JP2001333780A - Monoclonal antibody fused protein against antigen present on cell surface and method for producing the same - Google Patents
Monoclonal antibody fused protein against antigen present on cell surface and method for producing the sameInfo
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、新規の遺伝子キャ
リアーであるヒト型一本鎖イムノポーターモノクローナ
ル抗体蛋白質融合蛋白質及び当該融合蛋白質とDNA の複
合体に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel single-chain immunoporter monoclonal antibody protein fusion protein which is a novel gene carrier, and a complex of the fusion protein and DNA.
【0002】[0002]
【従来の技術】現在、遺伝子治療のための遺伝子キャリ
アーとして実用化されているのは組換えウィルスベクタ
ーや合成リポソームである。しかし、ウィルスベクター
は、遺伝子導入効率は高いものの、細胞特異性が低いこ
と、免疫原性の可能性があるなどの欠点がある。また、
リポソーム法も細胞特異性が低い欠点がある。このため
臨床治験では限られた効果しか報告されていない。遺伝
子治療の潜在的な能力を引き出すためにはこれらベクタ
ーの欠点を克服しなければならない。2. Description of the Related Art At present, recombinant virus vectors and synthetic liposomes have been put to practical use as gene carriers for gene therapy. However, although viral vectors have high gene transfer efficiency, they have drawbacks such as low cell specificity and the possibility of immunogenicity. Also,
The liposome method also has the disadvantage of low cell specificity. For this reason, only limited effects have been reported in clinical trials. To exploit the potential of gene therapy, the drawbacks of these vectors must be overcome.
【0003】近年、そのような欠点を克服することが可
能であり、正確に癌細胞を標的として捕らえることがで
きる癌の化学療法の開発が強く望まれている。その目的
のために、今日では、トランスフェリンレセプター、神
経増殖因子レセプターなどのレセプターだけでなく、乳
癌細胞、前立腺癌細胞など種々の癌細胞に対するモノク
ローナル抗体も、種々のタンパクトキシンに結合される
イムノトキシンとして使用されている。扁平上皮癌は上
皮細胞増殖因子(epidermal growth factor:EGF )レセ
プターを過剰に産生し、生体内での増殖が極めて速い。
また細胞表面のEGF レセプターは抗体と結合して共に嵌
入されることが知られているので、EGFレセプターは扁
平上皮癌に対する療法のための優れた標的と考えられ
る。[0003] In recent years, there has been a strong demand for the development of cancer chemotherapy which can overcome such disadvantages and can accurately target cancer cells. For that purpose, today, not only receptors such as transferrin receptor and nerve growth factor receptor, but also monoclonal antibodies against various cancer cells such as breast cancer cells and prostate cancer cells are immunotoxins that are bound to various proteintoxins. It is used. Squamous cell carcinomas excessively produce epidermal growth factor (EGF) receptors and grow very rapidly in vivo.
It is also known that the EGF receptor on the cell surface binds to and binds to an antibody, so that the EGF receptor is considered to be an excellent target for therapy for squamous cell carcinoma.
【0004】上皮細胞増殖因子レセプター(EGFR)は細
胞表面レセプターの一つであり、上皮細胞の表面に局在
していることが判明している。一方、EGF については、
その生理学的役割が、歯の発育、胃、肺の発達などにお
いて広範に研究されている。EGF は、特異的な細胞表面
のレセプターと相互作用して、生体内および生体外にお
いて、種々の細胞の増殖を刺激している。そのEGF レセ
プターは、内在性タンパクチロシンキナーゼ活性を持つ
1186個のアミノ酸からなる170,000 ダルトンの膜貫通性
グリコプロテインである。このEGF レセプターの発現
は、増殖中の細胞に限定され、その発現は細胞が分化
し、増殖を停止したときに終了する。またEGF の発現
は、増殖中の細胞が腺細胞に分化した後に起こる。更
に、腫瘍の中心部の末梢細胞では、DNA 合成が盛んに行
われていて、その細胞が急激に増殖している。従って、
EGF レセプターの発現と悪性腫瘍細胞の生育とは直接的
な因果関係があるといえる。[0004] Epidermal growth factor receptor (EGFR) is one of the cell surface receptors and has been found to be localized on the surface of epithelial cells. On the other hand, for EGF,
Its physiological role has been extensively studied in tooth development, stomach and lung development. EGF interacts with specific cell surface receptors to stimulate the growth of various cells in vivo and in vitro. The EGF receptor has endogenous protein tyrosine kinase activity
It is a 170,000 dalton transmembrane glycoprotein consisting of 1186 amino acids. Expression of this EGF receptor is restricted to proliferating cells, and expression ends when the cells differentiate and stop proliferating. EGF expression also occurs after proliferating cells have differentiated into glandular cells. Furthermore, DNA synthesis is actively performed in peripheral cells at the center of the tumor, and the cells are proliferating rapidly. Therefore,
It can be said that there is a direct causal relationship between the expression of EGF receptor and the growth of malignant tumor cells.
【0005】EGF レセプターに対するモノクローナル抗
体(以下、「抗EGF レセプターモノクローナル抗体」と
もいう)は、主に、EGF レセプターを過剰産生する扁平
上皮癌の細胞において過剰産生される低親和性のEGF レ
セプターと免疫反応をする。本発明者らは、EGF レセプ
ターに対するモノクローナル抗体を、60S リポゾーム不
活化蛋白質であるゲロニンに結合させたものを既に報告
している(Hirota,N.,et al.;CANCER RESEARCH;49,7106
-7109,Dec.15,1989 )。このモノクローナル抗体−ゲロ
ニン複合体は、EGF レセプターの数に比例して細胞表面
に結合する。この結合体は、細胞内に嵌入し、蛋白質合
成を阻害し、EGF レセプターを過剰産生する癌細胞を死
滅させることができる。更に、この結合体は、通常のヒ
ト繊維芽細胞に対して僅かに細胞毒性を示すが、EGF レ
セプターが欠失している小細胞肺癌細胞とマウス繊維芽
細胞を死滅させることはない。これに対して、遊離のゲ
ロニンおよびこれらの混合物では、EGF レセプターを過
剰産生する細胞を死滅させることはなかった。これらの
結果から、このモノクローナル抗体−ゲロニン結合体
は、EGF レセプターを過剰産生する扁平上皮癌に対する
標的療法に使用できることを示唆した。[0005] Monoclonal antibodies against the EGF receptor (hereinafter, also referred to as “anti-EGF receptor monoclonal antibodies”) are mainly used for immunization with low-affinity EGF receptors overproduced in squamous cell carcinoma cells that overproduce EGF receptors. React. The present inventors have already reported that a monoclonal antibody against the EGF receptor was bound to gelonin, a 60S liposome-inactivating protein (Hirota, N., et al .; CANCER RESEARCH; 49, 7106).
-7109, Dec. 15, 1989). This monoclonal antibody-gelonin complex binds to the cell surface in proportion to the number of EGF receptors. This conjugate can be inserted into cells, inhibit protein synthesis, and kill cancer cells that overproduce the EGF receptor. Furthermore, the conjugate is slightly cytotoxic to normal human fibroblasts, but does not kill small cell lung cancer cells and mouse fibroblasts deficient in the EGF receptor. In contrast, free gelonin and mixtures thereof did not kill cells that overproduce the EGF receptor. These results suggested that this monoclonal antibody-gelonin conjugate could be used for targeted therapy against squamous cell carcinomas that overproduce the EGF receptor.
【0006】一方、本発明者らはEGF レセプターを認識
するモノクローナル抗体と、扁平上皮癌に対する抗癌剤
であるペプロマイシンとを結合させた結合体も報告して
いる(Osaku,M,.et al.;ANTICANCER RESEARCH,11;1951-
1956,1991 )。この結合体は、PEP 単独よりも低濃度
で、EGF レセプターを過剰産生する扁平上皮癌のA431細
胞を死滅させる。また、この結合体は、EGF レセプター
が扁平上皮癌における多くの症例で過剰産生されている
ことから、EGF レセプターを利用する処置のための有用
な武器となりうると報告した。On the other hand, the present inventors have also reported a conjugate in which a monoclonal antibody recognizing the EGF receptor and pepromycin, which is an anticancer drug against squamous cell carcinoma, are linked (Osaku, M, et al .; ANTICANCER). RESEARCH, 11; 1951-
1956, 1991). This conjugate, at lower concentrations than PEP alone, kills squamous cell carcinoma A431 cells that overproduce the EGF receptor. We also reported that this conjugate could be a useful weapon for treatments utilizing EGF receptors, as the EGF receptor is overproduced in many cases of squamous cell carcinoma.
【0007】上述したように、抗EGF レセプターモノク
ローナル抗体と不活化蛋白質や抗癌剤との結合体が作製
され、臨床での効果が期待されている。しかしながら、
癌という病気の多様性を考慮すると、多種多様な癌療法
を開発することも強く望まれているのが現状である。[0007] As described above, a conjugate of an anti-EGF receptor monoclonal antibody and an inactivated protein or an anticancer agent has been prepared, and clinical effects are expected. However,
At present, it is strongly desired to develop a wide variety of cancer therapies in view of the variety of diseases of cancer.
【0008】かかる要請に応えて、本発明者は、EGF レ
セプター媒介エンドサイトーシスによって、遺伝子と一
緒に内部移行されるモノクローナル抗体を利用する新規
なジーンデリバリーシステムを完成した。このモノクロ
ーナル抗体を、癌の遺伝子治療へのジーンデリバリーシ
ステムに応用する取り組みを提案した。つまり、本発明
者は特開平7−216000に係る発明において、EGF
レセプターに対するモノクローナル抗体と、ポリリジン
とをジスルフィド結合を介して結合させて得られた結合
体をジーンデリバリーシステムに利用することを提案し
ている。In response to this need, the present inventors have completed a novel gene delivery system that utilizes a monoclonal antibody that is internalized with the gene by EGF receptor-mediated endocytosis. We proposed to apply this monoclonal antibody to a gene delivery system for gene therapy of cancer. That is, the inventor of the present invention disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No.
It has been proposed to utilize a conjugate obtained by binding a monoclonal antibody against a receptor to polylysine via a disulfide bond in a gene delivery system.
【0009】しかしながら、特開平7−216000に
係る発明において提案された結合体は、トランスフェク
ションの効率があまり高くなくまた安定性も高いとはい
えない。そのために、トランスフェクションの効率が高
く、より安定性の優れた結合体が望まれた。そこで、本
発明者は特開平10−84959において、EGF レセプ
ターに対するモノクローナル抗体のFab 断片をポリリジ
ンと非分解性のスペーサーで結合させることにより、よ
り高いトランスフェクション活性とより一層安定した結
合体を得た。そしてこの結合体と遺伝子と結合させた複
合体が、該レセプターを過剰生産する癌細胞を標的とす
るジーンデリバリーシステムを構築することを示した。However, the conjugate proposed in the invention according to Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 7-216000 does not have high transfection efficiency and high stability. Therefore, a conjugate having high transfection efficiency and excellent stability was desired. Therefore, the present inventor has disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-84959 that a Fab fragment of a monoclonal antibody against an EGF receptor is bound to polylysine with a non-degradable spacer to obtain a conjugate having higher transfection activity and more stability. . And, it was shown that a complex obtained by binding this conjugate to a gene constructs a gene delivery system targeting cancer cells that overproduce the receptor.
【0010】この特開平10−84959に係る発明に
おいては、抗体の種としてはマウスモノクローナル抗体
を化学修飾して用いているため、異種動物に由来する事
による免疫反応のために臨床応用するには至らなかっ
た。また、DNA 結合部としての荷電性アミノ酸であるリ
ジンと化学修飾して結合させて作製したモノクローナル
抗体であるために、安定して大量生産する事には困難が
あった。In the invention of Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 10-84959, a mouse monoclonal antibody is used as a species of the antibody after chemical modification, so that it can be used clinically for an immune reaction derived from a foreign animal. Did not reach. In addition, since it is a monoclonal antibody produced by chemically modifying and binding to lysine, which is a charged amino acid as a DNA binding portion, it has been difficult to stably mass-produce the antibody.
【0011】[0011]
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者の課題
は、上記ジーンデリバリーシステムであるモノクローナ
ル抗体/DNA 複合体(イムノジーン)を実用に供するた
めに改良を行う事にある。具体的には、免疫原性の問題
を解決する事と、DNA 結合ドメインの改良を行うことに
より大量生産を可能にすることにある。SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present inventors to improve the above-described gene delivery system in order to put a monoclonal antibody / DNA complex (immunogen) into practical use. Specifically, it aims to solve the problem of immunogenicity and to improve the DNA binding domain to enable mass production.
【0012】[0012]
【課題を解決するための手段】上記課題を達成するため
に、本発明者はイムノジーン法の以下の改良を行った。
まず、DNA 結合ドメインの設計・培養条件・精製法に関
する幾多の技術的課題を解決し、抗体分子の化学的修飾
を必要としない一本鎖抗体を利用した「組換えイムノジ
ーン法」による遺伝子導入に成功した。In order to achieve the above object, the present inventors have made the following improvements in the immunogene method.
First, we solved a number of technical issues related to the design, culture conditions, and purification methods of the DNA-binding domain, and introduced gene transfer by the “recombinant immunogene method” using a single-chain antibody that does not require chemical modification of the antibody molecule. Successful.
【0013】本発明のイムノポーターは、特開平10−
84959に係る発明と比較して、モノクローナル抗体
の一本鎖抗体を作製した後にアミノ酸テイルをコードす
る遺伝子を付加し、細菌内で発現させた組み換え蛋白質
であるという特徴を有する。通常の抗体分子は重鎖(H
鎖)と軽鎖(L 鎖)からなる二本鎖の蛋白質であり、抗
体結合部位である可変部分が複数ある。ここで一本鎖抗
体とは、抗体の可変部だけを取り出してリンカーで結合
し、一本鎖の蛋白質が抗体としての機能を有するように
改変した抗体蛋白質のことである。この様な抗体蛋白質
の一本鎖抗体をコードする遺伝子を作製することによ
り、抗体蛋白質を細菌内で発現させた組み換え蛋白質と
して発現させて大量に生産することができるという利点
を有する。The immunoporter of the present invention is disclosed in
As compared with the invention according to No. 84959, it is characterized in that it is a recombinant protein expressed in bacteria by adding a gene encoding an amino acid tail after preparing a single chain antibody of a monoclonal antibody. A normal antibody molecule has a heavy chain (H
Chain) and a light chain (L chain), and has a plurality of variable portions that are antibody binding sites. Here, the single-chain antibody refers to an antibody protein obtained by extracting only the variable region of the antibody and linking it with a linker, so that the single-chain protein has a function as an antibody. By preparing a gene encoding a single-chain antibody of such an antibody protein, there is an advantage that the antibody protein can be expressed as a recombinant protein expressed in bacteria and produced in large quantities.
【0014】また本発明のモノクローナル抗体融合蛋白
質(イムノポーター)においては、抗体分子のフレーム
ワーク部分をヒト型に改変することに成功した。そのた
めに異種動物に由来する事による免疫反応の問題は解決
し、イムノジーン法を実用化する上での最大の問題は解
消された。ヒト型化抗体の抗原認識能を検討したところ
マウス型と同様であった。In the monoclonal antibody fusion protein (immunoporter) of the present invention, the framework portion of the antibody molecule was successfully changed to a human type. Therefore, the problem of the immune reaction caused by the xenogeneic animal was solved, and the biggest problem in putting the immunogene method into practical use was solved. When the antigen recognition ability of the humanized antibody was examined, it was similar to that of the mouse type.
【0015】特開平10−84959に係る発明におい
て、DNA 結合部として荷電性アミノ酸であるリジンの連
続配列を付加したが、リジンの連続配列の付加は一本鎖
抗体産生において酵母でも分泌効率を著しく下げ、大量
産生は困難であった。そのため、本発明において産生効
率と遺伝子導入効率を向上させる目的で、DNA との複合
体形成のために抗体のカルボキシ末端又はアミノ末端に
結合させる種々のアミノ酸テイルを設計し、それを組み
込んだ一本鎖抗体融合蛋白質の遺伝子を作製した。それ
らの大腸菌・酵母での発現効率を検討し、分泌効率が改
善したことを確認できた。荷電性アミノ酸テイルをもつ
一本鎖抗体は、通常の精製法ではカラムに吸着すること
が判明し、試行錯誤の末精製する事が可能となった。精
製した抗体を用いてin vitroで抗体特異的な遺伝子導入
に成功し、その遺伝子導入効率はFab イムノジーンと同
等かそれ以上であった。In the invention according to JP-A-10-84959, a continuous sequence of lysine, which is a charged amino acid, is added as a DNA binding portion. However, the addition of the continuous sequence of lysine significantly increases secretion efficiency even in yeast in producing a single-chain antibody. It was difficult to mass produce. Therefore, in order to improve the production efficiency and the gene transfer efficiency in the present invention, various amino acid tails to be bound to the carboxy or amino terminus of the antibody for forming a complex with DNA are designed, and one of these tails is incorporated. The gene for the chain antibody fusion protein was prepared. The expression efficiency in Escherichia coli and yeast was examined, and it was confirmed that the secretion efficiency was improved. It was found that a single-chain antibody having a charged amino acid tail was adsorbed to a column by a conventional purification method, and it was possible to purify it after trial and error. The antibody-specific gene transfer was successfully performed in vitro using the purified antibody, and the gene transfer efficiency was equal to or higher than that of Fab immunogene.
【0016】[0016]
【発明の実施の形態】本発明は、細胞表面に存在するレ
セプターに対するヒト型のモノクローナル抗体にDNA 結
合部位であるペプチド(以下、アミノ酸テイルともい
う)が結合した構造からなる、細胞表面に存在するレセ
プターに対するモノクローナル抗体融合蛋白質(イムノ
ポーター)ならびに当該抗体融合蛋白質と治療用遺伝子
との複合体である、細胞表面に存在するレセプターに対
するモノクローナル抗体融合蛋白質の複合体(イムノジ
ーン)である。本発明のイムノジーンを用いることによ
り、例えばEGF レセプターの様な細胞表面レセプターを
介して、エンドサイトーシスを利用して細胞内に導入
し、標的とする癌細胞を治療することができる。本発明
はそのようなジーンデリバリーシステムを提供するもの
である。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention resides on a cell surface having a structure in which a peptide (hereinafter also referred to as an amino acid tail) as a DNA binding site is bound to a human-type monoclonal antibody against a receptor present on the cell surface. A monoclonal antibody fusion protein (immunoporter) against a receptor and a complex (immunogen) of a monoclonal antibody fusion protein against a receptor present on the cell surface, which is a complex of the antibody fusion protein and a therapeutic gene. By using the immunogene of the present invention, a target cancer cell can be treated by introducing it into a cell utilizing endocytosis, for example, via a cell surface receptor such as an EGF receptor. The present invention provides such a gene delivery system.
【0017】本発明のイムノポーターにおけるDNA 結合
部位であるペプチド(アミノ酸テイル)は、電荷により
DNA と結合する。即ち、当該イムノポーターにおけるペ
プチドは、正電荷又は負電荷で荷電した90個以下のア
ミノ酸からなるペプチドである。このペプチドが正電荷
で荷電している場合には、DNA と直接結合する事が可能
である。このペプチドが、負電荷で荷電している場合に
は、正電荷高分子でDNA を被覆することによりDNA と結
合することが可能となる。The peptide (amino acid tail), which is a DNA binding site in the immunoporter of the present invention, is charged by an electric charge.
Binds with DNA. That is, the peptide in the immunoporter is a peptide consisting of 90 or less amino acids charged with a positive or negative charge. If the peptide is charged with a positive charge, it can bind directly to DNA. When the peptide is charged with a negative charge, it can be bound to the DNA by coating the DNA with a positively charged polymer.
【0018】より詳細には、本発明のイムノポーターに
おけるアミノ酸テイルの構造は、[Xn Y] m で示される
構造である。なお、ここで、X はリジン、アルギニン、
アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Y はリジン、
アルギニン、アスパラギン酸及びグルタミン酸を除いた
アミノ酸であり、n は1ないし8、m は1ないし10で
ある。または、本発明のイムノポーターにおけるアミノ
酸テイルの構造は、 Xnで示される構造である。ここ
で、X はリジン、アルギニン、アスパラギン酸又はグル
タミン酸であり、n は2ないし8である。More specifically, the structure of the amino acid tail in the immunoporter of the present invention is a structure represented by [X n Y] m . Here, X is lysine, arginine,
Aspartic acid or glutamic acid, Y is lysine,
Amino acids excluding arginine, aspartic acid and glutamic acid, wherein n is 1 to 8 and m is 1 to 10. Alternatively, the structure of the amino acid tail in the immunoporter of the present invention is a structure represented by Xn . Here, X is lysine, arginine, aspartic acid or glutamic acid, and n is 2 to 8.
【0019】X で示されるアミノ酸がリジン、アルギニ
ンであれば、このアミノ酸テイルは正電荷を有し、負電
荷を有するDNA,RNA 等の核酸と直接結合することができ
る。X で示されるアミノ酸がアスパラギン酸、グルタミ
ン酸であれば、このアミン酸は負電荷を有する。その場
合には、負電荷を有するDNA,RNA 等の核酸をポリリジ
ン、ポリエチレンイミンなどの正電荷を有するポリマー
で包含する事により、核酸・ポリマー複合体を正電荷過
剰な状態にすることができる。それにより、[X nY] m
という構造からなるアミノ酸テイルは上記核酸・ポリマ
ー複合体に結合可能となり、更に抗体・ポリマー・核酸
複合体を形成することが可能となる。When the amino acid represented by X is lysine or arginine, this amino acid tail has a positive charge and can directly bind to a nucleic acid such as DNA or RNA having a negative charge. When the amino acid represented by X is aspartic acid or glutamic acid, this amino acid has a negative charge. In this case, the nucleic acid-polymer complex can be made to have an excess of positive charge by including a nucleic acid such as DNA or RNA having a negative charge with a polymer having a positive charge such as polylysine or polyethyleneimine. Thus, [X n Y] m
The amino acid tail having the following structure can be bound to the nucleic acid / polymer complex, and further can form an antibody / polymer / nucleic acid complex.
【0020】本発明のアミノ酸テイルの場合、電荷によ
りDNA と結合するので、荷電性アミノ酸が可能な限り連
続して長い方が有利である。一方、酵母における分泌効
率という意味では荷電性アミノ酸が長いと分泌効率が著
しく低下するので、両者のバランスが大切である。リジ
ンが8個連続した配列でも分泌可能であることから、電
荷を有するアミノ酸の数であるn の値が8以下ならば分
泌可能である。また、テイルの長さが長くなると、分泌
されるときに通過する細胞膜の厚みを越えるために細胞
分泌障害が生じる可能性も考えられる。しかしm の値が
5の場合、DNA結合部の長さは分泌されるときに通過す
る細胞膜の厚みを越えているにもかかわらず分泌障害性
は示さない。よって、DNA 結合部の長さによる分泌障害
性はこれ以上の繰り返しでも同等であり、m の値が10
以下ならば分泌可能である。n の値が8以下であってm
の値が10以下であることを考えると、[X n Y] m の構
造を有するアミノ酸テイルは、90個以下のアミノ酸か
らなる。また、[X n Y] mの機能は抗体分子と独立であ
るために、その位置はアミノ末端側でもカルボキシル末
端側でもDNA 結合部として機能することができる。In the case of the amino acid tail of the present invention, since the amino acid tail binds to DNA by charge, it is advantageous that the charged amino acids are as long as possible. On the other hand, in terms of the secretion efficiency in yeast, the secretion efficiency is significantly reduced if the charged amino acid is long, so that the balance between the two is important. Since a sequence of eight consecutive lysines can be secreted, secretion is possible if the value of n, which is the number of charged amino acids, is 8 or less. In addition, when the length of the tail is increased, the cell secretion disorder may occur because the thickness exceeds the thickness of the cell membrane through which the tail is secreted. However, when the value of m is 5, the secretory disorder is not exhibited even though the length of the DNA binding portion exceeds the thickness of the cell membrane through which the DNA is secreted. Therefore, the secretion impairment due to the length of the DNA binding portion is the same even after further repetition, and the value of m is 10
Secretion is possible if: n is less than or equal to 8 and m
Is less than or equal to 10, the amino acid tail having the structure of [X n Y] m is composed of 90 or less amino acids. In addition, since the function of [X n Y] m is independent of the antibody molecule, its position can function as a DNA binding site at either the amino terminal side or the carboxyl terminal side.
【0021】更に、本発明は上記細胞表面に存在するレ
セプターに対するモノクローナル抗体融合蛋白質(イム
ノポーター)の製造方法である。本発明のイムノポータ
ーは、以下の過程により製造をすることができる。 (1)前記細胞表面に存在するレセプターに対するモノ
クローナル抗体の産生能を有するハイブリドーマ細胞か
ら抽出したmRNAを鋳型として用いて、マウス型モノクロ
ーナル抗体の一本鎖抗体遺伝子をPCR 法で増幅し、
(2)前記マウス型モノクローナル抗体のフレームワー
ク部分を変換することによりヒト型モノクローナル抗体
の一本鎖抗体遺伝子を作製し、(3)前記ヒト型モノク
ローナル抗体の一本鎖抗体遺伝子にアミノ酸テイルをコ
ードする遺伝子を付加することによりヒト型一本鎖イム
ノポーター遺伝子を作製し、(4)前記ヒト型一本鎖イ
ムノポーター遺伝子を細菌内で発現させることによりヒ
ト型一本鎖イムノポーターの組み換え蛋白質を得る。Further, the present invention is a method for producing a monoclonal antibody fusion protein (immunoporter) against a receptor present on the cell surface. The immunoporter of the present invention can be produced by the following steps. (1) using a mRNA extracted from a hybridoma cell capable of producing a monoclonal antibody against a receptor present on the cell surface as a template, amplifying a single-chain antibody gene of a mouse monoclonal antibody by PCR,
(2) a single-chain antibody gene of a human-type monoclonal antibody is prepared by converting the framework part of the mouse-type monoclonal antibody; and (3) an amino acid tail is encoded in the single-chain antibody gene of the human-type monoclonal antibody. And (4) expressing the human-type single-chain immunoporter gene in bacteria to produce a recombinant human-type single-chain immunoporter protein. obtain.
【0022】ここで、ヒト型モノクローナル抗体の一本
鎖抗体遺伝子を作製するとは、マウス由来の配列から、
ヒトの抗体遺伝子由来の配列に置き換えることである。
上述した様に、一本鎖抗体とは抗体分子の可変領域(V
H, VL)をリンカーでつないだ構造を有する抗体であ
る。VHとVLは抗体の内部を形成し、形を保つ働きのフレ
ームワーク領域(FR)と、異物である抗原を認識するた
めのCDR (超可変領域)から成る。EGF レセプターの抗
体分子は、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4という構造
を有している。そこでEGF レセプターを例にとると、ヒ
ト型化という作業はVHとVLにそれぞれ4カ所ずつ、合計
8カ所あるフレームワーク領域をヒト由来の配列に置換
することである。フレームワーク中のアミノ酸の幾つか
は、CDR 中のアミノ酸と相互作用して、CDR の立体構造
を保つために重要であることが知られている。これまで
の知見からその様なアミノ酸配列の位置は予測され、そ
のような部分を除いて置換する事が重要である。Here, the production of a single-chain antibody gene of a humanized monoclonal antibody is based on the sequence derived from a mouse.
In other words, it is to replace with a sequence derived from a human antibody gene.
As described above, a single-chain antibody is defined as the variable region (V
H, VL) with a linker. VH and VL consist of a framework region (FR) that forms the inside of an antibody and maintains its shape, and a CDR (hypervariable region) for recognizing a foreign antigen. The antibody molecule of the EGF receptor has a structure of FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Thus, taking the EGF receptor as an example, the task of humanization is to replace a total of eight framework regions, four each in VH and VL, with human-derived sequences. Some of the amino acids in the framework are known to be important for interacting with the amino acids in the CDR and maintaining the conformation of the CDR. From such findings, the position of such an amino acid sequence is predicted, and it is important to replace such amino acid sequence except for such a portion.
【0023】このようにして得られた本発明の抗体融合
蛋白質(イムノポーター)は、次いで遺伝子との複合体
を形成し、イムノジーンとなる。モノクローナル抗体と
遺伝子であるDNA とは、電荷により結合している。即
ち、本発明のイムノポーターには上述したアミノ酸テイ
ルが結合しており、そのアミノ酸テイルを介してモノク
ローナル抗体と遺伝子は結合する。上述した様にアミノ
酸テイルは正電荷テイル又は負電荷テイルであり、正電
荷テイルの場合には直接DNA と結合し、負電荷テイルの
場合にはDNA を正電荷で分子を被覆したあと負電荷/抗
体を結合させる。The antibody fusion protein (immunoporter) of the present invention thus obtained then forms a complex with a gene to become an immunogene. The monoclonal antibody and the DNA that is the gene are bound by an electric charge. That is, the amino acid tail described above is bound to the immunoporter of the present invention, and the monoclonal antibody and the gene are bound via the amino acid tail. As described above, the amino acid tail is a positively charged tail or a negatively charged tail. In the case of a positively charged tail, the amino acid tail directly binds to DNA. Let the antibody bind.
【0024】原理的にはあらゆるDNA をイムノポーター
に結合して複合体を作製することができ、この複合体を
イムノジーンとして標的とする細胞内に、嵌入(エンド
サイトーシス)の機構を介して移行させることができ
る。このようにイムノジーンによって細胞内に導入でき
る遺伝子は特に限定されるものでなく、使用目的に応じ
て、いずれの遺伝子をも本発明のイムノポーターに結合
し、癌治療などを行う事ができる。本発明は、EGF レセ
プターに対するモノクローナル抗体は当然のことなが
ら、細胞表面に存在するその他のレセプターを標的とす
るモノクローナル抗体についても、エンドサイトーシス
の機構を介して細胞内に導入することができる限り、同
様に応用することができる。In principle, any DNA can be bound to an immunoporter to form a complex, and this complex is transferred into cells targeted as an immunogene via a mechanism of insertion (endocytosis). Can be done. As described above, the gene that can be introduced into cells by the immunogene is not particularly limited, and any of the genes can be bound to the immunoporter of the present invention to perform cancer treatment or the like depending on the purpose of use. The present invention provides a monoclonal antibody against the EGF receptor as well as a monoclonal antibody targeting other receptors present on the cell surface, as long as it can be introduced into cells via an endocytosis mechanism. The same can be applied.
【0025】本発明の目的に最も適うものの1つとし
て、本発明はEGF レセプターを過剰発現している扁平上
皮癌細胞などの癌細胞に応用することができる。この種
の癌細胞には、例えば、ヘルペスウイルスのチミジンキ
ナーゼ遺伝子を効率よく導入した後に、ガンシクロビル
を投与すれば、癌細胞を選択的に死滅させることができ
る。その他の癌抑制遺伝子としては、例えば、ウイルム
ス腫瘍にはWT-1、網膜芽細胞にはRbなどが挙げられる。As one of the most suitable objects of the present invention, the present invention can be applied to cancer cells such as squamous cell carcinoma cells overexpressing the EGF receptor. For example, by efficiently introducing a thymidine kinase gene of a herpes virus into this kind of cancer cells and then administering ganciclovir, the cancer cells can be selectively killed. Other tumor suppressor genes include, for example, WT-1 for Wilms tumor and Rb for retinoblasts.
【0026】更には、癌遺伝子(オンコジーン)が過剰
発現しているものには、アンチセンス発現ベクターなど
を導入して、抑制することもできる。更にまた、本発明
にかかる複合体ならびにエンドサイトーシスを適用する
ことができるその他の癌としては、例えばBeckwith-Wie
demann症候群(例えば、ヘパトーマ、横紋筋肉腫、ウイ
ルムス腫瘍など)、膀胱癌、Ewing 肉腫などが挙げられ
る。つまり、本発明は、当該遺伝子を結合させて癌細胞
に導入して、所謂遺伝子治療に応用することができる。Furthermore, those in which the oncogene (oncogene) is overexpressed can be suppressed by introducing an antisense expression vector or the like. Furthermore, other cancers to which the complex of the present invention and endocytosis can be applied include, for example, Beckwith-Wie
demann syndrome (eg, hepatoma, rhabdomyosarcoma, Wilms tumor, etc.), bladder cancer, Ewing sarcoma and the like. That is, the present invention can be applied to so-called gene therapy by binding the gene and introducing it into cancer cells.
【0027】更に本発明は、配列表の配列番号1に示
す、アミノ酸番号1−258で示されるアミノ酸配列か
らなることを特徴とする、ポリペプチドである。当該配
列はB4G7抗体から得た、上皮細胞レセプターに対するマ
ウス型の一本鎖抗体のアミノ酸配列である。配列表の配
列番号1に示すアミノ酸配列において、1ないし数アミ
ノ酸が欠失、置換若しくは付加された構造からなるポリ
ペプチドもまた、上皮細胞増殖因子レセプターと結合す
る活性を有する限り、本発明の範囲内である。ここで、
1ないし数アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたと
は、10個以内のアミノ酸の変換を意味する。尚、当該
配列のアミノ酸番号 39-44、58-74 、107-115 、165-17
5 、191-197 及び231-238 の部分は抗原認識部位であ
り、この部分を変換することは上皮細胞増殖因子レセプ
ターと結合する活性を失わせることであり、不適切であ
る。[0027] The present invention further provides a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1-258 shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing. This sequence is the amino acid sequence of a mouse-type single chain antibody against the epithelial cell receptor obtained from the B4G7 antibody. In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a polypeptide having a structure in which one or several amino acids are deleted, substituted or added is also within the scope of the present invention, as long as it has an activity of binding to an epidermal growth factor receptor. Is within. here,
Deletion, substitution or addition of one or several amino acids means conversion of up to 10 amino acids. In addition, amino acid numbers 39-44, 58-74, 107-115, 165-17 of the sequence
5, portions 191-197 and 231-238 are antigen recognition sites, and converting this portion results in loss of the activity of binding to the epidermal growth factor receptor, which is inappropriate.
【0028】更に本発明は、配列表の配列番号2に示
す、アミノ酸番号1−258で示されるアミノ酸配列か
らなることを特徴とする、ポリペプチドである。当該配
列は、上記のマウス型抗体のフレームワーク領域をヒト
抗体型に変換した、ヒト型の一本鎖抗体(後述するCaC
型)の配列である。配列表の配列番号2に示すアミノ酸
配列において、1ないし数アミノ酸が欠失、置換若しく
は付加された構造からなるポリペプチドもまた、上皮細
胞増殖因子レセプターと結合する活性を有する限り、本
発明の範囲内である。ここで、1ないし数アミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されたとは、10個以内のアミノ
酸の変換を意味する。マウス型の抗体と同様に、当該配
列のアミノ酸番号 39-44、58-74 、107-115 、165-175
、191-197及び231-238 の部分は抗原認識部位であり、
この部分を変換することは上皮細胞増殖因子レセプター
と結合する活性を失わせることであり、不適切である。
本明細書においてはEGF レセプターに対するモノクロー
ナル抗体を例に挙げて説明するが、本発明はその範囲に
限定されるものではない。Further, the present invention relates to a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1-258 shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. The sequence is a human-type single chain antibody (CaC described later) obtained by converting the framework region of the mouse-type antibody into a human antibody type.
Array). In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, a polypeptide having a structure in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added is also within the scope of the present invention so long as it has an activity of binding to an epidermal growth factor receptor. Is within. Here, deletion, substitution or addition of one or several amino acids means conversion of up to 10 amino acids. Amino acid numbers 39-44, 58-74, 107-115, 165-175 of the sequence as in the case of the mouse antibody
, 191-197 and 231-238 are antigen recognition sites,
Converting this moiety results in loss of activity binding to the epidermal growth factor receptor and is inappropriate.
In this specification, a monoclonal antibody against the EGF receptor will be described as an example, but the present invention is not limited to this range.
【0029】[0029]
【実施例】(一本鎖抗体遺伝子の作製)ファルマシア社
組換え一本鎖抗体作製キットを用い、B4G7抗体産生ハイ
ブリドーマ細胞から抽出したmRNAを鋳型に用いて一本鎖
抗体遺伝子をPCR 法で増幅した。ファルマシア社ベクタ
ーpCANTAB5E に組み込みキットのマニュアルに従い一本
鎖抗体発現ファージを得た。ファージは、ホルマリン固
定したA431細胞を抗原としてスクリーニング・濃縮(4
回)を行ったのち、クローニングし、強陽性クローンを
同定した。クローンからプラスミドを調製し(pCANTAB5E
-scB) 、塩基配列決定後、さらにHis タグを組み込む改
変を行い、発現ベクターpBH を得た。図1にpBH の一本
鎖抗体部分の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。な
お、ベクターのその他の部分はほぼ同一である。図1に
おいて、下線部は一本鎖抗体遺伝子(VH-Linker-VL)を、
3カ所の斜体字部分は上からg3分泌シグナル配列、一本
鎖抗体内部リンカーアミノ酸配列及びE-tag アミノ酸配
列を、それぞれ示す。[Example] (Preparation of single-chain antibody gene) Amplification of single-chain antibody gene by PCR using Pharmacia's recombinant single-chain antibody preparation kit and mRNA extracted from B4G7 antibody-producing hybridoma cells as template did. A phage expressing a single-chain antibody was obtained according to the manual of the kit incorporated into the Pharmacia vector pCANTAB5E. Phage was screened and concentrated using formalin-fixed A431 cells as antigen (4.
), And cloned to identify a strongly positive clone. Prepare plasmid from clone (pCANTAB5E
-scB), after determining the nucleotide sequence, further modification to incorporate a His tag was performed to obtain an expression vector pBH. FIG. 1 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of the single-chain antibody portion of pBH. The other parts of the vector are almost the same. In FIG. 1, the underlined portion indicates the single-chain antibody gene (VH-Linker-VL),
The three italicized portions indicate a g3 secretion signal sequence, a single-chain antibody internal linker amino acid sequence, and an E-tag amino acid sequence from the top, respectively.
【0030】(一本鎖抗体遺伝子の発現及び精製)上記
のpBH を大腸菌HB2151株に導入し、IPTG 1mMを添加し4
時間発現誘導を行った。大腸菌を回収して4 ℃、PBS,1m
M EDTA,0.1% tween20 中で撹拌し、抽出液を得た。それ
をPBS に対して透析し、透析液中に存在する一本鎖抗体
であるscBHをQiagen社Ni-NTAカラムで精製した。(Expression and purification of single-chain antibody gene) The above pBH was introduced into Escherichia coli HB2151, and 1 mM of IPTG was added.
Time expression induction was performed. Collect Escherichia coli, 4 ° C, PBS, 1m
The mixture was stirred in M EDTA, 0.1% tween20 to obtain an extract. It was dialyzed against PBS, and the single-chain antibody scBH present in the dialysate was purified with a Qiagen Ni-NTA column.
【0031】(一本鎖抗体の抗体価の評価)西洋わさび
ペルオキシダーゼ(HRP )で標識したB4G7抗体と、未標
識B4G7抗体、一本鎖scBH抗体または後述する組換えイム
ノポーターscHBFLを混合し、ホルマリン固定したA431細
胞を抗原として競合ELISA を行った。結果を図2に示
す。図2に示すように、一本鎖scBH抗体はB4G7抗体と同
じ抗原(EGFレセプター)を認識し、抗体一価あたりの結
合力は約1/3 であった。(Evaluation of antibody titer of single-chain antibody) B4G7 antibody labeled with horseradish peroxidase (HRP) and an unlabeled B4G7 antibody, single-chain scBH antibody or a recombinant immunoporter scHBFL described later were mixed and mixed with formalin. Competition ELISA was performed using the fixed A431 cells as an antigen. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 2, the single-chain scBH antibody recognized the same antigen (EGF receptor) as the B4G7 antibody, and the binding force per antibody monovalent was about 1/3.
【0032】(一本鎖抗体遺伝子のイムノポーター遺伝
子への変換)一本鎖抗体遺伝子scBHを改変して、種々の
イムノポーター遺伝子を作製した。scBHに以下の塩基配
列を付加して、正電荷テイルを有するイムノポーターを
コードするscHBFL遺伝子を作製した。即ち、scBH遺伝子
の5'末端及び3'末端に、図3(1)に示す配列を付加し
て、scHBFLを作製した。5'末端においては、scBH遺伝子
のVH領域であるCAGGTGCAGCTGCAGCAG(GlnValGlnLeuGlnG
ln)に、ヒスチジンタグをコードする遺伝子を付加し
た。3'末端においては、scBH遺伝子のVL領域であるAAGT
TGGAAATAAAA (LysLeuGluIleLys )に、テイルの運動性
を保つためのリンカーであるGATTATAAAGAT(AspTyrLysA
sp)、テイルであるLysLysLysLysLysLysLysLys(即ち
(Lys)8 )をコードする遺伝子、及びベクターへ組み込
むための制限酵素EcoRI 切断部位(GAATTC)を付加し
た。(Conversion of Single-Chain Antibody Gene to Immunoporter Gene) Various immunoporter genes were prepared by modifying the single-chain antibody gene scBH. The scHBFL gene encoding an immunoporter having a positively charged tail was prepared by adding the following nucleotide sequence to scBH. That is, the sequence shown in FIG. 3A was added to the 5 ′ end and 3 ′ end of the scBH gene to prepare scHBFL. At the 5 'end, CAGGTGCAGCTGCAGCAG (GlnValGlnLeuGlnG, which is the VH region of the scBH gene)
(ln), a gene encoding a histidine tag was added. At the 3 ′ end, AAGT which is the VL region of the scBH gene
TGGAAATAAAA (LysLeuGluIleLys) and GATTATAAAGAT (AspTyrLysA), which is a linker to maintain tail motility
sp), the tail LysLysLysLysLysLysLysLys (ie,
A gene encoding (Lys) 8 ) and a restriction enzyme EcoRI cleavage site (GAATTC) for integration into a vector were added.
【0033】scBHに図3(2)に示す塩基配列を付加し
て、やはり正電荷テイルを有するイムノポーター遺伝子
であるscHBFL20を作製した。scBH遺伝子の5'末端及び3'
末端に、以下の配列を付加して、scHBFLを作製した。5'
末端においては、scBH遺伝子のVH領域であるCAGGTGCAGC
TGCAGCAG(GlnValGlnLeuGlnGln)に、ヒスチジンタグを
コードする遺伝子を付加した。3'末端においては、scBH
遺伝子のVL領域であるAAGTTGGAAATAAAA (LysLeuGluIle
Lys )に、リンカーであるGATTATAAAGATGACGATGAC (As
pTyrLysAspAspAspAsp )、テイルであるLysLysLysLysHi
sLysLysLysLysHisLysLysLysLysHisLysLysLysLysHisLysL
ysLysLysHis (即ち [(Lys)4His]5 )をコードする遺伝
子、及びベクターへ組み込むためのEcoRI 切断部位(GA
ATTC)を付加した。By adding the nucleotide sequence shown in FIG. 3 (2) to scBH, scHBFL20, which is also an immunoporter gene having a positively-charged tail, was prepared. 5 'end and 3' of scBH gene
The following sequences were added to the ends to prepare scHBFL. Five'
At the end, CAGGTGCAGC, the VH region of the scBH gene
A gene encoding a histidine tag was added to TGCAGCAG (GlnValGlnLeuGlnGln). At the 3 'end, scBH
AAGTTGGAAATAAAA (LysLeuGluIle
Lys) with the linker GATTATAAAGATGACGATGAC (As
pTyrLysAspAspAspAsp), the tail LysLysLysLysHi
sLysLysLysLysHisLysLysLysLysHisLysLysLysLysHisLysL
a gene encoding ysLysLysHis (ie [(Lys) 4 His] 5 ) and an EcoRI cleavage site (GA
ATTC).
【0034】更に、下記の方法により新規一本鎖抗体遺
伝子(scHBH )を作製し、更に負電荷テイルをコードす
る遺伝子を接続することにより、負電荷イムノポーター
遺伝子であるDS4x5 を作製した。scHBH 遺伝子は、上記
の一本鎖抗体遺伝子であるscBH遺伝子に、図3(3)に
示す塩基配列を付加することにより作製した。5'末端に
おいては、scBH遺伝子のVH領域であるCAGGTGCAGCTGCAGC
AG(GlnValGlnLeuGlnGln)に、ヒスチジンタグをコード
する遺伝子を付加した。3'末端においては、scBH遺伝子
のVL領域であるACAAAGTTGGAAATAAAA(ThrLysLeuGluIleL
ys)にリンカー(CATCACCATCACCATCACGGTGGCGGTTCT)及
びベクターへ組み込むためのEcoRI 切断部位(GAATTC)
を付加して、大腸菌発現ベクターに組み込める様にした
遺伝子を作製した。また、3'末端にscBH遺伝子のVL領域
であるACAAAGTTGGAAATAAAA(ThrLysLeuGluIleLys)にヒ
スチジンタグをコードする遺伝子及びショートリンカー
であるGGTGGCGGTTCT(GlyGlyGlySer)を付加して、Pich
ia菌に組み込めるようにした遺伝子もまた作製した。Further, a novel single-chain antibody gene (scHBH) was prepared by the following method, and a gene encoding a negatively charged tail was further connected to prepare a negatively charged immunoporter gene, DS4x5. The scHBH gene was prepared by adding the base sequence shown in FIG. 3 (3) to the scBH gene, which is the above single-chain antibody gene. At the 5 'end, CAGGTGCAGCTGCAGC which is the VH region of the scBH gene
A gene encoding a histidine tag was added to AG (GlnValGlnLeuGlnGln). At the 3 'end, the VL region of the scBH gene, ACAAAGTTGGAAATAAAA (ThrLysLeuGluIleL
ys) to a linker (CATCACCATCACCATCACGGTGGCGGTTCT) and an EcoRI cleavage site (GAATTC) for integration into a vector
Was added to prepare a gene that could be incorporated into an E. coli expression vector. Further, a gene encoding a histidine tag and a short linker GGTGGCGGTTCT (GlyGlyGlySer) were added to the 3 'end of the scBH gene VL region ACAAAGTTGGAAATAAAA (ThrLysLeuGluIleLys), and Pich was added.
A gene that could be integrated into ia was also made.
【0035】scBHに上記の塩基配列を付加して作製した
scHBH の3'末端に、図3(4)に示す構造の塩基配列を
付加して負電荷イムノポーター遺伝子であるDS4x5 を作
製した。scHBH 遺伝子に結合した上記のショートリンカ
ー(GGTGGCGGTTCT)に、負電荷テイルであるAspAspAspA
spSerAspAspAspAspSerAspAspAspAspSerAspAspAspAspSer
AspAspAspAspSer ([(Asp)4Ser]5)、及びベクターへ組
み込むためのEcoRI 切断部位(GAATTC)を付加した。付
加した配列の詳細を、図3(4)に示す。The scBH was prepared by adding the above nucleotide sequence to scBH.
A base sequence having the structure shown in FIG. 3 (4) was added to the 3 ′ end of scHBH to prepare DS4x5, a negatively-charged immunoporter gene. The above-mentioned short linker (GGTGGCGGTTCT) linked to the scHBH gene is added to the negative charge tail AspAspAspA.
spSerAspAspAspAspSerAspAspAspAspSerAspAspAspAspSer
AspAspAspAspSer ([(Asp) 4 Ser] 5 ) and an EcoRI cleavage site (GAATTC) for integration into the vector were added. Details of the added sequence are shown in FIG.
【0036】上記のscHBFL、scHBFL20及びD4Sx5 につい
て遺伝子発現を試みた。尚、その他に正電荷テイルであ
る(Lys)8Ser (K8S )、(Arg)8Ser (R8S )、[(Arg)8S
er]2(R4Sx2 )、[(Arg)8Ser]5(R4Sx5 )、[(Lys)4Se
r]5(K4Sx5 )、[(Lys)4His]5(K4Hx5 )及び負電荷テ
イルである(Gln)8Ser (E8S )、(Asp)8Ser (D8S )、
[(Asp)4Ser]2(D4Sx2 )を作製した。Gene expression of scHBFL, scHBFL20 and D4Sx5 was attempted. In addition, (Lys) 8 Ser (K8S), (Arg) 8 Ser (R8S), [(Arg) 8 S
er] 2 (R4Sx2), [(Arg) 8 Ser] 5 (R4Sx5), [(Lys) 4 Se
r] 5 (K4Sx5), [(Lys) 4 His] 5 (K4Hx5) and the negative charge tails (Gln) 8 Ser (E8S), (Asp) 8 Ser (D8S),
[(Asp) 4 Ser] 2 (D4Sx2) was prepared.
【0037】(組換えイムノポーター遺伝子の発現)In
vitrogen社製Pichia発現キットを用いて、組換えイムノ
ポーター遺伝子の発現を行った。まず部位特異的変異導
入法によりInvitorogene社製pPIC9Kのneomycin耐性遺伝
子領域内のXho I 切断部位ctcgag配列をcttgagに、ampi
cillin耐性遺伝子領域内のSca I 切断部位agtact配列を
agtattに置換することにより、pPIC9Kdel の作製を行っ
た。得られたpPIC9Kdel の全塩基配列を図4に示す。(Expression of recombinant immunoporter gene)
The expression of the recombinant immunoporter gene was performed using a Pichia expression kit manufactured by vitrogen. First, the Xho I cleavage site ctcgag sequence in the neomycin resistance gene region of pPIC9K manufactured by Invitrogene
The Sca I cleavage site in the cillin resistance gene region
By substituting with agtatt, pPIC9Kdel was prepared. FIG. 4 shows the entire nucleotide sequence of the obtained pPIC9Kdel.
【0038】そして、scHBFL、scHBFL20およびD4Sx5 遺
伝子の5'端にPCR 法により以下の配列を付加した。即
ち、scHBFLにつきCTC GAG AAA AGA 、scHBFL20およびD4
Sx5 につきCTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT を付加し
た。そして、Invitrogen社製pPIC9 (scHBFL遺伝子)、
pPIC9Kdel (scHBFL20およびD4Sx5 遺伝子)のXho I-Ec
oRI 部位に挿入した。キットに従い、作製したプラスミ
ドを制限酵素Bgl IIで切断し、Pichia pastrisGS115 株
にエレクトロポレーション法で導入し最少培地で選択し
形質転換株を得た。形質転換株をメタノール含有寒天培
地で生育させ、メタノール耐性度から、MetS( 感受性
株)とMet+(耐性株)の二群に分類した。キットに従
い、培地にメタノールを添加し発現を誘導した。scHBFL
20およびD4Sx5に関して、分解産物と思われるものが多
く正常な産物が得られなかった。そこで、形質転換株を
0.5Mないし1M NaCl を含む培地に馴化させてから、0.5M
ないし1MNaCl を含む培地中で発現誘導を行うと、正常
産物の収量を増大させることが可能となった。発現誘導
した培地の培養上清を用いてタンパクを抗Flag抗体で検
出したウェスタンブロットの結果を図5に示す。図5に
おいて、目的とする抗体蛋白質の位置を矢印で示す。測
定したどのクローンにおいても、抗体蛋白質が検出され
た。Then, the following sequences were added to the 5 'end of the scHBFL, scHBFL20 and D4Sx5 genes by PCR. That is, CTC GAG AAA AGA, scHBFL20 and D4 per scHBFL
For Sx5, CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT was added. And Invitrogen's pPIC9 (scHBFL gene),
Xho I-Ec of pPIC9Kdel (scHBFL20 and D4Sx5 genes)
Inserted at the oRI site. According to the kit, the prepared plasmid was digested with restriction enzyme BglII, introduced into Pichia pastris GS115 strain by electroporation, and selected with minimal medium to obtain a transformant. The transformed strain was grown on an agar medium containing methanol, and classified into two groups, MetS (sensitive strain) and Met + (resistant strain), based on the degree of methanol tolerance. According to the kit, methanol was added to the medium to induce expression. scHBFL
Regarding 20 and D4Sx5, many were considered to be degradation products, and normal products could not be obtained. Therefore, the transformed strain
After acclimation to a medium containing 0.5M to 1M NaCl, 0.5M
When expression was induced in a medium containing 1 to 1 M NaCl, it was possible to increase the yield of normal products. FIG. 5 shows the results of Western blotting in which a protein was detected with an anti-Flag antibody using the culture supernatant of the culture medium in which expression was induced. In FIG. 5, the position of the target antibody protein is indicated by an arrow. Antibody protein was detected in all the clones measured.
【0039】(組換えイムノポーターの精製)以下のよ
うにして、組換えイムノポーターの精製を行った。scHB
FLについては、発現誘導した培地から菌体を遠心分離
し、上清をPBS に対して透析した。それをQiagen社製Ni
-NTAレジンを用いてアフィニティ精製しさらにPBS に対
して透析した。scHBFL20およびD4Sx5 については、0.5M
NaCl 含有培地で発現誘導した培地上清を、20mM Tris
HCl (pH7.5)-250mM NaClで3 倍に希釈し、ファルマシア
社イオン交換レジンSTREAMLINE-S(D4Sx5 の場合は-Q)
に吸着させ、同緩衝液で洗浄後、20mM Tris HCl (pH7.
5)-1M NaCl で溶出した。ついで、クロンテック社製TAL
ON レジンに吸着させ、100mM EDTA (pH8.0)で溶出し
た。溶出サンプルに濾過膜への吸着を防ぐために0.5M N
aCl を添加し限外濾過濃縮を行った。濃縮サンプルを、
イムノポーターのレジンへの吸着を防ぐために1M Argin
ine HCl-5% Glycerol (D4Sx5の場合は1M Sodium Glutam
ate -5% Glycerol) で平衡化したファルマシア社superd
ex 75 ゲル濾過カラムで精製した。イムノポーターを含
む分画を、0.6M NaCl に対して透析し、さらに限外濾過
濃縮を行った。(Purification of Recombinant Immunoporter) The recombinant immunoporter was purified as follows. scHB
For FL, cells were centrifuged from the medium in which expression was induced, and the supernatant was dialyzed against PBS. It is Ni made by Qiagen
The mixture was affinity-purified using -NTA resin and dialyzed against PBS. 0.5M for scHBFL20 and D4Sx5
The culture supernatant induced in the medium containing NaCl was washed with 20 mM Tris
HCl (pH7.5) -250 mM NaCl 3 times diluted, Pharmacia ion exchange resin STREAMLINE-S (-Q for D4Sx5)
After washing with the same buffer, 20 mM Tris HCl (pH 7.
5) Eluted with -1M NaCl. Next, Clontech TAL
It was adsorbed to ON resin and eluted with 100 mM EDTA (pH 8.0). 0.5MN for eluted sample to prevent adsorption to filtration membrane
aCl was added and ultrafiltration concentrated. The concentrated sample
1M Argin to prevent immunoporter from adsorbing to resin
ine HCl-5% Glycerol (1M Sodium Glutam for D4Sx5
ate -5% Glycerol)
Purified on an ex 75 gel filtration column. The fraction containing the immunoporter was dialyzed against 0.6 M NaCl and further concentrated by ultrafiltration.
【0040】(組換えイムノポーターによる遺伝子導
入)以下のようにして、組換えイムノポーターによる遺
伝子導入を行った。schBFLについては、精製したscHBFL
とプラスミド(β−ガラクトシダーゼ発現ベクター)を
混合し30分放置し、さらにポリ-L- リジンを混合し30分
放置してから、10%血清を含む培養液に添加した。二日
後に細胞を固定しX-Gal 染色を行い、青染細胞を計数し
遺伝子導入効率を検討した。NA細胞及びA431細胞
による結果を図6に示す。schBFLについては、ポリ-L-
リジンを添加しないと遺伝子導入は観察されなかった。
ここでポリ-L- リジンは、DNA が分解することを防ぐ保
護剤として作用していると思われる。(Gene Transfer by Recombinant Immunoporter) Gene transfer by a recombinant immunoporter was performed as follows. For schBFL, purified scHBFL
And a plasmid (β-galactosidase expression vector) were mixed and allowed to stand for 30 minutes. Poly-L-lysine was further mixed and allowed to stand for 30 minutes, and then added to a culture solution containing 10% serum. Two days later, the cells were fixed and subjected to X-Gal staining, the number of blue-stained cells was counted, and the gene transfer efficiency was examined. FIG. 6 shows the results for NA cells and A431 cells. For schBFL, poly-L-
No gene transfer was observed without the addition of lysine.
Here, poly-L-lysine is thought to act as a protective agent to prevent DNA degradation.
【0041】scHBFL20については、以下の標準的遺伝子
導入法を用いた。まず、DNA(0.25μg)とscHBFL20(2.5μ
g)を15μL HBS[20mM Hepes(pH7.4), 150mM NaCl]中で混
合し30分放置、その後PEI(ポリエチレンイミン:平均分
子量25K)溶液(15μL,HBS )と素早く混合し、さらに30
分放置した。そして、20% コンフルエント状態のA431細
胞を植えたウェルあたり0.5mL の[DMEM,10%FBS, Kanamy
cin]を含む24well-culture dish に滴下した。更に、40
時間後、X-gal 染色を行い、青染した細胞を計数した。
scHBFL20/DNA/PEI複合体形成をHBS で行うとscHBFL20依
存的に遺伝子導入された(図7)。また、scHBFL20/DNA
/PEI複合体形成をPBS[20mM Na-PO4(pH7.4), 150mM NaC
l] 下で行うと遺伝子導入のscFv依存性がなくなった
(図8)。ここでPEI はポリ-L- リジンと同様に、保護
剤として作用していると思われる。For scHBFL20, the following standard gene transfer method was used. First, DNA (0.25 μg) and scHBFL20 (2.5 μ
g) was mixed in 15 μL HBS [20 mM Hepes (pH 7.4), 150 mM NaCl] and allowed to stand for 30 minutes, and then quickly mixed with a PEI (polyethyleneimine: average molecular weight 25K) solution (15 μL, HBS), and further mixed for 30 minutes.
Left for a minute. Then, 0.5 mL of [DMEM, 10% FBS, Kanamy
[cin] was dropped into a 24-well-culture dish. In addition, 40
After time, X-gal staining was performed and blue-stained cells were counted.
When a scHBFL20 / DNA / PEI complex was formed in HBS, the gene was transferred in a scHBFL20-dependent manner (FIG. 7). Also, scHBFL20 / DNA
/ PEI complex formation with PBS (20 mM Na-PO4 (pH 7.4), 150 mM NaC
l], the scFv dependency of gene transfer was eliminated (FIG. 8). Here, PEI seems to act as a protective agent, similarly to poly-L-lysine.
【0042】(一本鎖抗体遺伝子のマウス型からヒト型
への変換)B4G7抗体より得たマウス型一本鎖抗体である
scBH抗体の配列を基にして、scBH抗体の可変ループドメ
イン(抗原認識部位;下図下線部)以外のフレームワー
クアミノ酸配列に類似したヒト抗体フレームワークアミ
ノ酸配列をデータベースで検索した。それらのうちCDR
ループ立体構造維持に重要だと推定されるアミノ酸およ
びVL/VH 境界面で保存されているアミノ酸をできるだけ
置換しないフレームワークを選択することによりヒト型
化を行った。また、ヒト型に変換することにより抗原結
合能が変化した場合を想定し、VH・VL領域のどちらかが
マウス型(scBH抗体由来)のキメラ抗体も作製した。(Conversion of single-chain antibody gene from mouse type to human type) Mouse type single-chain antibody obtained from B4G7 antibody
Based on the scBH antibody sequence, a database was searched for a human antibody framework amino acid sequence similar to the framework amino acid sequence other than the variable loop domain (antigen recognition site; underlined in the lower figure) of the scBH antibody. CDR out of them
Humanization was performed by selecting a framework that does not replace amino acids presumed to be important for maintaining the loop conformation and amino acids conserved at the VL / VH interface as much as possible. In addition, assuming that the antigen-binding ability was changed by conversion to a human type, a chimeric antibody in which either the VH or VL region was a mouse type (derived from scBH antibody) was also prepared.
【0043】ここで、キメラ抗体作製用にscBH抗体遺伝
子に各種制限酵素部位を導入した、マウス改変型(BB
型) 遺伝子の塩基配列及びアミノ酸を図9に示す。図9
において、アミノ酸番号 9-126までがVH領域であり、イ
タリックで示すアミノ酸番号127-141 がリンカー配列で
あり、アミノ酸 142-248までがVL領域である。マウス型
であるB 型を基にして、そのVH領域のフレームワーク部
分をヒト由来の配列に置き換えたD 型を設計した。ま
た、D 型においてマウス型フレームワーク部分中におい
て重要だと思われるアミノ酸を残した配列であるCa型,C
v 型を設計した。これら3つの構造を比較し、よりヒト
抗体に近い順番に並べると、D 型が一番ヒト抗体に近
く、次いでCa型、Cv型の順番になる。また、ヒト型VL領
域の配列であるC 型も設計した。Here, a modified mouse (BB) in which various restriction enzyme sites were introduced into the scBH antibody gene for producing a chimeric antibody.
(Type) The nucleotide sequence and amino acids of the gene are shown in FIG. FIG.
, The amino acid numbers 9-126 are the VH region, the amino acid numbers 127-141 shown in italics are the linker sequence, and the amino acids 142-248 are the VL region. Based on the mouse type B, a type D was designed in which the framework portion of the VH region was replaced with a human-derived sequence. In addition, Ca-type and C-type sequences that retain amino acids thought to be important in the mouse-type framework part in D-type
v Designed the type. When these three structures are compared and arranged in the order closer to the human antibody, the D type is closest to the human antibody, followed by the Ca type and Cv type. In addition, C-type, which is a sequence of the human-type VL region, was also designed.
【0044】その様にして作製した、マウス・ヒトキメ
ラ抗体を図10から図13に示す。図10に示すCvB 型
はVH領域がヒト型であるCv型、VL領域がマウス型である
B 型のキメラである。図11に示すCaB 型はVH領域がヒ
ト型であるCa型、VL領域がマウス型であるB 型のキメラ
である。図12に示すDB型はVH領域がヒト型であるD
型、VL領域がマウス型であるB 型のキメラである。更
に、作製したヒト型抗体を図14から図16に示す。即
ち、図14に示すCvC 型はVH領域がCv型、VL領域がC 型
のヒト型抗体である。図15に示すCaC 型はVH領域がCa
型、VL領域がC 型のヒト型抗体である。図16に示すDC
型はVH領域がD 型、VL領域がC 型のヒト型抗体である。
図9から図16において、斜体字は抗体遺伝子に付加し
た配列およびVHとVLを連結するリンカー配列を、下線部
は可変ループドメインを、それぞれ示す。The mouse / human chimeric antibody thus produced is shown in FIGS. The CvB type shown in FIG. 10 is a Cv type in which the VH region is human, and a mouse type in the VL region
It is a type B chimera. The CaB type shown in FIG. 11 is a Ca-type chimera whose human VH region is a human type and a B-type chimera whose VL region is a mouse type. DB type shown in FIG.
Type and VL region are mouse type B chimeras. 14 to 16 show the prepared humanized antibodies. That is, the CvC type shown in FIG. 14 is a humanized antibody in which the VH region is Cv type and the VL region is C type. In the CaC type shown in FIG.
Type and VL regions are human type C antibodies. DC shown in FIG.
The type is a human antibody in which the VH region is D-type and the VL region is C-type.
9 to 16, the italic letters indicate the sequence added to the antibody gene and the linker sequence connecting VH and VL, and the underlined part indicates the variable loop domain.
【0045】(ヒト型一本鎖抗体遺伝子の発現)上記に
おいて得たヒト型一本鎖抗体遺伝子の両端に制限酵素部
位(Nco IおよびEco RI) を導入し、Novagen 社製大腸菌
発現ベクターpET22bを高コピー型に改変したpET22bhcの
Nco I-Eco RI部位に導入した。作製した発現ベクターを
Novagen社製大腸菌株BL21(DE3) に導入し、IPTGで発現
誘導を行った。大腸菌全タンパク中の一本鎖抗体を抗5x
His 抗体(Qiagene 社製)を用いてウエスタンブロット
法で検出した。ウエスタンブロットの結果を、図17に
示す。Novagen 社製pET22bのPsh AI-Sca I領域をSTRATA
GEN 社製pBluescript II SK(-)の Pvu II-Sca I 断片と
置換することにより、pET22bhcを作製した。pET22bhcの
全塩基配列を、図18に示す。(Expression of human single-chain antibody gene) Restriction enzyme sites (NcoI and EcoRI) were introduced into both ends of the human single-chain antibody gene obtained above, and the Escherichia coli expression vector pET22b manufactured by Novagen was used. PET22bhc modified to high copy type
It was introduced at the Nco I-Eco RI site. The prepared expression vector
It was introduced into Novagen E. coli strain BL21 (DE3), and expression was induced with IPTG. Anti-5x single-chain antibody in all E. coli proteins
Detection was performed by Western blotting using a His antibody (Qiagene). The result of the Western blot is shown in FIG. The Psh AI-Sca I region of Novagen's pET22b was
PET22bhc was prepared by substituting the PvuII-ScaI fragment of pBluescript II SK (-) manufactured by GEN. FIG. 18 shows the entire nucleotide sequence of pET22bhc.
【0046】(ヒト型一本鎖抗体の精製)発現誘導した
大腸菌菌体を可溶化バッファー(6M Guanidine HCl, 20m
M Tris HCl (pH8.0), 10mM b-mercatoetanol, 25mM Imi
dazol)に懸濁し、可溶化タンパクを遠心分離した。可溶
化タンパクを含む上清中の一本鎖抗体をCLONTEC 社製TA
LON レジンに吸着・0.1M EDTA を含む可溶化バッファー
で溶出することによりアフィニティー精製した。精製し
た一本鎖抗体溶液をリフォールディングバッファーで透
析し、最後にPBS で透析しタンパク巻き戻しを行った。
リフォールディングバッファーは20mM Tris HCl (pH7.
4), 0.5M NaCl, 1mM b-mercatoetanol 中に尿素を6M,4
M,2M,1M 含むものを用意し、尿素濃度の高いものから低
いものに対して順番に透析を行った。(Purification of human single-chain antibody) Expression-induced Escherichia coli cells were dissolved in a solubilization buffer (6 M Guanidine HCl, 20 mM).
M Tris HCl (pH8.0), 10 mM b-mercatoetanol, 25 mM Imi
dazol) and the solubilized protein was centrifuged. The single-chain antibody in the supernatant containing the solubilized protein was
Affinity purification was performed by adsorption to LON resin and elution with a solubilization buffer containing 0.1 M EDTA. The purified single-chain antibody solution was dialyzed against a refolding buffer and finally dialyzed against PBS to rewind the protein.
The refolding buffer is 20 mM Tris HCl (pH 7.
4), 0.5M NaCl, 1mM b-mercatoetanol in 6M urea
A sample containing M, 2M, and 1M was prepared, and dialysis was performed sequentially from a sample having a high urea concentration to a sample having a low urea concentration.
【0047】(ヒト型一本鎖抗体の抗体価の評価)西洋
わさびペルオキシダーゼ(HRP )で標識したB4G7抗体と
未標識B4G7抗体または一本鎖scBH抗体を混合し、ホルマ
リン固定したA431細胞を抗原として競合ELISA を行っ
た。上記のマウス型、キメラ型、ヒト型抗体の抗体価を
測定した結果を図19に示す。図19に示すように、D
型をのぞきキメラ型およびヒト型化一本鎖抗体はマウス
型(BB 型:VH・VL部分のアミノ酸配列はscBHと同一)と
ほぼ同様の結合能を有していた。(Evaluation of antibody titer of human single-chain antibody) B4G7 antibody labeled with horseradish peroxidase (HRP) and unlabeled B4G7 antibody or single-chain scBH antibody were mixed, and formalin-fixed A431 cells were used as antigen. A competitive ELISA was performed. FIG. 19 shows the results of measuring the antibody titers of the above-mentioned mouse, chimeric and human antibodies. As shown in FIG.
Except for the types, the chimeric and humanized single-chain antibodies had almost the same binding ability as the mouse type (BB type: the amino acid sequence of the VH / VL portion was the same as scBH).
【0048】(ヒト型一本鎖抗体遺伝子のイムノポータ
ー遺伝子への変換)部位特異的変異導入法によりpPIC9K
del のHis4遺伝子領域内のNco I 切断部位ccatgg配列を
ccatagに置換した。D4Sx5 遺伝子を組み込んだpPIC9Kde
l にも同様の変異を導入し、pPIC9Kdd-D4Sx5を得た。pP
IC9Kddの全塩基配列を、図20に示す。(Conversion of human single-chain antibody gene to immunoporter gene) pPIC9K was obtained by site-directed mutagenesis.
The ccatgg sequence at the Nco I cleavage site in the His4 gene region of del
Replaced by ccatag. PPIC9Kde incorporating D4Sx5 gene
The same mutation was introduced into l to obtain pPIC9Kdd-D4Sx5. pP
FIG. 20 shows the entire nucleotide sequence of IC9Kdd.
【0049】ヒト型化一本鎖抗体遺伝子のPCR 法により
5'端にCTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT という塩基配
列を導入し、3'のHis タグ部の塩基配列を5'-GTTGACATC
AAACACCATCACCATCACCATGGTGGCGGTTCTTAAGAATTCと変更し
た。Xho I とNco I の制限酵素部位を用いて,pPIC9Kdd
-D4Sx5の同部位に導入した。それ以降の方法は組み換え
イムノポーター遺伝子の発現及び精製において前に記載
した方法に準じた方法を用いて、ヒト型一本鎖抗体のイ
ムノポーターを得た。The PCR method of the humanized single chain antibody gene
Introduce the base sequence CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT at the 5 'end, and change the base sequence of the 3' His tag to 5'-GTTGACATC
AAACACCATCACCATCACCATGGTGGCGGTTCTTAAGAATTC Using restriction sites of Xho I and Nco I, pPIC9Kdd
-Introduced into the same site of D4Sx5. In the subsequent method, a human single-chain antibody immunoporter was obtained by using a method similar to the method described above in the expression and purification of the recombinant immunoporter gene.
【0050】[0050]
【発明の効果】本発明により、新規のDNA 運搬システム
である、ヒト型一本鎖イムノポーターモノクローナル抗
体蛋白質融合蛋白質及び当該融合蛋白質とDNA の複合体
が与えられた。Industrial Applicability According to the present invention, a novel DNA delivery system, a human single-chain immunoporter monoclonal antibody protein fusion protein and a complex of the fusion protein and DNA are provided.
【0051】[0051]
【配列表】 <110>出願人氏名:学校法人 慶応義塾 <120>発明の名称:細胞表面に存在する抗原に対するモノクローナル抗体融 合蛋白質及びその製造方法 <160>配列の数:2 <210>配列番号:1 <211>配列の長さ:258 <212>配列の型:アミノ酸 <213>起源:マウス上皮細胞増殖因子レセプター抗体 <400>配列 M G H H H H H H Q V Q L Q Q S G A E L V R P G A S 25 V K L S C T A S G F N I K D T L M H W V K Q R P E 50 Q G L E W I G W I D P E D G N T K Y V R K F Q G K 75 A T I T A D T S S N T A Y L Q V S S L T S E D T A 100 I Y Y C V R G G S Y G N W A Y W G Q G T T V T V S 125 S G G G G S G G G G S G G G G S D I E L T Q S P A 150 S L S A S V G E T V T I T C R T S E N I Y S Y F A 175 W Y Q Q K Q G K S P H L L V Y N A K T L A E G V P 200 S R F S G S G S G T Q F S L K I N S L Q P E D F G 225 I Y F C Q H H Y G S L H T F G G G T K L E I K H H 250 H H H H G G G S 258 <210>配列番号:2 <211>配列の長さ:258 <212>配列の型:アミノ酸 <213>起源:ヒト上皮細胞増殖因子レセプター抗体 <400>配列 M G H H H H H H Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S 25 V K V S C K A S G F N I K D T L M H W V R Q A P G 50 Q G L E W M G W I D P E D G N T K Y V R K F Q G R 75 V T M T R D T S T S T V Y M E L S S L R S E D T A 100 V Y Y C A R G G S Y G N W A Y W G Q G T T V T V S 125 S G G G G S G G G G S G G G G S D I Q M T Q S P S 150 S L S A S V G D R V T I T C R T S E N I Y S Y F A 175 W Y Q Q K S G K A P K L L I Y N A K T L A E G V P 200 S R F S G S G S G T E F T L T I S S L Q P E D F A 225 T Y F C Q H H Y G S L H T F G G G T T V D I K H H 250 H H H H G G G S 258[Sequence list] <110> Name of applicant: Keio Gijuku <120> Title of the invention: Monoclonal antibody fusion protein against antigen present on cell surface and method for producing the same <160> Number of sequences: 2 <210> sequences No .: 1 <211> Sequence length: 258 <212> Sequence type: Amino acid <213> Origin: Mouse epidermal growth factor receptor antibody <400> Sequence MGHHHHHHHVVQLQQSGAELVR PGAS 25 VKLSCTASGFNIKDTLMHWVK QRPE 50 QGLEWIGWIDPEDGNTKYVRK FQGK 75 ATITADTSSNTAVGSTYVYTSATITATSTSAGGTSVTS 125 SGGGGSGGGGSGGGGSDIELT QSPA 150 SLSASVGETVTITCRTSENIY SYFA 175 WYQQKQGKSPHLLVYNAKTLA EGVP 200 SRFSGSGSGTGTFSLKINSLQP EDFG 225 IYFCQHHYGSLHTFGGGTKLE IKHH 250 HHHHGGGS 258 <210> SEQ ID NO: 2 <211> Sequence length: 258 <212> Sequence type: Amino acid <213> Origin: Human epidermal growth factor receptor antibody <400> Sequence MGHHHHHHQVQLVQSGAEVKK PGAS 25 VKVSCKASGFNIKDTLMHWVR QAPG 50 QGLEWMGWIDPEDGNTKYVRK FQGR 75 VTMTRDTSTSTVYMELSSLRS EDTA 100 VYYCARGGSYGNWAYWGQGTT VTVS 125 SGGGGSGGGGSGGGGSDIQMT QSPS 150 SLSASVGDRVTITCRTSENIY SYFA 175 WYQQKSGKAPKLH GSHH GSH HGS TGH HGS TGVP HGS TF HGS TGH HGS TF HGS TG HGS TF HGS TG HGS TG HGS
【図1】 図1はpBH の一本鎖抗体部分の塩基配列とア
ミノ酸配列を示す図である。FIG. 1 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of the single-chain antibody portion of pBH.
【図2】 図2は一本鎖抗体の抗体価を示すグラフであ
る。FIG. 2 is a graph showing the antibody titer of a single-chain antibody.
【図3】 図3は作製したイムノポーターを作製するた
めに付加した配列の構造を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing the structure of a sequence added for producing the produced immunoporter.
【図4】 図4はpPIC9Kdel の全塩基配列を示す図であ
る。FIG. 4 is a view showing the entire nucleotide sequence of pPIC9Kdel.
【図5】 図5は発現誘導した培地中の蛋白質を抗Flag
抗体で検出したウエスタンブロットを示す写真である。[Fig. 5] Fig. 5 shows that the protein in the medium for which expression was induced was subjected to anti-Flag.
It is a photograph which shows the western blot detected with the antibody.
【図6】 図6はschBFLによる遺伝子導入効率を示す図
である。FIG. 6 is a diagram showing gene transfer efficiency by schBFL.
【図7】 図7はHBS 下における、scHBFL20による遺伝
子導入効率を示す図である。FIG. 7 is a diagram showing the efficiency of gene transfer by scHBFL20 under HBS.
【図8】 図8はPBS 下における、scHBFL20による遺伝
子導入効率を示す図である。FIG. 8 is a diagram showing gene transfer efficiency using scHBFL20 under PBS.
【図9】 図9はBB型のマウス改良型の一本鎖抗体遺伝
子の塩基配列とアミノ酸配列を示す図である。FIG. 9 is a diagram showing the nucleotide sequence and amino acid sequence of a mouse improved single-chain antibody gene of BB type.
【図10】 図10はCvB 型のマウス・ヒトキメラの一
本鎖抗体遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列を示す図であ
る。FIG. 10 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of a single-chain antibody gene of a CvB mouse / human chimera.
【図11】 図11はCaB 型のマウス・ヒトキメラの一
本鎖抗体遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列を示す図であ
る。FIG. 11 is a diagram showing the nucleotide sequence and amino acid sequence of a single-chain antibody gene of a CaB-type mouse / human chimera.
【図12】 図12はDB型のマウス・ヒトキメラの一本
鎖抗体遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列を示す図であ
る。FIG. 12 is a view showing the nucleotide sequence and amino acid sequence of a single-chain antibody gene of DB mouse / human chimera.
【図13】 図13はBC型のマウス・ヒトキメラの一本
鎖抗体遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列を示す図であ
る。FIG. 13 is a view showing the nucleotide sequence and amino acid sequence of a single-chain antibody gene of BC mouse / human chimera.
【図14】 図14はCvC 型のヒト型抗体の一本鎖抗体
遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列を示す図である。FIG. 14 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of a single-chain antibody gene of a CvC human antibody.
【図15】 図15はCaC 型のヒト型抗体の一本鎖抗体
遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列を示す図である。FIG. 15 is a diagram showing a base sequence and an amino acid sequence of a single-chain antibody gene of a human antibody of CaC type.
【図16】 図16はDC型のヒト型抗体の一本鎖抗体遺
伝子の塩基配列とアミノ酸配列を示す図である。FIG. 16 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of a single-chain antibody gene of a DC human antibody.
【図17】 図17は一本鎖抗体遺伝子の発現を検出し
たウエスタンブロットを示す写真である。FIG. 17 is a photograph showing a Western blot in which the expression of a single-chain antibody gene was detected.
【図18】 図18はpET22bhcの全塩基配列を示す図で
ある。FIG. 18 is a view showing the entire nucleotide sequence of pET22bhc.
【図19】 図19はヒト型一本鎖抗体の抗体価を示す
グラフである。FIG. 19 is a graph showing the antibody titer of a humanized single-chain antibody.
【図20】 図20はpPIC9Kddの全塩基配列を示す図で
ある。FIG. 20 is a view showing the entire nucleotide sequence of pPIC9Kdd.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C07K 16/28 C12P 21/02 C 19/00 21/08 C12P 21/02 (C12P 21/02 21/08 C12R 1:19) //(C12P 21/02 (C12P 21/02 C12R 1:19) C12R 1:84) (C12P 21/02 (C12P 21/08 C12R 1:84) C12R 1:19) (C12P 21/08 (C12P 21/08 C12R 1:19) C12R 1:84) (C12P 21/08 C12N 15/00 ZNAA C12R 1:84) A61K 37/02 Fターム(参考) 4B024 AA01 BA44 CA04 DA06 DA12 EA03 EA04 GA11 HA01 4B064 AG27 CA02 CA06 CA19 CC24 DA05 4C084 AA01 AA13 BA07 BA22 CA25 DA27 NA14 ZB262 4C085 AA14 BA21 BB50 CC07 DD23 DD33 DD41 EE05 4H045 AA11 BA41 BA54 CA40 DA76 EA28 FA74 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C07K 16/28 C12P 21/02 C 19/00 21/08 C12P 21/02 (C12P 21/02 21/08 C12R 1:19) // (C12P 21/02 (C12P 21/02 C12R 1:19) C12R 1:84) (C12P 21/02 (C12P 21/08 C12R 1:84) C12R 1:19) (C12P 21 / 08 (C12P 21/08 C12R 1:19) C12R 1:84) (C12P 21/08 C12N 15/00 ZNAA C12R 1:84) A61K 37/02 F term (reference) 4B024 AA01 BA44 CA04 DA06 DA12 EA03 EA04 GA11 HA01 4B064 AG27 CA02 CA06 CA19 CC24 DA05 4C084 AA01 AA13 BA07 BA22 CA25 DA27 NA14 ZB262 4C085 AA14 BA21 BB50 CC07 DD23 DD33 DD41 EE05 4H045 AA11 BA41 BA54 CA40 DA76 EA28 FA74
Claims (15)
子を運搬する事が可能である融合蛋白質であって、細胞
表面に存在する抗原に対するヒト型の一本鎖モノクロー
ナル抗体と、遺伝子結合部位であるペプチドを含む融合
蛋白質であることを特徴とする、細胞表面に存在する抗
原に対するモノクローナル抗体融合蛋白質。1. A fusion protein capable of carrying a gene by binding to the gene, comprising a human-type single-chain monoclonal antibody against an antigen present on a cell surface, and a peptide which is a gene binding site. A monoclonal antibody fusion protein against an antigen present on a cell surface, which is a fusion protein comprising:
増殖因子レセプターである、請求項1記載のモノクロー
ナル抗体融合蛋白質。2. The monoclonal antibody fusion protein according to claim 1, wherein the antigen present on the cell surface is an epidermal growth factor receptor.
90個以下のアミノ酸からなるペプチドである、請求項
1記載のモノクローナル抗体融合蛋白質。3. The monoclonal antibody fusion protein according to claim 1, wherein the peptide is a peptide comprising 90 or less amino acids charged to a positive charge.
90個以下のアミノ酸からなるペプチドである、請求項
1記載のモノクローナル抗体融合蛋白質。4. The monoclonal antibody fusion protein according to claim 1, wherein the peptide is a peptide comprising 90 or less amino acids charged to a negative charge.
はリジン、アルギニン、アスパラギン酸及びグルタミン
酸からなる群より選択されたアミノ酸であり、Yはリジ
ン、アルギニン、アスパラギン酸及びグルタミン酸を除
くアミノ酸であり、n は1ないし8、m は1ないし1
0)で示される構造である、請求項1記載のモノクロー
ナル抗体融合蛋白質。5. The method according to claim 1, wherein the peptide is [X n Y] m (where X
Is an amino acid selected from the group consisting of lysine, arginine, aspartic acid and glutamic acid, Y is an amino acid excluding lysine, arginine, aspartic acid and glutamic acid, n is 1 to 8, and m is 1 to 1
The monoclonal antibody fusion protein according to claim 1, which has a structure represented by 0).
ン、アルギニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸であ
り、n は2ないし8)で示される構造である、請求項1
記載の細胞表面に存在するレセプターに対するモノクロ
ーナル抗体融合蛋白質。6. The peptide according to claim 1, wherein the peptide has a structure represented by X n (where X is lysine, arginine, aspartic acid or glutamic acid, and n is 2 to 8).
A monoclonal antibody fusion protein against the receptor present on the cell surface as described above.
抗体融合蛋白質とDNA との複合体であることを特徴とす
る、モノクローナル抗体融合蛋白質の複合体。7. A complex of the monoclonal antibody fusion protein, which is a complex of the monoclonal antibody fusion protein according to claim 1 and DNA.
ある、請求項7記載のモノクローナル抗体融合蛋白質の
複合体。8. The complex of the monoclonal antibody fusion protein according to claim 7, wherein the gene is a gene having an anticancer effect.
0個以下のアミノ酸からなるペプチドであり、遺伝子と
直接結合していることを特徴とする、請求項7記載のモ
ノクローナル抗体融合蛋白質の複合体。9. The peptide according to claim 9, wherein said peptide is positively charged.
The monoclonal antibody fusion protein complex according to claim 7, which is a peptide comprising 0 or less amino acids and is directly bound to a gene.
90個以下のアミノ酸からなるペプチドであり、正電荷
高分子で被覆した遺伝子と結合していることを特徴とす
る、請求項7記載のモノクローナル抗体融合蛋白質の複
合体。10. The peptide according to claim 7, wherein the peptide is a peptide consisting of 90 or less amino acids charged to a negative charge, and bound to a gene coated with a positively charged polymer. Complex of monoclonal antibody fusion protein.
るモノクローナル抗体融合蛋白質を作製する方法であっ
て、(1)前記細胞表面に存在するレセプターに対する
モノクローナル抗体に対するモノクローナル抗体の産生
能を有するハイブリドーマ細胞から抽出したmRNAを鋳型
として用いて、マウス型モノクローナル抗体の一本鎖抗
体遺伝子をPCR 法で増幅し、(2)前記マウス型モノク
ローナル抗体のフレームワーク部分を変換することによ
りヒト型モノクローナル抗体の一本鎖抗体遺伝子を作製
し、(3)前記ヒト型モノクローナル抗体の一本鎖抗体
遺伝子にアミノ酸テイルをコードする遺伝子を付加する
ことによりヒト型一本鎖イムノポーター遺伝子を作製、
(4)前記ヒト型一本鎖イムノポーター遺伝子を細菌内
で発現させることによりヒト型一本鎖イムノポーターの
組み換え蛋白質を得る過程により構成される、モノクロ
ーナル抗体融合蛋白質の作製方法。11. A method for preparing a monoclonal antibody fusion protein against a receptor present on a cell surface, comprising: (1) extracting from a hybridoma cell capable of producing a monoclonal antibody against a monoclonal antibody against a receptor present on the cell surface. Using mRNA as a template, a single-chain antibody gene of a mouse monoclonal antibody is amplified by PCR, and (2) a single-chain antibody of a human monoclonal antibody is converted by converting the framework portion of the mouse monoclonal antibody. Gene, and (3) a human-type single-chain immunoporter gene by adding a gene encoding an amino acid tail to the single-chain antibody gene of the human-type monoclonal antibody;
(4) A method for producing a monoclonal antibody fusion protein comprising a step of obtaining a recombinant human single-chain immunoporter protein by expressing the human single-chain immunoporter gene in bacteria.
合蛋白質の複合体を、細胞表面レセプターを介して細胞
内に導入する方法。12. A method for introducing the complex of the monoclonal antibody fusion protein according to claim 7 into a cell via a cell surface receptor.
伝子を導入する事を特徴とする、請求項12記載の方
法。13. The method according to claim 12, wherein the gene is introduced into cells by endocytosis.
ノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。 (a)配列表の配列番号1に示す、アミノ酸番号1−2
58で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とす
る、ポリペプチド。 (b)上皮細胞増殖因子レセプターと結合する活性を有
し、(a)のアミノ酸の1ないし数アミノ酸が欠失、置
換若しくは付加された、ポリペプチド。14. A polypeptide comprising an amino acid sequence represented by the following (a) or (b): (A) amino acid numbers 1-2 shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by 58. (B) a polypeptide having an activity of binding to an epidermal growth factor receptor, wherein one or several amino acids of (a) are deleted, substituted or added.
ノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。 (c)配列表の配列番号2に示す、アミノ酸番号1−2
58で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とす
る、ポリペプチド。 (d)上皮細胞増殖因子レセプターと結合する活性を有
し、(c)のアミノ酸の1ないし数アミノ酸が欠失、置
換若しくは付加された、ポリペプチド。15. A polypeptide comprising an amino acid sequence represented by the following (c) or (d): (C) amino acid numbers 1-2 shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing
A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by 58. (D) A polypeptide having an activity of binding to an epidermal growth factor receptor, wherein one or several amino acids of (c) are deleted, substituted or added.
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JPN6010028273, 臨床免疫, (2000.04.25), 33, [4], p.469−474 * |
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JP2004350502A (en) * | 2003-05-26 | 2004-12-16 | Keio Gijuku | Partial histone tail type immunoporter |
JP4521519B2 (en) * | 2003-05-26 | 2010-08-11 | 学校法人慶應義塾 | Partial histone tail type immunoporter |
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