JP2001501527A

JP2001501527A - Improved filtration system and method

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Publication number: JP2001501527A
Application number: JP10514893A
Authority: JP
Inventors: スティーヴンジェイエッケンバーグ
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 1996-09-18
Filing date: 1997-09-18
Publication date: 2001-02-06
Also published as: CA2265702A1; EP0927077A1; AU4425597A; AU730718B2; EP0927077A4; KR100486402B1; WO1998011989A1; KR20000036247A

Abstract

(57)【要約】細胞破片から核酸を単離するろ過システム及び方法。該ろ過システムは、一端にフィルター(28)を含む、ミクロ遠心管(9)と真空マニホールドアダプター(12)の双方を内部に取り付けるように設計されたフィルターバスケット(10)が含まれる。 (57) Abstract: A filtration system and method for isolating nucleic acid from cell debris. The filtration system includes a filter basket (10) designed to mount both a microcentrifuge tube (9) and a vacuum manifold adapter (12), including a filter (28) at one end.

Description

【発明の詳細な説明】改良されたろ過システム及び方法発明の技術分野本発明は、生物体を単離するろ過システム又は装置及び方法に関する。更に詳細にはかつその範囲を限定することなしには、本発明は、リボ核酸(RNA)又はデオキシリボ核酸(DNA)のような核酸を細胞破片のような他の材料から単離又は分離するシステム及び方法に関する。本発明は、特にDNA、更に特にプラスミドDNA を単離するろ過システム又は装置及び方法に関する。発明の背景核酸がシリカに結合することは周知である。この性質は、核酸、特にDNA、更に特にプラスミドDNAを細胞破片や他の材料から収集又は単離するために用いられた。例えば、特許協力条約公開国際特許出願第95/06652号を参照されたい。シリカ含有樹脂として又はシリカを含浸したフィルターとしてのシリカ材料を用いて生きている細胞に含まれる核酸を次の一般手順に従って該細胞内の他の材料から単離又は分離する。まず、細胞を破壊又は溶解して溶解液、即ち、溶解した材料を含む液を生成する。次に、溶解液を処理して細胞破片を除去して透明溶解液を生成する。透明溶解液は、典型的には、破片を沈降させるために溶解液を遠心分離しかつ得られた透明溶解液を傾瀉及び保存することによりつくられる。次に、問題の核酸材料をシリカへ結合することを促進するように設計されたカオトロピック剤の存在下に透明溶解液とシリカとを接触させる。この方法の最後の工程（通常は数段の中間洗浄又は処理工程後）は、シリカに結合した核酸を、例えば、ヌクレアーゼを含まない水でシリカから核酸を溶離することにより遊離させるものである。上記一般手順においては、溶解液中の核酸材料に結合する前又は後にシリカ材料をフィルターバスケットに入れる。フィルターバスケットは、バスケット/管アセンブリが標準ミクロ遠心分離機内にはまるような方法で標準サイズのミクロ遠心捕集管に組込まれるように設計される。フィルターバスケットは、溶解液を充填した場合にシリカ材料を保持すると共に遠心分離又は真空のような外力を受けた場合に溶解液が材料を捕集管へ通過させるように設計される。上記のタイプの手順による核酸単離に使用するために設計された市販のフィルターバスケットは２つの一般構造のいずかに有効である。一方の構造は、回転ろ過に用いられるように設計された（即ち、捕集管に挿入されかつ遠心分離機で回転されるように設計された)底がかなり平らなフィルターバスケットである。例えば、米国特許第5,552,325号に開示されたフィルターバスケットやGLASSMAX^TMスピンカートリッジ(Life Technologies，Inc.、米国メリーランド州ゲイザースバーグ)を参照されたい。もう一方の一般構造は、フィルターバスケットの底から突き出ているが相互交換可能に用いられるように設計されたフィルターバスケット構造である。 Inc．ドイツ、ヒルデン)を参照されたい。上に略述した今日使用している２種の市販のフィルターバスケットの主な構造は、DNAのような核酸を単離するためにそれらのバスケットを使用することを望むには難点がある。平底フィルターバスケットは、フィルターバスケットの底から取り出しつつ収集されるべき多量の溶液の捕集管の底よりフィルターバスケットの底が十分に高いので単一の遠心分離工程において多量の溶液がフィルターを遠心させることを可能にするという利点がある。しかしながら、平底フィルターバスケットは、上記一般核酸単離手順の結合及び洗浄工程になるときの欠点、使用者がバスケットの内容物を処理するために真空ろ過を用いることを可能にしない。真空アダプターが突き出ているフィルターバスケットは、核酸を単離するために遠心分離及び/又は真空ろ過を使用するという融通性を使用者に与える。しかしながら、フィルターバスケットの真空アダプター突出部分はフィルターバスケットの底(即ち、アダプター端)に接触させずに捕集管へ遠心沈殿させ得る溶液量を必ず制限する。その最後の問題に取り組むために、フィルターバスケットの使用者は平底フィルターバスケットを用いて１スピンサイクルで処理されるちょうど同じ量の溶解液を処理するためにミクロ遠心分離機で２以上のスピンサイクルを使用することがしばしば必要である。その最後のタイプの市販のフィルターバえば、上記キアジェンから市販されているミニプレップミクロ遠心スピンカラムを参照されたい。フィルターバスケットから突き出ている取り付け部分は、フィルターを遠心させた溶液が取り付け部分のグルーブに集まるという問題が更にあり、ある分離プロセス工程から次の工程へのキャリオーバーによる潜在的問題を生じる。本発明は、改良されたろ過システムであり、容量が制限されずしかも市販の突出真空アダプターフィルターバスケットに固有のキャリオーバー問題のない市販の平底フィルターバスケットアセンブリに匹敵する容量の溶液を処理する遠心分離又は真空ろ過の互換性の使用を可能にするものである。本発明は、また、DNAのような核酸を単離するために本発明の改良されたろ過システムを使用する方法である。本発明の方法は、その用途で適応性があり、高収量の単離した核酸を生じる意味で特に効率がよく、既知の核酸単離法より労働集約的でない。本発明の方法の実施で生成した核酸は、特に透明であり、自動蛍光DNAシークエンシング、増幅反応(特にポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に用いるもの)、トランスフェクション、遺伝子治療及び遺伝子発現のようなそれ以後の用途によく適している。本発明を用いて分離又は単離した核酸の他の多くの用途は当業者に明らかである。代表的な従来技術は下記のものが含まれるが決してこれだけでない。発明者特許番号 Lymanら米国特許第4,683,058号 Limb 米国特許第4,832,842号 Setcavageら米国特許第5,491,067号 Paley 米国特許第4,046,479号 Guirguis 米国特許第5,429,803号 Diekmann 米国特許第4,956,298号 Nieuwkerk 米国特許第5,438,128号 Sheerら米国特許第5,124,041号発明の要約概略として、一態様においては、本発明は改良されたろ過システムである。他の態様においては、本発明は、細胞破片から核酸、特にDNAを単離又は分離する方法である。本発明のシステム及び方法は、従来のミクロ遠心分離機及び従来の多くの異なる真空マニホールドのいずれかの双方と共に用いられるように設計される。本発明のろ過システム又はアセンブリは、別個のフィルターバスケットと真空アダプターの部品を含む。選択が自由の実施においては、本システム又はアセンブリは慣用のミクロ遠心捕集管が含まれる。真空アダプターは、第１端と第２端を有する円筒管を含む。真空アダプターの第１端は、挿入することができるフィルターバスケットと協同してアダプターの通過を制限しかつ実質的に密封する。アダプターの第２端は、真空マニホールドのような真空源と連結するように設計される。例えば、真空アダプターの第２端プラー部分は、システムが共にプロメガコーポレーション、米国ウィスコンシンドと共に用いることを可能にする。フィルターバスケットと真空アダプターは、真空アダプターの第１端内に限定的に又は摩擦的に組込まれて実質的に密封する点で協同するように設計される。フィルターバスケットの外面か又は真空アダプターの内面は、適切な場合にはわずかに広がっているか細くなっていて実質的に密封することができる。アダプターの第２端が真空マニホールドに取り付けられる場合、実質的な密封はバスケットフィルターとアダプター間に真空密閉が生じることを可能にする。実施においては、フィルターバスケットはその一端にシリカフィルター又はフィルターディスク(又は複数のディスク)を支持した高い表面領域がある。本発明の好ましい方法において核酸が最終的には単離されるのはそのシリカフィルター材料である。その最後の実施方法においては、シリカを含有するフィルターバスケットの端に好ましくは穴が開けられて１又は複数のディスクを保持しつつ遠心力か又は真空補助手段によって液体を貫流させる。本発明の方法は、本発明のろ過システムを用いることにより可能になった選択、問題の材料を溶解液から分離するために用いられる方法工程の選択を用いて生物材料、特にプラスミドDNAを精製又は単離する方法である。詳細には、本発明の核酸材料を単離する方法は、ミクロ遠心工程で生じるような遠心力か又は実験用真空マニホールドによって利用できるような真空補助手段の使用を可能にする。出願人の知る限りでは、以前に開示或いは示唆された他のろ過システム又は方法は本発明の驚くべきかつ予期しない有用性を与えていない。図面の簡単な説明図１は、本発明のフィルターバスケットの平面正面図である。図２は、本発明のフィルターバスケットの底面斜視図である。図３は、本発明のフィルターバスケットの底面図である。図４は、図３の線3-3に沿って切ったフィルターバスケットの断面図である。図５は、本発明の真空アダプターの平面正面図である。図６は、本発明の真空アダプターの底面正面図である。図７は、本発明の真空アダプターの平面端面図である。図８は、図７の線7-7に沿って切った本発明の真空アダプターの断面図である。図９は、本発明の真空アダプターに挿入したフィルターバスケットを含む本発明のフィルターアセンブリの断面図である。図10は、捕集管内に含まれる本発明のフィルターバスケットの断面図である。図11は、捕集管の断面図である。図12は、プラスミドDNAを単離するために本発明のろ過システムを用いる方法の系統線図である。発明の詳細な説明本発明のろ過システムの２つの主な部品、フィルターバスケット10と真空アダプター12を各々図1〜4及び図5〜8に示す。（各図面においては同じ構造を示すために同じ番号を用いる。）フィルターバスケット10は、第１端16と第２端18を有する中空円筒管14を含む。フィルターバスケットの断面構造は重要ではないが、本実施態様においては、第１端16は肩20及びリム22を含む。肩20とリム22は、下に詳述され図11に示される捕集管又は捕獲管に関する対応する構造と協同するように構成される。第１端16は開放端24を有する。フィルターバスケット第２端18 は、穿孔構造又は手段、即ち、一連の小開口又は窓26を有する。円筒管14の壁と共にこれらの開口はフィルターバスケットの“バスケット”構造を形成する。この点で穿孔構造又は手段26がフィルターバスケット10の軸27に対してたいていは垂直である平面を形成することを留意することは重要である。従って、穿孔構造 26は、たいていはフィルターバスケット10の第２端18に平底として確認されるものを形成する。フィルターバスケットのこの特徴は、平底が協同する捕集管内に多くの容量を空にさせることから重要である。フィルターバスケット10の平底( 図４に最も良く図示されている)はバスケット構造内に少なくとも１枚のシリカフィルターディスクを保持している。図４は、２枚のシリカフィルターディスク 28がバスケット構造内に保持されていることを示す図である。図３及び図４は、フィルター手段又はシリカディスク28に相対する穿孔構造26 を示す図である。シリカディスク28は、フィルターバスケット10の底に限定的に組込まれる。中空円筒体14内にフィルターディスク28、例えば、内向きの放射状構造の段付き部分、ディンプル又はビードを保持するために他の方法が用いられることは本発明の企図の範囲内である。図5〜図８は、本発明の真空マニホールドアダプター12(よくフィルターカップと呼ばれる)を示す図である。マニホールドアダプター12は、第１端及び第２端各々30及び32を有し、円筒体34によって形成されている。第１端30は開口36を形成し、その中にフィルターバスケット10の第２端18が挿入される。フィルターバスケット10の第２端18の外径は真空アダプター12の内径と協同するように設計されるのでフィルターバスケット10が限定的に又は摩擦的にはまるか又はその中に収容されて実質的に密封される。（これは図９に最も良く見られる。）真空アダプター12の第２端32は、ねじ山36を内部に形成する。ねじマニホールドは、本発明が用いられるマニホールドの特に好ましい例を構成する。ガコーポレーションカタログ155頁に示されており、その記載は本願明細書に含まれるものとする。更に、マニホールドアダプター12の第２端32は流出開口38を形成するために内部に構成される。本発明によってろ過される材料は、流出開口 38を貫流する。真空アダプター12は、例えば、指の間で容易につかまえるようにする任意の粗い、即ち、鋸歯状の外面40を有する。図９は、マニホールドアダプター12に挿入されたフィルターバスケット10を示す断面図である。表面交差部分42の摩擦のはめ合いは、バスケット10を真空アダプター12に完全に挿入しないように防止しかつ実質的に密封する。フィルターバスケット10と真空アダプター12間の摩擦のかみ合いはチャンバ44を形成する。図10は、捕集管46内に挿入された本発明のフィルターバスケット10を示す断面図である。捕集管46は、開放端47と閉鎖端49を有する。フィルターバスケット10 と捕集管46間に限定のはめ合いが企図されないことは留意されるべきである。協同する肩20と捕集管リップ48は、フィルターバスケット10を捕集管46の中に完全にずれないように防止する。捕集管46内の捕集チャンバ50は、管壁及びフィルターバスケット10の平底によって形成される。この捕集チャンルターバスケットによって形成されたチャンバよりかなり大きい。フィルターバスケット10の平底が捕集管内のチャンバの容量を本質的に制限する同様の突出をもたないからである。フィルターバスケット10の平底は、カプラが突き出る従来技術に固有のキャリオーバー収量の問題も回避する。図11は、捕集管を示す断面図である。捕集管は、遠心分離を用いて、例えば、 DNAのような核酸を単離する場合に本発明のフィルターバスケットと共に用いられる。本発明のフィルターシステムは、任意の種類の核酸物質を含む多くの異なる物質のいずれか１つを単離するために用いられることが企図される。しかしながら、フィルターシステムを用いるという最も好ましい方法は、シリカ材料を含浸したフィルターを取り付けた本発明のフィルターシステムを用いてDNAを単離することであり、単離されるDNA種は最も好ましくはプラスミドDNAである。特に好ましい含浸フィルター材料は、アンシスコーポレーション、米国カリフォルニア州アーヴィンから市販されているSPEC^TMシリカディスクである。本発明の方法に用いられるフィルターバスケットに使用するために企図された他の適切なシリカ系材料としてはPCT公開国際出願第95/06652号に記載された樹脂材料が含まれ、この明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする。問題のDNA種を含む生物体を溶解すると共にフィルターバスケットアセンブリのシリカ成分に結合させるために多くの異なる処理法のいずれかが用いられる。それをするために適切な材キットとして市販されている。バスケットフィルターからDNAを洗浄及び溶離するのに適切な手法は文献に記載されている。下記の非限定的な実施例は、本発明の実施態様の使用を具体的に説明するものである。実施例に示される本発明のフィルターアセンブリ及び方法の個々の実施ニプレップDNA精製システムの部品を意味する。実施例に用いられる本発明のフプレップスピンカラム又は簡単にスピンカラムと呼ぶ。真空アダプター部品は、下ではミニプレップ真空アダプターと呼ぶ。本実施例が本発明の１実施態様にすぎないことは理解されるべきである。本発明の他の実施態様は、本明細書の教示から当業者に考えられるものである。実施例 I．システムの概要分子生物学操作では“ミニプレップ”として良く知られるプラスミドDNAの小規模単離操作が一般的である。例えば、Ausubel，F.M．ら(1989)Current protoc ols in Molecular Biology，Vol．2，John Wiley & Sons，NYを参照されたい。長い年月に多くのミニプレッププロトコールが開発されたが、ほとんどが一貫して信頼できることが証明されなかった。プラスミドDNAの収量は、量及び質がよく変動し、用いられる用途を制限する。更に、既知のミニプレップ操作は、特に多くのミニプレップが同時に行われる場合には骨が折れかつ時間も消費する。する簡便で信頼できる方法を与えることにより標準ミニプレップ操作と関連がある多くの問題を取り除くものである。本システムはプラスミドを単離するために用いられ、プラスミドが<20,000bpである場合に最も効率良く作動する。は処理される試料の数に依存して30分以内に完了する。更に、本プロトコールで単離したプラスミドは更に操作せず(高コピー数プラスミドが用いられる場合) ボヌクレアーゼ阻害剤(プロメガCat.#N2511)のようなリボヌクレアーゼ阻害剤で補足した場合に試験管内転写反応にも用いられる。レップスピンカラムに進めると共にプラスミドDNAを洗浄するためにミクロ遠心 SVミニプレップスピンカラムを通過し、プラスミドDNAは減圧を用いて洗浄さ験用真空マニホールド、容量20サンプル、プロメガCat.#A7231;又はVac-用がVII.B.項に記載されるようにプラスミドDNAを精製させることを可能にする。真空マニホールドの使用は、プラスミドDNAを精製するために要する時間と労力の量を著しく減少させかつ以前のシステムに比べて用いられるプラスチックの量を著しく減少させる。から増殖した培養物中の細菌からプラスミドDNAを単離するために用いられる操のフィルターバスケット10と同じであり、図1〜4に示されるフィルターバスケット10の実施態様であることを意味する。同様に、真空アダプター12と捕集管46は、図5〜図８と図10〜図11に各々示される真空アダプター12と捕集管46の実施態様である。系統線図(図12)は、真空ろ過、線図の左経路か又は遠心分離、線図の右経路を用いてプラスミドDNAを単離するためにその系を使用することを例示するものである。図12に示される方法は５工程(I-V)に示される。工程Ｉでは、培養皿３から細菌の単一コロニー１を選び、適当な抗生物質を含む1〜10mlのLB培養液に播種するために用いる。得られた播種物を37℃で一晩(12〜16時間)インキュベート＋SVミニプレップ細胞再懸濁液に十分に懸濁する。工程IIでは、得られた再懸濁細菌細胞液をミクロ遠心管２に移す。次に、溶解液を細胞の液に加え、逆にして混合し、1〜5分間インキユベートし、よって細胞を破壊すると共にDNAを液中に遊離させる。得られた溶解液にアルカリプロテアーゼ液を加え、室温で５分間インキュベートする。次に、中和液を加え、溶液のpHを中性又は生理的pHにする。中和した溶液はグアニジンも含み、DNAのシリカへの結合を促進させる。次に、得られた中和混合液を遠心分離して細胞破片を沈降させる。工程IIIでは、るスピンバスケット10として図示されている)を、DNAを単離するために真空ろ過経路又は遠心分離経路が用いられるかに依存して2ml捕集管46か又は真空マニホールド８上のミニプレップ真空アダプター12に挿入する。細胞破片を沈降瀉する。図12の真空ろ過経路(工程IVA)は、真空マニホールド８の口７上に挿入及びを示す図である。この経路の工程IVBでは、フィルターバスケット10から上清を除去するためにマニホールドに真空が用いられ、続いて真空が解除される。フ洗浄後に真空を用いてバスケットから洗浄液を除去する。工程IV.Cでは、フィルターバスケット10を捕集管46に移す。次に、得られたフィルターバスケット/管アセンブリを速心分離機で２分間回転して残存しているカラム洗浄液全てを除去する。ラム(フィルターバスケット10)を第２捕集管46に挿入し、上清をミクロ遠心分離により除去する。次に、フィルターバスケット10を遠心分離を用いてカラム洗浄液で２回洗浄してバスケットから洗浄液を除去する。各洗浄後に液を捨てる。上清を除去しかつフィルターバスケットを洗浄するために遠心分離が用いられるか真空ろ過が用いられるかは、図12で収束する矢印で示されるように同じでターバスケット10)を1.5mlの滅菌ミクロ遠心管９に移す。次に、ヌクレアーゼを含まない水を加え、得られたアセンブリを遠心分離してプラスミドDNAをフィルターバスケットから溶離する。 II．システム組成 10mlの培養物から50回の単離に十分な量の試薬と成分が含まれたものである。本システムにおける各液の組成については下記の項Xを参照されたい。 III．プラスミドとE．coli株の選択と調製培養物からプラスミドDNAを精製した。プラスミドの収量は、細菌培養物の量、プラスミドコピー数、培養液の種類及び細菌株を含む多くの要因に依存して変動した。本実施例に用いられるプロトコールは、E．coli細菌からプラスミドDNAを単離するためのものである。 A．E．coliの調製抗生物質を含む新たなルリア-ベルタニ(LB)寒天平板からE．coliの完全に単離した単一コロニーを選択し、そのコロニーを用いて抗生物質を含む1〜10mlのLB 培地に播種した。テリフィックブイヨンのようなリッチ培地はDNA精製システムを過負荷する極めて高い細胞濃度をまねくのでLB以外の培地の使用は勧められない。播種したLB培地を37℃で一晩(12〜16時間)インキュベートした。長時間のインキュベーションの際に細胞死と溶解が起こりプラスミドロスをきたすので、16 時間より長く培地をインキュベートしなかった。600オングストロームの光学濃度の読み取り(OD₆₀₀の読み取り)2-4から細胞が収集とプラスミドDNA単離に適切な増殖濃度に達したことが示された。対象とするプラスミドを含むE．coli細胞のみの増殖を行わせるために寒天培地も液体培養液も全てに抗生物質を含めた。プラスミドはE．coliに耐性のある抗生物質を与え、プラスミドを含まないものよりプラスミド保有細菌の選択を可能にする。複製でプラスミドを受け入れないE．coli後代は、プラスミドを含むものより速やかに抗生物質のない培地で増殖する。従って、後代は抗生物質の選択的圧力の存在しないときにプラスミドを含む細胞の培養物を過剰増殖する。本実施例に用いられる培地に含まれる抗生物質は、単離されるべきプラスミドが耐性遺伝子を含むものとした。下記の表１にクローニングに一般に用いられる数種の抗生物質、及び濃縮した保存液と使用液の調製及び抗生物質の効力を維持するために適切な貯蔵条件を示す。表１抗生物質の調製とクローニングにおける使用 ^*フィルター孔サイズ0.2μｍ B．プラスミドDNAの収量プラスミドコピー数は、プラスミドDNA収量に影響する最も重要な要因の１つである。コピー数は、主としてプラスミド内の複製起点内外のDNA領域によって求められる。レプリコンとして知られるこの領域は、細菌酵素複合体によりプラスミドDNAの複製を制御する。あるDNA配列は、具体的なプラスミドに挿入された場合に複製を妨害することによりプラスミドのコピー数を少なくすることがある。更に、過度に大きなDNA挿入断片もプラスミドコピー数を減少させることがある。多くの場合、具体的なプラスミド構築物の正確なコピー数は不明である。しかしながら、これらのプラスミドの多くは少数の一般に用いられる親構築物に由来する。表２にそのプラスミドのいくつかを報告されたコピー数/細胞と共に示す。そのプラスミドに対して発表されたコピー数に基づく理諭収量も表２に示す。本実施例のための高コピー数はプラスミドコピー数>200である。低コピー数プラスミドのコピー数は<50である。表２一般に用いられるプラスミドのコピー数 *理論プラスミド収量は、37℃で16時間増殖した培養物１ミリリットルあたり2 .0×109細胞と仮定した各プラスミドの報告されたコピー数とサイズから算出した。 **異種DNAが挿入される一連のユニークな制限部位によって分けられた２種類の異なるバクテリオファージRNAポリメラーゼ配列を有する転写ベクターに関し、プロメガコーポレーションに米国特許第4,766,072号が付与されている。表２の参考：C．細菌株の選択エンドヌクレアーゼＩは、二本鎖DNAを分解する12kDaの周辺タンパク質である。このタンパク質は、遺伝子endAによってコードされている。E．coli遺伝子型e ndA1は、エンドヌクレアーゼＩの不活性型を生じるendA遺伝子の突然変異を意味する。endA遺伝子内にこの突然変異があるE．coli株をendAマイナス(endA^-)と呼ぶ。表３は、endA^-E．coli株のリストである。E．coli遺伝子型にendA1がないことは、活性エンドヌクレアーゼＩを発現する野生型遺伝子の存在ステムを用いてendA⁺株及びendA^-株双方から高品質DNAが容易に得られた。しかしながら、あるendA+株は多くの用途に問題があることがわかった。表４は、野生型endA遺伝子(endA⁺株)を保有することが既知であるE．coli株のリストである。一般に、本システムとの使用が可能なときはいつでも、特に自動蛍光シークエンシングのような用途にendA^-株の使用が勧められる。表３との使用に勧められるE．coliのendA^-株表４ E．coliのendA⁺株E．coliのendA⁺株及びendA^-株双方から単離したプラスミドDNAの品質を改善するために、プロメガ製Wizard＠+SVミニプレップDNA精製システムはアルカリプロテアーゼ溶液が含まれる。はじめはズブチリシンカールスバーグとして同定されたアルカリプロテアーゼは、細菌のバシラス・リケニホルミスから単離される。 Guntelberg，A.V．& Otteson，M.(1954)Compt．Rend．Trav．Lab．Carlsberg 29 ，36．透明細菌溶解液の調製中の本DNA単離操作での溶解工程の終わりにアルカリプロテアーゼを添加してエンドヌクレアーゼを不活性化した。アルカリプロテアーゼはタンパク質を非特異的に分解するために作用するので、透明細菌溶解液中のタンパク質混入物のレベルを全体に低下させる。Aehle，W.ら（1993）J．Biotechnology 28，31;Van der Osten，C．ら（1993）J．Biotechno logy 28，55．アルカリプロテアーゼは、pH9以上で最適に活性である。溶解液を中和する場合、アルカリプロテアーゼ活性はかなり低下する。米国特許精製システムにおけるアルカリプロテアーゼの使用を示すものである。 IV．自動蛍光シークエンスに対する特別な考察自動蛍光シークエンシングに使用するプラスミドDNAを単離するために、収量及びプラスミド特性を最適化するプラスミド型とE．coli株の選択に特別な考察が示されなければならない。自動蛍光シークエンシングの最適な結果は、高コピ一数プラスミドとE．coliのendA^-株を用いることにより通常得られる。精製したプラスミドDNAは、満足すべき自動サイクルシークエンシングの適切な濃度範囲内、好ましくは0.1μｇ/μｌ以上、理想的には0.2μｇ/μｌ以上でなけプレップDNA精製システムを用いて精製したプラスミドDNAについて適切な濃度範囲を得るために、高コピー数プラスミドからのプラスミドDNAを下記のように細菌から単離してから１μｇ分割量を取ると共にスピード-バックミクロ遠心分離機で減圧乾燥することにより濃縮した。乾燥したDNAを６μｌのヌクレアーゼを含まない水に再懸濁し、濃度を求めた。低コピー数プラスミドからのプラスミド DNAと使用する場合、溶離工程後にVII.A又はＢ項に示されるエタノール沈殿工程を行った。適用する前にアガロースゲル/臭化エチジウム定量、低コピー数プラスミドIdを用いる場合に特に勧められる分析法によりDNA濃度を求めた。分光光度法によるDNA定量の代替的分析法は、誤差の傾向があり、多量の試料が必要である。＋SVミニプレップDNA精製システムにより通常3.5〜5μｇのプラスミドDNAが得られた。低コピー数プラスミドのシークエンシングに十分なDNAを得るためにのLB培地からのプラスミドDNAが1.5〜3.0μｇに変動した。注:細胞溶解物の中の混入物質に対するプラスミドDNAの比率が低いとDNAの同時精製の可能性と本又は他のDNA精製システムによる混入物が著しく増加することから、低コピー数のプラスミドはプラスミド精製システムに特別の問題がある。従って、自動傾向シークエンシング用途のためには高コピー数プラスミドの使用が勧められる。 V．他の使用材料（溶液の組成物はX項に示される。）抗生物質を含むLB寒天平板抗生物質を含むLB培地エタノール(95％） 14,000×gが可能なミクロ遠心分離機滅菌した1.5mlのミクロ遠心管エタノール(70％)（任意） 7.5M酢酸アンモニウム（任意）パスツールピペット(9"長か又は加熱により先端を伸ばしたもの)（任意） 10×TE緩衝液（任意） 10,000×gが可能なテーブルトップ遠心分離機(2〜10mlの培養液からE．coliを収集するため)（任意）（任意）真空源（任意） VI．透明溶解液の生成細菌の透明溶解液の精製から始めた。E．coliを含むプラスミドをアルカリ溶解に供することにより達成され(Birnboim，H.C．& Doly，J.(1979)Nucl．Acids Re s．7，1513)、粘稠な透明細胞溶解液が得られた。次の工程のアルカリ溶解物の中和により細胞破片の白色沈殿の生成が引き起こされ、プラスミドDNAが上清に可溶化した。遠心分離後に液体を除去及び処理してプラスミドDNAを精製した。高コピー数プラスミド(表２参照)を単離する場合、多数の分子生物学用途に十分なプラスミドDNAを得るために5mlを超える細菌培養物を処理することは不要ピンカラムの容量を超え、プラスミド収量の増加が見られない。低コピー数プラスミドを単離する場合、用途に十分なDNAを回収するために10mlの細菌培養物を処理することが必要であった。しかしながら、10mlの培養物を処理することにより、細菌溶解液の透明が不十分になるのでプラスミドDNA中の混入物が増加した。従って、10ml(低コピー数プラスミドの場合)又は5ml(高コピー数プラスミドの場合)より多く処理することが必要になった場合、培養物を10ml(低コピー数)又は5ml(高コピー数)分割量に分け、DNAを単離するように処理し、溶離したDNAを精製プロセスの終わりにプールした。溶解液を添加した後にアルカリプロテアーゼを用いた。この酵素を約250μｇ/ 試料で添加して細菌細胞の溶解中に遊離するエンドヌクレアーゼや他のタンパク質を不活性化した。これらのタンパク質は、単離したDNAの品質に悪影響を及ぼうことがある。アルカリ溶解操作中の条件であるpH9以上で最適に活性であることからアルカリプロテアーゼはこの方法に有効である。この方法で調製したプラスミドDNAについてアルカリプロテアーゼ活性のキャリオーバーを試験した。DNA 試料中には10ng末満のプロテアーゼが残存すること(添加したプロテアーゼの<0. 004％)及びプロテアーゼがpH9よりも低いpHでほとんど活性がないことがわかった。この操作で調製されたDNAを、蛍光シークエンシング、制限酵素消化、の範囲で広範に試験した。結果から、プロテアーゼのキャリオーバーはこれらの用途に影響しないことが示される。しかしながら、アルカリプロテアーゼ活性が関係する場合には、DNA試料を65℃で５分間加熱することにより酵素は不可逆的に不活性化される。製システムを用いる単離操作を開始するために行われる工程を詳しく纏める。手順を始める前に、最終容量55mlとして35mlの95％エタノールを加えることに 1．高コピー数プラスミドを含む1〜5mlの細菌培養物又は低コピー数プラスミドを含む10mlの細菌培養物をテーブルトップ遠心分離機を用いて10,000×gで５分間遠心することにより沈降させた。上清を流し出し、管を逆さにペーパータオルに吸い取り余分な液体を除去した。はピペットで完全に懸濁した。細胞を十分に再懸濁することは不可欠なことである。まだミクロ遠心管にない場合には、再懸濁した細胞を滅菌した1.5mlのミクロ遠心管に移した。注:染色体DNAのせん断、従ってプラスミドDNAの混入を防止するために、本工程後に撹拌しないことが勧められる。管を逆にして混ぜなければならない。 (撹拌せず)。得られた溶液を細胞浮遊液が透明になるまで約1〜5分間インキュベートした。注:アルカリプロテアーゼ液の添加(工程4)に進める前に溶解液が部分的に透明になることを見ることは重要である。しかしながら、５分より長くインキュベートしてはならない。 4．10μｌのアルカリプロテアーゼ液を加え、管を４回逆にして混合した。次に、得られた混合液を室温で５分間インキユベートした。注:５分間を超えるインキュベーションによりプラスミドDNAのニッキングが生じる。 6．細菌溶解液をミクロ遠心分離機で14,000×g、室温で10分間遠心分離した。 VII．プラスミドDNAの精製選択を可能にする(例えば、図12に示された２つの単離経路を参照)。詳しくは、プラスミドDNAを洗浄するミクロ遠心分離を用いて細菌溶解液からプラスミドDNA が精製される。また、細菌溶解液をスピンカラムに通過させると共にプラスミド DNAを洗浄するために真空が用いられる。ミニプレップ真空アダプターは、ルドは、１リットル又は２リットルの枝付きフラスコに挿入しやすい単一ユニッニホールドは、20試料まで収容する単一の内臓式ユニットである。標識し、真空マニホールドに取り付けられたミニプレップ真空アダプターに挿入する。ミニプレップ真空アダプター/スピンカラム連結部は、スピンカラムがミニプレップ真空アダプターの底に相接しないように設計される。これにより真空密封を保持しつつミニプレップ真空アダプターの使用が可能である。細菌の透明溶解液をスピンカラムに添加する。真空が用いられ、溶液をスピンカラムに通過ピンカラムに注ぎ、真空で通過させた。真空マニホールドからスピンカラムを取り出した後にDNAを溶離した。DNAの溶離は、ヌクレアーゼを含まない水を加えた後にスピンカラムを遠心分離することにより達成される(VII.A又はB項)。本実施例のVII.A項には、遠心分離によるプラスミドDNAの精製が記載され、VI I.B項には真空によるプラスミドDNAの精製が記載される。 A．遠心分離による集管に挿入することによりプラスミドDNA精製ろ過ユニットを調製した。次に、得られたろ過ユニットを用いて次のようにプラスミドDNAを単離する。傾瀉することにより移した(VI項工程６;約850μｌ)。白色沈殿と上清とのかき混ぜ又は移動を避けるために注意して移動を行った。白色沈殿が偶然にスピンカラムに移った場合には、スピンカラム内容物を滅菌した1.5mlのミクロ遠心管に流し戻し、14,000×gで5〜10分間遠心した後に再傾瀉した。得られた上清を本試料のために最初に用いた同じスピンカラムに移した。スピンカラムを下記の工程でも再び用いられるが、同じ試料についてのみ用いられる。 2．上清をミクロ遠心分離機で14,000×g、室温で１分間遠心分離した。次に、ースルーを捨てた。次に、スピンカラムを捕集管に挿入した。 4．得られたスピンカラム捕集管アセンブリをミクロ遠心分離機で14,000×g、室温で１分間遠心分離した。ーを捨てた。スピンカラムを捕集管に挿入した。 7．得られたスピンカラム捕集管アセンブリをミクロ遠心分離機で14,000×g、室温で２分間遠心分離した。に注意した。スピンカラムがカラム洗浄液を伴った場合には、アセンブリを14,0 00×gで１分間再び遠心分離した後に新しい1.5ml捕集管に移した。ムに加えることによりプラスミドDNAを溶離した。次に、カラム捕集管アセンブリをミクロ遠心分離機で14,000×g、室温で１分間遠心分離した。 10．DNAを溶離した後、1.5mlのミクロ遠心捕集管からアセンブリを取り出し、て低コピー数プラスミドを用いる場合には、下記の注を行うことが不可欠であることがわかった。注:低コピー数プラスミドと高培養量を用いる場合に自動蛍光シークエンシングの最適結果を行わせるために、DNAをスピンカラムから溶離した後にエタノール沈殿工程を行ってDNAを濃縮することは不可欠である。この沈殿工程は、次の試薬と条件を用いて行われなけれぼならない。 11．溶離したDNAを次のように濃縮した。50μｌの7.5M酢酸アンモニウムと375μ ｌの95％エタノールを溶離したDNAの100μｌ試料に加えてDNAを沈殿した。得られた混合液を14,000×g、室温で15分間遠心分離した。9"パスツールピペット又は加熱により先端を伸ばした通常のパスツールピペットを用いて上清を注意深く吸引して半透明のDNA沈降物をかき混ぜることを避けた。沈降物を250μｌの70％エタノールで簡単に洗浄してから14,000×gで５分間遠心分離した。次に、エタノールを吸引し、沈降物を3〜5分間風乾して残留エタノールを蒸発させた。乾燥したDNA沈降物を10〜25μｌのヌクレアーゼを含まない水に懸濁した。DNA沈降物を懸濁するために用いられる水の量は、経験的にDNAの濃度に依存して必然的に求められた。アガロース/臭化エチジウムを用いて本手順に従って単離したDNAを定量した。 12．最後に、濃縮した単離DNAをTE緩衝液中で保存するために10μｌの10×TE緩衝液を100μｌの溶離したDNAに加えることにより調製した。TE緩衝液中DNAのミクロ遠心管を-20℃以下で保存した。注:DNAを-20℃以下で保存する場合にはTE緩衝液のような緩衝液を添加せずに水中で安定である。DNAはTE緩衝液中4℃で安定である。 TE緩衝液中でのDNA保存の結果を考察することは重要である。詳しくは、TE緩衝液中のEDTAは酵素活性の補因子として必要とされるマグネシウムをキレート化することにより酵素の活性を阻害することができる。TE緩衝液の添加(及びEDTA の存在)は、DNA濃度が低い場合にたいてい問題となり、多量のDNA溶液が反応に添加されなければならない。TE緩衝液は蛍光DNAシークエンシングに用いられない。 B．真空による真空アダプターに決まった所でちょうど良くなるまで挿入した。 SVミニプレップスピンカラムに移した。沈殿がいくらかスピンカラムに移った場合には、液体と沈殿をミクロ遠心管に流し戻し、14,000×gで１分間遠心分離した後に液体だけをスピンカラムに傾瀉した。同じ試料の場合にのみスピンカラムを再使用した。いた。液体が全てカラムを通過したときに真空を解除した。カラムに加えた(VI項参照)。に通過させるために真空を用いた。液体が全てカラムを通過したときに真空を解除した。ムと捕集管アセンブリを14,000×gで２分間遠心分離して残留カラム洗浄液を除去した。2mlの捕集管とこの工程で集めた液体を遠心分離後に捨てた。心管に移した。ムに加えると共にスピンカラムと水をミクロ遠心管で14,000×g、室温で１分間遠心分離することによりプラスミドDNAを溶離した。遠心管から取り出し、捨てた。特に自動蛍光シークエンシングで低コピー数プラスミドを用いる場合には、下記の注を行うことは不可欠である。注:低コピー数プラスミドと高培養量を用いる場合に自動蛍光シークエンシンから溶離した後にエタノール沈殿工程を行ってDNAを濃縮することは不可欠である。この沈殿工程は、次の試薬と条件を用いて行われなければならない。 10．溶離したDNAを次のように濃縮した。50μｌの7.5M酢酸アンモニウムと375μ ｌの95％エタノールを溶離したDNAの100μｌ試料に加えた。得られた混合液を14 ,000×g、室温で15分間遠心分離した。9"パスツールピペット又は加熱により先端を伸ばした通常のパスツールピペットを用いて上清を注意深く吸引して半透明のDNA沈降物をかき混ぜることを避けた。沈降物を250μｌの70％エタノールで簡単に洗浄してから14,000×gで５分間遠心分離した。次に、エタノールを吸引し、沈降物を3〜5分間風乾して残留エタノールを蒸発させた。乾燥したDNA沈降物を10〜25μｌのヌクレアーゼを含まない水に懸濁した。DNA沈降物を懸濁するために用いられる水の量は、経験的にDNAの濃度に依存して必然的に求められた。アガロース/臭化エチジウムを用いて本手順に従って単離したDNAを定量した。 11．最後に、濃縮した単離DNAをTE緩衝液中で保存するために10μｌの10×TE緩衝液を100μｌの溶離したDNAに加えることにより調製した。TE緩衝液中DNAのミクロ遠心管を-20℃以下で保存した。注:DNAを-20℃以下で保存する場合にはTE緩衝液のような緩衝液を添加せずに水中で安定である。DNAはTE緩衝液中４℃で安定である。 TE緩衝液中でのDNA保存の結果を考察することは重要である。詳しくは、TE緩衝液中のEDTAは酵素活性の補因子として必要とされるマグネシウムをキレート化することにより酵素の活性を阻害することができる。TE緩衝液の添加(及びEDTA の存在)は、DNA濃度が低い場合にたいてい問題となり、多量のDNA溶液が反応に添加されなければならない。TE緩衝液は蛍光DNAシークエンシングに用いられない。 VIII．他の考察 A．大量プラスミドプレップの実施 Cat.#A7640)、マキシプレップ(100〜500ml培養物;Cat.#A7270)又はメガプレップ (500〜1,000ml培養物;Cat.#A7300)DNA精製システムが用いられる。これらのシステムは高コピー数プラスミドに対して各々500μｇ、1mg及び2mgまでの量のプラスミド精製用に設計されている。 B．低融点/ゲル化温度アガロースゲルからのプラスミドDNAの精製 DNAと使用するために設計されていない。低融点/ゲル化温度アガロースバンドスライスからプラスミドDNA(環状又は線状)を精製するためにはプロメガ製の M1741)が勧められる。 IX．トラブルシューティング１リットルの蒸留水に溶解する。オートクレーブにかけ55℃に冷却した後に抗生物質を加える(表１参照)。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Improved filtration system and methodTECHNICAL FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to filtration systems or devices and methods for isolating organisms. Further details Without limitation and without limiting the scope, the invention relates to ribonucleic acids (RNA) or Isolate or separate nucleic acids, such as oxyribonucleic acid (DNA), from other materials, such as cell debris Release system and method. The invention relates to DNA, more particularly plasmid DNA. A filtration system or apparatus and method for isolating.Background of the Invention It is well known that nucleic acids bind to silica. This property is relevant for nucleic acids, especially DNA, Especially for collecting or isolating plasmid DNA from cell debris and other materials. Was. See, for example, Patent Cooperation Treaty Published International Patent Application No. 95/06652. Shi Using silica material as a Rica-containing resin or as a filter impregnated with silica Nucleic acids contained in living cells may be separated from other materials within the cells according to the following general procedure: Isolated or separated from them. First, cells are disrupted or lysed, and a lysis solution, To produce a liquid containing the ingredients. Next, treat the lysate to remove cell debris and Generate Clear lysates are typically centrifuged to settle debris It is made by decanting and storing the clear solution obtained. next Designed to Facilitate Binding of Nucleic Acid Materials of Interest to Silica The clear solution is contacted with the silica in the presence of a pick agent. The last step of the method (Usually after several intermediate washing or treatment steps), the nucleic acid bound to the silica is Is released by eluting nucleic acids from silica with nuclease-free water Things. In the above general procedure, a silica material is used before or after binding to the nucleic acid material in the lysis solution. Put the ingredients in the filter basket. Filter basket, basket / tube Standard-size microcentrifuges in such a way that the assembly fits inside a standard microcentrifuge. Designed to be incorporated into a centrifugal collection tube. Filter basket contains lysate When filled, it retains the silica material and receives external forces such as centrifugation or vacuum. The lysate is designed to allow the material to pass through the collection tube when shirred. The above type Commercial filter basket designed for use in nucleic acid isolation according to the procedure of Is valid for one of two general structures. One structure is used for rotary filtration Designed to be inserted into the collection tube and rotated by a centrifuge (Designed) is a filter basket with a fairly flat bottom. For example, US Patent No. 5,552,325 filter basket and GLASSMAX^TMSpin cart See Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD, USA I want to be. The other general structure protrudes from the bottom of the filter basket Is a filter basket structure designed to be used interchangeably . Inc. See Hilden, Germany. The main structure of the two commercially available filter baskets used today, outlined above Wants to use those baskets to isolate nucleic acids such as DNA There are drawbacks. Is the flat-bottom filter basket the bottom of the filter basket? From the bottom of the collection tube for a large amount of solution to be collected while The bottom of the filter is high enough that a large amount of solution There is the advantage of allowing centrifugation. However, a flat bottom filter Baskets have the drawbacks and uses of the binding and washing steps of the general nucleic acid isolation procedure described above. Do not allow users to use vacuum filtration to process the contents of the basket. No. Filter baskets with protruding vacuum adapters to isolate nucleic acids Gives the user the flexibility of using centrifugation and / or vacuum filtration. Only However, the projecting part of the vacuum adapter of the filter basket is Volume of solution that can be spun down into the collection tube without touching the bottom of the kit (i.e., the end of the adapter) Be sure to restrict To address that last issue, use a filter basket. The user is treated in one spin cycle using a flat bottom filter basket Two or more spin cycles in a microcentrifuge to process the same amount of lysate It is often necessary to use The last type of commercial filter bar For example, a miniprep microcentrifugal spin column commercially available from Qiagen Please refer to. The mounting part protruding from the filter basket is Another problem is that the centrifuged solution collects in the grooves in the mounting area. Potential problems from carryover from one separation process step to the next. Occurs. The present invention is an improved filtration system that has unlimited capacity and commercially available bumps. Commercially available with no carryover problem inherent to the outgoing vacuum adapter filter basket Centrifuge to handle volumes of solution comparable to the flat bottom filter basket assembly It allows the use of separation or vacuum filtration interchangeability. The present invention also provides the improved filtration of the present invention for isolating nucleic acids such as DNA. How to use the system. The method of the present invention is adaptable in its application, It is particularly efficient in producing yields of isolated nucleic acid and requires less labor than known nucleic acid isolation methods. Not intensive. The nucleic acids produced in the practice of the method of the present invention are particularly transparent and Optical DNA sequencing, amplification reaction (especially used for polymerase chain reaction (PCR) Later use such as transfection, gene therapy and gene expression Well suited for the way. Many other uses for nucleic acids isolated or isolated using the present invention are: It will be apparent to those skilled in the art. Representative prior art includes, but is not limited to:Inventor Patent number Lyman et al. U.S. Pat.No. 4,683,058 Limb U.S. Pat.No. 4,832,842 Setcavage et al. U.S. Patent No. 5,491,067 Paley U.S. Pat.No. 4,046,479 Guirguis US Patent 5,429,803 Diekmann U.S. Pat.No. 4,956,298 Nieuwkerk U.S. Patent No. 5,438,128 Sheer et al. U.S. Pat.No. 5,124,041Summary of the Invention In general, in one aspect, the invention is an improved filtration system. other In an embodiment, the present invention provides for isolating or separating nucleic acids, especially DNA, from cell debris. Is the way. The systems and methods of the present invention are compatible with conventional microcentrifuges and conventional Designed to be used with either of many different vacuum manifolds It is. The filtration system or assembly of the present invention comprises a separate filter basket and vacuum Including adapter parts. If the implementation is optional, the system or assembly Yellowtail contains conventional microcentrifuge collection tubes. The vacuum adapter includes a cylindrical tube having a first end and a second end. Vacuum adapter The first end of the adapter is cooperated with a filter basket that can be inserted. Restricts passage and is substantially sealed. The second end of the adapter is a vacuum manifold It is designed to be connected to a vacuum source such as For example, the second end of a vacuum adapter For the puller part, both systems are Promega Corporation, Wisconsin, USA To be used with the password. Filter basket and vacuum adapter limited to first end of vacuum adapter It is designed to cooperate in that it is integrated or frictionally incorporated and substantially sealed. The outer surface of the filter basket or the inner surface of the vacuum adapter, if appropriate, Spreading or narrowing can be substantially sealed. adapter When the second end of the lock is attached to a vacuum manifold, a substantial seal is Allows a vacuum seal to occur between the filter and the adapter. Implementation smell In some cases, the filter basket has a silica filter or filter There is a high surface area supporting the disk (or disks). Preferred person of the present invention It is the silica filter material that the nucleic acid is ultimately isolated in the method. In its last implementation, the end of the filter basket containing silica Preferably a hole is drilled to hold one or more disks while centrifugal or vacuum The liquid flows through the auxiliary means. The method of the present invention provides a selection option made possible by using the filtration system of the present invention. Using a selection of process steps used to separate the material in question from the lysate This is a method for purifying or isolating material, especially plasmid DNA. Specifically, the present invention The method of isolating nucleic acid material of the present invention is based on centrifugal force as generated in the microcentrifugation step or on the experiment. Allows the use of vacuum aids such as those available with vacuum manifolds . To the applicant's knowledge, other filtration systems or methods previously disclosed or suggested. The method does not provide the surprising and unexpected utility of the present invention.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 is a plan front view of the filter basket of the present invention. FIG. 2 is a bottom perspective view of the filter basket of the present invention. FIG. 3 is a bottom view of the filter basket of the present invention. FIG. 4 is a cross-sectional view of the filter basket taken along line 3-3 in FIG. FIG. 5 is a plan front view of the vacuum adapter of the present invention. FIG. 6 is a bottom front view of the vacuum adapter of the present invention. FIG. 7 is a plan end view of the vacuum adapter of the present invention. FIG. 8 is a cross-sectional view of the vacuum adapter of the present invention taken along line 7-7 of FIG. . FIG. 9 shows the present invention including a filter basket inserted into the vacuum adapter of the present invention. FIG. 3 is a cross-sectional view of the light filter assembly. FIG. 10 is a cross-sectional view of the filter basket of the present invention contained in the collection tube. FIG. 11 is a cross-sectional view of the collection tube. FIG. 12 shows a method using the filtration system of the present invention to isolate plasmid DNA. FIG.Detailed description of the invention The two main components of the filtration system of the present invention, the filter basket 10 and the vacuum adapter The putter 12 is shown in FIGS. 1-4 and 5-8, respectively. (The same structure is shown in each drawing. Use the same numbers for ) The filter basket 10 has a first end 16 and a second end 18. Including a hollow cylindrical tube 14. The cross-sectional structure of the filter basket is not important, In this embodiment, first end 16 includes shoulder 20 and rim 22. Shoulder 20 and rim 22 It will cooperate with the corresponding structure for the collection tube or the capture tube detailed in Figure 11 and shown in Figure 11. It is configured as follows. The first end 16 has an open end 24. Filter basket second end 18 Has a perforated structure or means, ie, a series of small openings or windows 26. With the wall of cylindrical tube 14 Together these openings form the "basket" structure of the filter basket. This In most cases, the perforating structure or means 26 is It is important to note that it forms a plane that is vertical. Therefore, the perforated structure 26 is often found as a flat bottom at the second end 18 of the filter basket 10 To form This feature of the filter basket is in the collection tube where the flat bottom cooperates This is important because it leaves a lot of capacity empty. Flat bottom of filter basket 10 ( (Best shown in FIG. 4) is at least one sheet of silica in the basket structure. Holds a filter disc. Figure 4 shows two silica filter disks Figure 28 shows that 28 is held in the basket structure. 3 and 4 show the perforated structure 26 opposite the filter means or silica disk 28. FIG. Silica disk 28 is limited to the bottom of filter basket 10 Be incorporated. A filter disk 28 in the hollow cylinder 14, for example, an inward radial Other methods are used to hold the steps, dimples or beads of the structure It is within the contemplation of the present invention. FIGS. 5 to 8 show the vacuum manifold adapter 12 (often a filter filter) of the present invention. FIG. The manifold adapter 12 has a first end and a second end. It has ends 30 and 32 respectively and is formed by a cylinder 34. The first end 30 has an opening 36 Into which the second end 18 of the filter basket 10 is inserted. filter The outer diameter of the second end 18 of the basket 10 is designed to cooperate with the inner diameter of the vacuum adapter 12 Filter basket 10 fits or frictionally or And is substantially sealed. (This is best seen in FIG. 9.) The second end 32 of the adapter 12 forms a thread 36 therein. screw The manifold constitutes a particularly preferred example of a manifold in which the present invention is used. . It is shown on page 155 of the Gaga Corporation Catalog, and its description is included in the present specification. Shall be rare. Further, the second end 32 of the manifold adapter 12 has an outlet opening 38. Configured internally to form. The material to be filtered according to the invention has an outlet opening Flow through 38. Vacuum adapter 12, for example, so that it can be easily grasped between fingers Having an outer surface 40 which is any rough, i.e., serrated. FIG. 9 shows the filter basket 10 inserted into the manifold adapter 12. FIG. To fit the friction at the surface intersection 42, apply vacuum It is prevented from being completely inserted into the putter 12 and is substantially sealed. Filter bar The frictional engagement between the sket 10 and the vacuum adapter 12 forms a chamber 44. FIG. 10 is a cross-sectional view showing the filter basket 10 of the present invention inserted in the collection tube 46. FIG. The collection tube 46 has an open end 47 and a closed end 49. Filter basket 10 It should be noted that a limited fit between the and the collection tube 46 is not contemplated. Cooperative The matching shoulder 20 and the collecting tube lip 48 completely fit the filter basket 10 into the collecting tube 46. To prevent slippage. The collection chamber 50 in the collection tube 46 is provided with a tube wall and a filter. -Formed by the flat bottom of the basket 10. This collection Chan Considerably larger than the chamber formed by the Luther basket. Filter bar The flat bottom of the sket 10 creates a similar protrusion that essentially limits the volume of the chamber in the collection tube. Because there is no end. The flat bottom of the filter basket 10 is It also avoids carryover yield problems inherent in the technology. FIG. 11 is a cross-sectional view showing the collection tube. The collection tube is centrifuged, for example, Used with the filter basket of the present invention when isolating nucleic acids such as DNA It is. The filter system of the present invention can be used for many different objects, including any type of nucleic acid material. It is contemplated that it will be used to isolate any one of the qualities. However The most preferred method of using a filter system is to impregnate the silica material DNA using the filter system of the present invention fitted with a modified filter Thus, the isolated DNA species is most preferably plasmid DNA. Especially preferred New Impregnated Filter Material, Cisco Corporation, California, USA SPEC commercially available from Irvine^TMIt is a silica disk. For use in the method of the present invention Other suitable silica systems intended for use in filter baskets Materials include resin materials described in PCT Publication No. 95/06652, Is included in the specification of the present application. Organism containing the DNA species in question To dissolve and bind to the silica component of the filter basket assembly. Any of a number of different processing methods can be used for this. The right material to do it It is commercially available as a kit. Wash and elute DNA from basket filter Appropriate techniques for performing this are described in the literature. The following non-limiting examples illustrate the use of embodiments of the present invention. It is. Specific Implementation of the Filter Assembly and Method of the Invention as Shown in the Examples Refers to components of the Niprep DNA purification system. The present invention used in Examples It is called a prep spin column or simply a spin column. The vacuum adapter parts are Below it is called a miniprep vacuum adapter. This example is one embodiment of the present invention. It should be understood that it is inevitable. Other embodiments of the present invention are directed to the teachings herein. For those skilled in the art.Example I. System overview In molecular biology operations, small pieces of plasmid DNA commonly known as "minipreps" Large scale isolation operations are common. For example, Ausubel, F.M. (1989) Current protoc ols in Molecular Biology, Vol. See 2, John Wiley & Sons, NY. Many miniprep protocols have been developed over the years, but most have been consistent. Was not proven to be reliable. Plasmid DNA yields vary in quantity and quality. Fluctuates and limits the applications used. In addition, known miniprep operations are particularly If many minipreps are performed at the same time, it is painful and time consuming. Provide a convenient and reliable way to connect with standard miniprep operations. Removes many problems. This system is used to isolate plasmids. It works and works best when the plasmid is <20,000 bp. Is completed within 30 minutes depending on the number of samples to be processed. In addition, this protocol No further manipulation of the isolated plasmid (if high copy number plasmids are used) A ribonuclease inhibitor such as a bonuclease inhibitor (Promega Cat. # N2511) When supplemented, it is also used for in vitro transcription reactions. Microcentrifuge to advance to rep spin column and wash plasmid DNA Pass through an SV mini-prep spin column and the plasmid DNA is washed using vacuum. Test manifold, 20 samples, Promega Cat. # A7231; or Vac-Can purify plasmid DNA as described in section VII.B. . The use of a vacuum manifold reduces the time and effort required to purify plasmid DNA. Significantly reduces the amount of force and reduces the amount of plastic used compared to previous systems. Significantly reduce the volume. Procedure used to isolate plasmid DNA from bacteria in cultures grown from The filter basket 10 is the same as the filter basket 10 shown in FIGS. 10 means the embodiment. Similarly, the vacuum adapter 12 and the collection tube 46 , FIGS. 5 to 8 and FIGS. 10 to 11 show an embodiment of the vacuum adapter 12 and the collecting tube 46, respectively. It is like. The system diagram (Fig. 12) is based on vacuum filtration, the left path of the diagram or centrifugation, Illustrates the use of that system to isolate plasmid DNA using the right route Things. The method shown in FIG. 12 is shown in five steps (I-V). In step I, the culture dish 3 Pick a single colony of bacteria 1 and inoculate 1-10 ml of LB culture containing the appropriate antibiotic Used to Incubate the resulting inoculum at 37 ° C overnight (12-16 hours) + Resuspend well in SV miniprep cell resuspension. In step II, the resulting resuspension Transfer the bacterial cell solution to the microcentrifuge tube 2. Next, add the lysate to the cell solution and reverse. Mix and incubate for 1-5 minutes, thus destroying cells and bringing DNA into solution Release. An alkaline protease solution is added to the obtained solution, and the mixture is incubated at room temperature for 5 minutes. Incubate. Next, a neutralizing solution is added to bring the pH of the solution to neutral or physiological pH. The neutralized solution also contains guanidine, which promotes the binding of DNA to silica. next, The resulting neutralized mixture is centrifuged to sediment cell debris. In Step III, (Shown as spin basket 10) and vacuum filtered to isolate DNA 2 ml collection tube 46 or vacuum Insert into miniprep vacuum adapter 12 on manifold 8. Sediment cell debris Exhale. The vacuum filtration path (step IVA) of FIG. 12 is inserted into the port 7 of the vacuum manifold 8 and FIG. In step IVB of this route, the supernatant is removed from the filter basket 10. A vacuum is used on the manifold to remove, and the vacuum is subsequently released. H After the cleaning, the cleaning liquid is removed from the basket using a vacuum. In step IV.C, fill The tar basket 10 is transferred to the collection tube 46. Next, the resulting filter basket / tube Rotate the assembly on a fast-centrifuge for 2 minutes to remove any remaining column wash I do. Insert the ram (filter basket 10) into the second collection tube 46 and microcentrifuge the supernatant To remove. Next, the filter basket 10 is washed with a column by centrifugation. Wash twice with liquid to remove the cleaning liquid from the basket. Discard the solution after each wash. Centrifugation is used to remove the supernatant and wash the filter basket. Or whether vacuum filtration is used, as indicated by the converging arrows in FIG. Transfer the basket 10) to a 1.5 ml sterile microcentrifuge tube 9. Next, the nuclease Add fresh water and centrifuge the resulting assembly to filter the plasmid DNA. Eluted from the tar basket. II. System composition Contains sufficient reagents and components for 50 isolations from a 10 ml culture. See section X below for the composition of each liquid in this system. III. Plasmid and E. coli E. coli strain selection and preparation Plasmid DNA was purified from the culture. Plasmid yield depends on the amount of bacterial culture, Varies depending on many factors including plasmid copy number, culture medium and bacterial strain did. The protocol used in this example is E. coli. plasmid DNA from E. coli bacteria It is for isolation. A. E. Preparation of E. coli E. coli from new Luria-Bertani (LB) agar plates containing antibiotics. Complete isolation of E. coli Selected single colony, and use the colony for 1-10 ml of LB containing antibiotics. The medium was inoculated. Rich media, such as terrific bouillon, use DNA purification systems Use of media other than LB is not recommended as it leads to very high cell concentrations that overload No. The inoculated LB medium was incubated overnight (12-16 hours) at 37 ° C. Long time Cell death and lysis occur during incubation, resulting in plasmid loss. The medium was not incubated for more than an hour. 600 angstrom optical density Degree reading (OD₆₀₀Cells read from 2-4 are suitable for harvesting and plasmid DNA isolation High growth concentrations were reached. E. containing the plasmid of interest agar to grow only E. coli cells Both ground and liquid cultures contained antibiotics. The plasmid is E. coli. resistant to E. coli Give antibiotics and select plasmid-bearing bacteria from those that do not contain plasmids Make it work. E. Not accepting plasmid for replication. E. coli progeny contain plasmids Grow more quickly in antibiotic-free media than they do. Therefore, progeny should be selected for antibiotics. The culture of cells containing the plasmid is overgrown in the absence of selective pressure. Book The antibiotics contained in the medium used in the Examples are resistant to the plasmid to be isolated. Sex genes were included. Table 1 below shows some commonly used cloning species Preparation of antibiotics and concentrated stock solutions and working solutions and maintenance of antibiotic efficacy Indicate the appropriate storage conditions for Table 1 Preparation of antibiotics and their use in cloning ^*Filter hole size 0.2μm B. Plasmid DNA yield Plasmid copy number is one of the most important factors affecting plasmid DNA yield It is. The copy number is mainly determined by the DNA region inside and outside the origin of replication in the plasmid. Desired. This region, known as the replicon, is Controls replication of sumid DNA. One DNA sequence was inserted into a specific plasmid Interference with replication may reduce plasmid copy number in some cases . In addition, excessively large DNA inserts may also reduce plasmid copy number. You. In many cases, the exact copy number of a particular plasmid construct is unknown. I However, many of these plasmids rely on a small number of commonly used parent constructs. Come. Table 2 shows some of the plasmids with the reported copy number / cell. You. The yield based on the published copy number for the plasmid is also shown in Table 2. . The high copy number for this example is plasmid copy number> 200. Low copy number Rasmid copy number is <50. Table 2 Copy number of commonly used plasmid * Theoretical plasmid yield is 2 per milliliter of culture grown at 37 ° C for 16 hours. Calculated from the reported copy number and size of each plasmid, assuming Was. ** Two types separated by a series of unique restriction sites into which heterologous DNA is inserted Transcription vectors with different bacteriophage RNA polymerase sequences U.S. Patent No. 4,766,072 to Promega Corporation. Reference for Table 2:C. Bacterial strain selection Endonuclease I is a 12 kDa peripheral protein that degrades double-stranded DNA . This protein is encoded by the gene endA. E. coli genotype e ndA1 refers to a mutation in the endA gene that results in an inactive form of endonuclease I I do. E. coli with this mutation in the endA gene. coli strain to endA minus (endA^-) Huh. Table 3 shows endA^-E. It is a list of E. coli strains. E. coli genotype does not have endA1 Is the presence of a wild-type gene expressing active endonuclease I EndA using stem⁺Shares and endA^-High quality DNA was easily obtained from both strains. Only However, certain endA + strains proved to be problematic for many uses. Table 4 shows the fields The raw endA gene (endA⁺E. known to own E. list of E. coli strains . In general, whenever possible with the system, especially when using automatic fluorescence EndA for applications like lancing^-Use of strains is recommended. Table 3 E. Recommended for use with coli endA^-stock Table 4 E. coli endA⁺stockE. coli endA⁺Shares and endA^-Improve the quality of plasmid DNA isolated from both strains For this reason, the Promega WizardW + SV miniprep DNA purification system Aase solution is included. Initially identified as Subtilisin Carlsberg The alkaline protease is isolated from the bacterium Bacillus licheniformis. Guntelberg, A.V. & Otteson, M. (1954) Compt. Rend. Trav. Lab. Carlsberg 29 , 36. At the end of the lysis step in this DNA isolation procedure during the preparation of the The endonuclease was inactivated by adding reprotease. A Lucari protease acts to non-specifically degrade proteins, so it is transparent. Reduces the level of protein contaminants in the specification lysate overall. Aehle, W. et al. (1993) J.C. Biotechnology 28, 31; Van der Osten, C.I. (1993) J. et al. Biotechno logy 28, 55. Alkaline proteases are optimally active at pH 9 and above. Lysate When neutralized, alkaline protease activity is significantly reduced. US Patent Fig. 4 illustrates the use of alkaline protease in a purification system. IV. Special considerations for automated fluorescence sequencing To isolate plasmid DNA for use in automated fluorescence sequencing, And plasmid types to optimize plasmid properties and E. coli. special considerations for selection of E. coli strains Must be indicated. The best results for automated fluorescence sequencing are One plasmid and E. coli. coli endA^-It is usually obtained by using strains. Purified plasmid DNA is suitable for satisfactory automated cycle sequencing Within a suitable concentration range, preferably 0.1 μg / μl or more, ideally 0.2 μg / μl or more. Ke Appropriate concentration range for plasmid DNA purified using the prep DNA purification system. To obtain the perimeter, plasmid DNA from the high copy number plasmid was Take 1 μg aliquots after isolation from the bacteria and speed-back microcentrifugation It was concentrated by drying under reduced pressure with a machine. Dry DNA with 6 μl of nuclease It was resuspended in free water and the concentration was determined. Plasmids from low copy number plasmids When used with DNA, after the elution step, the ethanol precipitation step shown in section VII.A or B Was done. Agarose gel / Ethidium bromide determination, low copy number The DNA concentration was determined by an analysis method particularly recommended when using Sumid Id. Spectral light Alternative methods for DNA quantification by the density method are error prone and require large amounts of sample. is there. + SV miniprep DNA purification system usually yields 3.5-5 μg of plasmid DNA Was. To obtain enough DNA for low copy number plasmid sequencingOf the plasmid DNA from the LB medium varied from 1.5 to 3.0 μg. Note: If the ratio of plasmid DNA to contaminants in the cell lysate is low, The potential for purification and the significant increase in contaminants from books or other DNA purification systems. Therefore, low copy number plasmids have special problems with plasmid purification systems . Therefore, the use of high copy number plasmids for automated trend sequencing applications Is recommended. V. Other materials used (The composition of the solution is shown in Section X.) LB agar plates containing antibiotics LB medium containing antibiotics Ethanol (95%) Micro centrifuge capable of 14,000 xg Sterile 1.5 ml microcentrifuge tube Ethanol (70%) (optional) 7.5M ammonium acetate (optional) Pasteur pipette (9 "long or with heated tip) (optional) 10 x TE buffer (optional) A tabletop centrifuge capable of 10,000 xg (collecting E. coli from 2 to 10 ml of culture solution) To collect) (optional) (Any) Vacuum source (optional) VI. Generation of clear lysate We started by purifying the bacterial lysate. E. Alkaline lysis of plasmid containing E. coli (Birnboim, H.C. & Doly, J. (1979) Nucl. Acids Re. s. 7, 1513), and a viscous clear cell lysate was obtained. In the next step, Neutralization causes the formation of a white precipitate of cell debris and plasmid DNA in the supernatant Solubilized. After centrifugation, the liquid was removed and treated to purify the plasmid DNA. When isolating high copy number plasmids (see Table 2), it is suitable for many molecular biology applications. No need to treat more than 5 ml of bacterial culture to obtain accurate plasmid DNA No increase in plasmid yield is seen beyond the capacity of the pin column. Low copy number plastic When isolating a sumid, use 10 ml of bacterial culture to recover enough DNA for the application. It was necessary to process. However, by processing 10 ml of culture, Contamination of plasmid DNA increased due to insufficient clarity of bacterial lysate . Therefore, 10 ml (for low copy number plasmids) or 5 ml (for high copy number plasmids) If more processing is needed, add 10 ml of culture (low copy number) or Is divided into 5 ml (high copy number) aliquots, treated to isolate DNA, and eluted DNA Pooled at the end of the purification process. Alkaline protease was used after adding the lysis solution. About 250 μg / Endonucleases and other proteins that are added to the sample and released during bacterial cell lysis The quality was inactivated. These proteins adversely affect the quality of the isolated DNA. Sometimes. It is optimally active at pH 9 or higher, which is the condition during alkaline dissolution operation. Thus, alkaline protease is effective for this method. Plastic prepared by this method The carryover of alkaline protease activity was tested on the sumid DNA. DNA Protease of less than 10 ng remains in the sample (<0. 004%) and protease has little activity at pH lower than pH9 Was. The DNA prepared by this operation is subjected to fluorescence sequencing, restriction enzyme digestion, Extensively tested in the range. The results show that the carryover of the protease It shows no effect on the application. However, alkaline protease activity If relevant, the enzyme is irreversible by heating the DNA sample at 65 ° C for 5 minutes. Inactivated.The steps performed to initiate the isolation operation using the production system are summarized in detail. hand Before starting the procedure, add 35 ml of 95% ethanol to a final volume of 55 ml 1． 1-5 ml of bacterial culture containing high copy number plasmid or low copy number plasmid 10 ml of bacterial culture containing 10,000 g at 10,000 xg for 5 minutes using a table top centrifuge The mixture was sedimented by centrifugation. Drain the supernatant and invert the tube with a paper towel The excess liquid was removed. Was completely suspended with a pipette. It is imperative that the cells be well resuspended. You. If not already in the microcentrifuge tube, resuspend the cells in a sterile 1.5 ml Transferred to a centrifuge tube. Note: To prevent shearing of chromosomal DNA and therefore contamination of plasmid DNA, It is recommended not to stir shortly after. The tubes must be inverted and mixed. (Without stirring). Incubate the resulting solution for about 1-5 minutes until the cell suspension is clear. I did it. Note: The lysate is partially clear before proceeding with the addition of alkaline protease solution (Step 4) It is important to see what happens. However, incubate longer than 5 minutes Don't do it. 4. Add 10 μl of alkaline protease solution and mix by inverting the tube four times. next The resulting mixture was incubated at room temperature for 5 minutes. Note: Incubation for more than 5 minutes may result in nicking of plasmid DNA. I will. 6． The bacterial lysate was centrifuged at 14,000 xg for 10 minutes at room temperature in a microcentrifuge. VII. Purification of plasmid DNA Allow selection (see, for example, the two isolation routes shown in FIG. 12). For more information,Plasmid DNA from bacterial lysate using microcentrifugation to wash plasmid DNA Is purified. In addition, let the bacterial lysate pass through the spin column and A vacuum is used to wash the DNA. The miniprep vacuum adapter is A single unit is easy to insert into a one-liter or two-liter branched flask. The manifold is a single self-contained unit that holds up to 20 samples. Label and insert into miniprep vacuum adapter attached to vacuum manifold I do. The mini prep vacuum adapter / spin column connection is Designed to not touch the bottom of the Niprep vacuum adapter. This allows vacuum It is possible to use a miniprep vacuum adapter while maintaining the seal. Bacterial transparency Add the lysate to the spin column. Vacuum is used to pass the solution through the spin column Poured into a pin column and passed through in vacuo. Remove spin column from vacuum manifold After elution, the DNA was eluted. For DNA elution, nuclease-free water was added This is achieved later by centrifuging the spin column (Section VII.A or B). Section VII.A of this example describes purification of plasmid DNA by centrifugation, Section IB describes purification of plasmid DNA by vacuum. A. By centrifugation A plasmid DNA purification and filtration unit was prepared by inserting it into a collecting tube. next, Plasmid DNA is isolated using the obtained filtration unit as follows. Transferred by decanting (section VI step 6; about 850 μl). Oyster with white precipitate and supernatant Care was taken to avoid mixing or moving. White precipitate accidentally spins If transferred to a ram, transfer the contents of the spin column to a sterile 1.5 ml microcentrifuge tube. It was drained back, centrifuged at 14,000 xg for 5-10 minutes, and decanted again. The obtained supernatant is Transferred to the same spin column that was originally used for loading. The following steps It is used again, but only for the same sample. 2． The supernatant was centrifuged at 14,000 xg for 1 minute at room temperature in a microcentrifuge. next, -Threw away. Next, the spin column was inserted into the collection tube. Four. The resulting spin column collection tube assembly was microcentrifuged at 14,000 xg, Centrifuged at warm for 1 minute. -Discarded. A spin column was inserted into the collection tube. 7． The resulting spin column collection tube assembly was microcentrifuged at 14,000 xg, Centrifuged at warm for 2 minutes. Noted. If the spin column was accompanied by a column wash, remove the assembly After centrifugation again at 00 × g for 1 minute, the mixture was transferred to a new 1.5 ml collection tube. The plasmid DNA was eluted by adding it to the system. Next, assemble the column collection tube The mixture was centrifuged at 14,000 × g for 1 minute at room temperature in a microcentrifuge. Ten. After eluting the DNA, remove the assembly from the 1.5 ml microcentrifuge collection tube, When using low copy number plasmids, it is essential to note I understand. Note: Automated fluorescent sequencing when using low copy number plasmids and high culture volumes For best results, use ethanol after eluting the DNA from the spin column. It is essential to perform the DNA precipitation step to concentrate the DNA. This precipitation step is as follows: It must be done using reagents and conditions. 11． The eluted DNA was concentrated as follows. 50 μl of 7.5 M ammonium acetate and 375 μl The DNA was precipitated by adding 1 l of 95% ethanol to a 100 μl sample of the eluted DNA. Get The mixed solution was centrifuged at 14,000 × g at room temperature for 15 minutes. 9 "Pasteur pipette or Carefully remove the supernatant using a regular Pasteur pipette with the tip extended by heating. Aspirated to avoid stirring the translucent DNA precipitate. 250 μl of 70% sediment After brief washing with ethanol, the mixture was centrifuged at 14,000 × g for 5 minutes. Next, The knol was aspirated and the sediment was air-dried for 3-5 minutes to evaporate residual ethanol. Dry The resulting DNA precipitate was suspended in 10 to 25 μl of nuclease-free water. DNA sediment The amount of water used to suspend the DNA is empirically dependent on the concentration of DNA I was asked. DNA isolated according to this procedure using agarose / ethidium bromide Quantified. 12． Finally, 10 μl of 10 × TE buffer is used to store the concentrated isolated DNA in TE buffer. It was prepared by adding the buffer to 100 μl of the eluted DNA. Of DNA in TE buffer The microcentrifuge tubes were stored below -20 ° C. Note: When storing DNA at -20 ° C or lower, do not add a buffer such as TE buffer. Stable in water. DNA is stable at 4 ° C. in TE buffer. It is important to consider the consequences of DNA storage in TE buffer. For details, EDTA in impaction chelates magnesium required as a cofactor for enzyme activity By doing so, the activity of the enzyme can be inhibited. Add TE buffer (and EDTA Is usually a problem when the DNA concentration is low, and large amounts of DNA solution Must be added. TE buffer should not be used for fluorescent DNA sequencing. No. B. By vacuumIt was inserted into the vacuum adapter at a fixed place until it was just right. Transferred to SV mini prep spin column. If some precipitate has been transferred to the spin column If necessary, pour the liquid and precipitate back into the microcentrifuge tube and centrifuge at 14,000 xg for 1 minute. After that, only the liquid was decanted into a spin column. Spin column only for the same sample Was reused. Was. The vacuum was released when all the liquid had passed through the column. Added to the column (see section VI). A vacuum was used to pass through. Release vacuum when all liquid has passed through the column Removed. Centrifuge at 14,000 xg for 2 minutes to remove residual column wash. I left. The 2 ml collection tube and the liquid collected in this step were discarded after centrifugation. Transferred to the heart tube. And spin column and water in a microcentrifuge tube at 14,000 xg for 1 minute at room temperature The plasmid DNA was eluted by centrifugation.Removed from the centrifuge tube and discarded. In particular, low copy number The following notes are essential when using Sumid. Note: Automated fluorescent sequencing when using low copy number plasmids and high culture volumes It is essential to concentrate the DNA by performing an ethanol precipitation step after elution from You. This precipitation step must be performed using the following reagents and conditions. Ten. The eluted DNA was concentrated as follows. 50 μl of 7.5 M ammonium acetate and 375 μl One liter of 95% ethanol was added to a 100 μl sample of the eluted DNA. 14 Centrifugation was performed at 000 × g and room temperature for 15 minutes. 9 "Pasteur pipette or heated Carefully aspirate the supernatant using a regular, extended Pasteur pipette and translucent Avoided stirring the DNA precipitate. Settle the precipitate with 250 μl 70% ethanol Simply washed and centrifuged at 14,000 xg for 5 minutes. Next, aspirate the ethanol The sediment was air dried for 3-5 minutes to evaporate residual ethanol. Dried DNA sediment Was suspended in 10-25 μl of nuclease-free water. Suspend DNA sediment The amount of water used for this was empirically determined empirically depending on the concentration of DNA. DNA isolated according to this procedure was quantified using agarose / ethidium bromide. 11． Finally, 10 μl of 10 × TE buffer is used to store the concentrated isolated DNA in TE buffer. It was prepared by adding the buffer to 100 μl of the eluted DNA. Of DNA in TE buffer The microcentrifuge tubes were stored below -20 ° C. Note: When storing DNA at -20 ° C or lower, do not add a buffer such as TE buffer. Stable in water. DNA is stable at 4 ° C. in TE buffer. It is important to consider the consequences of DNA storage in TE buffer. For details, EDTA in impaction chelates magnesium required as a cofactor for enzyme activity By doing so, the activity of the enzyme can be inhibited. Add TE buffer (and EDTA Is usually a problem when the DNA concentration is low, and large amounts of DNA solution Must be added. TE buffer should not be used for fluorescent DNA sequencing. No. VIII. Other considerations A. Perform large-scale plasmid prep Cat. # A7640), maxiprep (100-500 ml culture; Cat. # A7270) or megaprep (500-1,000 ml culture; Cat. # A7300) A DNA purification system is used. this These systems allow up to 500 μg, 1 mg and 2 mg, respectively, for high copy number plasmids. Designed for purification of plasmids in large quantities. B. Purification of plasmid DNA from low melting / gelling temperature agarose gels Not designed for use with DNA. Low melting point / gelling temperature agarose band To purify plasmid DNA (circular or linear) from rice M1741) is recommended. IX. trouble shooting Dissolve in 1 liter of distilled water. Antibiotics after autoclaving and cooling to 55 ° C Add material (see Table 1).

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, S D, SZ, UG, ZW), AM, AT, AU, BB, B G, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK , EE, ES, FI, GB, GE, HU, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LT, L U, LV, MD, MG, MN, MW, MX, NO, NZ , PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TT, UA, UG, US, UZ, V N

Claims

[Claims] 1. A filter assembly for filtering material by centrifugal force or vacuum assist means. What A filter basket including a cylindrical tube, wherein the filter basket is a second filter basket. A first end of the filter basket, the first end having a first end and a second end; The second end of the filter basket is adapted to receive and hold the filter means Wherein the adaptation means includes a perforated structure at a second end of the filter basket. Wherein the perforated structure supports and holds the filter means while allowing the liquid to flow therethrough. Said filter basket being perforated enough to Vacuum manifold adapter including a cylindrical vacuum adapter having a first end and a second end Wherein the adapter has a first end inside the filter basket. The second end is adapted to receive frictionally and an interior of the second end of the adapter. Are connected to the vacuum manifold and are configured to form an outlet opening. The adapter The filter assembly comprising: 2. A perforated structure wherein the perforated structure forms a flat bottom at the second end of the filter basket; The filter assembly of claim 1. 3. The filter assembly of claim 1, wherein said filter means comprises silica. 4. The second end of the filter basket is adapted to be further incorporated into a collection tube. The filter assembly according to claim 1, wherein 5. The filter assembly according to claim 4, further comprising a collection tube. 6. The following parts: A filter basket including a cylindrical tube, wherein the filter basket is a second filter basket. A first end of the filter basket, the first end having a first end and a second end; The second end of the filter basket is adapted to receive and hold the filter means Wherein the adaptation means includes a perforated structure at a second end of the filter basket. Wherein the perforated structure supports and holds the filter means while allowing the liquid to flow therethrough. Said filter basket being perforated only enough to To the filter basket adapted to reversibly bind nucleic acid material Built-in filter means; Vacuum manifold adapter including a cylindrical vacuum adapter having a first end and a second end Wherein the adapter has a first end inside the filter basket. The second end is adapted to receive frictionally and an interior of the second end of the adapter. The adapter is configured to couple to a vacuum manifold; and The end of the filter basket adjacent to the filter means is at the open end of the collection tube Collector tube with open end and closed end incorporated Filter assembly for filtering material by centrifugal force or vacuum auxiliary means including A method for isolating a nucleic acid substance using a. Supplying a cell containing the nucleic acid substance; b. Lysing or destroying the cells, thus forming a lysate; c. A chaotrope capable of promoting the binding of the nucleic acid material to silica. Transferring the lysate to the filter basket in the presence of a filter agent; d. (i) placing the filter basket in the collection tube and subjecting it to centrifugal force; or (Ii) attach the filter basket to the first end of the manifold adapter And removing the second end to a vacuum manifold and subjecting to a vacuum. Removing the lysate from the filter basket using a step; e. Washing the filter basket with a washing solution using centrifugation or vacuum Process; and f. The filter basket is added by adding elution buffer or water to the basket. Elute the nucleic acid material from the kit, place the basket in a second collection tube and subject to centrifugal force. Process The above method, comprising: 7. Using the filter basket fitted with filter means containing silica 7. The method of claim 6, wherein said nucleic acid material is isolated.