JP2001502182A

JP2001502182A - 真核細胞過程のインヒビターを同定するための方法および培養細胞

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Publication number: JP2001502182A
Application number: JP10518757A
Authority: JP
Inventors: デービス，ジュリアン，イー．; ウォーターズ，バーバラ; サクセナ，ゲータ
Original assignee: ターラジェンディバーシティインコーポレイテッド
Priority date: 1996-10-17
Filing date: 1997-10-17
Publication date: 2001-02-20
Also published as: US5770392A; EP0934431A1; WO1998017822A1; ATE230031T1; DE69718041D1; AU4697097A; EP0934431B1; CA2267616A1

Abstract

(57)【要約】物質の翻訳後タンパク質リン酸化のインヒビターとしての活性は，物質を原核生物たとえばストレプトマイシートの増殖中の培養液に物質を添加し，培養液を物質の存在下にある期間増殖させ，ついで物質の非存在下に増殖する原核生物の生育に比較して変化した生育を観察することによりアッセイすることができる。変化した生育の観察は物質が翻訳後タンパク質リン酸化のインヒビターとしての活性をもつことを指示する。とくに試験される物質は新たに接種したプレート上に物質を保持する担体ディスクを増殖中の培養原核生物に配置することによって添加することができる。気中菌糸の発生および胞子形成の阻害は物質が翻訳後タンパク質のリン酸化のインヒビターとしての活性をもつことのインディケーターである。

Description

【発明の詳細な説明】真核細胞過程のインヒビターを同定するための方法および培養細胞発明の背景本出願は，物質のキナーゼおよびホスファターゼ酵素のインヒビターとしての活性をアッセイするための方法および微生物組成物に関する。キナーゼおよびホスファターゼ酵素は原核細胞および真核細胞，両者の調節に重要な役割を果たしている。たとえば，真核細胞においては，プロテインキナーゼおよびホスファターゼの協調作用によって調節される多重シグナル伝達経路により，増殖および分化の制御が達成される。原核細胞でも細胞の活動性の調節はタンパク質リン酸化のカスケードに依存している。これらのキナーゼおよびそれらの関連応答レギュレーターは，適応応答，たとえば窒素固定，腸内細菌の化学走性およびバチルス（Batillus）種における胞子形成の調節に関与する。真核細胞におけるキナーゼ活性は３つのタイプに分類することができる。すなわち，チロシン残基をリン酸化する酵素，セリンまたはスレオニン残基に特異的な酵素，ならびにチロシンおよびセリン／スレオニン残基の両者に二重の特異性を有する酵素である。真核細胞の調節過程におけるこれらの酵素の重要性から，キナーゼおよびホスファターゼにより誘導される経路，とくに医学的な重要性が考えられる過程の解明の助けとなる様々な分類のキナーゼを選択的に阻害できることはきわめて望ましい。加えて，選択的なキナーゼまたはホスファターゼのインヒビターは治療剤として使用できる可能性がある。たとえばＡＧ-940と命名されているチロシンキナーゼ遮断剤は，Ｊak-2プロテインチロシンキナーゼを特異的に阻害し，その抑制を解除して急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）患者の白血球細胞を本質的に活性化する（Meydanら，"Inhibition of acute lymphoblasticleuk emia by a Jak-2 inhibitor"，Nature 379:645-648，1996）。この阻害はインビトロにおいて試験した場合に，アポトーシスの初期に一致する細胞変化を誘発する。さらに，前もってＡＬＬ細胞を注射したマウスにこのインヒビターを静脈内投与すると骨髄からＡＬＬ細胞を根絶させる効果を示した。キナーゼおよびホスファターゼのインヒビターには利用可能性が認められているにもかかわらず，既知の特徴的なインヒビターの数はきわめて少ない。スタウロスポリン（staurosporine）およびＫ-252aは全般的なキナーゼインヒビターとして作用することが知られていて，またハービマイシン（herbimycin）およびラジコール（radicol）はチロシンキナーゼを特異的に阻害するが，有効性はかなり低い。細胞膜で受容される広範囲のシグナルの核の転写および複製機構への伝達に中心的な役割を果たすと考えられている重要な酵素グループであるＭＡＰキナーゼファミリーに対する特異的なインヒビターは知られていない。新たなキナーゼおよびホスファターゼのインヒビターの同定を容易にするためには，単純な，阻害活性を可視的に評価できるアッセイ方法がきわめて有利である。本発明の目的はこのような方法およびこの方法の実施に有用なキットの提供にある。本発明のさらに他の目的は本発明における使用にとくに適した微生物株を提供することにある。発明の概略本発明によれば，原核生物たとえばストレプトマイシート（Streptomycete）の増殖中の培養液に被験物質を添加し，培養生物を被験物質の存在下で、ある期間増殖させ，ついで被験物質の非存在下に増殖する原核生物の生育に比較して培養生物の変化した発育を観察することにより，物質の翻訳後タンパク質のリン酸化のインヒビターとしての活性をアッセイすることができる。変化した生育の観察は，その物質が翻訳後タンパク質のリン酸化のインヒビターとしての活性をもつことを指示する。とくに被験物質は，新たに接種したプレート上に被験材料を保持する担体ディスクを配置することにより，増殖中の培養原核生物に添加することができる。気中菌糸の発生および胞子形成の阻害は，被験物質が翻訳後タンパク質のリン酸化のインヒビターとしての活性を有することのインディケーターである。この方法は，微生物上清および地衣類抽出物から単離された４種の化合物の同定に使用され，この４種の既知化合物はキナーゼのインヒビターとして，これまで認められたことのない有効性を有することが見出されている。図面の簡単な説明図１Ａおよび１Ｂはビスコシン（viscosin）とサーファクチン（surfactin）の構造を示す。図２はブルピン酸（vulpinic acid）の構造を示す。図３はウスン酸（usnic acid）の構造を示す。発明の詳細な説明真核細胞および原核細胞のプロテインキナーゼは，全般的に様々な基質特異性を有するが，一部の原核細胞においては，真核細胞様のキナーゼおよびホスファターゼ活性が，細菌に典型的な２つの成分系を補足することが認められている。とくにストレプトマイシート（Watersら，"Protein tyrosine phosphorylation in streptomycetes"，FEMS Microbiology Letter 120:187-190，1994;Liら，"Cl oning purification and properties of a phosphotyrosine protein phosphata se from Streptomyces coelicolor A3(2)"，J.Bact．178:136-142，1996）；ミクソコッカス・キサンタス（Zhangら，"Identification of putative eukaryoti c-like protein kinase family in the developmental bacterium Myxococcusxa nthus"，J.Bact．174:5450-5453，1992）；およびシアノバクター種（Zhangら," Bacterial signaling involving eukaryotic-type protein kinase"，Molec.Mic robiol．20:9-15，1996）に見られる。本発明は一部の微生物のこの性質を利用し，真核細胞の翻訳後タンパク質リン酸化のインヒビターとしての活性について物質をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明は，任意の種類の物質について，真核細胞の翻訳後タンパク質リン酸化のインヒビターとしての活性の評価に適用できる。すなわち，本発明の方法は精製された化合物のスクリーニングに使用することができる。本発明の好ましい使用は，しかしながら，特徴が全くまたはほとんど明らかにされていない培養微生物に由来する細胞フリーのプレパレーションについて，タンパク質リン酸化の天然産物インヒビターの産生を確認するスクリーニングにおける使用である。所望により，ついで細胞フリーのプレパレーション内の活性なインヒビターを単離し，精製して，特性の解明，試験および使用を行うこともできる。本発明によれば，アッセイ方法の最初の工程は，タンパク質内のチロシン，セリンまたはスレオニン残基をリン酸化する酵素活性を有する試験原核生物が増殖中の培養液に，評価すべき物質を添加する工程である。好ましくは，生物体はチロシンおよびセリン／スレオニンの両者に特異的な酵素を有する。本発明のアッセイにおける使用に適当な試験原核生物は，ストレプトマイシート，とくにStreptomyces griseus株および16ＳｒＤＮＡの配列決定によって識別可能なことが証明されている多数の野生型株（たとえば，ＷＥＣ９3−17Ａ，ＷＥＣ188-31Ｃ，ＷＥＣ362-68Ａ，およびＷＥＣ403-73Ｆと命名された株）である。とくに好ましい原核生物は、土壌から単離され、Streptomyces ＷＥＣ478-8 5Ｅと命名されたストレプトマイセスの野生型株（以下，85Ｅ株という）である。この株はブダペスト条約の規定によりAmerican Type Culture Collectionに寄託され，受入番号ＡＴＣＣ55824が割当てられている。試験される物質はろ紙ディスクに適用し，ついで試験原核生物で新たに接種されたプレート上に配置することができる。ついで試験原核生物をろ紙ディスクの存在下に24〜36時間増殖させたのち，生物のディスク周囲のゾーンにおける生育の変化を評価する。観察される作用には全体的な増殖阻害も包含されるが，少なくともストレプトマイシートの場合には，生存能のある菌糸体の増殖は阻害しない気中菌糸および胞子の形成阻害の観察はとくに翻訳後リン酸化のインヒビターの存在を指示する。用いられた特定の試験生物体に依存し，使用する増殖培地は最小培地または肥沃培地とする必要がある。これは，最小培地上での増殖を促進する代謝経路が肥沃培地上での増殖時に機能する経路とは異なり，異なる増殖条件では異なるキナーゼおよびホスファターゼが生育および代謝を調節している可能性があるからである。物質の試験に肥沃培地および最小培地の両者を用いることも有利である。ストレプトマイセス85Ｅの場合，本発明の方法はたとえば，Difcoから入手できる無機塩／デンプンアガー，ＩＳＰ4のような最小培地を用いて実施するのが好ましい。この株はこの培地上で増殖させた場合，容易に胞子を形成するからである。この円滑な胞子形成は胞子形成における差の肉眼的評点を容易にし，容易な評点化アッセイを実現する。肥沃培地たとえばトリプシン大豆培地上で胞子を形成する株（たとえば，17Ａおよび31Ｃ）も本発明のアッセイに使用できる。試験原核生物の増殖に影響を及ぼす能力に基づき，真核細胞の翻訳後リン酸化のインヒビターとしての可能性があるかもしくはそれを含有するものとして同定される物質は，阻害される酵素の種類を確認し特徴を明らかにするため，さらに１種または２種以上のクラスの特異的なアッセイにより試験することができる。たとえば，物質はＭＡＰキナーゼ活性，チロシンキナーゼ活性たとえばsrc活性，またはセリン／スレオニンキナーゼ活性たとえばcdc2活性のインヒビターについての個々のアッセイで試験することができる。本発明の方法をこのようなアッセイと組み合わせて使用して，本発明者らは，ＭＡＰキナーゼ，srcキナーゼおよびcdc2キナーゼのインヒビターを含めて数種のキナーゼ特異的インヒビターを同定した。本発明の主要な適用は翻訳後リン酸化のインヒビターのスクリーニングであるが，本発明の細菌アッセイシステムは，実際，真核細胞におけるシグナリング経路の一般的な阻害のスクリーニング手段として有効である。すなわち，キナーゼおよびホスファターゼのインヒビターに加えて，本発明のアッセイは細胞周期の発生のインヒビター，アポトーシスのインヒビター，カルシウムを介するシグナル伝達のインヒビター，および翻訳後修飾が関与する他の真核細胞過程のインヒビターのスクリーニングに有用である。このアッセイは，容易に評点化可能で，自動化される高スループットスクリーニングに使用される簡便で有効なプレスクリーニング手段を提供する。さらに，アッセイの結果として更なる評価に選択された物質は，インビトロアッセイシステムに基づく活性とは異なり細胞において有効であることが既に分かっている。最も重要な点はこのアッセイシステムは，被検物質中の哺乳動物細胞に細胞毒性を示し，したがって哺乳動物細胞を用いるアッセイを妨害する化合物により影響されず，微生物の形態学的アッセイは妨害しないが，動物細胞および単離受容体アッセイでは重大な問題になるプロテアーゼの夾雑による問題が回避される。本発明のアッセイを用い検出される種類のインヒビターを産生する培養微生物が同定されたならば，培養により産生される特異的インヒビターを単離し，特性を解明することができる。たとえばシュードモナス（Pseudomonas）およびバチルス（Bacillus）株としてそれぞれ同定された２種の培養細胞，ＷＥＣ64-11ＣおよびＷＥＣ297-60Ａは，試験株85Ｅおよび他のストレプトマイセス株における胞子形成および気中菌糸形成を阻害する細胞フリーの上清を産生する。各培養細胞について，上清および細胞を別個に抽出して酢酸エチル抽出物を調製し，ついで得られた生成物ならびに抽出物を合わせてシリカゲルカラム上で分画化した。カラムから回収された分画中の活性をアッセイすると，活性な阻害分画の同定が可能になった。この分画をさらにクロマトグラフィーにより精製し，阻害化合物をマススペクトロスコピーによって分析した。シュードモナス11Ｃの場合は，生成物はビスコシンであることが決定された。バチルス60Ａの場合は生成物はサーファクチンと決定された。ビスコシンおよびサーファクチンの構造はそれぞれ図１Ａおよび１Ｂに示す。いずれも多重機能ペプチドシンセターゼによりリボソーム外で合成されるリポペプチド生物界面活性剤である（Stachelhausら，Biochemical Pharmacology 52:177-186，1996）。第三者のソース(sources)から得られた純粋なビスコシンおよびサーファクチンを使用した試験によりこれらの化合物のヒトc-Srcキナーゼ，チロシンキナーゼのインヒビターとして作用する能力，および効果はより低いがリン脂質依存性のセリン-スレオニンキナーゼ，プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）のインヒビターとして作用する能力が確認された。本発明の方法はまた，地衣植物の62種からの抽出物のスクリーニングにも使用され，このうち52種の抽出物が試験株ストレプトマイセス85Ｅの胞子形成を阻害することが見出された。見出された阻害結果が広範囲に及ぶことから，２種の広く分布する地衣類化合物，ブルピン酸（図２）およびウスン酸（図３）を純粋な型で得て，最初に胞子形成のインヒビターとして，ついでキナーゼインヒビターとしての活性を試験した。ウスン酸は広く分布する地衣植物の化合物である。Huneckおよび Yoshimura，Identification of Lichen Substances，Springer-Verlag，Berlin ，1996）は，この化合物が単離された地衣植物の16個の属を掲げている。ブルピン酸は，通常，Letharia vulpinaから単離されるが，他の地衣植物の種にも見出されている。これらの化合物はいずれも抗細菌活性を示すことが報告されている（Lauterweinら，Antimicrobial Agents and Chemotherapy 39:2541-2543，1995 ）が，両者ともキナーゼインヒビターとしてはこれまで同定されていない。精製された両化合物はストレプトマイセス85Ｅの胞子形成を阻害することが見出された。いずれの化合物もまた，ヒトc-Srcキナーゼを阻害することが見出されたが，サーファクチンおよびビスコシンほど強くはない。両化合物についてプロテインキナーゼＣの最小阻害も観察された。試験された２種の酵素に関してキナーゼ阻害活性はとくに強力ではないが，胞子形成の阻害活性はきわめて顕著で，これらの化合物により他の真核細胞キナーゼがさらに強力に影響される可能性もある。これらの結果は，本発明の方法が細胞過程のインヒビターとしての治療的可能性をもつ化合物の同定能力を有することを証明するものである。本発明の方法を用い，これまで阻害作用をもつとは認められていなかった４種の化合物が同定された。治療剤としてこのようなインヒビターが重要である可能性，および現在少数のインヒビターしか知られていないことを考慮すると，これらの結果は従来阻害作用が認識されていなかった化合物の中から，新たな治療候補化合物の迅速なスクリーニング法を提供する本発明の重要性が確認される。本発明を以下に記載する非限定的実施例によりさらに詳細に説明し例示する。実施例１スクリーニングアッセイは，総計1000の土壌サンプル単離体について試験原核生物としてストレプトマイセス85Ｅを使用して実施した。各単離体をトリプシン大豆培地（Difco）上で２〜３日の期間増殖させた。ついで，細胞フリーの上清を，17,000×g，10分間の遠心分離によって収集した。この上清30μｌを12mm径のろ紙ディスク上に分配した。ディスクをついで，ＩＳＰ4最小培地から調製され，新たにストレプトマイセス85Ｅを播いたプレート上に配置した。プレートを標準インキュベーターキャビネット内において30℃で24〜36時間インキュベートした。この間に，培養液にはディスクの周辺領域で増殖および／または生育の差について観察された。ストレプトマイセス，バチルスおよびシュードモナスの種を含む1000の単離体中52において，インディケーター株のストレプトマイセス85Ｅの胞子形成に影響する上清の産生が認められた。追跡実験ではこの試験を３種のより強力なインヒビターについて元の上清の10 倍と100倍の希釈度を用いて反復した。インディケーター株のストレプトマイセス85Ｅの胞子形成は10倍希釈では低下が見られたが，100倍希釈では低下は検出できなかった。実施例２ストレプトマイセス85Ｅの胞子形成を阻害することが見出された37の上清を，実施例１の記載と同じ操作を用いて，Streptomyces griseus ATCC No．23345における胞子形成の阻害能について試験した。16個の上清でこの株の胞子形成の阻害が見出された。すなわち，Streptomyces griseus ATCC No．23345はストレプトマイセス85Ｅほど高感度ではないが，本発明のアッセイに使用できる。実施例３ストレプトマイセス85Ｅの胞子形成を阻害することが見出された52個の上清を，グラム陽性菌（S.aureus ＲＮ450），グラム陰性菌（E.coli ＤＢ10株）および酵母種（S.cerevisiae ＲＣ1-707株）の増殖の阻害能について試験した。大部分は細菌種の増殖には影響しなかった。数種は酵母の阻害に反映される抗菌活性を示した。すなわち，ストレプトマイセス85Ｅによって提供される選択基準は他の通常の生物体を用いて全般的に複写することはできない。実施例４実施例１の試験で陽性を示した単離体60Ａ（Bacillus licheniformisに16ＳｒＤＮＡ配列分析によって類似し，バチルス種と考えられる）をトリプシン大豆培地（Difco）中で24〜48時間増殖させた。粗製の細胞フリー上清を17,000×g で10分間遠心分離して回収した。この粗製の上清を0.2μｍのフィルターに通して滅菌し，ついでＭＡＰキナーゼの阻害を評価する更なる試験に使用した。ＭＡＰキナーゼ阻害の試験は，Upstate Biotechnologyから供給されるのと同等な標準試薬およびプロトコールを用いて実施した。ＭＡＰＫ酵素，基質としてのミエリン塩基性タンパク質および５μｌの粗製の上清を含む30μｌの反応混合物を調製した。反応混合物を³²Ｐ−ＡＴＰとともに30℃で10分間インキュベートし，タンパク質中に取り込まれた放射能をシンチレーションカウンターで測定した。二重の実験で，粗製の上清を含むサンプル中の活性は対照の活性の3.8％および6.25％にすぎないことが見出された。すなわち，60Ａは明らかにＭＡＰキナーゼの効果的なインヒビターを産生する。実施例５実施例４の実験を，胞子形成アッセイで陽性を示したさらに11種の単離体からの上清で反復した。これらの11種の上清中，計５種がＭＡＰキナーゼの阻害に有効であった。表１に示すように，この活性は粗製のプレパレーションを10倍に希釈したときにも維持された。実施例６ＭＡＰキナーゼアッセイにおける阻害が低分子量物質により生じ，プロテアーゼまたはＡＴPaseの存在から生じた人為的な結果ではなかったことを確認するため，粗製の上清を分子量カットオフ値10,000ダルトンのフィルターユニットを通してろ過した。ろ過した上清をついでＭＡＰキナーゼの阻害能について試験した。実施例１の胞子形成試験で活性を示さなかった単離体（31Ｃ）からの上清も付加的な対照として同時に試験した。結果は表２に示す。表から明らかなように阻害活性はろ液中に残留したが，活性はやや低下した。単離体31Ｃからの上清はＭＡＰキナーゼ活性を阻害しなかった。 60Ａの上清から活性な阻害化合物を単離しようとする努力にもかかわらず，まだＭＡＰキナーゼ活性を阻害する化合物の産生は同定されていない。すなわち，大部分のプロテアーゼのサイズは10,000ダルトン以上であるが，検出された活性は10,000ダルトンのフィルターを通過できたプロテアーゼによる可能性も残されている。特定の化合物を同定できなかったことのもっと考えやすい説明は，現在まで使用してきた分離培地中にＭＡＰキナーゼ活性が残留しているかまたは試みられた単離操作によりインヒビターが破壊／不活性化された可能性である。この場合，同定された上清はＭＡＰキナーゼインヒビターの唯一の既知例としてなお留まっている。実施例７単離体60Ａからの粗製上清およびろ過上清を，市販の試薬およびプロトコールを用いてチロシンキナーゼ，srcの阻害能について試験した。粗製上清について認められた活性は対照の61％であり，一方，ろ液の活性は対照の67％であった。すなわち，60Ａからの上清はチロシンキナーゼも阻害した。実施例８単離体60Ａからの粗製上清を，Upstate Biotechnologyにより供給された試薬およびプロトコールを用いてセリン/スレオニンキナーゼ，ccd2の阻害能について試験した。粗製上清について認められた活性は対照の99％であった。すなわち 60Ａからの上清はセリン／スレオニンキナーゼを阻害しない。実施例９株85Ｅの胞子形成を阻害することが見出された多数の上清を用いて，さらに４種の野生型株（17Ａ，31Ｃ，68Ａおよび73Ｆ）に顕著な阻害が観察された。16ＳｒＤＮＡ配列のデータは，かなりの配列変動が記録された40塩基対領域を示している。これらの配列のGeneBankにおける配列との比較から，これらの株は多分すべて株85ＥおよびStreptomyces griseusとは異なる４種の別のストレプトマイセス種であることが示唆される。実施例10 実施例１に記載したように，土壌単離体の培養液から調製された細胞フリーのプレパレーションは，様々な試験株の胞子形成の阻害の試験のためにディスクに適用された。ＷＥＣ64-11ＣおよびＷＥＣ297-60Ａ（もしくは11Ｃおよび60Ａ）と命名された２種の単離体の培養液からの上清では，とくに，ディスクの周辺のゾーンの観察により決定して陽性と試験され，生存能のある菌糸体の増殖が明らかであったが，気中菌糸の発生および胞子形成は阻害された。この阻害ゾーンの直径は細胞培養液の異なるプレパレーションで変動するが，ストレプトマイセス 85Ｅ試験株を用いると通常20〜25mmの範囲である。これらの上清は他のストレプトマイセス種，たとえばStreptomyces griseusならびに野生型17Ａおよび31Ｃの胞子形成も阻害する（実施例２および９）。実施例11 バチルス60Ａの上清から活性なインヒビターを単離するために，バチルス60Ａの３Ｌの培養液を，新たに増殖させた種培養液の１％v/v接種材料からＴＳＢ（トリプシン大豆培地，Difco）中，30℃で24時間増殖させた。7880×gでの遠心分離により細胞を収穫し，上清および細胞ペレットの両者を別個にそれぞれ，３容量の酢酸エチルおよび３容量の酢酸エチル中20％メタノールで抽出した。粗製の酢酸エチル抽出液を低メッシュシリカゲルカラム上クロロホルム中メタノールを増加させる勾配により分画化した。分画中の阻害活性はアリコートのシリカゲル上薄層クロマトグラフィーによりモニターした。クロロホルム：メタノール（95 :5 v/v）で展開後プレートを四角の培養皿に移し，ストレプトマイセス85Ｅの新鮮な培養液からの接種材料10⁷〜10⁸cfuを含むＩＳＰ（Difco）軟質アガー（0.6 ％）で覆った。30℃で24〜30時間インキュベーション後，活性を有する分画は１または２以上のスポット上のゾーンでの胞子形成の阻害によって同定できた。この方法を用いて，クロロホルム中12％メタノールで溶出した活性分画を同定し，さらにSephadex ＬＨ-20上クロロホルム：メタノール（1:1 v/v）を用いるカラムクロマトグラフィーによって精製した。活性分画を再び同定し，再度Sephadex ＬＨ-20上，今回はクロロホルム：メタノール（8:2 v/v）を用いてクロマトグラフィーに付した。ＴＤＩ-4と命名された純粋な活性化合物44.2mgが回収された。ＴＤＩ-4は白色の粉末で，クロロホルムに可溶性であり，クロロホルム：メタノール：アセトン4:3:3を用いてＴＬＣに付したのちバニリン-Ｈ₂ＳＯ₄をスプレーすると桃色のスポットを生じる。この段階において，低分解能のＦＡＢ-マススペクトロスコピーに付したところＭ⁺をm/z 1036に与えた。高分解能ＦＡＢ-ＭＳからは分子式Ｃ₅₃Ｈ₉₃Ｎ₇Ｏ₁₃が示唆された。この化合物の起源，その分子量および推定分子式を考慮すると，ペプチドのサーファクチンと同定できるように思われた。アミノ酸分析ではロイシン×４，アスパラギン酸×１，グルタミン酸 ×１およびバリン×１の組成が得られ，組成はサーファクチンの場合と一致する。ＴＤＩ-4をついでバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)からのサーファクチン（Sigmaから入手，分子量1036）と，共ＴＬＣおよびＮＭＲスペクトロスコピーで直接比較したところ，合致することが見出された。実施例12 シュードモナスＣ11から活性インヒビターを単離するため，シュードモナス11 Ｃの培養液10Ｌを新たに増殖させた種培養液の１％v/v接種材料からトリプシン大豆培地中，30℃で24時間増殖させた。7880×gで遠心分離して細胞を収穫し，上清および細胞ペレットの両者を別個にそれぞれ酢酸エチルおよび酢酸エチル中 20％メタノールで抽出した。前述のように，粗製の酢酸エチル抽出液を最初はシリカゲルカラム上クロロホルムで分画化し，ついで活性分画（上述のようにＴＬＣおよびオーバーレイバイオアッセイによって同定）をSephadex ＬＨ-20上メタノールによりさらにクロマトグラフィーに付した。ＴＤＩ-5と命名された純粋な活性化合物4.2mgが回収された。ＴＤＩ-5は黄色を帯びた白色の化合物であり，クロロホルム：メタノール：アセトン（6:2:2）中で展開してバニリン-Ｈ₂ＳＯ₄ をスプレーすると，ＴＬＣプレート上桃色のスポットとして発色する。ＬＲＦＡＢ-ＭＳ分析により分子量は1126と示唆された。m/z 1126についての分子式はＨＲＦＡＢ-ＭＳ分析からＣ₅₄Ｈ₉₆Ｎ₉Ｏ₁₆と決定された。この情報および化合物の起源に基づいて，ペプチドのビスコシンと同定できるように思われ，アミノ酸分析では，ロイシン×３，バリン×１，セリン×２，イソロイシン×１およびグルタミン酸×１の組成が得られた。第９のアミノ酸のＤ-allo-スレオニンとしての存在は，ＬＲＦＡＢ-ＭＳから計算されたマスフラグメンテーションのデータによって証明された。ＴＤＩ-５をついで，ビスコシンの標品サンプル（Raymond A nderson氏から恵与）と共ＴＬＣで比べ合致することを見出した。実施例13 精製されたサーファクチンおよびビスコシンの試験は，ａ）ストレプトマイセス種の胞子形成のそれらの阻害能およびｂ）真核細胞プロテインキナーゼの活性のそれらの阻害能力を決定するために実施した。ａ）胞子形成の阻害上述のようにバチルス60Ａから調製したサーファクチンのサンプル，ならびに Sigmaから入手した同じ分子量（1036）をもつバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)からのサーファクチンを，ストレプトマイセス85Ｅの胞子形成の阻害能について試験した。これらの濃度のサーファクチンは生存能のある菌糸体の増殖は阻害しないが，気中菌糸の発生および胞子形成は阻害される。この作用はきわめて持続的で，培養体の影響を受けなかった部分が胞子を形成したのち少なくとも３〜４日間継続する。最終的には阻害は克服されて，培養体は胞子を形成する。これらの濃度のサーファクチンは他の細菌種たとえばE.coliまたはS.aureusの増殖は阻害しないことに留意すべきである。しかしながら，サーファクチンは抗マイコバクテリア活性を有することが報告され（Stachelhausら，1996），これは，これらのサンプルのMycobacterium phleiでの試験によって確認されている（25μｇのSigmaのサーファクチンを12mmの増殖阻止ゾーンを生成したディスクに適用し，バチルス 60Ａからのサーファクチン20μｇは８mm増殖阻止ゾーンを生じた）。この阻害の機構は不明であるが，マイコバクテリアは真核細胞シグナル伝達経路のある種のエレメントを有することが示されていて（Av-Gay & Dvies,1997），キナーゼインヒビターとして作用するサーファクチンはこの生物におけるシグナリング過程を妨害する可能性がある。さらに，真核細胞のシグナリング過程のインヒビターを検出できる可能性のある上述のスクリーニングでは，新規な抗マイコバクテリア剤を発見できる可能性もある。ストレプトマイセス85Ｅの胞子の形成を阻害することが見出された少なくとも８種の細胞フリー上清もM．aurum，M.phleiおよびM.tuberculosisの阻害試験で抗マイコバクテリア活性を有するが，S.aureusまたはE.coliの増殖は阻害しない。これらの活性な上清は２種のストレプトマイセス，土壌から単離されたバチルス種およびシュードモナス種からのものである。ストレプトマイセス種からの活性化合物は，これまで精製されても単離されてもいない。バチルス種は60Ａに関連し，多分サーファクチンを産生し，一方，シュードモナスはビスコシン産生菌であると思われる。シュードモナス11Ｃから精製されたビスコシンはまたストレプトマイセス85Ｅの胞子形成を阻害することも示された（15μｇが持続性の胞子形成ゾーン30mmを生じ，生存能のある菌糸体の増殖は阻害しない）。ビスコシンは抗マイコバクテリア活性を有することが報告され（Geraredら，1997），これはM.aurumの増殖の阻害により確認された（25μｇをディスクに適用すると，９mmの増殖阻止ゾーンを生じた）。ｂ）真核細胞のプロテインキナーゼの阻害Ｉ）プロテインチロシンキナーゼc-Srcの阻害：ヒトc-Src（p60^c-src）はUpstate Biotechnologyから入手した。この酵素の活性はPierceによって開発されたＥＬＩＳＡベースのアッセイでアッセイされた。それらのプロトコールに従い，蒸留水中500ngのビオチン化ペプチド基質（Pierc eビオチン化ペプチド基質#2，配列：ビオチン-ＥＧＰＷＬＥＥＥＥ-ＥＡＹＧＷＭＤＦ）をNeutrAvidin（登録商標）でコートしたウエルに添加し，37℃において30分間インキュベートし，ウエルに結合させ，Tris-緩衝食塩水（ＴＢＳ，25 ｍＭのTris，0.15Ｍ NaCl，ｐＨ7.6）で洗浄した。各反応毎に，10μｌのsrcアッセイ緩衝液（100ｍＭ Tris-HCl，ｐＨ7.2，25ｍＭMnCl₂，2.0ｍＭＥＧＴＡ， 0.25ｍＭ Na₃ＶＯ₄，125ｍＭ酢酸マグネシウム），20μｌのＡＴＰ／ＭｇＣｌ₂ 緩衝液（ＴＢＳ中５ｍＭＡＴＰ，50ｍＭ MgCl₂）および１μｌのプロテアーゼインヒビターミックス（ＰＭＳＦおよびペプシン，Rx中終濃度：0.5ｍＭおよび1 .5μＭ）を含有する反応緩衝液混合物を調製した。src酵素は３単位／μｌの濃度で供給し，キナーゼの希釈液は通常，ＴＢＳ中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に終濃度10μｌ中0.2〜0.4単位に調製した。阻害活性を試験すべき化合物の溶液10μｌを反応緩衝液混合物に添加して，10〜15分間室温に放置し，ついで10 μｌの希釈キナーゼ酵素を加えて混合物を室温に10分間放置したのち，基質でコートしたウエルに添加した。プレートを30℃で様々な時間インキュベートし，ついで内容物をＴＢＳで繰り返し濯いで洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（Pierce）に接合したマウスモノクローナル抗-ホスホチロシン抗体（ＰＹ20）を１mg/mlから１％ＢＳＡ中に1:2000に希釈し，この希釈液75μｌを各ウエルに加え，37℃で１時間インキュベートし，ＴＢＳで繰り返し濯いで洗浄した。各ウエルに100μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ基質溶液（3,3',5,5'-テトラメチルベンチジンおよびＨ₂Ｏ₂，Pierce ＴＭＢ-ＥＬＩＳＡ）を添加し，100 μｌの１ＮＨ₂ＳＯ₄を添加することによって反応を停止させた。吸収を450nmにおいてMolecular Devices V-maxプレートリーダーで読み取った。このアッセイを用いて検出された阻害の例（記載の値は酵素を含まないブランクのウエルの値を差し引いた吸収の読みである）：Ｉ．ヒトc-Srcキナーゼを10μｇのサーファクチン（srf）または５μｇのビスコシン（vis）と30℃で１時間インキュベートした： II．ヒトc-Srcキナーゼをサーファクチンまたはビスコシンと30℃で５分間インキュベートした：これらの反応に添加した10μｇのサーファクチンは反応混合物中で200μＭの濃度を示し，この濃度ならびに100μＭは試験したチロシンキナーゼの活性を阻害した。同様に90μＭの濃度のビスコシンはこのキナーゼの活性を阻害した。土壌細菌単離株からのインヒビターのプレパレーションならびにサーファクチンの Sigmaプレパレーションは残留プロテアーゼ活性についてａ．色素原基質，Ｎ-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe p-ニトロアニリドとのインキュベーション，ｂ．タンパク質の混合物とのインキュベーション，ついで，ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析，ｃ．プロテアーゼ基質としてゼラチンを含有するゲル中におけるザイモグラム分析を包含する様々な方法により試験された。バチルスからの粗培養液の上清は明らかにプロテアーゼ活性を含むが，サーファクチンの精製されたプレパレーション中には全く検出されなかった。シュードモナス培養液の上清のプロテアーゼ活性の程度は低いが，この場合もビスコシンの精製されたプレパレーション中には全く検出されなかった。これらの化合物はいずれもサーファクチンであり，見掛けの阻害がアビジン-ビオチン相互作用またはアビジンのウエルへの接着での干渉によった可能性をサーファクチンもしくはビスコシンを含むが酵素は含有しない反応混合物と基質でコートしたウエルの 30分間のプレインキュベーションにより試験した。ウエルをついでＴＢＳにより繰り返し濯いで洗浄し，インヒビターを含まない標準キナーゼ反応をセットアップした。この反応では対照反応に比較して活性の低下を示さなかった。したがって，サーファクチンおよびビスコシンはこのチロシンキナーゼのインヒビターであると結論される。 ii）リン脂質依存性セリン-スレオニンキナーゼであるプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の阻害ラット脳から精製されたプロテインキナーゼＣはUpstate Biotechnologyから入手した。酵素の活性はPierceによって開発された比色アッセイによりアッセイした。反応混合物は，それぞれ５μｌの５×反応緩衝液，1.77ｍＭに再構築された色素標識グリコーゲンシンターゼ合成ペプチド基質ならびにホスファチジル-L -セリンのアクティベーターの５×溶液（すべてＰＫＣアッセイキット中にPierc eによって供給される）を含有するように調製した。アクティベーター溶液は使用前に氷上で30秒間超音波処理した。キナーゼ１μ１（比活性12.1単位/mgを有する酵素10ngに相当）を，阻害活性を試験すべき化合物を含有する溶液10μｌに加えて室温に10分間放置し，ついで基質を含む反応管に移し，30℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後，各サンプル20μｌをアッセイキットとともに供給された分離ユニット中の親和性膜の中央に適用した。これらの膜はリン酸化色素標識基質を特異的に結合するが，非リン酸化ペプチドは低速度で回転させた場合，膜を通過した。膜を洗浄したのちリン酸化ペプチドを回転させながら溶出緩衝液により溶出し，吸収を570nmにおいてMolecular Devices V-maxプレートリーダーで読み取った。反応混合物中250μＭの濃度のビスコシンは阻害作用を示さなかった。反応混合物中380μＭの濃度のサーファクチンは以下の例に示すように，わずかに阻害作用を示すのみであった。ポリミキシンＢはビスコシンおよびサーファクチンに類似の分子量を有するペプチドであり，ＰＫＣのインヒビターを認識する。キナーゼの阻害は以下の例に示すようにこのアッセイシステムで検出することができた。したがってサーファクチンおよびビスコシンはこのセリン-チロシンキナーゼよりも試験したチロシンキナーゼの強力なインヒビターであると結論できた。実施例14 抽出物（メタノール：アセトン1:1中）を地衣類植物62種から調製し，52種が試験株ストレプトマイセス85Ｅの胞子形成を阻害することを見出した。多くの様々な地衣類植物種から活性化合物の精製の試みを開始する先立って，２種類の広範に分布する地衣類化合物，すなわち，ブルピン酸およびウスン酸（両者ともSi gmaから入手）を試験した。生存能のある菌糸の増殖は阻害されなかった。胞子形成の阻害は持続的で少なくとも２〜３日間継続した。数種の陽性な地衣類抽出物中にウスン酸およびブルピン酸の存在が，標品化合物との共ＴＬＣ，ついでストレプトマイセス85Ｅとのアガーオーバーレイ試験で確認された。胞子形成はこれらの化合物のスポット上のゾーンで阻害され，また，地衣類抽出物中の同じRfを有するスポット上のゾーンでも阻害が認められた。少なくとも16種の抽出物がウスン酸を，少なくとも５種がブルピン酸を含有することが見出された。プロテインキナーゼ活性の阻害例： II．ヒトc-srcを30℃で５分間，５μｇのウスン酸または５μｇのブルピン酸とインキュベートした。 III．プロテインキナーゼＣを30℃で５分間，５μｇのウスン酸または５μｇのブルピン酸とインキュベートした。 50μｌのＰＫＣ反応混合物中５μｇは，これらの化合物の両者について約300 μＭの濃度を示し，25μｌのPＫＣ反応混合物中の２倍である。したがって，ある程度の阻害は検出されたが，これらの化合物は，この特定のプロテインチロシンキナーゼに対してはサーファクチンまたはビスコシンよりも阻害作用は弱く，プロテインキナーゼＣにはわずかな阻害作用しか示さないように思われる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１０月２２日（１９９８．１０．２２）【補正内容】キナーゼおよびホスファターゼのインヒビターには利用可能性が認められているにもかかわらず，既知の特徴的なインヒビターの数はきわめて少ない。スタウロスポリン（staurosporine）およびＫ-252aは全般的なキナーゼインヒビターとして作用することが知られていて，またハービマイシン（herbimycin）およびラジコール（radicol）はチロシンキナーゼを特異的に阻害するが，有効性はかなり低い。細胞膜で受容される広範囲のシグナルの核の転写および複製機構への伝達に中心的な役割を果たすと考えられている重要な酵素グループであるＭＡＰキナーゼファミリーに対する特異的なインヒビターは知られていない。 Hongら，Molecular Gen．Genetics 236:347-354（1993）には既知の真核細胞キナーゼインヒビターをStreptomyces griseus IFO 13350の培養液と接触させついで培養液中の形態学的変化を観察するインビボ実験が記載されている。この文献には，未知物質を真核細胞のリン酸化反応のそれらの阻害能力について試験するアッセイ方法の開発に関しては何らの指示もない。新たなキナーゼおよびホスファターゼのインヒビターの同定を容易にするためには，単純な，阻害活性を可視的に評価できるアッセイ方法がきわめて有利である。本発明の目的はこのような方法およびこの方法の実施に有用なキットの提供にある。本発明のさらに他の目的は本発明における使用にとくに適した微生物株を提供することにある。発明の概略本発明によれば，原核生物たとえばストレプトマイシート（Streptomycete）の増殖中の培養液に被験物質を添加し，培養生物を被験物質の存在で，ある期間増殖させ，ついで被験物質の非存在下に増殖する原核生物の生育に比較して培養生物の変化した発育を観察することにより，物質の翻訳後タンパク質のリン酸化のインヒビターとしての活性をアッセイすることができる。変化した生育の観察は，その物質が翻訳後タンパク質のリン酸化のインヒビターとしての活性をもつことを指示する。とくに被験物質は，新たに接種したプレート上に被験材料を保持する担体ディスクを配置することにより，増殖中の培養原核生物に添加することができる。気中菌糸の発生および胞子形成の阻害は，被験物質が翻訳後タンパク質のリン酸化のインヒビターとしての活性を有することのインディケーターである。この方法は，微生物上清および地衣類抽出物から単離された４種の化合物の同定に使用され，この４種の既知化合物はキナーゼインヒビターとして,これまで認められたことのない有効性を有することが見出されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:545） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ウォーターズ，バーバラカナダ国ブイ４エル２イー６ブリティッシュコンロビア，デルタ，ティムバーバリイロード 5706 (72)発明者サクセナ，ゲータカナダ国ブイ６ティ２ジー３ブリティッシュコロンビア，バンクーバー，オソヨースクレセント，ナンバー302― 2875

Claims

【特許請求の範囲】 1. 真核細胞の翻訳後タンパク質修飾，カルシウムシグナル修飾，細胞周期の発生またはアポトーシスのインヒビターとしての活性について物質をアッセイする方法において，タンパク質内のチロシン，セリンまたはスレオニン残基のリン酸化に有効な酵素活性を有する原核生物の増殖中の培養液に該物質を添加し，培養生物を該物質の存在下で、ある期間増殖させ，物質の非存在下に増殖する原核生物の生育に比較した生育の変化を培養生物について観察し，変化した発育は被験物質が翻訳後タンパク質のリン酸化のインヒビターとしての活性をもつことを指示することからなる方法。 2. 物質は新たに接種したプレート上に，物質を保持する担体ディスクを増殖中の培養原核生物に配置することにより添加される「請求項１」記載の方法。 3. 原核生物はストレプトマイシートである「請求項１」記載の方法。 4. 物質が翻訳後タンパク質のリン酸化のインヒビターとしての活性をもつことのインディケーターとして，培養体を気中菌糸の発生および胞子形成の阻害について観察する「請求項３」記載の方法。 5. ストレプトマイシートはStretomyces griseusの株である「請求項３」記載の方法。 6. ストレプトマイシートはストレプトマイセス85Ｅ（ＡＴＣＣ No.55824）である「請求項３」記載の方法。 7. 真核細胞酵素のインヒビターとしての活性について物質をアッセイする方法において，タンパク質内のチロシン，セリンまたはスレオニン残基のリン酸化に有効な酵素活性を有する原核生物の増殖中の培養液に該物質を添加し，培養生物を該物質の存在下にある期間増殖させ，該物質の非存在下に増殖する原核生物の生育に比較した生育の変化を培養生物について観察し，変化した発育は被験物質が翻訳後タンパク質のリン酸化のインヒビターとしての活性をもつことを指示することからなる方法。 8. 物質は新たに接種したプレート上に，物質を保持する担体ディスクを増殖中の培養原核生物に配置することにより添加される「請求項７」記載の方法。 9. 原核生物はストレプトマイシートである「請求項７」記載の方法。 10．物質が翻訳後タンパク質のリン酸化のインヒビターとしての活性をもつことのインディケーターとして，培養体を気中菌糸の発生および胞子形成の阻害について観察する「請求項９」記載の方法。 11．ストレプトマイシートはStretomyces griseusの株である「請求項９」記載の方法。 12．ストレプトマイシートはストレプトマイセス85Ｅ（ＡＴＣＣ No.55824）である「請求項９」記載の方法。 13．試験される物質は微生物の培養液または地衣類抽出物から採取された細胞フリーのプレパレーションである「請求項１〜12」のいずれか一項に記載の方法。 14．さらに微生物または地衣類の培養液より活性な化合物を単離する工程からなる「請求項13」記載の方法。 15．実質的に純粋な培養ストレプトマイセス85Ｅ（ＡＴＣＣ No.55824）。