して組込んだ。
発明の背景技術
ブチロフィリンは多くの種類の乳中で脂肪−小球膜(FGM)を結合させ乳分
泌機構の役割を演じると思われる重要な必須タンパク質である。Franke et al.,
J.Cell Biol.89:485-494(1981);Jack and Mather,J.Biol.Chem.265:14481
-14486(1990);およびJack and Mather,J.Dairy Sci.76:3832-3850(1993);を見
ると、それらそれそれの文章中において引用して組込まれている。乳房上皮細胞
の頂点表面でにじみ出されるブチロフィリンは、グリコシル化されたエキソプラ
スミックドメイン、配列のおおよそ中間のメンブレンアンカー、および長い細胞
質尾部を含むI型の糖タンパクである。
ブチロフィリンは、エキソプラスミックドメインのB7.1(CD80)およ
びB7.2(CD86)受容体(Linsley et al.,Protein Sci.3:1341-1343(1994
))と同属の細密構造を持つ免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)(Gar
dinier et al.,J.Neurosci.Res.33,177-187(1992))の1つである。それら
のタンパク質の特徴は、2つのエキソプラスミック免疫グロブリン様ドメインで
ある;N−末端近傍の可変物質(V)型または中間生成物(I)型の1つである
(Williams and Barclay,Ann.Rev.Immunol.6,381-405(1988);Harpaz and Ch
othia,J.Mol.Biol.238,528-539(1994));メンブレンアンカー近傍の定常
物質(C)型の1つである(Williams and Barclay,1988)。エキソプラスミック
ドメイン中でブチロフィリンと同族の他のタンパク質は、髄鞘の構成要素である
(Gardinier et al.,1992)ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク(MOG)、およびト
リ主要組織適合性複合体(Miller et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8
8:4377-4381)と結合しているチキンB−G抗原(Gardinier et al.,1992;Mill
er et al.,1991)を含んでいる。IgSFおよびB−G抗原システムにおける
ブチロフィリン含有物は、ブチロフィリンが免疫効果を有していることを暗示し
ている。
ブチロフィリンのC末端細胞質ドメインは、Znフィンガーおよびコイルドコ
イルドメインに含まれるタンパク質の集合におけるC末端に類似している。これ
らのタンパク質は核酸あるいはタンパク質と結びつき(Bellini et al.,J.Cel
l Biol.131:563-570(1995))、retフィンガータンパク質(RFP)(Takahas
hi et al.,J.Cell Biol.8:1853-1856(1998))、シューグレン症候群の核抗原
A(SSA/Ro)(Chan et al.,J.Clin.Invest.87:68-76(1991))、アフリ
カツノガエル核要素7(XNF7)(Reddy et al.,Develop.Biol.148:107-11
6(1991))、Pleurodeles waltl起源のPwA33(Bellini et al.,EMBO J.12:1
07-114(1993))、および酸フィンガータンパク質(AFP)(Chu et al..,Genomic
s 29:229-239(1995))を含んでいる。DNAレベルでは、この同族領域はMOG
、RFPおよびブチロフィリン遺伝子と一緒に染色体6のヒトMHCクラスI領
域に位置するB30.2といわれるエクソンに包み込まれている(Vernet et al.
,J.Mol.Evol.37:600-612(1993))。上記の知識に基づいてVernet et al.(19
93)は、ブチロフィリン遺伝子はブチロフィリンにおけるエクソンのIセット免
疫グロブリン様ドメインのエンコードによって生じた祖先のMOG遺伝子と、ブ
チロフィリン遺伝子のB30.2領域で生じた祖先のRFP遺伝子とのエクソン
の混合によってMHCに進化したと提唱している。
ブチロフィリンは、授乳期間中に最大の状態として乳房の組織にはっきりと現
れる。このブチロフィリン遺伝子の乳房特性の発現は、ブチロフィリンプロモー
タの支配下にあると考えられる。ブチロフィリンは多くの種において乳FGMと
結合している総タンパク質中の重要なタンパク質を構成している、例えば牛科の
乳において総FGM結合タンパク質の40%以上であるので、ブチロフィリンプロ
モータは遺伝子組替え哺乳類の乳における同族タンパク質を生み出すための乳房
特有のプロモータとしての魅力がある。
他の乳房特性遺伝子のプロモータ、例えばカゼイン、清酸タンパク質、α−ラ
クトアルブミン、およびβ−ラクトグロブリン遺伝子は、遺伝子組替え動物の乳
において無関係のタンパク質を製造するために直接利用されている。乳房特性の
遺伝子プロモータにおける最近の分析は、乳腺刺激性の反応を多くの潜在的に重
要な調整要素と同一なものへ導いている。それらの要素は以下のための結合部位
を含んでいる;β−ラクトグロブリンにおけるCTF/NF1(Watson et al.,
Nucl.AcidsRes.19:6603-6610(1991))と清酸タンパク質遺伝子(Li and Rosen,
Mol.Cell Biol.15:2063-2070(1995));牛αS2−カゼイン遺伝子中のOct1(
Groenen et al.,Nuc.Acids Res.20:4311-4318(1992));消極的にβ−カゼイ
ン遺伝子を調整する1本鎖核酸結合タンパク質(Altiok and Groner,Mol>Cell B
iol.14:6004-6012(1994));Ets−同族タンパク質の刺激(Welte et al.,Eur
.J.Biochem.223:997-1006(1994))および消極的に調整する非同一化される要
素、清酸タンパク質遺伝子(Kolb et al.,J.Cellul.Biochem.56:245-261(199
4))、ならびにねずみβ−カゼイン遺伝子のプロゲステロン−中間体抑制を調整
する妊娠期間特有タンパク質(Lee and Oka,J.Biol.Chem.267:5797-5801(199
2))。げっ歯類β−カゼイン遺伝子プロモータの最も徹底的な研究を含むいくつ
かの遺伝子は、C/EBP(Doppler et al.,J.Biol.Chem.270:17962-17969(
1995))、YYI(Meier and Groner,Mol.Cell Biol.14:128-137(1994);Raught
et al.,Mol.Cell Biol.14:1752-1763(1994))、MGF/STAT5(Watson
et al.,Nucl.Acids Res.19:6603-6610(1991);Groenen et al.,1992;Wakao et
al.,EMBO J.13:2182-2191(1994))および糖質コルチコイド応答要素(Raught e
t al.,1995)を含んでいる。加えて、細胞の生存に基本的に必要なプロモータ遺
伝子であるβ1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼは、AP−2およびCTF
/NF1の乳房特性3.9kb転写物の合成を調整するための結合部位を含んで
いる(Rajput et al.,J.Biol.Chem.271:5131-5142(1996))。
乳房特性発現の土台は、十分に理解されていないいくつかのシステムである。
第1にいくつかの部位においてα−ラクトアルブミン遺伝子プロモータ基部にお
ける同一化が起こる「ミルクボックス」そういわれる配列は、カゼイン遺伝子(L
aird et al.Biochem.J.254:85-94(1988))の多くにおいても保護され、YY
1、STAT5(Meier and Groner,1994;Raught et al.,1994)およびC/E
BPアイソフォーム(Doppler et al.,1995;Raught et al.,1995)のための結合
部位を包み込む。また、ブロックA、BそしてCに関連しているカゼイン遺伝子
においても3つの保護配列がある(Yoshimura,M.and Oka,T.,Gene 78,267-27
5)。Raught et al.(1995)は、カゼイン遺伝子の発現はSTAT5およびグルコ
コルチコイド応答要素ならびにC/EBP結合部位を含む各種の要素からなる応
答要素(CoREs)により制御されることを最近提案した。
最初に、発明者はプロモータ領域を含みプロモータ配列がそれら他の乳房特性
プロモータの公知の配列とのかなりの類似性を有しないことを発見し、ねずみブ
チロフィリンを無性生殖させ、配列した。
ブチロフィリンプロモータの分析は、ブチロフィリンプロモータがα−および
β−インターフェロン応答要素を含む免疫システム遺伝子と結合された多くの潜
在能力のある調整要素を含み、TCF−1およびPU.1と配列が同一である(
PU.1はマクロファージであり、ets発ガン遺伝子に関連するB細胞特性転
写因子である。Klemsz et al.,Cell 61:113-125(1990)を見よ。)。加えて発明
者は、ブチロフィリンプロモータの基部に近い領域は、同じ前後関係でT細胞内
でマクロファージ顆粒球コロニー刺激因子部位の分裂促進因子の発現を調整する
ことを示すGMCSFの反復要素を3つ含むことを見出した。それゆえ、ブチロ
フィリンプロモータは、発ガン物質の検出にもまた有用である。
発明の開示
本発明は、5’フランキング領域の配列およびねずみブチロフィリン遺伝子(
Btn)の転写性ユニットを提供する。特に、本発明はBtnプロモータおよび
その中に含まれる転写性調整要素を提供する。
したがって、発明の目的は生物学的活性を有するポリペプチドをエンコードす
る1つのDNA配列を構成するDNA断片の分離と精製である。
発明の他の目的は、ブチロフィリンプロモータの生物学的活性を有する1つの
DNA配列を構成するDNA断片の分離と精製である。
本発明の補足的な目的は、哺乳類の乳腺におけるポリペプチドを表現するため
のrDNAの構築である。rDNA構造は、所望のポリペプチドを記号化するD
NA配列に影響するようにリンクしているブチロフィリンプロモータを含んでい
る。またrDNA構造は、DNAポリペプチドを記号化するDNA配列と影響す
るようにリンクしている信号配列を記号化するDNA配列を有している。むしろ
、その信号配列は、乳タンパク信号配列である。DNA構造は、転写単位および
/またはブチロフィリン遺伝子中の3’フランキング配列もまた含んでいる。
本発明のさらなる目的は、乳腺で所望のポリペプチドを製造する遺伝子組替え
動物の提供である。これは、哺乳動物の乳房上皮細胞においてポリペプチドを記
号化するDNA配列に影響するようにリンクしているブチロフィリンプロモータ
を含むrDNA構造を取り入れることにより達成される。rDNA構造が哺乳動
物の生殖系列に組み込まれる、上記のように後に続く世代も乳中に所望のポリペ
プチドを生成することは選択できる。
本発明の他の側面は、種々の原因による発ガン能力を有する物質の分裂促進特
性を検出するためのブチロフィリンプロモータ中の分裂促進因子の利用である。
例えば、周囲の環境から発見や食料源から分離された物質は発癌性の高さのため
に試験された。物質の分裂促進特性は、物質にさらされた細胞中でのブチロフィ
リンプロモータ活性のブチロフィリンmDNAや蛋白質の検出、もしくはブチロ
フィリンプロモータの制御下におけるレポーター遺伝子の生成の検出によって評
価される。
さらなる発明の目的は、ブチロフィリンの生成のための非乳分泌動物の哺乳ま
たは非哺乳組織のふるいわけによる乳ガンのような疾病状態の診断である。
図面の簡単な説明
図1Aは、ねずみブチロフィリン遺伝子および5’フランキング領域の配列を
発生させるために用いられるλBtn1から用意されるサブクローンの位置を示
すλBtn1クローンの概念図である。
図1Bは、エクソンおよびイントロンの位置を示すねずみBtn遺伝子構造の
概念図である。
図1Cは、ねずみブチロフィリンsCNAの配列に用いられるcDNAサブク
ローンの位置を示すねずみブチロフィリンcDNAの概念図である。
図2A〜Cは、ねずみブチロフィリン遺伝子の5’フランキング領域の基部近
傍において推定される規定要素の位置を示している。
発明を実施するための最良の形態
発明は、ねずみブチロフィリン遺伝子の配列、およびブチロフィリンプロモー
タとしても関連する5’フランキング領域におけるおおよその4.6kb配列を
提供している。これらの配列は、以下に記述されるねずみゲノムライブラリから
分離されるクローンにより得られる。実施例1:ねずみブチロフィリン遺伝子の無性生殖 (Stratagene,La Jolla,CA)におけるA129ES細胞ゲノムライブラリは、
記号化牛ブチロフィリンcDNAの2.3kb XhoI-XbaI断片によってふるいわ
けされた(Jack and Mather,1990)。プラークDNA(総計500,000pfu)は、ナ
イロン膜(Dupont,Boston,MA)に転移され、0.5NのNaOHで変性され、
膜は、前洗浄溶液(Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manua
l,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,(1989))中におい
て42℃で2時間、続いてプレハイブリダイゼーション溶液中において42℃で
6時間培養し、その後無作為付加方法(Feinberg and Vogelstein,Anal.Bioch
em.132:6-13(1983))により109cpm/μgの特異活性を[α−32P]−dC
TPにより標識化された牛ブチロフィリンcDNA断片とともにハイブリダイゼ
ーション溶液中において42℃で一晩培養された。フィルターは、2X SSC(Samb
rook et al.,1989)で簡単にゆすがれ、それから0.1%(w/v)のSDSを含む
55℃の2X SSCでそれぞれ20分間3回洗浄され、cDNAが結合された膜は8
0℃で一晩X線フィルムに露光され検出された。潜在的に陽性なあるプラークは
、総計
500,000pfuのふるいわけにより検出され、この無性生殖DNAはλBtn1と称
され、それはアメリカンタイプカルチャーコレクションにATCCデザイネーシ
ョン97513として預けられた。
λBtn1がねずみブチロフィリン遺伝子を含んでいることを確認するために
、無性生殖したDNA(λBtn1)、ねずみ、および牛ゲノムDNAのサンプル
はEcoR1またはHindIIIにより体系化され、プローブとして同族牛c
DNAの[32P]−標識化2.3kb XbaI断片を用いたサザンブロット法を条件
とした。それそれの場合、制限エンドヌクレアーゼとの温浸は、[32P]−標識化
プローブとのハイブリダイズDNA断片の特徴的なパターンをもたらした。放射
性物質標識化バンドの類似パターンは、ゲノムDNAおよびλBtn1サンプル
中に検出された(データは示していない)。λBtn1の配列が利用できるように
なると、ねずみcDNAプローブ、mcDNA3、エクソン7の第1の396b
pを通るエクソン3の3’端部の記号化(図1Cを見よ)はRT−PCRにより
作成される。上記に記載されこの同族cDNAを検出したそれらと類似のサザン
ブロット法は、λBtn1の同一性を裏付けた(データは示していない)。実施例2:ねずみブチロフィリン遺伝子配列
λBtn1DNAの14kbをこえる長さのサブコロニーは、作成され(図1
Aを見よ)、Promega Corp(Madison,WI)のfmol配列キットを用いて両要素で配
列された。放射線写真は分子力学コンピューティング写真濃度計で走査され、配
Sunnyvale,CA)を用いて読み取られた。コンピュータプログラムMACAW(S
chuler et al.,1991)は、配列決定ゲルから最大の長さの配列をコンパイルし
て使用され、配列はSEQ ID NO:1に示された。Btn配列のすべては、GenBankデ
ータベースにアソシエーションNo.U67065として預けられた。ブチロフィリンプ
ロモータはSEQ ID NO:1の最初の4,693ヌクレオチドが含まれていた。この領域の
基部(最初の1750ヌクレオチド)部分は、SEQ ID NO:2に示され、定型例え
ばここでは最も基部の転写開始部(下を見よ)は+1に示されているリナンバー
する形式のヌクレオチドとして図2に図示されている。実施例3:ねずみブチロフィリン遺伝子の形式
ねずみブチロフィリンmRNAの5’端部の位置。転写開始部配列5'-GGGCTCT
GTATTTCCCCTAC-3'(SEQ ID NO:3)を有する32P−標識化開始剤を用いる開始剤伸
長分析、および14日乳を分泌した乳房上皮総RNAによって識別した。この開
始剤伸長分析は、Roussel et al.(DNA Cell Biol.14:777-788(1995))から適用
され、ここでは参照文献を引用している。3つの主な標識化された生成物はこの
開始剤伸長分析試験によって得られ、Btnは図2の−83の位置に示されてい
るヌクレオチドTにおいて最も頻繁に用いられる部位、少なくとも−83、−1
8および+1(図2)(SEQ ID NO:1残基4611、4675、4694)の3つ
の部位から開始される。3つすべての転写開始部位は、通常のTATAAおよびCCAAT
ボックスのない遺伝子において転写の開始を成立させることができる開始要素5'
-YYA+1NWYY-3'(Javahery et al.,Mol.Cell Biol.14:116-127(1994)、参照文
献)の近傍あるいは前後関係の内側にある。−83および−19のこれら2つの
部位は一致する配列からそれぞれ1つおよび3つのミスマッチを含み、−83の
部位はよりありふれたA+1開始部位に沿った2つのヌクレオチドある。逆説的に
最も頻繁に現れることはないけれども、ヌクレオチド+1における最も基部の部
位は内部では完璧に一致している。
Btnは通常のTATAA要素は有していないけれども、2つのAT-リッチ部位、位
置−49における5'-TGTAAAT-3'(SED ID NO:1のヌクレオチド4645-4651)、およ
び位置−106における5'-TCTAAA-3'(SED ID NO:1のヌクレオチド4583-4588)
は、より弱い開始部位である20〜25以内のヌクレオチドである。他の遺伝子
と同様に他の領域がTATA-および開始部結合タンパク質を経て転写の開始を協同
的に強化し、これはなぜ位置−83における開始部位が最も使用される部位とし
て現れるかを説明することができる。興味深いことに後者の部位は、多くのヒト
MHCクラスI遺伝子(Le Boutellier,Crit.Rev.Immunol.14:89-129(1994),
参照文献)においてTATA要素を特徴づけている配列5'-TCTAAA-3'(図2の位置−1
06)に接近している。加えて、乳タンパク質遺伝子プロモータの多くは、ラッ
トおよびねずみホエータンパク質遺伝子(Campbell and Rosen,Nucl.Acids Res
.12:8685-8697(1984))ならびにカゼイン遺伝子(Yu-Lee et al.,Nucl.Acids R
es.14:1883-1902(1986))の多くにおいて配列5'-TTTAAAT-3'を含んで
いるむしろ類似した非定型的なTATAAボックスを有していることに注意すべきで
ある。
またBtnは、TATA配列(Breathnach and Chambon,Arm.Rev.Biochem.50:
349-383(1981),参照文献)から上流側のおおよそ50ヌクレオチドの前後関係
で考えられる典型的なCCAAT要素が不足している。しかしながら、TATAボックス
基部の50以内のヌクレオチドにある配列5'-ACAAAGT-3'(SEQ ID NO:1のヌクレ
オチド4597-4603)、ならびにTATAボックス末端の30〜40以内のヌクレオチド
にある配列5'-CCATTT-3'および5'-CATTT-3'(それぞれSEQ ID NO:1のヌクレオチ
ド4546-4551および4533-4537)を含むいくつかのCCAAT-様の能力を持つ部位(図2
の二重下線部)がある。乳タンパク質遺伝子プロモータの配列順によると、通常
のCCAATボックスは有していない。
RT−PCRによるねずみ・ブチロフィリンmRNAの3’エンドのマッピン
グ
Btnにおけるポリアデニール信号配列は、Btnにおけるストップコドンの
後、第1潜在ポリアデニール(ポリA)信号配列(SEQ ID NO:Iのヌクレオチド
13091−13096)あたりの4つのcDNAの領域を拡大するため、RT
−PCRを用いて識別された。期待されたサイズの拡大生成物は、推定されたポ
リA信号配列のプライマーズ(primers)5'で得られた。一方、RT−PCR生成
物は、このポリA信号配列を囲むかまたはヌクレオチド13199(図示せず)
の領域3’を含むプライマー(primer)ペアで得られた。これらのデータは、Bt
nにおける第1潜在ポリアデニール信号は好ましい停止信号であり、転写の3’
エンドはヌクレオチド13,097と13,199の間にあることを示唆してい
る。
Btnの予想された5’と3’との境界は、初期遺伝子転写サイズとして約8
.40−8.57kbと評価される。加工したmRNAのサイズとして3.50
−3.68kbの値が評価される。後の評価は、オリゴヌクレオチド試験(デー
タ表示せず)としてmcDNA3を用いねずみの乳腺から乳を出し、全RNAの
北方解析により決定されたねずみブチロフィリンmRNAのサイズである3.7
kbの値と一致している。
ブチロフィリン遺伝子配列の配列解析は、未翻訳領域5’(5’−UTR)と
未翻訳領域3’(3’−UTR)とにおいて単純に反転繰り返しをしている。興
味深いことに、5’−UTR(SEQ ID NO:1のヌクレオチド 4807−481
4)における繰り返し配列は、3’−UTR配列(SEQ ID NO:1のヌクレオチド
12,556−12,563)の正確な補足物である。これらの配列がブチロ
フィリン転写の合成、安定性または調整において作用的な役割を果たすことを示
している。
ねずみブチロフィリンmRNAの翻訳
予測されるねずみ科のブチロフィリンアミノ酸配列はRT−PCRとねずみ遺
伝子配列とにより生成されたねずみcDNAのDNA配列からエクソン/イント
ロンの境界を確認してから抽出された。トータルRNAはねずみの乳房組織(1
日の授乳)(Chomczynski and Sacchi,Anal.Biochem.162:156-159(1987))から生
成され、Perkin ElmerのRT−PCRキット(Perkin Elmer Corp.,Branchburg,
NJ)に記載された手順に従い、15分間42℃においてMuMLV反転転写酵素
とランダム・ヘキサマーズ(hexamers)との培養によりcDNAへ反転転写され
た。cDNA、mcDNA1、2、3、4(図1c)は、それからPCRによる
DNAの指示された領域を拡大することにより生成された。
アミノ酸配列は、ウィスコンシン遺伝子コンピユータグループ(GCG)(SE
Q ID NO:4)のTRANSLATEプログラムを用い実証されたcDNA配列か
ら予測された。このアミノ酸配列に基づき、翻訳開始コドンAUGはSEQ ID NO:
1のヌクレオチド4923−4925であると予測されている。この部位は、牛
のブチロフィリンmRNAに翻訳開始の予測された位置と一致しており、また殆
どの真核遺伝子(Kozak,Nucl.Acids Res.15:8125-8248(1987))のため好適な前後
関係内にある。ポジション4611の最末端の転写開始部位とポジション492
3(SEQ ID NO:1)の予測された転写開始部位との間に位置するSEQ ID NO:1のポ
ジション4650、4743、4765、4776に4つの他の潜在AUG開始
コドンがある。しかしながら、これらAUGコドンの最末端にあるコドンは好適
な配列前後関係内にはなく、他の3つのコドンは停止コドンTAA、TGA、T
AGにより、フレーム内で殆ど速やかにフォローされる。たいていのすべての
後半のケースにおいて、RNAポリメラーゼは次の潜在AUGスタート部位(Koz
ak,Nucl.Acids Res.12:3873-3893(1984))のためmRNAをスキャンし続ける。
BtnのDNA配列とブチロフィリンcDNAのDNA配列との比較はまた、IgS
F(Williams and Baclay,1988)内の多くの他の遺伝子のように、エクソン組織と
たんぱく質の機能ユニットとの間に緊密な相互関係がある。したがって、エクソ
ン1は5’−UTRと信号配列のすべてをコード化する。信号配列の位置は、図
1Bの垂直ダッシュラインにより示されている。エクソン2とエクソン3はIセ
ットとCセットの各免疫グロブリン状領域をコード化し、エクソン4は細胞膜ア
ンカーをコード化する。
ねずみブチロフィリンの組織特有の発現
前のワークはブチロフィリンは明確に乳房組織に発現することを提案し、発現
は授乳の間最大であることを提案する(Mather and Jackにより記述、1993
)。しかしながら、この結論は、関係する鈍感なたんぱく質とRNAに汚れをつ
ける技術、または免疫蛍光顕微鏡法の使用に基づいている。したがって、ねずみ
の組織におけるmRNAの発現は、非常に敏感なRNA酵素防御評価試験により
分析される。
リボプルーブはねずみのcDNA、mcDNA(図1C)から生成され、pC
RII(Meltonその他.,Nucl.Acids Res.12:7035-7056(1984))にサブクローンされ
た。反感覚リボプルーブのため、プラスミドは、SP6 RNAを用いて統合し
たXbaIとRNAを蒸解することによりリニア化された。感覚リボプルーブにとっ
て、プラスミドはT7 RNAポリメラーゼを用いて統合したHindIIIとRNA
との蒸解によりリニア化された。各ケースにおいて、RNAは、反応混合物内の
[α-32P]-dUTP(≧800Ci/mmol)の含有によってラベルをつけられた。全RNA
は、授乳1日目の3匹のBalb/cねずみの13の組織(すい臓、腸、脾臓、肝臓、
腎臓、心臓、肺、子宮、卵巣、胸腺、脳、唾液腺、乳房)から生成された(Chomc
zynski and sacchi,Anal.Biochem.162:156-159(1987))。乳房組織はいくつかの
発展段階(妊娠、授乳、退縮)の各段階において3匹のBalb/cねずみから採取さ
れた。反感覚または感覚リボプローブ(2×106cpm/sample)は、30μlの混合
溶液(80%(v/v))フォーマミド中の10μgのトータルRNAと、1mM E
D
TAと、10mMのナトリウムクエン酸塩とpH6.4の300mMのナトリウム
アセテートとで一晩、47℃で培養された(Ambion,Austin,TX)。各サンプル内の
RNAは、生成者の指示に従い、RNA酵素1(プロメガ)(5U/sample)と
30分間37℃で蒸解された。RNAは次の標準手続きと(Sambrookその他.,198
9)、6%(w/v)の変性ポリアクリルアミドジェルにおいて電気泳動により分けら
れたサンプルとによりリカバーされた。RNA酵素蒸解から放射線でラベルをつ
けられたリボプローブは、X線フィルムへの乾燥ジェルの露光により検出された
。
反感覚リボプローブのサイズは、ブチロフィリンmRNAへの統合はRNA酵
素との蒸解から625bpRNAを保護するために期待されたものであった。予想
されたサイズの放射線でラベルをつけられた断片は、分析された計13の組織か
ら乳房組織だけにおいてだけ検出された(図示せず)。異なる発展段階における
乳房組織の分析は、ブチロフィリンmRNAがバージン動物の腺ではなく妊娠、
授乳および退縮期間中に検出可能であることを示した。ブチロフィリンmRNA
の発現は、妊娠の最終半期において顕著に増加するように思われ、授乳期間を通
して比較的高レベルに残る。
Btnプロモータの分析
Btnは、乳腺に明確に発現し、MHCまたはMHCと同類の遺伝子と関連し
ている(Vernetその他.,1993;Amadouその他.,Genomics26:9-20(1995)ので、Bt
nプロモータと乳房の特質または免疫システム遺伝子の調整要素との類似性の調
査は導かれた。SEQ ID NO:2に示される約1.8kbのBtn5’隣接配列は、転
写要因データベス(Transcription Factor Data Base,TFD)(FaisstとMeyer,Nucl.
Acids Res.20:3-26(1992))における配列との比較、または乳清酸たんぱく質、α
−ラクタルブミン、β−ラクトグロブリン、およびカゼイン遺伝子の出版された
配列との比較によるストランド(strand)において分析された。
30以上の潜在的な調節要素の異なる分類は、配列を通して同定された。他の
乳房特質のプロモータまたは免疫システム遺伝子において機能的であると前に示
されたBtn内の要素は、図2に示されている。明瞭にするため、以下において明
確に論議しないとしても他の要素は除外されている。
乳房関連の要因は、一般的なSTATコンセンサス5’−TTNC(N)3A
A−5'を用いて認識された3つの潜在的STAT結合部位を含んでいる(IhleとK
err,Trends Genet.11:69-74(1995)、引用例参照)(図2にアスタリスクで示す)。
付加的なSTAT結合部位は、Lambその他の功績(Nucl.Acids Res.23:3283-328
9(1995)、引用例参照)に基づき境界コンセンサスTT(N)5AAを用いて認識
することができる(図2にアスタリスクで示さず)。いくつかのC/EBP部位は
、ヌクレオチド1505から1514の間のひとつを含み認識された。その一つ
は不完全なパリンドローム5’−ATTAGGTAAT−3’である(SEQ ID N0
:5)。妊娠特有の乳房核要因(5’−TGAT/ATCA−3’、LeeとOka,19
92,、引用例参照)または単一ストランドの核酸結合たんぱく質(種種のコンセ
ンサス配列がチェックされている,AltiokとGroner,1994,引用例参照)のための
部位はないように思われる。Btnは、Ets同類のたんぱく質NF1(PU.1部位,Kle
mszその他.,1990,、引用例参照)のための潜在的結合部位、Oct1(Kemler
その他.,EMBO J.8:2001-2008(1989),引用例参照)とグリココルチコイド応答要
素(1/2部位)とのためのヘプタマー(heptamer)結合部位とを含んでいる。
いくつかのYY1部位があり、YY1を結合する少なくとも11のGMCSF要
素(Nimerその他.,1990、引用例参照)がある(Yeその他.,Nucl.Acids Res.22:567
2-5678(1994),、引用例参照)。乳清酸たんぱく質遺伝子プロモータにおいて特
有な2個の負調節要素が認識された(Kolbその他.,1994,引例参照)。これらの要
素は(それぞれひとつの不一致を許せば)、Btnの適当な前後関係、基部のプロ
モータ領域から離れた約270のヌクレオチド内にある。非常に重要なことに、
「ミルクボックス」領域は、Liardその他(1988),(引用例参照)のコンセンサス
配列を用いて発見できず、混合物C/EBPを有する明かなCoREs、グルコ
コルチコイド応答要素とSTAT5部位(Raughtその他,1995,、引用例参照)は
認識されなかった。さらに、FASTA(PearsonとLipman,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.85:2444-2448(1988)、またはBLAST(Altschulその他.,J.Mol.Biol.2
15:403-410(1990))によるカゼインのプロモータ、乳清酸たんぱく質、α−ラク
タルブミンおよびβ−ラクトグロブリン遺伝子とBtnの5'隣接領域との比較は、
限られた類似性しか示さなかった。Btnプロモータはそれゆえ、他の乳房特有の
遺伝子の
調節要素と新しい特徴を有するように思える。
Btnプロモータは正統的なMHCクラスIとクラスIIの遺伝子と関連している
特徴的な応答要素を欠いている(Le Boutelier,1994;Dornその他.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.U.S.A.84:6249-6253(1987))。しかしながら、α−およびγ−インターフ
ェロン応答要素と、TCF−1(FaisstとMeyer,1992,、引用例参照)(図2には示
さず)のためのコンセンサス配列と、PU.1(Klemszその他.,1990)とを含む免
疫システム遺伝子と関連する多くの潜在的調節要素がある。基部プロモータ内に
ある3個のGMCSF部位の繰り返し要素が認識され、同一前後関係においてT
細胞内のGMCSFのミトゲン誘導発現を調節していることが実証された(Nimer
その他.,1990)。
したがって、ねずみのBtnは、トランジェニック動物の乳における望ましいた
んぱく質の発現を導き、ミトジェックな混合物を選り分けるために使用可能であ
る。ここで用いられるように、ねずみのBtnプロモータという用語は、SEQ ID NO
:1の1から4693のすべての配列されたヌクレオチド、または実質的に同等の
ものを意味する。実質的に同等のものとは、厳しい状態のもとSEQ ID NO:1の
ヌクレオチド1から4693を有するDNA断片に統合するこの配列を有するD
NA断片を可能にするDNA配列として定義される。
遺伝子のプロモータ領域において見つけられる調節要素に加え、組織特有の発
現に含まれる調節要素はまた、遺伝子の転写ユニットまたは3'隣接配列に配置
可能である(例えば、Charnayその他.,Cell38:251-263(1984);Gillesその他.Cel
l 33:717-728(1983)を参照)。したがって、複製されたブチロフィリン遺伝子は
そのような調節配列の源として使用可能である。例えば、異質のたんぱく質を発
現するためのrDNA構造は、Btn遺伝子の第1エクソンにインサートされたた
んぱく質用にコード化しているDNA配列を含むことができる。好適には、イン
サートされたものは、通常、乳へのブチロフィリン分泌に含まれる分泌経路に向
け異質のたんぱく質を的とするためのBtn信号配列に正確に融合されたものであ
る。
実施例4 牛のブチロフィリンプロモータの複製および分析
牛のブチロフィリン遺伝子の5'非転写領域は、JackとMatcher(1990)において
開示された牛のブチロフィリンcDNAを用いる標準的な統合方法により、牛ゲ
ノムλライブラリーから複製可能である。ここでBTN1として参照した牛のプ
ロモータを有する複製を配列し、ねずみのプロモータ配列と牛のプロモータを有
する複製の配列とを比較することにより、牛のプロモータとそこに含まれる調節
要素との境界を認識可能である。
実施例5:合成ブチロフィリンプロモータ領域の作成
この技術に習熟した者により、すべてのブチロフィリンプロモータは望ましい
生物学的活動を提供する必要はないと理解されるだろう。例えば、乳における異
質のたんぱく質の製造が望まれるなら、授乳組織におけるブチロフィリン遺伝子
の発現を制御する転写要因に応答する必要があり、かつ充分に応答するブチロフ
ィリンプロモータ内に、何らかの最小の領域または領域の組み合わせがあるだろ
う。一方、ミトジェニックな化合物を選り分けることが目的なら、何らかの最小
領域、あるいはミトゲンの存在するところでブチロフィリンまたは他の遺伝子の
発現を導く必要があり、かつ充分に導くことができるブチロフィリンプロモータ
内の領域の組み合わせがあるだろう。望ましい生物学的活動を提供する必要があ
り、かつ充分に提供できるそのような最小プロモータ領域は、この技術において
良く知られた方法を用いる削除分析により認識されうる。
簡単に述べると、削除構造物は、リポータ遺伝子に実施可能に連結されたλBt
n1またはBTN1のますます小さい部分を含んで作成される(例えば、次の実施
例6を参照)。そして、種種の転写要因への応答においてリポータ遺伝子の発現
量は、削除構造物内で比較される。望ましい応答を提供するλBtn1またはBTN
1の最小のプロモータ領域は、削除構造物からサブクローンされるか、または自
動DNA合成器において合成されたオリゴヌクレオチドから作成される。これら
の最小領域は、前述したように、ブチロフィリン遺伝子またはそれらと実質的に
同等なものから誘導されたDNA配列を備えることができる。これらの最小プロ
モータ領域は、望ましくコード化された配列に使用可能に連結され、そして組換
え発現ベクターに配置されうる。
実施例6−ブチロフィリンの構造:hGH発現ベクター (Nicholas Institute Diagnostics,San Juan Capistrano,CA)は、ブチロフィリ
ン
プロモータまたはプロモータ領域を評価するために使用可能である。簡単に述べ
ると、ブチロフィリンプロモータまたは最小プロモータ領域を有するDNA断片
は、人間の成長ホルモン(hGH)構造造伝子を有するp0GHベクターに複製されるが
、真核プロモータを欠いている。結果融合プラスミドは、最初の乳房細胞のライ
ンにトランスフェクト(tansfect)され、そして中間に分泌されたhGHは、単一複
製の抗体ベース試験(Nicholas Institute Diagnostics,#40-2205)を用いて免疫
学的に検出される。分泌されたhGHのレベルはmRNAに比例するので、プロモ
ータの活動は観察可能である。
hGHに加え、コード化したクロラムフェニコール・アセチルトランスファーゼ(
CAT)、緑蛍光性のたんぱく質、または発光酵素のような他のリポーター遺伝子は
、ブチロフィリンプロモータ領域の評価に使用可能である。これらのリポーター
遺伝子生成物の生成物の検出は、この技術分野でよく知られている。
実施例7−トランジェニック動物の構造物
望ましいたんぱく質または初期胚ラインのポリペプチド用の異なるDNA配列
コーディングを有するトランジェニック動物の生成は、この技術分野でよく知ら
れている手続きにより行われる。例えば、Rosenのアメリカ合衆国特許5,304,489
(トランジェニック動物)と、Clarkその他のアメリカ合衆国特許5,322,775(トラ
ンジェニック羊)を参照。いずれも引用例参照。一般的にその工程は、胚の収集
と、胚へのDNA注入と、母体を代用するための生存胚の変質と、異質遺伝子の
統合と発現のため子孫選択を有している。発明に含まれるトランジェニック動物
を組み立てるため、注入されたDNAは、ブチロフィリンプロモータ、または望
ましいポリペプチドをコード化するDNA配列に効果的に連結された最小のブチ
ロフィリンプロモータ領域を有するrDNA構造物になりうる。DNA構造物は
また、望ましいポリペプチドをコード化するDNA配列に使用可能に連結された
信号配列を有することが望ましい。
初期胚ライントランジェニック動物を構成することに加え、本発明は、ブチロ
フィリンプロモータまたは体細胞のトランジェニック哺乳動物におけるプロモー
タ領域の制御の元で、望ましいコード配列の発現を予想する。Lothar Henningha
usen,J.Cell.Biochem.,49:325-332(1992),引用例参照、が述べているように、そ
のような動物は生きた授乳動物の乳房上皮細胞にジェット注射ガンとDNAの物
理的導入により生成される。Furth,P.Aその他の生きた動物の分化した組織と、
の器官培養とにジェット注射を行うことによる遺伝子転送を参照せよ。Mol.Biot
echnol 4(2):121-127(Oct.1995)
実施例8−非授乳哺乳動物におけるブチロフィリンの発現に関連する病気状態 の検出
前述したように、ブチロフィリンはIgSFのメンバーであり、その細胞質領域は
ジーン・フィンガー(zine-finger)たんぱく質における細胞質領域と類似してい
る。したがって、非授乳組織内または非授乳動物の乳房組織のRNAにおけるブ
チロフィリンの発現は、ブチロフィリンプロモータが活動している癌または他の
病気の状態を検出するために利用できる。
本発明の原理、望ましい実施形態と使用モードは、これまで述べた明細書中に
記述されている。しかしながら、ここに保護しようとする発明は、限定的と言う
よりも説明的であると見なされるので、ここに開示された形式に限定して説明す
るものではない。本発明の精神から離れることなくこの技術分野に習熟した者に
より実施形態は種種変化可能である。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Title of invention
Butyrophilin gene promoter and its use
Field of the Invention
The present invention relates generally to the butyrophilin gene promoter. More specifically,
The present invention relates to the production of non-cognate proteins by the milk of transgenic animals and carcinogens
The invention relates to the use of a butyrophilin gene promoter to detect quality. to this
Therefore, the applicant filed US Serial No. 60/022, 563 papers
The contents are quoted and incorporated.
BACKGROUND OF THE INVENTION
Butyrophilin binds the fat-small membrane (FGM) in many types of milk and
It is an important essential protein that may play a role in the secretory machinery. Franke et al.,
J. Cell Biol. 89: 485-494 (1981); Jack and Mather, J. Amer. Biol. Chem. 265: 14481
-14486 (1990); and Jack and Mather, J. Dairy Sci. 76: 3832-3850 (1993);
Then, they are quoted and incorporated in their respective sentences. Breast epithelial cells
Butyrophilin, which oozes on the surface of the apex, is a glycosylated exopura
Smic domains, membrane anchors roughly in the middle of the sequence, and long cells
It is a type I glycoprotein containing a tail.
Butyrophilin is derived from the exoplasmic domains B7.1 (CD80) and
And B7.2 (CD86) receptor (Linsley et al., Protein Sci. 3: 1341-1343 (1994).
)) And the immunoglobulin superfamily (IgSF) (Gar
dinier et al. Neurosci. Res. 33, 177-187 (1992)). Those
Is characterized by two exoplasmic immunoglobulin-like domains
Yes; one of the variable substances (V) or intermediates (I) near the N-terminus
(Williams and Barclay, Ann. Rev. Immunol. 6, 381-405 (1988); Harpaz and Ch.
othia, J .; Mol. Biol. 238, 528-539 (1994)); Steady state near the membrane anchor
It is one of the substance (C) types (Williams and Barclay, 1988). Exoplasmic
Other proteins cognate with butyrophilin in the domain are components of myelin sheath
(Gardinier et al., 1992) Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), and
Major Histocompatibility Complex (Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 8
8: 4377-4381) and chicken BG antigen (Gardinier et al., 1992; Mill)
er et al., 1991). In the IgSF and BG antigen systems
Butyrophilin content implies that butyrophilin has an immune effect
ing.
The C-terminal cytoplasmic domain of butyrophilin is composed of Zn fingers and coiled
It is similar to the C-terminus in the set of proteins contained in the IL domain. this
These proteins are associated with nucleic acids or proteins (Bellini et al., J. Cel.
l Biol. 131: 563-570 (1995)), ret finger protein (RFP) (Takahas
hi et al. Cell Biol. 8: 1853-1856 (1998)), nuclear antigen of Sjogren's syndrome
A (SSA / Ro) (Chan et al., J. Clin. Invest. 87: 68-76 (1991)), Africa
Frog nuclear element 7 (XNF7) (Reddy et al., Develop. Biol. 148: 107-11).
6 (1991)), PwA33 of Pleurodeles waltl origin (Bellini et al., EMBO J. 12: 1).
07-114 (1993)) and acid finger protein (AFP) (Chu et al., Genomic
s 29: 229-239 (1995)). At the DNA level, this cognate region is MOG
MHC class I region on chromosome 6 together with the, RFP and butyrophilin genes
Region is surrounded by an exon called B30.2 (Vernet et al.
, J. et al. Mol. Evol. 37: 600-612 (1993)). Based on the above knowledge, Vernet et al. (19
93) indicates that the butyrophilin gene is compatible with exon I-set in butyrophilin.
An ancestral MOG gene generated by the encoding of the
Exon with the ancestral RFP gene generated in the B30.2 region of the tyrophilin gene
It has been proposed that the mixture has evolved into MHC.
Butyrophilin is clearly present in breast tissue as a maximum during lactation.
It is. The expression of the mammary properties of this butyrophilin gene is consistent with the butyrophilin promoter.
It is considered to be under the control of Ta. Butyrophilin is associated with milk FGM in many species.
Make up important proteins in the total protein bound, eg bovine
More than 40% of total FGM binding protein in milk
Motor is the breast to produce cognate proteins in transgenic mammalian milk
There is an attractiveness as a unique promoter.
Promoters of other breast characteristic genes such as casein, citrate protein, α-la
The ctalbumin and β-lactoglobulin genes are found in the milk of transgenic animals.
Has been used directly to produce unrelated proteins. Breast characteristics
Recent analysis of gene promoters has shown that mammary gland
Leading to the same as the key adjustment factors. These elements are binding sites for
CTF / NF1 in β-lactoglobulin (Watson et al.,
Nucl.AcidsRes. 19: 6603-6610 (1991)) and the clear acid protein gene (Li and Rosen,
Mol. Cell Biol. 15: 2063-2070 (1995)); Cow αS2-Oct1 in the casein gene (
Groenen et al., Nuc. Acids Res. 20: 4311-4318 (1992)); β-casei passively
Single-stranded nucleic acid binding protein (Altiok and Groner, Mol> Cell B
iol. 14: 6004-6012 (1994)); Stimulation of Ets-cognate proteins (Welte et al., Eur
. J. Biochem. 223: 997-1006 (1994)) and passively adjusting the disidentified element
Element, citrate protein gene (Kolb et al., J. Cellul. Biochem. 56: 245-261 (199
4)), and regulates progesterone-intermediate suppression of the mouse β-casein gene
Gestational period specific protein (Lee and Oka, J. Biol. Chem. 267: 5797-5801 (199
2)). Several, including the most thorough study of the rodent β-casein gene promoter
The gene is C / EBP (Doppler et al., J. Biol. Chem. 270: 17962-17969 (
1995)), YYI (Meier and Groner, Mol. Cell Biol. 14: 128-137 (1994); Raught
et al., Mol. Cell Biol. 14: 1752-1763 (1994)), MGF / STAT5 (Watson
et al., Nucl. Acids Res. 19: 6603-6610 (1991); Groenen et al., 1992; Wakao et
al., EMBO J. 13: 2182-2191 (1994)) and the glucocorticoid response element (Raught e
t al., 1995). In addition, promoter elements that are fundamentally necessary for cell survival
The gene β1,4-galactosyltransferase is derived from AP-2 and CTF
/ Binding site for regulating the synthesis of NF1 breast 3.9 kb transcript
(Rajput et al., J. Biol. Chem. 271: 5131-5142 (1996)).
The basis for breast characterization is a number of poorly understood systems.
First, at some sites, the base of the α-lactalbumin gene promoter
The sequence called so-called "milk box", where the identification occurs, is the casein gene (L
aird et al. Biochem. J. 254: 85-94 (1988)).
1, STAT5 (Meier and Groner, 1994; Raught et al., 1994) and C / E
Binding for BP isoforms (Doppler et al., 1995; Raught et al., 1995)
Wrap the site. Also, the casein gene associated with blocks A, B and C
Also have three protected sequences (Yoshimura, M. and Oka, T.,Gene 78,267-27
Five). Raught et al. (1995) reported that casein gene expression was STAT5 and glucoside.
A response consisting of a corticoid response element and various elements including a C / EBP binding site.
It has recently been proposed to be controlled by answer elements (CoREs).
First, the inventor concluded that the promoter sequence contains the promoter region and that
They have found that they have no significant similarity to the known sequence of the promoter, and
Tyrophilin was asexually reproduced and sequenced.
Analysis of the butyrophilin promoter indicates that the butyrophilin promoter is α- and
Many latents associated with immune system genes including the β-interferon response element
Includes competent regulatory elements, TCF-1 and PU. Sequence is identical to 1 (
PU. 1 is a macrophage, which is a B cell characteristic transducer associated with the ets oncogene.
It is a copying factor. See Klemsz et al., Cell 61: 113-125 (1990). ). In addition to the invention
The authors report that the region close to the base of the butyrophilin promoter has the same context in T cells.
Regulates the expression of mitogen at the macrophage granulocyte colony-stimulating factor site
Was found to contain three repetitive elements of GMCSF. Therefore Butiro
Filin promoters are also useful for detecting carcinogens.
Disclosure of the invention
The present invention relates to the sequence of the 5 'flanking region and the murine butyrophilin gene (
Btn). In particular, the present invention provides a Btn promoter and
The present invention provides a transcription control element contained therein.
Accordingly, it is an object of the invention to encode polypeptides having biological activity.
Separation and purification of a DNA fragment constituting one DNA sequence.
Another object of the invention is to provide one of the biologically active butyrophilin promoters.
Separation and purification of DNA fragments constituting the DNA sequence.
An additional object of the invention is to express a polypeptide in the mammary gland of a mammal.
RDNA construction. The rDNA structure has a D symbolizing the desired polypeptide.
Contains the butyrophilin promoter linked to affect the NA sequence
You. The rDNA structure also affects the DNA sequence encoding the DNA polypeptide.
So that the DNA sequence encodes a signal sequence linked in such a manner. Rather
, The signal sequence is a milk protein signal sequence. The DNA structure consists of a transcription unit and
And / or 3 'flanking sequences in the butyrophilin gene.
A further object of the present invention is to provide a genetically engineered production of the desired polypeptide in the mammary gland
Animal offers. This describes the polypeptide in mammalian mammary epithelial cells.
Butyrophilin promoter linked to affect the coding DNA sequence
This is achieved by incorporating an rDNA structure containing rDNA structure is suckling
Subsequent generations, as described above, that are incorporated into the germline of the product
Generating the peptide is optional.
Another aspect of the invention relates to the mitogenic properties of substances capable of carcinogenesis for various reasons.
Use of mitogens in the butyrophilin promoter to detect gender.
For example, substances found in the surrounding environment or separated from food sources are highly carcinogenic.
Tested. The mitogenic properties of a substance are related to the butyrophyll in cells exposed to the substance.
Detection of butyrophilin mRNA and protein with phosphopromotor activity, or butyrophilin
Evaluation by detection of reporter gene production under the control of the filin promoter
Be valued.
It is a further object of the invention to feed non-lactating animals for the production of butyrophilin.
Diagnosis of disease states such as breast cancer by sieving non-mammalian tissue.
BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
FIG. 1A shows the sequence of the mouse butyrophilin gene and the 5 'flanking region.
Indicates the location of the subclone prepared from λBtn1 used to generate
FIG. 1 is a conceptual diagram of a λBtn1 clone.
FIG. 1B shows the murine Btn gene structure showing exon and intron locations.
It is a conceptual diagram.
FIG. 1C shows the cDNA subclone used for the sequence of the mouse butyrophilin sCNA.
FIG. 3 is a conceptual diagram of a mouse butyrophilin cDNA showing the position of a loan.
2A-C show near the base of the 5 'flanking region of the mouse butyrophilin gene.
It shows the position of the prescribed element estimated nearby.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The invention relates to the sequence of the murine butyrophilin gene, and the butyrophilin promoter.
The approximate 4.6 kb sequence in the 5 'flanking region, which is also
providing. These sequences were obtained from a mouse genomic library described below.
Obtained by the clone to be separated.Example 1 Asexual Reproduction of the Mouse Butyrophilin Gene (Stratagene, La Jolla, CA)
Sieve with 2.3 kb XhoI-XbaI fragment of the encoded bovine butyrophilin cDNA
(Jack and Mather, 1990). Plaque DNA (total of 500,000 pfu) was
Transferred to an iron membrane (Dupont, Boston, MA), denatured with 0.5N NaOH,
The membrane was prepared using a pre-cleaning solution (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manua).
l, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, (1989))
For 2 hours at 42 ° C. followed by 42 ° C. in prehybridization solution.
After culturing for 6 hours, a random addition method (Feinberg and Vogelstein, Anal.
em. 132: 6-13 (1983))9cpm / μg specific activity [α-32P] -dC
Hybridization with bovine butyrophilin cDNA fragment labeled with TP
And incubated overnight at 42 ° C. in a solution solution. The filter is 2X SSC (Samb
rook et al., 1989), then contain 0.1% (w / v) SDS
The membrane was washed three times for 20 minutes each with 2 × SSC at 55 ° C.
Exposure to X-ray film overnight at 0 ° C. detected. Some potentially positive plaques
,Grand total
The asexual germline DNA was detected by sieving 500,000 pfu and was called λBtn1.
Was added to the American Type Culture Collection
Was deposited as 997513.
To confirm that λBtn1 contains the mouse butyrophilin gene
, Asexually Reproduced DNA (λBtn1), Rat, and Bovine Genomic DNA Samples
Is codified by EcoR1 or HindIII and used as a probe for cognate bovine c
DNA [32P] -labeled 2.3 kb XbaI fragment with Southern blot
And In each case, digestion with restriction endonucleases [32P] -labeling
A characteristic pattern of DNA fragments hybridized with the probe was obtained. radiation
A similar pattern of the substance labeled bands is shown in the genomic DNA and λBtn1 samples.
Detected (data not shown). Be able to use the λBtn1 sequence
The mouse cDNA probe, mcDNA3, first 396b of exon 7
The encoding of the 3 'end of exon 3 through p (see FIG. 1C) was performed by RT-PCR.
Created. Southern similar to those described above that detected this cognate cDNA
Blotting confirmed the identity of λBtn1 (data not shown).Example 2: Rat butyrophilin gene sequence
Subcolonies longer than 14 kb of λBtn1 DNA were generated (FIG. 1).
A) and arrange for both elements using the fmol sequencing kit from Promega Corp (Madison, WI).
Lined up. The radiograph is scanned with a molecular mechanics computing photographic densitometer and distributed.
Sunnyvale, CA). Computer program MACAW (S
chuler et al., 1991) compiled a maximum length sequence from a sequencing gel.
The sequence is shown in SEQ ID NO: 1. All of the Btn sequences are in GenBank
Deposited with the database as Association No.U67065. Butyrophilin
The promoter contained the first 4,693 nucleotides of SEQ ID NO: 1. In this area
The base (first 1750 nucleotides) portion is shown in SEQ ID NO: 2,
For example, here the most transcription start (see below) is the renumbering shown at +1
This is illustrated in FIG.Example 3: Format of the mouse butyrophilin gene
Position of the 5 'end of the mouse butyrophilin mRNA. Transcription start site sequence 5'-GGGCTCT
Has GTATTTCCCCTAC-3 '(SEQ ID NO: 3)32Initiator extension using P-labeled initiator
Longitudinal analysis and discrimination by 14 day milk secreted mammary epithelial total RNA. This opening
Initiator extension analysis applied from Roussel et al. (DNA Cell Biol. 14: 777-788 (1995))
Here, references are cited. The three main labeled products are
Btn was obtained by the initiator elongation assay and is shown at position -83 in FIG.
Most frequently used sites at nucleotide T, at least -83, -1
8 and +1 (FIG. 2) (SEQ ID NO: residues 4611, 4675, 4694)
It starts from the site. All three transcription start sites are normal TATAA and CCAAT
Initiation element 5 'to enable initiation of transcription in boxless genes
-YYA+1NWYY-3 '(Javahery et al., Mol. Cell Biol. 14: 116-127 (1994), reference text)
In the vicinity or inside the context. These two of -83 and -19
The sites contain one and three mismatches respectively from the matching sequence,
The site is more common A+1There are two nucleotides along the start site. Paradoxically
The most proximal part at nucleotide +1 although it does not occur most frequently
The ranks are perfectly matched internally.
Btn does not have the usual TATAA element, but has two AT-rich sites, positions
5'-TGTAAAT-3 'at nucleotide -49 (nucleotides 4645-4651 of SED ID NO: 1), and
And 5'-TCTAAA-3 'at position -106 (nucleotides 4583-4588 of SED ID NO: 1)
Is within 20-25 nucleotides, the weaker start site. Other genes
As well as other regions coordinate transcription initiation via TATA- and starter binding proteins
This is why the start site at position -83 is the most used site.
Can be explained. Interestingly, the latter site is
MHC class I gene (Le Boutellier, Crit. Rev. Immunol. 14: 89-129 (1994),
The sequence 5'-TCTAAA-3 'characterizing the TATA element in the reference
06) is approaching. In addition, many of the milk protein gene promoters
And mouse whey protein genes (Campbell and Rosen, Nucl. Acids Res
. 12: 8685-8697 (1984)) and the casein gene (Yu-Lee et al., Nucl. Acids R
es. 14: 1883-1902 (1986)) containing the sequence 5'-TTTAAAT-3 '
It should be noted that rather has a similar atypical TATAA box
is there.
Btn has a TATA sequence (Breathnach and Chambon, Arm. Rev. Biochem. 50:
349-383 (1981), reference) about 50 nucleotides upstream from
Lacks the typical CCAAT factor considered in. However, TATA box
The sequence 5'-ACAAAGT-3 '(nucleotide of SEQ ID NO: 1) within 50 nucleotides of the base
Otide 4597-4603), as well as nucleotides within 30-40 of the end of the TATA box
5′-CCATTT-3 ′ and 5′-CATTT-3 ′ (nucleotides of SEQ ID NO: 1, respectively)
Sites with several CCAAT-like abilities (Fig. 2
Double underlined part). According to the sequence of the milk protein gene promoter,
Does not have a CCAAT box.
Mapping of the 3 'end of mouse / butyrophilin mRNA by RT-PCR
The
The polyadenyl signal sequence in Btn is the stop codon in Btn.
Followed by a first latent polyadenyl (polyA) signal sequence (nucleotide of SEQ ID NO: I).
To expand the region of the four cDNAs around
-Identified using PCR. The expanded product of the expected size is
Obtained with the primers 5 'of the A signal sequence. On the other hand, RT-PCR generation
An object surrounds the polyA signal sequence or contains nucleotides 13199 (not shown).
Was obtained with a primer pair containing the region 3 '. These data are
n is the preferred stop signal, 3 'of the transcript
End indicates that it is between nucleotides 13,097 and 13,199.
You.
The expected boundary between 5 'and 3' of Btn is approximately 8 as an initial gene transcript size.
. Evaluated at 40-8.57 kb. 3.50 as the size of the processed mRNA
A value of -3.68 kb is evaluated. Subsequent evaluation is based on oligonucleotide testing (data
Milk from mouse mammary gland and total RNA
3.7 is the size of rat butyrophilin mRNA determined by northern analysis.
kb.
Sequence analysis of the butyrophilin gene sequence revealed that the untranslated region 5 '(5'-UTR)
Inversion is simply repeated in the untranslated region 3 '(3'-UTR). Entertainment
Deliciously, the 5'-UTR (nucleotides 4807-481 of SEQ ID NO: 1)
The repeat sequence in 4) is a 3'-UTR sequence (nucleotide of SEQ ID NO: 1)
12, 556-12, 563). These sequences are
Demonstrates an active role in the synthesis, stability or regulation of filin transcription
are doing.
Translation of rat butyrophilin mRNA
Predicted rodent butyrophilin amino acid sequence is determined by RT-PCR and rodent
Exon / Int from DNA sequence of mouse cDNA generated by gene sequence
Ron's boundary was confirmed before extraction. Total RNA is from mouse breast tissue (1
Lactation of the Sun) (Chomczynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987))
RT-PCR kit from Perkin Elmer (Perkin Elmer Corp., Branchburg,
NJ) according to the procedure described in NJ) for 15 minutes at 42 ° C.
Is reverse transcribed into cDNA by cultivation with random hexamers
Was. The cDNA, mcDNA 1, 2, 3, 4 (FIG. 1c) was then
Generated by enlarging the indicated region of DNA.
The amino acid sequence was determined by the Wisconsin Gene Computer Group (GCG) (SE
CDNA sequence verified using the TRANSLATE program of Q ID NO: 4)
Predicted. Based on this amino acid sequence, the translation initiation codon AUG is represented by SEQ ID NO:
It is predicted to be one nucleotide 4923-4925. This part is a cow
Of butyrophilin mRNA is consistent with the predicted position of translation initiation, and
Suitable before and after for any eukaryotic gene (Kozak, Nucl. Acids Res. 15: 8125-8248 (1987))
In a relationship. The transcription start site at the extreme end of position 4611 and position 492
3 (SEQ ID NO: 1) and the predicted transcription start site of SEQ ID NO: 1
4 other potential AUG starts at 4650, 4743, 4765, 4776
There are codons. However, the codon at the extreme end of these AUG codons is preferred
The other three codons are not in the exact sequence context and the stop codons TAA, TGA, T
The AG follows almost immediately in the frame. Most of all
In the latter case, the RNA polymerase will start the next potential AUG start site (Koz
ak, Nucl. Acids Res. 12: 3873-3893 (1984)).
Comparison of the DNA sequence of Btn with the DNA sequence of butyrophilin cDNA was also performed using IgS
Like many other genes in F (Williams and Baclay, 1988),
There is a close correlation between the functional units of the protein. Therefore, exo
1 encodes the 5'-UTR and all of the signal sequence. The position of the signal array is shown in the figure.
This is indicated by the vertical dashed line in 1B. Exons 2 and 3 are
Exon 4 encodes each immunoglobulin-like region of the
Code the anchor.
Tissue-specific expression of rat butyrophilin
The previous work suggested that butyrophilin was clearly expressed in breast tissue and expressed
Suggest maximum during lactation (described by Mather and Jack, 1993
). However, this conclusion contaminates the insensitive proteins and RNAs involved.
Or the use of immunofluorescence microscopy. Therefore, the mouse
MRNA expression in various tissues was determined by a highly sensitive RNA enzyme defense assay.
Will be analyzed.
Riboprobe is generated from rat cDNA, mcDNA (Figure 1C),
Subcloned into RII (Melton et al., Nucl. Acids Res. 12: 7035-7056 (1984)).
Was. For anti-sensory riboprobe, the plasmid was integrated using SP6 RNA.
XbaI and RNA were digested for linearization. To sensory revolving probe
In addition, the plasmid is constructed using HindIII and RNA integrated using T7 RNA polymerase.
And was made linear by cooking. In each case, the RNA is contained in the reaction mixture.
[Α-32P] -dUTP (≧ 800 Ci / mmol). Total RNA
Shows 13 tissues (pancreas, intestine, spleen, liver, liver, 3 Balb / c rats) on day 1 of lactation
From the kidney, heart, lung, uterus, ovaries, thymus, brain, salivary glands, and breast) (Chomc
zynski and sacchi, Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987)). Some breast tissue
Collected from three Balb / c rats at each stage of development (pregnancy, lactation, regression)
Was. Antisensory or sensory riboprobe (2 × 106cpm / sample) is 30 μl
10 μg of total RNA in solution (80% (v / v)) formamide and 1 mM E
D
TA, 10 mM sodium citrate and 300 mM sodium, pH 6.4
Cultured overnight at 47 ° C. with acetate (Ambion, Austin, Tex.). Within each sample
RNA was combined with RNA enzyme 1 (Promega) (5 U / sample) according to the producer's instructions.
Cooked at 37 ° C. for 30 minutes. RNA is prepared according to the following standard procedure (Sambrook et al., 198
9) Separation by electrophoresis in 6% (w / v) denatured polyacrylamide gel
And recovered. Labeling with RNA from RNA digestion
The riboprobe was detected by exposure of the dried gel to X-ray film.
.
The size of the antisensory riboprobe depends on the integration of the butyrophilin mRNA into the RNA enzyme.
It was expected to protect 625 bp RNA from digestion with nitrogen. Expectation
Fragments labeled with radiation of the indicated size were collected from a total of 13 tissues analyzed.
Were detected only in breast tissue (not shown). At different stages of development
Analysis of breast tissue shows that butyrophilin mRNA is not gland of virgin animals but pregnant,
It was shown to be detectable during lactation and regression periods. Butyrophilin mRNA
Expression appears to increase significantly in the last half of pregnancy and throughout lactation
And remain at a relatively high level.
Analysis of Btn promoter
Btn is specifically expressed in the mammary gland and is associated with MHC or MHC-like genes.
(Vernet et al., 1993; Amadou et al., Genomics 26: 9-20 (1995)
Investigating similarities between n promoters and regulatory elements of breast traits or immune system genes
Inspection was guided. The approximately 1.8 kb Btn5 'flanking sequence shown in SEQ ID NO: 2 is
Transcription Factor Data Base (TFD) (Faisst and Meyer, Nucl.
Acids Res. 20: 3-26 (1992)), or the whey acid protein, α
-Published lactalbumin, β-lactoglobulin, and casein genes
Analyzed on the strand by comparison with the sequence.
More than 30 different classes of potential regulatory elements were identified throughout the sequence. other
Previously shown to be functional in breast-specific promoters or immune system genes
The elements in the assigned Btn are shown in FIG. For clarity,
Other elements have been excluded, if not explicitly discussed.
Breast related factors are the general STAT consensus 5'-TTNC (N)ThreeA
It contains three potential STAT binding sites recognized using A-5 '(Ihle and K
err, Trends Genet. 11: 69-74 (1995), see citation) (indicated by an asterisk in FIG. 2).
Additional STAT binding sites are described by Lamb et al. (Nucl. Acids Res. 23: 3283-328).
9 (1995), refer to the cited example) based on the boundary consensus TT (N).FiveRecognition using AA
(Not shown with an asterisk in FIG. 2). Some C / EBP sites are
, Including one between nucleotides 1505 to 1514. One of them
Is an incomplete palindrome 5'-ATTAGGTAAT-3 '(SEQ ID NO:
: 5). Pregnancy-specific breast nucleus factors (5'-TGAT / ATCA-3 ', Lee and Oka, 19
92, see citations) or single-stranded nucleic acid binding proteins (various
For which the sequence is checked, see Altiok and Groner, 1994, citations).
There seems to be no site. Btn is a protein related to Ets, NF1 (PU.1 site, Kle
Octl (Kemler), a potential binding site for msz et al., 1990, see citations.
Others, see EMBO J. 8: 2001-2008 (1989), cited example) and the need for a glycocorticoid response.
And a heptamer binding site for the element (1/2 site).
There are several YY1 sites and at least 11 GMCSF binding YY1s
(Nimer et al., 1990, see citations) (Ye et al., Nucl. Acids Res. 22: 567).
2-5678 (1994), see references). Special feature in whey acid protein gene promoter
Two significant negative regulatory elements were identified (Kolb et al., 1994, reference). These points
Elements (if you allow one discrepancy each) have the proper context of Btn,
Within about 270 nucleotides away from the motor region. Very importantly,
The “milk box” area is based on the consensus of Liard et al. (1988) (see citation).
Clear CoREs with mixture C / EBP, glucos, not found using the sequence
Corticoid response element and STAT5 site (Raught et al., 1995, see citation)
Not recognized. Further, FASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 85: 2444-2448 (1988), or BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 2).
15: 403-410 (1990)), the promoter of casein, whey acid protein, α-lac
Comparison of the talbumin and β-lactoglobulin genes with the 5 ′ flanking region of Btn
It showed only limited similarity. The Btn promoter is therefore
Genetic
It seems to have adjusting elements and new features.
Btn promoter is associated with canonical MHC class I and class II genes
Lacking characteristic response elements (Le Boutelier, 1994; Dorn et al., Proc. Natl. Aca
d.Sci.U.S.A. 84: 6249-6253 (1987)). However, α- and γ-interfaces
And the TCF-1 (see Faisst and Meyer, 1992, cited reference) (see FIG. 2).
Consensus sequence for PU. 1 (Klemsz et al., 1990)
There are many potential regulatory elements associated with the disease system genes. Inside the base promoter
Repetitive elements at three GMCSF sites are recognized and T
It has been demonstrated to regulate mitogen-induced expression of GMCSF in cells (Nimer
Others, 1990).
Therefore, mouse Btn is desirable in milk of transgenic animals.
It can be used to guide protein expression and to select mitogenic mixtures.
You. As used herein, the term murine Btn promoter refers to SEQ ID NO:
: 1 to 4693 of all sequenced nucleotides, or substantially equivalent
Means things. Substantially equivalent is that of SEQ ID NO: 1 under severe conditions
D having this sequence integrates into a DNA fragment having nucleotides 1 to 4693
Defined as a DNA sequence that allows for NA fragments.
In addition to regulatory elements found in the promoter region of the gene, tissue-specific expression
The regulatory elements present are also located in the transcription unit or 3 'flanking sequence of the gene.
It is possible (eg, Charnay et al., Cell 38: 251-263 (1984); Gilles et al. Cel)
l 33: 717-728 (1983)). Therefore, the replicated butyrophilin gene is
It can be used as a source of such regulatory sequences. For example, if you have a foreign protein
The rDNA structure to be expressed was inserted into the first exon of the Btn gene.
It may include a DNA sequence encoding for a protein. Preferably, the in
What is inserted is normally directed to the secretory pathway involved in butyrophilin secretion into milk.
Correctly fused to the Btn signal sequence to target a heterologous protein
You.
Example 4 Bovine Butyrophilin Promoter Replication and Analysis
The 5 'untranscribed region of the bovine butyrophilin gene has been described by Jack and Matcher (1990).
By standard integration methods using the disclosed bovine butyrophilin cDNA, bovine bovine
It can be replicated from the Nom λ library. The cow cattle referred to here as BTN1
Sequence with a mouse promoter and a mouse promoter sequence and a bovine promoter.
Comparison of the sequence of the replicating bovine promoter and the regulation contained therein
The boundary with the element can be recognized.
Example 5: Creation of synthetic butyrophilin promoter region
All butyrophilin promoters are desirable by those skilled in the art.
It will be appreciated that there is no need to provide biological activity. For example, in milk
If production of high-quality proteins is desired, the butyrophilin gene in lactating tissue
Butyrov needs to respond to transcription factors that regulate the expression of
There may be some minimal region or combination of regions within the promoter
U. On the other hand, if the purpose is to select mitogenic compounds,
Region or in the presence of mitogens, butyrophilin or other genes
Butyrophilin promoter that needs to be induced and can be fully induced
There will be a combination of regions within. Need to provide the desired biological activity
Such a minimal promoter region, which can be provided sufficiently, is
It can be recognized by deletion analysis using well-known methods.
Briefly, the deletion construct is a λBt operably linked to a reporter gene.
n1 or BTN1 (including, for example,
See Example 6). And, in response to various transcription factors, reporter gene expression
The quantities are compared in the deleted structure. ΛBtn1 or BTN to provide the desired response
One minimal promoter region is either subcloned from the deleted construct or
It is made from oligonucleotides synthesized in a moving DNA synthesizer. these
The minimal region of the butyrophilin gene, or substantially
A DNA sequence derived from the equivalent can be provided. These minimum professionals
The motor region is operably linked to the desirably encoded sequence and
And can be placed in an expression vector.
Example 6-Structure of butyrophilin: hGH expression vector (Nicholas Institute Diagnostics, San Juan Capistrano, CA)
N
Can be used to evaluate promoters or promoter regions. Briefly stated
Then, a DNA fragment having a butyrophilin promoter or a minimal promoter region
Is replicated in the p0GH vector containing the human growth hormone (hGH) structural gene.
Lacks eukaryotic promoters. The resulting fusion plasmid is the first breast cell line
HGH transfected into the cell and secreted in the middle
Using an antibody-based test (Nicholas Institute Diagnostics, # 40-2205)
Biologically detected. Since the level of secreted hGH is proportional to the mRNA,
Data activity is observable.
In addition to hGH, the encoded chloramphenicol acetyltransferase (
CAT), green fluorescent protein, or other reporter genes such as luminescent enzymes
Can be used to evaluate the butyrophilin promoter region. These reporters
The detection of gene product products is well known in the art.
Example 7 Transgenic Animal Structure
Different DNA sequences for desired proteins or polypeptides of the early embryo line
The generation of transgenic animals with coding is well known in the art.
It is performed according to the procedures that have been implemented. For example, Rosen in U.S. Pat.
(Transgenic animals) and Clark et al., US Patent 5,322,775 (tiger)
Genetic sheep). See the cited examples for all. Generally, the process involves collecting embryos
DNA injection into the embryo, alteration of the surviving embryo to substitute for the mother,
Has progeny selection for integration and expression. Transgenic animals included in the invention
In order to assemble the DNA, the injected DNA must be a butyrophilin promoter or
The smallest spot operably linked to a DNA sequence encoding a preferred polypeptide
It can be an rDNA construct having a lofilin promoter region. DNA structures are
It is also operably linked to a DNA sequence encoding the desired polypeptide.
It is desirable to have a signal arrangement.
In addition to constructing early embryo line transgenic animals, the present invention provides
Filin promoter or somatic promoter in transgenic mammals
Under the control of the protein region, the expression of the desired coding sequence is predicted. Lothar Henningha
As described by usen, J. Cell. Biochem., 49: 325-332 (1992), see the cited reference.
Animals such as live lactating mammary epithelial cells are injected into a jet injection gun and DNA
Generated by rational introduction. Furth, P.A and other differentiated tissues of living animals,
See Gene Transfer by Jet Injection into Human Organ Cultures. Mol.Biot
echnol 4 (2): 121-127 (Oct. 1995)
Example 8-Disease states associated with butyrophilin expression in non-lactating mammals Detection
As mentioned above, butyrophilin is a member of the IgSF and its cytoplasmic region is
Similar to the cytoplasmic region in the zine-finger protein
You. Therefore, a block in RNA in non-lactating tissue or in breast tissue of a non-lactating animal.
Tyrophilin expression is dependent on cancer or other cancers in which the butyrophilin promoter is active.
Can be used to detect disease states.
The principles, preferred embodiments and modes of use of the present invention are described in the foregoing specification.
It has been described. However, the invention we are trying to protect here is limited
It is considered more descriptive, so it is limited to the form disclosed herein.
Not something. To those skilled in the art without departing from the spirit of the invention
More embodiments can be varied.
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(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(GH,KE,LS,MW,S
D,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG
,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL,AM,AT
,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA,
CH,CN,CU,CZ,DE,DK,EE,ES,F
I,GB,GE,GH,HU,IL,IS,JP,KE
,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,
LT,LU,LV,MD,MG,MK,MN,MW,M
X,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE
,SG,SI,SK,SL,TJ,TM,TR,TT,
UA,UG,US,UZ,VN,ZW
(72)発明者 オーグ・シェリー・エル
アメリカ合衆国 メリーランド州 20905,
シルバー・スプリング,ブリッグス・チャ
ネイ・ロード,905番
(72)発明者 ジャック・ルーシンダ・ジェー・ダブリュ
ー
アメリカ合衆国 メリーランド州 21029,
クラークスビル,ホール・ショップ・ロー
ド,11912番────────────────────────────────────────────────── ───
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D, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG)
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, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA,
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X, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE
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(72) Inventor Aug Shelley Elle
United States Maryland 20905,
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ー
United States Maryland 21029,
Clarksville, Hall Shop Law
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