JP2001501085A - Hematopoietic stem cells and methods for producing such cells - Google Patents

Hematopoietic stem cells and methods for producing such cells

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、十分に規定される動力学的パターンで、再現可能におよび効率よく、造血細胞を発生するために使用され得る、発生の造血系を提供する。１つの局面において、本発明の方法は、一般に、以下の工程、動物ドナーから生存可能な幹細胞を得る工程、および造血遺伝子（例えば、LH-2遺伝子）を含む発現構築物で細胞をトランスフェクトして、生存可能な造血幹細胞を生成する工程、を包含する。 SUMMARY The present invention provides a developing hematopoietic system that can be used to reproducibly and efficiently generate hematopoietic cells in a well-defined kinetic pattern. In one aspect, the method of the invention generally comprises the steps of: obtaining viable stem cells from an animal donor; and transfecting the cells with an expression construct comprising a hematopoietic gene (eg, the LH-2 gene). Generating viable hematopoietic stem cells.

Description

【発明の詳細な説明】 造血幹細胞およびこのような細胞を生成するための方法 発明の背景 造血系（HS）の発生および分化を調節する分子機構は、現在解明されつつある 。内部シグナルおよび外部シグナルの組み合わせが調和して相互作用して、多能 性の造血幹細胞（HSC）の自己回復および／または分化を誘導する（Huang，S.お よびTerstappen，L.（1992）Nature 360；745-49）。HSCの分化は、特異的な表 現型特徴の獲得を付随する、一連の系統委任的段階を包含する。細胞は、それら の分化の系統および段階に基づいて、特定のサイトカインに対する抗原性特徴お よび応答を獲得または損失する。発生が進行するにつれ、HSCは、特定の骨髄系 統、リンパ球系統、または赤血球系統に対して委託するようになる。これらの委 託された「前駆体」幹細胞は、最終的に、広範に多様な特殊化された細胞のタイ プに分化され、これらとしては、赤血球、好中球、好塩基球、好酸球、血小板、 肥満細胞、単球、組織マクロファージ、骨芽細胞、ならびにＴリンパ球およびＢ リンパ球が挙げられる。 マウス胚における造血の最初の証拠は、7.5〜8日齢胚での卵黄嚢における血島 の存在によって検出される。卵黄嚢において検出される最も初期の造血前駆体集 団は、初期の赤血球タイプであり、これはヘモグロビンの胚形態を産生する大き な有核細胞からなる。これらの一過性の前駆体は、９日齢胚後に消失する。胎児 肝臓は、約11日齢胚で、主要な造血組織として卵黄嚢に取って代わり、および胎 児生活を通じて、主要な造血器官のままである。造血が肝臓に移行するにつれて 、無核の有限の（definite）造血集団についてのおよびほとんどの骨髄性系統に ついての前駆体が出現する。出生後、造血は骨髄において生じる。成体において 、血球の全ての異なるタイプヘ自己回復および分化する独特の能力を有する、初 期の多型潜在性の幹細胞の集団によって、連続的な血球形成は維持される。 造血を調節することに関与する遺伝子については、ほとんど知られていないが 、転写因子が本質的な調節因子であるようである。ホメオボックス（Hox）タン パク 質は、特徴的な60アミノ酸ドメインの、ホメオドメインを共有する転写因子のフ ァミリーであり、このホメオドメインは特定のDNA配列に結合する。Hoxタンパク 質は、胚発生および胎児発生の間、厳密に調節された発現のパターンを示し、こ れは、胚のデザインにおけるそれらの役割を示唆する。さらなるデータは、HSを 含む種々の体細胞組織における系統特異的機能における、Hoxタンパク質を含意 した。造血細胞におけるHox遺伝子の発現について最初に報告されたので、かな りの注意が、HSにおけるこれらの遺伝子の推定の機能に対して集中した。 LIMドメインを含有するホメオボックス（LhX）タンパク質は、最近、Hoxタン パク質のクラスを同定した。LIMドメインは、３つのホメオボックス遺伝子のLin -11、Isl-1、およびMec-3において最初に同定されたシステインに富むアミノ酸 配列である。Lhxタンパク質は、特定の細胞タイプの分化の制御に関与した。最 近クローン化されたLhxタンパク質のLH-2は、ラット胎児肝臓における細胞中で 発現される。胎児肝臓におけるLH-2の発現パターンは、造血における初期の事象 を、特に造血前駆体の活性な集団が生じる場合に、調節するにおけるLH-2につい ての役割を示唆する。 胚幹（ES）細胞は、造血系（HS）の確立に関与するプロセスを研究するための 強力なモデルを提供する。ES細胞は、発生する胚盤胞の内塊に由来する一時強力 な（topipotet）細胞である。これらの細胞は、白血病阻害因子（LIF）の存在下 で、長期間にわたって、インビトロでの未分化状態において維持され得る。LIF を除去すると、ES細胞は、胚様体（EB）として知られる細胞の集団にインビトロ で分化することが示された。EBは、造血前駆体細胞を含む種々の細胞タイプを含 む。これらの前駆体の発生の時問的分析は、これらの前駆体がEB内に、特定の秩 序正しいパターンで生成されることを示し、これはインビボで生じる事象に非常 に類似する。従って、ESは、初期の赤血球タイプの前駆体を最初に生じ、次いで 成体赤血球系統、ならびに骨髄性多系統を生じる。インビトロのES細胞に由来す る造血前駆体の、そのインビボ対応物に類似の特性は、多型潜在性の造血前駆体 を単離および増殖するための有用なモデルを提供する。ES系のさらなる利点とし ては、胎児致死性についての懸念を伴わない、遺伝子操作および遺伝子機能の評 価に対するその利用のしやすさを含む。 異なる系統へ分化するHSCの強力な能力のために、この単離された多能性の幹 細胞の連続的な供給源についての非常な必要性がある。インビボでのこの細胞の 一過性の性質および極めて低い量は、HSCの実験的および臨床学的適用を妨げて きた。長期の、この細胞の相同な培養物の確立は、系統委託のプロセスおよび自 己回復のプロセスの識見、ならびに骨髄移植および造血細胞遺伝子療法の臨床学 的ストラテジーの両方を増強する。 発明の要旨 本発明は、造血遺伝子を異所的に発現する、遺伝子改変された造血幹細胞に関 し、およびこのような細胞を生成するための方法に関する。より具体的には、本 出願は、哺乳動物の胚幹細胞または造血幹細胞における、LIMドメインを含有す るホメオボックスタンパク質LH-2の異所性の発現に関する。本発明はさらに、こ のような前駆体細胞およびその子孫についての所定の使用に関する。 本発明の１つの局面は、造血系統へ分化し得る回復可能な幹細胞を生成するた めの方法を提供する、この方法は、造血遺伝子の異所性の発現を引き起こす工程 を包含し、この遺伝子の発現は、自己回復可能な表現型を幹細胞に付与する。例 えば、この方法は、造血遺伝子をコードする遺伝子発現構築物で幹細胞をトラン スフェクトする工程、および造血遺伝子が、トランスフェクトされた幹細胞の自 己回復可能な表現型を付与するレベルで発現される条件下で細胞を維持する工程 を包含し得る。 好ましい実施態様において、造血遺伝子は、LH-2のようなLIM-ホメオボックス タンパク質をコードする。例示的なLH2遺伝子は、配列番号１および３に提供さ れる。しかし、本明細書中で記載されるように、造血遺伝子は、これが、造血細 胞の相対数の減少の機能消失表現型によって特徴づけられる造血に関与する遺伝 子であるという基準によって選択され得る。 ある実施態様において、幹細胞は胚幹細胞である。別の実施態様において、幹 細胞は造血幹細胞であることが好ましい。本発明において使用するための造血幹 細胞についての供給源としては、抹消血、臍帯血、胎児肝臓、および骨髄が挙げ られる。好ましい実施態様において、幹細胞は、哺乳動物（例えば、霊長類（例 えばヒト））から単離される。本発明はまた、トランスジェニック非ヒト哺乳動 物からの幹細胞の使用を意図する。 本発明の幹細胞を生成するために、１つの好ましいアプローチは、例えば、ウ イルス媒介性遺伝子移入、リポソーム媒介性遺伝子移入などによって、幹細胞を 遺伝子発現構築物でトランスフェクトすることである。幹細胞は、インビボで（ 例えば、遺伝子療法によって）またはイクスビボにて（例えば、培養において） 、遺伝子発現構築物でトランスフェクトされ得る。 好ましい実施態様において、本発明の方法はまた、Steel因子との接触によっ てトランスフェクトされた細胞を増殖する工程を包含する。本発明の方法はまた 、エリトロポイエチン（EPO）、トロンボポイエチン、顆粒球／マクロファージ コロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、マクロファ ージコロニー刺激因子（M-CSF）、およびインターロイキンからなる群より選択 される、１つ以上の因子と、トランスフェクトされた細胞とを接触する工程をさ らに包含し得る。このような因子は、骨髄細胞、リンパ球細胞、および／または 赤血球細胞のような造血細胞へ幹細胞を分化するために使用され得る。 本発明の別の局面は、実質的に純粋な集団の生存可能な幹細胞を提供し、この 細胞は、遺伝子改変されて造血遺伝子を異所的に発現し、この遺伝子の発現は、 自己回復可能な表現型を幹細胞に付与する。ある実施態様において、幹細胞、ま たはその子孫は、薬学的組成物に処方され得る。 本発明の別の局面において、減少された数の造血前駆体またはその子孫によっ て特徴づけられる異常を、処置するための方法を提供する。一般に、この方法は 、被験体動物に本発明の幹細胞（および／またはその子孫）の薬学的組成物を導 入する工程を包含する。本発明の方法は、例えば、骨髄欠損から生じる異常、放 射線療法および化学療法を含むガン処置、遺伝性貧血または後天性貧血の異常を 処置するために使用され得る。 本発明の別の局面において、本発明の細胞の薬学的調製物は、免疫系における 変質（例えば、自己免疫疾患、AIDSなど）によって特徴づけられる異常を処置す るために使用され得る。 本発明のさらに別の局面において、本発明は、自己回復表現型を幹細胞に付与 する造血遺伝子を異所的に発現する幹細胞を含有する幹細胞培養物によって生成 される馴化培地を提供する。同様に、本発明はまた、自己回復可能な表現型を幹 細胞に付与する造血遺伝子を異所的に発現する幹細胞を含有する幹細胞培養物に よって生成される１つ以上の因子の精製調製物または半精製調製物を提供する。 本発明の実施は、他に示さない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、ト ランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術 を用い、これは当業者の範囲内である。このような技術は文献に記載されている 。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual、第２版、Sambrook、Frits chおよびManiatis編（Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989）；ＤＮＡ C loning，第IおよびII巻（D.N．Glover編、1985）；Oligonucleotide Synthesis （M.J．Gait編、1984）；Mullisら、米国特許第4,683,195号；Nucleic Acids Hy bridization（B.D．Hames & S.J．Higgins編、1984）；Transcription And Tran slation（B.D．Hames & S.I．Higgins編、1984）；Culture Of Animal Cells（R .I．Freshney，Alan R．Liss，Inc.、1987）；Immunobilized Cells And Enzyme s（IRLPress，1986）；B．Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning（ 1984）；the treatise，Methods in Enzymology（Academic Press，Inc.，N.Y. ）；Gene Transfer Vectors For Mammmalian Cells（J.H．MillerおよびM.P．Ca los編、1987，Cold Spring Harbor Laboratory）；Methods In Enzymology，154 巻および155巻（Wuら編）、Immunchemical Methods In Cell And Molecular Bio logy（MayerおよびWalker編）、Academic Press，London、1987）；Handbook of Experimental Immunology、I〜IV巻（D.M．WeirおよびC.C.Blackwell編、1986 ）；Manipulating the Mouse Embryo、(Cold Spring Harbor Laboratory Press ，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)を参照のこと。 本発明の別の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および請求の範囲から明 らかになる。 図面の詳細な説明 図１は、造血幹細胞の分化の経路の図解である。 図２は、６日問培養されたEB細胞を、エリトロポイエチン（EPO）およびsteel 因子（SF）の存在下、再平板培養する場合に存在する２つのタイプのコロニーの 典型的な形態学を示す写真である。小さな堅い初期の赤血球タイプのコロニー(p ) は、胎児タイプのグロビンを発現する大きな有核ヘモグロビン化（red）赤血球 からなる。より大きなおよび不規則に広がったコロニーは、有限の赤血球タイプ のコロニー(d)である。このコロニーは、無核ヘモグロビン化赤血球、ならびに 網赤血球および赤芽球のようなそれら即時型前駆体から優先的になる。 図３Ａおよび３Ｂは、マウス幹細胞ウイルス（MSCV）レトロウイルスベクター （MSCV）で、またはLH-2遺伝子を含有するこのベクター（MSCV-LH-2）で形質導 入された、分化されたES細胞株CCEに由来する、６日間培養されたESにおける赤 血球前駆体の頻度を示すグラフである。（３Ａ）初期の赤血球系統についての前 駆体の頻度。（３Ｂ）有限の赤血球系統についての前駆体の頻度。 図４は、分化されたJ1 ES細胞に由来する、６日間培養されたES細胞における 初期の赤血球系統についての前駆体の頻度を示すグラフである。 図５は、マウス幹細胞ウイルスベクターの構造（MSCV、上段のパネル）および LH-2を含有するMSCVの構造（MSCV-LH-2、下段のパネル）の模式図である。矢印 は、転写開始を示す。LH-2は、改変されたLTRプロモーターの制御下にある。こ のベクターは、内部ｐｇプロモーターの制御下にネオマイシンホスホトランスフ ェラーゼ（neo）遺伝子を含む。p(A)は、ポリアデニル化部位を表す。LH-2遺伝 子は、neo遺伝子をまた含有するポリシストロン転写物上に存在するか、neo遺伝 子は、2つの異なるメッセージ上に存在する。SDおよびSAは、ドナー部位および アクセプター部位を示し、そして+は、高いウイルス力価についての増殖された パッケージング領域を示す。全ての他のウイルス特異的遺伝子は、BOSC-23細胞 株に存在する。 図６は、メチルセルロースにおける「幹細胞」の形態学を示す写真である。こ のタイプのコロニーは、MSCV-LH-2ベクターでトランスフェクトされたCCE細胞に 由来した、６日間培養されたEBを、再平板培養することによって生成された。特 定のコロニーは、CCE MSCV-LH-2サブクローン７に由来する。 図７および８は、実施例４に記載されるメチルセルロースコロニーアッセイの 写真である。 図９は、HPCコロニー形成に対する馴化培地の効果を示すグラフである。 発明の詳細な説明Ｉ．方法の概説 真正の造血幹細胞は、２つの独特の特徴を有する。第１に、これらは多能性で ある；すなわち、これらは、全ての成熟な血球タイプへ分化し得る。第２に、こ れらは、自己回復する；すなわち、これらは、その多能性を分化および維持し得 る。造血幹細胞は、特徴づけられてきており、発生可能性、機能的特徴、および 培養物において維持するための条件がを含む。しかし、当該分野において記載さ れる造血幹細胞培養物は自己回復についての能力を有するが、このような自己回 復についての能力は、それにもかかわらず、インビボでの幹細胞の明白な回復能 力に比べて実質的に制限される。 本発明は、十分に規定される動力学的パターンで、再現可能におよび効率よく 、造血細胞を発生するために使用され得る、発生の造血系を提供する。１つの局 面において、本発明の方法は、一般に、以下の工程、動物ドナーから生存可能な 幹細胞を得る工程、および造血遺伝子（例えば、LH-2遺伝子）を含む発現構築物 で細胞をトランスフェクトして、生存可能な造血幹細胞を得る工程、を包含する 。別の実施態様において、内因性造血遺伝子は、遺伝子活性化構築物との相同組 換えによって活性化される。 これらの細胞の顕著な特徴は、これらか多くの世代について一時強力な細胞株 として培養物において維持され得ることである。添付の実施例において提供され るデータから、このプロトコルが、それ自身を回復し得、および種々の成熟造血 細胞タイプへ分化するための能力を維持した、多系統の（multilineasg）前駆体 を生成するために使用され得ることが、明らかである。この知見は、幹細胞の発 生量か天然で非常に低いので、重要である。従って、純粋なおよび相同なこれら の細胞の集団は、今日利用可能な技術によって実質的に実現されていなかった。 本発明の造血幹細胞組成物は、長期間、培養物において維持され得ることによ って、二次および高次の培養物へ選択および移入され得ることによって、ならび に種々の造血系統（これは、種々のリンパ球系統および骨髄単球系統（例えば、 Bリンパ球、Tリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、赤血球など）を含み得 る）へ分化し得ることによって、特徴づけら得る。 本発明の１つの局面は、造血遺伝子（例えば、転写因子（例えば、LIM-ホメオ ボックス遺伝子））を発現するように遺伝子改変された幹細胞を含有する細胞性 組成物に関する。例として、LH-2を発現する胚幹細胞が、自己回復し得る、初期 あるいは早期の造血細胞の培養物を確立するために使用され得る。本発明の幹細 胞としては、ヒト供給源および非ヒト供給源に由来する細胞が挙げられる。 幹細胞は、適切な栄養培地（馴化培地を含むがこれに限定されない）、適切な 間質層または他の支持層との共存培養、接着分子、または本発明の遺伝子改変さ れた幹細胞の増殖および（必要に応じて）分化を維持するために十分である増殖 因子の合成的な組合せを含有する培地において培養され得る。 本発明の遺伝子改変された幹細胞および、その子孫は、種々の適応において使 用され得る。これらとしては、インビボでの遺伝子操作された細胞の移植（tran splantation）あるいは移植（implantation）；細胞障害性化合物、アレルゲン 、増殖/調節因子、薬学的組成物などのインビトロでのスクリーニング；ある疾 患の機構の解明；薬物および／または増殖因子が操作する機構の研究；および生 物学的に活性な産物の産生が挙げられるがこれらに限定されない。従って、細胞 は、骨髄移植を必要とする病気（例えば、放射線療法または化学療法を含む全て のガン、ii）病原性リンパ球を置換えることによる自己免疫疾患についての潜在 的な治癒、iii）異なる種類の遺伝性貧血および後天性貧血についての潜在的な 治癒、iv）少数の患者自身の非感染の幹細胞を増殖することにより、HIV感染さ れた区画が、健常な細胞で置換えられ得る可能性が存在する場合、AIDSの処置の ために、治療学的に使用され得る。 別の局面において、造血幹細胞の供給源またはその子孫は、LH-2を発現するよ うに遺伝子操作されている支持層を含む支持層細胞の存在下で幹細胞を培養する ことによって提供される。LH-2が造血細胞の自己回復可能な表現型に関与するパ ラクリン因子の発現を生じるという見解を前提として、この実施態様は、野生型 幹細胞（例えば、幹細胞は、それ自身が遺伝子改変されていない）のエクスビボ での増殖を許容する。幹細胞またはその子孫が、治療学的に使用される実施態様 について、このような支持細胞層は好ましくあり得る。 関連する様式において、本発明の別の局面は、馴化培地、またはLH-2を異所的 に発現する細胞によって生成される因子の精製もしくは半精製の供給源を利用可 能にする。すなわち、本明細書中に記載される遺伝子改変された幹細胞の上清に おいて見出される任意の誘導的な因子は、供給源の細胞から単離されたある形態 において提供され得る。本発明はまた、このようなLH-2で誘導される因子のクロ ーニングを意図し、ここでは組換えタンパク質は、例えば、精製形態で提供され 得るか、または共存培養における細胞から発現され得る。上述のように、この実 施態様は、野生型幹細胞（例えば、幹細胞は、それ自身が遺伝子改変されていな い）のエクスビボでの増殖を許容する。 本発明のさらに別の局面は、インビボでの治療のための本発明の造血遺伝子構 築物の使用に関する。従って、遺伝子療法アプローチによって、本発明の方法は 、患者において直接、造血系またはその部分における欠乏を増加または矯正する ための手段を提供する。 本発明のなお別の局面は、制限された系統である造血幹細胞の生成に関する。 以下に記載されるように、そうでなければ一時強力な幹細胞が任意の造血細胞へ 分化する能力は、１つ以上の特定の系統の発生に決定的な遺伝子に機能消失変異 を導入することによって制限され得る。例えば、GATA-3またはNFATへの機能消失 変異は、造血幹がＴ細胞へ分化する能力を低減する。同様に、PU.1またはOct2の 変異は、非Ｂ細胞系統への分化を制限する。他の機能消失変異は、以下に記載さ れ、例えば、単球、好中球、好酸球、好塩基球、巨核球、および／または赤血球 のような系統への分化を低減するために使用され得る。II ．定義 簡便のために、本明細書、実施例、および添付の請求の範囲において用いられ る特定の用語が、ここに集められる。 用語「系統委託的細胞」は、もはや多能性でないが特定の系統（例えば、骨髄 性系統、リンパ球系統、赤血球系統）に制限されるようになった幹細胞をいう。 系統委託的細胞は、特殊化された細胞タイプ（例えば、赤血球、Ｔリンパ球、お よびＢリンパ球）に実質的に分化する。 用語「幹細胞」は、自己回復（すなわち、より多くの幹細胞を生じるために増 殖）し得、および特定の系統へ分化および増殖し得る系統依存的前駆体を生じ得 る、未分化の細胞をいう。好ましい実施態様において、用語「幹細胞」は、その 派生物（子孫）が、分化により（例えば、胚細胞および組織の漸進性の多様化に おいて生じるように、完全に個々の特徴を獲得することにより）、しばしば、異 なる方向に特殊化される一般化された母細胞をいう。本明細書中で使用されるよ うに、用語「幹細胞」は、一般に、哺乳動物起源（例えば、ヒト）からの胚幹細 胞および造血幹細胞の両方をいう。 幹細胞組成物は、長期間にわたって培養物において維持され得ることによって 、二次および高次の培養物へ選択および移入され得ることによって、ならびに種 々のリンパ球系統または骨髄性系統（特に、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、単球、マ クロファージ、好中球、赤血球など）へ分化し得ることによって、特徴づけら得 る。 本明細書中で使用されるように、用語「胚幹細胞」は、全ての体細胞系統およ び生殖細胞系統への分化のための発生潜在性を保持する、多能性の、胚盤胞由来 の細胞を意味する（概説のために、Robertson，E.J.(1986)Trends in Genetics2 :9-13を参照のこと）。この細胞タイプはまた、「ES細胞」といわれる。 本明細書中で使用されるように、用語「造血幹細胞」（HSC）は、自己回復、 および全ての規定された造血系統（すなわち、骨髄性系統、リンパ球系統、また は赤血球系統）の分化の両方を行い得る両方の細胞の集団を意味し；ならびに制 限する数の細胞は、骨髄剥離処置を受けた受容者の造血系を再集団化し得る。HS Cは、最終的に、造血細胞（共通のリンパ球前駆体細胞、Ｔ細胞（例えば、ヘル パー細胞、細胞障害性細胞、サフルッサー細胞）、Ｂ細胞、血漿細胞、ナチュラ ルキラー細胞、共通の骨髄前駆体細胞、単球、マクロファージ、肥満細胞、白血 球、好塩基球、好中球、好酸球、巨核球、血小板、および赤血球を含むが限定さ れない）へ分化し得る。HSCは、初期の表現型の細胞表面抗原（例えば、CD34+Th y-1+Lin-）の存在、およびに系統特異的抗原についての陰性染色によって同定可 能である。 用語「造血遺伝子」は、エクスビボおよびインビボでのHSCの自己回復および ／または分化のプロセスに関与するタンパク質産物をコードする遺伝子をいう。 LH-2遺伝子は、LH-2遺伝子が造血組織（例えば、胎児肝臓）、ならびに特定のリ ンパ球悪性腫瘍を発生するにおいて発現されるので（Oncogene 12，1205-66）； 胚幹細胞におけるこの遺伝子の異所性の発現が、造血前駆体（例えば、有限赤血 球系統に対する前駆体）の増強された産生を生じるので；およびLH-2遺伝子の機 能 消失変異を有するホモ接合体マウスが、減少数の有限赤血球前駆体細胞および多 型潜在性前駆体細胞を示すので、造血遺伝子の例を提供する。 用語「造血遺伝子構築物」は、核酸分子（例えば、宿主細胞において本発明の 造血遺伝子を複製および発現し得る様式で作動可能に連結される本発明の造血遺 伝子を含有するベクター）を含む。造血遺伝子構築物は、受容体ヒト細胞または 受容体非ヒト細胞へ、核酸媒介性遺伝子移入によって導入され得る。 本明細書中で使用されるように、「異種ＤＮＡ」または「異種核酸」は、ゲノ ムの一部として天然に存在しないＤＮＡを含み、ＤＮＡが天然の位置とは異なる ゲノムにおける位置（単数または複数）において存在するかまたは見出される。 異種ＤＮＡは、導入される細胞に対して内因性でないが、別の細胞から得られて いる。一般に、必ずしも必要ではないが、このようなＤＮＡは、ＲＮＡおよびタ ンパク質（それらは、発現される細胞によって通常産生されない）をコードする 。異種ＤＮＡはまた、外来遺伝子としていわれる。当業者が、発現される細胞に 対して異種または外来であると認識または考慮する任意のＤＮＡは、異種ＤＮＡ によって本明細書中に包含される。 用語「ホメオボックス遺伝子」および「ホメオボックスタンパク質」は、特有 の60アミノ酸ヘリックスターンヘリックスＤＮＡ結合ドメイン（LevineおよびHo ey(1998)）を共有する構造的に関連する転写因子のファミリーの、それぞれ、遺 伝子および遺伝子産物をいう。用語「ホメオボックス」および「ホメオドメイン 」タンパク質は、本明細書中で交換可能に使用される。 本明細書中で使用されるように、用語「LH-2タンパク質」は、ホメオボックス タンパク質のLhxサブクラスのメンバーをいう。これらのタンパク質は、lin-11i sl-l mec-3（Xu，Y.(1993)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90，227-31）についてL IMドメインとして公知の新規なCys-His構造モチーフを含む。 用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、本明細書中 で交換可能に使用される。 本明細書中で使用されるように、幹細胞に関して、用語「実質的に純粋な」は 、全細胞集団を構成する幹細胞に関して、少なくとも約75％、好ましくは少なく とも約85％、より好ましくは少なくとも約90％、および最も好ましくは少なくと も約95％純粋である幹細胞の集団をいう。換言すると、用語「実質的に純粋な」 は、 その後の培養および増幅の前に、元来の未増幅のおよび単離された集団において 、約20％未満の、より好ましくは約10％未満の、最も好ましくは約５％未満の系 統委託細胞を含む本発明の幹細胞の集団をいう。 用語「培養培地」は、当該分野において認識され、および一般に、生存する細 胞の培養のために使用される任意の基質または調製物をいう。従って、「組織培 養」は、組織（例えば、その構造および機能を保存するようなインビトロでの器 官原基または成人器官の外殖片）の維持または増殖をいう。「細胞培養」は、イ ンビトロでの細胞の増殖をいう；細胞は増殖するが、それ自身は組織に組織化さ れない。 用語「馴化培地」は、上清、例えば、培養細胞／組織を含有せず、培地は、細 胞によって産生されるかおよび培養物中へ分泌される、あるパラクリン因子およ び／またはオートクライン因子を含むように改変され、ある期間の培養細胞との 接触後に生じる 本明細書中で使用されるように、用語「細胞性組成物」は、細胞の調製物をい い、この調製物は、細胞に加えて、細胞培養培地のような非細胞性成分、例えば 、タンパク質、アミノ酸、核酸、ヌクレオチド、コエンザイム、抗オキシダント 、金属などを包含し得る。さらに、細胞性組成物は、細胞性の成分の増殖および 性存性を影響しないが、特定の形式において（例えば、カプセル化または薬学的 調製物のためのカプセル化マトリックスとして）、細胞を提供するために使用さ れる。 本明細書中で使用されるように、用語「動物」は、哺乳動物、好ましくはヒト のような哺乳動物をいう。同様に、本発明の方法によって処置される「患者」ま たは「被験体」は、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを意味し得る。 本明細書中に使用されるように、「トランスジェニック動物」は、任意の動物 、好ましくは非ヒト哺乳動物、鳥類、または両生類であり、ここで、動物の１つ 以上の細胞は、ヒト介入の方法によって（例えば、当該分野において周知のトラ ンスジェニック技術によって）導入される異種核酸を含む。核酸は、直接的なま たは間接的な、細胞の前駆体への導入によって、計画的な遺伝子操作によって（ 例えば、マイクロインジェ・クションによって、もしくは組換えウイルスでの感 染に よって）、細胞へ導入される。用語遺伝子操作は、伝統的な交配育種、またはイ ンビトロ受精を含まないが、むしろ組換えＤＮＡ分子の導入に指向される。この 分子は、染色体内に組込まれるか、またはこの分子は染色体外で複製するＤＮＡ であり得る。本明細書中で記載される典型的なトランスジェニック動物において 、トランスジーンは、細胞に組換え形態のホメオボックスタンパク質を発現させ る。しかし、例えば、以下に記載されるFLPまたはCREリコンビナーゼ依存性の構 築物のように、組換えホメオボックス遺伝子がサイレントであるトランスジェニ ック動物がまた意図される。さらに、「トランスジェニック動物」はまた、１つ 以上のホメオボックス遺伝子の遺伝子破壊が、ヒト介入（組換え技術およびアン チセンス技術の両方を含む）によって引き起こされる、それらの組換え動物を含 む。 本発明の「非ヒト動物」としては、げっ歯類、非ヒト霊長類、ミニチュアブタ 、ヒヒ、ヒツジ、イヌ、ウン、および他の非ヒト哺乳動物のような脊椎動物が挙 げられる。本明細書中で使用される用語「キメラ動物」は、組換え遺伝子が見出 されるか、またはいくつかのしかしすべてではない細胞において、組換え遺伝子 が発現される動物をいう。用語「組織特異的キメラ動物」は、組換え造血遺伝子 が、ある組織において存在および／または発現もしくは破壊されるが、他の組織 においてはそうではないことを示す。 本明細書中で使用されるように、用語「トランスジーン」は、核酸配列（例え ば、造血タンパク質をコードするか、またはそれらにアンチセンスな転写物を係 属する）を意味し、これは、トランスジーンが導入されるトランスジェニック動 物または細胞に対して部分的にまたは完全に異種、すなわち外来性であるが、こ の遺伝子が挿入される（例えば、この遺伝子は天然の遺伝子の位置とは異なる位 置で挿入されるか、またはこの遺伝子の挿入はノックアウトを生じる）、細胞の ゲノムを改変するような方法で動物のゲノムヘ挿入されるように設計されるかま たは挿入される。トランスジーンは、１つ以上の転写調節配列および任意の他の 核酸（例えば、イントロン）を含み、これらは選択された核酸の至適な発現のた めに必要であり得る。 本明細書中で使用されるように、用語「ベクター」は、それが連結される別の 核酸を輸送し得る核酸分子をいう。用語「発現ベクター」としては、ベクターに よって保有されるそれそれの組換え遺伝子によってコードされる、本発明の造血 −タンパク質を合成し得る、プラスミド、コスミド、またはファージが挙げられ る。好ましいベクターは、自己複製し得るおよび／またはそれらが連結される核 酸を発現し得るベクターである。本明細書において、「プラスミド」および「ベ クター」は、プラスミドがベクターの形態で最も一般的に使用されるので、交換 可能に使用される。さらに、本発明は、等価な機能を作用しおよび本発明以後当 該分野において公知になる発現ベクターの他の形態を包含することが意図される 。 本明細書中で使用されるように、用語「トランスフェクション」は、核酸媒介 性移入による受容体細胞への核酸（例えば、発現ベクター）の導入を意味する。 本明細書中で使用されるように、「形質導入」は、細胞の遺伝子型が外因性のＤ ＮＡまたはRNAの細胞性取り込みの結果として変化するプロセスをいい、そして 例えば、形質導入された細胞は、造血タンパク質の組換え形態を発現するか、ま たはアンチセンス発現が移入された遺伝子から生じる場合、造血タンパク質の天 然の形態の発現が破壊される。 「造血細胞の疾患」は、造血細胞の任意の正常な機能の欠陥によって特徴づけ られる任意の状態をいう。本発明の細胞を利用して処置され得る造血細胞の疾患 としては、遺伝子異常（例えば、アデノシンデアミナーゼ欠損症、ファンコーニ 貧血、および異常血色素症（例えば、鎌形赤血球貧血）、サラセミア、およびヘ モグロビンＣ症）、ならびに感染手段または非感染手段によって獲得される疾患 （例えば、後天性免疫不全症候群、および白血病）が挙げられる。 「遺伝子産物」によって、遺伝子の転写の結果として産生される分子が意味さ れる。遺伝子産物としては、遺伝子から転写されるRNA分子、およびこのような 転写物から翻訳されるタンパク質が挙げられる。III ．遺伝子及びベクター Ａ．組換え遺伝子 上記で示したように、本発明は１つの特徴において、幹細胞の自己再生表現型 を高めそして広範囲の成熟造血系譜への末端分化を可能にする造血遺伝子を異所 的に発現するように遺伝子的に修飾されている幹細胞を提供する。下記実施例は 、幹細胞を操作してＬＩＭ-ホメオボックスタンパク質LH-2を組換え的に発現さ せる説明的な実施態様を提供する。しかしながら、本明細書で提供した説明から 、熟練技術者は、他の造血遺伝子構築物を使用して産生される細胞を含めて本発 明の主題細胞に関する他の実施態様が実施可能であることを理解するであろう。 更なる手引きとして、本発明での使用に適している造血遺伝子の１つの選択規 準は、遺伝子の機能消失突然変異によって与えられる表現型の観察に基づいてい ることが認められる。例えば、下記実施例に記載されているように、造血遺伝子 の機能消失突然変異によって１つ又はそれより多くの成熟造血細胞型に分化する 幹細胞の能力が低下するということに基づいて、適当な造血遺伝子を選択するこ とができる。例えば、LH-2遺伝子の機能消失突然変異によってトランスジェニッ ク動物の成熟造血細胞が消失する。即ち、LH-2は造血にとって決定的に重要であ る。機能消失突然変異と反対に、本発明の細胞での野生型LH-2遺伝子の異所性発 現（機能獲得）によって、実施例で証明されているように、所望の幹細胞表現型 が発生する。かくして、機能消失突然変異の表現型は、本発明の操作された造血 細胞の実例に適合し得る遺伝子を同定するマーカーとして使用される。 本発明で使用される造血遺伝子はまた(又は代替的に)、この遺伝子が造血発生 中、特に最初の造血拘束段階中に発現されるという観察に基づいて選択すること もできる。他の実施態様では、組換え造血遺伝子が或る形態の白血病で過剰発現 され、そしてその結果、ＨＳＣの自己再生及び／又は分化の過程に関与するタン パク質をコードできるという理由で、この遺伝子を選択することができる。 本発明で考えられる造血遺伝子構築物の１つのクラスは、造血系において発生 的又は系譜特異的な態様で発現される転写因子をコードしている遺伝子から誘導 される。好ましい造血遺伝子はホメオボックスタンパク質ファミリーから選択さ れる。このようなタンパク質はホメオボックスドメイン、例えば、ヘリックス・ ターン・ヘリックスモチーフ、特異的なＤＮＡ結合用の一次配列モチーフを含ん でいることを特徴としている(例えば、Levine等（1988年）Cell 55:537〜540;Ro bertson（1988年）Nature 336:522〜524及びこれらの参照文献参照)。ホメオボ ックス遺伝子は胚のパターン形成及び、造血系を含む種々の身体組織における系 譜特異的機能に関与している。 好ましい実施態様では、上記ホメオボックスタンパク質はホメオボックスタン パク質のＬＩＭサブクラスのメンバー、例えば、ＬＩＭ-ホメオボックスタンパ ク質である。これらのタンパク質は、lin-11 isl-1 mec-3用のＬＩＭドメインと して知られている新規なCys-His構造モチーフを含有している(Xu等（1993年）PN AS 90、227〜231)。かくして、ＬＩＭ-ホメオボックスタンパク質はホメオドメ インと少なくとも１つのＬＩＭドメインの両方を含んでいる。代表的なＬＩＭ- ホメオボックス遺伝子はLH-2と称されている（例えば、Xu等、上述；及びGenBan k受理番号U11701［ヒト］及びL06804［ラット］参照）。全長LH-2タンパク質は ホメオドメインと２つのＬＩＭドメインを含有している。このLH-2タンパク質は 発生中の造血組織、例えば胎児肝臓、並びにリンパ性悪性物、例えば、慢性骨髄 性白血病、リンパ性悪性物で発現される。 このクラスのホメオボックスタンパク質の別のメンバーには:Lhx3遺伝子産生 物（例えば、Zadanov等（1995年）Dev Dyn 202:354〜364;及びGenBank受理番号L 40482［マウス］参照);isl-1、isl-2、isl-3等(例えば、Dong等（1991年）Mol E ndocrin 5:1633〜16/11;及びGong等（1995年）J Biol Chem 270:3335〜3345参照 );islet-1、islet-2等(例えば、Tanizawa等（1994年）Diabetes 43:935〜941;及 びGenBank受理番号Ｕ07559［ヒト、islet-1］及びL35571［ラット、islet-2］参 照);ＬＩＭ-１、ＬＩＭ-２、ＬＩＭ-３等（例えば、Fujii等（1994年）Dev Dyn 199 :73〜83;Barnes等（1994年）Dev Biol 161:168〜178；Seidah等（1994年）Ｄ ＮＡ Cell Biol 13:1163〜1180;及びGenBank受理番号Ｌ38249［マウス、Lim3a］ 参照);及びLmx-1（German等（1992年）Genes Dev 6:2165〜2176）が含まれる。 主題発明で使用されるもう１つの候補造血遺伝子はc-myb遺伝子である。この 遺伝子は全てのタイプの造血細胞に関係している。その発現は、リンパ、骨髄性 及び赤芽球系譜を含む全ての系譜の未成熟細胞で高いが、成熟細胞では低いか又 は全く存在していない。mybタンパク質は増殖プロモーターとして関与している 。ｃ-mybは造血で明らかに重要な役割を果たしているが、これが全ての未成熟細 胞で発現していることは、個々の細胞系譜の特定では重要な因子として作用しな いことを示唆している。むしろ、c-mybの発現は、個々の経路に沿って増殖しそ して分化し得る未成熟細胞を特定するものと思われる。このような転写因子は、 主題方 法で造血遺伝子として与えられると、非拘束造血幹細胞の発生を促進することが できる。 本発明で有用なメンバーを含んでいると思われるもう１つのクラスの転写因子 には、例えば、未成熟造血細胞中で発現されるジンクフィンガー含有転写因子が 含まれる。このクラスの実例には、ジンクフィンガー含有転写因子のＧＡＴＡフ ァミリーのメンバー、例えば、ＧＡＴＡ-１が含まれる。相同的組換えによるＧ ＡＴＡ-１の不活性化によって、インビボ及びエクスビボで赤芽球の産生が低下 し、そしてこれはこの遺伝子が赤芽球発生で或る役割を果たしていることを示唆 している。赤芽球多能性前駆細胞で発現されるＧＡＴＡ-２や主としてＴリンパ 系細胞で発現されるものと思われるＧＡＴＡ-３のようなＧＡＴＡファミリーの 他の系譜特異的メンバーもこのクラスで意図されている。 主題造血遺伝子構築物を産生する更にもう１つの遺伝子源には、或る種のロイ シンジッパー含有転写因子をコードする遺伝子が含まれる。造血系におけるこの タイプの発生制御の１例はＣ/ＥＢＰβ（ＮＦ-ＩＬ6、ＮＦ-Ｍ、ＬＡＰ、ＩＬ-6 ＤＢＰ、ＡＧＰ/ＥＢＰ及びＣＲＰ2としても知られている）で説明されている。 Ｃ/ＥＢＰβの発現は骨髄性細胞の分化中に変化することが示されており、これ は分化調節剤としてのこの遺伝子の役割と一致している。 上記で述べたように、好ましい実施態様では、遺伝子的に修飾された主題幹細 胞の産生に使用される造血遺伝子構築物は、例えば、ホメオボックスタンパク質 のLhxサブクラスのＬＩＭ-ホメオボックスタンパク質、例えば、LH-2又はその相 同体をコードしている。LH-2タンパク質の活性を有しているとして本明細書で言 及するポリペプチドは好ましくは、配列識別番号２若しくは４で示されるヒトLH -2タンパク質のアミノ酸配列の全部若しくは一部分に相当するアミノ酸配列、又 はこれらのイソ体（種々のスプライシング変異体を含む）を有している。配列識 別番号１及び２で示されるLH-2配列はヒトLH-2遺伝子について発表された配列（ 配列識別番号３及び４参照）とは、前者が配列識別番号１の1653位に余分のＧ残 基を有している点で異なっていることが認められ、そして下記実施例で記載する 実験では前者のクローンを使用した。この余分の残基はフレームシフトを生じさ せ、その結果発表されたマウス相同体と比較して異なるＣ末端配列 が得られる。しかしながら、配列識別番号２で示されているLH-2遺伝子産物のＣ 末端配列は、ニワトリ及びゼブラフィッシュLH-2クローン並びに出願人が再度配 列を決定したラットLH-2クローンについて発表されたＣ末端配列と一致している 。この配列の差異は真実である、即ち、スプライシング変異体若しくは対立形質 変異体であるか、又は発表されたヒトLH-2配列が単に誤っているだけであろう。 いずれにしても、ヒト遺伝子の３'及び５'ヌクレオチド配列に基づくＰＣＲプラ イマーを使用すると、本発明の細胞で機能的なLH-2配列を単離することができよ う。 他の種由来のLH-2タンパク質、例えば、ラットLH-2遺伝子（SwisProt受理番号 P36198）も本発明の一部として使用するように意図されている。好ましい実施態 様では、異所的に発現されるLH-2タンパク質の生物学的活性には：幹細胞の増殖 力を高める能力；細胞外因子及びサイトカインの存在下で幹細胞が造血系譜、例 えば骨髄性、赤芽球又はリンパ系譜に分化する潜在力を調節する能力；移植で骨 髄に再度定着し得る造血幹細胞を創製する能力が含まれる。 野生型LH-2タンパク質の種々の相同体も本発明の細胞で使用できることは明白 であろう。好ましい実施態様では、組換えLH-2遺伝子は、ＤＮＡ結合ドメインを 有しておりそしてCys-Hisに富む反復配列、例えば、配列識別番号２又は４に表 されているような２個又はそれより多くのCys-Hisに富む反復配列を特徴とする アミノ酸配列を含んでいるタンパク質をコードしている。或る実施態様では、LH -2タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは異種転写活性化ドメインを有する融合タン パク質中で提供することができる。 「相同性」及び「同一性」とはそれぞれ、２つのポリペプチド配列間の配列類 似性を言い、同一性はより厳密な比較である。相同性と同一性はそれぞれ、比較 の目的で整列させられ得る各配列の位置を比較して決定することができる。比較 した配列の１つの位置が同一のアミノ酸残基で占められているときには、これら のポリペプチドはその位置で同一であると言うことができ、同等の部位が同一の アミノ酸（例えば、一致する）又は類似のアミノ酸（例えば、立体的及び／又は 電子的性質が類似している）で占められているときには、これらの分子はその位 置で相同性であると言うことができる。配列間の相同性又は同一性の割合は、配 列が共有する対合数又は相同位置数の関数である。「関連無し」又は「非相同性 」の配列では共有する同一性は40パーセント未満であるが、好ましくは25パーセ ント未満である。 好ましい核酸は、ＬH-2タンパク質活性を有しておりそして配列識別番号２又 は４に示されているアミノ酸配列と少なくとも60％相同、更に好ましくは70％相 同、そして最も好ましくは80％相同のペプチドをコードしている。LH-2タンパク 質の活性を有しておりそして配列識別番号２又は４に示されている配列と少なく とも約90％、更に好ましくは少なくとも約95％、そして最も好ましくは少なくと も約98〜99％の相同性を有するペプチドをコードする核酸も本発明の範囲内であ る。好ましくは、上記核酸は配列識別番号１又は３に示されているコード化配列 の少なくとも１部を含んでいるｃＤＮＡ分子である。 LH-2ポリペプチドの構造の修飾は、治療的又は予防的有効性、安定性（例えば 、エクスビボ貯蔵寿命やインビボでのタンパク質分解に対する抵抗性）を高める ような目的であるか又はリン酸化等のような転写後修飾であることができる。こ のような修飾ペプチドは、例えば、アミノ酸置換、欠失又は付加によって製造す ることができる。 例えば、ロイシンをイソロイシン若しくはバリンで、アスパラギン酸をグルタ ミン酸で、スレオニンをセリンで置換するか、又は或るアミノ酸を構造的に関係 のあるアミノ酸で同様に置換（即ち、等配電子的及び／又は等電的突然変異）し ただけでは、得られる分子の生物学的活性に対して大きな影響を有していないと 考えることが妥当である。保存的置換は、側鎖に関係しているアミノ酸のファミ リーの範囲内で生起する置換である。遺伝子的にコードされるアミノ酸は４つの ファミリー：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシ ン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イ ソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び （４）非電荷型極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリ ン、スレオニン、チロシンに分類することができる。フェニルアラニン、トリプ トファン及びチロシンはときには一緒にして芳香族アミノ酸として分類される。 同様にして、アミノ酸は全て、（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸； （２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）脂肪族＝グリシン、ア ラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン(セリンとスレ オニンは、任意に、脂肪族ヒドロキシルとして別個に分類される)；（４）芳香 族＝フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；（５）アミド＝アスパラギ ン、グルタミン；並びに（６）硫黄含有＝システイン及びメチオニンとしてグル ープ分けすることができる。(例えば、Biochemistry、第２版、L．Stryer編集、 WHFreemanand Co.;1981年参照)。ペプチドのアミノ酸配列の変化がLH-2の機能的 相同体（例えば、真正形態が本発明の前駆細胞を産生する能力を、得られたポリ ペプチドが模擬しているという意味で機能的）を生じさせるかどうかは容易に決 定することができる。１つより多くの置換が生起しているポリペプチドは同じ方 法で容易に試験することができる。 同様に、上記造血遺伝子構築物は、Cys-His反復配列を含んでいる、例えば、 配列識別番号１又は３のうちの１つに示されているアミノ酸配列の全部又は一部 を有しているLH-2ポリペプチドをコードする核酸と高度、中程度又は低度の緊縮 条件下でハイブリッドを形成する、例えば、配列識別番号１又は３で示される核 酸配列とハイブリッドを形成するヌクレオチド配列を含んでいるLH-2遺伝子を用 いて作成することができる。ＤＮＡハイブリッド形成を促進する適当な緊縮条件 、例えば、約45℃で6.0×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続 いて50℃で2.0×ＳＳＣの洗浄は、当該技術分野の熟練者に知られているか又は カレント プロトコールズ イン モレキュラー バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology)、ジョーン ウイリー アンド サンズ(John Wiley & Son s)、ニューヨーク州(1989年)、6.3.1〜6.3.6中に見ることができる。例えば、洗 浄段階の塩濃度は50℃で約2.0×ＳＳＣの低い緊縮度から50℃で約0.2×ＳＳＣの 高い緊縮度までで選択することができる。加えて、洗浄段階の温度は室温、即ち 約22℃の低い緊縮条件から約65℃の高い緊縮条件に高めることができる。 主題LH-2タンパク質の生物学的に活性の部分をコードする核酸も本発明の範囲 内である。本明細書で使用するとき、LH-2タンパク質の活性部分をコードする核 酸のフラグメントとは、例えば、配列識別番号１又は３で表されているLH-2タン パク質の全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列よりヌクレオチ ドが少なく且つ全長タンパク質の転写活性を保持しているペプチドをコードする ヌクレオチド配列を言う。 幹細胞で造血遺伝子を組換え的に発現させるために、以下に記載するような広 範囲のベクターを使用できることが理解されよう。このようなベクターは、例え ば、サムブルック(Sambrook)、フリッツ（Fritsch）及びマニアチス（Maniatis ）編集、モレキュラー クローニング(Molecular Cloning):アラボラトリー マニ ュアル（A Laboratory Manual）(Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニュ ーヨーク州コールドスプリングハーバー［1989年］)に記載されているような制 限エンドヌクレアーゼ消化、結合、プラスミド並びにＤＮＡ及びＲＮＡ精製、Ｄ ＮＡシークエンス法等の標準的な技術を含むが、これらに限定されない当該技術 分野で周知の方法を使用して構築することができる。大部分の実務者は標準的な 原材料並びに特定の条件及び方法に精通している。しかしながら、便宜上、以下 の項が指針として役立つであろう。 適当な造血遺伝子構築物を作成するために、意図した造血遺伝子に相当する核 酸は、本明細書に記載したプロトコール並びに当該技術分野で一般的に知られて いるプロトコールに従って多数の真核細胞のいずれかに存在するｍＲＮＡ又はゲ ノムＤＮＡから得ることができる。説明すると、LH-2タンパク質をコードするｃ ＤＮＡは、該タンパク質を発現する細胞、例えば、造血細胞又は神経細胞から全 ｍＲＮＡを単離して得ることができる。次いで、二本鎖ｃＤＮＡを上記全ｍＲＮ Ａから調製し、そしてその後、多数の既知の技術の任意のものを使用して適当な プラスミド又はバクテリオファージベクターに挿入することができる。LH-2タン パク質をコードする遺伝子は、本発明で提供したヌクレオチド配列情報に従って 、確立されたポリメラーゼ連鎖反応技術を使用してクローン化することもできる 。 ＤＮＡフラグメントをベクターに挿入するための当該技術分野で知られている 任意の方法を使用して、適当な転写／翻訳制御シグナルを含んでいる本発明の発 現構築物を作成することができる。例えば、サムブルック等、上述;及びアウス ベル（Ausubel）等編集、カレント プロトコールズ イン モレキュラー バイオ ロジー（John Wiley & Sons、ニューヨーク州［1992年］）参照。これらの方法 には インビトロＤＮＡ組換え技術及び合成技術並びにインビボ遺伝子組換えを含める ことができる。 本発明の造血遺伝子は典型的には、特別の態様で遺伝子の発現を調節するため にプロモーター及び／又はエンハンサーのような転写調節配列と機能的に結合さ れているであろう。或る実施態様では、有用な転写調節配列は、活性に関して、 時間的に且つ空間的に高度に規制されている配列である。かくして、選択される プロモーターは、特別の組織又は細胞型においてだけ活性のものであることがで きる。プロモーターが或る哺乳類から得られる場合、その哺乳類は同種（トラン スフェクションされる哺乳類と同じ種）又は非同種（異なる種）であることがで きる。 適当なプロモーター／エンハンサーは当該技術分野の標準的な方法を使用して ベクターに導入することができる(例えば、Maniatis参照)。造血細胞内での転写 開始を指令するのに十分な任意のプロモーターを本発明で使用することができる 。例えば、組換え造血遺伝子の発現を制御するために使用できるプロモーター／ エンハンサーには、組換え遺伝子用の天然の転写調節配列(例えば、LH-2調節配 列等)、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー(Keating 等（1990年）Exp Hematol 19:99〜102;及びKarasuyama等、1989年、J Exp．Med ．169:13)、ヒトβ-アクチンプロモーター(Gunning等（1987年）PNAS 84:4831〜 4835)、マウス乳癌ウイルスの長い末端反復配列（ＭＭＴＶ ＬＴＲ）中に存在す るグルココルチコイド誘導性プロモーター(Klessig等（1984年）Mol．Cell Biol ．4:1354〜1362)、モロニーマウス白血病ウイルスの長い末端反復配列（ＭｕＬ ＶＬＴＲ）(Weiss等（1985年）RNA Tumor Viruses、Cold Spring Harbor Labora tory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー)、マウス幹細胞ウイ ルス（ＭＳＣＶ）由来のプロモーター(以下の実施例参照)、ＳＶ40初期又は後期 領域プロモーター(Bernoist等（1981年）Nature 290:304〜310;Templeton等（19 84年）Mol．Cell Biol.、4:817;及びSprague等（1983年）J．Virol.、45:773)、 ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長い３'末端反復配列に含まれているプロモー ター(Yamamoto等、1980年、Cell、22:787〜797)、単純ヘルペスウイルス（ＨＳ Ｖ）チミジンキナーゼプロモーター／エンハンサー（Wagner等（1981年）PNAS 8 2 :35 67〜3571）及び単純ヘルペスウイルスＬＡＴプロモーター（Wolfe等（1992年）N ature Genetics、1:379〜384）が含まれるが、これらに限定されない。好ましい 非組織特異的プロモーターはＣＭＶプロモーター（DeBernardi等（1991年）PNAS USA 88:9257〜9261）である。これに関して、マウスＣＭＶ前初期プロモーター はヒト造血前駆細胞並びに培養中のストロマ細胞中で非常に活性であることが示 されている（Keating，A.等（1990年）Exp．Hematol．18:99〜102）。 構成的発現の代替として、造血遺伝子を造血細胞に特異的なプロモーターの制 御下に置くことができる。これらプロモーターの例にはグロビンプロモーター、 例えば赤血球内発現用のβ-グロビンプロモーター(Karlsson等（1985年）Ann．R ev．Biochem．54:1071〜1108);Ｔ細胞及びＮＫ細胞内発現用のグランザイムＡプ ロモーター、幹細胞及び前駆細胞内発現用のＣＤ34プロモーター、細胞毒性Ｔ細 胞内発現用のＣＤ8プロモーター、並びに骨髄性細胞内発現用のＣＤ11bプロモー ターが含まれる。 或る生理学的条件下での遺伝子発現用の誘導的プロモーターを使用することも できる。当該技術分野の熟練者は、組換え造血遺伝子の発現を制御するために使 用できる多様な誘導的真核生物プロモーターを知っているであろう。例えば、Ｉ ＰＴＧ-誘導的プロモーターを使用して、組換え遺伝子の発現を条件付で制御す ることができる。別の転写制御系はホルモンに応答性である（Lee等（1981年）N ature 294:228〜232;Hynes等（1981年）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:2038〜 2042;Klock等（1987年）Nature 329:734〜736;Israel & Kaufman（1989年）Nucl ．Acids Res．17:2589〜2604）。 造血遺伝子及び転写調節配列に加えて、本発明の組換え遺伝子の調製に有用な ベクターは典型的には、宿主動物内での異所性発現を最適にするのに有用な１つ 又はそれより多くの他の要素を含有している。説明すると、上記遺伝子構築物は 、イントロン配列だけでなく、ｍＲＮＡ転写産物のポリアデニル化を指令するよ うな転写終結要素を含んでいることができる。例えば、上記組換え遺伝子のコー ド化配列には、転写産物に転写終結シグナルやポリアデニル化シグナルを付加す るＳＶ40配列（ＳＶ40イントロン／ｐＡ）が３'末端の側部に位置していること ができる。更に他の実施態様では、造血遺伝子はコード化配列を中断するイント ロン 配列（単数又は複数）を含んでいることができる。多くの場合に、哺乳類におけ る組換え遺伝子の転写はコード化配列中の１つ又はそれより多くのイントロンの 存在によって高められる。 更に他の実施態様では、上記遺伝子構築物は、意図された受容細胞に挿入する 前に細胞（例えば、細菌性）内での操作を容易にする追加的な要素を含んでいる ことができる。例えば、上記ベクターは原核細胞内増殖用の複製要素起源を含ん でいることができる。 更に、造血遺伝子構築物は、受容動物か又は得られる中間トランスジェニック 動物（即ち、上記構築物の増幅に使用される細菌細胞）のどちらかから細胞を単 離するための選択マーカーを含んでいることができる。選択マーカー遺伝子は選 択的培養条件下で、トランスフェクションされた細胞の生存及び／又は増殖に必 要なタンパク質をコードすることができる。典型的な選択マーカー遺伝子は、例 えば：（ｉ）抗生物質又は他のトキシン、例えば、原核宿主細胞についてはアン ピシリン、テトラサイクリン又はカナマイシン、そして哺乳類細胞についてはネ オマイシン、ヒグロマイシン又はメトトレキセートに対する抵抗性を付与するか ；或いは（ii）細胞の補体自己栄養欠損症を付与するタンパク質をコードしてい る。 Ｂ．幹細胞における造血遺伝子の異所性発現用の系 上記造血遺伝子構築物は生物学的に有効な担体、例えば、該発現構築物を用い てエクスビボ又はインビボで細胞を効果的にトランスフェクションできる任意の 処方又は組成物中で投与することができる。効率的なＤＮＡ転移方法が造血細胞 用に開発されている(例えば、Keating等（1990年）Exp Hematol 18:99〜102;及 びDick等（1986年）Trends Genet 2:165参照)。これらの方法には、組換えレト ロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスを含むウイルスベクター、 又は組換え細菌プラスミド若しくは真核生物プラスミドへの造血遺伝子の挿入が 含まれる。ウイルスベクターを使用して細胞を直接トランスフェクションするこ とができ;プラスミドＤＮＡは上記遺伝子構築物の直接注入又はＣａＰＯ4沈降法 を実施することだけでなく、例えば、カチオン性リポソーム（リポフェクチン） 若しくは誘導体（例えば、抗体抱合体）、ポリリシン抱合体、グラマシジンＳ、 人 工ウイルスエンベロープ又は他のこのような細胞内担体の助けを借りて送達する ことができる。適当な標的細胞の形質導入は遺伝子治療において決定的に重要な 第１段階を示しているので、特別の遺伝子送達系の選択は表現型のような要素、 例えば、幹細胞が受ける（もし受けている場合には）拘束度に依存することが認 められよう。適当なトランスフェクション処方の選択における別の要素はエクス ビボトランスフェクション対インビボトランスフェクションで提起される考慮事 項であり、後者では投与経路、例えば、局所的又は全身的な経路を考慮しなけれ ばならない。 細胞内への主題造血遺伝子構築物のエクスビボ又はインビボ導入の両方に好ま しい方法は造血遺伝子を含有するウイルスベクターを使用することによるもので ある。ウイルスベクターで細胞を感染させると、大部分の標的細胞が核酸を受け 取ることができるという利点を有している。更に、ウイルスベクター内で、例え ば、ウイルスベクター内に含まれているｃＤＮＡでコードされる分子は、ウイル スベクターの核酸を取り込んでいる細胞内で効率的に発現される。 レトロウイルスベクターは一般的に、外来遺伝子を幹細胞、特にヒト細胞内に 導入するために選択される組換え遺伝子送達系の１つであると理解されている。 (例えば、Hawley R．G.等（1994年）Gene Therapy 1:136〜138参照)。これらの ベクターは細胞内への効率的な遺伝子送達を提供し、そして導入された核酸は宿 主の染色体ＤＮＡに安定的に組み込まれる。レトロウイルスを使用する主要な前 提条件は、特に細胞集団中の野生型ウイルスの蔓延の可能性に関して、レトロウ イルス使用の安全性を確保することである。複製欠損レトロウイルスしか産生し ない特別の細胞系（「パッケージング細胞」と称される）の開発が、遺伝子送達 系としてのレトロウイルスの有用性を高めており、そして欠損レトロウイルスは 遺伝子治療目的の遺伝子導入における使用に関して良好に特徴付けられている( 総説については、Miller，A.D．（1990年）Blood 76:271参照)。かくして、レト ロウイルスのコード化配列部分（gag、pol、env）が造血遺伝子で置換されてい る組換えレトロウイルスを構築して、レトロウイルスを複製欠損とすることがで きる。次いで、複製欠損レトロウイルスをビリオン内にパッケージングし、そし てこのビリオンを使用し、標準的な技術でヘルパーウイルスを使用して標的細胞 を 感染させることができる。組換えレトロウイルスを産生させそしてこのウイルス を使用してエクスビボ又はインビボで細胞を感染させるプロトコールはアウスベ ル等、上述の9.10〜9.14節及び他の標準的な実験室マニュアル中に見い出すこと ができる。適当なレトロウイルスの例には、当該技術分野の熟練者に良く知られ ているｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ及びｐＥＭが含まれる。同種指向性と両種指向 性の両レトロウイルス系を調製するのに適するパッケージングウイルス系譜の例 にはΨCrip、ΨCre、Ψ２及びΨＡｍが含まれる。 レトロウイルスは、多様な遺伝子をエクスビボとインビボの両プロトコールで 胚幹細胞、骨髄細胞、リンパ球、肝細胞を含む多数の異なる細胞型に導入するた めに使用されている（例えば、Eglitis等（1985年）Science 230:1395〜1398；D anos及びMulligan（1988年）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:6460〜6464;Wilso n等（1988年）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:3014〜3018;Armentano等（1990 年）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:6141〜6145;Huber等（1991年）Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 88:8039〜8043;Ferry等（1991年）Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 88:8377〜8381;Chowdhury等（1991年）Science 254:1802〜1805;van Beusech em等（1992年）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:7640〜7644；Kay等（1992年）H uman Gene Therapy 3:641〜647;Dai等（1992年）Proc．Natl．Acad．Sci．USA89 :10892〜10895;Hwu等（1993年）J．Immunol．150:4104〜4115;米国特許第4,868, 116号;米国特許第4,980,286号;ＰＣＴ出願ＷＯ89/07136;ＰＣＴ出願ＷＯ89/0246 8;ＰＣＴ出願ＷＯ89/05345;及びＰＣＴ出願ＷＯ92/07573参照）。 代表的なレトロウイルスベクターは、未分化の胚及び造血細胞中で遺伝子を効 率的に形質導入しそして発現し得る高力価ウイルスを生じさせると記載されてい る(Hawley等（1994年）Gene Therapy 1:136〜138)。これらのベクターはレトロ ウイルス変異体ＰＣＭＶ（ＰＣＣ4胚性癌細胞を継代した骨髄増殖性肉腫ウイル ス）由来の変種ＬＴＲの下流に、内部マウスpgkプロモーターの転写制御下の選 択マーカー（neo、hph又はpac）と固有の遺伝子挿入制限部位を含有している。 上記したレトロウイルスベクターの変種、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）は 以下に記載する実施例で説明する。 代表的な実施態様では、ヒトLH-2遺伝子の全コード化領域（配列識別番号： １）は、ウイルスＬＴＲプロモーターの制御下でＭＳＣＶneoベクター（Hawley 等、上述）内に挿入され、そしてＧ418に対する抵抗性を与える選択マーカーと してネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子も有している。図５参照。簡 単に言えば、ＰＣＲアンカープライマーを使用してヒトLH-2コード化配列を単離 してその側部に制限部位を付加することができ、そしてこれによって、LH-2配列 はＭＳＣＶneoベクターの多数のクローニング部位にサブクローニングすること ができる。パッケージング細胞を産生する無ヘルパーＭＳＣＶneo-LH-2ウイルス （以下の実施例及びMarkowitz等（1988年）J Virol 62:1120〜1124参照）は、ホ ーリー（Hawley）等（1991年）Leukemia Res 15:659〜673の方法に従って一過性 トランスフェクション体から得られる上清液でツニカマイシン処理細胞を感染さ せて作成することができる。これらの細胞は、例えば、Ｇ418を補充したダルベ ッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持される。無ヘルパーＭＳＣＶneo- LH-2ウイルスのストックは高力価（例えば、＞106ＣＦＵ/ml）のパッケージング 細胞集団を集めて作ることができる。レトロウイルスは、集めたレトロウイルス パッケージング細胞系統によって得られる培養培地、上清液（例えば、５〜20％ （ｖ/ｖ）)のどちらかにレトロウイルスを加えて、若しくは感染させたレトロウ イルスパッケージング系統自体の上で幹細胞を直接培養して、又はこれらの両方 によって感染させることができる。例えば、米国特許第5,399,493号及び第5,399 ,346号並びにＰＣＴ公開ＷＯ93/07281参照。 レトロウイルスベクターの一般的な考察に戻ると、当該技術分野では、ウイル ス粒子表面のウイルスパッケージングタンパク質を修正することによって、レト ロウイルスそしてその結果レトロウイルスに基づくベクターの感染スペクトルを 制限できることが証明されていることが認められる(例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ93/ 25234、ＷＯ94/06920及びＷＯ94/11524)。例えば、レトロウイルスベクターの感 染スペクトルの修正戦略には:幹細胞表面抗原に特異的な抗体をウイルスenvタン パク質と結合させること（Roux等（1989年）PNAS 86:9079〜9083;Julan等（1992 年）J．Gen Virol 73:32:51〜3255;及びGoud等（1983年）Virology 163:251〜25 4);又は細胞表面リガンドをウイルスenvタンパク質と結合させること（Neda等（ 1991年）J Biol Chem 266:14143〜14146）が含まれる。結合は、融合タンパク 質（例えば、一本鎖抗体／env融合タンパク質）を産生させることによるだけで なく、タンパク質又は他のもの（例えば、envタンパク質をアシアロ糖タンパク 質に転換するためのラクトース）との化学的交差結合の形態であることができる 。この技術は、感染を或る組織タイプに限定するか又は向けさせるのに有用であ るが、同種指向性ベクターを両種指向性ベクターに転換させるために使用するこ ともできる。 更に説明すると、造血遺伝子構築物はレトロウイルスベクターを使用して作成 することができ、そしてこれは更に、ウイルスエンベロープタンパタ質と水疱性 口内炎ウイルス（ＶＳＶ-Ｇ）糖タンパク質を含んでいる融合タンパク質を提供 する(Burns等（1993年）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:8033〜8037;ＰＣＴ特 許出願ＷＯ 92/14829;及びＷＯ 96/09400)。典型的な両種指向性envタンパク質 とは異なって、ＶＳＶ-Ｇタンパク質は細胞表面タンパク質を認識することによ ってというよりはむしろ細胞膜のリン脂質成分と融合してウイルス感染を媒介す ると考えられている。感染は特定のレセプターに依存しないので、ＶＳＶ-Ｇプ ソイド型ベクターは広範な宿主範囲を有している。ＣＤ34＋/Ｔｈｙ-1＋移動末 梢血細胞はＶＳＶ-Ｇプソイド型レトロウイルスベクターによって高い効率で形 質導入されることが以前に証明されている(Kerr等、ＰＣＴ公開ＷＯ 96/09400参 照)。造血遺伝子構築物による幹細胞の遺伝子修飾は、発現構築物を含有するＶ ＳＶ-Ｇプソイド型ビリオンを使用して形質導入することによって幹細胞維持中 の任意の時点で達成することができる。 更に、レトロウイルス遺伝子送達系の用途は、組換え造血遺伝子の発現を制御 する組織又は細胞特異的転写調節配列を使用することによって更に増大させるこ とができる。 本発明で有用なもう１つのウイルス遺伝子送達系ではアデノウイルス由来ベク ターが使用される。アデノウイルスのゲノムは、問題の造血遺伝子産物をコード しているが、通常の溶菌性ウイルス生活環における複製能力に関して不活性化さ れているように操作することができる(例えば、Berkner等（1988年）Bio Techni ques 6:616;Rosenfeld等（1991年）Science 252:431〜434;及びRosenfeld等（19 92年）Cell 68:143〜155参照)。アデノウイルス株Ａｄタイプ５ dl324又はア デノウイルスの他の株（例えば、Ａd2、Ａd3、Ａd7等）から誘導される適当なア デノウイルスベクターは当該技術分野の熟練者に良く知られている。組換えアデ ノウイルスは比較的安定であるので精製や濃縮になじみ易く、そして上記したよ うに、幹細胞集団に関して感染性スペクトルに影響を与えるように修飾すること ができる。 更に、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（及びそこに含まれている外来ＤＮＡ ）は宿主細胞のゲノムに組み込まれないで、依然としてエピソームのままであり 、そしてそのため、導入されたＤＮＡが宿主ゲノム（例えば、レトロウイルスＤ ＮＡ）に組み込まれるようになる状況下における挿入突然変異誘発の結果として 生じることがある潜在的な問題が回避される。その上、アデノウイルスゲノムの 外来ＤＮＡ保持能力は他の遺伝子送達ベクターと比べて大きい（８キロベースま で）(Berkner等、上述:Haj-Ahmand及びGraham（1986年）J．Virol．57:267)。現 在使用されておりそしてそれ故本発明で好ましい、大部分の複製欠損アデノウイ ルスベクターはウイルスＥ1及びＥ3遺伝子の全部又は一部を欠いているが、80％ ほどの多くのアデノウイルス遺伝子材料を保持している（例えば、Jones等（197 9年）Cell 16:683;Berkner等、上述;及びGraham等、Methods in Molecular Biol ogy、E．J．Murray編集(Humane、ニュージャージー州クリフトン）７巻、109〜1 27頁参照)。挿入された造血遺伝子は、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、主要な後 期プロモーター（ＭＬＰ）及び関連リーダー配列、Ｅ3プロモーター又は外来的 に付加されたプロモーター配列の制御下で発現することができる。 主題造血遺伝子の送達に有用な尚もう１つのウイルスベクター系はアデノ随伴 ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ随伴ウイルスベクターは、多分化能造血幹細 胞内への他の遺伝子のインビトロ形質導入に効果的であることが示されている( ＰＣＴ出願ＷＯ 96/08560参照)。アデノ随伴ウイルスは天然生起の欠損ウイルス であり、効率的な複製や増殖生活環にはヘルパーウイルスとしてアデノウイルス 又はヘルペスウイルスのような他のウイルスが必要である。(総説については、M uzyczka等Curr．Topics in Micro and Immunol．（1992年）158:97〜129参照)。 アデノ随伴ウイルスは、ＤＮＡを非分割細胞に組み込むことができ、そして高頻 度の安定的な組み込みを示す数少ないウイルスのうちの１つでもある(例えば、 Flotte等（1992年）Am．J．Respir．Cell．Mol．Biol．7:349〜356;Samulski等( 1989年)J．Virol．63:3822〜3828;及びMcLaughlin等（1989年）J．Virol．62:19 63〜1973参照)。300塩基対ほどの小さなＡＡＶを含有するベクターはパッケージ ングされることができそして組み込むことができる。外来ＤＮＡの空間は約4.5k bに制限される。トラツィン（Tratschin）等（1985年）Mol．Cell．Biol．5:325 1〜3260に記載されているようなＡＡＶベクターを使用して組換え造血遺伝子を 幹細胞に組み込むことができる。ＡＡＶベクターを使用して多様な核酸が種々の 細胞型に導入されている（例えば、Hermonat等（1984年）Proc．Natl．Acad．Sc i．USA 81:6466〜6470;Tratschin等（1985年）Mol．Cell．Biol．4:2072〜2081 、Wondisford等（1988年）Mol．Endocrinol．2:32〜39、Tratschin等（1984年） J．Virol．51:611〜619;及びFlotte等（1993年）J．Biol．Chem．268:3781〜379 0参照）。 上記で説明したようなウイルス導入方法に加えて、非ウイルス方法を使用して 、トランスフェクションした幹細胞内で異種造血遺伝子を発現させることもでき る。大部分の非ウイルス的遺伝子導入法は巨大分子の取り込みや細胞内輸送のた めに哺乳類細胞で使用される通常のメカニズムに依拠している。好ましい実施態 様では、本発明の非ウイルス遺伝子送達系は、標的細胞が造血遺伝子構築物を取 り込むエンドサイトーシス経路に依拠している。このタイプの代表的な遺伝子送 達系にはリポソーム由来の系、ポリ-リシン抱合体及び人工的なウイルスエンベ ロープが含まれる。 代表的な実施態様では、LH-2タンパク質をコードする遺伝子を含んでいる発現 構築物は表面に陽電荷を有するリポソーム（例えば、リポフエクチン）内に封入 することができ、そして（任意に）これは標的幹細胞集団の細胞表面抗原に対す る抗体で標識される(Mizuno等（1992年）No Shinkei Geka 20：547〜551;ＰＣＴ 公開ＷＯ91/06309;日本特許出願1047381;及びヨーロッパ特許公開ＥＰ-A43075) 。 尚もう１つの説明的な実施態様では、本発明の遺伝子送達系は、ポリリシンの ような遺伝子結合作用剤と交差結合する抗体又は細胞表面リガンドを含んでいる (例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ93/04701、ＷＯ92/22635、ＷＯ92/20316、ＷＯ92/19 749及びＷＯ92/06180参照)。レセプター介在エンドサイトーシスによる主題核酸 構築物の有効な送達は、エンドソーム構造からの遺伝子脱出を高める作用剤を使 用して改善できることも認められよう。例えば、アデノウイルス全体又はインフ ルエンザＨＡ遺伝子産物のフソジェニック（fusogenic）ペプチドを送達系の一 部として使用して、ＤＮＡ含有エンドソームの効率的な破壊を誘導することがで きる(Mulligan等（1993年）Science 260:926;Wagner等（1992年）PNAS 89:7934; 及びChristiano等（1993年）PNAS 90:2122)。 例えば、上記造血遺伝子構築物を使用し、ポリカチオン、例えば、ポリリシン と抱合した幹細胞レセプターのリガンド（例えば、Ｓｌ因子）を含んでいる可溶 性ポリヌクレオチド担体を使用して造血幹細胞をトランスフェクションすること ができる。更に説明すると、上記遺伝子送達系はc-kit発現細胞、例えば、ヒト 造血前駆細胞に特異的に標的化することができる。上記のc-kitタンパク質はＳ ｌ因子用のチロシンキナーゼレセプターであり、そして全ての造血系譜を再構築 し得る多分化能幹細胞上で発現される。更に、c-kit発現は幹／前駆細胞に限定 されるので、マスト細胞内での発現を除いて、拘束されている上記細胞の子孫で は発現されない。１つの説明的な実施態様では、造血遺伝子の発現ベクターは、 ストレプトアビジンと共有結合したポリリシン（ＰＬ）やアデノウイルスと共有 結合したＰＬと静電力で縮力している(エンドソーム溶解を達成するために)。上 記のベクター-ＰＬ抱合体にビオチン化したＳｌ因子を加えると、該因子はスト レプトアビジン-ビオチン相互作用によってベクター-ＰＬ抱合体と会合するよう になる。このような構築物を使用して、造血幹細胞を造血遺伝子構築物によるト ランスフェクション用に標的化することができる。例えば、米国特許第5,166,32 0号及びシュバルツェンベルガー（Schwarzenberger）等、Blood（1996年）87(2) :472〜478参照。上記したＰＬ-ベクター構築物の１つの利点は幹細胞集団の一時 的トランスフェクションを実施できることであるが、拘束された造血細胞は、c- kitを欠いているのでトランスフェクション過程に対して抵抗性である。この方 法のもう１つの利点は、ＤＮＡ取り込みが非常に効率的なレセプター介在性エン ドサイトーシス、即ち、細胞毒性に関係のない巨大分子取り込み用の生理学的経 路に依拠しているという事実に由来する。 主題の造血遺伝子構築物は、ＤＮＡトランスフェクション又は上記で広範に記 載したウイルス介在性形質導入によって幹細胞内に効率的に導入することができ る。当該技術分野で知られている幹細胞のインビトロ培養系は遺伝子操作用の利 用可能なモデルを提供する。考えられる形質導入法には、幹細胞とウイルス産生 細胞の直接的同時培養（例えば、Bregni等（1992年）Blood 80.:1418〜1422参照 ）が含まれるが、これに限定されない。或いは、ウイルス感染細胞から得られる 上清液を単離し、そして幹細胞の感染に適する条件下で幹細胞培養物に適用する ことができる。例えば、スウ（Xu）等（1994年）Exp．Hemat．22:223〜230;及び ヒューズ（Hughes）等（1992年）J．Clin．Invest．89:1817参照。次いで、得ら れた形質導入細胞を、非修飾幹細胞と同様な条件下で増殖させることによって修 飾幹細胞は拡大させられそして分化させられると思われる。 尚もう１つの実施態様では、造血遺伝子は、ゲノムＤＮＡとの相同的組換えで 内在性形態の遺伝子の転写調節配列を改変する「遺伝子活性化」構築物を使用し て異所的に発現させることができる。例えば、上記遺伝子活性化構築物はLH-2遺 伝子の内在性プロモーターを異種プロモーター、例えば、遺伝子の構成的発現を 生じさせるか又は遺伝子の通常の発現パターンと異なる条件下で遺伝子の誘導的 発現を生じさせる異種プロモーターで置換することができる。遺伝子活性化構築 物の多種多様なフォーマットが利用できる。例えば、トランスカリオチック セ ラピーズ インク(Transkaryotic Therapies，Inc)、ＰＣＴ公開ＷＯ93/09222、 ＷＯ95/31560、ＷＯ96/29411、ＷＯ95/31560及びＷＯ94/12650参照。 好ましい実施態様では、遺伝子活性化構築物として使用されるヌクレオチド配 列は、（１）組換えを指令する内在性誘導因子遺伝子（エキソン配列、イントロ ン配列、プロモーター配列等）の或る部分から得られるＤＮＡ及び（２）上記遺 伝子活性化構築物の組換えによってゲノム遺伝子のコード化配列と機能的に結合 させられる異種転写調節配列（単数又は複数）から構成されていることができる 。因子産生細胞培養物の産生に使用するために、上記構築物は、細胞のゲノムＤ ＮＡ内に存在する組換え構築物を検出するレポーター遺伝子を更に含んでいるこ とができる。 上記遺伝子活性化構築物は細胞内に挿入され、そして天然遺伝子と機能的に結 合した異種調節配列を提供するような位置で該細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれ る。このような挿入は相同的組換えによって生じる。即ち、内在性誘導因子遺伝 子配列と相同性の活性化構築物の組換え領域がゲノムＤＮＡとハイブリッドを形 成しそしてゲノム配列と組み換えられて、上記構築物はゲノムＤＮＡの対応する 位置に取り込まれる。 用語「組換え領域」又は「標的配列」とは、ゲノム遺伝子配列と実質的に同一 又は実質的に相補的な配列を有しており、例えば、上記ゲノム遺伝子の５'フラ ンキング配列を含んでおり、そしてゲノム配列と標的導入遺伝子構築物間の相同 的組換えを促進し得る遺伝子活性化構築物の断片(即ち、一部分)を言う。 本明細書で使用するとき、用語「置換領域」とは、組換え領域とゲノム配列間 の相同的組換えによって内在性染色体位置に組み込まれるようになる活性化構築 物の一部分を言う。 例えば、置換領域で提供される異種調節配列は、プロモーター(例えば、構成 的プロモーター又は誘導プロモーター)、エンハンサー、遺伝子座調節領域、転 写因子結合部位又はこれらの組合せを含む多様な要素のうちの１つ又はそれより 多くを含んでいることができる。インビボで標的遺伝子の発現を制御するために 使用できるプロモーター／エンハンサーにはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プ ロモーター／エンハンサー(Karasuyama等、1989年、J．Exp．Med.、169:13)、ヒ トβ-アクチンプロモーター(Gunning等（1987年）PNAS 84:4831〜4835)、マウス 乳癌ウイルスの長い末端反復配列（ＭＭＴＶＬＴＲ）(Klessig等（1984年）Mol ．Cell Biol．4:1354〜1362)、モロニーマウス白血病ウイルスの長い末端反復配 列（MuLV ＬＴＲ）(Weiss等（1985年）RNA Tumor Viruses、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）中に存在している グルココルチコイド誘導プロモーター、ＳＶ40初期若しくは後期領域プロモータ ー(Bernoist等（1981年）Nature 290:304〜314;Templeton等（1984年）Mol．Cel l Biol.、4:817;及びSprague等（1983年）J．Virol.、45:773)、ラウス肉腫ウイ ルス（ＲＳＶ）の長い３'末端反復配列に含まれているプロモーター(Yamamoto等 、1980年、Cell、22:787〜797)、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナ ーゼプロモーター／エンハンサー（Wagner等（1981年）PNAS 82:3567〜3571） 及び単純ヘルペスウイルスＬＡＴプロモーター（Wolfe等（1992年）Nature Gene tics、1:379〜384）が含まれるが、これらに限定されない。 IV．細胞供給源 当該技術分野の熟練者は、主題方法がインビボ又はエクスビボ（例えば、細胞 培養物中）実施態様のどちらでも実施できることを認めるであろう。造血遺伝子 構築物のインビボ送達は多様な遺伝子治療技術の任意のものを使用して実施する ことができる。エクスビボ適用では、遺伝子的に修飾される幹細胞は先ず細胞培 養物中で単離しなければならない。胚幹細胞及び／又は造血幹細胞を単離する多 様なプロトコールが当該技術分野で良く知られている。主題方法で使用される代 表的な幹細胞培養物を以下で記載する。 Ａ．造血幹細胞の単離 造血幹細胞（HSCs）は骨髄(成体及び胎児)、移動末梢血(ＭＰＢ)、臍帯血及び ／又は胎児肝臓を含むが、これらに限定されない哺乳類供給源から単離すること ができる。好ましい実施態様では、HSCsは、造血遺伝子構築物のインビトロ培養 及び形質導入後に幹細胞が移植される対象から得る。 本発明の細胞供給源は、ヒトに加えて、非ヒト哺乳類であることができる。当 該技術分野では、非ヒト動物から胚幹細胞と造血幹細胞の両者を単離する多様な プロトコールが知られている。例えば、ホイーラー（Wheeler）の米国特許第5,5 23,226号、発明の名称「トランスジェニックブタ組成物及び方法」並びにエメリ ー（Emery）等のＰＣＴ云開ＷＯ95/13363、発明の名称「ブタ臍帯血由来の造血 幹細胞及びその用途」参照。好ましい非ヒト動物には、齧歯類、非ヒト霊長類、 ヒツジ、イヌ、ウシ及びブタのような脊椎動物が含まれる。用語「非ヒト哺乳類 」とは、ヒトを除く哺乳類クラスの全てのメンバーを言う。 得られる造血細胞の意図された用途がヒト患者での移植である場合、トランス ジェニック動物由来の細胞を、例えば、ヒト対象への異種移植片移植用の「ヒト 型化」造血細胞の供給源として使用することができる。例えば、サックス（Sach s）等のＰＣＴ公開ＷＯ96/06165、発明の名称「遺伝子操作したブタ細胞」に記 載されているように、この技術は、例えば、受容体の環境下で供与幹細胞の移植 又は機能を促進するために、供与細胞と受容体の分子及び細胞間の望ましい相互 作用を高めるように操作されているブタ供与細胞の移植を提供している。説明す ると、細胞はヒト接着分子、例えば、造血細胞の移植及び／又は維持に関与する 接着分子を発現するように操作することができる。ヒト接着分子の例には、ＶＬ Ａ-４、c-kit、ＬＦＡ-１、ＣＤ11ａ、Mac-１、ＣＲ3、ＣＤ11ｂ、ｐ150、ｐ95 、ＣＤ11ｃ、ＣＤ49ａ、ＬＰＡＭ-１、ＣＤ49ｄ、ＣＤ44、ＣＤ38及びＣＤ34が 含まれる。トランスジェニック細胞は供与細胞と、例えば、供与移植細胞の拒絶 を促進するか又は供与移植細胞の機能を阻止する受容体の分子及び細胞との間の 望まれていない相互作用を最小限にするように操作することもできる。例えば、 供与細胞は、１つ又はそれより多くのヒトＭＨＣポリペプチドを発現するトラン スジェニック動物から誘導することができる。 骨髄細胞は、腸骨（例えば、腸骨稜を経て寛骨から）、脛骨、大腿骨、脊椎又 は他の骨内腔が含まれるが、これらに限定されない骨髄供給源から得ることがで きる。他の幹細胞供給源には胚性卵黄嚢、胎児肝臓及び胎児脾臓が含まれるが、 これらに限定されない。 骨髄の単離には、適当な溶液、例えば、低濃度、一般的には約５〜25mMの許容 可能な緩衝液と一緒に、例えば、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）又は他の天然生起因子 を補充した塩溶液を使用して骨をさっと洗い流すことができる。好都合な緩衝液 にはＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液及び乳酸緩衝液が含まれる。そうでない場合、骨 髄は慣用の技術に従って骨から吸引することができる。 幹細胞を末梢血に移動させる方法は当該技術分野で知られており、そして一般 的には、化学療法薬、サーイトカイン（例えば、ＧＭ-ＣＳＦ、Ｇ-ＣＳＦ又はIL ３）又はこれらの組合せ物による処理に係わっている。典型的には、総白血球数 が500〜200個の細胞/ｌに達しそして血小板数か50,000/ｌに達したとき、総白血 球の成分献血を開始する。 種々の技術を使用して、最初に系譜前駆細胞を除去することによって細胞を分 離することができる。モノクローナル抗体は、特定の細胞系譜及び／又は分化段 階に関連したマーカーの同定に特に有用である。この抗体を固体支持体に付着さ せて粗く分離することができる。使用する分離技術は採集すべきフラクションの 生存力の保持を最大にするものでなければならない。種々の有効性の種々の技術 を使用して、「比較的粗く」分離することができる。このような分離では、存在 しているマーカー無し総細胞の10％まで、通常はせいぜい約５％、好ましくはせ いぜい約１％が保持すべき細胞集団と共に残存することができる。使用される特 別の技術は分離、随伴する細胞毒性、実施し易さ及び実施速度、並びに精巧な装 置及び／又は技術熟練の必要性に依存するであろう。 分離技術の使用には、物理的特性（密度勾配遠心法及び交流遠心水簸法）、細 胞表面特性（レクチン及び抗体親和性）及びウイルス染色特性（ミトコンドリア 結合染料rho123及びＤＮＡ結合染料Hoechst33342）の差異に基づくものが含まれ るが、これらに限定されない。分離法には、抗体被覆磁気ビーズを使用する磁気 分離法、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体と結合するか 又はモノクローナル抗体と一緒に使用される細胞毒性剤(これには補体及び細胞 毒素が含まれるが、これらに限定されない)、及び固体マトリックス、例えばプ レートに結合した抗体を有する「パニング（panning）」、水簸法又は他の任意 の好都合な技術が含まれるが、これらに限定されない。精密な分離を提供する技 術には、種々の精巧度を有することができる、例えば、複数のカラーチャンネル 、ローアングル及び鈍角光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネル等を 有することができるＦＡＣＳが含まれるが、これに限定されない。 分化した細胞の大部分は、比較的粗い分離を最初に使用して除去することがで き、そこでは、巨核球、マスト細胞、好酸球及び好塩基球のような小集団だけで なく、造血系の主要な細胞集団系譜、例えばリンパ球や骨髄単球が除去される。 通常、造血細胞の少なくとも約70〜90パーセントが除去されるであろう。所望の 場合、フィコール・ハイパク分離を使用して、先行分離を実施して赤血球を除去 することができる。 包括的分離は、磁気ビーズ、細胞毒性剤、アフィニティークロマトグラフィー 又はパニングが含まれるが、これらに限定されない当該技術分野で知られている 方法を使用して達成することができる。使用が見い出されている抗体には、全部 ではないとしても、大部分の成熟細胞の除去を可能にするが、幹細胞には存在し ていない系譜特異的マーカーに対する抗体が含まれる。 正の選択を提供する包括的分離と同時にか又はその後に、取り組んでいる細胞 に存在する系譜特異的マーカーの抗体を使用する負の選択を実施することができ る。殆どの場合、これらのマーカーはＣＤ2−、ＣＤ3−、ＣＤ7−、ＣＤ8−、Ｃ Ｄ10−、ＣＤ14−、ＣＤ15−、ＣＤ16−、ＣＤ19−、ＣＤ20−、ＣＤ33−及びグ リコホリンＡを含むが、これらに限定されない;好ましくは、少なくともＣＤ2− 、ＣＤ14−、ＣＤ15−、ＣＤ16−、ＣＤ19−及びグリコホリンＡを含むが、これ らに限定されない;そして通常は少なくともＣＤ14−とＣＤ15−を含んでいる。 本明細書で使用するとき、Linとは少なくとも１つの系譜特異的マーカーを欠い ている細胞集団を言う。次いで、取り組んでいる細胞が実質的に枯渇している造 血細胞組成物を、Thy-１用のマーカーを使用して更に分離して、実質的に同種の 幹細胞集団を達成することができる。この幹細胞集団の代表例はＣＤ34＋Thy-1 ＋Lin−の集団であり、そしてこれによって幹細胞に富む組成物が提供される。 ＣＤ34＋細胞の再分割が報告されておりそして幹細胞を更に濃厚にする他のマー カーにはＣＤ38−、ローダミン lo、c-kitレセプター、ＨＬＡ ＤＲ lo/−、Ｃ Ｄ71及びＣＤ45 ＲＡ−が含まれるが、これらに限定されない。ギィウスト（Giu sto）等（1993年）Blood 84:421〜432に記載されているように、胎児組織及び臍 帯では、幹細胞はＣＤ34 hiLin−集団で非常に濃厚化されている。 精製幹細胞はＦＡＣＳ分析では低度の側方散乱と低度から中程度の前方散乱プ ロフィールを有している。サイトスピン（Cytospin）調製物は濃厚な幹細胞が成 熟リンパ系細胞と成熟顆粒球の間の大きさであることを示している。細胞は、光 散乱特性並びに種々の細胞表面抗原の発現に基づいて選択することができる。 特別の分離順序は本発明にとって決定的には重要でないと考えられるが、示さ れた順序が好ましい。好ましくは、細胞は最初に粗い分離法で分離し、続いて、 幹細胞と結合したマーカーでの正の選択と系譜前駆細胞と結合したマーカーでの 負の選択による精密な分離法で分離する。 幹細胞に非常に富んでいる組成物はこのようにして達成することができる。所 望の幹細胞はＣＤ34＋Thy-1＋Lin−表現型を有する集団で具体化されており、そ して種々の造血系譜の全てのメンバーの細胞再生及び発生を提供することができ る。 系譜特異的マーカーでの負の系譜選択を選択すると、より濃厚な幹細胞がＭＰ Ｂより骨髄から得られることが認められる。末梢血に移動するＣＤ34細胞の大部 分は系譜特異的マーカーを発現しないので、末梢血ではLin選択によって骨髄に おけるほどＣＤ34選択以上に顕著には濃厚化されない。Thy-1＋選択では、移動 末梢血と骨髄の両方で幹細胞が濃厚化される。 胎児又は新生児血液も本発明の造血幹細胞及び前駆細胞の供給源である。 胎児血液は当該技術分野で知られている任意の方法で得ることができる。例え ば、胎児血液は、超音波で誘引される針の使用(Daffos等（1985年）Am．J．Obst et Gynecol 153:655〜660;Daffos等（1983年）Am．J．Obstet Gynecol．146:985 )、胎盤穿刺(Valenti，C．（1973年）Am．J．Obstet Gynecol．115:851;Cao等（ 1982年）J．Med．Genet．19:81)、胎児検査法（Rodeck，C.H．（1984年）Prenat al Diagnosis、Rodeck，C.H.及びNicolaides，K.H.編集、Royal College of Obs tetricians and Gynaecologists、ロンドン）等によって胎盤根の胎児循環から 採取することができる。 本発明の好ましい実施態様では、新生児造血幹細胞及び前駆細胞は臍帯血及び ／又は胎盤血から得ることができる。造血細胞供給源として臍帯血又は胎盤血を 使用すると多数の利点がもたらされる。臍帯血は容易にそして供与体にショック を与えないで得ることができる。現在はこれと対照的に、骨髄細胞の採集は、入 院にかかる時間と金に関して高価でショックな経験である。必要な場合、臍帯血 細胞は自家移植に使用することができ、そして大部分の組織適合性コンプレック スに部分的にしか適合しないか、又は大部分のコンプレックスには十分に適合す るが少数のコンプレックスに部分的にしか適合しないという同種細胞の使用に随 伴する通常の血液学的及び免疫学的問題が軽減される。 採集は無菌条件下でなされなければならない。採集するとすぐに、新生児又は 胎児血液は抗凝血物質と混合しなければならない。このような抗凝血物質は、Ｃ ＰＤ(クエン酸塩−リン酸塩−デキストロース)、ＡＣＤ(クエン酸−デキストロ ース)、オールシーバー液、ドゴーイン（De Gowin's）液、エドグルゲート-Mg(E dglugate-Mg)、ラウスーターナー（Rous-Turner）液、他のグルコース混合物、 ヘパリン、ビスクム酢酸エチル（ethyl biscoumacetate）等が含まれるが、これ らに限定されない当該技術分野で知られている任意のものであることができる （Hurn，B.A.L.、1968年、Storage of Blood、Academic Press,New York、26〜1 60頁参照）。 Ｂ．胚幹細胞の単離 本発明の系はＥＳ細胞が、培養物中やインビボで分化しそして造血細胞を発生 する、例えば、造血を発生反復する能力に基づいている。以前の研究で、ＥＳ細 胞は培養物中で分化しそして多数の造血系譜を発生することが証明されている。 しかしながら、これらの研究の大部分で、造血発生の程度が限定されており且つ 変動的であるので、造血分化の正確な動力学は予測不可能であるか又は殆ど特定 されていない。本発明の主題方法を使用すると、造血幹細胞はLH-2のような造血 遺伝子の異所性発現によって発生させることができる。このような系の利点は数 倍である。第１に、この系の発生に伴って、全ての分化段階の細胞を利用でき、 この系を操作することができる。第２に、ＥＳ細胞に基づくインビトロ系によっ て、インビボ系に固有の問題；即ち胚の致死性に遭遇することなく、相同的組換 えによる不活性化で広範囲の遺伝子の機能を研究することが可能になる。 胚幹細胞は、バイス（Weiss）等（1996年）J．Clinical Inves 97:591〜595; 及びデッチュマン（Doetschman）等（1985年）J．Embryol．Exp．Morphol．87:2 7〜45によって記載されているような熟練技術者に周知の方法を使用して発生さ せられそして維持される。ＥＳ細胞の任意の系統を使用することができるが、選 択される系統は典型的には、細胞が胚子様体（ＥＢ）に分化する能力について選 択され、そしてその後ＥＢは造血系譜、例えば赤芽球、リンパ、骨髄性系譜に拘 束される。かくして、上記の可能性を有していると思われるヒト又は非ヒト起源 の任意のＥＳ細胞系統が本発明での使用に適している。ＥＳ細胞の産生に典型的 に使用される１つのマウス株の代表例としては129Ｊ株、例えば、以下の実施例 で使用した細胞系統ＣＣＥがある。更にもう１つの好ましいマウス細胞系統は細 胞系統Ｊ1である。他のＥＳ細胞系統にはＤ3（米国菌培養収集所、カタログ番号 ＣＫＬ 1934）及びＷＷ6細胞系統（Ioffe等（1995年）PNAS 92:7357〜7361）が 含まれる。 ＥＳ細胞は、ロバートソン（Robertson）(Teratocarcinomas and Embryonic S tem Cells:A Practical．Approach、E.J．Robertson編集、IRL Press、ワシント ンＤ.Ｃ.［1987年］);ブラッドリー（Bradley）等（1986年）(Current Topics i n Devel．Biol．20:357〜371);及びホーガン（Hogan）等（Manipulating the Mo use Embryo:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニ ューヨーク州コールドスプリングハーバー［1986年］）によって記載されている ような、熟練技術者に周知の方法を使用して培養される。１つの説明として、Ｅ Ｓ細胞は、Ｓｌ因子（膜結合又は可溶性形態）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）及び 繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）から選択される増殖因子の存在下で、支持層、例 えば胚繊維芽細胞を有して又は有さないでインビトロで増殖させそして継代培養 することができる。例えば、米国特許第5,453,357号参照。増殖及び分化を高め るこれら因子の濃度は0.5〜500ng/ml、好ましくは、10〜20ng/mｌの範囲である ことができる。ＥＳ細胞から胚子様体（ＥＢｓ）及び多数の細胞型、例えば、造 血、内皮、筋及び神経系譜への分化は、当該技術分野で知られている多数の標準 的な方法で達成することができる(G．Keller、Current Opinion:862〜869に総説 されている；Ｇ．Keller等のMCB 13(1):473〜486も参照)。 ＥＳ細胞の分化に最も頻繁に使用される技術は単に、これら細胞を支持細胞と の接触又はＬＩＦの存在から取り出し、そしてこれらを細菌等級のペトリ皿の液 体又はメチルセルロース含有培地中で培養することである。これらの条件下で、 ＥＳ細胞はペトリ皿表面に付着できないので、ＥＢｓの形成が高められる。この 方法の、ＥＳ細胞から造血系譜への分化を最大にする修正は、ストロマ細胞上で これら細胞を培養することに係わっており、そして該ストロマ細胞は造血細胞が ＥＢｓ内で発生するとき、造血細胞の支持環境を提供する。ストロマ細胞培養方 法は以下の遺伝子的に修飾した細胞の拡張と分化の項で広範囲に記載する。ＥＢ ｓが一度形成されると、それらを単一の細胞懸濁物に分離することができる。発 生したＥＢｓは特定の細胞集団の存在について種々の発生段階でアッセイするこ とができる。例えば、造血前駆集団を決定するために、増殖因子の存在下でメチ ルセルロース中にＥＢ由来細胞を播くことによって造血系譜を試験することがで きる。前駆細胞アッセイに関する特定の説明は以下の実施例で提供する。簡単に 言えば、ＥＢｓの単一細胞懸濁物は、ケラー（Keller）等、上述中に記載されて いるコロニー形成細胞-培養物（ＣＦＣ-ｃ）アッセイでプリカーサー含有量につ いてアッセ イすることができる。この方法は以下ではプリカーサーアッセイと称する。或い は、ＥＢ由来の細胞は特定の細胞表面抗原（例えば、免疫グロブリンはＢリンパ 球を染色するために使用することができる）の存在について免疫細胞化学法又は ＦＡＣＳ分析によって分析することができる。これら細胞の分化能に対する最も 厳密な試験は、分離したＥＢ細胞が受容動物の造血系に再度定着する能力に係わ っている。細胞表面抗原の検出及び移植プロトコールは以下の「遺伝子的に修飾 した細胞の拡張と分化」と題する項で広範に記載する。 Ｖ．遺伝学的に改質した幹細胞の増殖と分化 一般に、移入に使用する幹細胞は、造血遺伝子構成体による改質の前後におい て、この分野で知られている標準プロトコールによって培養が可能である。例え ば、この細胞は、特定のまたは血清誘導培養液単独内で、あるいは基質細胞共培 養系のような支持細胞層との共培養体として培養できる。単離した幹細胞は、血 清と抗生物質を補足した最小必須培養液中で培養ができる。使用できる培養液に は、例えばＨａｎｋｓ．ＭｃＣｏｙｓ，ＲＰＭＩ１６４０最小必須培養液中（Ｍ ＥＭ）等が含まれ、１％から２０％の血清を含有する。添加できる細胞外部因子 およびシトキンは、以下の幹細胞の増殖と分化の章に述べる。複合培養液内で主 題の幹細胞が成長できる一方で、培養液内のある種の始原体の集団の活性化をよ り正確に制御するために、その細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏの最小必須培養液中（Ｄ ＭＥＭ）のような単純培養液内に保持するのが、一般的に好ましい。 細胞は、１２または２４の受け穴のミクロプレートなどの任意の適合する培養 容器に保持し、５％ＣＯ2、３７℃のような同じ動物から単離した細胞用の典型 的培養条件下に保持する。 更に他の実施態様においては、この改質幹細胞は、誘発因子を分泌する支持細 胞の層または誘発因子を含有するポリマー層等の上で培養が可能である。好まし い実施態様においては、この細胞は基質細胞共培養系で増殖する。例えば、Ｄｅ ｒｙｕｇｉｎａ等（１９９３）、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１ ３：１１５−１５０を参照のこと。基質細胞は、幹細胞が宿る物理的マトリック スを提供するのみならず、幹細胞の増殖と分化を増進できる膜接触信号および／ または造血成長因子を産出するものと考えられている。各種の異なる基質培養系 が入手できる。一般には、改質幹細胞を基質層上で培養し、非接着の細胞を次の 転変、移植またはその他の用途のために単離する。 典型的な実施態様においては、この主題となる幹細胞は、Ｄｅｘｔｅｒ及び共 同研究者（Ｄｅｘｔｅｒ等（１９７７）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、９１： ３３５、およびＤｅｘｔｅΓ等（１９７９）Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ、６２ ：２９９）により開発された長期培養液内に支持できる。人の随からのＤｅｘｔ ｅｒの長期培養を確立するのは比較的に容易である。しかし、マウスの髄細胞と 異なり、人Ｄｅｘｔｅｒ培養液内の造血は、以前は約２ないし３カ月に制限があ った。本発明の改質人幹細胞は、Ｄｅｘｔｅｒ培養液内の寿命を顕著に延長する と予測される。 本発明の改質人幹細胞を支持するのに使用できるその他の基質層は、骨髄内皮 細胞から誘導される。例えば、Ａｓｃｈ等のＰＣＴ刊行、ＷＯ９６／００７７９ を参照のこと。骨髄内皮細胞は、骨髄吸引物含有針状体を含む管状フラグメント が関与するプロセスにより単離される。骨髄針状体を髄から回収し、タンパク質 酵素に消化させる。消化された針状体からのミクロ管状フラグメントを回収し、 このフラグメントを外植体として成長させて骨髄内皮細胞を形成する。 更に、種々の哺乳類基質細胞系が入手でき、これらはその上に即時幹細胞調合 物が培養できる融合性の細胞層を作製するのに使用できる。典型的な人基質細胞 系には、ＫＭ‐１０２、ＳＶ‐ＭＳＣ、ＳＴ‐１、ＳＣＬおよびＨ‐７の細胞系 が含まれる（例えば、上記のＤｅｒｙｕｇｉｎａ等を参照のこと）。 他の実施態様においては、マトリゲル層などが、幹細胞の集団の増殖を誘発す るのに使用できる。マトリゲル（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅｒｃｈ ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ」，Ｍａｓｓ．）は、マトリックスとマウス基底膜 タンパク質の抽出物として誘導される連結した物質との複雑な混合物であり、主 にラミニン、コラーゲンIV、ヘパリン硫酸塩プリテオグリカンおよびニドゲンか らなり、エンタクチンはＫｌｅｉｎｍａｎ等の（”生物学的活性を有す基底膜複 合体”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．（１９８６）、ページ３１２−３１ ８）に記載のあるようにＥＨＳ腫瘍から調製された。Ｈｕｍａｔｒｉｘのような 他種のこのようなマトリックスも提供が可能である。 同様に、天然および組換え技術の細胞も、即時培養に対する支持層として提供 が可能である。 更にその他の培養系には、Ｓｌｉｖｋａ等の米国特許第５，４７８，７３９号 などの３次元の基質細胞と組織の培養系が挙げられる。 他の実施態様においては、現発明の幹細胞は、例えばＩ１‐３、ＬＩＦ、Ｇ‐ ＣＳＦおよびＳＣＦなどのようなシトキンを補充した”基質フリー”細胞培養媒 体内で培養が可能である。ＭｃＧｌａｖｅ等の米国特許第５，５２３，２８６号 に記載があるように、幹細胞は、シトキンと組み合わせた基質‐誘導アニオン性 フラクションと共培養できる。この方法によれば、このアニオン性フラクション は、基質細胞条件の水性培養液をイオン交換クロマトグラフィにかけ、分子量が ２００ｋＤ以上を有すアニオン性のグリコタンパク質フラクションを単離するこ とからなるプロセスにより調製される。この生活性のアニオン性フラクションは 、プロテオグリカン類を含むグリコタンパク質類の混合物から成ると考えられる 。 Ｂ．分化因子 造血幹細胞の分化行程と成長因子依存性は、この分野で適切に実証されている 。多分化能のＨＳＣｓは、それらの由来と分化の段階に基ずき、特定シトキンに 対する抗原的特徴と感応性を取得そして損失する（図１）。本発明の遺伝学的に 改質した幹細胞は、それらの成長因子感応性および表現された細胞表面抗源の点 において、特性が明かにできる。図１に図示は、多分化能のＨＳＣｓを特性化し 分化する方法に本発明に述べる骨髄またはリンパの始原体を組み入れを教えてい る。 例えば、細胞外因子やシトキンなどの周知の造血因子の組合せが生体外で即時 幹細胞培養液に付加でき、そして細胞感応性の変化、例えば信号形質導入カスケ ードおよび／または細胞の成長または分化の変化を検定できる。使用できる因子 には、限定はしないがエリトロポイエチン（ＥＰＯ）、トロンボポイエチン、顆 粒球／マクロファージ コロニー 刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）、顆粒球コロニー 刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ‐ＣＳＦ）、 インターロイキン１‐１２（ＩＬ‐１からＩＬ‐１２）およびステール因子（Ｓ Ｆ）が含まれる。特に関心の高いのは、ＬＩＦ、ステール因子、エリトロポイエ チン、ＩＬ‐３、ＴＬ‐６、ＧＭ‐ＣＳＦおよびＧ‐ＣＳＦである。これら因子 は単独にまたは任意の組合せで付加できる。応用される因子は、天然産でもよい し例えば組換え的に調製された合成的なものでもよく、人のでもよいしマウス等 非人の因子でもよい。因子の量は、一般には一日当り約１ｎｇ／ｍｌから１００ ｎｇ／ｍｌの範囲にある。一般的に云うと、ステール因子では濃度が約１から１ ００ｎｇ／ｍｌの範囲、ＬＩＦでは濃度が約１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ 、より普通には約５ｎｇ／ｍｌから約３０ｎｇ／ｍｌの範囲、ＩＬ‐３では濃度 が約５ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌ、より普通には約５ｎｇ／ｍｌから１０ ０ｎｇ／ｍｌの範囲、ＩＬ‐６では濃度が約５ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌ、 より普通には約５ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの範囲、エリトロポイエチンで は濃度が約１単位ｎｇ／ｍｌから１０単位／ｍｌの範囲、ＧＭ−ＣＳＦでは濃度 は一般的に約５ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌ、より普通には約５ｎｇ／ｍｌか ら２０ｎｇ／ｍｌの範囲である。 一実施態様においては、幹細胞は、形質導入の前または後に任意に増殖される 。増殖の間、これら成長因子を、幹細胞の成長と増殖の初期過程、通常は少なく とも２４時間、より通常には少なくとも４８時間から４日の間のみに存在させて もよいし、または増殖の過程の間を通して保持してもよい。 臨床上の設定には、前増殖または継続増殖を行わずに、幹細胞を形質導入する のが好ましい。従って一つの実施態様においては、幹細胞を適当な培養液中でシ トキンの存在または非存在下に培養し、適当なベクターに形質導入し、約７２時 間培養し、そしてホスト内に再導入する。 その上に、モノクロナールまたはポリクロナール抗体を使用し、特定の細胞由 来および／または分化の段階と関連する細胞表面抗原を同定することが可能であ る。例示すると、以下の由来物の細胞表面抗原を追跡することができる。ＣＤ３ ４＋、ＣＤ３８−抗原性表現型を有す細胞のようなは多分化性ＨＳＣは、骨髄由 来体に継続的に制限（特定的に切断）できるようになり、その例としてバースト ‐形成単位赤芽球（ＢＦＵ‐Ｅ）はコロニー‐形成単位赤芽球（ＣＦＵ‐Ｅ）に 、バースト‐形成単位巨核球（ＢＦＵ‐Ｍｅｇ）はコロニー‐形成単位巨核球（ ＣＦＵ‐Ｍｅｇ）に、コロニー‐形成単位顆粒球‐単球（ＣＦＵ‐ＧＭ）はコロ ニー‐形成単位好酸球（ＣＦＵ‐Ｅｏ）またはコロニー‐形成単位顆粒球‐赤芽 球 ‐巨核球‐単球（ＣＦＵ‐ＧＥＭＭ）に制限できるようになる。または、多分化 性ＨＳＣは、Ｔ‐またはＢ‐細胞始原細胞を発生する由来体のようなリンパ性由 来体に継続的に制限（特定的に切断）できるようになる。 Ｃ． 遺伝学的に改質した造血幹細胞の特性化と単離 遺伝学的に改質した幹細胞またはその分化した所産体を特性化し単離するのに 各種の技術が応用できる。好ましい単離手法は、可能の限り細胞死滅を抑制する 結果を得る手法である。例えば、特定の分化された細胞集団の単離は、親和性分 離技術または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を利用した特定の細胞マーカーの 表現パターンに頼ることにより達成できる。 更に例示すると、モノクロナール抗体は、特定の細胞由来体および／または分 化の段階に関連するマーカー（表面膜タンパク質、例えばレセプター）を同定す るのに特に有用である。特定の造血表現型の細胞を分離する手順には、幹細胞培 養物の単離のために上記した様に、抗体被覆の磁気ビーズを用いた磁気分離、親 和性クロマトグラフィ、プレート等の固体マトリックスに付着した抗体による” パンニング法”のような技術またはその他の簡便技術が含まれる。正確な分離を 提供する技術に蛍光活性化細胞選別があり、これは複数の色相チャンネル、低鈍 角光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネルのような複雑化の度合を変 えることができる。 直接分離を可能とする磁気ビーズ、支持体に結合したアビジンまたはストレプ タビジンにより除去できるビオチン、蛍光活性化細胞選別により使用できるフル オロクロムス等のマーカーに抗体を複合化し、特定の細胞型の分離を容易にする のが便利である。細胞の生存力にとり、過度に不利にならない全ての技術が利用 できよう。 単離の際に、細胞は以下の手法で更に特性を明確にできる。成長因子に対する 感応性：特異遺伝子の表現：その細胞の表面上の抗原性マーカー：および／また は基本的形態。の成長因子感応性の度合、例えば感応する成長因子の濃度範囲、 最大と最小の応答、感応できる他種の成長因子と条件は、造血細胞を特性化する のに利用できる。更に、単離した始原細胞は、特定の由来体に対してコミットメ ントをマークすると知られている遺伝子の表現により、特性が明らかにできる。 この技法は、幹細胞が造血幹細胞であるか否かを確定する種々検定法を提供す る。造血幹細胞にとり最も厳しい実験的判定基準は、致命的に照射された動物の 全血液系を再構築するこの細胞の性能である。人のＨＳＣｓの最も広く受容され ている検定法は”長期培養‐開始細胞”（ＬＴＣ‐ＩＣ）検定法であり、これは 骨髄細胞を５週間培養し、次いで半固形状媒体内にこれらの細胞を塗布すること により生存細胞の発生したポテンシャルを分析することからなる（Ｅａｖｅｓ等 、（１９９１）Ｊ．Ｔｉｓｓ．Ｃｕｌｔ．Ｍｅｔｈ．１３：５５−６２）。半固 形状媒体内での１４日後に、全ての細胞由来体のコロニーは、長期培養が開始し た時点で多分化能の自己再生細胞が存在すれば、検出可能である。ＬＴＣＩＣの 検定では、典型的には高度にリッチな幹細胞集団は、１／２０ないし１／１００ の範囲、好ましくは少なくとも１／５０のＬＴＣＩＣ頻度を有す。長期植え付け ポテンシャルの動物モデルには、ＳＣＩＤ‐ｈｕ骨モデルおよび胎内ヒツジモデ ルが挙げられる。概観には、Ｓｒｏｕｒ等（１９９２）、Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈ ｅｒ、１：１４３‐５３を参照のこと。 Ｄ．細胞の製薬としての調製 本発明の別の面は、細胞成分として、遺伝学的に改質した主題の幹細胞または その所産物の実質的に純粋な調製物を含有する細胞組成物に関する。本発明の細 胞組成物は幹細胞の実質的に純粋な集団を含有するのみならず、例えばアミノ酸 、金属、補酵素成分、並びに細胞の一部が発明の単離した幹細胞の続く分化によ り生じるような少集団の非幹細胞を含む培養媒質などの細胞培養成分も含有でき る。更に、他の非細胞性成分には、内植、連続培養等の特定の環境下で細胞成分 を支持に適するようにする成分も含まれる。 ここで詳細に述べる、本発明の幹細胞を被験物、特に人被験者に投与する共通 の方法には、被験物の目的箇所への細胞の注射または内植が含まれるので、発明 の細胞は、注射または内植による被験物への細胞の導入を容易にする放出装置へ の挿入が可能である。そのような放出装置には、受け入れる被験物の母体に細胞 と流体を注射するためのカテーテルなどのチューブが挙げられる。好ましい実例 では、チューブは更にそれを通して発明の細胞が被験物の所定の位置に導入でき るシリンジなどの針を有している。発明の幹細胞は、種々の形状のシリンジのよ うな放出装置に挿入できる。例えば、細胞がこのような放出装置に入れられる時 は、細胞は溶液に懸濁、または支持マトリックスに埋め込みが可能となる。ここ で使用する用語”溶液”には、発明の細胞が能力を保持する製薬的に許容できる キャリアーまたは希釈剤が含まれる。製薬的に許容できるキャリアーまたは希釈 剤には、食塩水、水性緩衝溶液、溶媒および／または分散媒体が含まれる。この ようなキャリアーまたは希釈剤は、この分野においては良く知られている。溶液 は好ましくは無菌であり、容易な注射性が存在する程度に流体である。好ましく は溶液は、生産と貯蔵の条件下に安定であり、例えばパラベン、クロロブタノー ル、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどを使用してバクテリアおよ び眞菌等の微生物の汚染作用に対抗するように保存される。発明の溶液は、ここ で述べた幹細胞を製薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤および必要に応じ て上に挙げた他の成分に混合し、次いで濾過殺菌することにより調製できる。 幹細胞を混入または埋め込みできる支持マトリックスには、被験者相容性であ り、被験者に有害でない生成物に分解するマトリックスが挙げられる。天然およ び／または合成の生分解性のマトリックスが、そのようなマトリックスの例であ る。天然の生分解性のマトリックスには、哺乳動物から誘導したような凝固血シ ョウおよびコラーゲンマトリックスが挙げられる。合成の生分解性のマトリック スには、ポリ無水物、ポリオルソエステルおよびポリ乳酸等の合成ポリマーが挙 げられる。合成ポリマーの他の例およびこれらマトリックスへの細胞の混入また は埋め込みの方法は、この分野においては知られている。例えば、米国特許第４ ，２９８，００２号、米国特許第５，３０８，７０１号を参照のこと。これらの マトリックスは、生体内の壊れ易い幹細胞の支持および保護を提供し、従って幹 細胞を受け入れる被験者に導入する好ましい形態にある。 VI．幹細胞の典型的用途 本発明の遺伝学的に改質した幹細胞およびその所産物は、種々の応用面で利用 できる。それらには、限定はしないが生体内での工学的細胞の内植または移植、 細胞毒、アレルゲン、成長／調節因子、薬剤化合物等のスクリーニング、生体外 ての疾病種の機構の解明、薬剤および／または成長因子が作動する機構の研究お よび生物的活性の生成物の産出が数例ではあるが挙げられる。 例えば本発明は、１）放射または化学的療法が与る全ての癌の治療、２）病原 性リンパ球を換えることによる自己免疫疾病のための実行性のある治療、３）種 々の遺伝性または後天性の貧血の実行性のある治療、４）患者自身の非感染幹細 胞の少数を増殖することによりＨＩＶ感染部分を健全細胞で置き換える可能性が 存在するとすればＡＩＤＳ、のような骨髄移植を必要とする病気の治療用に薬剤 として使用可能の実質的に純粋な幹細胞を提供する。 Ａ．薬剤スクリーニング 本発明の工学幹細胞は生体内で使用でき、細胞毒、成長／調節因子、薬剤など の広範囲の各種化合物をスクリーニングする。この目的のため、培養物を生体外 に保持し、試験用の化合物に曝す。細胞毒化合物の活性は、培養物内で細胞を損 傷または死滅させるその性能により測定できる。生体染色技法により、これは容 易に査定できる。成長／調節因子の影響は、全細胞数および差別的細胞数などの 培養物の細胞含有量を解析することにより査定できる。これは、タイプ特異性の 細胞抗原を明確にする抗体を利用する免疫細胞学技術の使用を含む標準細胞毒お よび／または組織学の技術を用いて達成できる。細胞上の各種薬剤の効果を査定 できる。例えば、赤血球細胞形成を増加する薬剤を試験できる。 Ｂ．移植 幹細胞の注入により治療できる疾病には、限定はしないが五つの広いカテゴリ ーがある。第一は、正常な血液細胞の産出および成熟の欠損または不全から生じ る疾病である（即ち、再生不良性貧血および低増殖性幹細胞疾患）。第二の群は 、造血器官の新生物性の悪性疾病である（例えば、白血病およびリンパ腫）。疾 病の第三の群は、非造血器官の悪性の堅い腫瘍の広スペクトルを有す患者の疾病 を含む。これら患者への幹細胞の注入は骨髄救助手順としての役割を果たし、さ もなければその悪性腫瘍の致命的化学療法または照射に従う患者に供される。疾 病の第四の群は自己免疫状態からなり、ここでは幹細胞が異常免疫系の置換源と しての役を果たす。この疾病の第五の群は、移植前に遺伝子治療を受けた造血幹 細胞の、好ましくは同系的に、注入によって矯正できる幾つかの遺伝病に関する 。新生児の幹および由来の細胞による造血性再構成によって治療が可能な特定の 疾病および障害は、限定はしないが以下に記されるものが挙げられる。正常な血 液 細胞の産出および成熟の欠損または不全から生じる疾病であり、以下を含む：低 増殖性幹細胞病：形成不全貧血：汎血球減少症：顆粒球減少症：血小板減少症： 赤血球形成不全症：ブラックファン‐ダイアモンド症候群薬：照射または感染に よる病名不明症。造血悪性種は以下を含む：急性リンパ芽球（リンパ球）白血病 ：慢性リンパ球白血病：急性骨髄性白血病：慢性骨髄性白血病：急性の悪性骨髄 硬化症：多発性骨髄腫：ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ ｖｅｒａ：変質骨髄性変質 形成：ワルデンストレームの巨大マクログロブリン症：ホジキンスのリンパ腫： 非ホジキンスのリンパ腫。悪性の堅い腫瘍を持つ患者の免疫抑制症は以下を含む 。：悪性黒色腫：胃の癌腫：卵巣ガン腫：乳ガン腫：小細胞肺癌腫：網膜芽細胞 腫：こう丸ガン腫：膠細胞芽腫：横紋筋肉腫：神経芽腫：アービングの肉腫：リ ンパ腫。自己免疫疾病は以下を含む。：リウマチ性関節炎：糖尿病タイプ１：慢 性肝炎：多発性硬化症：組織性狼そう紅班症。遺伝学的（先天性）疾病は以下を 含む：貧血：家族性形成不全症：ファンコニ症候群：ブルーム症候群：純赤血球 細胞形成不全症（ＰＲＣＡ）：先天的悪液質疾患：ブラックファン‐ダイアモン ド症候群、先天性作動不全症候群Ｉ‐IV、シュワッシュマン‐ダイアモンド症候 群、ジヒドロ葉酸還元酵素欠乏症：フォルムアミノトランスフェラーゼ欠乏症： レッシュ・ナイハン症候群：先天的球状細胞増多症：先天的楕円状細胞増多症： 先天的気孔細胞増多症：先天的Ｒｈヌル症：発作的夜行性ヘモグロビン尿症：Ｇ ６ＰＤ（グルコース‐６‐フォスファトデヒロゲナーゼ）：変異体１，２，３： ピルビン酸キナーゼ欠乏：先天性赤血球形成感作欠乏症：先天的鎌状赤血球症と 体質：重併発性免疫不全症（ＳＣＩＤ）：裸リンパ球症候群：イオノフォア‐応 答性併発性免疫不全：ヌクレオシドフォスフォリラーゼ欠乏症：顆粒球アクチン 欠乏：幼児性顆粒球減少症：ガウシャー病：アデノシンデアミナーゼ欠乏症：コ ーストマン症候群：網状組織発育不全：先天的白血球異常機能症候群。本発明の 造血細胞で治療の可能性がある他の病気には、骨石化症、骨髄硬化症、後天性溶 血貧血、後天性免疫不全、疾病を生じる感染性疾患、ムコポリサッカリド蓄積症 、ムコ脂質蓄積症、免疫機構が関与する各種疾患、ウィスコット‐アルドリッチ 症候群、アルファ１‐アンチトリプシン欠乏がある。 病巣の髄の少量を処理し続く生体外での増殖によってより有効なパージを可能 にするに加えて、三次元培養系がパージされた髄のより大容積に利用できる。多 くのパージ化剤の副作用は正常の造血皮膚細胞の破壊と分裂であり、副作用は植 え付けの長期化および二次感染による患者の死亡を度々にして起こす。急性非リ ンパ球白血病に使用する有力なパージ剤は、４‐ヒドロペルオキシオヨロホスフ ァアミド（４ＨＣ）であり、これは二を底数とする対数で悪性細胞を死滅させる 。伝統的治療法では、病んだ髄の５００ｍｌ‐１０００ｍｌを４ＨＣｌ／ｍｌの ６０‐１００ｎｇと生体外でインキュベートし、この髄を治療する。次いで、髄 を凍結保存し、臨床化学療法の２‐３週間後に患者内に再注入する。本発明によ れば、骨髄の相当量の容積が取入れられ、４ＨＣｌでパージし、次いで三次元培 養で生体外で増殖し、それにより迅速な植え付け時間の増加と患者の死亡を減少 を可能とする。 本発明の幹細胞培養物は、健全な骨髄細胞を破壊またはその細胞の機能的性能 を抑圧する疾病または状態を治療するのに使用される。このプロセスは、骨髄に 転移する造血悪性種および他の新生種の治療に特に有効である。また発明のこの 面は、骨髄に直接影響を与えない疾病により必要とされている環境因子（例えば 、照射、毒素等）、化学療法および／または放射療法によりその骨髄が悪影響を 受けている患者を治療するのにも有効である。例えばこの場合、健全な患者から 骨髄細胞を取り出し、それを保存し、そして複製しておき、患者が骨髄を直接破 壊するかその治療法が骨髄に悪影響を与える病気を進行させるようなことが生じ たならば、再注入ができる。本発明の幹細胞培養系は骨髄移植の必要のある患者 にとり幾つかの利点がある。男性または女性の患者が自身の細胞を受け入れてい るのならば、これを同原移植と呼び、このような移植片は拒絶の可能性は殆どな い。同原移植は骨髄移植の拒絶、即ち移植対ホストの反応、の主原因を取り除く 。髄が悪性または疾患細胞を含むのなら、その少試料をより効果的にパージでき 、その幹細胞を発明の培養系を用いて増殖する。この分野において理解されてい るように、悪性または疾患細胞をパージする選択的方法は、骨髄細胞の少容積で 最良に動作する。ここに述べる幹培養系は、これを実現可能にする。従って、患 者から得た少量試料を、悪性細胞を死滅させるが健全細胞を節減する選択法を用 いて、より有効にパージできる。次ぎにこの主題の技法を用いて、残存した健全 細胞を 相当量増殖できる。 本発明によれば、疾患の患者から骨髄の相対的少容量を採取し、その患者の骨 髄を化学療法または照射により破壊する。次ぎに、この骨髄試料から適当な化学 療法剤を用いて疾病細胞をパージし、本発明の方法により造血遺伝子構成体を移 入し、その遺伝学的に改質した細胞を生体外で増殖し、それから患者に再投与す る。 他の実施態様においては、本発明の遺伝学的に改質した細胞は、ＡＩＤＳ関連 状態の治療に使用できる。１９９５年１１月１−５日にＳｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓ ｈｉｎｇｔｏｎで開催されたアメリカ血液学協会の第３７回年次会議において著 者等が提出した抄録によれば、”血球減少症は人免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感 染の共通の困難な問題であり、これは赤血球形成、リンパ形成、血小板形成およ び顆粒形成を含む種々の造血の由来物質に影響を与えるものである”。著者達は フローシトメトリィにより、ＡＩＤＳの２３人の骨髄吸引物の根源細胞を定量化 した。ＣＤ３４（＋）の平均パーセンテージは正常な成人の骨髄に比肩するが、 ＣＤ３４（＋）集団の表現型の解析では、ＣＤ３４（＋）／ＣＤ３８（−）、Ｃ Ｄ３４（＋）／ＣＤ３８１（−）ＣＤ４（＋）およびＣＤ３４（＋）１ＨＹ‐Ｉ （＋）の各サブセットは正常のドナーに比較すると激しく減少しており、未熟の 造血始原体の顕著な損失を示唆するものであった。ＨＩＶ‐１患者からの分別Ｃ Ｄ３４（＋）の長期培養‐開始細胞（ＬＴＣ‐ＩＣ）検定における生体外機能性 解析は、対照に比べてクローン性活性の大きな減少を示した。ＬＴＣ‐ＩＣ頻度 をより正確に定量化するために、次に三人の患者からのＣＤ３４（＋）細胞を限 界希釈検定法で分類した。５週間後にそれぞれの受け穴内のコロニー形成を査定 し、ネガティブの受け穴のパーセンテージを用いてＬＴＣ‐ＩＣ頻度を計算した 。この手法により、本研究者達は、ＣＤ３４（＋）誘導‐ＨＩＶ‐１患者のＬＴ Ｃ‐ＩＣ頻度は正常の髄吸引物試料で測定したそれより約７ないし１０倍低いこ とを発見した。正常の本来の始原体の多くはＣＭを表現するので、ＰＣＲ技法を 用いて、未熟始原体の感染を長期培養誘導の各コロニーによる研究およびＣＤ３ ４（＋）細胞の純粋懸濁液内の両方で検討した。検査した六人の患者のＣＤ３４ （＋）細胞にはＨＩＶ‐１ＤＮＡが存在せず、未熟造血始原体の直接的ウイルス 感染以外の機構によりＨＩＶ‐１感染患者の欠損造血形成を説明する必要がある ことを示した。これらのデータはＡＩＤＳ患者の未熟始原細胞サブセットの定量 的欠乏を表はしていると、結論ずけられる。 本発明は、ＡＩＤＳ患者の造血系の性能を増大するのに使用できる造血幹細胞 源またはその所産物質を提供する。好ましい実施態様においては、造血幹細胞を 患者（または相当するドナー）から単離し、必要に応じてウイルス感染細胞をパ ージする。次ぎに、本方法によりその幹細胞に造血遺伝子構成体を移入する。生 じた細胞を培養液内で増殖し、そしてその患者に内植するか、または更に一また は複数の造血性由来物質に分化してから患者に内植する。この説明から、別法と して幹細胞の移入は、遺伝子治療手法の一部として、生体内においても遂行でき ることが明かである。 Ｃ．生体内幹細胞の改質 更に他の実施態様においては、例えば遺伝子療法プロトコールの一部として、 造血遺伝子構成体は、生体内で細胞を移行するのに使用できる。臨床的設定にお いては、造血性遺伝子放出系を、それぞれこの分野ではよく知られた幾つかの方 法のいずれかにより、患者に導入できる。例えば、静脈注射などにより遺伝子放 出系の薬剤調製物を系統的に導入でき、遺伝子放出媒体、遺伝子の表現を制御す る転写性調節シーケンスによる細胞型または組織型の表現またはそれらの組合せ によって提供される移入の特異性から、ターゲットの幹細胞の特異的形質導入は 主に生じる。他の実施態様においては、局在化している動物内への導入の場合に は、この組換え体遺伝子の初期放出はより制限が加わる。例えば、この遺伝子放 出媒体は、カテーテル（米国特許第５，３２８，４７０号）または走触性注射（ 例えばＣｈｅｎ等（１９９４）ＰＮＡＳ９１：３０５４−３０５７）により導入 できる。 造血性遺伝子放出系は、例えば許容可能の希釈剤中の薬剤調製物としてまたは 遺伝子放出媒体が埋め込まれている緩慢脱離マトリックスの一部として、提供で きる。別法として、完全遺伝子放出系がレトロウイルス パッケージのように組 換え体細胞から完全に産出できる場合は、薬剤調製物は遺伝子放出系を産出する 一または複数の細胞を含有することができる。後者の場合の、ウイルス パッケ ージ細胞を導入する方法は、例えば再装薬性または生分解性のデバイスにより提 供される。近年、タンパク質系、生物薬剤系を含む医薬の制御下の放出のために 、各種の緩慢離脱ポリマーデバイスが開発され、生体内で試験されており、この デバイスはポリマー組成と形状を操作することによりウイルス微粒子の離脱用に 適合が可能である。生分解性と非生分解性のポリマーの両方を含む各種の生物相 容性ポリマー（ヒドロゲルを含む）を使用して、特定目的サイトに内植された細 胞によりウイルス微粒子の持続離脱用の移植片を形成できる。本発明のこのよう な実施態様は、ポリマーデバイスに混入されている外因性的に純化したウイルス の放出、またはポリマーデバイスにカプセル化した細胞により産出したウイルス 微粒子の放出に利用できる。 モノマー組成または重合技術の選定により、水分量、細孔度およびその結果の 透過特性を制御できる。内植のための形状、サイズ、ポリマーおよび方法の選択 は、治療する病気と患者個人の応答によるそれぞれの根本原理に従って確定でき る。このような内植片の作製は、この分野では一般に知られている。例えば、Ｄ ａｖｉｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓによる”医療および歯科用材料のコンサイス百科辞 典”（ＭＩＴ Ｐｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、１９９０）およびＳａ ｂｅｌ等の米国特許第４，８８３，６６６号）を参照のこと。内植片の他の実施 態様においては、この組換え体ウイルスを産出する細胞源は、内植可能の空洞フ ァイバーにカプセル化される。このを前紡糸し、次にウイルス源を負荷すること ができる（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ等、米国特許第４，８９２，５３８号；Ａｅｂｉ ｓｃｈｅｒ等、米国特許第５，１０６，６２７号；Ｈｏｆｆｍａｎ等（１９９０ ）Ｅｘｐｔ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、１１０：３９−４４；Ｊａｅｇｅｒ等（１９ ９０）Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．８２：４１−４６；及びＡｅｂｉｓｃｈ ｅｒ等、（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．Ｅｎｇ．１１３：１７８−１８３） 、またはファイバーポリマーと共に共押出してウイルスパッケージ細胞の周りに ポリマーコートを形成することができる（Ｌｉｍ、米国特許第４，３９１，９０ ９号；Ｓｅｆｔｏｎ、米国特許第４，３５３，８８８号；Ｓｕｇａｍｏｒｉ等（ １９８９）Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ａｒｔｉｆ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｏｒｇａｎ３５：７ ９１−７９９；Ｓｅｆｔｏｎ等（１９８７）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅ ｎ ｇ．２９：１１３５−１１４３；およびＡｅｂｉｓｃｈｅｒ等（１９９１）、Ｂ ｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ１２：５０−５５）。繰り返すが、ポリマーの操作を遂 行すればウイルス微粒子の最適脱離が提供される。 Ｄ．遺伝学的に改質した幹細胞により産出した因子 発明の更なる面はある因子、特にLH-2細胞により産出され、誘発性因子として 造血細胞の増殖の役割を果たす細胞外因子の同定と究極の調製に関する。このLH -2表現細胞により産出される自己分泌および／またはパラ分泌因子は、順化培地 として提供でき、またはこの分野で周知のまたは標準タンパク質精製手順により 純化が可能である。 実施例３および４に記載するように、LH-2のような造血遺伝子の異所性表現は 、例えば少なくともパラ分泌様式において、再生可能の表現型を誘発できる一ま たは複数の因子を分泌する細胞を産出する。ある特定の理論に束縛されるのは望 まないが、それでも順化培地にあるこの因子は、可溶性タンパク質として分泌す るかまたは開裂等により脱離した細胞膜タンパク質の細胞外部分であるポリペプ チドであることは注目される。 順化培地からこの誘発性因子を単離し純化するのに種々の方法が利用される。 順化培地内のこの可溶性因子の性質を検査するために、差動沈降、分子ふるいク ロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、等電焦点化法、透析、ゲル電気 泳動および親和性／免疫親和性クロマトグラフィなどを含む技法により因子は単 離できる。増殖活性がリッチであるフラクションは、例えば特定のフラクション の正常の幹細胞培養物の増殖を起こす性能を基ずく検定法を用いて同定できる。 このような活性がリッチであるフラクションを、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に単 一バンドの結果が得られるまで、標準法により更に純化できる。次に、ミクロ配 列化とクローン化技術を用いて、誘発性因子をコード化した遺伝子を同定できる 。 動物への投与または添加物として細胞培養物への添加を目的とする場合は、選 択すべき誘発性因子の種々の異なる組成が存在する。適切には誘発性因子は、例 えばこの活性成分と作用しないような実質的に不活性である薬剤的に受容できる キャリアー内に提供される。適当な不活性キャリアーには、水、アルコール、ポ リエチレングリコール、鉱油または石油のケル、プロピレングリコール等が含ま れる。 この発明の薬剤組成物を調製するために、活性成分として因子の有効量を薬剤 的に受容できるキャリアーとよく混合して一つにする。そのキャリアーは、投与 に所望される調製物の形態に応じて種々の形状をとることができる。この薬剤組 成物は、特に経口、直腸、経皮または非経口的注射による投与に適した個装投薬 形であるのが望ましい。例えば、経口投薬形状の組成物を調製する場合は、懸濁 液、シロップ、エリクシル、溶液などの経口液調製の場合における水、グリコー ル類、油類、アルコール等、または粉体、ピル、カプセルおよび錠剤の場合にお ける澱分、糖、カオリン、潤滑剤、バインダー、砕解剤等の固体キャリアーなど 有用な薬剤媒質のいずれかが使用できる。投与の容易さにより、錠剤およびカプ セルが最も有利な経口投薬単位形態を表し、その場合は固体の薬剤キャリアーが 当然使用される。非経口的組成物には、通常はキャリアーは、例えば溶解を助長 するような他の成分も含むが、少なくとも大部分の量の殺菌水を含む。 注射可能の溶液は例えば、キャリアーが食塩溶液、グルコース溶液または食塩溶 液とグルコース溶液の混合物から成るように調製する。 また注射可能の懸濁液の調製の場合には、適当な液体キャリアー、懸濁剤等が使 用される。また、使用直後に液体形状調製物に変えることを意図した液体形状調 製物も挙げられる。経皮的投与に適した組成物では、キャリアーは任意に、皮膚 に著しい悪影響をもたらさない少量割合の任意性質の適当な添加剤と任意に組み 合わせた浸透促進剤および／または適当な湿順潤剤を含有する。 投与の容易さと投薬の均一性のために、主題の組成物を投薬単位形態に組成す るのが特に利点がある。この明細書と請求範囲で用いる投薬単位形態は、単一用 量に適した物理的に離散した単位を云い、各単位は必要な薬剤キャリアーとの連 携において所望の医療効果を発生するように計算した所定量の活性成分を含有す る。このような投薬単位形態の実例として、錠剤（刻み目付きまたはコート化の 錠剤を含む）、カプセル、ピル、粉末パッケット、ウエファ、注射可能の溶液ま たは懸濁液、大さじを用いる形態、及びその分離した複合体がある。 本発明の薬剤調合物は上に述べたように、化粧品用途と見なされる多くの応用 に利用できる。この分野で知られている化粧品組成物は、好ましくは低アレルギ ー性であり特にｐＨ調整が好まれ、トイレット水、パック、ローション、スキン ミルクまたはミルク状ローションが含まれる。その調整物はこの誘発性因子の他 に、このような調整物に普通使用される成分を含有できる。そのような成分の例 は、油類、脂肪類、ワックス、界面活性剤、湿潤剤、増粘剤、抗酸化剤、粘度安 定剤、キレート剤、緩衝剤、保存剤、芳香剤、染料、低級アルカノールなどであ る。必要に応じ更に、防燃剤、抗菌剤、抗かび剤、消毒剤、ビタミン、太陽光用 クリーム、抗生物質または抗ニキビ剤のような成分をこの組成物に混入してもよ い。 油類の例は、オリーブ油、水素化油などの油脂：蜂ワックス、ラノリンなどの ワックス：液体パラフィン、ケラシン、スクアランなどの炭化水素：ステアリン 酸、オレイン酸などの脂肪酸：セチルアルコール、ステアリルアルコール、ラノ リンアルコール、ヘキサデカノールなどのアルコール：およびミリスチン酸イソ プロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチルなどのエステル：を 含む。界面活性剤の例として、ステアリン酸ナトリウム、セチル硫酸ナトリウム 、ポリオキシエチレンラウリルエーテル燐酸エステル、Ｎ‐アシルグルタミン酸 などのアニオン性界面活性剤：ステアリルジメチルベンジルアンモニウムクロラ イド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライドなどのカチオン性界面活性 剤：アルキルアミノエチルグリシン塩酸溶液、レシチンなどの両性界面活性剤： グリシンモノステアリン酸エステル、ソルビタンモノステアリン酸エステル、ス クロース脂肪酸エステル、プロピレングリコールモノステアリン酸エステル、ポ リオキシエチレンオレイルエステル、ポリエチレングリコールモノステアリン酸 エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル、ポリオキ シエチレン椰子脂肪酸モノエタノールアミド、ポリオキシプロピレングリコール （例えば、商標”Ｐｌｕｒｏｎｉｃ”で市場にある材料）、ポリオキシエチレン ひまし油、ポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤が引用でき る。湿潤剤の例には、グリセリン、１，３‐ブチレングリコールおよびプロピレ ングリコールが含まれる。低級アルコールの例には、エタノールおよびイソプロ パノールが含まれる。増粘剤の例には、キサンタンガム、ヒドロキシプロピルセ ルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコールおよ びカルボキシメチルセルロースが含まれる。抗酸化剤の例は、ブチル化ヒドロキ シトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、没食子酸プロピール、くえん酸お よびエトキシキナ酸を含む。キレート剤の例は、エデチン酸２ナトリウム塩およ びエタンヒドロキシジ燐酸エステルを含む。緩衝剤の例は、くえん酸、くえん酸 ナトリウム、ほう酸、ボラックスおよび燐酸２ナトリウム１水素を含む。保存剤 の例は、パラヒドロキシ安息香酸メチルエステル、パラヒドロキシ安息香酸エチ ルエステル、デヒドロ酢酸および安息香酸である。 軟膏、クリーム、トイレット水、スキンミルクなどの調整には、典型的には誘 発性因子等の活性成分の０．０１から１０％、特に０．１から５％、より特別に ０．２から２．５％を組成物に混入する。軟膏とクリームでは、キャリアーは例 えば、湿潤剤の１から２０％、特に５から１５％、増粘剤の０．１から１０％、 特に０．５から５％および水からなる。またはこのキャリアーは界面活性剤の７ ０から９９％、特に２０から９５％および脂肪の０から２０％、特に２．５から １５％：または増粘剤の８０から９９．９、特に９０から９９％：または界面活 性剤の５から１５％、湿潤剤の２から１５％、油脂の０から８０％、極少量（＜ ２％）の保存剤、着色剤および／または芳香剤および水からなる。トイレット水 では、例えばキャリアーは２ないし１０％の低級アルコール、０．１から１０％ 、特に０．５から１％の界面活性剤、１から２０％、特に３から７％の湿潤剤、 ０から５％の緩衝剤、水およびの保存剤、染料および／または芳香剤の少量（＜ ２％）からなる。スキンミルクでは、キャリアーは典型的には油脂の１０から５ ０％、界面活性剤の１から１０％、水の５０から８０％、および保存剤および／ または芳香剤の０から３％からなる。上記の全ての％記号は、重量／重量パーセ ンテージを示す。 本発明の方法で使用する特定の組成物は、この因子をリポソーム含有組成物に 調合させた組成物である。リポソームは、ホスファチジルコリン、エタノールア ミンとセリン、スフィゴミエリン、カルジオリピン、プラズマロケン、ホスファ チジル酸およびセレビオシドなど極性リピドの両親媒性分子から形成された人工 のビヒクルである。リポソームは、適当な両親媒性分子を水または水性溶液中で 膨潤させて、水性材料により相互に分離された多くの二重層から成る多層構造の 液晶（または疎リポソームと称す）を通常は形成する。水性材料をカプセル化し た単一の二重層から成ることが知られている他のタイプのリポソームは、単層ビ ヒクルと称す。水溶性材料がリピドの膨潤の間に水性相に混入すると、材料はリ ピド二重層間の水性層にトラップされるようになる。 例えば誘発性因子の種々の塩の形態のような水溶性活性成分は、この分子層の 間の水性スペース内にカプセル化される。このタンパク質のカプセル化は、幾つ かの方法により達成できる。最も普通に使用される方法は、有機溶媒からの蒸発 によるホスホリピドの薄いフィルムのフラスコの壁へのキャスティングである。 このフィルムを適合する水性媒質に分散すると、単層リポソームが形成する。適 当な超音波処理を行うと、この疎リポソームはより小さい類似した閉止小胞を形 成する。 水溶性活性成分を通常は、この化合物の水性溶液にキャストしたフィルムを分 散することにより組み込まれる。次にこのカプセル化されなかったこの化合物は 、遠心分離、クロマトグラフィ、透析または他の知られた適応する処理法より除 去する。リピド可溶の活性成分は通常は、フィルムのキャスティングの前に活性 成分をホスホリピドにより有機溶媒に溶かすことにより混入させる。リピド相内 のこの材料の溶解性が超過しなければまたは存在するその量がリピドに結合でき る量を越えなければ、この方法で調整したリポソームは、通常はリピド二重層内 に結合したこの材料の多くを含有し、非カプセル化材料からのリポソームの分離 を必要としない。 この因子のリポソーム組成形態を調整する特に便利な方法は、この参考文献に 挙げたＥＰ‐Ａ‐２５３，６１９に記された方法である。この方法では、カプセ ル化活性成分を含有する単一の二重層状のリポソームを、有機媒質にリピド化合 物を溶解し、高速ホモジナイザーまたは撹はん手段により有機と水性の成分を同 時に撹き混ぜながらリピド化合物の有機性溶液を加圧下に水性成分に射入し、そ れにより瞬時にリポソームを形成することで作製する。 カプセル化因子を含有する単一の二重層状のリポソームは直接利用できるし、 またはこれは局在投与のために適当な薬剤に許容できるキャリアー内でも使用で きる。リポソームの粘度を、例えばキサンタンガム、ヒドロキシプロピルセルロ ース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びその混合物等の一または複数の 適当な増粘剤の添加によって増大できる。水性成分は水単独でもよいし、電解質 、緩衝化系および保存剤などの他の成分を含有してもよい。使用が可能の適当な 電解質には、アルカリ金属およびアルカリ土類金属の塩などの金属塩が含まれる 。好まれる金属塩は塩化カルシウム、塩化ナトリウムおよび塩化カリである。電 解質の濃度は０から２６０ｍＭ，好ましくは５ｍＭから１６０ｍＭまで変化する 。水性成分を、有機成分の射入の間に大きな乱れを発生することにより均一化を 遂行するに適した適合する容器に入れる。この二成分の均一化はこの容器内で達 成できるが、または水性と有機の各成分を別々に容器の外に位置している撹はん 手段内に射入してもよい。後者の場合には、リポソームはこの撹はん手段内に形 成し、次に収集の目的のためにそれを別の容器に移す。 有機成分は、エタノール、グリセロール、プロピレングリコールおよびポリエ チレングリコールなどの適合する非毒性で薬剤的に受容できる溶媒、およびこの 溶媒に可溶のホスホリピドから成る。使用が可能の適合するホスホリピドは、例 えばレシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジル エタノール‐アミン、ホスファチジルイノシトール、リソホスファチジルコリン およびホスファチジルグリセロールが含まれる。他の親油性添加物を、リポソー ムの特性を選択的に改質するために使用してもよい。そのような他の添加物の例 は、ステアリルアミン、ホスファチジン酸、トコフェノール、コレステロールお よびラノリン抽出物である。 加えて、ホスホリピドの酸化を防止できる他の成分を有機成分に加えてもよい 。そのような他の成分には、トコフェノール、ブチル化ヒドロキシアニソール、 ブチル化ヒドロキシトルエン、アスコルビイルパルミチン酸エステルおよびアス コルビイルオレイン酸エステルが含まれる。安息香酸、メチルパラベンおよびプ ロピルパラベンなどの保存剤も添加できる。 他の面においては、本発明は、LH-2の再生事例同伴表現に関与する遺伝子のク ローン化を容易にする。”クローン化”は、対象の因子をコード化している核酸 配列のＲＮＡまたはＤＮＡ源からの単離を意味する。例えば、主題の細胞は、造 血性幹細胞の増殖の誘発性信号を提供する遺伝子および遺伝子産出物の同定、 単離および研究に使用できる。例で示すと、新規転写が一または複数の誘発性タ ンパク質の産出のために必要ならば、対照のターゲット細胞（異所性LH-2表現が ない）からのｍＲＮＡを実験のターゲット細胞（組換え体LH-2を表現）からのｍ ＲＮＡに雑種形成した後に作製した控除性ｃＤＮＡライブラリーを使用して、LH -2転写因子の表現によって作動するまたは作動が切れる遺伝子を単離できる。こ のタイプの控除的手法は、各種新規遺伝子性の単離に使用して成功している。（ 例えば、Ｗａｎｇ等（１９９１）ＰＮＡＳ．ＵＳＡ８８：１１５０５−１１５０ ９を参照のこと）。 同様な手法は、”作動ディスプレイ”の使用を含む。例えば、Ｌｉａｎｇ等（ １９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：６９６６−６９９８；Ｌｉａｎｇ等（ １９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９６７−９７１：およびＬｉａｎｇ等（１９ ９３）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２１：３２６９−３２７５を参照のこと。こ の方法の戦略は、対象の二種の細胞から単離したＲＮＡｓの逆転写により作製し ておいた部分ｃＤＮＡｓを増幅するのにＰＣＲを使用することにあり、二つの細 胞は工学的にLH-2を表現させた造血幹細胞と表現しない細胞である。次に、ＰＣ Ｒ産出物を変性ポリアクリルアミドゲル上の隣接レーン内に分離し、一方の組織 に作製され他方には作製されない生成物をこのゲルから直接切取り、サブクロー ン化しそして配列化する。 単一ゲル上に１００前後のＰＣＲ生成物の良好な分割を得るのが可能であるに すぎないので、ＰＣＲ始動物質を、ＲＮＡｓのサブセットのみが各ＰＣＲ反応に 表れるように選定する。これは、１２Ｔ’ｓおよび特異性を付与する二つの３’ 塩基から成るオリゴ‐ｄＴ始動物質を使用した逆転写により達成される。またこ のオリゴ‐ｄＴ始動物質は任意配列の第二の始動物質とのＰＣＲ反応にも使用さ れ、この始動物質は、ｐｏｌｙＡ+末端からの異なる距離の異なるｃＤＮＡｓに 徐冷再対合すると考える。この第二の始動物質の配列およびオリゴ‐ｄＴ始動物 質の最後の塩基の配列を変化させると、この手順を利用して、任意のある時間に 典型的細胞内に表現していると考えるｐｏｌｙＡ+含有ｍＲＮＡｓの多くを増幅 できる。 作動ディスプレイ方法を使用すると、その転写が不均一転写因子の表現により 刺激される遺伝子を同定できる。ＲＮＡは、組換え的に改質してLH-2を表現した 細胞およびからLH-2を表現しない同種の細胞から単離する。次に各細胞タイプか らのこのＲＮＡは、その３’端部にｄＧ、ｄＡ、ｄＴまたはｄＣを有すオリゴ‐ ｄＴ始動物質を用いた四っの異なる反応中に逆転写される。得られたｃＤＮＡｓ は、この四種のオリゴ‐ｄＴ始動物質の一種と任意配列の市場で入手できる２０ の異なる始動物質の一種とのセットを用いて「35Ｓ］ｄＡＴＰの存在下に増幅さ れる。従って、各組織にたいしては８０の異なるＰＣＲ反応が存在し、それそれ 異なる始動物質の使用が関与する。始動物質の各セットを用いて得たＰＣＲ生成 物は、次に変性ポリアクリルアミドケル上で分割される。ここで、参照ターゲッ ト組織からのｃＤＮＡの増幅から生じたＰＣＲ生成物と実験ターゲット組織から のｃＤＮＡの増幅から生じたＰＣＲ生成物とを平行して分割を実行する。ＰＣＲ 生成物は、オートラジオグラフィにより視覚かされ、一つだけのレーンに存在す るいかなる生成物もゲルから切り離され、サブクローン化し、配列化する。多分 、これらの生成物は、この転写因子の異所性表現の結果とし転写される遺伝子の 増幅を表すのであろう。 本発明の他の実施形態によれば、誘発性因子またはその誘導体（省略形態、融 合タンパク質、突然変異体等のような）を異所的に表現するための表現構成体の 治療調整物が提供される。表現ベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、 アデノ‐連結ウイルス、ヘルペスウイルス等（上記）のウイルスベクターの形態 で、またはリポソーム、ポリリシン接合体、人工ウイルス外皮など（上記）の非 ウイルス系として提供できる。適当な表現ベクターは上に記した薬剤キャリアー 内に提供できる。 VII．遺伝学的に修飾されたフィーダー層 本発明の今一つの具体化は、異所的にLH-2を発現するように設計された細胞に よって生産された一つもしくはそれ以上の因子が、オートクライン／パラクリン 因子の役目を果たすだろう、という観測結果によってもたらされている。従って 、添えられた実施例中に提供されたデータの幾つかが示すように、異所的にLH-2 を発現する細胞は、混合細胞培養中で未修飾細胞に再生表現型を誘導する因子を 生産することが出来るだろう。 従って、本発明の今一つの例は、LH-2（もしくは幾つかの他の適当な造血遺伝 子）を異所的に発現するように修飾されているフィーダー細胞を、好ましくはフ ィーダー細胞層の形で提供し、正常な胚幹細胞もしくは造血幹細胞は、そのフィ ーダー細胞を用い、好ましくはスチール因子の存在のもとに培養される。その道 では公知の技術を用いて拡大した幹細胞集団をフィーダー細胞から分離すること が出来る。そのような具体化の利益は、幹細胞を遺伝学的に設計する必要を避け ることが出来る点である。 VIII．リネージ限定幹細胞 本発明の今一つの例は、再移植されたとき細胞にアクセス出来る造血リネージ を限定する機能喪失突然変異、によって修飾されてきた幹細胞に関わる。分化に よって創り出されたリネージがエクスビボ培養の場合にはより厳密に制御される のに反し、インビボで造血幹が遭遇する細胞外シグナルは、終局的にすべての種 類の分化した造血細胞を生産するシグナルを含むだろう、ことは理解されよう。 例えば、相同的組換え、アンチセンスもしくは優性ネガチブ突然変異体のような 方法による機能喪失突然変異は、インビボで生じる最終的な分化した細胞型を限 定する手段を提供することが出来る。このようにして例えば、GATA-3およびPU-1 に対する機能喪失突然変異は、移植されたときＢ-もしくはＴ-細胞に分化する能 力を低下させた幹細胞、例えば骨髄系リネージを生産する公算が大きいであろう 幹細胞、を結果として生じるはずである。 相同的組換え ES細胞中の遺伝子に機能喪失突然変異を引き起こす一つの方法は、ターゲティ ング遺伝子構成体を用いて、例えば相同的組換えによる、ターゲットとされた遺 伝子の取り替え、である。例えば、そのような構成体は、（i）ターゲットとさ れた遺伝子配列と実質的に同一の配列、もしくは実質的に相補的な配列、もしく は宿主幹細胞に存在する、その遺伝子にフランキングな配列、を有する少なくと も一つの組換え領域、および(ii)宿主細胞のゲノムに組み込まれるようになる取 り替え領域、を含むように取り出すことが出来る。ゲノム配列を用いる相同的組 換えにより宿主細胞の遺伝子はターゲティング構成体により分断される。例えば 組み込みは転写制御領域で起こり、遺伝子の転写ロスをもたらすことがあり得る 。 今一つの具体化の中で、分断する構成体はコード配列に組み込まれ、その結果機 能的遺伝子産物の発現を、例えばフレームシフト、未成熟中断コドン、等により 混乱させることがあり得る。 分断構成体は標準的な方法、例えばエレクトロポレーション、マイクロインジ ェクション、およびリン酸カルシウム処理、により培養されたES細胞に導入する ことが出来る。挿入の好ましい方法はエレクトロポレーションである。細胞に挿 入される各遺伝子構成体は何よりもまず第一に線形でなければならない。それ故 にもし遺伝子構成体がベクターに挿入されたのであれば、ベクター配列内だけで 切断し遺伝子構成体配列内では切断しないように選ばれた適当な制限エンドヌク レアーゼ、でDNAを消化することによって線状化は達成される。 ターゲットとされる挿入のために、遺伝子構成体は熟練した技術者にとって公 知であるように、選んだ挿入法に適した条件下でES細胞に添加される。一つより 以上の構成体をES細胞に導入しなければならない場合には、各遺伝子構成体は同 時にもしくは一度に一つ導入することが出来る。 もしES細胞をエレクトロポレートしなければならないのであれば、ES細胞と遺 伝子構成体DNAは、エレクトロポレーションマシンを用いメーカーの使用指針に 従って電気パルスに曝される。エレクトロポレーション後ES細胞を典型的には適 当なインキュベーション条件下で回収に付す。細胞はついで遺伝子構成体の存在 に関してスクリーニングされる。 トランスフェクトされた細胞のスクリーニングは色々な方法を用いて行うこと が出来る。構成体がマーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子を含む場合には ES細胞をさもなければ致死的な濃度の抗生物質の存在下に培養してもよい。生き 残るES細胞は恐らくは遺伝子構成体を組み込んだのである。もしマーカー遺伝子 が抗生物質耐性遺伝子以外であれば、ES細胞ゲノムDNAのサザンブロットを、マ ーカー配列に対してのみハイブリッド形成するようにデザインされたDNAの配列 を用いて精査することが出来る。今一つにはPCRを使用することが出来る。最後 に、もしマーカー遺伝子が、その活性を検出出来る酵素（例えば、β−ガラクト シダーゼ）をコードする遺伝子であるならば、その酵素基質を適当な条件下で細 胞に添加し、酵素活性を分析することが出来る。その道の熟練者は、その他の有 用な マーカーと所与の細胞におけるマーカーの存在を検出する手段に精通しているだ ろう。そのようなマーカーはすべて、本発明の教理の範囲内に含まれると考えら れる。 遺伝子構成体はES細胞ゲノム中の幾つかの場所に組み入れられるかもしれず、 またランダムな挿入事象の発生のため各ES細胞ゲノム中の異なった場所に組み入 れられるかもしれない。典型的には、遺伝子構成体を取り込むES細胞の約１−５ ％以下が実際にその遺伝子構成体を望む場所に組み入れるだろう。遺伝子構成体 を適切に組み入れたこれらのES細胞を同定するために、標準的な方法を用いて全 DNAをES細胞から抽出することが出来る。特定の制限酵素（複数のことも：訳者 註）で消化したゲノムDNAに対し一定のパターンでハイブリッド形成するように デザインされたプローブ（一つもしくはそれ以上：訳者註）を用いてサザンブロ ット上で精査することが出来る。今一つには、もしくは、さらに加えて、ゲノム DNAを、特定のサイズと配列を持ったDNAフラグメントを増幅するように明確にデ ザインされたプローブ（例えば、適当な位置に遺伝子構成体を含む細胞のみが適 当なサイズのDNAフラグメントを生成するだろう）を用いてPCRによって増幅する ことが出来る。 一つの具体化において、遺伝子ターゲティング、これは動物のゲノムを修飾す るために相同的組換えを用いる方法であるが、を培養した胚幹細胞に変化を導入 するのに用いることが出来る。ES細胞中の、興味の的である造血遺伝子のターゲ ティングによりこれらの変化を動物の生殖系に導入してキメラを創り出すことが 出来る。遺伝子ターゲティング法は、ターゲット造血遺伝子座に相同な分節を含 み、また造血ゲノム配列に意図した配列修飾（例えば挿入、欠失、点突然変異） をも含むDNAターゲティング構成体、を組織培養細胞に導入することによって成 し遂げられる。処理した細胞はついで正確なターゲティングに関してスクリーニ ングし、適切にターゲットされた細胞を同定し分離する。 胚幹細胞における遺伝子ターゲティングは、事実、造血遺伝子からの一つもし くはそれ以上のゲノム配列との相同的組換えを受けるようにデザインされたター ゲティング遺伝子導入構成物の使用を通じて、造血遺伝子機能を混乱させる手段 として本発明によって考えられたスキームである。ターゲティング構成物は、造 血遺伝子のエレメントとの組換えののち、明確な選択マーカーがターゲットとさ れる造血遺伝子のコード配列に挿入さ（もしくは取り替えら）れるように手筈を 整えることが出来る。挿入された配列は機能的に造血遺伝子を分断し、同時にま たポジティブな選択特質を与える。 例示 本発明は今や一般的に記述され、それは以下の実施例を参照することによって より容易に理解されるだろう、その実施例はただ単に本発明の幾つかの例と具体 化の解説の目的のために数え入れられただけで本発明を限定することを意図する ものではない。 実施例１：ES細胞の造血細胞への分化 下に述べられた実験の多くは１２９由来ES細胞系CCE（例えば１２９株マウス のES細胞）を用いて行われてきた。しかしなから、Ｊ１のようなその他のES細胞 系は同様の条件下で等しくよく機能した。ES細胞は白血病阻害因子(LIF)の存在 のもとでフィーダー細胞無しにごく普通に培養した。標準的な分化検定は次のよ うであった：ES細胞は、技術書に書かれたとおりに、但し若干の修飾を加えて、 ６日間分化して胚様体(ＥＢｓ)を形成した。ＥＢｓを採取して単細胞サスペンジ ョンを調製した。単細胞サスペンジョンを、上掲のKellerらに述べられたように して、コロニー形成細胞-培養(CFC-c)検定で前駆体含量を検定した。この手順は 以後前駆体検定と呼ぶこととする。前駆体検定で用いられた造血因子は、まず第 一にエリスロポエチン(epo)とスチール因子(SF)であった。EB発生のこの段階で はこれらの因子のコンビネーションは、初期および最終段階の赤血球系リネージ に向けての前駆体の分化を促進し、巨核球リネージ向けの程度は少ない。 図２で、２タイプの赤血球系コロニーの典型的形態を見ることが出来る。小さ な赤い密なコロニーは初期の赤血球系細胞、すなわち、グロビンの胎児型を発現 する大きな有核のヘモグロビン化した細胞からなる。このタイプのコロニーは再 平板培養後４〜５日で既に存在している。赤い大きな不規則な形のコロニーは、 最終段階の赤血球系細胞、すなわちグロビンの成熟型を発現する小さな無核のヘ モグロビン化細胞からなっている。このタイプのコロニーは再平板培養後７−９ 日までは出現しない。後者タイプのコロニーのあるものはまた、個々のコロニー から取り出された細胞のMay-Grunwald Giemsa染色によって示されるように巨核 球をも含む（データは示されず）。図３および４に、異なったES細胞系を用いた 実験におけるそれぞれのリネージ向けの前駆体の頻度を示す。典型的には、６日 の分化で初期赤血球系リネージ向けの前駆体の頻度はほぼEB由来細胞の1／100で あり、最終段階の赤血球系リネージ向けの前駆体の頻度は、5-30／105細胞であ る。典型的には、皿あたり105ES細胞が平板培養された。このようにして、培養 皿あたりの前駆体数は、胚芽期の８日で１０胚中に存在する造血前駆体の数に等 しい。 実施例２：ES細胞系を用いたHS発生におけるLH-2遺伝子産物の役割の分析 造血システム(HS)の発生と拡大におけるLhx遺伝子LH-2の推定される機能、を 研究することが出来るために、一つのレトロウイルス系を確立した。ES細胞中の 遺伝子の効率的な発現のためにこのレトロウイルスベクターを修飾し、以下マウ ス幹細胞ウイルス(MSCV)ベクターと呼ぶ。LH-2遺伝子はMSCVベクターの多重クロ ーニングサイトに組み込まれてクローニングされた。ベクター単独(MSCV)および LH-2含有ベクター(MSCV-LH-2)の構造を図５に示す。これら二つのベクターを、 述べられているようにしてウイルス生産細胞系BOSC-23にトランスフェクトする ことによってウイルス粒子を生産し収穫した。MSCV−ベクターはネオマイシン ホスホトランスフェラーゼ(neo)遺伝子を含んでいるので、感染したCCE ES細胞 をＧ−418耐性に関して選択した。バルクで感染した（すなわちサブクローニン グ無しの）集団とサブクローンからの両ES細胞が分析された。MSCV-LH-2感染し た、MSCV感染した、もしくは非感染のES細胞、の間には目立った形態上、もしく は成長速度の差異は認められず、LH-2の発現がES細胞の未分化状態を変えなかっ たことを示している。感染したES細胞のこれら異なった集団を上述の前駆体細胞 分化検定に付した。MSCVおよびMSCV-LH-2感染バルク集団を比較した場合初期の 胚様体細胞向けの前駆体の頻度の差は検出されなかった（図３ａ）。しかしなが ら、最終段階の赤血球系細胞向けの前駆体の頻度の増大が、MSCVバルク集団（31 ／2×105細胞）に比較してMSCV-LH-2バルク集団（53／2×105細胞）において検 出された（図3bを見よ）。 付け加わった極めて興味ある差異は、MSCV-LH-2感染したES細胞に由来するＥ Ｂｓのクローン検定において、新しいタイプのコロニーが出現し、これはMSCV感 染し たもしくは非感染ES細胞に由来したＥＢｓの何れにも存在しなかった、という点 であった。MSCV-LH-2バルク集団中のこのタイプのコロニーの頻度は、最終段階 の胚様体コロニーの頻度よりもほぼ１０〜２０倍少なかった。MSCV-LH-2-グルー プの試験した４サブクローンの一つにこの新しいタイプのコロニーが、最終段階 の胚様体コロニーに対すると同じ頻度で出現し、MSCV-LH-2バルクグループに比 較してより大きく生育した。コロニー内の大多数の細胞が７〜８日以内にヘモグ ロビン化（赤色に変わる）したすべての他のコロニーと対照的に、この新しいタ イプのコロニーは決して完全にはヘモグロビン化せずコロニー内に赤い”スポッ ト”が出現する。これらの赤い”スポット”を伴った典型的な大きな非赤色コロ ニーを図６に示す。この図は再平板培養後1.5−２週後のこれらのコロニーの典 型的な外観を図示するものである。大多数のこれらの細胞は”末成熟な”表現型 を示す、すなわちMay-Grunwald Giemsa染色によって認められるように、明瞭な 形態構造を示さず、大きな丸い核と細胞質の小さな縁を持つ芽球様の細胞を示す 。これらの末成熟な細胞に加えて、巨核球と無核の赤血球が存在した。これらの データは、このコロニーの大多数の細胞が何等の特定の造血リネージへの拘束を 伴うことなく拡大した未成熟細胞である、ことを示唆する。この仮説を検証する ために、多数の個々のコロニーを取り出し、EPOとSFにに加えてインターロイキ ン-3（IL-3）を含む前駆体検定で再平板培養した。この検定は他のタイプの前駆 体の数を拡大する筈である。この二次前駆体検定におけるコロニーの形態構造お よび個々のコロニーに由来する細胞のMay−Grunwald Giemsa染色によって結論さ れるように、未成熟細胞のコロニー、ならびに純然たる赤血球様細胞、赤血球様 ／巨核球、赤血球様／マクロファージ、および赤血球／巨核球／好中球／マクロ ファージを含むコロニー、が再出現した（データは示されず）。さらに、このタ イプのコロニーに由来する細胞は成長因子を欠いた前駆体検定でアッセイしたと きは成長しなかった。これらの細胞の成長因子依存性をより明確に検討するため に細胞培養を、EPO、SF、もしくはIL-3のいずれか、およびIL-3と組み合わせたS F、を含む液体培養基中に移した。SFはこれらの細胞の成長を促進出来るただ一 つの因子であった。IL-3の存在のもとでは著しい成長は観察されなかった（デー タは示されず）。さらに重要なことは、SFの使用中止とEPOの添加は赤血球系前 駆体の即時かつ大規 模な最終的分化を促進した（データは示されず）。 これらのデータは、この実験プロトコルが、自己再生能力を持ち同時にさまざ まな成熟した造血細胞タイプへの分化能力を維持するマルチリネージ前駆体を創 り出した、ことを示している。このタイプの細胞を以後、推定的な造血原種細胞 (HPCs)と呼ぶ。これは非常に重要な発見である、というのはインビボでの同等な 細胞の研究はその量が極めて少ないことによって厳しく妨げられるからである。 こうして、これらの細胞の純粋で均一な集団は、今日使用できる技術を用いてイ ンビボで得ることは殆ど不可能である。これはこれらの細胞の間接的な特性化を もたらした。推定的なHPCsの確立は、原種細胞の諸性質を直接的に細胞レベル、 分子レベルおよび生化学レベルで特性づけることを可能にする。さらに、例えば ヒトの臍帯血、から精製したヒト造血幹／原種細胞へのヒト（もしくはマウス） LH-2のトランスフェクションは、ヒトからの同等な細胞を確立することを可能に するだろう。 LH-2ノックアウトマウスの表現型に関する予備報告は、造血幹細胞の、LH-2の 仲介による増殖、の可能なメカニズムに対する興味ある手がかりを明らかにして いる。ホモ接合LH-2ノックアウトマウスは、恐らくは重い貧血症をもたらす赤血 球系前駆体の減少により妊娠１７日で死亡する。さらに、野生型細胞、とLH-2に 関してホモ接合である突然変異体細胞、についてキメラであるマウスでは、ホモ 接合突然変異体細胞は赤血球系およびリンパ球系リネージの細胞を形成すること が出来る。この結果は、LH-2ホメオドメイン蛋白質が、スチール因子と協力して 際立った分化をすることもなく未成熟な造血細胞を拡大出来る因子、の発現を制 御する、細胞の非独自的欠陥、を強く示唆している。 これらの発見の可能な臨床的用途は：i)限られた数の造血前駆体を患者から分 離し、移植の枠組みでの使用を目指して細胞の無制限の供給を創り出すためのそ のインビトロでの拡大を含む。これは、放射線-もしくは化学療法を含むあらゆ るがん治療、ii)病原性リンパ球の取り替えによる自己免疫疾患に対する可能な 治療薬iii)さまざまな種類の先天的もしくは後天的貧血症の可能な治療薬iv)患 者自身の数少ない非感染幹細胞の拡大による健全な細胞を用いてHIV感染区画が 取り替えられる可能性がもしあるならばAIDS、のような骨髄移植を必要とする疾 患の治療 にその用途を持つ事が出きるだろう。 実施例３：LH-2遺伝子産物を発現する細胞は他の共-培養細胞に再生表現型を誘 導することが出来る 上に述べたように、造血細胞におけるLH-2の強制発現は、胎児肝細胞造血の達 成のための重大な因子であるスチール因子の存在のもとで未成熟な細胞を拡大す る。長期にわたる骨髄培養において、スチール因子は分化を促進するだけで未成 熟細胞の自己再生を促進することはない。このデータはLH-2は胎児肝臓で発現さ れるという事実と共に、胎児肝臓中のHPCの拡大にLH-2発現を関与させることと なろう。ここにに二つの可能なメカニズムがある、すなわち細胞以外に由来する 外因性もしくは細胞に本来備わっている内因性、である。前者に関しては、LH2+ /+<-.>LH2-/-キメラマウスのLH2-/-細胞が造血システムの細胞に寄与することが 出来る（細胞非独自欠陥）という事実は、LH-2発現が、可溶性および／または膜 結合性の、細胞-細胞シグナリング分子（一つもしくはそれ以上の：訳者註）の 発現を促進する、ことを示唆している。 この可能性を試すために有糸分裂的に不活性化された野性-型もしくはLH-2発 現胚幹細胞を、前駆体検定において、エリスロポエチン／スチール因子と共にも しくは無しで、野性-型細胞と混合した。因子無しでは成熟型の造血コロニーは 出現しなかったことは、LH-2発現細胞はコロニー形成を刺激し得る何らの既知因 子、例えばスチール因子、IL-3、コロニー刺激因子、等を生産しなかった、こと を示している。エリスロポエチン／スチール因子を混合細胞培養に添加すると、 野生-型細胞の平板培養効率は、有糸分裂的に不活性なLH-2発現細胞が共-培養に 用いられたときの成熟赤血球系細胞のコロニーのために（有糸分裂的に不活性化 された野性-型細胞との共培養に比して）100％だけ増加した。これは、LH-2の異 所的な発現によって作り出された因子が混合培養中での再生表現型幹細胞の形成 を誘導する能力があるのだろう、ということを示している。さらに、付け加わっ たコロニーの大部分は成熟した赤血球系コロニーであったので、このデータは初 期の前駆体、例えばまだエリスロポエチン／スチール因子に応答しない、が野生 -型胚幹細胞中に存在していたことを示している。 実施例４：培地上澄液（原文10頁；定義の部参照：訳者註）は再生表現型を誘導 できる LH-2の異所的発現によって産出されるであろう幹細胞誘導因子（一つもしくは それ以上：訳者註）をさらに同定するために、培地上澄液がメチルセルロースコ ロニー検定での自己再生表現型を創り出すその能力をさらに試験した。手短に言 えば、問題のLH-2発現細胞からの培地上澄液は造血幹細胞の希釈集団の増殖およ び／または生き残りを支え得る、ことをはじめて液体培地中で観察した。液体培 地中では造血幹細胞は1000細胞／ml以下に希釈されるとスチール因子を用いた補 足にも拘わらず死滅することを観察した。ここに述べたLH-2発現細胞からの培地 上澄液の添加は、これらの条件下の培養細胞を救うことが出来る…LH-2の異所的 発現が培養した造血細胞に再生可能な表現型を導入しうる一つもしくはそれ以上 の可溶性因子の発現／分泌を誘導できる、という考えを支持する。 希釈細胞の救出の原因である、LH-2に誘導された培地中の一つもしくはそれ以 上の因子の存在を検出するより定量的な手段を提供するために、メチルセルロー スベースの検定が既存技術から改作された（例えば、Evanら、（1978）Blood52 巻：1196〜1210頁、を見よ）。この検定でHPCsを、Iscovの修飾Dulbecco培地(IM DM)中１％メチルセル１コース、１０％胎児子牛血清(FCS)、スチール因子（１０ ０ng/ml）を含む培養皿中に、培地上澄液を添加しもしくは添加しないで、平板 培養する。図７は、１０6細胞／mlではHPC細胞が培地上澄液の添加と無関係にコ ロニーを生じることを示している。しかしながら５×１０4細胞／mlでは、コロ ニー形成は培地上澄液の添加に依存し（図８を見よ）、一つもしくはそれ以上の 被分泌因子がLH-2の異所的発現によって生産され、その因子が被培養造血細胞に 再生可能な表現型を誘導しうることを確証した。 この検定は液体検定に比してより敏感であり、コロニーは数を数えてサイズを 調べ、さらに研究するために皿から取り出すことが出来る。図９は、培地上澄液 ＋／−３０％の培地中でHPC細胞の数を変化させて平板培養した幾つかの検定の 結果を示す。問題のメチルセルロースコロニー検定は、再生可能な表現型を生じ るLH-2被誘導因子（一つもしくはそれ以上：訳者註）を分別しまた別に精製する ために用いることが出来る。 すべての上述の参考文献および出版物はこれによって参考に組み入れられる。 同等物 その道の熟練者は、さらに決まり切った実験をすることなく、ここに述べた本 発明の特定の具体化に対する多くの同等物を認知するか、もしくは確認すること が出来るだろう。そのような同等物は、以下の請求項に含むつもりである。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION            Hematopoietic stem cells and methods for producing such cells                                Background of the Invention   The molecular mechanisms that regulate the development and differentiation of the hematopoietic system (HS) are now being elucidated . A combination of internal and external signals interact in harmony Induces self-renewal and / or differentiation of sex hematopoietic stem cells (HSC) (Huang, S. et al. And Terstappen, L. (1992) Nature 360; 745-49). HSC differentiation is a specific table Includes a series of systematic delegation steps that accompany the acquisition of current features. Cells Antigenic characteristics and specific cytokines based on the lineage and stage of differentiation And gain or lose responses. As development progresses, HSCs are , A lymphocyte lineage, or an erythroid lineage. These committees The committed “progenitor” stem cells ultimately result in a wide variety of specialized cell types. Erythrocytes, neutrophils, basophils, eosinophils, platelets, Mast cells, monocytes, tissue macrophages, osteoblasts, and T lymphocytes and B Lymphocytes.   The first evidence of hematopoiesis in mouse embryos is that blood islands in the yolk sac in 7.5-8 day-old embryos Is detected by the presence of Earliest hematopoietic precursor cluster detected in yolk sac The population is an early erythrocyte type, which is the size that produces the embryonic form of hemoglobin. Nucleated cells. These transient precursors disappear after 9-day-old embryos. Fetus The liver is an approximately 11-day-old embryo that replaces the yolk sac as the primary hematopoietic tissue, and It remains a major hematopoietic organ throughout childhood. As hematopoiesis migrates to the liver For annuclear definite hematopoietic populations and for most myeloid lineages About the precursor appears. After birth, hematopoiesis occurs in the bone marrow. In adults Has the unique ability to self-heal and differentiate into all different types of blood cells, Continuous hematopoiesis is maintained by the population of polymorphic potential stem cells in the phase.   Little is known about genes involved in regulating hematopoiesis, Apparently, transcription factors are essential regulators. Homeo Box (Hox) Tan Park The quality is that of a transcription factor that shares a homeodomain with a characteristic 60 amino acid domain. This homeodomain binds to a specific DNA sequence. Hox protein Quality shows a tightly regulated pattern of expression during embryonic and fetal development, This suggests their role in embryo design. Further data, HS Implies Hox protein in lineage-specific functions in various somatic tissues, including did. Since the first report on the expression of the Hox gene in hematopoietic cells, Attention has been focused on the putative function of these genes in HS.   The homeobox (LhX) protein containing the LIM domain has recently been A class of parkin was identified. The LIM domain is the Lin of three homeobox genes Cysteine-rich amino acids first identified in -11, Isl-1, and Mec-3 Is an array. Lhx proteins have been implicated in controlling the differentiation of certain cell types. Most The recently cloned Lhx protein LH-2 is found in cells in rat fetal liver Is expressed. LH-2 expression pattern in fetal liver is an early event in hematopoiesis Regulate LH-2 in regulating, especially when an active population of hematopoietic precursors arises. Suggest a role.   Embryonic stem (ES) cells are used to study processes involved in establishing the hematopoietic system (HS) Provides a powerful model. ES cells are transiently strong from the inner mass of the developing blastocyst (Topipotet) cells. These cells are in the presence of leukemia inhibitory factor (LIF) For an extended period of time in an undifferentiated state in vitro. LIF When ES cells are removed, ES cells are transformed in vitro into a population of cells known as embryoid bodies (EBs). Was shown to differentiate. EBs contain a variety of cell types, including hematopoietic progenitor cells. No. A temporal analysis of the occurrence of these precursors shows that these precursors are in a specific order within the EB. Show that they are produced in an orderly pattern, which is very important for events that occur in vivo. Similar to Thus, ES first produces precursors of the early erythrocyte type, then It gives rise to the adult erythroid lineage, as well as the myeloid multilineage. Derived from ES cells in vitro The properties of such hematopoietic progenitors are similar to their in vivo counterparts. Provides a useful model for isolating and growing E. coli. Further advantages of ES system Of genetic manipulation and function without concern for fetal lethality Includes its accessibility to value.   Due to the strong ability of HSCs to differentiate into different lineages, this isolated pluripotent stem There is a great need for a continuous source of cells. Of this cell in vivo Transient nature and very low doses have hampered the experimental and clinical application of HSC Came. The establishment of a long-term, homologous culture of this cell depends on the lineage commissioning process and the Insight into the process of self-healing and the clinic of bone marrow transplantation and hematopoietic cell gene therapy Enhance both strategic strategies.                                Summary of the Invention   The present invention relates to genetically modified hematopoietic stem cells that ectopically express hematopoietic genes. And methods for producing such cells. More specifically, the book The application contains a LIM domain in a mammalian embryonic stem cell or hematopoietic stem cell. Ectopic expression of homeobox protein LH-2. The present invention further provides As well as certain uses for progenitor cells and progeny thereof.   One aspect of the invention is to generate renewable stem cells that can differentiate into hematopoietic lineages. Providing a method for causing ectopic expression of hematopoietic genes. And expression of this gene confers a self-recoverable phenotype to stem cells. An example For example, this method transfects stem cells with a gene expression construct encoding a hematopoietic gene. The transfected stem cells and the hematopoietic genes Maintaining cells under conditions expressed at a level that confer a self-healing phenotype May be included.   In a preferred embodiment, the hematopoietic gene is a LIM-homeobox, such as LH-2. Encodes a protein. Exemplary LH2 genes are provided in SEQ ID NOs: 1 and 3. It is. However, as described herein, hematopoietic genes are Inheritance involved in hematopoiesis characterized by a loss-of-function phenotype of reduced relative vesicle number Can be selected by the criteria of being a child.   In certain embodiments, the stem cells are embryonic stem cells. In another embodiment, the stem Preferably, the cells are hematopoietic stem cells. Hematopoietic stem for use in the present invention Sources for cells include peripheral blood, cord blood, fetal liver, and bone marrow Can be In a preferred embodiment, the stem cell is a mammal (eg, a primate (eg, For example, human)). The invention also relates to transgenic non-human mammals. The use of stem cells from an object is contemplated.   One preferred approach for generating the stem cells of the invention is, for example, Stem cells can be transformed by irrus-mediated or liposome-mediated gene transfer. Transfection with a gene expression construct. Stem cells are generated in vivo ( Eg, by gene therapy) or ex vivo (eg, in culture) Can be transfected with the gene expression construct.   In a preferred embodiment, the method of the invention also comprises contacting with a Steel factor. And expanding the transfected cells. The method of the invention also , Erythropoietin (EPO), thrombopoietin, granulocyte / macrophage Colony stimulating factor (GM-CSF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), macropha From colony stimulating factor (M-CSF) and interleukin Contacting the transfected cells with one or more factors, May be included. Such factors may include bone marrow cells, lymphocyte cells, and / or It can be used to differentiate stem cells into hematopoietic cells, such as red blood cells.   Another aspect of the invention provides a substantially pure population of viable stem cells, The cells are genetically modified to ectopically express the hematopoietic gene, and the expression of this gene is Confers a self-healing phenotype to stem cells. In some embodiments, the stem cells or Or the progeny can be formulated into a pharmaceutical composition.   In another aspect of the invention, the reduced number of hematopoietic progenitors or progeny thereof has Methods for treating abnormalities characterized by: Generally, this method Introducing a stem cell (and / or progeny thereof) pharmaceutical composition of the present invention into a subject animal. Including the step of entering. The method of the present invention can be used to detect abnormalities, Cancer treatment, including radiation therapy and chemotherapy, for inherited or acquired anemia abnormalities Can be used to treat.   In another aspect of the invention, a pharmaceutical preparation of the cells of the invention is used in an immune system. Treat abnormalities characterized by alterations (eg, autoimmune diseases, AIDS, etc.) Can be used to   In yet another aspect of the invention, the invention provides a self-healing phenotype to a stem cell Produced by a stem cell culture containing stem cells that ectopically express a growing hematopoietic gene Conditioned medium is provided. Similarly, the invention also provides a self-healing phenotype. Stem cell culture containing stem cells that ectopically express the hematopoietic gene imparted to the cells Thus, a purified or semi-purified preparation of one or more factors produced is provided.   The practice of the present invention will, unless otherwise indicated, be directed to cell biology, cell culture, molecular biology, Conventional techniques of transgenic biology, microbiology, recombinant DNA, and immunology Which is within the skill of the art. Such techniques are described in the literature . For example, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd edition, Sambrook, Frits ch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA C loning, Volumes I and II (edited by DN Glover, 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed., 1984); Mullis et al., US Pat. No. 4,683,195; Nucleic Acids Hy. bridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds., 1984); Transcription And Tran slation (B.D. Hames & S.I. Higgins eds., 1984); Culture Of Animal Cells (R .I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immunobilized Cells And Enzyme s (IRLPress, 1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning ( 1984); the treatise, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y. ); Gene Transfer Vectors For Mammmalian Cells (J.H. Miller and M.P. los, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, 154. Volumes and 155 (ed. By Wu et al.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Bio logy (Mayer and Walker eds.), Academic Press, London, 1987); Handbook of  Experimental Immunology, Volumes I-IV (ed. By D.M.Weir and C.C.Blackwell, 1986) ); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press) , Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).   Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description, and from the claims. Become clear.                             Detailed description of the drawings   FIG. 1 is an illustration of hematopoietic stem cell differentiation pathways.   FIG. 2 shows that EB cells cultured for 6 days were cultured with erythropoietin (EPO) and steel. Of two types of colonies present when replating in the presence of factor (SF) It is a photograph showing typical morphology. Small hard early erythroid-type colonies (p ) Is a large nucleated hemoglobinized (red) erythrocyte that expresses fetal-type globin Consists of Larger and irregularly spread colonies have a finite erythroid type Is a colony (d). This colony contains enucleated hemoglobinated red blood cells, Preferentially from those immediate precursors such as reticulocytes and erythroblasts.   Figures 3A and 3B show mouse stem cell virus (MSCV) retroviral vectors. (MSCV) or with this vector containing the LH-2 gene (MSCV-LH-2) Red in ES cultured for 6 days, derived from the populated, differentiated ES cell line CCE It is a graph which shows the frequency of a blood cell precursor. (3A) Before the early erythroid lineage Carrier frequency. (3B) Precursor frequency for a finite erythroid lineage.   FIG. 4 shows ES cells cultured for 6 days derived from differentiated J1 ES cells. Figure 3 is a graph showing the frequency of precursors for early erythroid lineages.   FIG. 5 shows the structure of the mouse stem cell virus vector (MSCV, upper panel) and It is a schematic diagram of the structure of MSCV containing LH-2 (MSCV-LH-2, lower panel). Arrow Indicates the start of transcription. LH-2 is under the control of a modified LTR promoter. This Vector contains neomycin phosphotransfection under the control of an internal pg promoter. Includes the E. coli (neo) gene. p (A) represents a polyadenylation site. LH-2 inheritance The offspring are on polycistronic transcripts that also contain the neo gene or Children exist on two different messages. SD and SA are Indicates acceptor site, and + was propagated for high virus titer Shows the packaging area. All other virus-specific genes are in BOSC-23 cells Present in strains.   FIG. 6 is a photograph showing the morphology of “stem cells” in methylcellulose. This Colonies of type CCE cells transfected with the MSCV-LH-2 vector EBs derived and cultured for 6 days were produced by replating. Special Certain colonies are derived from CCE MSCV-LH-2 subclone 7.   7 and 8 show the methylcellulose colony assay described in Example 4. It is a photograph.   FIG. 9 is a graph showing the effect of the conditioned medium on HPC colony formation.                             Detailed description of the inventionI. Method outline   Authentic hematopoietic stem cells have two unique characteristics. First, they are pluripotent There are: they can differentiate into all mature blood cell types. Second, this They self-heal; that is, they can differentiate and maintain their pluripotency. You. Hematopoietic stem cells have been characterized and have potential, functional characteristics, and Conditions for maintaining in culture include. However, as described in the art, Hematopoietic stem cell cultures have the potential for self-healing, The capacity for reversion is nonetheless a clear ability of stem cells to recover in vivo. Substantially limited compared to force.   The present invention is reproducible and efficient with well-defined kinetic patterns. Provides a developing hematopoietic system that can be used to generate hematopoietic cells. One station In aspects, the method of the present invention generally comprises the following steps: Obtaining a stem cell, and an expression construct comprising a hematopoietic gene (eg, the LH-2 gene) Transfecting the cells with to obtain viable hematopoietic stem cells. . In another embodiment, the endogenous hematopoietic gene is homologous to the gene activation construct. Activated by replacement.   The striking feature of these cells is that they are transiently strong cell lines for these or many generations. As it can be maintained in culture. Provided in the accompanying examples. Data suggests that this protocol could recover itself, and various mature hematopoiesis Multilineasg precursors that retain their ability to differentiate into cell types It can be seen that this can be used to generate This finding suggests that stem cell development It is important because it is very low in raw or natural. Therefore, these pure and homologous Cell populations have not been substantially realized by the technology available today.   The hematopoietic stem cell composition of the present invention can be maintained in culture for a long period of time. Thus, by being able to select and transfer to secondary and higher cultures, Various hematopoietic lineages (this includes various lymphoid and myelomonocytic lineages (eg, B lymphocytes, T lymphocytes, monocytes, macrophages, neutrophils, erythrocytes, etc.) ) Can be characterized.   One aspect of the invention is directed to hematopoietic genes (eg, transcription factors (eg, LIM-homeo). Cell containing stem cells that have been genetically modified to express Composition. As an example, embryonic stem cells expressing LH-2 can self-heal, Alternatively, it can be used to establish early hematopoietic cell cultures. The present invention Vesicles include cells from human and non-human sources.   Stem cells can be in a suitable nutrient medium (including but not limited to conditioned medium), Co-culture with stromal layer or other support layer, adhesion molecule, or genetically modified according to the present invention Proliferation that is sufficient to maintain the proliferation and (if necessary) differentiation of the differentiated stem cells It can be cultured in a medium containing a synthetic combination of factors.   The genetically modified stem cells of the present invention and their progeny can be used in various applications. Can be used. These include transplantation of engineered cells in vivo (tran splantation or implantation; cytotoxic compounds, allergens In vitro screening for growth / regulatory factors, pharmaceutical compositions, etc .; Elucidation of the mechanism of the disease; study of the mechanism by which drugs and / or growth factors operate; Including, but not limited to, the production of a physically active product. Therefore, cells Is a disease requiring a bone marrow transplant (for example, all including radiation or chemotherapy) Cancer, ii) potential for autoimmune diseases by replacing pathogenic lymphocytes Iii) the potential for different types of hereditary anemia and acquired anemia Cure, iv) HIV infection by growing a small number of patients' own uninfected stem cells. If there is a possibility that the replaced compartment can be replaced by healthy cells, Can be used therapeutically.   In another aspect, the source of hematopoietic stem cells or progeny thereof expresses LH-2. Stem cells in the presence of feeder cells, including feeder layers that have been genetically engineered Provided by that. LH-2 is involved in the self-healing phenotype of hematopoietic cells. Given the view that it results in the expression of the laculin factor, this embodiment Ex vivo of stem cells (eg, stem cells are not themselves genetically modified) To allow growth on An embodiment wherein the stem cells or progeny thereof are used therapeutically For such a feeder layer may be preferred.   In a related mode, another aspect of the invention is the use of conditioned medium, or ectopic LH-2, Available for purified or semi-purified sources of factors produced by cells expressing in Make it work. That is, the supernatant of the genetically modified stem cells described herein Any inducible factor found in the cell is in some form isolated from the source cell Can be provided. The present invention also provides for the cloning of such LH-2 induced factors. Wherein the recombinant protein is provided, for example, in purified form. Can be obtained or expressed from cells in co-culture. As mentioned above, An embodiment is directed to a wild-type stem cell (eg, a stem cell that is not itself genetically modified). B) ex vivo growth.   Yet another aspect of the present invention relates to a hematopoietic gene construct of the present invention for in vivo therapy. Concerning the use of structures. Thus, through a gene therapy approach, the method of the present invention Increase or correct deficiencies in the hematopoietic system or parts thereof directly in the patient To provide the means for:   Yet another aspect of the present invention relates to the generation of a restricted lineage hematopoietic stem cell. As described below, otherwise transiently strong stem cells can be transferred to any hematopoietic cells. The ability to differentiate is a loss-of-function mutation in a gene that is critical for the development of one or more specific lineages Can be limited by introducing For example, loss of function to GATA-3 or NFAT The mutation reduces the ability of the hematopoietic stem to differentiate into T cells. Similarly, PU.1 or Oct2 Mutations limit differentiation to non-B cell lineages. Other loss-of-function mutations are described below. For example, monocytes, neutrophils, eosinophils, basophils, megakaryocytes, and / or erythrocytes Can be used to reduce lineage differentiation.II . Definition   For convenience, reference will be made to the specification, examples, and appended claims. Certain terms are collected here.   The term “lineage committed cell” is no longer a pluripotent but specific lineage (eg, bone marrow). Sexual lineage, lymphocyte lineage, erythroid lineage). Lineage committed cells are specialized cell types (eg, red blood cells, T lymphocytes, And B lymphocytes).   The term “stem cell” is self-healing (ie, expanded to give rise to more stem cells). And produce lineage-dependent precursors that can differentiate and proliferate into specific lineages Undifferentiated cells. In a preferred embodiment, the term "stem cell" Derivatives (progeny) are differentiated (eg, by the progressive diversification of embryonic cells and tissues) By completely acquiring individual characteristics (as occurs in A generalized mother cell that is specialized in a certain direction. Used in this document As such, the term “stem cell” generally refers to embryonic stem cells from a mammalian source (eg, human). Refers to both vesicles and hematopoietic stem cells.   Stem cell compositions can be maintained in culture for extended periods of time Can be selected and transferred to secondary and higher cultures, and Various lymphoid or myeloid lineages (especially B lymphocytes, T lymphocytes, monocytes, Clophages, neutrophils, erythrocytes, etc.) You.   As used herein, the term “embryonic stem cells” refers to all somatic cell lines and Pluripotent, blastocyst-derived, which retains developmental potential for differentiation into germ cell lines (For review, see Robertson, E.J. (1986) Trends in Genetics 2 : 9-13). This cell type is also called "ES cells".   As used herein, the term “hematopoietic stem cells” (HSC) refers to self-healing, And all defined hematopoietic lineages (ie, myeloid, lymphoid, Means both populations of cells that are capable of both differentiation of the erythroid lineage); A limited number of cells can repopulate the hematopoietic system of recipients who have undergone a myeloablation procedure. HS C ultimately leads to hematopoietic cells (common lymphocyte precursor cells, T cells (eg, Par cells, cytotoxic cells, saflusser cells), B cells, plasma cells, natura Lukiller cells, common bone marrow precursor cells, monocytes, macrophages, mast cells, leukemia Including but not limited to spheres, basophils, neutrophils, eosinophils, megakaryocytes, platelets, and erythrocytes Not). HSCs have an early phenotypic cell surface antigen (eg, CD34 + Th y-1+Lin-) And negative staining for strain-specific antigens Noh.   The term "hematopoietic gene" refers to the self-healing and A gene encoding a protein product involved in the process of differentiation. The LH-2 gene is used by hematopoietic tissues (eg, fetal liver), as well as As expressed in developing malignant malignancies (Oncogene 12, 1205-66); Ectopic expression of this gene in embryonic stem cells is associated with hematopoietic progenitors (eg, And the production of LH-2 gene Noh Homozygous mice with the disappearing mutations have a reduced number of finite erythroid progenitor cells Examples of hematopoietic genes are provided as they show type-latent precursor cells.   The term “hematopoietic gene construct” refers to a nucleic acid molecule (eg, a host cell of the invention). A hematopoietic residue of the invention operably linked in a manner capable of replicating and expressing hematopoietic genes. Vector containing the gene). The hematopoietic gene construct can be a recipient human cell or Receptor non-human cells can be introduced by nucleic acid-mediated gene transfer.   As used herein, "heterologous DNA" or "heterologous nucleic acid" Contains non-naturally occurring DNA as part of a system, where the DNA differs from its natural location Present or found at the location (s) in the genome. Heterologous DNA is not endogenous to the cell into which it is introduced, but is obtained from another cell. I have. Generally, although not necessarily, such DNA is used for RNA and Encodes proteins, which are not normally produced by the cells in which they are expressed . Heterologous DNA is also referred to as a foreign gene. Those skilled in the art will be able to Any DNA that is recognized or considered to be heterologous or foreign to the subject is heterologous DNA Is included herein.   The terms “homeobox gene” and “homeobox protein” are distinctive A 60 amino acid helix turn helix DNA binding domain (Levine and Ho ey (1998)), each of a family of structurally related transcription factors that share Refers to genes and gene products. The terms "homeobox" and "homeodomain" "Protein" is used interchangeably herein.   As used herein, the term "LH-2 protein" refers to a homeobox Refers to members of the Lhx subclass of proteins. These proteins are lin-11i About sl-l mec-3 (Xu, Y. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 227-31) Includes a novel Cys-His structural motif known as the IM domain.   The terms "protein," "polypeptide," and "peptide" are used herein. Used interchangeably with.   As used herein, with respect to stem cells, the term "substantially pure" At least about 75%, preferably at least about 75% of the stem cells that make up the entire cell population At least about 85%, more preferably at least about 90%, and most preferably at least Also refers to a population of stem cells that are about 95% pure. In other words, the term "substantially pure" Is Prior to subsequent culture and amplification, in the original unamplified and isolated population Less than about 20%, more preferably less than about 10%, most preferably less than about 5% Refers to a population of stem cells of the present invention including a committed cell.   The term “culture medium” is art-recognized and generally refers to a viable cell. Refers to any substrate or preparation used for culturing cells. Therefore, " “Culture” refers to a tissue (eg, an in vitro device that preserves its structure and function) Maintenance or proliferation of explants of government primordia or adult organs). “Cell culture” Cell growth in vitro; cells proliferate but are themselves organized into tissue Not.   The term “conditioned medium” does not contain supernatant, eg, cultured cells / tissues, Certain paracrine factors and secreted by the vesicles and secreted into the culture. And / or modified to include autocrine factors, and Occurs after contact   As used herein, the term "cellular composition" refers to a preparation of cells. In addition, the preparation contains, in addition to the cells, non-cellular components such as cell culture media, e.g., , Proteins, amino acids, nucleic acids, nucleotides, coenzymes, antioxidants , Metals and the like. In addition, the cellular composition provides for the growth of cellular components and Does not affect viability, but in a particular format (eg, encapsulation or pharmaceutical (As an encapsulation matrix for the preparation), used to provide cells It is.   As used herein, the term "animal" refers to a mammal, preferably a human. Such as mammals. Similarly, "patients" to be treated by the methods of the invention Or "subject" can mean either a human or non-human animal.   As used herein, a "transgenic animal" is any animal , Preferably a non-human mammal, bird, or amphibian, wherein one of the animals These cells are obtained by methods of human intervention (eg, trauma well known in the art). Heterogeneous nucleic acids introduced (by transgenic technology). Nucleic acids can be directly Or indirect, by introducing cells into precursors, by deliberate genetic manipulation ( For example, by microinjection or by To dye Therefore, it is introduced into cells. The term genetic manipulation refers to traditional crossbreeding or It does not include in vitro fertilization, but rather is directed to the introduction of recombinant DNA molecules. this The molecule integrates intrachromosomally or the molecule is extrachromosomally replicating DNA Can be In a typical transgenic animal described herein Transgenes allow cells to express recombinant forms of homeobox proteins You. However, for example, the FLP or CRE recombinase dependent structures described below Transgenic plants in which the recombinant homeobox gene is silent, such as Cook animals are also contemplated. In addition, "transgenic animals" also have one The above-mentioned gene disruption of the homeobox gene can be achieved by human intervention (recombinant technology and Including those recombinant animals caused by both No.   "Non-human animals" of the present invention include rodents, non-human primates, Vertebrates, such as baboons, sheep, dogs, dogs, unes, and other non-human mammals. I can do it. As used herein, the term "chimeric animal" Or in some but not all cells, the recombinant gene Refers to an animal in which is expressed. The term “tissue-specific chimeric animal” refers to a recombinant hematopoietic gene Is present and / or expressed or destroyed in one tissue but not in another Indicates that this is not the case.   As used herein, the term “transgene” refers to a nucleic acid sequence (eg, Coding for hematopoietic proteins or engaging them with antisense transcripts Belonging), which is the transgenic activity in which the transgene is introduced. Partially or completely heterologous to an object or cell, i.e., foreign, (For example, this gene is located at a position different from the position of the natural gene). Or insertion of this gene results in a knockout), A bite designed to be inserted into the genome of an animal in a way that alters the genome Or inserted. The transgene comprises one or more transcriptional regulatory sequences and any other Nucleic acids (eg, introns), which provide optimal expression of the selected nucleic acid. May be necessary for   As used herein, the term "vector" refers to another vector to which it is ligated. A nucleic acid molecule capable of transporting a nucleic acid. The term "expression vector" refers to a vector Hematopoietic of the present invention, thus encoded by the respective recombinant genes carried -A plasmid, cosmid, or phage, which can synthesize a protein, You. Preferred vectors are those that are capable of autonomous replication and / or to which It is a vector that can express an acid. In this specification, "plasmid" and "ve The vector is the most commonly used plasmid in the form of a vector, Used as possible. Furthermore, the present invention serves equivalent functions and It is intended to include other forms of expression vectors known in the art. .   As used herein, the term “transfection” refers to nucleic acid mediated Refers to the introduction of a nucleic acid (eg, an expression vector) into a recipient cell by sexual transfer. As used herein, "transduction" means that the genotype of a cell is exogenous D A process that changes as a result of cellular uptake of NA or RNA, and For example, the transduced cells express a recombinant form of the hematopoietic protein, or Or if antisense expression results from the transferred gene, the hematopoietic protein The natural form of expression is destroyed.   "Hematopoietic cell disorders" are characterized by defects in any normal function of hematopoietic cells Means any state that can be achieved. Hematopoietic cell diseases that can be treated using the cells of the invention As genetic abnormalities (eg, adenosine deaminase deficiency, Fanconi Anemia, and dyschromatosis (eg, sickle cell anemia), thalassemia, and Moglobin C disease), and diseases acquired by means of infection or non-infection (Eg, acquired immunodeficiency syndrome, and leukemia).   By "gene product" is meant a molecule produced as a result of gene transcription. It is. Gene products include RNA molecules transcribed from genes, Proteins translated from transcripts.III . Genes and vectors A. Recombinant gene   As indicated above, in one aspect, the invention provides a self-renewal phenotype of stem cells. Ectopic hematopoietic genes that enhance expression and allow terminal differentiation to a broad mature hematopoietic lineage Provided are stem cells that have been genetically modified to be specifically expressed. The following example is Manipulates stem cells to recombinantly express LIM-homeobox protein LH-2 An illustrative embodiment is provided. However, from the description provided herein, Skilled technicians have developed a new system, including cells produced using other hematopoietic gene constructs. It will be appreciated that other embodiments for the subject cells described are feasible.   For further guidance, one selection of hematopoietic genes suitable for use in the present invention. The criteria are based on phenotypic observations conferred by loss-of-function mutations in genes. Is allowed. For example, as described in the Examples below, Differentiate into one or more mature hematopoietic cell types by loss-of-function mutations Selection of appropriate hematopoietic genes based on reduced stem cell capacity Can be. For example, transgenic mutations due to loss-of-function mutations in the LH-2 gene Animal loses mature hematopoietic cells. That is, LH-2 is critical for hematopoiesis. You. Contrary to loss-of-function mutations, ectopic expression of the wild-type LH-2 gene in the cells of the invention According to the present (gain of function), the desired stem cell phenotype as demonstrated in the Examples Occurs. Thus, the phenotype of the loss-of-function mutations is Used as a marker to identify genes compatible with the cell instance.   The hematopoietic gene used in the present invention also (or alternatively) To be selected based on observations during development, especially during the initial hematopoietic restraint phase Can also. In another embodiment, the recombinant hematopoietic gene is overexpressed in some forms of leukemia And as a result, proteins involved in the process of HSC self-renewal and / or differentiation This gene can be selected because it can encode protein.   One class of hematopoietic gene constructs contemplated by the present invention occurs in the hematopoietic system. Derived from genes encoding transcription factors expressed in a specific or lineage-specific manner Is done. Preferred hematopoietic genes are selected from the homeobox protein family It is. Such proteins are homeobox domains, such as helix Turn helix motif, including primary sequence motif for specific DNA binding (Eg, Levine et al. (1988) Cell55: 537〜540; Ro bertson (1988) Nature336: 522-524 and references therein). Homeovo Genes are involved in embryonic pattern formation and in various bodily tissues, including the hematopoietic system. It is involved in staff-specific functions.   In a preferred embodiment, the homeobox protein is a homeoboxtan Members of the LIM subclass of proteins, such as the LIM-homeobox protein Quality. These proteins have a LIM domain for lin-11 isl-1 mec-3. Contains a novel Cys-His structural motif known as Xu et al. (1993) PN AS90227-231). Thus, LIM-homeobox proteins are homeodome And at least one LIM domain. Representative LIM- The homeobox gene has been termed LH-2 (eg, Xu et al., Supra; and GenBan k See accession numbers U11701 [human] and L06804 [rat]). The full length LH-2 protein It contains a homeodomain and two LIM domains. This LH-2 protein Developing hematopoietic tissues, such as fetal liver, as well as lymphoid malignancies, such as chronic bone marrow It is expressed in leukemia and lymphoid malignancies.   Another member of this class of homeobox proteins is: Lhx3 gene production Things (eg, Zadanov et al. (1995) Dev Dyn202: 354-364; and GenBank accession number L 40482 [mouse]); isl-1, isl-2, isl-3, etc. (eg, Dong et al. (1991) Mol E ndocrinFive: 1633-16 / 11; and Gong et al. (1995) J Biol Chem270: See 3335-3345 ); islet-1, islet-2, etc. (eg, Tanizawa et al. (1994) Diabetes)43: 935-941; and And GenBank accession numbers U07559 [human, islet-1] and L35571 [rat, islet-2] LIM-1, LIM-2, LIM-3, etc. (eg, Fujii et al. (1994) Dev Dyn)199 : 73-83; Barnes et al. (1994) Dev Biol161: 168-178; Seidah et al. (1994) D NA Cell Biol13: 1163-1180; and GenBank accession number L38249 [mouse, Lim3a] Lmx-1 (German et al. (1992) Genes Dev)6: 2165 to 2176).   Another candidate hematopoietic gene used in the subject invention is the c-myb gene. this Genes are involved in all types of hematopoietic cells. Its expression is lymphoid, myeloid High in immature cells of all lineages, including erythroid and erythroid lineages, but low or Does not exist at all. myb protein is involved as a growth promoter . c-myb plays a clearly important role in hematopoiesis, but this is Expression in cells does not act as an important factor in identifying individual cell lineages. Suggests that Rather, c-myb expression grows along individual pathways. It is likely to identify immature cells that can be differentiated. Such transcription factors are Subject When given as a hematopoietic gene by the method, it can promote the development of unrestricted hematopoietic stem cells. it can.   Another class of transcription factors that may contain members useful in the present invention For example, zinc finger-containing transcription factors expressed in immature hematopoietic cells included. Examples of this class include the GATA family of zinc finger-containing transcription factors. Family members, eg, GATA-1. G by homologous recombination Inactivation of ATA-1 reduces erythroid production in vivo and ex vivo And this suggests that this gene plays a role in erythroid development are doing. GATA-2 expressed in erythroid pluripotent progenitor cells and mainly T lymphocytes GATA family such as GATA-3 which is thought to be expressed in lineage cells Other genealogy-specific members are also contemplated in this class.   Yet another source of genes that produce the subject hematopoietic gene constructs includes certain leukocytes. Genes encoding synzipper-containing transcription factors are included. This in the hematopoietic system One example of type generation control is C / EBPβ (NF-IL6, NF-M, LAP, IL-6 DBP, also known as AGP / EBP and CRP2). Expression of C / EBPβ has been shown to change during myeloid cell differentiation. Is consistent with the role of this gene as a differentiation regulator.   As noted above, in a preferred embodiment, the subject genetically modified subject matter Hematopoietic gene constructs used to produce vesicles include, for example, homeobox proteins Lh-subclass LIM-homeobox proteins, such as LH-2 or a phase thereof Code the same. It is referred to herein as having LH-2 protein activity. The polypeptide to be affected is preferably a human LH represented by SEQ ID NO: 2 or 4. -2 an amino acid sequence corresponding to all or part of the amino acid sequence of the protein, or Have these isoforms (including various splicing variants). Sequence The LH-2 sequences shown in the separate numbers 1 and 2 are sequences published for the human LH-2 gene ( (See SEQ ID Nos. 3 and 4) means that the former has an extra G residue at position 1653 of SEQ ID No. 1. Are different in having a group and are described in the examples below. In the experiment, the former clone was used. This extra residue causes a frameshift. Resulting in a different C-terminal sequence compared to the published mouse homolog Is obtained. However, the C of the LH-2 gene product shown in SEQ ID NO: 2 The terminal sequences were rearranged by the chicken and zebrafish LH-2 clones and applicants. Consistent with published C-terminal sequence for sequenced rat LH-2 clone . This sequence difference is true, i.e., a splice variant or allele. It may be a mutant or simply incorrect human LH-2 sequence published. In any case, PCR primers based on the 3 'and 5' nucleotide sequences of the human gene The use of immers allows the isolation of functional LH-2 sequences in the cells of the invention. U.   LH-2 proteins from other species, such as the rat LH-2 gene (SwisProt accession number P36198) is also intended for use as part of the present invention. Preferred embodiment Likewise, the biological activity of the ectopically expressed LH-2 protein includes: stem cell proliferation Ability to enhance power; stem cells in hematopoietic lineage in the presence of extracellular factors and cytokines, eg Ability to regulate the potential to differentiate into, for example, myeloid, erythroid or lymphoid lineages; Includes the ability to create hematopoietic stem cells that can repopulate the marrow.   Obviously, various homologs of the wild-type LH-2 protein can also be used in the cells of the present invention. Will. In a preferred embodiment, the recombinant LH-2 gene has a DNA binding domain A repetitive sequence that has and is rich in Cys-His, for example, as shown in SEQ ID NO: 2 or 4. Characterized by two or more Cys-His-rich repeats as described Encodes a protein containing an amino acid sequence. In some embodiments, LH -2 protein has a heterologous transcriptional activation domain Can be provided in the park.   "Homology" and "identity" refer to sequences between two polypeptide sequences, respectively. Saying similarity, identity is a stricter comparison. Homology and identity are each compared The position of each sequence that can be aligned for the purpose of is determined by comparison. Comparison When one position in the sequence is occupied by the same amino acid residue, Can be said to be identical at that position, and the equivalent site is the same Amino acids (eg, identical) or similar amino acids (eg, steric and / or Electronic properties are similar), these molecules are Can be said to be homologous. The percentage of homology or identity between sequences is It is a function of the number of pairs or homologous positions shared by the columns. "Unrelated" or "heterologous" ), The shared identity is less than 40 percent, but preferably 25 percent Less than   Preferred nucleic acids have LH-2 protein activity and have SEQ ID NO: 2 or Is at least 60% homologous to the amino acid sequence shown in 4, and more preferably 70% homologous It encodes the same, and most preferably, 80% homologous peptide. LH-2 protein Having the same activity as the sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, At least about 90%, more preferably at least about 95%, and most preferably at least Also, nucleic acids encoding peptides having about 98-99% homology are within the scope of the invention. You. Preferably, the nucleic acid is a coding sequence as set forth in SEQ ID NO: 1 or 3. Is a cDNA molecule comprising at least a portion of   Modification of the structure of the LH-2 polypeptide may have therapeutic or prophylactic efficacy, stability (eg, , Enhances ex vivo shelf life and resistance to proteolysis in vivo) For such purposes or post-translational modifications such as phosphorylation. This Such as modified by amino acid substitution, deletion or addition. Can be   For example, leucine is isoleucine or valine, and aspartic acid is Substitute threonine for serine or replace certain amino acids structurally with Amino acid substitution (ie, isosteric and / or isoelectric mutation) Has no significant effect on the biological activity of the resulting molecule It is reasonable to think. Conservative substitutions result in a family of amino acids involved in the side chain. Are substitutions that occur within the range of the Lie. There are four genetically encoded amino acids Family: (1) acidic = aspartic acid, glutamic acid; (2) basic = lysi Arginine, histidine; (3) non-polar = alanine, valine, leucine, a Soleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan; and (4) Uncharged polarity = glycine, asparagine, glutamine, cysteine, seric , Threonine and tyrosine. Phenylalanine, trip Tophan and tyrosine are sometimes jointly classified as aromatic amino acids. Similarly, all amino acids are (1) acidic = aspartic acid, glutamic acid; (2) basic = lysine, arginine, histidine; (3) aliphatic = glycine, a Lanin, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine (serine and thread (4) aromatics are optionally classified separately as aliphatic hydroxyls); Family = phenylalanine, tyrosine, tryptophan; (5) amide = asparagine , Glutamine; and (6) sulfur-containing = cysteine and methionine Can be divided into groups. (For example, Biochemistry, 2nd edition, edited by L. Stryer, WH Freemanand Co .; 1981). Changes in the amino acid sequence of the peptide make LH-2 functional Homologs (e.g., the ability of the authentic form to produce the progenitor cells of the invention It is easy to determine whether the peptide is functional (in the sense that it mimics it). Can be specified. Polypeptides in which more than one substitution occurs are the same It can be easily tested by the method.   Similarly, the hematopoietic gene construct comprises a Cys-His repeat, for example, All or part of the amino acid sequence shown in one of SEQ ID NOs: 1 and 3 A nucleic acid encoding an LH-2 polypeptide having a high, moderate or low stringency A nucleus which forms a hybrid under the conditions, for example, a nucleus represented by SEQ ID NO: 1 or Uses the LH-2 gene containing a nucleotide sequence that hybridizes with the acid sequence Can be created. Suitable stringent conditions to promote DNA hybridization For example, 6.0 × sodium chloride / sodium citrate (SSC) at about 45 ° C., The washing of 2.0 × SSC at 50 ° C. is known to those skilled in the art or Current Protocols in Molecular Biology  in Molecular Biology), John Wiley & Sons s), New York (1989), 6.3.1-6.3.6. For example, wash The salt concentration at the stage of purification ranges from a low stringency of about 2.0 × SSC at 50 ° C. to about 0.2 × SSC at 50 ° C. You can choose up to a high degree of stringency. In addition, the temperature of the washing step is room temperature, ie It can be increased from low stringency conditions of about 22 ° C to high stringency conditions of about 65 ° C.   Nucleic acids encoding biologically active portions of the subject LH-2 proteins are also within the scope of the invention. Is within. As used herein, the nucleus encoding the active portion of the LH-2 protein The acid fragment is, for example, LH-2 tandem represented by SEQ ID NO: 1 or 3. Nucleotide sequence encoding the full-length amino acid sequence of the protein Encodes a peptide that has low transcriptional activity and retains the transcription activity of the full-length protein Refers to a nucleotide sequence.   For recombinant expression of hematopoietic genes in stem cells, It will be appreciated that a range of vectors can be used. Such vectors, for example, Examples include Sambrook, Fritsch and Maniatis. Editing, Molecular Cloning: Laboratory Mani (A Laboratory Manual) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, -Cold Spring Harbor, York [1989]) Restriction endonuclease digestion, ligation, plasmid and DNA and RNA purification, D Such techniques include, but are not limited to, standard techniques such as NA sequencing It can be constructed using methods well known in the art. Most practitioners are standard Familiar with raw materials and specific conditions and methods. However, for convenience, Section will serve as a guide.   To create an appropriate hematopoietic gene construct, the nucleus corresponding to the intended hematopoietic gene Acids are commonly used in the protocols described herein as well as generally known in the art. MRNA or gene present in any of a number of eukaryotic cells according to the protocol It can be obtained from nome DNA. To explain, c encoding LH-2 protein DNA is isolated from cells that express the protein, such as hematopoietic cells or neural cells. mRNA can be isolated and obtained. Next, the double-stranded cDNA was converted to all mRNs described above. A and then suitable using any of a number of known techniques It can be inserted into a plasmid or bacteriophage vector. LH-2 Tan The gene encoding the protein is prepared according to the nucleotide sequence information provided in the present invention. Can also be cloned using established polymerase chain reaction techniques .   Known in the art for inserting DNA fragments into vectors Using any method, the invention of the invention containing the appropriate transcription / translation control signals may be used. A current construct can be created. For example, Sambrook et al., Supra; and Aus. Edited by Ausubel, etc., Current Protocols in Molecular Bio Rosie (John Wiley & Sons, New York, 1992). These methods To Includes in vitro DNA recombination and synthesis techniques and in vivo genetic recombination be able to.   Hematopoietic genes of the invention typically regulate the expression of the gene in a particular manner. Operably linked to transcriptional regulatory sequences such as promoters and / or enhancers. Would have been. In some embodiments, useful transcriptional regulatory sequences include, for activity, An array that is highly regulated both temporally and spatially. Thus selected Promoters can be active only in particular tissues or cell types. Wear. When the promoter is obtained from a mammal, the mammal is homologous (tran Be the same species as the mammal to be infected) or non-homogeneous (different species). Wear.   Suitable promoters / enhancers are determined using standard methods in the art. It can be introduced into a vector (see, eg, Maniatis). Transcription in hematopoietic cells Any promoter sufficient to direct initiation can be used in the present invention. . For example, promoters that can be used to control the expression of recombinant hematopoietic genes / Enhancers include native transcription regulatory sequences for recombinant genes (e.g., LH-2 regulatory elements). Column), cytomegalovirus (CMV) promoter / enhancer (Keating (1990) Exp Hematol19: 99-102; and Karasuyama et al., 1989, J Exp. Med .169: 13), human β-actin promoter (Gunning et al. (1987) PNAS84: 4831〜 4835), which is present in the mouse mammary tumor virus long terminal repeat (MMTV LTR). Glucocorticoid-inducible promoter (Klessig et al. (1984) Mol. Cell Biol .Four: 1354-1362), the long terminal repeat of Moloney murine leukemia virus (MuL). VLTR) (Weiss et al. (1985) RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Labora tory Press, Cold Spring Harbor, NY), mouse stem cell window Rus (MSCV) -derived promoter (see Examples below), SV40 early or late Region promoter (Bernoist et al. (1981) Nature290: 304-310; Templeton et al. (19 84) Mol. Cell Biol.,Four: 817; and Sprague et al. (1983) Virol.,45: 773), Promoter contained in the long 3 'terminal repeat of Rous sarcoma virus (RSV) (Yamamoto et al., 1980, Cell,twenty two: 787-797), herpes simplex virus (HS) V) Thymidine kinase promoter / enhancer (Wagner et al. (1981) PNAS)8 Two : 35 67-3571) and the herpes simplex virus LAT promoter (Wolfe et al. (1992) N ature Genetics,1: 379-384), but not limited thereto. preferable The non-tissue specific promoter is the CMV promoter (DeBernardi et al. (1991) PNAS USA88: 9257-9261). In this regard, the mouse CMV immediate early promoter Is highly active in human hematopoietic progenitor cells as well as stromal cells in culture (Keating, A. et al. (1990) Exp. Hematol.18: 99-102).   As an alternative to constitutive expression, hematopoietic genes may be regulated by a promoter specific to hematopoietic cells. You can put it under your control. Examples of these promoters are the globin promoter, For example, the β-globin promoter for expression in erythrocytes (Karlsson et al. (1985) Ann. R) ev. Biochem.54Granzyme A for expression in T cells and NK cells Promoter, CD34 promoter for expression in stem and progenitor cells, cytotoxic T cells CD8 promoter for intravesicular expression and CD11b promoter for myeloid intracellular expression Included.   It is also possible to use inducible promoters for gene expression under certain physiological conditions it can. Those of skill in the art can use it to control the expression of recombinant hematopoietic genes. You will know a variety of inducible eukaryotic promoters that can be used. For example, I Conditioning control of recombinant gene expression using a PTG-inducible promoter Can be Another transcriptional regulatory system is responsive to hormones (Lee et al. (1981) N ature294: 228-232; Hynes et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA78: 2038〜 2042; Klock et al. (1987) Nature329: 734-736; Israel & Kaufman (1989) Nucl . Acids Res.17: 2589-2604).   In addition to hematopoietic genes and transcriptional regulatory sequences, useful for the preparation of the recombinant genes of the present invention Vectors typically comprise one useful vector for optimizing ectopic expression in a host animal. Or more other elements. To illustrate, the gene construct is Directs polyadenylation of mRNA transcripts as well as intron sequences. Such transcription termination elements may be included. For example, the code of the above recombinant gene The transcription sequence adds a transcription termination signal or polyadenylation signal to the transcript. The SV40 sequence (SV40 intron / pA) is located on the side of the 3 'end. Can be. In yet another embodiment, the hematopoietic gene has an interrupting coding sequence. Ron The sequence (s) can be included. Often in mammals Transcription of the recombinant gene can include one or more introns in the coding sequence. Enhanced by being.   In yet another embodiment, the gene construct is inserted into an intended recipient cell. Includes additional elements that facilitate manipulation within cells (eg, bacterial) be able to. For example, the vector contains a replication element source for propagation in prokaryotic cells. You can be in.   In addition, the hematopoietic gene construct may be transferred to the recipient Cells can be isolated from either an animal (ie, the bacterial cells used to amplify the construct). A selectable marker for release can be included. The selectable marker gene is Under selective culture conditions, the transfected cells are required for viability and / or growth. Key proteins can be encoded. Typical selectable marker genes are For example: (i) antibiotics or other toxins, eg, for prokaryotic host cells, Picilin, tetracycline or kanamycin and, for mammalian cells, Whether to confer resistance to omycin, hygromycin or methotrexate Or (ii) encodes a protein that confers a complement autotrophic deficiency in a cell. You. B. A system for ectopic expression of hematopoietic genes in stem cells   The hematopoietic gene construct uses a biologically effective carrier, for example, the expression construct. Any cells that can effectively transfect cells ex vivo or in vivo It can be administered in a formulation or composition. Hematopoietic cells are an efficient method for DNA transfer (Eg Keating et al. (1990) Exp Hematol18: 99-102; and And Dick et al. (1986) Trends GenetTwo: 165). These methods include recombinant Virus vectors, including rovirus, adenovirus and adeno-associated virus, Or insertion of hematopoietic genes into recombinant bacterial or eukaryotic plasmids. included. Transfect cells directly using viral vectors. Plasmid DNA was directly injected with the gene construct or CaPOFourSedimentation method Not only that, for example, cationic liposomes (Lipofectin) Or derivatives (eg, antibody conjugates), polylysine conjugates, gramacidin S, Man Delivered with the help of engineered viral envelopes or other such intracellular carriers be able to. Transduction of appropriate target cells is critical in gene therapy Showing the first step, the choice of a particular gene delivery system depends on factors such as phenotype, For example, it has been found that stem cells depend on the degree (if any) they receive. I'll get it. Another factor in selecting an appropriate transfection regimen is Considerations raised in vivo vs. in vivo transfection The latter should take into account the route of administration, e.g. local or systemic route. Must.   Preferred for both ex vivo or in vivo introduction of the subject hematopoietic gene constructs into cells. A new approach is to use viral vectors containing hematopoietic genes. is there. When cells are infected with a viral vector, most target cells receive the nucleic acid. It has the advantage that it can be taken. Furthermore, in a viral vector, for example, For example, the molecule encoded by the cDNA contained in the viral vector is Are efficiently expressed in cells that have taken up the nucleic acid of the vector.   Retroviral vectors generally transfer foreign genes into stem cells, especially human cells. It is understood that this is one of the recombinant gene delivery systems selected for introduction. (Eg, Hawley RG, et al. (1994) Gene Therapy1: 136-138). these Vectors provide efficient gene delivery into cells, and introduced nucleic acids It is stably integrated into the main chromosomal DNA. Major before using retrovirus The conditions are retrospective, especially regarding the potential for the spread of wild-type virus in cell populations. It is to ensure the safety of the use of ills. Produces only replication-defective retroviruses The development of a specialized cell line (called "packaging cells") Retroviruses as useful systems, and defective retroviruses Well characterized for use in gene transfer for gene therapy purposes ( For a review, see Miller, A.D. (1990) Blood76: 271). Thus, leto Rovirus coding sequence (gag, pol, env) has been replaced by a hematopoietic gene. By constructing a recombinant retrovirus, the retrovirus can be made replication-defective. Wear. The replication defective retrovirus is then packaged in virions and Use lever virions and target cells using helper virus with standard techniques To Can be infected. Producing a recombinant retrovirus and the virus The protocol for infecting cells ex vivo or in vivo using Et al., Found in sections 9.10-9.14 above and in other standard laboratory manuals. Can be. Examples of suitable retroviruses are well known to those skilled in the art. PLJ, pZIP, pWE and pEM. Homogeneous and bidirectional Of a suitable packaging virus lineage for preparing both sex retroviral systems Include ΨCrip, ΨCre, Ψ2, and ΨAm.   Retroviruses use a variety of genes in both ex vivo and in vivo protocols. For introduction into a number of different cell types, including embryonic stem cells, bone marrow cells, lymphocytes, and hepatocytes (Eg, Eglitis et al. (1985) Science230: 1395-1398; D anos and Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85: 6460-6464; Wilso n et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85: 3014-3018; Armentano et al. (1990 Year) Proc. Natl. Acad. Sci. USA87: 6141-6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl . Acad. Sci. USA88: 8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U SA88: 8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science254: 1802-1805; van Beusech em et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA89: 7640-7644; Kay et al. (1992) H uman Gene TherapyThree: 641-647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 : 10892-10895; Hwu et al. Immunol.150: 4104-4115; U.S. Patent 4,868, No. 116; U.S. Pat. No. 4,980,286; PCT application WO 89/07136; PCT application WO 89/0246 8; see PCT application WO 89/05345; and PCT application WO 92/07573).   Representative retroviral vectors are effective in undifferentiated embryos and hematopoietic cells. Described as giving rise to high titer viruses that can be transduced and expressed efficiently. (Hawley et al. (1994) Gene Therapy1: 136-138). These vectors are retro Virus mutant PCMV (myeloproliferative sarcoma virus passaged from PCC4 embryonal cancer cells) Downstream of the variant LTR derived from under the transcriptional control of the internal mouse pgk promoter. It contains a selectable marker (neo, hph or pac) and a unique gene insertion restriction site. A variant of the above retroviral vector, mouse stem cell virus (MSCV), An example will be described below.   In an exemplary embodiment, the entire coding region of the human LH-2 gene (SEQ ID NO: 1) is an MSCVneo vector (Hawley) under the control of the viral LTR promoter. A selection marker inserted within and conferring resistance to G418; And also has a neomycin phosphotransferase gene. See FIG. Simple Simply, use human PCR anchor primers to isolate human LH-2 coding sequence To add a restriction site on its side, and thereby the LH-2 sequence Requires subcloning into multiple cloning sites of the MSCVneo vector Can be. Helper-free MSCVneo-LH-2 virus producing packaging cells (Examples below and Markowitz et al. (1988) J Virol621120-1124) Hawley et al. (1991) Leukemia ResFifteen: Transient according to the method of 659-673 Infect tunicamycin-treated cells with the supernatant obtained from the transfectants. Can be created. These cells are, for example, Dalbe supplemented with G418. Maintained in modified Eagle's medium (DMEM). No helper MSCVneo- LH-2 virus stocks have high titers (eg,> 106CFU / ml) packaging A cell population can be collected and made. Retroviruses collected retroviruses Culture medium and supernatant obtained by the packaging cell line (for example, 5-20% (V / v)) to which retrovirus was added or infected. Culture stem cells directly on the ils packaging line itself, or both Can be infected by For example, U.S. Patent Nos. 5,399,493 and 5,399 No. 346 and PCT publication WO 93/07281.   Returning to the general considerations of retroviral vectors, the art describes viruses. By modifying viral packaging proteins on the surface of particles, Virus and consequently the retroviral-based vector infection spectrum It is recognized that it can be restricted (for example, PCT Publication WO93 / 25234, WO94 / 06920 and WO94 / 11524). For example, the feeling of a retroviral vector Strategies for modifying the staining spectrum: Antibody specific for stem cell surface antigen Combining with protein (Roux et al. (1989) PNAS86: 9079-9083; Julan et al. (1992 Year) J. Gen Virol73: 32: 51-3255; and Goud et al. (1983) Virology163: 251〜25 4); or binding a cell surface ligand to the viral env protein (Neda et al. ( 1991) J Biol Chem266: 14143 to 14146). Binding is a fusion protein Quality (eg, single-chain antibody / env fusion protein) Without the protein or other (eg, env protein asialoglycoprotein) Lactose to convert to lactose) can be in the form of a chemical cross-link . This technique is useful for limiting or directing infection to certain tissue types. However, it can be used to convert an ecotropic vector to an amphotropic vector. Can also be.   To further illustrate, hematopoietic gene constructs were created using retroviral vectors. And this can further reduce viral envelope protein and vesicularity Provide fusion protein containing stomatitis virus (VSV-G) glycoprotein (Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 8033〜8037; PCT (Applications WO 92/14829; and WO 96/09400). Typical amphotropic env protein Unlike VSV-G proteins, they recognize cell surface proteins. Rather than fuse with the phospholipid component of the cell membrane to mediate viral infection It is believed that. Since infection does not depend on specific receptors, the VSV-G Pseudo-type vectors have a broad host range. CD34 + / Thy-1 + Peripheral blood cells are formed with high efficiency by the VSV-G pseudotyped retroviral vector. Has been previously proven (see Kerr et al., PCT publication WO 96/09400). See). Genetic modification of stem cells by a hematopoietic gene construct can be performed by During stem cell maintenance by transduction using SV-G pseudo-virions Can be achieved at any time.   In addition, the use of a retroviral gene delivery system controls the expression of recombinant hematopoietic genes. Can be further increased by using tissue or cell specific transcriptional regulatory sequences. Can be.   Another viral gene delivery system useful in the present invention is a vector derived from adenovirus. Is used. Adenovirus genome encodes hematopoietic gene product of interest But inactivated with respect to the ability to replicate in the normal lytic virus life cycle. (Eg Berkner et al. (1988) Bio Techni). ques6: 616; Rosenfeld et al. (1991) Science252: 431-434; and Rosenfeld et al. (19 92) Cell68: 143-155). Adenovirus strain Ad type 5 dl324 or Appropriate DNA derived from other strains of denovirus (eg, Ad2, Ad3, Ad7, etc.) Denovirus vectors are well known to those skilled in the art. Recombinant Ade Virus is relatively stable, so it is easy to purify and concentrate. Modifying the stem cell population to affect the spectrum of infectivity Can be.   Furthermore, the introduced adenovirus DNA (and the foreign DNA contained therein) ) Is not integrated into the host cell genome and remains episomal And, therefore, the introduced DNA is the host genome (eg, retrovirus D NA) as a result of insertional mutagenesis under circumstances of becoming incorporated into Potential problems that may arise are avoided. Moreover, the adenovirus genome The ability to retain foreign DNA is greater than other gene delivery vectors (up to 8 kilobases). (Berkner et al., Supra: Haj-Ahmand and Graham (1986) J. Virol.57: 267). Present Most replication-defective adenoviruses that are in use and are therefore preferred in the present invention The Lus vector lacks all or part of the viral E1 and E3 genes, but 80% (Eg, Jones et al. (1971). 9 years) Cell16: 683; Berkner et al., Supra; and Graham et al., Methods in Molecular Biol. ogy, E. J. Edited by Murray (Humane, Clifton, NJ) Volume 7, 109-1 See page 27). The inserted hematopoietic gene is, for example, the E1A promoter, Promoter (MLP) and related leader sequences, E3 promoter or exogenous Can be expressed under the control of a promoter sequence added to E. coli.   Yet another viral vector system useful for delivering the subject hematopoietic genes is adeno-associated Virus (AAV). Adeno-associated virus vector is a multipotent hematopoietic stem cell Has been shown to be effective for in vitro transduction of other genes into the vesicle ( See PCT application WO 96/08560). Adeno-associated virus is a naturally occurring defective virus Adenovirus as a helper virus for efficient replication and growth life cycle Or other viruses such as herpes virus are needed. (For a review, see M Curr. Topics in Micro and Immunol. (1992)158: 97-129). Adeno-associated virus can integrate DNA into undivided cells and It is also one of the few viruses that shows stable integration (e.g., Flotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol.7: 349-356; Samulski et al. ( 1989) Virol.63: 3822-3828; and McLaughlin et al. (1989) J. Am. Virol.62: 19 63-1973). Vector containing AAV as small as 300 base pairs is packaged Can be embedded and incorporated. Space of foreign DNA is about 4.5k Limited to b. Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol.Five: 325 Recombinant hematopoietic genes using AAV vectors as described in 1-3260 Can be incorporated into stem cells. Using AAV vectors, various nucleic acids Introduced into cell types (eg, Hermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sc. i. USA81: 6466-6470; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol.Four: 2072〜2081 Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol.Two: 32-39, Tratschin et al. (1984) J. Virol.51: 611-619; and Flotte et al. Biol. Chem.268: 3781〜379 0).   Using non-viral methods in addition to the virus introduction method described above Can also express heterologous hematopoietic genes in transfected stem cells You. Most non-viral gene transfer methods involve macromolecule uptake and intracellular transport. Rely on the usual mechanisms used in mammalian cells to Preferred embodiment In another embodiment, the non-viral gene delivery system of the present invention provides that the target cell It relies on an endocytic pathway into the system. Typical gene transfer of this type Liposome-based systems, poly-lysine conjugates and artificial virus envelopes. Rope included.   In an exemplary embodiment, an expression comprising a gene encoding a LH-2 protein Constructs are encapsulated in liposomes with a positive surface charge (eg, lipofectin) And (optionally) this is directed against a cell surface antigen of the target stem cell population. (Mizuno et al. (1992) No Shinkei Geka20: 547-551; PCT (Publication WO 91/06309; Japanese patent application 1047381; and European patent publication EP-A43075) .   In yet another illustrative embodiment, the gene delivery system of the invention comprises a polylysine. Contains antibodies or cell surface ligands that cross-link with such gene binding agents (For example, PCT publications WO93 / 04701, WO92 / 22635, WO92 / 20316, WO92 / 19 749 and WO 92/06180). Subject nucleic acids by receptor-mediated endocytosis Effective delivery of the construct uses agents that enhance gene escape from endosomal structures. It will be recognized that it can be improved by using it. For example, whole adenovirus or inf Delivery of the fusogenic peptide of the Ruenza HA gene product to a delivery system Can be used to induce efficient disruption of DNA-containing endosomes. Kiru (Mulligan et al. (1993) Science260: 926; Wagner et al. (1992) PNAS89: 7934; And Christiano et al. (1993) PNAS90: 2122).   For example, using the hematopoietic gene construct described above, a polycation such as polylysine Containing a stem cell receptor ligand (eg, Sl factor) conjugated to Transfecting hematopoietic stem cells using an inducible polynucleotide carrier Can be. To further explain, the gene delivery system is used for c-kit expressing cells, for example, human It can be specifically targeted to hematopoietic progenitor cells. The above c-kit protein is S tyrosine kinase receptor for factor l and reconstructs all hematopoietic lineages Expressed on pluripotent stem cells. Furthermore, c-kit expression is restricted to stem / progenitor cells As a result, except for expression in mast cells, Is not expressed. In one illustrative embodiment, the expression vector for the hematopoietic gene is Polylysine (PL) covalently linked to streptavidin and shared with adenovirus It is contractile by electrostatic force with the bound PL (to achieve endosomal lysis). Up When a biotinylated Sl factor is added to the vector-PL conjugate described above, To associate with vector-PL conjugate via leptavidin-biotin interaction become. Using such constructs, hematopoietic stem cells can be transformed with hematopoietic gene constructs. It can be targeted for transfection. For example, U.S. Pat. No. 0 and Schwarzenberger et al., Blood (1996)87 (2) : 472-478. One advantage of the PL-vector constructs described above is that the Transfections can be performed, but the committed hematopoietic cells have c- Resistant to transfection process due to lack of kit. This one Another advantage of the method is that it has a highly efficient receptor-mediated Dcytosis, a physiological pathway for macromolecule uptake that is not related to cytotoxicity Derived from the fact that they rely on the road.   The subject hematopoietic gene constructs may be DNA transfected or described extensively above. Virus-mediated transduction for efficient transfer into stem cells You. In vitro culture systems for stem cells known in the art are useful for genetic engineering. Provide a usable model. Possible transduction methods include stem cell and virus production Direct co-culture of cells (eg, Bregni et al. (1992) Blood)80.See: 1418-1422 ), But is not limited thereto. Alternatively, obtained from virus-infected cells Isolate supernatant and apply to stem cell cultures under conditions suitable for infection of stem cells be able to. For example, Su (Xu) et al. (1994) Exp. Hemat.twenty two: 223-230; and Hughes et al. (1992) Clin. Invest.891817. Then get Repaired transduced cells by growing them under similar conditions to unmodified stem cells. Decorated stem cells appear to be expanded and differentiated.   In yet another embodiment, the hematopoietic gene is homologous recombination with genomic DNA. Using a "gene activation" construct that alters the transcriptional regulatory sequences of the endogenous form of the gene Can be expressed ectopically. For example, the gene-activating construct is LH-2 A gene's endogenous promoter can be replaced by a heterologous promoter, such as a constitutive expression of a gene. Inducible or induced under conditions that are different from the normal expression pattern of the gene It can be replaced with a heterologous promoter that causes expression. Gene activation construction A wide variety of object formats are available. For example, transcariotic Rapies Inc. (Transkaryotic Therapies, Inc), PCT published WO 93/09222, See WO95 / 31560, WO96 / 29411, WO95 / 31560 and WO94 / 12650.   In a preferred embodiment, the nucleotide sequence used as the gene activation construct The columns are (1) the endogenous inducer gene (exon sequence, intro DNA obtained from a certain portion of the DNA sequence, promoter sequence, etc.) and (2) Functionally linked to genomic gene coding sequence by recombination of gene activation construct Heterologous transcription control sequence (s) . For use in producing factor-producing cell cultures, the above-described constructs comprise the genome D of the cell. It should further include a reporter gene that detects the recombinant construct present in the NA. Can be.   The gene activation construct is inserted into the cell and is functionally linked to the native gene. Integrated into the genomic DNA of the cell at a location that provides a combined heterologous regulatory sequence. You. Such insertions result from homologous recombination. That is, endogenous inducer inheritance The recombination region of the activation construct, which is homologous to the promoter sequence, forms a hybrid with genomic DNA. Constructed and recombined with the genomic sequence, the construct constructs the corresponding genomic DNA. Taken in position.   The term “recombination region” or “target sequence” is substantially identical to a genomic gene sequence Or has a substantially complementary sequence, for example, the 5 ′ Includes a homology between the genomic sequence and the target transgene construct Refers to a fragment (ie, a portion) of a gene activation construct that can promote genetic recombination.   As used herein, the term "replacement region" refers to the region between the recombination region and the genomic sequence. Construction that becomes integrated at an endogenous chromosomal location by homologous recombination of A part of an object.   For example, a heterologous regulatory sequence provided in a replacement region may include a promoter (e.g., Promoter or inducible promoter), enhancer, locus regulatory region, One or more of a variety of elements including a transcription factor binding site or a combination thereof Can contain more. To control target gene expression in vivo Possible promoters / enhancers include cytomegalovirus (CMV) Lomotor / Enhancer (Karasuyama et al., 1989, J. Exp. Med.,169: 13) G-actin promoter (Gunning et al. (1987) PNAS84: 4831-4835), mouse Long terminal repeat (MMVT LTR) of breast cancer virus (Klessig et al. (1984) Mol . Cell Biol.Four: 1354-1362), long terminal repeats of Moloney murine leukemia virus. Column (MuLV LTR) (Weiss et al. (1985) RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor  Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) Glucocorticoid-inducible promoter, SV40 early or late region promoter ー (Bernoist et al. (1981) Nature290: 304-314; Templeton et al. (1984) Mol. Cel l Biol.,Four: 817; and Sprague et al. (1983) Virol.,45: 773), Rous sarcoma ui Promoter (Yamamoto et al.) Contained in the long 3 'terminal repeat of Rus (RSV). , 1980, Cell,twenty two: 787-797), herpes simplex virus (HSV) thymidine quina Rose promoter / enhancer (Wagner et al. (1981) PNAS82: 3567〜3571) And herpes simplex virus LAT promoter (Wolfe et al. (1992) Nature Gene tics,1: 379-384), but not limited thereto. IV. Cell source   Those skilled in the art will appreciate that the subject methods may be in vivo or ex vivo (eg, cells It will be appreciated that any of the embodiments can be performed in culture. Hematopoietic genes In vivo delivery of the construct is performed using any of a variety of gene therapy techniques be able to. In ex vivo applications, genetically modified stem cells are first cultured Must be isolated in feed. Multiplier for isolating embryonic stem cells and / or hematopoietic stem cells Such protocols are well known in the art. Charges used in the subject method A representative stem cell culture is described below. A. Hematopoietic stem cell isolation   Hematopoietic stem cells (HSCs) are derived from bone marrow (adult and fetal), mobile peripheral blood (MPB), cord blood and And / or isolation from a mammalian source, including but not limited to fetal liver Can be. In a preferred embodiment, the HSCs are cultured in vitro for hematopoietic gene constructs. And from the subject into which the stem cells are transplanted after transduction.   The cell source of the present invention can be a non-human mammal in addition to a human. This In the art, various techniques for isolating both embryonic stem cells and hematopoietic stem cells from non-human animals have been developed. The protocol is known. See, for example, Wheeler U.S. Pat. No. 23,226, title of invention "Transgenic pig composition and method" and Emery -(Emery) et al., WO 95/13363, entitled "Hematopoiesis derived from porcine cord blood" Stem cells and uses thereof ”. Preferred non-human animals include rodents, non-human primates, Vertebrate animals such as sheep, dogs, cows and pigs are included. The term "non-human mammal" "Refers to all members of the mammalian class except humans.   If the intended use of the resulting hematopoietic cells is for transplantation in human patients, trans Cells derived from a transgenic animal can be used, for example, in humans for xenograft transplantation into human subjects. It can be used as a source of "typed" hematopoietic cells. For example, Sachs s) et al. in PCT Publication WO 96/06165, entitled "Genetically Engineered Pig Cells" As described, this technique can be used, for example, to transplant donor stem cells in the environment of a recipient. Or the desired interaction between donor and acceptor molecules and cells to promote function. Provided is a transplant of porcine donor cells that have been engineered to enhance the effect. Explain The cells are then involved in the transplantation and / or maintenance of human adhesion molecules, eg, hematopoietic cells. It can be manipulated to express adhesion molecules. Examples of human adhesion molecules include VL A-4, c-kit, LFA-1, CD11a, Mac-1, CR3, CD11b, p150, p95 , CD11c, CD49a, LPAM-1, CD49d, CD44, CD38 and CD34 included. Transgenic cells can be a donor cell, for example, a rejection of a donor transplant cell. Between the receptor molecule and the cell to promote or block the function of the donor transplant cell It can also be manipulated to minimize unwanted interactions. For example, The donor cell is a transgenic cell expressing one or more human MHC polypeptides. It can be derived from sgenic animals.   Bone marrow cells are derived from the iliac bone (eg, from the hipbone through the iliac crest), tibia, femur, spine or Can be obtained from bone marrow sources, including but not limited to other bone lumens Wear. Other sources of stem cells include embryonic yolk sac, fetal liver and fetal spleen, It is not limited to these.   For the isolation of bone marrow, a suitable solution, for example, a low concentration, generally about 5-25 mM tolerable Along with possible buffers, for example, fetal calf serum (FCS) or other natural factors The bone can be washed off quickly using a salt solution supplemented with. Convenient buffer Include HEPES, phosphate buffer and lactate buffer. If not, bone The marrow can be aspirated from the bone according to conventional techniques.   Methods for transferring stem cells to peripheral blood are known in the art, and Specifically, chemotherapeutic drugs, sirtokines (eg, GM-CSF, G-CSF or IL) 3) or a combination thereof. Typically, the total white blood cell count When leukemia reaches 500-200 cells / l and platelet count or 50,000 / l, total leukemia Initiate blood donation of sphere components.   Using a variety of techniques, cells are sorted by first removing lineage progenitor cells. Can be released. Monoclonal antibodies may be of particular cell lineage and / or differentiation stage. Particularly useful for the identification of floor-related markers. This antibody is attached to a solid support And can be roughly separated. The separation technique used depends on the fraction to be collected. It must maximize survival. Different technologies of different effectiveness Can be used to “relatively coarse” separation. In such a separation, Up to 10%, usually at most about 5%, preferably At most about 1% can remain with the cell population to be retained. Features used Other techniques include separation, associated cytotoxicity, ease and speed of performance, and sophisticated equipment. And / or the need for technical skill.   The use of separation techniques involves physical properties (density gradient centrifugation and AC centrifugation elutriation), Cell surface characteristics (lectin and antibody affinity) and virus staining characteristics (mitochondria Includes those based on the difference between the binding dye rho123 and the DNA binding dye Hoechst33342) But not limited to these. The separation method uses antibody-coated magnetic beads. Separation method, affinity chromatography, binding to monoclonal antibody Or cytotoxic agents used with monoclonal antibodies (including complement and cell Toxins), and solid matrices such as "Panning" with antibody bound to the rate, elutriation or any other Including, but not limited to, the following advantageous techniques: Techniques that provide precise separation Surgery can have various sophistications, for example, multiple color channels , Low angle and obtuse angle light scattering detection channel, impedance channel, etc. Includes, but is not limited to, FACS that may be included.   Most of the differentiated cells can be removed using a relatively coarse separation first. Where there are only small populations such as megakaryocytes, mast cells, eosinophils and basophils. Instead, the major cell population lineage of the hematopoietic system, such as lymphocytes and bone marrow monocytes, is removed. Typically, at least about 70-90 percent of the hematopoietic cells will be removed. Desired If necessary, use Ficoll-Hypaque Separation to perform a pre-separation to remove red blood cells can do.   Comprehensive separations include magnetic beads, cytotoxic agents, affinity chromatography Or known in the art, including but not limited to panning It can be achieved using methods. All antibodies found to be used include If not, it allows removal of most mature cells, but is not present in stem cells. Antibodies against non-lineage specific markers.   Cells working simultaneously with or after comprehensive separation providing positive selection Negative selection using lineage specific marker antibodies present in You. In most cases, these markers are CD2-, CD3-, CD7-, CD8-, C D10-, CD14-, CD15-, CD16-, CD19-, CD20-, CD33- and Including but not limited to lycophorin A; preferably at least CD2- , CD14-, CD15-, CD16-, CD19- and glycophorin A. But usually includes at least CD14- and CD15-. As used herein, Lin lacks at least one lineage-specific marker. Cell population. Then, the cells in which the cells you are working on are substantially depleted The blood cell composition is further separated using a marker for Thy-1 to provide substantially homogeneous A stem cell population can be achieved. A representative example of this stem cell population is CD34 + Thy-1 + Lin- population, and this provides a composition rich in stem cells. Subdivision of CD34 + cells has been reported and other markers that further enrich stem cells CD38-, rhodamine lo, c-kit receptor, HLA DR lo /-, C D71 and CD45 RA- include, but are not limited to. Giu (Giu sto) et al. (1993) Blood84: Fetal tissue and navel as described in 421-432 In the band, the stem cells are very enriched in the CD34 hiLin- population.   Purified stem cells show low side scatter and low to moderate forward scatter in FACS analysis. It has a lofil. Cytospin preparations produce rich stem cells. It indicates that the size is between mature lymphoid cells and mature granulocytes. Cells are light Selection can be based on scattering properties as well as expression of various cell surface antigens.   Although the particular order of separation is not believed to be critical to the present invention, A preferred order is preferred. Preferably, the cells are first separated by a coarse separation method, followed by: Positive selection with markers associated with stem cells and with markers associated with lineage progenitors Separate by precise separation with negative selection.   Compositions that are very rich in stem cells can be achieved in this way. Place The stem cells of interest have been embodied in a population having the CD34 + Thy-1 + Lin- phenotype, Can provide cell regeneration and development of all members of the various hematopoietic lineages You.   Choosing a negative lineage selection with a lineage-specific marker results in a more enriched stem cell B indicates that it is obtained from bone marrow. Most CD34 cells migrating to peripheral blood Do not express lineage-specific markers, so in peripheral blood It is not significantly enriched more than the CD34 selection. Move with Thy-1 + selection Stem cells are enriched in both peripheral blood and bone marrow.   Fetal or neonatal blood is also a source of the hematopoietic stem cells and progenitor cells of the invention.   Fetal blood can be obtained by any method known in the art. example For example, fetal blood can be collected using ultrasound-induced needles (Daffos et al. (1985) Am. J. Obst et Gynecol153: 655-660; Daffos et al. (1983) Am. J. Obstet Gynecol.146: 985 ), Placental puncture (Valenti, C. (1973) Am. J. Obstet Gynecol.115: 851; Cao et al. ( 1982) J. Med. Genet.19: 81), fetal examination method (Rodeck, C.H. (1984) Prenat al Diagnosis, edited by Rodeck, C.H. and Nicolaides, K.H., Royal College of Obs from the fetal circulation of the placental root by tetricians and Gynaecologists, London) Can be collected.   In a preferred embodiment of the present invention, the neonatal hematopoietic stem cells and progenitor cells are cord blood and And / or from placental blood. Umbilical cord blood or placental blood as a source of hematopoietic cells Its use offers a number of advantages. Umbilical cord blood easily and shock to donor Can be obtained without giving. Currently, in contrast, bone marrow cell harvesting is It's an expensive and shocking experience in terms of time and money. Cord blood, if needed The cells can be used for autologous transplantation and most of the histocompatibility complex Or only partially fits most of the complex Use of allogeneic cells that are only partially compatible with a small number of complexes The usual hematological and immunological problems involved are reduced.   Harvesting must be done under sterile conditions. Immediately after collection, newborn or Fetal blood must be mixed with an anticoagulant. Such anticoagulants include C PD (citrate-phosphate-dextrose), ACD (citrate-dextrose) ), All Seaver solution, De Gowin's solution, Edgulgate-Mg (E dglugate-Mg), Rous-Turner solution, other glucose mixtures, Heparin, ethyl biscoumacetate, etc. Can be any known in the art, including but not limited to (Hurn, B.A.L., 1968, Storage of Blood, Academic Press, New York, 26-1 See page 60). B. Isolation of embryonic stem cells   The system of the present invention allows ES cells to differentiate in culture and in vivo and generate hematopoietic cells. For example, based on the ability to repeat hematopoiesis. In previous studies, ES The vesicles have been shown to differentiate in culture and develop numerous hematopoietic lineages. However, in most of these studies, the extent of hematopoiesis has been limited and Due to variability, the exact kinetics of hematopoietic differentiation is unpredictable or almost specific It has not been. Using the subject method of the present invention, hematopoietic stem cells may be hematopoietic, such as LH-2. It can be generated by ectopic expression of a gene. The advantage of such a system is It is twice. First, with the development of this system, cells at all stages of differentiation are available, This system can be operated. Second, the use of ES cell-based in vitro systems And homologous recombination without encountering embryonic lethality Inactivation by means of a variety of genes allows the study of the function of a wide range of genes.   Embryonic stem cells are described in Weiss et al. Clinical Inves97: 591-595; And Doetschman et al. (1985) Embryol. Exp. Morphol.87: 2 Generated using methods well known to skilled technicians as described by 7-45. Forced and maintained. Although any lineage of ES cells can be used, The lineage selected is typically selected for the ability of the cells to differentiate into embryoid bodies (EBs). And then the EBs are involved in the hematopoietic lineage, eg, erythroid, lymphoid, myeloid lineage. Be bundled. Thus, human or non-human sources that seem to have the above potential Any ES cell line is suitable for use in the present invention. Typical for ES cell production As a typical example of one mouse strain used in the above, 129J strain, for example, the following Examples There is a cell line CCE used in. Yet another preferred mouse cell line is a cell line. Cell line J1. Other ES cell lines include D3 (American Culture Collection, Catalog No. CKL 1934) and WW6 cell line (Ioffe et al. (1995) PNAS92: 7357-7361) included.   ES cells were obtained from Robertson (Teratocarcinomas and Embryonic S tem Cells: A Practical. Approach, E.J. Edited by Robertson, IRL Press, Washint DC [1987]); Bradley et al. (1986) (Current Topics i n Devel. Biol.20: 357-371); and Hogan et al. (Manipulating the Mo use Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, d Listed by Cold Spring Harbor, New York [1986] Such cells are cultured using a method well known to a skilled technician. As one explanation, E S cells comprise Sl factor (membrane bound or soluble form), leukemia inhibitory factor (LIF) and A support layer in the presence of a growth factor selected from fibroblast growth factor (FGF), eg For example, grown in vitro with or without embryonic fibroblasts and subcultured can do. See, for example, U.S. Patent No. 5,453,357. Increase proliferation and differentiation The concentration of these factors ranges from 0.5 to 500 ng / ml, preferably from 10 to 20 ng / ml. be able to. From ES cells to embryoid bodies (EBs) and many cell types, such as Differentiation into blood, endothelium, muscle and nervous lineages is performed using a number of standard techniques known in the art. (Reviewed in G. Keller, Current Opinion: 862-869). G. MCB such as Keller13 (1): 473-486).   The most frequently used techniques for the differentiation of ES cells simply refer to these cells as feeder cells. From the contact or the presence of LIF, and remove them from the liquid in a bacterial-grade Petri dish. Culturing in a body or a medium containing methylcellulose. Under these conditions, Since ES cells cannot adhere to the Petri dish surface, EBs formation is enhanced. this A modification of the method that maximizes the differentiation of ES cells to hematopoietic lineages was performed on stromal cells. Are involved in culturing these cells, and the stromal cells are When generated in EBs, they provide a supportive environment for hematopoietic cells. Stromal cell culture method The method is described extensively in the section below on the expansion and differentiation of genetically modified cells. EB Once s are formed, they can be separated into a single cell suspension. Departure The generated EBs can be assayed at various stages of development for the presence of a particular cell population. Can be. For example, to determine the hematopoietic progenitor population, Hematopoietic lineage can be tested by seeding EB-derived cells in Wear. Specific description regarding the precursor cell assay is provided in the Examples below. simply In other words, single cell suspensions of EBs have been described by Keller et al. Colony forming cell-culture (CFC-c) assay for precursor content And asse I can do it. This method is referred to below as the precursor assay. Some Means that EB-derived cells are specific cell surface antigens (eg, immunoglobulins Immunocytochemistry or the presence of It can be analyzed by FACS analysis. Most of the differentiation potential of these cells A rigorous test relates to the ability of the isolated EB cells to re-establish the recipient animal's hematopoietic system. ing. Cell surface antigen detection and transplantation protocols are described below under “Genetically Modified In the section entitled "Expansion and Differentiation of Isolated Cells." V. Proliferation and differentiation of genetically modified stem cells   In general, the stem cells used for transfer are either before or after modification with the hematopoietic gene construct. Thus, cultivation can be performed by standard protocols known in the art. example The cells can be used in specific or serum-derived cultures alone or in It can be cultured as a co-culture with a feeder cell layer such as a nutrient system. The isolated stem cells are It can be cultured in the minimum essential culture medium supplemented with Qing and antibiotics. Available culture media Are described, for example, in Hanks. McCoys, RPMI1640 minimum essential culture solution (M EM) etc. and contains 1% to 20% serum. Extracellular factors that can be added And cytokines are described in the stem cell proliferation and differentiation section below. Mainly in complex culture While the subject stem cells can grow, it is necessary to activate certain progenitor populations in culture. For more precise control, the cells were placed in Dulbecco's minimal essential medium (D It is generally preferred to keep it in a simple culture medium such as MEM).   Cells can be cultured in any suitable culture, such as 12 or 24 well microplates 5% COTwoTypical for cells isolated from the same animal, such as at 37 ° C The culture conditions.   In yet another embodiment, the modified stem cells are a supportive cell that secretes an inducing factor. The culture can be performed on a cell layer or a polymer layer containing an inducer. Preferred In a preferred embodiment, the cells are grown in a stromal cell co-culture system. For example, De (1993), Crit Rev Immunology, 1 3: 115-150. Substrate cells are the physical matrix where stem cells reside And / or membrane contact signals that can enhance stem cell proliferation and differentiation. Or it is thought to produce hematopoietic growth factors. Various different substrate culture systems Is available. Generally, the modified stem cells are cultured on the substrate layer, and the non-adherent cells are Isolate for inversion, transplantation or other uses.   In an exemplary embodiment, the subject stem cells are Dexter and Researcher (Dexter et al. (1977) J Cell Physiol, 91: 335, and Dexte et al. (1979) Acta Haematol, 62. : 299) can be supported in the long-term culture solution. Text from people It is relatively easy to establish a long-term culture of er. However, with mouse medullary cells In contrast, hematopoiesis in human Dexter culture was previously limited to about 2-3 months. Was. The modified human stem cells of the present invention significantly extend the life span in Dexter culture It is predicted.   Another substrate layer that can be used to support the modified human stem cells of the present invention is bone marrow endothelium. Derived from cells. For example, PCT published by Asch et al., WO 96/00779. checking ... Bone marrow endothelial cells are tubular fragments containing needles containing bone marrow aspirate Is isolated by a process involving The marrow needles are recovered from the marrow and the protein Digest to enzymes. Recovering microtubular fragments from the digested needles, This fragment is grown as an explant to form bone marrow endothelial cells.   In addition, a variety of mammalian stromal cell lines are available on which immediate stem cell It can be used to create a confluent cell layer on which an article can be cultured. Typical human matrix cells The lines include KM-102, SV-MSC, ST-1, SCL and H-7 cell lines (See, eg, Deryugina et al., Supra).   In another embodiment, the Matrigel layer or the like induces the expansion of a population of stem cells. Can be used to Matrigel (Collaborative Research) , Inc. , Bedford ", Mass. A) matrix and mouse basement membrane It is a complex mixture with linked substances derived as an extract of protein, Laminin, Collagen IV, Heparin Sulfate Priteoglycan and Nidogen Entactin is derived from Kleinman et al. ("The biologically active basement membrane complex"). Combination "Biochemistry, Vol. (1986), pages 312-31 Prepared from EHS tumors as described in 8). Like Humatrix Other types of such matrices can be provided.   Similarly, cells from both natural and recombinant technologies are provided as a support layer for immediate culture. Is possible.   Still other culture systems include US Pat. No. 5,478,739 to Slivka et al. And a three-dimensional substrate cell and tissue culture system.   In another embodiment, the stem cells of the present invention are, for example, I1-3, LIF, G- "Substrate-free" cell culture medium supplemented with cytokins such as CSF and SCF It can be cultured in the body. U.S. Pat. No. 5,523,286 to McGlave et al. As described in, Stem Cells Are Substrate-Induced Anionic In Combination With Cytokin Can be co-cultured with fractions. According to this method, this anionic fraction Is to perform an ion exchange chromatography on the aqueous culture solution under the substrate cell conditions, Isolation of an anionic glycoprotein fraction having 200 kD or more It is prepared by a process consisting of This viable anionic fraction is May consist of a mixture of glycoproteins, including proteoglycans . B. Differentiation factor   Hematopoietic stem cell differentiation process and growth factor dependence are well documented in this area . Pluripotent HSCs, based on their origin and stage of differentiation, Gains and loses antigenic characteristics and responsiveness to it (Figure 1). The genetics of the present invention Modified stem cells are sensitive to their growth factor sensitivity and expressed cell surface antigens In, characteristics can be clarified. FIG. 1 illustrates the characterization of multipotent HSCs. Teaches the incorporation of the bone marrow or lymph progenitors described in the present invention into a method of differentiation. You.   For example, combinations of well-known hematopoietic factors such as extracellular factors and It can be added to stem cell cultures and changes in cell sensitivity, such as signal transduction Changes in growth and differentiation of cells and / or cells can be assayed. Available factors Include, but are not limited to, erythropoietin (EPO), thrombopoietin, Granulocyte / macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), granulocyte colony   Stimulating factor (G-CSF), macrophage colony stimulating factor (M-CSF), Interleukin 1-12 (IL-1 to IL-12) and stale factor (S F). Of particular interest are LIF, stell factor, erythropoie Chin, IL-3, TL-6, GM-CSF and G-CSF. These factors Can be added alone or in any combination. Applied factors may be natural For example, it may be synthetically prepared recombinantly, may be human, may be a mouse, etc. It may be a non-human factor. The amount of the factor generally ranges from about 1 ng / ml to 100 ng / ml. Generally speaking, the concentration of the steal factor is about 1 to 1 00 ng / ml, for LIF the concentration is about 1 ng / ml to 100 ng / ml , More usually in the range of about 5 ng / ml to about 30 ng / ml, for IL-3 the concentration From about 5 ng / ml to 500 ng / ml, more usually from about 5 ng / ml to 10 ng / ml. 0 ng / ml, for IL-6 the concentration is about 5 ng / ml to 50 ng / ml, More usually in the range of about 5 ng / ml to 20 ng / ml, with erythropoietin Is a concentration in the range of about 1 unit ng / ml to 10 units / ml, and the concentration is GM-CSF. Is generally about 5 ng / ml to 50 ng / ml, more usually about 5 ng / ml. 20 ng / ml.   In one embodiment, the stem cells are optionally expanded before or after transduction . During growth, these growth factors are used during the initial stages of stem cell growth and proliferation, usually less. For at least 24 hours, more usually at least between 48 hours and 4 days Or may be retained throughout the growth process.   Transduce stem cells without pre-growth or continuous growth in clinical settings Is preferred. Thus, in one embodiment, stem cells are cultured in a suitable culture medium. The cells were cultured in the presence or absence of Tokin, and transduced with an appropriate vector. Incubate and reintroduce into host.   In addition, monoclonal or polyclonal antibodies can be used to It is possible to identify cell surface antigens associated with the origin and / or stage of differentiation You. For example, cell surface antigens of the following origin can be traced. CD3 Pluripotent HSCs, such as cells with a 4+, CD38-antigenic phenotype, are You can be continuously restricted (specifically disconnected) to the body, for example burst -Forming unit erythroblasts (BFU-E) are transformed into colony-forming unit erythroblasts (CFU-E) Burst-forming unit megakaryocytes (BFU-Meg) are colony-forming unit megakaryocytes (BFU-Meg). CFU-Meg), colony-forming unit granulocyte-monocyte (CFU-GM) Knee-forming unit eosinophils (CFU-Eo) or colony-forming unit granulocytes-erythroblasts ball -Megakaryocyte-monocyte (CFU-GEMM). Or multi-division HSCs are derived from lymphoid sources, such as those from which T- or B-cell progenitors develop. You will be able to continuously limit (specifically cut) your body. C.   Characterization and isolation of genetically modified hematopoietic stem cells   To characterize and isolate genetically modified stem cells or their differentiated products Various technologies can be applied. Preferred isolation techniques minimize cell killing where possible This is a technique for obtaining results. For example, isolation of a particular differentiated cell population Of specific cell markers using separation techniques or fluorescence activated cell sorting (FACS) This can be achieved by relying on expression patterns.   To further illustrate, a monoclonal antibody may be derived from a particular cell origin and / or Identify markers (surface membrane proteins such as receptors) associated with the stage of activation It is particularly useful for Procedures for isolating cells of a particular hematopoietic phenotype include stem cell culture. Magnetic separation using antibody-coated magnetic beads as described above for nutrient isolation By affinity chromatography, antibody attached to a solid matrix such as a plate " Techniques such as "panning" or other convenient techniques. One technique offered is fluorescence-activated cell sorting, which involves multiple hue channels, low Changes the degree of complication such as angular light scattering detection channel and impedance channel. Can be obtained.   Magnetic beads allowing direct separation, avidin or strep bound to support Biotin that can be removed by tabidin, full that can be used by fluorescence-activated cell sorting Conjugate antibodies to markers such as olochromus to facilitate isolation of specific cell types It is convenient. Uses all techniques that are not unduly detrimental to cell viability I can do it.   Upon isolation, the cells can be further characterized by the following procedure. Against growth factors Sensitivity: expression of specific gene: antigenic marker on the surface of the cell: and / or Is the basic form. The degree of growth factor sensitivity, for example, the concentration range of sensitive growth factors, Maximum and minimum responses, sensitive other growth factors and conditions characterize hematopoietic cells Available for In addition, isolated progenitor cells can be committed to specific origins. Characterization can be revealed by the expression of the gene known to mark the event.   This technique provides various assays to determine whether a stem cell is a hematopoietic stem cell. You. The most stringent experimental criteria for hematopoietic stem cells are those of lethally irradiated animals. The ability of this cell to rebuild the whole blood system. The most widely accepted of human HSCs The assay that is used is the "long-term culture-initiating cell" (LTC-IC) assay, which Culturing bone marrow cells for 5 weeks and then plating these cells in a semi-solid medium Analysis of the potential generated by live cells by means of Eaves et al. (1991) J. Am. Tiss. Cult. Meth. 13: 55-62). Semi-solid After 14 days in shape media, all cell-derived colonies have begun long-term culture. At this point, if multipotent self-renewing cells are present, they can be detected. LTCIC In assays, typically highly enriched stem cell populations range from 1/20 to 1/100 , Preferably at least 1/50 of the LTCIC frequency. Long-term planting Animal models of potential include the SCID-hu bone model and the fetal sheep model. Le. For an overview, see Surour et al. (1992); Hematoth er, 1: 143-53. D. Pharmaceutical preparation of cells   Another aspect of the invention is that the cell component comprises a genetically modified subject stem cell or The present invention relates to a cell composition containing a substantially pure preparation of the product. Details of the present invention The vesicle composition not only contains a substantially pure population of stem cells, , Metals, coenzyme components, and some of the cells may be responsible for the subsequent differentiation of the isolated stem cells of the invention. Cell culture components such as culture media containing a small population of non-stem cells You. Furthermore, other non-cellular components include cell components under specific circumstances such as in-planting and continuous culture. Also included are components that make the material suitable for support.   As will be described in detail herein, common administration of a stem cell of the present invention to a subject, particularly a human subject The method of the present invention involves the injection or implantation of cells into the target site of the subject. Cells into a release device that facilitates the introduction of cells into the subject by injection or implantation. Can be inserted. Such release devices include cells in the mother of the receiving subject. And a tube such as a catheter for injecting a fluid. Preferred illustration The tube then allows the cells of the invention to be introduced into the subject at a predetermined location. It has a needle such as a syringe. The stem cells of the invention can be used as syringes of various shapes. Can be inserted into such a release device. For example, when cells are placed in such a release device Allows the cells to be suspended in solution or embedded in a support matrix. here The term "solution" as used in refers to a pharmaceutically acceptable cell that retains the ability of the cells of the invention A carrier or diluent is included. Pharmaceutically acceptable carrier or dilution Agents include saline, aqueous buffer solutions, solvents and / or dispersion media. this Such carriers or diluents are well-known in the art. solution Is preferably sterile and fluid to the extent that easy syringability exists. Preferably Is stable under the conditions of production and storage; for example, parabens, chlorobutano Bacteria, phenol, ascorbic acid, thimerosal, etc. And preserved against the contaminating action of microorganisms such as fungi. The solution of the invention is here Use a pharmaceutically acceptable carrier or diluent and optionally a stem cell as described in Can be prepared by mixing with the other ingredients listed above and then sterilizing by filtration.   The support matrix into which stem cells can be contaminated or implanted is subject compatible. And matrices that break down into products that are not harmful to the subject. Natural and And / or synthetic biodegradable matrices are examples of such matrices. You. Natural biodegradable matrices contain coagulated blood, such as those derived from mammals. Leopard and collagen matrices. Synthetic biodegradable matrix Examples include synthetic polymers such as polyanhydrides, polyorthoesters and polylactic acid. I can do it. Other examples of synthetic polymers and the incorporation of cells into these matrices or Embedding methods are known in the art. For example, US Pat. See, U.S. Patent No. 5,308,701. these The matrix provides support and protection for fragile stem cells in vivo, and It is in a preferred form for introduction into a subject receiving cells. VI. Typical uses of stem cells   The genetically modified stem cells and their products of the present invention can be used in various applications it can. These include, but are not limited to, in vivo implantation or transplantation of engineered cells, Screening of cytotoxins, allergens, growth / regulatory factors, drug compounds, etc., ex vivo Elucidation of the mechanism of all disease types, research on the mechanisms by which drugs and / or growth factors operate And the production of biologically active products, to name a few.   For example, the invention relates to 1) the treatment of all cancers given radiation or chemotherapy; Treatment for autoimmune diseases by replacing lymphocytes 3) Species Viable treatment for various hereditary or acquired anemias; 4) the patient's own non-infected stem cells; Proliferation of a small number of cells may replace HIV-infected parts with healthy cells Drugs for treating diseases requiring bone marrow transplantation, such as AIDS, if any To provide substantially pure stem cells that can be used as A. Drug screening   The engineered stem cells of the present invention can be used in vivo, including cytotoxins, growth / regulators, drugs, etc. Of a wide variety of compounds. For this purpose, cultures can be transferred in vitro. And expose to the compound for testing. The activity of cytotoxic compounds damages cells in culture It can be measured by its ability to scratch or kill. Due to vital staining techniques, this is Can be easily assessed. The effects of growth / regulatory factors include total and discriminatory cell numbers. It can be assessed by analyzing the cell content of the culture. This is the type specificity Standard cytotoxins, including the use of immunocytology techniques that utilize antibodies to define cellular antigens And / or histological techniques. Assess the effect of various drugs on cells it can. For example, agents that increase red blood cell formation can be tested. B. Transplant   Five broad categories of diseases that can be treated by injecting stem cells include, but are not limited to: -There is. The first arises from the loss or failure of normal blood cell production and maturation. (I.e., aplastic anemia and hypoproliferative stem cell disease). The second group is And neoplastic malignancies of the hematopoietic organs (eg, leukemias and lymphomas). Illness The third group of diseases is the disease of patients with a broad spectrum of malignant hard tumors of non-hematopoietic organs including. Infusion of stem cells into these patients served as a bone marrow rescue procedure, Otherwise, it is given to patients who are followed by lethal chemotherapy or irradiation for the malignancy. Illness The fourth group of diseases consists of an autoimmune state, in which stem cells are a source of replacement for the abnormal immune system. Play the role of. The fifth group of the disease is the hematopoietic stem that received gene therapy before transplantation. For some genetic diseases of cells, preferably syngeneic, which can be corrected by injection . Specific hematopoietic reconstitution with neonatal stem and derived cells can be treated Diseases and disorders include, but are not limited to, those described below. Normal blood liquid Diseases that result from a defect or failure in cell production and maturation, including: Proliferative Stem Cell Disease: Dysplasia Anemia: Pancytopenia: Granulocytopenia: Thrombocytopenia: Erythropoiesis: Blackfan-Diamond Syndrome: Irradiation or Infection Due to unknown disease name. Hematopoietic malignancies include: acute lymphoblastic (lymphocyte) leukemia : Chronic lymphocytic leukemia: Acute myeloid leukemia: Chronic myeloid leukemia: Acute malignant bone marrow Sclerosis: Multiple myeloma: Polycythemia vera: Altered myeloid alteration Formation: Giant macroglobulinopathy of Waldenstrom: Hodgkins lymphoma: Non-Hodgkins lymphoma. Immunosuppression in patients with malignant solid tumors includes: . : Malignant melanoma: Gastric carcinoma: Ovarian carcinoma: Breast carcinoma: Small cell lung carcinoma: Retinoblast Tumor: Testicular carcinoma: Glioblastoma: Rhabdomyosarcoma: Neuroblastoma: Irving sarcoma: Li Nampa. Autoimmune diseases include: : Rheumatoid arthritis: Diabetes type 1: Excellent Hepatitis: Multiple sclerosis: Tissue lupus erythema. Genetic (congenital) diseases include: Including: anemia: familial dysplasia: Fanconi syndrome: Bloom syndrome: pure red blood cells Cell Dysplasia (PRCA): Congenital Cachexia: Blackfan-Diamon Syndrome, congenital dysfunction syndrome I-IV, Schwashman-Diamond syndrome Group, dihydrofolate reductase deficiency: formaminotransferase deficiency: Lesch-Nyhan syndrome: Congenital spherocytosis: Congenital elliptic cell hyperplasia: Congenital stomacytosis: Congenital Rh nullism: Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: G 6PD (glucose-6-phosphatodehydrogenase): mutant 1,2,3: Pyruvate kinase deficiency: Congenital erythropoiesis sensitization deficiency: With congenital sickle cell disease Constitution: Multiple concurrent immunodeficiency (SCID): Naked lymphocyte syndrome: Ionophore-responsive Complicated immunodeficiency: Nucleoside phosphorylase deficiency: Granulocyte actin Deficiency: Infantile granulocytopenia: Gaussian disease: Adenosine deaminase deficiency: Ostemann's syndrome: Reticular dysplasia: Congenital leukocyte dysfunction syndrome. Of the present invention Other diseases that may be treated with hematopoietic cells include osteocalcification, myelosclerosis, and acquired lysis. Blood anemia, acquired immunodeficiency, infectious diseases causing disease, mucopolysaccharide storage disease , Mucolipid storage disease, various diseases involving the immune system, Wiscott-Aldrich If you have the syndrome, alpha1-antitrypsin deficiency.   Allows for more effective purging by treating small volumes of focal medullary mass and subsequent in vitro growth In addition, a three-dimensional culture system is available for a larger volume of purged marrow. Many The side effects of most purging agents are the destruction and division of normal hematopoietic skin cells, Prolonged setting and frequent death of patients from secondary infections. Acute A potent purging agent used for lymphocyte leukemia is 4-hydroperoxyeurolophosph Amide (4HC), which kills malignant cells in base-2 logarithm . In traditional treatment, 500 ml-1000 ml of the diseased marrow is replaced with 4 HCl / ml. Incubate in vitro with 60-100 ng to treat the marrow. Then the pith Are cryopreserved and reinjected into patients 2-3 weeks after clinical chemotherapy. According to the invention Once a significant volume of bone marrow has been taken up, purged with 4HCl, then Proliferates ex vivo in culture, thereby increasing rapid planting time and reducing patient mortality Is possible.   The stem cell cultures of the present invention can destroy healthy bone marrow cells or It is used to treat diseases or conditions that suppress This process involves the bone marrow It is particularly effective in treating metastatic hematopoietic malignancies and other neoplasms. Also of this invention Aspects are environmental factors required by diseases that do not directly affect the bone marrow (eg, , Irradiation, toxins, etc.), chemotherapy and / or radiation therapy can adversely affect the bone marrow It is also effective in treating patients who are receiving it. For example, in this case, from a healthy patient The bone marrow cells are removed, stored and replicated so that the patient can Something that breaks or progresses to a disease that the treatment could harm the bone marrow Then you can re-inject. Patients in need of bone marrow transplantation Has several advantages. If a male or female patient has accepted their cells If this is the case, this is called an original transplant, and such grafts have little chance of being rejected. No. The same transplant removes the main cause of bone marrow transplant rejection, a transplant versus host reaction . If the marrow contains malignant or diseased cells, small samples can be purged more effectively. The stem cells are expanded using the culture system of the present invention. Understood in this field As such, an alternative method of purging malignant or diseased cells is with a small volume of bone marrow cells. Works best. The stem culture system described here makes this feasible. Therefore, the patient A small sample obtained from the elderly using a selection method that kills malignant cells but saves healthy cells. And can be purged more effectively. Then, using the technique of this subject, Cells Can grow in substantial quantities.   According to the present invention, a relatively small volume of bone marrow is collected from a diseased patient and the bone The marrow is destroyed by chemotherapy or irradiation. Then, from this bone marrow sample, Purging diseased cells with a therapeutic agent and transferring the hematopoietic gene construct by the method of the invention. The genetically modified cells are expanded in vitro and then re-administered to the patient You.   In another embodiment, the genetically modified cells of the present invention are AIDS-associated Can be used to treat conditions. Seattle, Was, November 1-5, 1995 Author of the 37th Annual Meeting of the American Hematology Society in Hington. According to the abstracts submitted by the people, "cytopenia is a human immunodeficiency virus (HIV) The common difficult problem of staining is red blood cell formation, lymphogenesis, platelet formation and And it affects a variety of hematopoietic sources, including cell formation and granulation. " Quantification of the source cells of 23 bone marrow aspirates of AIDS by flow cytometry did. The average percentage of CD34 (+) is comparable to that of normal adult bone marrow, Phenotypic analysis of the CD34 (+) population revealed CD34 (+) / CD38 (-), C34 D34 (+) / CD381 (-) CD4 (+) and CD34 (+) 1HY-I Each subset of (+) is sharply reduced compared to normal donors, immature This suggested a significant loss of hematopoietic progenitors. Separation C from HIV-1 patients In vitro functionality of D34 (+) in long-term culture-initiating cell (LTC-IC) assay Analysis showed a large decrease in clonal activity compared to controls. LTC-IC frequency For more accurate quantification of CD34 (+) cells from three patients, Classification was performed by the boundary dilution assay. Assess colony formation in each pit after 5 weeks LTC-IC frequency was calculated using the percentage of negative pits . With this approach, the present researchers have demonstrated that LT34 in CD34 (+)-induced HIV-1 patients The C-IC frequency should be about 7 to 10 times lower than that measured in normal medullary aspirate samples. And discovered. Because many of the normal original progenitors represent CM, PCR techniques should be used. Infection of immature primordial progenitors was studied using colonies of long-term culture induction and CD3 Both in a pure suspension of 4 (+) cells were studied. CD34 of six patients examined (+) HIV-1 DNA is absent in cells and direct virus of immature hematopoietic progenitor Mechanisms other than infection need to explain defective hematopoiesis in HIV-1 infected patients That was shown. These data demonstrate the quantification of immature progenitor cell subsets in AIDS patients. It can be concluded that there is evidence of physical deficiency.   The present invention relates to hematopoietic stem cells that can be used to increase the hematopoietic performance of AIDS patients Provide the source or its product. In a preferred embodiment, the hematopoietic stem cells are Isolate from the patient (or equivalent donor) and, if necessary, Page. Next, the hematopoietic gene construct is transferred to the stem cells by the present method. Raw The cells are grown in culture and implanted in the patient, or Is differentiated into a plurality of hematopoietic-derived substances and implanted in patients. From this explanation, The transfer of stem cells can also be performed in vivo as part of a gene therapy approach. It is clear that C. Modification of stem cells in vivo   In still other embodiments, for example, as part of a gene therapy protocol, Hematopoietic gene constructs can be used to transfer cells in vivo. For clinical setting In addition, hematopoietic gene release systems have been developed by several well-known individuals in the field. It can be introduced into a patient by any of the methods. For example, gene release by intravenous injection, etc. Systematic introduction of drug preparations, and control gene release vehicles and gene expression Cell type or tissue type expression by transcriptional regulatory sequences or combinations thereof Because of the specificity of the transfer provided by Mainly occurs. In other embodiments, when introduced into a localized animal, The initial release of this recombinant gene is more restricted. For example, this gene release The exit vehicle may be a catheter (US Pat. No. 5,328,470) or a tactile injection ( For example, introduced by Chen et al. (1994) PNAS 91: 3054-3057). it can.   The hematopoietic gene release system may be, for example, as a pharmaceutical preparation in an acceptable diluent or Available as part of a slow desorption matrix in which the gene release vehicle is embedded Wear. Alternatively, a complete gene release system can be assembled like a retroviral package. A drug preparation produces a gene release system if it can be completely produced from the transformed cells It can contain one or more cells. In the latter case, the virus package Methods for introducing phage cells can be provided, for example, by rechargeable or biodegradable devices. Provided. In recent years, for the controlled release of pharmaceuticals, including protein and biopharmaceutical systems A variety of slow release polymer devices have been developed and tested in vivo, The device is designed for removal of virus particles by manipulating the polymer composition and shape. Adaptation is possible. Various biota containing both biodegradable and non-biodegradable polymers Using implantable polymers (including hydrogels), cells implanted at specific sites The vesicles can form an implant for sustained release of viral microparticles. The present invention One embodiment is an exogenously purified virus incorporated into a polymer device. Release or virus produced by cells encapsulated in a polymer device Can be used to release fine particles.   Depending on the choice of monomer composition or polymerization technology, the water content, porosity and resulting Transmission characteristics can be controlled. Choice of shape, size, polymer and method for inplantation Can be determined according to the underlying principles of the disease being treated and the individual response of the patient. You. The production of such explants is generally known in the art. For example, D "Concise Encyclopedia of Medical and Dental Materials" by avid Williams (MIT Press: Cambridge, MA, 1990) and Sa bel et al., U.S. Patent No. 4,883,666). Other practices of inplants In embodiments, the cell source producing the recombinant virus is an implantable cavity. Encapsulated in fiber. Pre-spin this and then load the virus source (Aebischer et al., US Pat. No. 4,892,538; Aebi) Scher et al., U.S. Patent No. 5,106,627; Hoffman et al. (1990). ) Expt. Neurobiol, 110: 39-44; Jaeger et al. (19 90) Prog. Brain Res. 82: 41-46; and Aebisch er et al. Biomech. Eng. 113: 178-183) Or co-extruded with fiber polymer around virus packaged cells A polymer coat can be formed (Lim, US Pat. No. 4,391,90). No. 9, Sefton, U.S. Patent No. 4,353,888; Sugamori et al. 1989) Trans. Am. Artif. Intern. Organ 35: 7 91-799; Sefton et al. (1987), Biotechnol. Bioe n g. 29: 1135-1143; and Aebischer et al. (1991), B. iomaterials 12: 50-55). Again, complete the polymer operation Doing so will provide optimal shedding of viral microparticles. D. Factors produced by genetically modified stem cells   A further aspect of the invention is that certain factors, particularly those produced by LH-2 cells, It relates to the identification and ultimate preparation of extracellular factors that play a role in hematopoietic cell proliferation. This LH Autocrine and / or paracrine factors produced by -2 expressing cells Or by known or standard protein purification procedures in the art. Purification is possible.   As described in Examples 3 and 4, ectopic expression of hematopoietic genes such as LH-2 That can induce a renewable phenotype, for example, at least in a paracrine manner. Or produce cells that secrete multiple factors. It is hoped to be bound by a particular theory Nevertheless, this factor, which is still in the conditioned medium, is secreted as a soluble protein. Polypep, which is the extracellular part of the cell membrane protein that has been detached or cleaved off It is noted that it is a tide.   Various methods are used to isolate and purify this inducible factor from the conditioned medium. To examine the nature of this soluble factor in conditioned media, differential sedimentation, molecular sieving Chromatography, ion exchange chromatography, isoelectric focusing, dialysis, gel electrolysis Factors are simply identified by techniques including electrophoresis and affinity / immunoaffinity chromatography. You can release. Fractions that are rich in growth activity are, for example, specific fractions Can be identified using assays based on their ability to cause growth of normal stem cell cultures. Fractions having such a rich activity are simply subjected to, for example, SDS-PAGE. Until a single band result is obtained, it can be further purified by standard methods. Next, the micro distribution Identify genes encoding inducible factors using sequencing and cloning techniques .   If the purpose is to administer to animals or add to cell cultures as an additive, select There are a variety of different compositions of triggering factors to choose from. Suitably the inducer is an example A pharmaceutically acceptable that is substantially inert such that it does not interact with the active ingredient Provided in the carrier. Suitable inert carriers include water, alcohol, Contains ethylene glycol, mineral oil or petroleum keel, propylene glycol, etc. It is.   To prepare the pharmaceutical composition of this invention, an effective amount of the factor Mix well with a chemically acceptable carrier to make one. The carrier is administered It can take various forms depending on the form of preparation desired. This drug group The composition may be a packaged dosage, particularly suitable for administration by oral, rectal, transdermal or parenteral injection Desirably in shape. For example, when preparing a composition in an oral dosage form, a suspension Liquid, syrup, elixir, solution, etc. Oils, alcohols, etc., or powders, pills, capsules and tablets. Solid carriers such as sediment, sugar, kaolin, lubricants, binders, disintegrators, etc. Any of the useful drug media can be used. Depending on the ease of administration, tablets and capsules The cell represents the most advantageous oral dosage unit form, in which case a solid drug carrier is employed. Of course used. For parenteral compositions, the carrier will usually facilitate dissolution, for example It contains at least a majority of the sterile water, but also contains other ingredients. Injectable solutions are, for example, those in which the carrier is saline, glucose or saline. It is prepared to consist of a mixture of a liquid and a glucose solution. In preparing an injectable suspension, an appropriate liquid carrier, suspending agent and the like are used. Used. In addition, liquid form preparations intended to be converted to liquid form preparations immediately after use Products are also included. In compositions suitable for transdermal administration, the carrier may optionally be Optionally with small proportions of suitable additives of optional properties that do not have a significant adverse effect on Contains a combined penetration enhancer and / or a suitable moisturizing agent.   For ease of administration and uniformity of dosage, the subject compositions may be formulated in dosage unit form. Is particularly advantageous. Dosage unit forms used in this specification and in the claims are for single use only. Refers to physically discrete units suitable for volume, with each unit associated with the required drug carrier. Contains a predetermined amount of active ingredient calculated to produce the desired medical effect You. Examples of such dosage unit forms include tablets (notched or coated). Tablets, including tablets), capsules, pills, powder packets, wafers, injectable solutions Or suspensions, tablespoons, and discrete complexes thereof.   The pharmaceutical composition of the present invention, as mentioned above, has many applications that are considered cosmetic applications. Available to Cosmetic compositions known in the art are preferably low allergic , Especially preferred for pH adjustment, toilet water, pack, lotion, skin Includes milk or milky lotion. The preparation is not only In addition, components commonly used in such preparations can be contained. Examples of such components Are oils, fats, waxes, surfactants, wetting agents, thickeners, antioxidants, Agents, chelating agents, buffers, preservatives, fragrances, dyes, lower alkanols, etc. You. Additional flame retardants, antibacterials, antifungals, disinfectants, vitamins, sunlight as needed Ingredients such as creams, antibiotics or anti-acne agents may be incorporated into the composition. No.   Examples of oils include oils and fats such as olive oil and hydrogenated oil: bee wax, lanolin, etc. Wax: Liquid paraffin, kerosene, squalane and other hydrocarbons: Stearin Fatty acids such as acid and oleic acid: cetyl alcohol, stearyl alcohol, lano Alcohols such as phosphorus alcohol and hexadecanol: and isomyristate Esters such as propyl, isopropyl palmitate and butyl stearate: Including. Examples of surfactants include sodium stearate, sodium cetyl sulfate , Polyoxyethylene lauryl ether phosphate, N-acylglutamic acid Anionic surfactant such as: stearyl dimethyl benzyl ammonium chloride Cationic surfactants such as amide and stearyltrimethylammonium chloride Agent: amphoteric surfactant such as alkylaminoethylglycine hydrochloride solution, lecithin: Glycine monostearate, sorbitan monostearate, Sucrose fatty acid ester, propylene glycol monostearate, Lioxyethylene oleyl ester, polyethylene glycol monostearic acid Ester, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxy Ciethylene palm fatty acid monoethanolamide, polyoxypropylene glycol (Eg, materials marketed under the trademark “Pluronic”), polyoxyethylene Nonionic surfactants such as castor oil and polyoxyethylene lanolin can be cited. You. Examples of wetting agents include glycerin, 1,3-butylene glycol and propylene. Glycol. Examples of lower alcohols include ethanol and isopro Contains panol. Examples of thickeners include xanthan gum, hydroxypropyl Lulose, hydroxypropyl methylcellulose, polyethylene glycol and And carboxymethylcellulose. Examples of antioxidants are butylated hydroxy. Citrene, butylated hydroxyanisole, gallic acid propyl, citric acid And ethoxyquinic acid. Examples of chelating agents include edetic acid disodium salt and And ethane hydroxy diphosphate. Examples of buffers are citric acid, citric acid Contains sodium, boric acid, borax and disodium phosphate monohydrogen. Preservative Examples are methyl para-hydroxybenzoate, ethyl para-hydroxybenzoate Esters, dehydroacetic acid and benzoic acid.   Preparations for ointments, creams, toilet water, skin milk, etc. are typically 0. of active ingredients such as onset factor 01 to 10%, especially 0. 1%. 1 to 5%, more special 0. 2 to 2. 5% is incorporated into the composition. In ointments and creams, carriers are examples For example, 1 to 20%, especially 5 to 15%, of the wetting agent and 0.1% of the thickening agent. 1 to 10%, Especially 0. Consist of 5 to 5% and water. Or this carrier is a surfactant 7 0 to 99%, especially 20 to 95% and 0 to 20% of fat, especially 2. From 5 15%: or 80-99 of thickener. 9, especially 90 to 99%: or surface activity 5 to 15% of a wetting agent, 2 to 15% of a wetting agent, 0 to 80% of a fat, 2%) of preservatives, colorants and / or fragrances and water. Toilet water For example, the carrier may be 2 to 10% of a lower alcohol, 0. 1 to 10% , Especially 0. 5 to 1% surfactant, 1 to 20%, especially 3 to 7% wetting agent, 0-5% buffer, water and preservatives, small amounts of dyes and / or fragrances (< 2%). In skin milk, the carrier is typically 10 to 5 fats or oils 0%, 1-10% of surfactant, 50-80% of water, and preservative and / or Or from 0 to 3% of the fragrance. All% symbols above are weight / weight percentages. Indicates a percentage.   Certain compositions used in the methods of the present invention include this factor in liposome-containing compositions. It is a prepared composition. Liposomes include phosphatidylcholine, ethanol Min and serine, sphingomyelin, cardiolipin, plasmalocen, phospha Artificial molecules formed from amphiphilic molecules of polar lipids such as tidylic acid and cerebioside Vehicle. Liposomes contain the appropriate amphiphilic molecules in water or aqueous solutions. Swell and form a multi-layer structure consisting of many double layers separated from each other by aqueous material Liquid crystals (also referred to as lipophores) are usually formed. Encapsulate the aqueous material Other types of liposomes, known to consist of a single bilayer, Called Hickle. If water-soluble material enters the aqueous phase during lipid swelling, the material becomes It becomes trapped in the aqueous layer between the pido bilayers.   Water-soluble active ingredients, such as various salt forms of the inducing factor, Encapsulated in the aqueous space between them. How many encapsulations of this protein This can be achieved. The most commonly used method is evaporation from organic solvents Casting of a thin film of phospholipid onto the wall of a flask. When the film is dispersed in a compatible aqueous medium, unilamellar liposomes are formed. Suitable With proper sonication, these liposome-free liposomes form smaller, similar closed vesicles. To achieve.   The film, in which the water-soluble active ingredient is usually cast into an aqueous solution of this compound, is separated. It is incorporated by scattering. Then this compound that was not encapsulated Less than centrifugation, centrifugation, chromatography, dialysis or other known suitable processing methods Leave. Active lipid-soluble ingredients are usually active prior to film casting. The components are incorporated by dissolving in phospholipid in an organic solvent. In the lipid phase If the solubility of this material is not exceeded or its amount present can bind to the lipid If the liposomes prepared in this way do not exceed Separation of liposomes from unencapsulated material containing much of this material bound to Do not need.   A particularly convenient way of adjusting the liposome composition of this factor is described in this reference. This is the method described in EP-A-253,619. This method uses the capse Single bilamellar liposomes containing active The organic and aqueous components are dissolved by a high-speed homogenizer or stirring means. The organic solution of the lipid compound is injected into the aqueous component under pressure, sometimes with stirring. Thus, liposomes are formed instantaneously.   A single bilamellar liposome containing an encapsulating factor is directly available, Or it can be used in a carrier that is acceptable for the appropriate drug for local administration. Wear. The viscosity of the liposome can be determined, for example, by using xanthan gum, hydroxypropyl cellulose, One or more such as glucose, hydroxypropyl methylcellulose and mixtures thereof It can be increased by the addition of a suitable thickener. The aqueous component may be water alone or an electrolyte. , Buffering systems and other components such as preservatives. Suitable for use Electrolytes include metal salts, such as alkali metal and alkaline earth metal salts . Preferred metal salts are calcium chloride, sodium chloride and potassium chloride. Electric The concentration of the solute varies from 0 to 260 mM, preferably from 5 mM to 160 mM . Aqueous components are homogenized by generating significant turbulence during the injection of organic components Place in a suitable container suitable for performing. The homogenization of these two components is achieved in this container Agitation, or separate aqueous and organic components separately from the container It may project into the means. In the latter case, the liposomes are formed in this means of agitation. And then transfer it to another container for collection purposes.   Organic components include ethanol, glycerol, propylene glycol and polyether. Compatible non-toxic and pharmaceutically acceptable solvents such as Consists of phospholipids soluble in solvents. Suitable phospholipids that can be used are For example, lecithin, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidyl Ethanol-amine, phosphatidylinositol, lysophosphatidylcholine And phosphatidylglycerol. Other lipophilic additives, May be used to selectively modify the properties of the system. Examples of such other additives Means stearylamine, phosphatidic acid, tocophenol, cholesterol and And lanolin extract.   In addition, other components that can prevent the oxidation of phospholipids may be added to the organic components . Such other ingredients include tocophenol, butylated hydroxyanisole, Butylated hydroxytoluene, ascorbicyl palmitate and asbestos Corbiyl oleate is included. Benzoic acid, methyl paraben and Preservatives such as ropirparaben can also be added.   In another aspect, the present invention provides a method for identifying genes involved in LH-2 regeneration case accompanying expression. Make loans easy. "Cloning" is a nucleic acid that encodes the factor of interest. It means the isolation of the sequence from an RNA or DNA source. For example, the subject cell Identification of genes and gene products that provide an inducible signal of blood stem cell proliferation, Can be used for isolation and research. By way of example, a novel transcript may have one or more inducible If necessary for protein production, control target cells (ectopic LH-2 expression must be No) from the target cells of the experiment (expressing recombinant LH-2). Using a deducible cDNA library created after hybridization to RNA, LH Genes that are turned on or off by expression of the -2 transcription factor can be isolated. This This type of subtractive approach has been successfully used for the isolation of a variety of novel genetics. ( See, for example, Wang et al. (1991) PNAS. USA 88: 11505-1150 9).   A similar approach involves the use of an "active display". For example, Liang et al. ( 1992) Cancer Res. 53: 6966-6998; Liang et al. ( (1992) Science 257: 967-971: and Liang et al. 93) Nuc. Acid Res. 21: 3269-3275. This The strategy of this method is to make by reverse transcription of RNAs isolated from two cells of interest. Is to use PCR to amplify the partial cDNAs Vesicles are cells that do not express hematopoietic stem cells that have been engineered to express LH-2. Next, PC R products were separated in adjacent lanes on a denaturing polyacrylamide gel, The product made in the other and not made in the other is cut directly from this gel and And sequence.   It is possible to obtain good resolution of around 100 PCR products on a single gel Only a subset of the RNAs is used in each PCR reaction. Select so that it appears. This is because 12T's and two 3 'conferring specificities This is achieved by reverse transcription using an oligo-dT starting material consisting of bases. Again Oligo-dT starting material is also used in PCR reactions with a second starting material of any sequence. The starting material is polyA+Different cDNAs at different distances from the ends I think that it will be slowly cooled again. Sequence of this second starting material and oligo-dT starting material If you change the sequence of the last base of quality, you can use this procedure to PolyA is considered to be expressed in typical cells+Amplify many of the contained mRNAs it can.   When using the active display method, the transcription is caused by the expression of heterogeneous transcription factors. The gene to be stimulated can be identified. RNA was modified recombinantly to express LH-2 Isolate from cells and allogeneic cells that do not express LH-2. Next, each cell type These RNAs have oligo- with dG, dA, dT or dC at their 3 'end. It is reverse transcribed during four different reactions with dT starting material. CDNAs obtained Is one of the four oligo-dT starting materials and a commercially available 20 Using a set of different starting materials35[S] amplified in the presence of dATP It is. Therefore, there are 80 different PCR reactions for each tissue, each of which The use of different starting materials is involved. PCR generation using each set of starting materials The material is then resolved on a modified polyacrylamide gel. Here, the reference target PCR products resulting from amplification of cDNA from tissue and target tissue The split is performed in parallel with the PCR product resulting from the amplification of the cDNA. PCR The product is visualized by autoradiography and is in only one lane Any products that are cleaved from the gel are subcloned and sequenced. Maybe , These products are responsible for the genes transcribed as a result of the ectopic expression of this transcription factor. It may represent amplification.   According to another embodiment of the present invention, the inducer or derivative thereof (abbreviated form, fusion form) Expression constructs (eg, synthetic proteins, mutants, etc.) A therapeutic adjustment is provided. Expression vectors include retrovirus, adenovirus, Forms of viral vectors of adeno-linked virus, herpes virus, etc. (above) Or non-liposome, polylysine conjugate, artificial virus coat etc. (above) Can be provided as a viral system. Suitable expression vectors are the drug carriers described above. Can be provided within. VII. Genetically modified feeder layer   Another embodiment of the invention is directed to cells designed to ectopically express LH-2. Thus, one or more of the factors produced are autocrine / paracrine. It has been brought about by the observation that it will act as a factor. Therefore Ectopically, as some of the data provided in the appended examples show. Cells that express the regenerating phenotype in unmodified cells in mixed cell culture Will be able to produce.   Thus, another example of the present invention relates to LH-2 (or some other suitable hematopoietic genetics). Feeder cells that have been modified to ectopically express Provided in the form of a feeder cell layer, normal embryonic or hematopoietic stem cells Cells, preferably in the presence of a steel factor. The way Now it is time to separate the expanded stem cell population from feeder cells using known techniques Can be done. The benefits of such an embodiment avoid the need to genetically design stem cells. It is a point that can be. VIII. Lineage-limited stem cells   Another example of the present invention is a hematopoietic lineage that has access to cells when reimplanted. Involves stem cells that have been modified by loss-of-function mutations. For differentiation Thus, the lineage created is more strictly controlled in ex vivo cultures In contrast, the extracellular signals encountered by the hematopoietic stem in vivo ultimately result in all species It will be appreciated that it will include signals that produce a class of differentiated hematopoietic cells. For example, such as homologous recombination, antisense or dominant negative mutants Loss-of-function mutations by methods limit the final differentiated cell type that occurs in vivo. Means can be provided. Thus, for example, GATA-3 and PU-1 Loss-of-function mutations against B cells are capable of differentiating into B- or T-cells when implanted. Probably will produce stem cells with reduced strength, e.g. myeloid lineage Stem cells, which should result. Homologous recombination   One method of causing loss-of-function mutations in genes in ES cells is targeting Target gene, for example by homologous recombination, Replacement of a gene. For example, such a construct may be (i) a target A sequence substantially identical to or substantially complementary to the Has at least the sequence flanking the gene, which is present in the host stem cell. One recombination region, and (ii) an integration into the host cell genome. It can be taken out to include a replacement area. Homologous sets using genomic sequences In turn, the gene of the host cell is disrupted by the targeting construct. For example Integration occurs in transcriptional regulatory regions and can result in gene transcription loss . In another embodiment, the fragmenting construct is incorporated into the code sequence and the resulting Expression of a functional gene product is increased by, for example, frameshifting, immature interrupting codons, etc. It can be confusing.   Split constructs can be prepared by standard methods, such as electroporation, microinjection And transfection into cultured ES cells by calcium phosphate treatment I can do it. The preferred method of insertion is electroporation. Insert into cells Each gene construct to be entered must be first and foremost linear. Therefore If the gene construct was inserted into the vector, only in the vector sequence Appropriate restriction endonucleases selected to be cut and not cut within the gene construct sequence Linearization is achieved by digesting the DNA with a lease.   Because of the targeted insertion, the genetic construct is publicly available to the skilled technician. As is known, they are added to ES cells under conditions suitable for the chosen insertion method. Than one If these constructs must be introduced into ES cells, each gene construct must be identical. Sometimes or one at a time.   If ES cells must be electroporated, they are The gene construct DNA is used in the manufacturer's usage guidelines using an electroporation machine. Therefore, it is exposed to an electric pulse. After electroporation, ES cells are typically Collect under appropriate incubation conditions. The cell then has a gene construct Are screened for   Screen transfected cells using a variety of methods Can be done. When the construct contains a marker gene, for example, an antibiotic resistance gene ES cells may be cultured in the presence of otherwise lethal concentrations of antibiotics. Alive The remaining ES cells probably incorporated the genetic construct. If the marker gene If is not an antibiotic resistance gene, a Southern blot of ES cell genomic DNA was DNA sequence designed to hybridize only to the Can be scrutinized using. Alternatively, you can use PCR. last Alternatively, if the marker gene is an enzyme whose activity can be detected (eg, β-galacto If the gene encodes a (sidase), the enzyme substrate can be used under appropriate conditions. The enzyme activity can be analyzed by adding to the cells. Experts in the path are other Useful You are familiar with markers and the means to detect the presence of the marker in a given cell Would. All such markers are considered to be within the teachings of the present invention. It is.   Gene constructs may be integrated at several places in the ES cell genome, In addition, they are inserted at different locations in each ES cell genome to generate random insertion events. May be able to. Typically, about 1-5 of the ES cells that take up the gene construct % Or less will actually incorporate the gene construct where desired. Gene construct To identify these ES cells that have properly incorporated DNA can be extracted from ES cells. Certain restriction enzymes (or more) Hybridize with genomic DNA digested in Note) in a certain pattern Southern blot using one or more designed probes Can be scrutinized on the Internet. Another or in addition, the genome DNA is specifically decomposed to amplify DNA fragments of a particular size and sequence. Designed probes (for example, only cells containing the gene construct at the appropriate location are suitable) Amplify by PCR using the appropriate size of DNA fragment I can do it.   In one embodiment, gene targeting, which modifies the animal's genome Method that uses homologous recombination to introduce changes into embryonic stem cells cultured Can be used to Targets of hematopoietic genes of interest in ES cells These changes can be introduced into the animal's reproductive system to create chimeras. I can do it. Gene targeting methods include segments homologous to the target hematopoietic locus. Sequence modifications intended for hematopoietic genomic sequences (eg insertions, deletions, point mutations) DNA targeting constructs, which also contain Can be accomplished. Treated cells are then screened for accurate targeting. To identify and isolate properly targeted cells.   Gene targeting in embryonic stem cells is, in fact, one of the Or more designed to undergo homologous recombination with the genomic sequence Means to disrupt hematopoietic gene function through the use of a targeting gene transduction construct Is a scheme considered by the present invention. The targeting construct is After recombination with elements of the blood gene, a distinct selectable marker is targeted. To be inserted (or replaced) into the coding sequence of the hematopoietic gene Can be trimmed. The inserted sequence functionally disrupts the hematopoietic gene and simultaneously Give positive selection qualities.                                   Example   The present invention will now be described generally, by reference to the following examples. As will be more readily understood, the embodiments are merely illustrative of some embodiments of the present invention. It is intended to limit the invention merely by counting for purposes of explanation of Not something. Example 1: Differentiation of ES cells into hematopoietic cells   Many of the experiments described below involve the 129-derived ES cell line CCE (eg, strain 129 mouse). ES cells). However, other ES cells like J1 The system performed equally well under similar conditions. ES cells have leukemia inhibitory factor (LIF) Under normal conditions without feeder cells. The standard differentiation test is ES cells were used as described in the technical literature, but with some modifications. Differentiation was performed for 6 days to form embryoid bodies (EBs). Collecting EBs and single cell suspension Was prepared. Single cell suspension, as described by Keller et al. Then, the precursor content was assayed by the colony forming cell-culture (CFC-c) assay. This procedure Hereinafter, it is referred to as a precursor assay. The hematopoietic factors used in the precursor assay were Firstly, erythropoietin (epo) and steel factor (SF). At this stage of EB outbreak Is a combination of these factors, which is associated with early and final erythroid lineage. It promotes the differentiation of precursors toward, and the extent to megakaryocyte lineage is small.   In FIG. 2, the typical morphology of two types of erythroid colonies can be seen. small Red dense colonies express embryonic erythroid cells, the fetal form of globin Consists of large nucleated hemoglobinized cells. This type of colony Already present 4-5 days after plating. Red large irregularly shaped colonies The final stage of erythroid cells, small enucleated cells that express the mature form of globin Consists of moglobin-forming cells. This type of colony is 7-9 after replating. Does not appear until the day. Some of the latter types of colonies are also individual colonies. Megakaryocytes as indicated by May-Grunwald Giemsa staining of cells removed from Also includes a sphere (data not shown). Figures 3 and 4 use different ES cell lines. The frequency of precursors for each lineage in the experiment is shown. Typically, 6 days The frequency of precursors for early erythroid lineage is almost 1/100 of EB-derived cells Yes, the frequency of precursors for the final stage of erythroid lineage is 5-30 / 105 cells You. Typically, 105 ES cells were plated per dish. In this way, culture The number of precursors per dish is equal to the number of hematopoietic precursors present in 10 embryos on the 8th day of embryonic stage. New Example 2: Analysis of the role of the LH-2 gene product in HS development using ES cell lines   Putative function of the Lhx gene LH-2 in the development and expansion of the hematopoietic system (HS) To be able to study, one retroviral system was established. In ES cells This retroviral vector was modified for efficient gene expression and We call it a stem cell virus (MSCV) vector. The LH-2 gene is a multiple And cloned. Vector alone (MSCV) and FIG. 5 shows the structure of the LH-2 containing vector (MSCV-LH-2). These two vectors, Transfect virus-producing cell line BOSC-23 as described The virus particles were produced and harvested. MSCV-vector is neomycin CCE ES cells infected because they contain the phosphotransferase (neo) gene Was selected for G-418 resistance. Infected in bulk (ie, subclonin Both ES cells from the population and the subclone were analyzed. MSCV-LH-2 infected In addition, MSCV infected or uninfected ES cells have a prominent morphological or Shows no difference in growth rate, and LH-2 expression does not change the undifferentiated state of ES cells It shows that. These different populations of infected ES cells are transformed into precursor cells as described above. The cells were subjected to a differentiation assay. Early comparison of MSCV and MSCV-LH-2 infected bulk populations No difference in the frequency of precursors for embryoid somatic cells was detected (FIG. 3a). But The increased frequency of precursors for the final stage of erythroid cells was attributed to the MSCV bulk population (31). / 2 x 105 cells) compared to the MSCV-LH-2 bulk population (53/2 x 105 cells). Issued (see Figure 3b).   The very interesting difference that was added is that E-cells derived from MSCV-LH-2 infected ES cells In the Bs clone assay, a new type of colony appeared, which was Dyeing Or not present in any of the EBs derived from uninfected ES cells Met. The frequency of this type of colony in the MSCV-LH-2 bulk population is Was approximately 10-20 times less than the frequency of embryoid body colonies. MSCV-LH-2-glue This new type of colony in one of the four subclones tested Emerged at the same frequency as in the embryoid body colonies, compared to the MSCV-LH-2 bulk group. It grew larger in comparison. The majority of cells in the colony hemog within 7-8 days In contrast to all other robinized (turning red) colonies, Ip colonies never completely hemoglobinize and have red “spots” A typical large non-red roller with these red “spots” The knee is shown in FIG. This figure shows the reference of these colonies 1.5-2 weeks after replating. It is a diagram illustrating a typical appearance. The majority of these cells have a "mature" phenotype That is, as seen by May-Grunwald Giemsa staining, Shows blast-like cells with no large morphology, large round nuclei and small cytoplasmic edges . In addition to these mature cells, there were megakaryocytes and nucleated red blood cells. these The data show that the majority of cells in this colony are not bound to any particular hematopoietic lineage. This suggests that the cells are immature cells expanded without accompanying. Test this hypothesis Multiple individual colonies, pick EPO and SF and interleukin Were re-plated in a precursor assay containing IL-3. This test is a precursor to other types of It should expand the number of bodies. The morphology and structure of the colonies in this secondary precursor assay And by May-Grunwald Giemsa staining of cells from individual colonies. Colonies of immature cells, as well as pure erythroid-like cells, erythroid-like / Megakaryocytes, erythroid-like / macrophages, and erythrocytes / megakaryocytes / neutrophils / macro Colonies containing phage reappeared (data not shown). In addition, Cells from Ip colonies were assayed in a precursor assay lacking growth factors. Did not grow. To examine the growth factor dependence of these cells more clearly Cell culture in combination with either EPO, SF, or IL-3, and S-3 in combination with IL-3 F. in liquid culture medium containing SF is the only thing that can promote the growth of these cells Factors. No significant growth was observed in the presence of IL-3 (data Is not shown). More importantly, stop using SF and add EPO before erythroid Immediate and large Promoted modest terminal differentiation (data not shown).   These data indicate that this experimental protocol has a Create Multilineage Precursors That Maintain Differentiating Ability to Different Mature Hematopoietic Cell Types Has started. This type of cells will be referred to hereafter as putative hematopoietic progenitor cells. (HPCs). This is a very important finding, since the equivalent in vivo Cell studies are severely hampered by their very small quantity. Thus, a pure and homogeneous population of these cells can be obtained using techniques available today. It is almost impossible to get in vivo. This leads to indirect characterization of these cells Brought. The establishment of putative HPCs is directly related to the properties of progenitor cells at the cellular level, Allows characterization at the molecular and biochemical levels. Further, for example Human cord blood, human (or mouse) to human hematopoietic stem / progenitor cells purified from LH-2 transfection makes it possible to establish equivalent cells from humans will do.   A preliminary report on the phenotype of LH-2 knockout mice shows that hematopoietic stem cells Revealing interesting clues to possible mechanisms of mediated proliferation I have. Homozygous LH-2 knockout mice produce red blood, possibly leading to severe anemia He died on the 17th day of pregnancy due to a decrease in sphere precursors. In addition, wild type cells, and LH-2 In mice that are chimeric for mutant cells that are homozygous for Conjugative mutant cells form erythroid and lymphoid lineage cells Can be done. This result indicates that LH-2 homeodomain protein cooperates with the steel factor. Controls the expression of factors that can expand immature hematopoietic cells without significant differentiation It strongly suggests non-independent defects of cells.   Possible clinical uses for these findings include: i) separating a limited number of hematopoietic progenitors from patients To create an unlimited supply of cells for release and use in the transplantation framework. In vitro expansion. This includes any radiation- or chemotherapy Cancer treatment, ii) possible replacement of autoimmune diseases by replacing pathogenic lymphocytes Therapeutic agents iii) Possible therapeutic agents for various types of congenital or acquired anemia iv) Patients HIV-infected compartments using healthy cells by expanding the few uninfected stem cells A disease that requires a bone marrow transplant, such as AIDS, if possible. Treatment of the case Will have its use in the future. Example 3: Cells expressing the LH-2 gene product induce a regenerating phenotype in other co-cultured cells Can guide   As mentioned above, forced expression of LH-2 in hematopoietic cells is an important factor in fetal hepatocyte hematopoiesis. Expand immature cells in the presence of steel factor, a critical factor for growth You. In long-term bone marrow cultures, steel factors only promote differentiation It does not promote self-renewal of mature cells. This data shows that LH-2 is expressed in fetal liver Together with the fact that LH-2 expression is involved in the expansion of HPC in fetal liver. Become. There are two possible mechanisms here, that is, they originate outside the cell Exogenous or intrinsic to cells. For the former, LH2 + /+<-.>LH2-/- chimeric mouse LH2-/-cells may contribute to cells of the hematopoietic system That LH-2 expression is soluble and / or membrane Of binding, cell-cell signaling molecules (one or more) Promotes expression.   Wild-type or LH-2 mitotically inactivated to test this possibility Current embryonic stem cells can be used in progenitor assays with erythropoietin / steal factors With or without wild-type cells. Without factors, mature hematopoietic colonies The absence did not indicate that LH-2 expressing cells could stimulate colony formation. Did not produce offspring, such as steel factor, IL-3, colony stimulating factor, etc. Is shown. When erythropoietin / steel factor is added to a mixed cell culture, The plating efficiency of wild-type cells is higher for mitotically inactive LH-2 expressing cells than for co-culture. For mature erythroid cell colonies when used (mitotically inactivated 100% (compared to co-culture with wild-type cells). This is the difference between LH-2 Factors created by ectopic expression form regenerative phenotypic stem cells in mixed culture The ability to induce In addition, This data was the first since most of the colonies that were grown were mature erythroid colonies. Precursors, such as those that have not yet responded to erythropoietin / steel factors, -Type embryonic stem cells. Example 4 Medium Supernatant (Page 10; Definitions See Translator Note) Induces Reproduction Phenotype it can   A stem cell inducing factor (one or more) that would be produced by ectopic expression of LH-2 Further, to further identify Its ability to create a self-renewal phenotype in the Ronnie test was further tested. Briefly For example, the culture supernatant from the LH-2 expressing cells in question can be used to grow and grow a dilute population of hematopoietic stem cells. For the first time in a liquid medium, which could support survival and / or survival. Liquid culture In the ground, when hematopoietic stem cells are diluted to less than 1000 cells / ml, He was observed to die despite his feet. Medium from LH-2 expressing cells described here Addition of supernatant can rescue cultured cells under these conditions ... LH-2 ectopic One or more of which expression can introduce a renewable phenotype into cultured hematopoietic cells Supports the idea that the expression / secretion of soluble factors can be induced.   One or more of the LH-2 induced media that caused the rescue of the diluted cells To provide a more quantitative means of detecting the presence of the above factors, methylcellulose Based assays were adapted from existing techniques (eg, Evan et al., (1978) Blood52). Vol. 1196-1210, see). In this assay, HPCs were purified from Iscov's modified Dulbecco's medium (IM 1 course of 1% methylcell in DM) 10% fetal calf serum (FCS), steel factor (10 0 ng / ml) with or without medium supernatant. Incubate. FIG.6In cells / ml, HPC cells are isolated regardless of the addition of medium supernatant. This indicates that Ronnie will occur. However 5 × 10FourIn cells / ml, Knee formation depends on the addition of medium supernatant (see FIG. 8), and one or more Secreted factor is produced by ectopic expression of LH-2 and the factor is expressed in cultured hematopoietic cells. It was confirmed that a reproducible phenotype could be induced.   This assay is more sensitive than the liquid assay and colonies are counted and sized. Can be taken out of the dish for study and further study. FIG. 9 shows the culture supernatant. Several assays plated with varying numbers of HPC cells in +/− 30% medium The results are shown. The methylcellulose colony assay in question produces a reproducible phenotype LH-2 inducible factor (one or more) Can be used for   All of the above references and publications are hereby incorporated by reference.                                  Equivalent   Experts on the road can use this book without further experimentation. Recognize or confirm the many equivalents for a particular embodiment of the invention I can do it. Such equivalents are intended to be included in the following claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 35/14 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＺＷ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61K 35/14 C12N 5/00 B 38/00 A61K 37/02 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ) , TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, E, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ , PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, ZW

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．造血系統へ分化し得る回復可能な幹細胞を生成するための方法であって、該 方法は、造血遺伝子の異所性の発現を引き起こす工程を包含し、該遺伝子の発現 は、自己回復可能な表現型を該幹細胞に付与する、方法。 ２．造血系統へ分化し得る回復可能な幹細胞を生成するための方法であって、該 方法は、造血遺伝子をコードする遺伝子発現構築物で幹細胞をトランスフェクト する工程、および造血遺伝子が、トランスフェクトされた幹細胞の自己回復可能 な表現型を付与するレベルで発現される条件下で細胞を維持する工程、 を包含する、方法。 ３．請求の範囲第２項に記載の方法であって、前記造血遺伝子が、LIM-ホメオボ ックスタンパク質をコードする、方法。 ４．請求の範囲第３項に記載の方法であって、前記LIM-ホメオボックスタンパク 質がLH-2である、方法。 ５．請求の範囲第４項に記載の方法であって、前記LH-2タンパク質が、配列番号 ２または４のいずれかにおいて表される、方法。 ６．請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の方法であって、前記造血遺 伝子が、造血細胞の相対数の減少の機能消失表現型によって特徴づけられる造血 に関与する遺伝子である、方法。 ７．請求の範囲第２項に記載の方法であって、前記幹細胞が胚幹細胞である、方 法。 ８．請求の範囲第３項に記載の方法であって、前記幹細胞が造血幹細胞である、 方法。 ９．請求の範囲第８項に記載の方法であって、前記造血幹細胞が、抹消血、臍帯 血、または骨髄から単離される、方法。 １０．請求の範囲第２項、第７項、または第８項のいずれかに記載の方法であっ て、前記幹細胞が哺乳動物から単離される、方法。 １１．請求の範囲第１０項に記載の方法であって、前記哺乳動物が霊長類である 、方法。 １２．請求の範囲第１１項に記載の方法であって、前記霊長類がヒトである、方 法。 １３．請求の範囲第１０項に記載の方法であって、前記哺乳動物がトランスジェ ニック非ヒト動物である、方法。 １４．請求の範囲第２項に記載の方法であって、前記幹細胞が、ウイルス媒介性 遺伝子移入によって、前記遺伝子発現構築物でトランスフェクトされる、方法。 １５．請求の範囲第２項に記載の方法であって、前記幹細胞が、リポソーム媒介 性遺伝子移入によって、前記遺伝子発現構築物でトランスフェクトされる、方法 。 １６．請求の範囲第２項に記載の方法であって、前記幹細胞が、インビボにて、 遺伝子発現構築物でトランスフェクトされる、方法。 １７．請求の範囲第２項に記載の方法であって、前記幹細胞が、エクスビボにて 、遺伝子発現構築物でトランスフェクトされる、方法。 １８．請求の範囲第２項に記載の方法であって、該方法が、Steel因子との接触 によってトランスフェクトされた細胞を増殖する工程をさらに含む、方法。 １９．請求の範囲第２項に記載の方法であって、該方法が、エリトロポイエチン （EPO）、トロンボポイエチン、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（GM- CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（ M-CSF）、およびインターロイキンからなる群より選択される、１つ以上の因子 と、前記トランスフェクトされた細胞とを接触する工程をさらに包含する、方法 。 ２０．実質的に純粋な集団の生存可能な幹細胞であって、該細胞は、遺伝子改変 されて造血遺伝子を異所的に発現し、該遺伝子の発現は、自己回復可能な表現型 を該幹細胞に付与する、細胞。 ２１．請求の範囲第２０項に記載の細胞であって、前記造血遺伝子が前記造血遺 伝子が、LIM-ホメオボックスタンパク質をコードする、細胞。 ２２．請求の範囲第２１項に記載の細胞であって、前記LIM-ホメオボックスタン パク質がLH-2である、細胞。 ２３．請求の範囲第２２項に記載の細胞であって、前記LH-2タンパク質が、配列 番号１または３のいずれかにおいて表される核酸に、ストリンジェントな条件下 でハイブリダイズする遺伝子によってコードされる、細胞。 ２４．請求の範囲第２０項から第２３項のいずれかに記載の細胞であって、前記 造血遺伝子が、造血細胞の相対数の減少の機能消失表現型によって特徴づけられ る造血に関与する遺伝子である、細胞。 ２５．請求の範囲第２０項に記載の細胞であって、前記幹細胞が胚幹細胞である 、細胞。 ２６．請求の範囲第２０項に記載の細胞であって、前記幹細胞が造血幹細胞であ る、細胞。 ２７．請求の範囲第２６項に記載の細胞であって、前記造血幹細胞が抹消血、臍 帯血、胎児肝臓、または骨髄から単離される、細胞。 ２８．請求の範囲第２０項に記載の細胞であって、前記幹細胞が哺乳動物から単 離される、細胞。 ２９．請求の範囲第２８項に記載の細胞であって、前記哺乳動物が霊長類である 、細胞。 ３０．請求の範囲第２９項に記載の細胞であって、前記霊長類がヒトである、細 胞。 ３１．請求の範囲第２８項に記載の細胞であって、前記哺乳動物がトランスジェ ニック非ヒト哺乳動物である、方法。 ３２．請求の範囲第２０項に記載の分化される造血細胞の幹細胞を含有する、精 製調製物。 ３３．請求の範囲第３２項に記載の細胞であって、分化される造血細胞の幹細胞 が骨髄系統、リンパ球系統、赤血球コロニー、およびそれらの組合せからなる群 より選択される、細胞。 ３４．請求の範囲第２０項または第３２項のいずれかに記載の細胞組成物を含有 する、薬学的組成物。 ３５．減少された数の造血前駆体またはその子孫によって特徴づけられる異常を 、被験体動物において処置するための方法であって、該被験体に請求の範囲第３ ４項に記載の薬学的組成物を導入する工程を包含する、方法。 ３６．請求の範囲第３５項に記載の方法であって、前記異常が骨髄欠損の結果で ある、方法。 ３７．請求の範囲第３５項に記載の方法であって、前記異常が、放射線療法およ び化学療法を包含するガン処置の結果である、方法。 ３８．請求の範囲第３５項に記載の方法であって、前記異常が、遺伝性貧血また は後天性貧血である、方法。 ３９．被験体における免疫系における変質によって特徴づけられる異常を処置す るための方法であって、請求の範囲第３４項に記載の薬学的組成物を被験体に導 入する工程を包含する、方法。 ４０．請求の範囲第３９項に記載の方法であって、前記異常が自己免疫疾患であ る、方法。 ４１．請求の範囲第３９項に記載の方法であって、前記異常がAIDSである、方法 。 ４２．造血遺伝子を異所的に発現するように遺伝子改変された幹細胞であって、 該遺伝子の発現は、自己回復可能な表現型を該幹細胞に付与する、幹細胞。 ４３．幹細胞を含有する幹細胞培養物によって生成される馴化培地であって、該 幹細胞は、自己回復可能な表現型を該幹細胞に付与する造血遺伝子を異所的に発 現する、馴化培地。 ４４．幹細胞を含有する幹細胞培養物によって生成される１つ以上の因子の精製 調製物または半精製調製物であって、該幹細胞は、自己回復可能な表現型を該幹 細胞に付与する造血遺伝子を異所的に発現する、調製物。 ４５．請求の範囲第４３項に記載の馴化培地または請求の範囲第４４項に記載の 調製物であって、前記造血遺伝子がLIM-ホメオボックスタンパク質をコードする 、馴化培地または調製物。 ４６．自己回復可能な表現型を造血幹細胞に付与する因子を単離するための方法 であって、以下の工程（i）自己回復可能な表現型を該幹細胞に付与する造血遺 伝子を異所的に発現する改変された幹細胞を含む幹細胞培養物を提供する工程； および（ii）該幹細胞培養物によって生成される１つ以上の因子を、ある程度に 精製する工程を包含し、該因子は、改変されていない造血幹細胞に適用される場 合、自己回復可能な表現型を誘導する、方法。 ４７．自己回復可能な表現型を造血幹細胞に付与する因子のコード配列を得るた めの方法であって、以下の工程（i）幹細胞と請求の範囲第４６項に記載の精製 さ れた因子とを接触する工程；および（ii）幹細胞培養物により生成される因子を コードする、幹細胞において発現される１つ以上の遺伝子をクローン化する工程 を包含し、該因子は改変されていない造血幹細胞に適用される場合、自己回復可 能な表現型を誘導する、方法。 ４８．自己回復可能な表現型を造血幹細胞に付与する因子のコード配列を得るた めの方法であって、以下の工程（i）自己回復可能な表現型を幹細胞に付与する 造血遺伝子を、異所的に発現する改変された幹細胞を含む幹細胞培養物を提供す る工程；および（ii）該幹細胞培養物によって生成された因子をコードする、該 改変された幹細胞において発現される１つ以上の遺伝子をクローン化する工程を 包含し、該因子は改変されていない造血幹細胞に適用される場合、自己回復可能 な表現型を誘導する、方法。 ４９．請求の範囲第４７項または第４８項に記載の方法であって、前記クローン 化された遺伝子、または同一のもしくは相同なタンパク質をコードする核酸が、 該因子の組換え発現のために発現ベクター中に提供される、方法。 ５０．請求の範囲第４６項、第４７項、または第４８項に記載の方法であって、 前記因子が薬学的に受容可能なキャリア中に処方される、方法。 ５１．請求の範囲第４６項から第５０項のいずれかに記載の１つ以上の単離され た因子の、精製調製物または半精製調製物。[Claims] 1. A method for producing a renewable stem cell capable of differentiating into a hematopoietic lineage, the method comprising: The method includes the step of causing ectopic expression of a hematopoietic gene, wherein the expression of the gene is performed. Conferring a self-recoverable phenotype on said stem cells. 2. A method for producing a renewable stem cell capable of differentiating into a hematopoietic lineage, the method comprising: Method transfects stem cells with a gene expression construct encoding a hematopoietic gene And the hematopoietic genes are capable of self-healing in transfected stem cells Maintaining the cells under conditions that are expressed at a level that confer a phenotype, A method comprising: 3. 3. The method according to claim 2, wherein said hematopoietic gene is LIM-homeovo. A method of encoding a protein. 4. 4. The method according to claim 3, wherein the LIM-homeobox protein is used. The method, whose quality is LH-2. 5. 5. The method according to claim 4, wherein said LH-2 protein comprises SEQ ID NO: The method represented in either 2 or 4. 6. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the hematopoietic residue is used. Hematopoiesis where the gene is characterized by a loss-of-function phenotype of reduced relative numbers of hematopoietic cells Is a gene involved in 7. 3. The method according to claim 2, wherein said stem cells are embryonic stem cells. Law. 8. The method according to claim 3, wherein the stem cell is a hematopoietic stem cell, Method. 9. 9. The method according to claim 8, wherein the hematopoietic stem cells are peripheral blood, umbilical cord. A method isolated from blood or bone marrow. 10. A method according to any one of claims 2, 7, or 8. Wherein said stem cells are isolated from a mammal. 11. 11. The method according to claim 10, wherein said mammal is a primate. ,Method. 12. 12. The method of claim 11, wherein said primate is a human. Law. 13. 11. The method of claim 10, wherein said mammal is transgenic. The method, wherein the nick is a non-human animal. 14． 3. The method according to claim 2, wherein said stem cells are virus-borne. The method wherein the gene expression construct is transfected by gene transfer. 15. 3. The method of claim 2, wherein said stem cells are liposome-mediated. Transfected with said gene expression construct by sex gene transfer . 16. 3. The method according to claim 2, wherein said stem cells are in vivo, The method, which is transfected with the gene expression construct. 17． 3. The method according to claim 2, wherein said stem cells are ex vivo. Transfected with a gene expression construct. 18. 3. The method of claim 2, wherein the method comprises contacting with a Steel factor. Growing the cells transfected by the method. 19. 3. The method according to claim 2, wherein the method comprises erythropoietin. (EPO), thrombopoietin, granulocyte / macrophage colony stimulating factor (GM- CSF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), macrophage colony stimulating factor ( M-CSF), and one or more factors selected from the group consisting of interleukins And contacting the transfected cell with the transfected cell. . 20. A substantially pure population of viable stem cells, wherein the cells are genetically modified. Ectopically expresses the hematopoietic gene, the expression of which is self-healing phenotype To the stem cells. 21. 21. The cell according to claim 20, wherein the hematopoietic gene is the hematopoietic residue. A cell whose gene encodes a LIM-homeobox protein. 22. 22. The cell of claim 21, wherein said LIM-homeoboxtan A cell whose protein is LH-2. 23. The cell of claim 22, wherein the LH-2 protein has a sequence The nucleic acid represented by either No. 1 or 3 is subjected to stringent conditions. A cell encoded by a gene that hybridizes with 24. The cell according to any one of claims 20 to 23, wherein the cell Hematopoietic genes are characterized by a loss-of-function phenotype of reduced relative numbers of hematopoietic cells A cell that is a gene involved in hematopoiesis. 25. 21. The cell according to claim 20, wherein said stem cell is an embryonic stem cell ,cell. 26. 21. The cell according to claim 20, wherein said stem cell is a hematopoietic stem cell. Cell. 27. 27. The cell of claim 26, wherein said hematopoietic stem cells are peripheral blood, umbilical cord. Cells isolated from cord blood, fetal liver, or bone marrow. 28. 21. The cell according to claim 20, wherein said stem cell is derived from a mammal. Cells released. 29. 29. The cell of claim 28, wherein said mammal is a primate. ,cell. 30. 30. The cell of claim 29, wherein said primate is a human. Vesicles. 31. 29. The cell of claim 28, wherein said mammal is transgenic. The method is a nicked non-human mammal. 32. A sperm cell comprising the stem cell of the differentiated hematopoietic cell according to claim 20. Preparation. 33. 33. The cell according to claim 32, wherein the stem cell is a hematopoietic cell to be differentiated. Group consisting of myeloid lineage, lymphoid lineage, erythroid colony, and combinations thereof Cells, which are more selected. 34. A cell composition according to any one of claims 20 or 32. A pharmaceutical composition. 35. Abnormalities characterized by a reduced number of hematopoietic precursors or their progeny Claims: 1. A method for treating in a subject animal, said subject comprising: A method comprising introducing the pharmaceutical composition of claim 4. 36. 36. The method according to claim 35, wherein the abnormality is a result of bone marrow loss. Yes, the way. 37. 36. The method according to claim 35, wherein the abnormality is radiation therapy and radiation therapy. And methods that are the result of cancer treatment, including chemotherapy. 38. 36. The method according to claim 35, wherein the abnormality is hereditary anemia or Is an anemia, a method. 39. Treating abnormalities characterized by alterations in the immune system in a subject A method for introducing a pharmaceutical composition according to claim 34 to a subject. A method comprising the steps of: 40. 40. The method of claim 39, wherein said abnormality is an autoimmune disease. How. 41. 40. The method of claim 39, wherein the abnormality is AIDS. . 42. Stem cells genetically modified to ectopically express a hematopoietic gene, A stem cell, wherein expression of the gene confers a self-recoverable phenotype to the stem cell. 43. A conditioned medium produced by a stem cell culture containing stem cells, Stem cells ectopically express hematopoietic genes that confer a self-recoverable phenotype to the stem cells. A conditioned medium that reveals. 44. Purification of one or more factors produced by a stem cell culture containing stem cells A preparation or semi-purified preparation, wherein said stem cells have a self-renewable phenotype. A preparation that ectopically expresses a hematopoietic gene imparted to cells. 45. The conditioned medium according to claim 43 or the conditioned medium according to claim 44. A preparation wherein the hematopoietic gene encodes a LIM-homeobox protein Conditioned medium or preparation. 46. Methods for isolating factors that confer a self-healing phenotype to hematopoietic stem cells And the following step (i): giving the stem cells a self-healing phenotype. Providing a stem cell culture comprising a modified stem cell that ectopically expresses the gene; And (ii) reducing one or more factors produced by the stem cell culture to some extent Purifying, wherein the factor is applied to unmodified hematopoietic stem cells. If induced, a self-healing phenotype. 47. Obtaining coding sequences for factors that confer a self-healing phenotype to hematopoietic stem cells 47. A method according to claim 46, comprising the following step (i): stem cell and purification according to claim 46. Sa Contacting the factor with the selected factor; and (ii) the factor produced by the stem cell culture. Cloning one or more genes that encode and are expressed in stem cells Wherein the factor is self-healing when applied to unmodified hematopoietic stem cells. How to induce a competent phenotype. 48. Obtaining coding sequences for factors that confer a self-healing phenotype to hematopoietic stem cells The following step (i): imparting a self-recoverable phenotype to a stem cell. Providing a stem cell culture comprising a modified stem cell that ectopically expresses a hematopoietic gene And (ii) encoding the factor produced by the stem cell culture. Cloning one or more genes expressed in the modified stem cells The factor is self-healing when applied to unmodified hematopoietic stem cells How to induce a different phenotype. 49. 49. The method according to claim 47 or claim 48, wherein the clone Nucleic acid encoding a modified gene or an identical or homologous protein A method provided in an expression vector for recombinant expression of the factor. 50. A method according to claim 46, claim 47, or claim 48, wherein The method wherein the agent is formulated in a pharmaceutically acceptable carrier. 51. 51. One or more isolated according to any of claims 46 to 50. Purified or semi-purified preparation of the factor.
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