JP2001122800A - 骨シアロプロティンを含む結合組織修復促進組成物及び骨シアロプロティンの使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 インビボで結合組織の修復を促進する組成物
を提供する。 【解決手段】 本発明は、損傷又は病気の結合組織に生
物活性組成物をインビボで接触させて、それらの組織の
修復を誘発する生物活性組成物に関する。特に、本発明
は、損傷又は病気の骨の修復を促進する、有効量の骨シ
アロプロティンを含む組成物の用途に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、損傷又は病気の
骨、軟骨等の結合組織をインビボで組成物と接触させ
て、該組織の成長又は修復を促進する組成物に関する。
特に、この発明は、骨シアロプロティンを含む（bone s
ialoprotein)、骨の成長又は修復を誘発する組成物、お
よび該組生物の調製における単離した骨シアロプロティ
ンの使用に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】現
在、骨欠損は一般に自己移植片又はバンク骨（banked b
one)により修復されている。自己移植片は骨と良く一体
化できるので、外科医はしばしば腸骨稜等の源から骨を
使用することを好む。しかし、自己移植片を用いる方法
には幾つかの欠点がある。第一に、自己移植片は、別の
採取手術を必要とし、そのため、手術時間が長くなり輸
血が必要となる。第二に、患者はしばしば採取のための
適当量の物質に欠き、しばしば提供部位が病的状態にな
るのを経験する。バンク骨の移植には採取手術は必要で
ないが、そのような骨の治癒能力は自己移植片程高くな
い。従って、癒着欠如等の重篤な疾患ではバンク骨の使
用は望ましくない。

【０００３】これらの欠点のため、研究者は、自己移植
片又はバンク骨を使用する必要無しで、骨の成長を促進
させる組成物と方法を探し求めている。骨成長促進因子
を提供できる１つの可能性のある源は、健康な骨と軟骨
組織の細胞外マトリックスである。細胞外骨マトリック
スはミネラル（ヒドロキシアパタイト）と有機マトリッ
クスにより殆どが占められ、有機マトリックスの主成分
はコラーゲンタイプＩである。骨マトリックスの残りの
成分には、幾つかのそれほど多くはない非コラーゲン蛋
白質と成長因子が含まれる。例えば、１９６０年代中頃
から、脱ミネラル骨マトリックス（ＤＢＭ）と骨形態形
成蛋白質（ＢＭＰ）の両方の骨誘導活性が研究されてい
る（例えば、Ijiri 、１９９２年）。ＤＢＭとＢＭＰの
他にも、多くの骨マトリックス由来非コラーゲン蛋白質
成分が生物活性を有し、プロテーゼ装置、薬物、血液成
分等の医療用途に幅広く使用されている。

【０００４】細胞外骨マトリックスに存在する非コラー
ゲン蛋白質の一群がシアロプロティンであり、骨抽出物
の湿重量の約０．２％を占める。骨シアロプロティン
（ＢＳＰ）は脊椎動物の骨組織内にある最も豊富なシア
ロプロティンであり、当業者に知られている標準抽出技
術によりこのような組織から単離できる（Gorski等、１
９９０年；Chen等、１９９２年）。ＢＳＰは接着性糖蛋
白質であり、カルシウムとコラーゲンとに結合し、特に
ヒドロキシアパタイトと非常に強く結合する。ＢＳＰは
分泌された骨マトリックス内に見出され、マトリックス
ミネラル化の間のヒドロキシアパタイト結晶の核形成、
造骨細胞接着、及び骨再構築の間の造骨細胞の結合と活
性化等の、骨修復と再構築に役割を担っている可能性が
ある。その成熟蛋白質は３０４個のアミノ酸残基を有
し、細胞結合Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列
と、グルタミン酸残基の幾つかの長いストレッチを含
む。ＲＧＤ配列は、この配列を介して接着分子が細胞を
細胞外マトリックスに結合させるので、「細胞結合モチ
ーフ」と呼ばれている。

【０００５】骨シアロプロティンはシアル酸に豊むオリ
ゴ糖で置換される。さらに、ＢＳＰのセリン残基の３０
％はリン酸基を有し、複数のチロシン残基は硫酸化され
ている。従って、ＢＳＰは、ホスホリル化及び硫酸化さ
れている酸性糖蛋白質であり、シアル酸に豊み、分子量
は７５ｋＤａと見積もられる。この蛋白質は、新たな骨
形成部位において造骨細胞によりほとんど独占的に現
れ、軟骨界面に多く現れる。ＢＳＰの合成は、グルココ
ルチコイド（造骨細胞の分化を刺激する）とＴＧＦ−β
（骨形成を促進する）等の因子により刺激される。ＢＳ
Ｐ合成は、１，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ３によ
り抑制するように調節される。骨シアロプロティンメッ
センジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）は骨端軟骨付近の造骨
細胞で特定される。この部位におけるこの蛋白質の蓄積
は、初期の骨形成での役割を示唆する。また、骨シアロ
プロティンは、明らかに、石灰化軟骨内の軟骨細胞、骨
髄細胞、ラット胎児骨内の造骨細胞により産生される。
従って、この蛋白質は生物学的ミネラル化に役割を担っ
ている可能性がある。

【０００６】多くの物質が生物学的源から単離されて、
これらの物質に対する培養細胞の反応に基づいて、骨成
長促進能を有するとして同定されている。特に、骨シア
ロプロティンと動物組織内で発育中の骨との関連性、お
よび様々な培養細胞のインビトロで骨シアロプロティン
に対する応答に起因して、この分子が骨及び／又は軟骨
の成長において役割を担っている可能性が示唆されてい
る。しかし、インビトロの結果は、細胞の種類、細胞密
度、細胞単離方法、成長培地の種類等の様々な因子によ
り変わり得る。従って、インビトロの実験は有用ではあ
るが、常にインビボの活性を予測するものではない。

【０００７】例えば、過去２０年間、プロスタグランジ
ンが、骨吸収と骨形成の両方を促進するとして報告され
ていた。プロスタグランジンのこの相反する活性を報告
する文献を分析すると、骨吸収を報告するほとんど全て
の実験がインビトロで実施され、骨形成を報告するほと
んど全ての実験がインビボで実施されていたことが分か
る。インビトロでの骨成長実験は、骨の組織／器官培養
又は比較的純粋な単離された骨細胞群を用いて実施され
ていた。プロスタグランジンの骨格に及ぼす効果の明ら
かに相反する報告は、これらの効果の研究に使用した細
胞培養系の限界に基づいて説明できる。同様に、細胞培
養アッセイに基づくＴＧＦ−活性の初期の報告は、イン
ビボで観察された活性と相関しなかった。従って、当業
者は、インビトロ活性はインビボでの結果を必ずしも予
測するものではないと認識している。

【０００８】必要とされているのは、インビボで結合組
織の修復に有用な組成物である。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、骨シア
ロプロティンを含む組成物を、修復が必要なインビボ部
位において骨又は軟骨の成長を誘発するために使用す
る。開示する組成物を移植又は注射により温血動物種に
投与して、修復が必要な部位にインビボで接触させる。

【００１０】本発明の他の側面は、脊椎動物種の所定の
インビボ部位において新たな骨又は軟骨の成長を誘発す
る方法であって、この方法は、内生組織成長を誘発する
のに有効な量の実質的に純粋な骨シアロプロティンと薬
学的に許容される担体を含む組成物で上記の部位を接触
させることを含む。好ましい実施形態では、組成物は液
状形態で、組成物を注射して部位に接触させる。他の好
ましい実施形態では、担体は、ポリエステル、イオノマ
ー、ポリ（アミノ酸）、ポリビニルアセテート、ポリア
クリレート、ポリオルトエステル、ポリ無水物（ポリ酸
無水物、ポリエステル酸無水物を含む）、コラーゲン、
フィブリン、スターチ、アルギネート（アルギン酸塩を
含む）及びヒアルロン酸からなる群から選択されるポリ
マーを含むポリマーマトリックスである。また、担体
は、金属、ガラス又はミネラル塩でもよい。好ましいミ
ネラル塩の例には、リン酸トリカルシウム、ヒドロキシ
アパタイト及び石膏がある。

【００１１】本発明のさらに他の側面は、温血脊椎動物
の骨又は軟骨の病原性状態を治療する方法であって、こ
の方法は、内生組織成長を誘発するのに有効な量の実質
的に純粋な骨シアロプロティンと薬学的に許容される担
体を含む組成物を、温血脊椎動物に全身投与することを
含む。

【００１２】本発明の他の特徴は、発明を実施する最良
の態様を含む実施形態についての以下の詳細な説明によ
り、当業者に明らかとなるであろう。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明は、実質的に純粋な形態の
骨シアロプロティンを含む組成物、及びインビボで骨及
び軟骨の欠損の修復を促す、そのような組成物の用途に
関する。ここで使用する用語「骨シアロプロティン」
は、ヒト又は他の温血脊椎動物から単離される天然骨シ
アロプロティン蛋白質、骨シアロプロティン蛋白質の天
然由来アイソフォーム、骨シアロプロティンコード化核
酸配列から産生される組み換え蛋白質及び骨シアロプロ
ティン蛋白質の蛋白質フラグメント／ペプチドを含む。
ここでは、「骨シアロプロティン遺伝子」は、ヒト又は
他の温血脊椎動物から単離される天然遺伝子配列を含む
骨シアロプロティンをコード化した全ての核酸配列、骨
シアロプロティン蛋白質の活性フラグメントをコード化
した全ての核酸配列又は全てのこれらの組み換え誘導体
を含むものとして定義される。ここで使用する用語「実
質的に純粋な」とは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
又はアミノ酸分析で測定して、少なくとも９０％の純
度、好ましくは９５％の純度を意味する。「純度」等は
不純物を含まない程度をいう。

【００１４】本発明の組成物は、温血脊椎動物の損傷又
は欠損、結合組織の修復を誘発する方法に用いることが
できる。特に、骨シアロプロティンは、整形外科及び非
整形外科の創傷部位の組織（例えば、骨、軟骨、腱、靱
帯、筋肉、皮膚及び他の軟組織）の修復に用いることが
できる。一実施形態では、本発明の組成物は、骨の欠損
を満たし又は橋渡しし、さらに破断を効果的に修復する
ために用いる。骨の欠損又は破断には、例えば、頭蓋欠
損又は歯周欠損、関節破断、軟骨欠損、表在性軟骨欠
損、厚みの欠損、骨軟骨炎切開、極めて小さな裂け目、
靱帯裂け目、腱裂け目、筋肉損傷、筋腱炎関節損傷、感
染又は腫瘍による二次的骨損失の後の骨再構築、及び骨
粗鬆症等の様々な骨又は軟骨疾患に対する処理等があ
る。

【００１５】結合組織から単離した多くの物質が、イン
ビトロでそれらの物質に対して細胞が反応するため、骨
形成性を有するとして報告されている。しかし、インビ
トロで確立された活性は、しばしば、インビボで骨及び
軟骨の修復を促進する所望の活性を有する物質を選択す
る際の十分な指標となりえなかった。本発明では、イン
ビボアッセイ技術を用いて、骨及び軟骨組織の修復を誘
発する生物活性物質を特定する。好ましいことに、この
インビボアッセイでは、それ自体が骨形成性を示すこと
が知られているコラーゲン等の送達担体を使用しない。
この特徴的なインビボアッセイにより、骨修復を促進す
る物質が特定される。特に、実施例１に記載するインビ
ボアッセイでは、骨シアロプロティンがインビボで骨の
修復を促進することが示される。

【００１６】骨シアロプロティンはこれらの組織の修復
を直接又は間接に促進させることができる。例えば、骨
シアロプロティンは、直接造骨細胞の活性を刺激して
（即ち、マトリックスの産生を高める又は造骨細胞を増
やす）、又は血管形成を増やして、又は破骨細胞吸収を
阻害して、局所的部位における新しい骨形成を促進させ
ることができる。さらに、本発明の組成物は、骨シアロ
プロティンが骨母細胞又は生物活性物質と選択的に結合
することにより、局所的部位に対する骨母細胞又は生物
活性物質の新生に関与することができる。また、骨シア
ロプロティンは走化性により細胞の補充に関与すること
ができる。さらに、骨シアロプロティンは、セラミック
又はポリマー等の担体物質と組み合わせて（担体物質と
してコラーゲン等の蛋白質の使用も含む）傷の修復に使
用できることが期待される。また、骨シアロプロティン
は、自己細胞（例えば、骨又は軟骨母細胞）又は自己蛋
白質（例えば、フィブリン）と組み合わせることもでき
る。

【００１７】一実施形態では、本発明の組成物は、送達
（delivery）担体及び有効量の実質的に純粋な骨シアロ
プロティンを含む生物活性混合物を含む。他の実施形態
では、本発明の組成物は、送達担体及び骨シアロプロテ
ィン遺伝子を含む生物活性混合物を含む。インビボで骨
及び軟骨に生物活性物質を送達するのに使用する好適な
送達担体は当業者に良く知られている。一実施形態で
は、送達担体は、１以上の生体許容性ポリマーから形成
されるポリマーマトリックスを含む。ここで使用する
「生体許容性」は、ポリマーが無毒で、突然変異原性が
無く、少程度から中程度の炎症反応を引き起こさないこ
とを意味する。好ましくは、生体許容性ポリマーは生体
分解性であり、制御された方法で無毒の残留物に完全に
分解される。この実施形態では、ポリマーマトリックス
は生物活性混合物の送達担体として機能し、生物活性物
質を局所的な投与部位に濃縮し生物活性組成物の放出を
コントロールする。生物活性分子を生体分解性生体許容
性ポリマーと組み合わせて使用することにより、局所的
な骨及び軟骨部位への骨シアロプロティンの送達と放出
をコントロールする。即ち、生理学的に有効な期間内
に、処理部位から分子が放出されて効果を生じポリマー
は除去されるようにする。

【００１８】所定部位へ生物活性分子を送達するため
に、ポリエステル、ポリビニルアセテート、ポリアクリ
レート、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシエチルメ
タクリレート（ポリＨＥＭＡ）、ポリ無水物等の様々な
ポリマーを、インプラントの製造に使用できる。このよ
うな用途で使用するポリエステルの利点の１つは、ポリ
エステルが生体分解性でありかつ生体許容性であること
である。脂肪族ポリエステルは、負傷又は手術の後に移
植する薬物送達装置、縫い糸、一般的組織支持体に使用
する生物学的物質の分野で、幅広く使用されている。こ
れらのポリエステルは生物学的物質を局所的に送達する
のに従来から多大な関心が寄せられているが、このよう
なポリエステルは、ラクチド、グリコリド、カプロラク
トンモノマー由来であり、様々なターモノマー（三元モ
ノマー）の組み合わせにより広範囲な分解プロフィール
が可能となる。これら脂肪族ポリエステルのエステル結
合は加水分解及び／又は酵素分解されやすく、そのため
水性環境下でポリマーは分解可能になる。

【００１９】好ましい実施形態では、ポリエステル無水
物、イオノマー等のポリマーを用いる。ポリ乳酸、ポリ
オルトエステル等の他のポリマーを用いることもでき
る。他の実施形態では、ポリマーマトリックスはコラー
ゲン繊維を含む。コラーゲンは生物活性を有し骨及び軟
骨組織の修復をインビボで促進することが報告されてい
る。従って、コラーゲン繊維は、送達システムの構成成
分として、同時に、本発明の骨及び軟骨修復組成物の活
性成分として機能できる。ポリマーマトリックスを形成
するのに適する他のポリマーには、フィブリン、スター
チ、アルギネート及びヒアルロン酸がある。

【００２０】送達担体マトリックスを形成するのに使用
するポリマーの組成及びポリマーの分子量と物理学的特
性は、目的に応じて変えることができる。例えば、分解
時間を長くしたいときは、疎水性ポリ無水物を使用す
る。さらに高い強度又は他の所望の物理的特性が必要な
ときは、骨セメント等の当業者に知られている物質を用
いて、物質をポリマーに混合したりポリマーと重合した
りする。例えば、良好な物理的取り扱い特性を付与する
リン酸トリカルシウム又は他のセラミックタイプ物質を
組成物に添加する。

【００２１】一般に、骨破損の修復のためには、約３日
間から約４２日間（ヒトの体内で十分な修復が生じて骨
が体重に耐えられるようになるまで一般に６週間必要で
ある）ポリマーが物質を放出しなければならない。ま
た、ポリマーは約１６週乃至約２０週以内で完全に分解
しなければならない。放出時間と分解時間は、ポリマー
を使用する部位と放出される生物活性物質により決ま
る。ポリマーの他に、様々な経時的放出担体が知られて
いる。非経口投与方法の場合、ほぼ一定速度の薬物放出
が維持されるように、徐放システム又は持続放出システ
ムを移植する。例えば、米国特許第３，７１０，７９５
号参照。別の方法では、実施例１に記載するような浸透
ポンプ（osmotic pump）を使用する。

【００２２】本発明の一実施形態によれば、送達担体は
ポリエステルイオノマー（カルボキシ末端が塩のポリエ
ステル）を含む。ポリエステルイオノマーは、インプラ
ントの構造上／機能上必要な高い分子量においても、溶
解性が良好である。ポリエステルは天然由来代謝物から
製造し、天然由来代謝物に分解するので、生体許容性が
高い。ポリエステルイオノマーは、生体許容性の薬学的
に許容される塩形成塩基と中和又は部分中和して、対応
するカルボキシ末端ポリエステルから製造される。一実
施形態では、送達担体は、対応するイオノマーと生体分
解性カルボキシ末端ポリエステルを組み合わせて含む。
ポリエステルイオノマーの物理学的特性は、対応するカ
ルボキシ末端ポリエステルの中和の程度によりコントロ
ールでき、さらに、中和塩基の選択によってもある程度
コントロールできる。組織を修復するために及び／又は
生物活性物質を長期間放出するために、ポリエステルイ
オノマーは、生体許容性送達担体の構成において、単独
又はそれらのカルボキシ末端ポリエステル前駆体と組み
合わせて使用できる。

【００２３】ポリエステルイオノマーを送達担体として
使用することは米国特許第５，６６８，２８８号に記載
されており、この特許の開示はここに参考として取り込
む。一般にポリエステルイオノマーはポリエステルの２
価の残基である。ポリエステルは、例えば乳酸、グリコ
ール酸、−ヒドロキシカプロン酸、−ヒドロキシ吉草酸
等の生体許容性ヒドロキシ酸のホモポリマー、コポリマ
ー又はターポリマーであり得る。また、ポリエステル
は、多価アルコールと生体許容性ポリカルボン酸の共重
合により製造できる。最も典型的には、このようなコポ
リマーは、２価アルコール（例えば、生体許容性の点か
らポリエチレングリコール）と生体許容性ジカルボン酸
から形成される。

【００２４】本発明の組成物の生物活性成分は骨シアロ
プロティンを含み、任意に、薬学的に許容される担体、
可溶化剤又は充填剤と組み合わせることができる。骨成
長形成を誘導するためには、骨シアロプロティンは約５
ｎｇ／ｍｌ（欠損領域）乃至約５００μｇ／ｍｌ（欠損
領域）の濃度で投与しなければならない。一実施形態で
は、骨シアロプロティンは約１μｇ／ｍｌ（欠損領域）
乃至約２０μｇ／ｍｌ（欠損領域）の濃度で投与する。
損傷又は病気の骨の修復を助けるために、リン酸トリカ
ルシウム、ヒドロキシアパタイト、石膏又は他の適当な
生理学的ミネラル源を、追加して組成物と組み合わせる
ことができる。一実施形態によれば、生理学的許容性ミ
ネラルは、本発明の組成物の生物活性混合物の８０％ま
で占めることができる。または、生理学的許容性ミネラ
ルは、生物活性混合物の約５％乃至約５０％、より好ま
しくは、約５％乃至３０％を占めることができる。さら
に、骨の異常又は疾患を局所的に治療するための送達シ
ステムを形成するために、本発明の組成物を既知の医薬
品及び生物活性物質と組み合わせてもよい。

【００２５】また、本発明の組成物の生物活性成分は、
さらに、成長因子、成長因子結合蛋白質又は真核細胞と
組み合わせることができる。好適な成長因子の例とし
て、繊維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因
子（例えば、ＴＧＦ類）、骨形態形成蛋白質、上皮細胞
成長因子又は血小板由来成長因子がある。成長因子結合
蛋白質の例として、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ５等のイ
ンシュリン様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ類）があ
る。好適な真核細胞の例には、骨髄細胞、造骨細胞、間
葉幹細胞がある。本発明の生物活性組成物は、さらに、
骨欠損部位に移植したら骨の生成を刺激又は加速する骨
形成性物質を含むことができる。骨形成性物質の例に
は、脱ミネラル骨粉、小片海線状骨、吸引骨髄、骨又は
軟骨形成細胞及び他の骨源がある。

【００２６】本発明の生物活性組成物は、温血脊椎動物
の所定の局所的部位において骨及び軟骨組織の成長を刺
激するのに有用である。本発明の方法では、修復が必要
な部位を、実質的に純粋な骨シアロプロティンを含む組
成物と接触させる。一実施形態では、組成物を修復が必
要な部位に外科的に移植する。ここで、組成物は骨シア
ロプロティンとポリマーマトリックスを含み、ポリマー
マトリックスが骨シアロプロティンの放出をコントロー
ルして、所望部位で骨シアロプロティンを濃縮させる。
また、組成物は注射可能形態でもよく、修復が必要な部
位に接触させる方法は、組成物をその部位の中へ又はそ
の隣りに注射することを含む。一般に、組成物の注射可
能形態では、骨シアロプロティンを薬学的に許容される
担体と組み合わせる。組成物の粘度は、組成物の水含有
量をコントロールすることにより、又は当業者に知られ
ている薬学的に許容される充填剤又は増粘剤を添加する
ことにより調節できる。一実施形態では、注射可能形態
はコラーゲン繊維を含み、組成物の粘度は組成物のｐＨ
を約６．０乃至約７．５に調整してコントロールする。

【００２７】本発明の組成物に、有効量の抗生物質、化
学療法剤、追加の成長因子、抗原、抗体、酵素又はホル
モンを組み合わせることができる。例えば、骨シアロプ
ロティンと抗生物質を含む組成物は骨髄炎の治療に有用
であり、非経口抗生物質の必要性が減り、またその危険
も減る。骨シアロプロティンと抗腫瘍剤を含む組成物は
骨腫瘍の局所的治療に使用でき、また、骨シアロプロテ
ィンと骨形成性因子又は他の成長因子（例えば、骨形成
原、骨形態形成蛋白質、上皮小体ホルモン、ＴＧＦ類）
を含む組成物は、過度の外傷、骨形成不全症や骨粗鬆症
等の骨格欠失疾患に伴って生じる骨欠損の修復を促進す
るために使用できる。

【００２８】上述したように、本発明の組成物は温血脊
椎動物に注射するために液状形態で製造できる。一実施
形態では、注射可能形態により温血脊椎動物を全身的に
処理して、骨粗鬆症、関節炎又は他の骨及び／又は軟骨
に関する病原性状態等の病気に対して治療効果を生じ
る。注射可能な薬学的製剤は、皮下、腹膜内、筋肉内、
静脈内等の非経口ルートで投与できる。非経口投与形態
の例として、等浸透圧塩水、５％グルコース又は他の良
く知られた薬学的に許容される液状担体を用いた活性剤
の水性溶液を挙げられる。

【００２９】好ましい実施形態では、５％ジメチルスル
ホキシドと１０％Cremphor EL(シグマ・ケミカル・カン
パニー）を含む塩溶液に、骨シアロプロティン化合物を
溶かす。追加の可溶化剤は当業者に良く知られており、
骨シアロプロティン化合物の送達のための薬学的賦形剤
として使用できる。他の送達担体も本発明に使用でき、
本発明を流体形態で温血脊椎動物の全身に投与するのに
使用できる。送達担体は、経口投与形態、皮膚パッチ又
は他の当業者に知られている送達担体でもよい。

【００３０】

【実施例】実施例１：骨シアロプロティンによるインビ
ボでの新骨形成の促進 Ａ．ラットの頭蓋冠欠損モデルを用いた骨シアロプロテ
ィンの骨形成能力のインビボテスト 骨シアロプロティンの骨形成能力を測定するために、出
願人は、インビボにおける骨組織の内生成長の誘導を測
定するのに良く確立されているモデルを使用した。一般
に、このモデルでは、大人（６月齢を超える）のSpragu
e Dawleyラットの頭蓋骨に円状欠損（直径約６ｍｍ乃至
約８ｍｍ）を形成する。この欠損は、骨内傷が動物の生
涯において骨形成により治癒されない程の大きなサイズ
である。

【００３１】手術は滅菌技術、キャップ、マスク、ガウ
ン、手袋を用いて実施した。Ketoset １０ｍｌと１００
ｍｇ／ｍｌのキラジン（Xylazine）０．１５ｍｌ、さら
に１０ｍｇ／ｍｌのアセプロマジン０．３ｍｌを追加し
たケトセット（Ketoset)のカクテルを用いて動物を鎮静
させた。用量は体重１００ｇ当たり０．１ｍｌであっ
た。さらに鎮静させることが必要なときは、ケトセット
のみを０．０５ｍｌ増やす。ラットを鎮静させた後、頭
を耳の後ろから鼻の先端までさらに横方向に耳の腹側ま
で剃った。ベタジンとアルコールを交互に用いて３部分
を洗った（threepart scrub）。洗う前に、軟膏を眼に
付けた。動物の表面を洗った後、動物をＶトレイに置い
て、頭を４×４ガーゼの小さな積み重ねの上に配置して
水平な手術部位を形成した。鼻、耳及び背中にテープ紐
をかけて動物をトレイに縛って固定した。

【００３２】動物を固定したトレイを手術テーブル上の
滅菌掛け布の下に置いた。頭蓋の中線の皮膚を切開して
骨膜をこすって収縮させて中線部位を露出させた。約１
８ｋｇ（４０ポンド）以下の圧力下で、６ｍｍ又は８ｍ
ｍのトレフィンをマイクロドリルに使った。ドリルして
いる間、熱壊死を避けるためにこの部位を灌注する必要
があった。骨を切るとき、硬膜と矢状静脈洞を傷つけな
いように注意した。硬膜は可能ならば無傷のまま残し
た。出血したらその領域を数分間ジェルフォームで詰
め、出血が止まったら取り除いた。次に、欠損端をこす
って滑らかにした。

【００３３】６ｍｍ乃至８ｍｍの円状ゲルフィルムを脳
と骨シアロプロティン含有組成物の間に置いた。組成物
を欠損に置いた後、欠損領域において、５−０プロリン
連続縫い目パターンを用いて骨膜層を縫って閉じた。皮
膚をステープルを用いて閉じた。低体温症を避けるため
に動物を保温器の中で回復させ、歩いたらケージに戻し
た。

【００３４】Ｂ．生物活性組成物のインビボテスト方法 新たに変更したラット頭蓋冠欠損モデルでは、本発明の
組成物を、ALZET浸透ポンプを用いて大人ラットの局在
化したインビボ欠損部位（ラット頭蓋冠欠損モデルにお
ける頭蓋冠欠損部位）に直接投与した。ALZET 浸透ポン
プ（ALZA Scientific Products Palo Alto、カリフォル
ニア州）をSprague Dawleyラットの肩甲骨の少し後方の
背中の皮下に移植した。このポンプをカテーテルにつな
ぎ、カテーテルにより、頭蓋冠欠損内へのポンプの内容
物（骨シアロプロティン）の送達を管理して、約１１μ
ｇ／ｍｌ（欠損の全体積）の局所用量を付与するように
した。

【００３５】浸透ポンプは組み立ててから移植した。始
めに、送達する溶液が入っているシリンジをカテーテル
チューブに取り付け、送達する溶液で浸透ポンプを満た
して、ポンプ組立体を骨シアロプロティン組成物で満た
した。充満した浸透ポンプを流量調節器に取り付けた。
次に、ポンプ組立体を、３７℃で少なくとも４時間乃至
６時間滅菌塩水（０．９％）でインキュベートした。一
晩プライミングして最適結果を得た。この工程により、
確実に、浸透ポンプは移植する前に連続してポンピング
してテスト物質を送達する間にカニューレ内で凝血する
恐れ又は組織で閉塞する恐れを最小にした。この後、ポ
ンプ組立体を宿主動物に移植した。

【００３６】ラットを麻酔してポンプ装置をラットの背
中の肩甲骨の中央領域の皮下ポケットに移植した。移植
部位の準備のために、移植部位の皮膚を剃り、洗い、動
物の背中の肩甲骨の中央を切開した。止血鉗子を切開部
に挿入して、止血鉗子のあご部を開いて皮下組織を広げ
てポンプのためのポケットを形成した。このポケットは
ポンプが少し自由に動けるように十分に大きくなければ
ならない（例えば、ポンプより１ｃｍ長くする）。充満
ポンプをポケットに入れカテーテルにつないだ。カテー
テルの遠位端を頭蓋冠欠損内に配置して、骨シアロプロ
ティン組成物を欠損に直接送達した。その後、ポンプ挿
入部位を創傷クリップ又は縫い糸で閉じた。

【００３７】栄養障害ストレス又は正常行為の混乱を最
小にするための最大薬物送達速度及び時間に関しては、
製造業者のガイドラインに従った。ポンピング寿命が終
わったらALZET 浸透ポンプを取り除いた。

【００３８】結果：実験はALZET浸透ポンプモデル2002
を用いて実施した。この浸透ポンプはその内容物（２０
０μｌ体積）を１４日間かけて欠損部位へ送達した。実
験は、ポンプを移植した後全部で２８日間実施した。ラ
ットを２８日目に屠殺して欠損の中心を横切るセクショ
ン（頭から尾へ延びる）において骨成長の有無を組織学
的に観察した。対照動物群は２群であり、欠損領域には
塩水しか投与しないか全く何も投与しなかった（即ち、
ポンプは空であった）。骨成長についてセクションを盲
検で０乃至５にスコアした。スコアは以下の基準により
観察した新たな骨成長量に基づく。 ０＝成長無、又は既存の骨の吸収 １＝０乃至約１０％の隙間の骨による橋渡し ２＝約１０％乃至約３３％の隙間の骨による橋渡し ３＝約３３％乃至約６６％の隙間の骨による橋渡し ４＝約６６％以上の隙間の骨による橋渡し ５＝隙間の完全な橋渡し

【００３９】表１は、骨シアロプロティンに対するラッ
トのインビボ骨成長反応を分析するのに使用した実験方
法を示す。

【００４０】以下の組織学的スコアを表１に記載する実
験で得た。 表１：ラット頭蓋冠欠損モデルにおける処理と組織学的結果 処理 濃度 用量 動物の数 平均スコア 標準偏差 （μg/mlPBS）（μg/ml欠損) BSP 6 11 6 1.7 0.52 PBS 緩衝液 0 0 6 1.3 0.50

【００４１】要約すると、骨シアロプロティンを浸透ポ
ンプ方法でラット頭蓋冠欠損部位に導入すると新たな骨
成長が促進される。

【００４２】実施例２：外頚静脈経由静脈内注入 本発明の骨シアロプロティン組成物を静脈内投与により
全身投与する。このような全身投与により、骨粗鬆症又
は骨又は軟骨に関する他の病原性状態等の整形外科の病
気に対して治療効果を生じ得る。実施例１に記載したよ
うに、ALZET ポンプを用いて、流体組成物をカテーテル
により静脈又は動脈循環系に直接導入する。ALZET ポン
プは動脈圧に抵抗して流量を減らすことなくポンピング
できる。以下に、カテーテルの外頚静脈内への配置につ
いて詳説する。多くの場合、この部位がその大きさとア
クセスし易さの点から好ましいが、他の部位でも構わな
い。

【００４３】浸透ポンプ流量調節器をカテーテル（内径
≦０．７６２ｍｍ（０．０３０インチ））の一端につな
げる。カテーテルは、ポンプの皮下移植部（肩甲骨中央
領域）とカテーテルの外頚静脈挿入部位の間の距離より
２５％長くなければならない。骨シアロプロティン組成
物が入ったシリンジをカテーテルの自由端に取り付けて
流量調節器とカテーテルを満たす。浸透ポンプを骨シア
ロプロティン組成物で満たして流量調節器に取り付け
る。シリンジでカテーテルを満たしたら、シリンジを取
り外して、流量調節器を、ホワイトフランジにポンプ面
が同一面になるまで挿入する。ポンプとカテーテルを完
全に充満して空気泡が無いようにしなければならない。
充満したポンプとカテーテルを３７℃で少なくとも４時
間乃至６時間滅菌塩水（０．９％）でインキュベートす
る。この工程により、確実に、浸透ポンプを移植する前
に連続してポンピングしてテスト物質を送達する間凝血
する恐れ及びカテーテルが閉塞する恐れを最小にする。

【００４４】次に、完成した組立体を以下の様に動物に
移植する。動物の首の腹側部分を剃り、洗い、首を中線
の片側に向かって切り、組織を頭から尾への軸に沿って
広げる。鈍い切開により、外頚静脈を皮膚の直く下に特
定し、１．５ｃｍの距離について持ち上げて洗う。次
に、絹結紮糸（３．０）を洗った血管の頭側の端の周り
に巻いて縛る。血管の大きな分枝は全て縛って血行を止
めるが切らない。血管の心臓側の端で緩く２回ひとつ結
びする。鋭いカーブしたアイリス鋏みの腹部を用いて、
血管の中央部分を掴み、持ち上げ、切って、血管壁の楕
円状片を除く。（この技術は、鋏の先端で切れ目を作る
より良い。）カテーテルの自由端を血管壁の穴に挿入
し、静かに心臓の方まで進める（大人ラットで約２ｃ
ｍ）。近位（心臓側）の結紮糸をカテーテルの周りでき
ちんと結び、カテーテルを曲げないように注意する。次
に、遠位（頭側）の結紮糸をカテーテルの周りで結ぶ。
次に、３本全ての結紮糸の端を結び目近くで切る。

【００４５】止血鉗子を首にくぐらせて動物の背中の肩
甲骨の中央領域にポケットを作る。ポンプをこのポケッ
トに入れ、カテーテルが首を通って外頚静脈に達するよ
うにする。このとき、頭と首が自由に動けるように十分
にゆるくする。次に、首の皮膚にある切開部分を２個又
は３個の創傷クリップ又は縫い糸で閉じる。

【００４６】本発明を好ましい実施形態を挙げて詳細に
説明してきたが、特許請求の範囲に記載され定義される
本発明の範囲と精神内で変更及び改良ができる。

【００４７】参考文献リスト： １．Chen, Y.、Bal, B.S.及びGorski, J.P.、Journal o
f Biology and Chemistry 、２６７（３４）：第２４８
７１頁乃至第２４８７８頁（１９９２年）。 ２．Ijiri, S. 、「骨形態形成蛋白質における滅菌効
果」、第４回世界生物学的物質会議、４月２４日乃至２
８日（１９９２年） ３．Gorski, J.P.等、Journal of Biology Chemistry、
２６５（２５）：第１４９５６頁乃至第１４９６３頁
（１９９０年） ４．Mark, S.及びMiller, S.、Journal of Endocrinolo
gy、第１巻（１９９３年） ５．米国特許第３，７１０，７９５号 ６．米国特許第５，６６８，２８８号

【００４８】好適な実施態様を以下に示す。 （１）前記結合組織が骨である請求項１に記載の組成
物。 （２）前記送達担体が生体許容性ポリマーから形成され
るポリマーマトリックスを含む請求項１に記載の組成
物。 （３）前記ポリマーマトリックスが、ポリエステル、イ
オノマー、ポリ（アミノ酸）、ポリビニルアセテート、
ポリアクリレート、ポリオルトエステル、ポリアンヒド
ライド、コラーゲン、フィブリン、スターチ、アルギネ
ート及びヒアルロン酸からなる群から選択されるポリマ
ーを含む請求項１に記載の組成物。 （４）さらに、リン酸トリカルシウム、ヒドロキシアパ
タイト及び石膏から本質的になる群から選択されるミネ
ラル塩を含む請求項１に記載の組成物。 （５）前記ポリマーマトリックスが生体分解性ポリマー
を含む請求項１に記載の組成物。

【００４９】（６）前記生体分解性ポリマーがコラーゲ
ン及びポリエステルイオノマーからなる群から選択され
る実施態様（５）に記載の組成物。 （７）さらに、追加の成長因子、成長因子結合蛋白質又
は真核細胞を含む請求項１に記載の組成物。 （８）前記骨シアロプロティンが生理学的に許容される
担体と組み合わされて注射可能組成物を形成する請求項
２に記載の方法。 （９）脊椎動物種の所定のインビボ部位において局所的
な結合組織成長を誘発する方法であって、前記方法は、
結合組織成長を誘発するのに有効な量の実質的に純粋な
骨シアロプロティンと薬学的に許容される担体を含む組
成物を、前記部位に接触させることを含む方法。 （１０）前記組成物が流体形態で、前記組成物を注射に
よって前記部位に接触させる実施態様（９）に記載の方
法。

【００５０】（１１）前記組成物が、さらに、生体許容
性ポリマーマトリックスを含む実施態様（９）に記載の
方法。 （１２）前記ポリマーマトリックスが、ポリエステル、
イオノマー、ポリ（アミノ酸）、ポリビニルアセテー
ト、ポリアクリレート、ポリオルトエステル、ポリアン
ヒドライド、コラーゲン、フィブリン、スターチ、アル
ギネート及びヒアルロン酸からなる群から選択されるポ
リマーを含む実施態様（１１）に記載の方法。 （１３）前記薬学的に許容される担体が、ミネラル塩、
又は金属又はガラス化合物を含む実施態様（９）に記載
の方法。 （１４）前記ミネラル塩がリン酸トリカルシウム、ヒド
ロキシアパタイト及び石膏から本質的になる群から選択
される実施態様（１３）に記載の方法。 （１５）前記ポリマーマトリックスが生体分解性ポリマ
ーを含む実施態様（１１）に記載の方法。

【００５１】（１６）前記生体分解性ポリマーがコラー
ゲン及びポリエステルイオノマーからなる群から選択さ
れる実施態様（１５）に記載の方法。 （１７）前記組成物を前記部位に外科的に移植する実施
態様（１１）に記載の方法。 （１８）前記組成物が経時放出型送達担体で提供される
実施態様（９）に記載の方法。 （１９）前記結合組織が骨である実施態様（９）に記載
の方法。 （２０）温血脊椎動物の結合組織における病原性状態を
治療する方法であって、前記方法は、結合組織の成長を
誘発するのに有効な量の実質的に純粋な骨シアロプロテ
ィンと、薬学的に許容される担体を含む組成物を、前記
温血脊椎動物に全身投与することを含む方法。 （２１）前記組成物を非経口注射で投与する実施態様
（２０）に記載の方法。 （２２）前記病原性状態が骨粗鬆症である実施態様（２
０）に記載の方法。

【００５２】

【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば、イ
ンビボで結合組織の修復を促進する組成物を提供できる
効果がある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 599134034 700 Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｄｒｉｖ ｅ， Ｗａｒｓａｗ， ＩＮ 46581， Ｕ．Ｓ．Ａ. (72)発明者 ナンシー・ノーセク−ゴーブル アメリカ合衆国、46038 インディアナ州、 フィッシャーズ、カンバーランド・リッ ジ・コート 10416 (72)発明者 トッド・ピー・グランシー アメリカ合衆国、47928 インディアナ州、 フェアモント、4240・イー・1050・エス （番地なし) Ｆターム(参考） 4C084 AA02 BA03 CA34 DB60 NA14 ZA962 ZC022

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 送達担体及び、有効量の実質的に純粋な
   骨シアロプロティンを含む生物活性混合物を含む、結合
   組織の成長を促進するための組成物。
2. 【請求項２】 骨の成長を必要とするインビボ部位での
   当該成長を誘発するのに有用な組成物の調製における単
   離した骨シアロプロティンの使用方法。