JP2001503509A

JP2001503509A - アルツハイマー病の治療のための薬のスクリーニング

Info

Publication number: JP2001503509A
Application number: JP54178697A
Authority: JP
Inventors: ゴーダート，マイケル; ジェイクス，ロス; スピランティニ，マリア・グラジア; 成人長谷川; スミス，マイケル・ジョン; クラウザー，リチャード・アンソニー
Original assignee: メディカル・リサーチ・カウンシル
Priority date: 1996-05-23
Filing date: 1997-05-20
Publication date: 2001-03-13
Also published as: DE69719978D1; GB9610829D0; PT901633E; EP0901633B1; ES2194198T3; DE69719978T2; WO1997044669A1; US6245575B1; EP0901633A1; DK0901633T3; ATE235058T1

Abstract

(57)【要約】アルツハイマー病の治療において使用できる可能性のある薬をスクリーニングする方法は、薬が存在する状態においてタウ蛋白質を適当な条件の下で適当な硫酸化炭水化物と反応させてフィラメントを形成することと、フィラメントの有無をモニタすることとを含む。タウ蛋白質と硫酸化炭水化物、たとえば硫酸化グリコサミノグリカン、とは適当な条件の下で反応し、対をなすらせん状フィラメントまたはストレートフィラメントのいずれかを形成する。スクリーニングされる薬が存在する状態において反応が実行される際にフィラメント形成に影響が出た場合、これはその薬の干渉、阻害および遮断効果によるものである可能性がある。インビトロでＰＨＦのアセンブリを阻害する薬はインビボでも阻害効果を有する可能性があるため、アルツハイマー病の痴呆の進行を遅らせる上で治療的価値を秘めている。すなわち、この発明はアルツハイマー病の治療において使用するためにさらに研究する価値のある薬を識別するためのスクリーニングを提供できる。

Description

【発明の詳細な説明】名称：アルツハイマー病の治療のための薬のスクリーニング発明の分野この発明はアルツハイマー病の治療のための薬をスクリーニングすることに関し、アルツハイマー病の治療において使用できる可能性のある薬をスクリーニングする方法に関する。発明の背景アルツハイマー病は老人の痴呆の主たる原因である。アルツハイマー病の患者の脳は、斑およびもつれとして知られる特徴的な構造上の損傷を含んでいる。斑についてはここでは考慮しない。神経細線維のもつれとは、対をなすらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の細胞内の蓄積を表わし、これはニューロンの細胞骨格の正常な構成要素のいずれともかなり異なっている。もつれは病変細胞が死ぬと細胞外に現れる。ＰＨＦはまた、神経炎斑に関連のある異常ニューライトに見られ、脳の病変領域全体にわたる細い神経網糸の広範囲の分布として見られる。死後見られる神経細線維の変性の範囲は生前に観察された痴呆の程度の最も信頼のおける病理学的相関現象であるように思われる。これらのトピックに関しては参考文献１および２にさらに詳しく記述されている。ＰＨＦは、高リン酸化状態にある、微小管に関連する蛋白質タウからできている（３−８）。タウの高リン酸化により、タウが微小管に結合できなくなることが知られており（９，１０）、タウの高リン酸化はＰＨＦアセンブリより先に起こると考えられている（１１）。しかしながら、ＰＨＦ形成のためにタウを高リン酸化することが必要であるか、またはそれだけで十分であるかということははっきりしていない。こうした理解の欠如の主な理由は、これまでインビトロでもインビボでも完全長のタウ蛋白質のための対をなすらせん状フィラメントを形成することが不可能であったためである。タウ蛋白質は成人のヒトの脳において６つのイソ型からなり、交互のｍＲＮＡスプライシングにより単一の遺伝子から生じる。大きさが３５２から４４１のアミノ酸の範囲内であるイソ型は、カルボキシル末端の方に、３１または３２のアミノ酸からなる３つまたは４つの相同鎖を備えた縦列反復領域を含む。他のイソ型は、蛋白質のアミノ末端半分における２９の、または５８のアミノ酸挿入物の存在により生成される。タウの反復領域は微小管結合ドメインを表わし、蛋白質のアミノ末端半分は微小管の表面からの腕状突起を形成するように見える。タウ蛋白質が高リン酸化状態（ＰＨＦ−タウ）である場合、蛋白質は微小管に結合できず、ＰＨＦまたはその構造上の変形でストレートフィラメント（ＳＦ）として知られる形に集まる。タウの反復領域は生じるフィラメントのコアを構成する。タウ蛋白質についてのさらなる記述に関しては参考文献３１および３２を参照されたい。この発明は、生理的条件の下で実質的に定量的な態様で、適当な硫酸化炭水化物によりインビトロで、アルツハイマー病で見られるようなフィラメントの形にタウ蛋白質が集まるよう誘導することができるという発見に基づいている。この発見は、アセンブリを阻害する薬に対するインビトロでのアッセイまたはスクリーニングの基礎をなし、そしてアルツハイマー病の治療に使用できる可能性がある。発明の概要よってこの発明は、薬が存在する状態で適当な条件下においてタウ蛋白質を適当な硫酸化炭水化物と反応させてフィラメントを形成することと、フィラメントの存在をモニタすることとを含む、アルツハイマー病の治療において使用できる可能性のある薬をスクリーニングする方法を提供する。タウ蛋白質と硫酸化炭水化物、たとえば硫酸化グリコサミノグリカン、とは適切な条件下で反応して、対をなすらせん状フィラメントまたはストレートフィラメントのいずれかを形成する。スクリーニングされる薬が存在する状態でその反応が実行される際にフィラメント形成に影響が出た場合、これはその薬の干渉、阻害または遮断効果によるものである可能性がある。インビトロでＰＨＦのアセンブリ（会合または集合）を阻害する薬は、インビボでも阻害効果を有する可能性があるためアルツハイマー病の痴呆の進行を遅らせる上で治療的価値を秘めている。すなわち、この発明はアルツハイマー病の治療において使用するためにさらに研究する価値のある薬を識別するためのスクリーニングを提供できる。タウ蛋白質は、完全長の蛋白質またはフィラメントを形成するそのフラグメントであってもよい。タウのフィラメント形成フラグメントは一般的に、３つの微小管結合反復を含む部分を少なくとも含んでいる。上記のとおり、成人のヒトの脳に生じる６つのイソ型のうちのいずれを用いてもよい。上述のようにアルツハイマー病の患者の脳に見られる対をなすらせん状フィラメントに非常に類似した対をなすらせん状フィラメントを形成する完全長の３反復３８１アミノ酸イソ型がうまく働くため、目下有望視されている。フィラメント形成に顕著な影響を及ぼさずにアミノ酸を付加し、置換し、および／または欠失することによりタウ蛋白質を公知の態様で部分変更してもよい。用語「タウ蛋白質」は適当な条件下でフィラメントを形成するすべての蛋白質およびフラグメントを含む意味で用いられる。現在好まれている硫酸化炭水化物は硫酸化グリコサミノグリカンであり、好都合にはヘパリンまたはヘパラン硫酸である。反応は生理的条件下で、たとえば以下に説明するように試薬をＭＯＰＳおよびＡＥＢＳＨＦ中でインキュベートすることにより実行してもよく、定量的な結果が得られる。３０ｍＭＭＯＰＳ、１ｍＭＡＥＢＳＦ、ｐＨ７．４で３０℃ においてインキュベートすることにより良好な結果が得られており、フィラメント形成は５時間後に開始し、４８時間後に最大となる。タウ濃度は適当には少なくとも４０μＭであり、タウ／硫酸化グリコサミノグリカンのモル比はほぼ４：１で良好な結果が得られる。フィラメントの存在（または不在）は電子顕微鏡検査法または他の適当な方法を用いてモニタできる。この発明はさらに、添付の図面に関連して、以下の例において例示により説明される。図１は、ヒトのタウの３つの反復を含んだ３８１アミノ酸イソ型（ｈｔａｕ３７）（図１Ａ）、ヒトのタウの４つの反復を含んだ４４１アミノ酸イソ型（ｈｔａｕ４０）（図１Ｂ）およびＮＣＬＫでリン酸化したｈｔａｕ３７（図１Ｃ）からなる、硫酸化グリコサミノグリカンに誘導されるフィラメントアセンブリの一連の電子顕微鏡写真である。図１Ｃでの目盛線は１００ｎｍである。図２は、アミノ末端（抗血清１３３）（図２Ａ）、カルボキシ末端（抗血清１３４）（図２Ｂ）および微小管結合反復（抗血清１３５）（図２Ｃ）に対する抗体で標識されたヒトのタウの対をなすらせん状フィラメントの一連の電子顕微鏡写真である。図２Ｃでの目盛線は１００ｎｍである。図３Ａは、異なる濃度のＮａＣｌを含む緩衝液でヘパリン−セファロースカラムから溶離されるアリコートの電気泳動ゲルを示し、タウ蛋白質のヘパリン−セファロースへの結合を示す。図３Ｂは、微小管結合タウ（％）対ヘパリン（ｍｇ／ｍｌ）のグラフであり、タウの微小管への結合に対するヘパリンの効果を示す。図３Ｃは、（３５０ｎｍにおける）濁度対時間のグラフであり、（２０分間のインキュベーションの後）ヘパリンを添加することの、タウで促進される微小管アセンブリに対する効果を示す。図４は、茶色に染色された抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４で標識されるアルツハイマー病の脳の海馬構成物の組織切片（写真Ａ）と、青色に染色されたリン酸化依存性の抗タウ抗体ＡＴ８と１０Ｅ４とで標識される二重染色した脳の海馬構成物の組織切片（写真Ｂ−Ｆ）との一連の写真である。目盛線は、（Ａ）において４５μＭ、（Ｂ）において３４μＭ、（Ｃ）において３０μＭ、（Ｄ）および（Ｅ）において２４μＭ、ならびに（Ｆ）において４０μＭである。例１タウのリン酸化を刺激するために硫酸化グリコサミノグリカンを用いて実験を行なった。タウ蛋白質イソ型（ヒトのタウの３つの反復を含んだ３８１アミノ酸イソ型（ｈｔａｕ３７）およびヒトのタウの４つの反復を含んだ４４１アミノ酸イソ型（ｈｔａｕ４０））は（２８）に記述されるようにＥ．ｃｏｌｉで発現された。タウの精製のために、１０Ｌ細菌培養物からの凍結ペレットを、２４０ｍｌの５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭＤＴＴ，０．１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）（緩衝液Ａ）中で再懸濁し、氷の上で５×１分にわたって超音波処理した。遠心した後、上清をＤＥ−５２カラム（４×４ｃｍ）に通して濾過し、濾過された画分を、緩衝液Ａ中で平衡させたホスホセルロースカラムにかけた。０．１ＭＮａＣｌを含む緩衝液Ａで洗浄した後、０．１Ｍ−０．５ＭＮａＣｌ勾配を適用し、タウを含む画分を硫酸アンモニウムを添加することにより５０％に濃縮した。その沈殿物を５０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６．２５、０．１ｍＭＤＴＴ、０．１ｍＭＰＭＳＦ（緩衝液Ｂ）中で可溶化し、緩衝液Ｂ中で平衡させたＳ−２００カラム（１．３×１００ｃｍ）にかけた。緩衝液Ｂ中で平衡させたモノ（Ｍｏｎｏ）Ｓカラムにタウを含む画分を適用し、塩勾配を用いて溶離した。ピーク画分を高速真空により濃縮し、４０ｍＭヘペス（Hepes）、ｐＨ７．４、０．１ｍＭＤＴＴ、０．１ｍＭＰＭＳＦに対して透析した。タウの精製はＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニタされた。精製されたｈｔａｕ３７およびｈｔａｕ４０（８０μＭ）を、３０℃において４８時間の間、２５μｌの３０ｍＭ３−［Ｎ−モルホリノ］プロパン−スルホン酸（ＭＯＰＳ）、１ｍＭ［４−（２−アミノエチル）フッ化ベンゼンスルホニル］（ＡＥＢＳＦ、Ca1biochem）、ｐＨ７．４中ヘパリン（２０μＭ、ＢＤＨ）とともにインキュベートした。アリコートを取出し、（７）に説明されるように電子顕微鏡検査法で調べた。いくつかの場合、ヘパリンを添加する前にｈｔａｕ３７を５Ｕ／ｍｌの組換ニューロンのｃｄｃ２様キナーゼ（ＮＣＬＫ）でリン酸化した（２９）。結果は図１に示される。図１に示されるように、電子顕微鏡検査法によって数多くのフィラメントの存在が明らかになり、タウのイソ型の形態は微小管結合反復を３つ含むかまたは４つ含むかで異なっていた。３つの反復を含むタウのイソ型では、典型的な対をなすらせん状形態を有するフィラメントが得られ（図１Ａ）、４つの反復を含むタウのイソ型では、真っ直ぐの外観を有するフィラメントが得られた（図１Ｂ）。ヘパリン（またはヘパラン硫酸）とインキュベートする前にｐ４２マイトジェン活性化蛋白質（ＭＡＰ）キナーゼまたはＮＣＬＫによりリン酸化されたタウ蛋白質が形成したフィラメントは、非リン酸化タウにより形成されたものと区別がつかず、このことからタウのリン酸化はインビトロでのフィラメント形成に刺激を与えるものでも阻害するものでもないことが示された（図１Ｃ）。同じ形態のフィラメントが硫酸化グリコサミノグリカンおよびｐ４２ＭＡＰキナーゼまたはＭＣＬＫを用いるタウの共同インキュベーションにおいて形成された。最適のタウおよびヘパリン濃度において、対をなすらせん状フィラメントは３０ｍＭＭＯＰＳ、１ｍＭＡＥＢＳＦ、ｐＨ７．４中で３０℃において約５時間後に形成し始め、４８時間後に最大数に達した。フィラメント形成は臨界タウ濃度を要し、タウ／硫酸化グリコサミノグリカンの比が非常に重要である。対をなすらせん状のフィラメントおよびストレートフィラメントは４０μＭを超えるタウ濃度において形成され、タウ／硫酸化グリコサミノグリカンのモル比はほぼ４：１であった。こうした特徴はフィラメント形成が核形成依存性プロセスであることを示しており、これによって、硫酸化グリコサミノグリカンへのタウの結合が、整った核の形成につながり、この整った核のおかげでタウのフィラメントの成長が起こる。フィラメントの形態ではなくその数がグリコサミノグリカンの硫酸化の程度と相関しており、最大数はタウをヘパリンとインキュベートした後に得られ、ヘパラン硫酸とインキュベートした後のその数はより少なかった。コンドロイチン硫酸およびデルマタン硫酸で得られたフィラメントの数は最も少なく、ヒアルロン酸ではフィラメントは全く得られなかった。同様に、ポリ−Ｌ− グルタミン酸とタウをインキュベートした後にはフィラメントは得られず、このことはフィラメント形成が単純な電荷相互作用によって生じるのではないことを示している。ＭＡＰキナーゼまたはＭＣＬＫでリン酸化されているか否かにかかわらず、単独のタウ蛋白質ではフィラメントが観察されなかった。単独の硫酸化グリコサミノグリカンでもフィラメントは形成されなかった。タウのイソ型とさまざまな市販品のヘパラン硫酸またはヘパリンとを用いて行なった、ヘパリンの分子質量が５から３０ｋＤａの範囲内である、５０を超える別個の実験からも同様の結果が得られた。すなわち、この結果からタウはグリコサミノグリカンには依存するがリン酸化には依存しない態様でフィラメントを形成することが示されている。さらに、タウはインビトロで生理的条件下で定量的な態様でフィラメントを形成できる。例２組換ｈｔａｕ３７（８０μＭ）を、３０℃において４８時間の間、３０ｍＭＭＯＰＳ、１ｍＭＡＥＢＳＦ、ｐＨ７．４中でヘパリン（２０μＭ）とインキュベートした。３４６，０００×ｇにおける１時間の遠心の後、フィラメントペレットを３０ｍＭＭＯＰＳ、１ｍＭＡＥＢＳＦ、ｐＨ７．４中で再懸濁し、（７）に説明されるように、免疫電子顕微鏡検査法のために、タウのアミノ末端（抗血清１３３）、カルボキシ末端（抗血清１３４）および微小管結合反復領域（抗血清１３５）に対する抗体を用いて処理した。結果は図２に示される。金標識は１３３および１３４には見られるが、１３５には見られない。すなわち、対をなすらせん状フィラメントはタウのアミノおよびカルボキシ末端に対する抗体によって修飾されたが、微小管結合反復領域に対する抗体によっては修飾されなかった。こうした結果は、フィラメントにおいてタウの反復領域に抗体が接近することができないことを示すが、こうした結果は以前にアルツハイマー病の脳からのＰＨＦにより得られたものと同じであり（７）、すなわち、この２種類のフィラメントにおけるタウ分子の構成が類似していることを示している。ヘパリンが存在している状態では、６つの組換ヒト脳タウのイソ型の各々は対をなすらせん状フィラメントまたはストレートフィラメントのいずれかを形成した。３つまたは４つの微小管結合反復のみからなるタウ蛋白質と、タウのカルボキシ末端および反復領域からなる蛋白質とからも同様の結果が得られた。これと比較して、反復領域を除いた反復領域までのタウのアミノ末端半分からなる蛋白質からはフィラメントが得られなかった（データは示さず）。こうした実験結果から、タウの微小管結合反復領域が、硫酸化グリコサミノグリカンに誘導されるフィラメント形成にとって欠くことのできないものであることが確証される。タウの３つの微小管結合反復がアルツハイマー病の脳からのＰＨＦのコアを形成することは周知であり（４，１５）、このことも２種類のフィラメントの構成が類似していることの証拠を裏付けている。硫酸化グリコサミノグリカンが存在する状態で形成されたタウフィラメントのねじれはアルツハイマー病のフィラメントと比べて概してより不規則ではあったが、タウフィラメントの寸法はアルツハイマー病の脳のフィラメントの寸法に類似しており、ねじれたフィラメントの直径は約２０ｎｍであり、ストレートフィラメントでは１５ｎｍであり、対をなすらせん状フィラメントでは交差間隔は約８０ｎｍであった。例３タウのヘパリン結合特性をヘパリン−セファロースとのインキュベーションの後に調べた。６つの組換ヒト脳タウのイソ型の６０μｇの等混合物または２０μｇのウシの脳のチューブリン（Cytoskeleton，Inc.）を、３０ｍＭＭＯＰＳ、ｐＨ７．４中４．５×８ｍｍヘパリン−セファロース（Pharmacia）カラムにかけた。０（フロースルー、ｆ．ｔ．）、０．１５Ｍ、０．３Ｍ、０．５Ｍおよび１．０ＭのＮａＣｌを含む１０カラム容積の緩衝液を用いて溶出を行なった。アリコートをＳＤＳ−ＰＡＤＧにかけ、クーマシーブルーで染色した。この結果は図３Ａに示される。６つの組換タウのイソ型がヘパリン−セファロースに塩依存の態様で結合し、０．３−０．５ＭのＮａＣｌで溶離したことが示される。３つまたは４つの反復のみからなるタウ蛋白質、または反復領域およびカルボキシ末端を含むタウ蛋白質もまたヘパリン−セファロースに結合し、反復領域を除いた反復領域までのタウのアミノ末端半分からなる蛋白質も同様に結合した（データは示さず）。このことは、複数のヘパリン結合部位がタウ配列全体に分布していることを示している。同様に、ｐ４２ＭＡＰキナーゼまたはＮＣＬＫでリン酸化される組換タウはヘパリン−セファロースに結合でき、これはリン酸化がタウのヘパリンに結合する能力を顕著に妨げなかったことを示している。この結合はおそらく、ヘパリン中の負の電荷とタウ中の正の電荷との間の静電相互作用を介して行なわれたと考えられる。タウは反復領域および反復の上流側の領域において正に帯電しており、アミノ末端の１２５のアミノ酸は負に帯電している。次に、微小管に結合し微小管アセンブリを促進させるタウの能力に対するヘパリンの影響を調べるための実験を行なった。チューブリンは、３７℃において１５分間、アセンブリ用緩衝液（８０ｍＭＰＩＰＥＳ、１ｍＭＭｇCｌ₂、１ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＧＴＰ、ｐＨ６．８）中で２０μＭのタキソール（Ca1biochem）とインキュベートすることにより微小管の形に集まった。組換ｈｔａｕ４０（４μＭ、０．１８ｍｇ／ｍｌ）を３７℃において１０分間、アセンブリ用緩衝液中で異なる濃度のヘパリン（０、２、２０、１００、２００、５００、１０００、２０００μｇ／ｍｌ）とインキュベートし、１０μＭのタキソールにより安定化された微小管に加え、さらに２０分間インキュベートした。懸濁液を、２５％のグリセロールおよび２０μＭのタキソールを含むアセンブリ用緩衝液からなる緩衝剤上に重ね、２０分間、３４６，０００×ｇにおいて遠心した。得られたペレットは上清と同じ容積の緩衝液中で再懸濁された。上清（遊離のタウ）およびペレット（微小管結合タウ）のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、クーマシーブルーで染色した。蛋白質濃度は、Moleculate Dynamicsコンピューティングデンシトメータ(Model ３００Ａ）を用いてゲルを走査することにより見積った。蛋白質濃度はヘパリンが存在しない状態（１００％としてみなされる）において微小管に結合するタウの％として表わされる。この結果は図３Ｂに示され、ヘパリンの存在は、タキソールにより安定化された微小管にタウが結合するのを防ぐことが示される。タウで促進される微小管アセンブリに対するヘパリンの影響を調べるため、組換ｈｔａｕ４０（２μＭ）を３７℃においてアセンブリ用緩衝液中でチューブリン（１０μＭ）とインキュベートした。２０分後、ヘパリン（１０μＭ）を加え、インキュベーションをさらに２０分続けた。微小管の重合および解重合を３５０ｎｍにおいて濁度を測定することによりモニタした。この結果は図３Ｃに示され、タウが存在する状態において集まった微小管はヘパリンを添加すると急速に解重合したことが示される。タウなしに濃縮したチューブリンから集まった微小管はヘパリンを添加しても分散しなかった（データは示さず）。これらの結果から、ヘパリンは、タウが微小管に結合し微小管アセンブリおよび安定性を促進するのを防ぐことが立証される。例４以前の実験では、アルツハイマー病において神経細線維の損傷を有する神経細胞内にヘパラン硫酸が存在することがわかっている（１６−１９）。しかしながら、リン酸化依存性の抗タウ抗体により広く染色される神経細胞で構成される神経細線維の病状の知られている最も初期の段階（アルツハイマー病の「もつれ以前」の段階（１１））においてヘパラン硫酸と高リン酸化タウとが共存するかどうかについては研究がなされていなかった。そこで、抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４（２０）およびリン酸化依存性の抗タウ抗体ＡＴ８（２１、２２）を用いてアルツハイマー病の脳の海馬構成物に対して単一標識および二重標識の免疫組織化学を行なった。前述の方法（３０）の部分変更を用いて、３人のアルツハイマー病の患者（７６才、７９才および８０才）の海馬構成物の脱パラフィン化した４μＭの切片を単一標識および二重標識の免疫組織化学に用いた。抗体１０Ｅ４（Seikagaku Co rporation）を１：２５０で用い、抗体ＡＴ８（Innogenetics）を１：５００で用いた。細胞切片を、０．２％のトゥイーン２０および１５０ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．４中で第１または第２の一次抗体と４ ℃においてひと晩インキュベートした。その切片をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、１：２００に希釈した、ビオチニル化ウマ抗マウスＩｇＧまたはヤギ抗マウスＩｇＭ（Vector）と室温において２時間インキュベートした。さらにＰＢＳ中で洗浄した後、これを１：１００に希釈したアビジン−ＤＨ（Ve ctor）と１時間インキュベートし、３，３−ジアミノベンジディンで染色を行なった。次に切片をＰＢＳ中で洗浄し、０．０１％のチオニンで対比染色し、乾燥し、ＤＰＨに載せた。二重標識のため、非特異的染色を避けるため、最初の染色の後に切片をアビジン−ビオチン（ベクター・ブロッキング・キット）とインキュベートした。ＰＢＳ中で洗浄した後、基質として４−クロロ−１−ナフトールを用い、切片を１晩４℃において第２の一次抗体でインキュベートし、上述の手順を繰返した。二重染色した切片は直接ゼラチンに載せた。いくつかの実験では、一次抗体の順序を逆にし、第１または第２の一次抗体を省略した。さらに、組織切片を、１００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＣａＣｌ₂、１０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンおよび１ｍＭＰＭＳＦを含む、０．５ｍｌの５０ｍＭヘペス、ｐＨ７．０中で０、２．５、５または１０ｍＵのヘパリチナーゼ（Seikagak u Corporation）を用いて３７℃において３時間インキュベートした。ＰＢＳ中で洗浄した後、切片を上述のように抗体１０Ｅ４とインキュベートした。１０Ｅ４による染色は２．５ｍＵのヘパリチナーゼにより大幅に減少し、５および１０ｍＵの酵素によりなくなったが、ＡＴ８染色はヘパリチナーゼ処理の影響を受けなかった。ＡＴ８染色は、希釈した抗体を１０μＭのリン酸化された組換タウ蛋白質とインキュベートした後になくなった。結果は図４に示される。１０Ｅ４染色は茶色であり（図の薄い部分）、ＡＴ８染色は青色であった（図の濃い部分）（Nomarski optics）。（Ａ）の切片はチオニンで対比染色されており、（Ｂ−Ｆ）では対比染色されていない。図４Ａに示されるように、錐体細胞のサブセットは１０Ｅ４に対して強い免疫反応を示した。これらは明らかな神経細線維のもつれを有する細胞およびもつれを有さない細胞を含んでいた。二重標識免疫組織化学により、ＡＴ８によって広く染色される神経細胞は１０Ｅ４でも染色されることがわかった（図４Ｂ−図４Ｆ）。図４Ｂから図４Ｆでは、ほとんどの染色された細胞において、茶色の１０Ｅ４染色および青色のＡＴ８染色は十分な二重標識により混ざっていた。しかしながら、いくつかの神経細胞では、ヘパラン硫酸染色の方がタウ染色に比べてより広範囲にわたっていた。部分的に二重標識されていろ錐体細胞は図４Ｃ、図４Ｄおよび図４Ｆにおいて矢印で示されている。特に、拡散ヘパラン硫酸染色のなされたいくつかの錐体細胞においてタウ染色の小さな部分が観察された（図４Ｄにおける矢印で示した細胞）。さらに、いくつかのタウ陰性の神経細胞はヘパラン硫酸陽性であり、ヘパラン硫酸染色が高リン酸化タウに対する染色に優先して起こり得ることを示している。以前に示されるように（１６−１９）、タウおよびヘパラン硫酸免疫反応は明らかな神経細線維の損傷を有する神経細胞において共存しており、アミロイド斑はヘパラン硫酸抗体により染色された。細胞切片のヘパリチナーゼ処理の後ではヘパラン硫酸染色がなく、かつリン酸化タウによる抗体の予備吸着の後ではタウ染色がなかったため、免疫染色は特異的であった。年齢が一致した対照の脳において、１０Ｅ４またはＡＴ８で染色された細胞の数は非常に少なかった。このことから、神経細線維の病状の知られている最も初期の段階において、アルツハイマー病の脳の神経細胞内にはヘパラン硫酸と高リン酸化タウとが共存することがわかる。併せて考慮すると、この実験結果は、タウ蛋白質と硫酸化グリコサミノグリカンとの相互作用からアルツハイマー病の神経細線維の損傷が形成されることにつながり得ることを示している。後者は、微小管に結合できない高リン酸化タウ蛋白質を含むＰＨＦからなる（３−６、９、１０）。硫酸化グリコサミノグリカンは基質依存の態様でいくつかのプロテインキナーゼによりタウのリン酸化を刺激することが知られている（１２−１４）。本発明者はここで、完全長のタウと硫酸化グリコサミノグリカンとの間のリン酸化に依存しない相互作用により、アルツハイマー病の脳に見られるフィラメントに非常によく似たフィラメントが形成されることを示した。ＰＨＦに加えて、後者は少数の生物化学的におよび構造上関連のあるストレートフィラメントからなる（２３）。硫酸化グリコサミノグリカンが存在する状態では、３つの反復を含むタウのイソ型から対をなすらせん状フィラメントが生じ、４つの反復を含むイソ型からストレートフィラメントが形成されたが、これはアルツハイマー病の２つのタウアセンブリの機構を示している。非生理的条件の下での以前の研究では、タウの３つの微小管結合反復（２４ −２６）ないし完全長の分子からの非常に限られた範囲（２７）から、対をなすらせん状フィラメントが形成されることがわかっている。ここに提示した結果から、タウが硫酸化グリコサミノグリカンに結合することから生じるフィラメント形成は核形成依存性プロセスであり、完全長のタウが３つの微小管結合反復を介して集まり、ＰＨＦを形成できるようにするものであることが示される。また、この相互作用はタウが微小管に結合し微小管アセンブリを促進するのを妨げることが示される。さらに、ヘパラン硫酸およびタウ免疫反応は明らかな神経細線維の損傷が形成される前にアルツハイマー病の脳の神経細胞内にともに局在することがわかった。これらの結果により、神経細胞の細胞質内の硫酸化グリコサミノグリカンが増加するとタウの高リン酸化を引起こし、微小管を不安定にしＰＨＦのアセンブリを誘導することがあり、この結果アルツハイマー病の神経細線維の病状が生じることが示される。これらはまた、ＰＨＦ形成を妨げる化合物を識別するための簡単なアッセイを提供する。参考文献

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者スピランティニ，マリア・グラジアイギリス、シィ・ビィ・２２・キュー・ジェイケンブリッジ、ヒルズ・ロード、シダー・コート、20 (72)発明者長谷川成人イギリス、シィ・ビィ・１４・エス・エックスケンブリッジ、ホゥルブルック・ロード、55 (72)発明者スミス，マイケル・ジョンイギリス、シィ・ビィ・２２・ピィ・ダブリュケンブリッジ、セッドリィ・テイラー・ロード、22 (72)発明者クラウザー，リチャード・アンソニーイギリス、シィ・ビィ・４１・エイチ・ジィケンブリッジ、キンバリー・ロード、51

Claims

【特許請求の範囲】１．アルツハイマー病の治療において使用できる可能性のある薬をスクリーニングする方法であって、前記薬の存在する状態においてタウ蛋白質を適当な条件の下でフィラメントを形成するため適当な硫酸化炭水化物と反応させることと、フィラメントの存在をモニタすることとを含む、方法。２．前記タウ蛋白質は完全長の３反復３８１アミノ酸のイソ型を含む、請求項１に記載の方法。３．前記硫酸化炭水化物は硫酸化グリコサミノグリカンである、請求項１または請求項２に記載の方法。４．前記硫酸化グリコサミノグリカンはヘパリンまたはヘパラン硫酸である、請求項３に記載の方法。５．前記反応が生理的条件の下で実行される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。６．前記反応はＭＯＰＳおよびＡＥＢＳＦ中で試薬をインキュベートすることにより実行される、請求項５に記載の方法。７．フィラメントの存在は電子顕微鏡検査法または他の適当な方法を用いてモニタされる、請求項１から６のいずれかに記載の方法。