JP2001504937A

JP2001504937A - 等電式に粒子を分離するための方法及び装置

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Publication number: JP2001504937A
Application number: JP51529698A
Authority: JP
Inventors: コルラッハ、ヨーナス; エバルト、ルドルフ
Original assignee: フール、ギュンター
Priority date: 1996-09-28
Filing date: 1997-09-26
Publication date: 2001-04-10
Also published as: WO1998013689A1; US6833061B1; EP0928418B1; ATE256866T1; EP0928418A1

Abstract

(57)【要約】ｐＨに依存する実効電荷を有する粒子を等電分離するために、誘導液中の粒子を電界強さに晒す。少なくとも１つの所定のタイプの粒子が残りの粒子から分離され、電界強さの作用下で、固定用の捕集手段へ移動するように、誘導液のｐＨ値を調整する。捕集手段は、例えば、電界強さを形成する電極によって区画され、かつ分離されるサンプルと共に誘導液によって貫流される多孔性の中空繊維である。誘導液のｐＨ値と一致する等電点を有する粒子が繊維を妨げられずに通過するのに対し、残りの粒子は繊維内壁へ押され、案内流と共に先に運ばれることを阻止される。

Description

【発明の詳細な説明】等電式に粒子を分離するための方法及び装置本発明は、誘導液のｐＨ値に依存する荷電特性を有する粒子を等電分離するための、特に、両性の懸濁粒子、コロイド又は生物学的細胞を分離するための方法及び装置に関する。本発明は、特に、誘導液流からのこのような粒子の分離に関する。多数の分離技術が分子生物学、生化学、医学及びバイオ技術から知られている。この分離技術の機能は、分離される物質内での分子の電荷の違いに基づく。両性イオン化合物（いわゆる両性電解質又は両性分子）の場合には、分子の電荷は周囲溶液のｐIＨ値に依存する。或る化合物の等電点（以下ＩＰという）は、両性分子の実効電荷がゼロに等しいときのｐＨ値である。分子の電荷は、ＩＰよりも小さいｐＨ値の場合にプラスであり、逆の場合にはマイナスである。等電集束法（以下ＩＥＦという）では、夫々異なったＩＰを有するタンパク質を、或る分離区間に沿った空間的なｐＨの勾配を用いて分離する（Ｒ．Ａ．Ｍ．オッシャー等の『電気泳動力学』（編者Ｂ．Ｊ．ラドーラＶＣＨ、ヴァインハイム、１９９２、１６３−２３１頁を参照）。ＩＥＦは、例えば多孔性のゲルマトリクスを用いて行なわれ、あるいは、最小のサンプルの分析的分離のためには、いわゆるｃＩＥＦ（『電気泳動の進歩』第３巻（Ａ．クラムバッハ等ＶＣＨ、ヴァインハイム、２７３−３４７頁）に所収のＦ．フォレット等『毛細管電気泳動』を参照）として細い毛細管を用いて行なわれる。従来のＩＥＦは以下の理山から欠点を有し、その使用は制限されている。特に、他の分析、薬剤の適用等のような他の処理法のために、分離される物質を、キャリア物質から回収することは、分離される物質自体を場合によっては改質するか又は物質の損失をもたらすコストのかかる過程を要する。出来る限り幅広で直線的なｐＨ勾配を形成するための、添加物質の必要な使用は、分離されたサンプルの使の使用可能性の点で制限をもたらす。添加物質として用いられるいわゆるキャリア両性電解質は、分離されたタンパク質留分から分離するのが難しい化学的に非常に異なった物質混合物である。更に、ｃＩＥＦは、別個には捕集されることができないし、キャリア両性電解質から分離することもできない最小のサンプルに限定されている。特に、いわゆるＩＰＧ膜がｐＨ勾配を形成するために用いられるとき、問題は、このような膜をタンパクが通過する必要があるので、タンパクが，非常に低いイオン強度を有ずる媒質を通過しなくてはならないことにある。従って、感受性の高いタンパク質がこの領域では変性するか、沈殿することがある。この理由から、ＩＥＦの場合には、分離区間における電圧勾配の均等性に対して、最も厳しい要求がなされる。最後に、ＩＥＦの場合に、問題が、極端なｐＨ領域における電気浸透現象の形で、生じることがあり、例えば、キャリア媒体（ゲル）は加熱されて変化する（ゲルの破壊）。このような欠点を解消するために、外部電界の作用下でかつ改質する添加物質なしに両性電解質の分離を達成する装置が開発された。例えば、いわゆる電界- 流れ-分画（ｅＦＦＦ）の方法で作動する分離装置が知られている（Ｋ．Ｄ．コードウェル等の『サイエンス』第１７６巻、１９７２、２９６−２９８頁を参照）。この分離装置では、連続的な液流が２つのイオン流透析膜の間の狭いダクトを通って導かれ、分離されるサンプルが狭帯としてこの液流へ注入される。周囲液を介してダクトと電気的接触をしている外部電極は、液流中のタンパク質分子を、電荷に応じて程度を違えて抑制する。しかし、この方法の適用は、互いにかなり異なっているＩＰを有するタンパク質分子に限定されている。更に、タンパク質の完全な分離を達成することができなかった。液流のｐＨ値の（従って、分子荷電状態の）制御はこの知られた分離装置ではなされない。上記ｅＦＦＦ装置は、実用には適していない。これは、サンプルを（不完全には）分離することができるかもしれないが、分離された留分の捕集は実現化されなかったためである。更に、分離時間は容認できない程かかる。例えば、上記ｅＦＦＦ装置の改良（Ｌ．Ｆ．ケスナーの『分析化学』第４８巻、１９７６、１８３４−１８３９頁）は、実験室での規模においてさえ、数時間の分析時間又は分離時間を要した。ライトフット等（『分離科学及び技術』１６巻、１９８１年、６１９−６５６頁）により開示された改良のｅＦＦＦ装置は、シリンダ状のダクト構造を用いている。しかし、このこの装置は、同様に、実際に認容できない分離性能を示した。更に、タンパク質の抑制は、多数のパラメータに、例えば、用いられた緩衝イオン、サンプル量、タンパク質の種類、ダクト壁の特性に、複雑に依存した。更に、この知られた装置は、ｐＨ制御のためとか、例えば、種々のＩＰを有するタンパク質の分離のためには、考慮されていない。純度の高い物質を実験室の次元を越えて産業的規模で製造するために物質を分離することへの強い関心がある。しかし、上記制限及び欠点の故に、上記装置を用いて、実用のために十分な分離性能及び分離速度をもって、連続的に物質を分離することは、これまで全然知られていない。本発明の課題は、等電式に粒子を分離する改善された方法であって、分離可能な粒子及び用いられる周囲溶液媒体に関して、特に、高められた分離速度、高められた信頼性及び拡大された適用範囲によって区別される方法を提供することである。更に、本発明の課題は、この方法に対応する連続的な等電式の浄化方法を提供することである。また、本発明の課題は、粒子の分離並びにさらなる適用も可能な方法を実施する装置を提供することである。上記課題は、請求項１に係わる特徴部分を有する方法によって、及び請求項１２に係わる特徴を有する装置によって解決される。本発明の有利な実施の形態は双方の請求項に従属する請求項から明かである。本発明に係わる分離技術は、分離される粒子が電界の強度に晒されてなる誘導液中に、ｐＨ値を制御又は設定を行なって、実効電荷を有する全種類の粒子が電荷に依存する動きを行ない、実質的に中性の他の粒子が運動状態の変化を全然受けず、これによって、電荷に依存して動く粒子が捕集手段（捕集装置）へ動くという、思想に基づいている。粒子は、少なくとも一時的に、この捕集手段に留められる。これは、捕集手段の表面上の及び体積内の固定を含む。この固定の時間は、分離状態、特に、電界の強度の経時変化、ｐＨ値の変化、捕集手段の構造及び／又は捕集手段と誘導液との間の相対移動によって規定される。かくて、上記ｅＦＦＦ技術との著しい相違は、粒子が電荷に応じて異なって抑制されるのではなく、誘導液内でのｐＨ値の制御によって、或る条件、すなわち、粒子のどのタイプが、外部電界の作用下で、少なくとも一時的に固定された状態に動き、場合によっては再度解放されるかを定める条件が、調整されることにある。上記ｅＦＦＦ技術と相違させるために、本発明に係わる等電分離は、ｐＨが制御される電子保持クロマトグラフィーと称される。捕集手段は本当の拘束手段として作用する。かくして、等電式の逆の分子分離のための方法、つまり、ｐＨ値に依存する電荷を有する粒子を、誘導液中で、捕集手段の付近に導き、誘導液のｐＨ値を調整又は変化するので、無荷電粒子のみが誘導液中に留まるのに対し、荷電粒子を、電界を通って捕集手段へと移動し、かくして、少なくとも一時的にｐＨに依存して固定する方法が提案される。本発明に係わる、所定のタイプの粒子の移動での生じる変化は、分離される所定のタイプの粒子が捕集手段の表面に又は捕集手段の後方に自身で整のうか収集されるように、捕集手段へ向けられている。この捕集手段は、例えば、外部電界を発生する電極手段と誘導液との間に設けられている捕集装置(Auffanganordnun g)によって形成される。捕集手段を誘導液に関連して動かすことが可能である。捕集装置が物質に応じて半透過性を有するのは好ましい。半透過性は、例えば、捕集装置が、誘導液の分子又は誘導液中に溶解したイオンを透過させるが、分離される物質又はタイプの粒子を透過させない（バリア効果）ことを意味できる。半透過性は、比較的小さな粒子寸法を有し、ある種の分離される粒子が透過され、比較的大きな粒子寸法を有する分離される粒子の残りが透過されないように、設定され得る。捕集装置は、好ましくは、分離される粒子から誘導液を分ける。捕集装置の外側で、調整可能なｐＨ値を有する周囲溶液中に、電界を形成するための電極手段が設けられている。本発明は、静止の又は流れる誘導液で実現化され得る。両方の場合とも、捕集装置は、分離されるサンプルを出入れする少なくとも１つの開口部を有するコンパートメント又は容器を形成している。分離作用は、（隣り合う複数の捕集手段に対し場合によっては接線方向に流れる）誘導液中にあるサンプルの位置から捕集手段への粒子の移動通路が出来る限り細く保たれる場合には、特に良好かつ迅速である。捕集装置が、誘導液の流れ方向において、移動通路より著しく大きい特有のディメンションを有するのは好ましい。移動通路、あるいは複数のコンパートメントの内部寸法は、例えばｍｍのオーダかそれ以下である。好ましい実施の形態では、捕集装置は、半透過性又は多孔性の壁を有し、かつ、分離される粒子サンプルと共に誘導液が流れる少なくとも１つの縦長の中空要素（例えば管）である。しかし、他の形状を有する、特に、円形でなく角形の横断面を有する捕集装置も可能である。特に有利なかつ好ましい実施の形態では、捕集装置は、少なくとも部分領域において半透過性である壁を有する少なくとも１つの直線状又は湾曲状の中空繊維からなる。本発明による等電分離は、両性分子又はすべての他の合成の又は生物学的粒子（特に細胞又はウイルス）で実現可能である。これらの粒子は、両性分子のような電気特性、特に、周囲への実効電荷又は電荷密度のｐＨ依存性を有する。適用に応じて、本発明による等電分離は、電界において電荷に応じる動きの変化を被る所定の粒子のタイプを又は動きの状態の変化ない残りの粒子を得ることに向けられることができる。等電式に粒子を分離するための本発明の装置は、分離される粒子が入った誘導液内に電界を形成するための電極手段と、誘導液中のｐＨ値の制御又は調整のために設けられたｐＨ調整手段とを含有する。更に、電極手段と誘導液との間に複数の捕集手段が設けられており、これらの捕集手段は、分離されるタイプの粒子の捕集作用に加えて、調整可能なｐＨ値を有する周囲溶液に対する限定作用を有する。捕集手段は、少なくとも、周囲溶液及び誘導液に溶解されているイオンを、透過させるので、周囲溶液のｐＨ値の調整によって、誘導液のｐＨ値も調整可能又は制御可能である。本発明の好ましい複数の実施の形態は、両性を有する少なくとも１つの粒子タイプを含むサンプル混合物におけるすべての分離過程、及び／又は等電点、滴定曲線又は凝集反応を検出するための一定の物質の調査である。本発明による装置は、誘導液のイオン強度を減少させるため、ｐＨで制御された電気透析の分野に用いられる。本発明による等電式の粒子分離は以下の複数の利点を有する。分画又は分離は、追加の物質なしに、特に、キャリア両性電解質、あるいは、例えばｐＨ勾配を発生させるための他の手段なしに、生じる。ｐＨ勾配が発生されないので、貫れ装置での準備処理が著しく容易になるか、所望の（場合によってはすべての）分離される留分の収集が容易になる。分離又は浄化される留分は、元来の形状から変化することなく、分離後に、更なる操作のために利用され得る。分離された留分は、特に、常に、同じ濃度、場合によっては僅かに低い濃度又は比較的高い濃度の溶液中にある。本発明に係わる装置は、粒子のＩＰに応じて粒子を断続的及び連続的に分離するために、使用可能及び自動化可能である。空間的な分画のみならず、分離過程中のｐＨ値の変化による経時的な分画も可能である。以下に例を挙げて詳述するように、数分の範囲の高い分離速度が生じる。分離装置は最も狭い空間での電極手段の設置を可能にするので、従来の分離法と比較して、充分に高い電界強度が比較的低い電圧で発生され得る。このことによって、本発明に係わる装置のエネルギ消費が減少され、感温性のサンプルの状態を自由にしている。本発明の他の特徴及び利点は、添付の図面を参照した実施の形態の以下の記述から明らかである。図１は、本発明に係わる分離の際に生じる諸力を説明するための原理図である。図２は、本発明に係わるタンパク質の分離を図示する曲線の図である。図３は、本発明に係わる他のタンパク質の分離を図示する曲線の図である。図４は、本発明により達成可能な選択性を説明するモデル計算の曲線の図である。図５は、本発明に係わる他のタンパク質の分離を図示する曲線の図である。図６は、本発明に係わる分離装置の略図である。図７，８及び９は、変更された中空繊維装置の略図である。図１０は、組み合わされた分離・濃縮装置の略図である。図１１は、本発明に係わるマルチコンパートメン装置の略図である。図１２は、本発明に係わる分離装置の変形の実施の形態の略図である。以下の説明は、一例としての、捕集手段が中空繊維によって形成される本発明の装置に関する。しかし、説明される原理は、同様に、他の幾何学的形態の捕集手段のでも実施され得る。更に、本発明は、例として言及されるタンパク質の分離に限定されず、両性を有する任意の粒子又は微粒子で実施され得る。本発明の或る実施の形態（詳細については下記を参照せよ、図６）において、１本の細い中空繊維は、周囲溶液と、少なくとも２つの電極と、複数のｐＨ調整手段とを含む反応空間(Reaktionsraum)を通っている。電極は所定の直流電圧を印加するように設けられている。中空繊維の壁は、半透過性を呈するように、所定の寸法の多数の孔を有する。これら孔の寸法は、溶液（例えば水）と、電流を伝送するイオンとは透過されるが、分離される分子は壁を通過することができないように、選択されている。中空繊維は、例えば、数ミリ乃至数ミクロンの範囲の内径（又は内法の幅又はいわゆるルーメン）を有することができる。ｐＨ調整手段は、周囲溶液のｐＨ値を、知られた従来の方法、例えば電気式又は滴定で制御又は調整するために設けられている。分離されるサンプルは、第２の液体である誘導液と共に、中空繊維のルーメン内を導かれる。誘導液が周囲溶液と同じｐＨ値又は同じイオン組成を有するのは好ましい。この目的のために、誘導液を例えば反応空間から取り出すことができる。しかし、他に、誘導液が異なったｐＨ値を有することもあり得る。中空繊維の、上流端には、分離されるサンプルを誘導液に導入する手段が、中空繊維の、下流端には、検出手段及び／又は捕集手段が設けられている。以下、本発明による分離の際に発生する諸力を図１を参照して説明する。図１は中空繊維１１の部分の略断面図である。一定のｐＨ値と、分離されるサンプル１３ａ，１３ｂ及び１３ｃとを有する誘導液とが中空繊維１１の中を流れる。この中空繊維１１は、２つの直流電圧電極１２ａ，１２ｂの間に配置されており、この結果、誘導液はサンプルと共に電界中を通る。誘導液のｐＨ値に応じて、サンプルは負に帯電した分子１３ａと，正に帯電した分子１３ｂと、帯電していない分子１３ｃとを有する。電界強度(die elektri schen Feldkraene)の作用下で、荷電分子は誘導液の端部に向かって動く。そして、液流の端部で、すなわち、捕集手段として作用する中空繊維の端部で、荷電分子は誘導液と共にさらに先に運ばれることを阻止され、かくして、局所的に固定される。この局所的な固定は、一般的に、誘導液の流れ方向（Ｖｈ）に対し垂直な１つの成分を有する十分に高い電界と、中空繊維の、付着力を増進する（例えば粗いか多孔性の）内面とによって達成され得る。本発明の好ましい実施の形態においては、中空繊維の幾何学的形状と、誘導液の流速とは、図１に示した流れ分布がほぼ放物線状になるように、選択されている。このような流れ分布は、流速が誘導液の中央、つまり、中空繊維の中央で最大であり、両縁に向かって減少するという事実によって特徴付けられている。このような流れ分布は、例えば、中空繊維を通る誘導液の層流の発生の際に、達成される。流速は中空繊維の壁の直ぐ近くではゼロに等しい。この場合、分子は誘導液流の中での先への搬送を完全に阻止される（電子の保留）。誘導液中に支配的なｐＨ値と一致するIＰを有する或る分子は、電気的な実効電荷を有さず、従って、電界によって影響を受けないでいる。かくして、ｐＨ値に応じて、一定のタイプの分子が中空繊維を通って例えば検出器又は捕集器へ導かれるのに対し、荷電粒子は中空繊維の壁において留められる。図２及び３はタンパク質の分離のための実験結果を示している。曲線は、中空繊維の下流端にある検出器によって経時的に記録される吸収値を示している。図２の点１では、タンパク質の一定量が誘導液に供給され、電界の作用なしに、時間の経過（最大限約５分）のうちに検出される。点２では、タンパク質の一定量が再度誘導液に供給されるが、今度は、電界の影響がある。吸収の変化は全然ないか、あるいは測定システムによって引き起こされる僅かなマイナスの吸収の変化がある。何故ならば、タンパク質が留められるからである。電界の停止（点３）後にはじめて、留められたタンパク質は搬送電流に再度供給され、かくして検出される（最大限約２０分）。図３は図２に対応する実験結果を示している。但し、ここでは、タンパク質は周囲溶液又は誘導液のｐＨ値に一致するＩＰを有する。電界の影響のない点１と点２との間に並びに電界の影響のある点２と点３との間に、今度は、タンパク質が実効電荷のない故に影響を受けないでおり、変らずに検出器に達することが明らかになる。電界の停止（点３）の際に、タンパク質の吸収は全然検出されないが、出発サンプル中に含まれる不純物は僅かに検出される。このことは、タンパク質を電界（この電界の経過のうちに不純物がサンプルから引き出された）に通すことによって達成された洗浄効果を示している。ｐＨ値とは異なるＩＰを有するタンパク質の分離（図２に示す）又は不純物の分離（図３に示す）に加えるに、本発明の方法の以下の変更の実施の形態は可能である。周囲溶液の、従って、誘導液のｐＨ値を経時変化させることも可能である。経時変化が中空繊維の長さ又は誘導液の流速に適合されるならば、電界の連続的な影響下でかつｐＨ値の変化によって、複数の成分をサンプルから該成分のＩＰの順に時間的にずれて分離することができる。制御された、キャリアなしのｐＨの変化は、ｐＨスタットを用いて、約０．１乃至０．０１ｐＨ単位の精度で、広範囲に亘って達成され得る。このような経時的な分画の際に、かくして、ｐＨ値が或る時間領域の間に、サンプルの１成分のＩＰに対応するように、ｐＨ値は時間に応じて増減される。この時間領域は、サンプルからその時々の成分を完全に分離することができ、その時々に次の成分からの、中空繊維の内壁上の付着物の空間的な分離を実現化する（物質混合物の分画）ように、選択されている。分子又は粒子の電荷変化のためのｐＨの変化に加えるに、更に、電極間の上記モニターされる直流電流の代わりに、時間及び／又は空間で電界を変調することも可能である。結果は同様にサンプルの分離の最適化である。他の可能性は中空繊維を通る静圧流の変化（流速の変化）である。かくして、中空繊維要素中のサンプルが電界の作用下にある間は、誘導液流を時間につれて制限するか留めることが可能である。本発明に係わる分離方法又は浄化方法の１つの変形は、放された分離される分子の少なくとも一部が通過可能なように中空繊維の半透過性（孔の寸法の選択）が形成されるときに、可能である。誘導液の周囲溶液中で、分離される成分のＩＰに対応するｐＨ値が調整される。サンプルを狭帯として注入した後に又は連続的なサンプルの供給の際に、調整されたｐＨ値に対応しないＩＰを有するすべての成分は、中空繊維のルーメンから壁孔を通って周囲溶液へ動かされる。中空繊維中に留まっていて、浄化された成分は、誘導液流と共に、分離区間の後で捕集される。洗浄された成分の濃度は、中空繊維の壁を通る拡散によって僅かに低くなるが、後置された濃度増大ユニット（図１０参照）によって再度高められ得る。図４は、誘導液のｐＨ値と一致しないＩＰを有する分子に対する電界の作用を説明するためのモデル計算の結果を示している。図表のパラメータは時間、相対的濃度変化ｃ／ｃＯ、及びＩＰとｐＨ値との間の値つまり絶対偏差（ａｂｓ（ｐＨ-ＩＰ））である。ＩＰとｐＨ値との偏差が少しでもあれば、その時々の成分の濃度が、電界の強い作用の故に、短時間のうちにゼロに減少することが理解され得る。連続的な方法では、分離された成分で濃縮される周囲溶液は、同時に、新たな周囲溶液と取り替えられる。図５は、複数の成分を透過する中空繊維による例における、高い分離速度の、実験による証明を示している。連続的なサンプルの流れは中空繊維を通って導かれ、中空繊維の下流端で、電界の影響なしに検出される（点１並びに点２）。電界の印加（点２）後に、タンパク質が、僅かな反応時間（分のオーダ）で、中空繊維から完全に除去される（吸収の減少）。何故ならば、周囲溶液のｐＨ値がタンパク質のＩＰに対応しないからである。図６は、両性分子をＩＰに応じて分離する本発明に係わる分離装置の構造を略示している。中空繊維６１及び２つの電極６２ａ，６２ｂは、反応空間６４内に設けられている。中空繊維及び電極は、互いに平行に延びており、中空繊維は電極同士の間にある。反応空間６４には、周囲溶液６３が充填され、リザーバ６６と接続されている。ｐＨ調整装置６７は、周囲溶液のｐＨ値を調整する。中空繊維の半透過性の故に、誘導液のｐＨ値は、周囲溶液のｐＨ値に従う。少なくとも１つの撹拌手段６５が空間的なｐＨの一様性を保証するために設けられている。前記中空繊維６１の上流端には、誘導液６９を搬送するためのポンプ６８が設けられている。このポンプ６８は、接続手段６１０（例えば接続管）を介して反応空間６４及び／又は別個の液体用リザーバ６１１と接続されている。誘導液を送るためのポンプ６８の代わりに、吸引装置が中空繊維の下流端に設けられることができ、流れ方向への誘導液の必要な運動を引き起こす。サンプル６１２を狭帯として誘導液流に供給することは、配量手段（例えばハミルトン・インジェクタ６１４）を有する３方インジェクタブロック６１３を介して、なされる。しかし、サンプルの供給のために、中空繊維壁にマイクロダクトを設けることもできる。中空繊維の下流端には、中空繊維内の通過後にルーメン中にある複数の物質を同定するための検出ユニット６１５と、液体を中空繊維から留分捕集装置６１７へ制御搬送するための３方コック６１６とが配置されている。検出ユニット６１５は、例えば光学分光測定のための形態とされ得る。中空繊維が紫外線透過ガラスからなるときは、紫外領域での吸収性を有するタンパク質を、直接に中空繊維において検出することができる。ｐＨ値とは異なるＩＰを有する粒子は、繊維内壁に固定される。ｐＨ値に対応するＩＰを有する粒子は、妨げられずに繊維を通過することができる。分離中のｐＨ値の変化によって、個々の留分が分離され、次に、これらの留分は順々に繊維から洗い落とされる。図６に示した装置は、中空繊維の形状に応じて、上記の方法に基づく分離装置としてのみならず浄化装置としても用いることができる。ｐＨ値が異なっている複数の周囲溶液を収容するために反応空間を区分することが可能である。そのときは、電極を相応に断続的及び分割的に制御可能である。図６に示した装置は、複数でカスケード接続され得る。本発明に係わる捕集装置を中空繊維として構成している場合には、誘導液は分離区間の長さより著しく少ない流れ横断面を有する。かくして、中空繊維を間に挟んでいる電極同士を僅かな間隔で配置することができるので、高い電界強度を発生するためには僅かな電圧で十分である。通常の分離装置を例えば１乃至１０Ｖの電圧で作動することができる。このように僅かな電圧の場合、過度の熱の発生及び電解質生成物の発生を避けることができるので、感熱性のサンプルを傷めない。冒頭に記載したｃＩＦＦ技術と比較して、本発明では、電界が印加される区間が、約３桁分減少される。本発明の他の利点は、短い分析時間又は分離時間（約１０分かそれ以下）、貫流装置(Durchflusssystem)内での自動化された持続的な検出の可能性、及び従来のコストのかかるゲル技術又はＩＰＧ-ＩＥＦ技術による取扱易さ、の点にある。更に、本発明により、分離された成分が一時的に保留され、所定の電界又はｐＨの変化後に、再度解放される。本発明による等電分離の他の変更の実施の形態は濃縮処置である。１つ又は複数の成分を含む希釈された溶液は、連続的に中空繊維の中を貫流され、電界の影響に晒される。非等電成分は中空繊維の壁に空間的に固定される。貫流後に、電界は停止され、予め希釈された溶液の総量よりも少ない溶媒量（洗浄量）が中空繊維の中を通過する。洗浄量は壁に固定された分子を離し、かくて、これらの分子は同時に解放され、繊維(Faservolumen)を去り、その結果として、元の希釈された溶液よりも高い濃度の溶液が生じる。他の適用は透析の過程の促進にある。周囲溶液が誘導液よりも少ないイオン強度（イオン濃度）を有するならば、イオンは中空繊維から拡散される。この過程を電界によって強く促進することができる。しかし、示した装置を用いて、或る物質をその等電パラメータによって特徴付けることができる。このことは、特に、イソ酵素の特徴付けの際に、重要である。以下、図６に示した装置の変形例を図７乃至１２を参照して説明する。図７は屈曲された中空繊維７１が反応空間７２内に設けられてなる実施の形態を示している。中空繊維は螺旋状となっている。電極７３ａ，７３ｂは中空繊維の形状に適合されている。図示した実施の形態では、電極７３は、螺旋状横断面を丁度覆う環状電極である。繊維の螺旋形状はサンプルの比較的多い量を同時に分離することを可能にする。何故ならば、サンプルの比較的多い量を、流速がゼロである壁領域（図１を参照）に、留めることができるからである。微量調製の規模では、このことはサンプルの連続的供給を可能にする。図８は、同様に、シリンダ状の形状の電極８２ａに巻回されている螺旋状の形状の中空繊維８１を示している。対電極８２ｂ（点線で示す）を、例えば中空シリンダとして、装置に亘って押し被せることができる。周囲溶液は電極同士の間にあるギャップを貫流する。図８に示す装置は高い電荷能力又は分離能力並びに僅かな所要面積及び低い電圧を特徴とする。これまで別個の構成要素として記述された電極及び捕集手段を、図９に示すように、互いに結合することもできる。図９は中空繊維９１及び電極９２ａ，９２ｂの横断面を示している。これらの電極は薄層として中空繊維の外壁に取り付けられている。かくして、高い電界強度を得るために、一層少ない電圧が調整される。周囲溶液は、中空繊維の、自由になっている領域を介して、中空繊維の内部に影響を及ぼす。しかし、本発明に記載の装置を周囲溶液なしに作動することも可能である。図１０は、分離装置（中空繊維及び電極１０２ａ，１０２ｂを有する反応空間１０１）と、濃度増大装置１０４との組み合わせを示している。このような組み合わされた装置は、まず分離領域において物質混合物の本発明による分留がなされるように、作動される。濃度増大装置１０４（そこの周囲溶液１０５は分離領域における周囲溶液１０３とは異なるｐＨ値を有する）では、洗浄された留分は狭帯として電極１０６ａ，１０６ｂによって固定され、これらの電極における電界の停止後に、濃縮された留分として、留分捕集手段１０７に供給されることができる。図１１に示したマルチコンパートメントシステムは、その時々の反応空間内の周囲溶液１１４を流れるようにする逆流原理を実現化している。流れ方向が中空繊維１１２内の流れ方向と逆であることは好ましい。場合によっては電極１１１ａ，１１１ｂに生じる電解質生成物を捕集するために、膜１１３ａ，１１３ｂを電極と中空繊維１１２との間に取着する。周囲溶液の流動性は反応空間内でのｐＨ安定化に役立つ。本発明によれば、誘導液が流れを有することは絶対必要という訳ではない。誘導液は静止していることもできる。捕集手段を誘導液に対して動かすことも可能である。このことは図１２に示されている。室１２３はタンパク質混合物で充填されており、流れ透析膜１２２によって区画されている。室１２３はｐＨが調整された領域１２４へもたらされる。電界が電極１２５ａ，１２５ｂを介して印加されると、個々のタンパク質は本発明の原理に基づいて膜１２２へ移動する。これらの膜は、分離されたタンパク質に覆われた後に矢印の方向に引き出される可動のタンパク結合中間膜を有することができる。他に、分離されたタンパク質を膜領域から洗い落とすために、溶離液流(Elutionsstrom)を矢印方向に供給することも可能である。本発明では、分離装置が、カスケード状に設けられた複数の捕集手段あるいは直列又は平行に設けられた複数の分離領域を有することもできる。捕集手段を、記述した中空繊維による代わりに、任意の多孔性の膜又は薄層によっても形成することができる。これらの膜又は薄層は誘導液を収容するための対応の複数のコンパートメントを形成し、コンパートメントの隣には複数の電極手段が設けられている。捕集手段（例えば中空繊維）の半透過性は、その長さに亘って貫流方向を変更することができるので、誘導液及び／又は周囲溶液の区域毎に一定のイオン及び／又は一定の分子のみが透過させられる。更に、電界の作用を変えるために、中空繊維の内壁を化学的又は物理的な方法で改質することが可能である。中空繊維の内部にゲル、微粒子懸濁液又は粒質物を充填すること、又は反応空間にゲルを加えることが可能である。中空繊維を一定の間隔で任意の形状の電極の回りに巻回し、対電極をこの形状に適合させることが可能である。複数の捕集手段を、誘導液が全体に貫流する多数の中空繊維からなるマルチ繊維アレイによって形成されることができる。しかし、繊維内の貫流は異なった速度でなされるので、分離効率は物質に応じて影響を受けることができる。直流電圧又は交流電圧又は自由にプログラグ可能な電圧を少なくとも２つの電極に印加することができるので、これに応じて、誘導液中の電界強度が変えられる。このことによって、捕集手段の表面に所定の分離パタンを形成することができる。複数の電極は、場合によっては生じる電解反応を減少させるために、以下の如く改質された表面又は改質された物質を有することができる。電極は多孔性に設計されているか、複数の層（例えばゲル、スペーサ）を有することができる。捕集手段を、誘導液用のコンパートメントを形成する平坦な膜によって囲繞さすることができる。コンパートメントは、種々のタンパク分留を収容するために設けられている他の膜によって区分されていることができる。このような装置では、分離されるべきサンプルの供給を、サンプルを吸収してしまう膜の採用（導入）によって、実現化することができる。本発明の分離装置の特別な利点は分離装置の小形化にある。従って、好ましい実施の形態では、複数の電極の少なくとも複数の部分を、トランジスタ又はダイオードのような電子素子によって形成しかつ起動させ、電極、ダクト、中空繊維ホルダ及び反応空間の３次元装置を、半導体構造化の技術を用いて製造すること、が規定されている。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１０月１６日（１９９８．１０．１６）【補正内容】請求の範囲１．周囲のｐＨ値に依存する実効電荷又は電荷密度を有する粒子を案内液中で電界に晒し、これによって、案内液のｐＨ値を調整して、粒子の少なくとも１つの所定のタイプが、電界強さの作用下で、電荷に応じた動きの変化を被る、粒子を等電式に分離する方法において、動きの変化を被る前記粒子のタイプを、電界強さによって、案内液に隣り合いかつ電荷粒子の取外し可能な固定のために設けられている捕集手段（１１，６１，７１，８１，９１）へと移動させること、を特徴とする方法。２．前記移動された粒子のタイプは、案内液のｐＨ値と一致しない等電点を有する粒子を含んでいる、請求項１に記載の方法。３．案内液及び前記捕集手段を互いに相対的に動かす、請求項１又は２に記載の方法。４．前記捕集手段は、分離される粒子と共に案内液が付近を流れてなる少なくとも１つの多孔性の壁を有する、請求項３に記載の方法。５．電界強度を、少なくとも部分的に流れ方向に沿って前記多孔性の壁の長さに亘って延びる電極手段によって発生し、これによって、分離される粒子と共に案内液が前記多孔性の壁の中を流れる間に、流速、ｐＨ値及び／又は前記電極手段の電界を変える、請求項４に記載の方法。６．前記分離される粒子として、両性分子又は他の粒子、合成粒子又は生物細胞、ウイルス、又は、両性分子の電気特性に対応する電気特性を有する他の生物学的対象を、案内液に供給する、請求項１乃至５のいずれか１に記載の方法。７．案内液を洗浄するために、案内液から除去されるべき粒子を、前記捕集手段によって案内液から移動させる、請求項目２乃至６のいずれか１に記載の方法。８．分離される粒子が電界強度に晒されているとき、案内液の流速を少なくとも一時的に減少し又はゼロに低下する、請求項４乃至７のいずれか１に記載の方法。９．分離される粒子を含むサンプル及び／又は案内液を、前記多孔性の壁に形成されたマイクロダクトを介して供給する、請求項４乃至８のいずれか１に記載の方法。１０．粒子を案内液に供給する際に共に用いるサンプル溶液の、案内液の、及び／又は周囲溶液のｐＨ値を、所定のｐＨ勾配が前記捕集手段に形成されるように、独立に調整する、請求項１乃至９のいずれか１に記載の方法。１１．分離される粒子を案内液に供給してなるサンプル溶液の及び／又は案内液のｐＨ値を、周囲溶液を用いた拡散交換過程によって調整する、請求項１乃至９のいずれか１に記載の方法。１２．案内液のｐＨ値に依存する実効電荷又は電荷密度を有する粒子を含む案内液内に電界を形成する電極手段（１２ａ，ｂ，６２ａ，ｂ，７３ａ，ｂ，８２ａ，ｂ，９２ａ，ｂ，１０２ａ，ｂ，１１１ａ，ｂ，１２５ａ，ｂ）を具備する、粒子を等電式に分離するための装置において、案内液中の粒子のうちの、粒子の少なくとも１つの所定のタイプが、電界強さの作用下で、電荷に応じた動きの変化を被るように、案内液のｐＨ値を調整するために設置されたｐＨ調整手段（６７）と、前記電極手段と、粒子を含む案内液との間に配置され、電荷粒子の取外し可能な固定のために設けられている捕集手段（１１、６１、７１、８１、９１）と、を具備すること、を特徴とする装置。１３．前記捕集手段は案内液を収容するかあるいは案内液流を導くための少なくとも１つのコンパートメントを形成する、請求項１２に記載の装置。１４．前記捕集手段は半透過性又は多孔性の壁を有する、請求項１２又は１３に記載の装置。１５．前記捕集手段は、多孔性の壁及び／又は多孔性の膜又は薄層を有する少なくとも一つの中空繊維によって形成される、請求項１２乃至１４のいずれか１に記載の装置。１６．前記捕集手段は、前記電極手段と共に、前記ｐＨ調整手段で調整可能なｐＨ値を有する周囲溶液を含む反応空間に設けられている、請求項１２乃至１５のいずれか１に記載の装置。１７．壁の透過性は、前記壁が、少なくとも区域毎に、案内液及び周囲溶液の所定のイオン、及び／又は分離される粒子のうちの少なくとも１つの粒子のタイプのみを透過するように、案内液が貫流する領域に沿った壁に形成された孔の寸法及び／又は形状の変化によって変えられる、請求項１４乃至１６のいずれか１に記載の装置。１８．前記捕集手段は、案内液に向いた側において、分離される粒子を保持又は収容するために設けられた改質層を有する、請求項１２乃至１７のいずれか１に記載の装置。１９．前記改質層はゲル、微粒子懸濁液及び／又は粒質物によって形成される、請求項１８に記載の装置。２０．前記電極手段は、案内液から離隔した側に案内液の流れ方向に沿って前記捕集手段に設けられている複数の電極を有する、請求項１２乃至１９のいずれか１に記載の装置。２１．時間的及び空間的に可変の電圧降下が形成されるように、前記電極を選択的に起動することができる制御手段が設けられている、請求項２０に記載の装置。２２．前記捕集手段は、所定の間隔をあけて前記電極のうちの少なくとも１つの回りにコイルのように巻回されている中空繊維によって形成される、請求項２０に記載の装置。２３．前記電極は、前記捕集手段の、案内液から離隔した面に、固定されており、その表面を少なくとも部分的に覆う、請求項２０に記載の装置。２４．前記電極手段と、前記捕集手段と、案内液を導くコンパートメントとを夫々に含む多数の分離領域は、カスケード状に、直列に又は平行に接続されている、請求項２０乃至２３のいずれか１に記載の装置。２５．分離される分子の洗浄された留分及び１／又は洗浄された案内液を得るべく、粒子の少なくとも１つのタイプを案内液から分離するための、等電点の、滴定曲線の又は凝集反応の検出のような、物質の電気特性及び熱力学的特性を検出するための、粒子溶液又は粒子懸濁液の濃度を高めるための、又は案内液のイオン強度を減少させるための、１２乃至２４のいずれか１に記載の装置の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．周囲のｐＨ値に依存する実効電荷又は電荷密度を有する粒子を、複数の捕集手段に隣り合う誘導液中で、電界に晒し、これによって、誘導液のｐＨ値を調整して、粒子の少なくとも１つの所定のタイプが、電界強さの作用下で、電荷に応じた動きの変化を被り、荷電粒子の取外し可能な固定のために設けられている捕集手段へと移動される、粒子を等電分離する方法。２．前記移動された粒子のタイプは、誘導液のｐＨ値と一致しない等電点を有ずる粒子を含んでいる、請求項１に記載の方法。３．誘導液及び前記捕集手段を互いに相対的に動かす、請求項１又は２に記載の方法。４．前記捕集手段は、分離される粒子と共に誘導液が付近を流れてなる少なくとも１つの多孔性の壁を有する、請求項３に記載の方法。５．電界強度を、少なくとも部分的に流れ方向に沿って前記多孔性の壁の長さに亘って延びる電極手段によって発生し、これによって、分離される粒子と共に誘導液が前記多孔性の壁の中を流れる間に、流速、ｐＨ値及び／又は前記電極手段の電界を変える、請求項４に記載の方法。６．前記分離される粒子は両性分子又は他の粒子、合成粒子又は生物細胞、ウイルス、又は、両性分子の電気特性に対応する電気特性を有する他の生物学的対象を含む、請求項１乃至５のいずれか１に記載の方法。７．誘導液を洗浄するために、誘導液から除去されるべき粒子を、前記捕集手段によって誘導液から移動させる、請求項目２乃至６のいずれか１に記載の方法。８．分離される粒子が電界強度に晒されているとき、誘導液の流速を少なくとも一時的に減少し又はゼロに低下する、請求項４乃至７のいずれか１に記載の方法。９．分離される粒子を含むサンプル及び／又は誘導液を、前記多孔性の壁に形成されたマイクロダクトを介して供給する、請求項４乃至８のいずれか１に記載の方法。１０．粒子を誘導液に供給する際に共に用いるサンプル溶液の、誘導液の、及び／又は周囲溶液のｐＨ値を、所定のｐＨ勾配が前記捕集手段に形成されるように、独立に調整する、請求項１乃至９のいずれか１に記載の方法。１１．分離される粒子を誘導液に供給してなるサンプル溶液の及び／又は誘導液のｐＨ値を、周囲溶液を用いた拡散交換過程によって調整する、請求項１乃至９のいずれか１に記載の方法。１２．誘導液のｐＨ値に依存する実効電荷又は電荷密度を有する粒子を含む誘導液内に電界を形成する複数の電極手段と、誘導液中の粒子のうちの、粒子の少なくとも１つの所定のタイプが、電界強さの作用下で、電荷に応じた動きの変化を被るように、誘導液のｐＨ値を調整するために設置された複数のｐＨ調整手段と、前記電極手段と誘導液との間に配置され、荷電粒子の取外し可能な固定のために設けられている複数の捕集手段と、を具備する、粒子を等電分離するための装置。１３．前記捕集手段は誘導液を収容するかあるいは誘導液流を導くための少なくとも１つのコンパートメントを形成する、請求項１２に記載の装置。１４．前記捕集手段は半透過性又は多孔性の壁を有する、請求項１２又は１３に記載の装置。１５．前記捕集手段は、多孔性の壁及び／又は多孔性の膜又は薄層を有する少なくとも１つの中空繊維によって形成される、請求項１２乃至１４のいずれか１に記載の装置。１６．前記捕集手段は、前記電極手段と共に、前記ｐＨ調整手段で調整可能なｐＨ値を有する周囲溶液を含む反応空間に設けられている、請求項１２乃至１５のいずれか１に記載の装置。１７．壁の透過性は、前記壁が、少なくとも区域毎に、誘導液及び周囲溶液の所定のイオン、及び／又は分離される粒子のうちの少なくとも１つの粒子のタイプのみを透過するように、誘導液が貫流する領域に沿った壁に形成された孔の寸法及び／又は形状の変化によって変えられる、請求項１４乃至１６のいずれか１に記載の装置。１８．前記捕集手段は、誘導液に向いた側において、分離される粒子を保持又は収容するために設けられた改質層を有する、請求項１２乃至１７のいずれか１に記載の装置。１９．前記改質層はゲル、微粒子懸濁液及び／又は粒質物によって形成される、請求項１８に記載の装置。２０．前記電極手段は、誘導液から離隔した側に誘導液の流れ方向に沿って前記捕集手段に設けられている複数の電極を有する、請求項１２乃至１９のいずれか１に記載の装置。２１．時間的及び空間的に可変の電圧降下が形成されるように、前記電極を選択的に起動することができる制御手段が設けられている、請求項２０に記載の装置。２２．前記捕集手段は、所定の間隔をあけて前記電極のうちの少なくとも１つの回りにコイルのように巻回されている中空繊維によって形成される、請求項２０に記載の装置。２３．前記電極は、前記捕集手段の、誘導液から離隔した面に、固定されており、その表面を少なくとも部分的に覆う、請求項２０に記載の装置。２４．前記電極手段と、前記捕集手段と、誘導液を導くコンパートメントとを夫々に含む多数の分離領域は、カスケード状に、直列に又は平行に接続されている、請求項２０乃至２３のいずれか１に記載の装置。２５．分離される分子の洗浄された留分及び１／又は洗浄された誘導液を得るべく、粒子の少なくとも１つのタイプを誘導液から分離するための、等電点の、滴定曲線の又は凝集反応の検出のような、物質の電気特性及び熱力学的特性を検出するための、粒子溶液又は粒子懸濁液の濃度を高めるための、又は誘導液のイオン強度を減少させるための、１２乃至２４のいずれか１に記載の装置の使用。