JP2001103999A - Method for detecting nucleic acid - Google Patents
Method for detecting nucleic acidInfo
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、試料中に存在する
複数の標的核酸分子を検出又は定量する方法に関する。[0001] The present invention relates to a method for detecting or quantifying a plurality of target nucleic acid molecules present in a sample.
【0002】[0002]
【従来の技術】生体試料中に存在する特定の核酸分子を
検出する技術は、特定臓器で発現・機能するタンパク質
の核酸分子レベルでの解析、神経、脳あるいは免疫系で
の情報伝達におけるタンパク質の発現制御の研究等にお
いて重要であるのみならず、遺伝的疾患の変異遺伝子の
検出、癌の診断、ウイルス関連遺伝子の検出等遺伝子診
断においても極めて重要である。2. Description of the Related Art Techniques for detecting a specific nucleic acid molecule present in a biological sample include analyzing the protein expressed and functioning in a specific organ at the nucleic acid molecule level, and analyzing the protein in the information transmission in the nerve, brain or immune system. It is not only important in the study of expression control and the like, but also extremely important in gene diagnosis such as detection of mutant genes of genetic diseases, diagnosis of cancer, detection of virus-related genes, and the like.
【0003】しかしながら、従来の技術は、煩雑で且つ
多くの工程を含み、熟練を要するために、操作によって
はかなりの時間が必要とされることが多い。[0003] However, the conventional technology is complicated and involves many steps, and requires skill, so that a considerable amount of time is often required depending on the operation.
【0004】また、遺伝子診断などは確定診断として用
いられるため誤りが許されず、さらに迅速性も要求され
るために、迅速性を保ちながら高い精度有していなけれ
ばならないが、従来の技術は、かかる要請を十分に満足
するものとはいえない。[0004] In addition, since genetic diagnosis and the like are used as definitive diagnosis, errors are not allowed, and quickness is also required. Therefore, high accuracy must be maintained while maintaining quickness. Such a request cannot be fully satisfied.
【0005】試料中に存在する特定の核酸分子を検出す
る代表的な技術としては、ハイブリダイゼーション法が
ある。核酸のハイブリダイゼーション分析は、多種類の
核酸の中から非常に少数の標的核酸(DNAやRNA)をプロー
ブで検出する技術であるが、ハイブリダイゼーション法
では、高感度なレポーター(酵素、蛍光色素、ラジオア
イソトープ等)を用いても、低コピー数(1〜1000個)
の標的核酸分子を検出するのは困難である。さらに、ハ
イブリダイゼーション法には、非特異反応という大きな
問題点が存するため、類似した複数の核酸分子から特定
の核酸分子のみを検出することが難しい。A typical technique for detecting a specific nucleic acid molecule present in a sample is a hybridization method. Hybridization analysis of nucleic acids is a technique for detecting a very small number of target nucleic acids (DNA or RNA) from a wide variety of nucleic acids with a probe, but the hybridization method uses a highly sensitive reporter (enzyme, fluorescent dye, Low copy number (1 to 1000) even when using radioisotopes
Is difficult to detect. Furthermore, since the hybridization method has a major problem of nonspecific reaction, it is difficult to detect only a specific nucleic acid molecule from a plurality of similar nucleic acid molecules.
【0006】このように、核酸ハイブリダイゼーション
法は感度及び特異性が十分ではため、高感度な検出を要
する臨床的診断に適用することは困難である。[0006] As described above, since the nucleic acid hybridization method has sufficient sensitivity and specificity, it is difficult to apply the method to clinical diagnosis requiring highly sensitive detection.
【0007】これに対して、古典的なハイブリダイゼー
ション法とは全く異なるDNA検出法として、フォードー
ル(Fodor)ら、サイエンス(Science)第251巻、767−
773頁、1991年は、写真平板技術を用いてマトリックス
上にオリゴヌクレオチドを合成する方法を開示してい
る。また、ピルング(Pirrung)ら、米国特許第5,143,8
54号、1992年9月1日は、シリコン基板上のアレイ様式に
てのポリペプチドの大規模写真平板固相合成法を教示し
ている。さらに、ビーティエ(Beattie)、「1992年サ
ンジエゴ会議:遺伝子認識(The 1992 San Diego Confe
rence:Genetic Recognition)」1992年11月では、超微
細ロボットエ学システムを用いて、特異的DNA配列を含
む微小液滴をガラス基体上の個々の超微細加工試料ウェ
ルに滴下させて基体上にDNA配列を合成する方法を開示
している。各試料ウェルにおけるハイブリダイゼーショ
ンは、交流電場で各個別超微小ウェルを取り囲んだ、ミ
ニチュア電極試験固定体を応答指令信号を送ることによ
って検出する。On the other hand, as a DNA detection method completely different from the classical hybridization method, Fodor et al., Science, Vol. 251, 767-
773, 1991, discloses a method for synthesizing oligonucleotides on a matrix using photolithographic techniques. Also, Pilrung et al., US Pat. No. 5,143,8
No. 54, September 1, 1992, teaches a large-scale, photolithographic solid phase synthesis of polypeptides in an array format on a silicon substrate. In addition, Beattie, 1992 San Diego Conference: Gene Recognition (The 1992 San Diego Confe
rence: Genetic Recognition), in November 1992, using a microscopic robotics system, microdroplets containing a specific DNA sequence were dropped onto individual microfabricated sample wells on a glass substrate and placed on the substrate. A method for synthesizing a DNA sequence is disclosed. Hybridization in each sample well is detected by sending a command signal to a miniature electrode test fixture surrounding each individual microwell with an alternating electric field.
【0008】このような方法によって固相上に多種類の
DNAが合成されたDNAチップは、ハイブリダイゼーション
法に比べて操作が非常に簡便であるため、診断の迅速性
を極めて向上させ得る。[0008] By such a method, various kinds of
The operation of a DNA chip on which DNA has been synthesized is much simpler than that of a hybridization method, so that the speed of diagnosis can be significantly improved.
【0009】しかし、従来のDNAチップでは、単に、検
出すべき標的核酸の塩基配列と相補的な配列を有するプ
ローブが固相されているにすぎないので、各プローブの
至適ハイブリダイゼーション条件が一定ではなく、偽陽
性ハイブリダイゼーションが起こりやすいという欠点を
有している。However, in a conventional DNA chip, only probes having a sequence complementary to the base sequence of the target nucleic acid to be detected are immobilized, so that the optimal hybridization conditions for each probe are constant. Rather, it has the disadvantage that false positive hybridization is likely to occur.
【0010】このような偽陽性ハイブリダイゼーション
を避けるためには、各プローブ毎に最適化されたハイブ
リダイゼーション条件を付与すればよいが、極めて密に
固相化された各プローブ毎に最適な条件を与えることは
不可能であるために、従来のDNAチップは、特異性が十
全でないというハイブリダイゼーションに存する根本的
な問題を解決するには至っていない。In order to avoid such false-positive hybridization, optimized hybridization conditions may be provided for each probe. Because it is impossible to give, conventional DNA chips have not solved the fundamental problem of hybridization, which is not sufficient in specificity.
【0011】加えて、従来のDNAチップでは、検出すべ
き標的核酸の種類が変われば、新たにそれらの相補配列
を固相化し直さなければならないので、極めて多種類の
核酸が検出対象とされる臨床検査に適用するには汎用性
が十分ではないという欠点をも有している。[0011] In addition, in the conventional DNA chip, if the type of the target nucleic acid to be detected is changed, its complementary sequence must be re-immobilized again, so that an extremely large variety of nucleic acids are to be detected. It also has the disadvantage that versatility is not sufficient for application to clinical tests.
【0012】[0012]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、かかる事情
に鑑みてなされたものであり、従来の核酸検出技術に比
べて、操作が簡便であるとともに向上した特異性を有
し、且つ多種類の核酸に適用し得るという汎用性をも備
えた核酸検出法を提供することを特徴とする。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above circumstances, and has a simpler operation, improved specificity, and a greater variety of properties than conventional nucleic acid detection techniques. The present invention is characterized by providing a nucleic acid detection method having versatility that can be applied to nucleic acids.
【0013】[0013]
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明は、所定の配列を有する試料中の標的核酸N1
〜Nn(nは2以上の整数)を検出又は定量する方法であ
って、a) 前記標的核酸N1〜Nn中の第一の部分配列F1〜
Fnに相補的な配列F1’〜Fn’と、各F1’〜Fn’に連結さ
れた標識物質を備えたプローブA1〜Anを含む第一のプロ
ーブ群と、前記標的核酸N1〜Nn中の第二の部分配列S1〜
Snに相補的な配列S1’〜Sn’と、各S1’〜Sn’に連結さ
れたフラッグ配列FL1〜FLnとを備えたプローブB1〜Bnを
含む第二のプローブ群とを準備する工程と、b)前記第一
のプローブ群と、前記第二のプローブ群と、前記試料と
を混合して、前記標的核酸N1〜Nn中の前記第一の部分配
列F1〜Fnに前記プローブA1〜Anをハイブリダイズさせる
とともに、前記第二の部分配列S1〜Snに前記プローブB1
〜Bnをハイブリダイズさせる工程と、c) 前記標的核酸
N1〜Nnにハイブリダイズした前記プローブA1〜Anと前記
プローブB1〜Bnをライゲートして、プローブ(A1+B1)〜
(An+Bn)を作出する工程と、d) 前記フラッグ配列FL1〜
Flnを該配列と相補的な配列FL1’〜FLn’にハイブリダ
イズさせることにより、前記プローブ(A1+B1)〜(An+B
n)を回収する工程と、e) 回収した前記プローブ(A1+B
1)〜(An+Bn)中の前記標識物質を検出又は定量すること
により、前記試料中の標的核酸N1〜Nnを検出又は定量す
る工程と、を具備する方法を提供する。Means for Solving the Problems To solve the above problems, the present invention provides a method for preparing a target nucleic acid N1 in a sample having a predetermined sequence.
A method for detecting or quantifying NNn (n is an integer of 2 or more), comprising: a) a first partial sequence F1〜 in the target nucleic acids N1NNn;
Sequences F1 ′ to Fn ′ complementary to Fn, a first probe group including probes A1 to An with a labeling substance linked to each F1 ′ to Fn ′, and a first probe group in the target nucleic acids N1 to Nn. Two partial arrays S1 ~
A step of preparing a second probe group including probes B1 to Bn having sequences S1 ′ to Sn ′ complementary to Sn and flag sequences FL1 to FLn linked to each of S1 ′ to Sn ′, b) mixing the first probe group, the second probe group, and the sample, the first partial sequence F1 ~ Fn in the target nucleic acid N1 ~ Nn the probe A1 ~ An. While hybridizing, the probe B1 was added to the second partial sequences S1 to Sn.
~ Bn hybridizing, c) the target nucleic acid
The probes A1 to An hybridized to N1 to Nn and the probes B1 to Bn are ligated, and the probes (A1 + B1) to
(An + Bn) to produce, d) the flag array FL1 ~
By hybridizing Fln to the sequences FL1 ′ to FLn ′ complementary to the sequence, the probes (A1 + B1) to (An + B
recovering n) and e) recovering the probe (A1 + B
1) detecting or quantifying the labeling substance in (An + Bn) to detect or quantify the target nucleic acids N1 to Nn in the sample.
【0014】[0014]
【発明の実施の形態】以下、図1を参照しながら、本発
明の方法の一態様を説明する。DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS One embodiment of the method of the present invention will be described below with reference to FIG.
【0015】本方法の第一工程では、 −標的核酸1、標的核酸2、…、標的核酸n(以下標的
核酸N1〜Nnと略記するの存在を検出又は定量すべき試料
と、 − 前記標的核酸1の第一の部分配列F1に相補的な配列
と該配列に結合された標識物質とを有するプローブA1
と、前記標的核酸2の第一の部分配列F2に相補的な配列
と該配列に結合された標識物質とを有するプローブA2と
…、前記標的核酸nの第一の部分配列Fnに相補的な配列
と該配列に結合された標識物質とを有するプローブAnを
含む(以下プローブA1〜Anと略記する)第一のプローブ
群と、 − 前記標的核酸1の第一の部分配列F1とは異なる第二
の部分配列S1に相補的な配列と該配列に結合されたフラ
ッグ配列FL1とを有するプローブB1と、前記標的核酸2
の第一の部分配列F2とは異なる第二の部分配列F2に相補
的な配列と該配列に結合されたフラッグ配列FL2とを有
するプローブB2と…、前記標的核酸nの第一の部分配列F
nとは異なる第二の部分配列Snに相補的な配列と該配列
に結合されたフラッグ配列FLnとを有するプローブBnを
含む(以下プローブB1〜Bnと略記する)第二のプローブ
群とを混合する工程である。The first step of the method comprises:-a sample to be detected or quantified for the presence of target nucleic acid 1, target nucleic acid 2, ..., target nucleic acid n (hereinafter abbreviated as target nucleic acids N1 to Nn); Probe A1 having a sequence complementary to one first partial sequence F1 and a labeling substance bound to the sequence
A probe A2 having a sequence complementary to the first partial sequence F2 of the target nucleic acid 2 and a labeling substance bound to the sequence, ..., complementary to the first partial sequence Fn of the target nucleic acid n A first probe group including a probe An having a sequence and a labeling substance bound to the sequence (hereinafter, abbreviated as probes A1 to An);-a first probe group different from the first partial sequence F1 of the target nucleic acid 1; A probe B1 having a sequence complementary to the two partial sequences S1 and a flag sequence FL1 bound to the sequence,
A probe B2 having a sequence complementary to the second subsequence F2 different from the first subsequence F2 and a flag sequence FL2 bound to the sequence, ..., the first subsequence F of the target nucleic acid n
and a second probe group including a probe Bn having a sequence complementary to the second partial sequence Sn different from n and a flag sequence FLn linked to the sequence (hereinafter abbreviated as probes B1 to Bn) This is the step of performing
【0016】前記検出又は定量すべき前記標的核酸N1〜
Nnは、任意の配列を有する任意の核酸であり得るが、遺
伝病の原因遺伝子、癌関連遺伝子、又はウイルス由来の
核酸など疾病のマーカーとなり得る核酸は、とりわけ好
ましい標的核酸である。The target nucleic acids N1 to N1 to be detected or quantified
Nn can be any nucleic acid having any sequence, but a nucleic acid that can be a marker of a disease, such as a causative gene of a genetic disease, a cancer-related gene, or a nucleic acid derived from a virus, is a particularly preferred target nucleic acid.
【0017】それ故、前記試料には、血液、尿、唾液等
の体液が含まれるが、体液以外の任意の試料を使用し得
る。試料が固体であれば、酵素処理、界面活性剤又は有
機溶媒の添加等の適切な方法で液体に溶解せしめればよ
い。Therefore, the samples include body fluids such as blood, urine and saliva, but any sample other than body fluids can be used. If the sample is a solid, it may be dissolved in a liquid by an appropriate method such as enzyme treatment, addition of a surfactant or an organic solvent.
【0018】なお、本明細書で、「核酸」には、cDNA、
ゲノムDNA、合成DNA、mRNA、全RNA、hnRNA、合成RNAを
含む全てのDNA及びRNAを意味するものとする。As used herein, the term “nucleic acid” includes cDNA,
All DNAs and RNAs including genomic DNA, synthetic DNA, mRNA, total RNA, hnRNA, and synthetic RNA are meant.
【0019】各標的核酸N1〜Nn中の第一の部分配列F1〜
Fnの塩基数は1塩基以上であり得るが、安定なハイブリ
ダイゼーションを達成するために、20塩基以上であるこ
とが好ましい。各第一の部分配列は、標的核酸N1〜Nnの
塩基配列から任意に選択することができる。The first partial sequences F1 to F1 in each of the target nucleic acids N1 to Nn
The number of bases of Fn may be 1 or more, but is preferably 20 or more in order to achieve stable hybridization. Each first partial sequence can be arbitrarily selected from the base sequences of the target nucleic acids N1 to Nn.
【0020】各標的核酸N1〜Nn中の第二の部分配列S1〜
Snの塩基数も1塩基以上であり得るが、第一の部分配列
と同じく20塩基以上であることが好ましい。各第二の部
分配列は、対応する第一の部分配列と異なる配列であれ
ば、対応する第一の部分配列と部分的に重複してもよ
い。なお、この後の工程における操作を容易にするため
に各標的核酸N1〜Nn中の第一の部分配列と第二の部分配
列は、全て隣接するように選択することが好ましい。The second partial sequences S1 to S1 in each of the target nucleic acids N1 to Nn
Although the number of bases of Sn may be one or more, it is preferably 20 or more as in the first partial sequence. Each second subsequence may partially overlap with the corresponding first subsequence as long as it is different from the corresponding first subsequence. It is preferable that the first partial sequence and the second partial sequence in each of the target nucleic acids N1 to Nn are selected so as to be all adjacent to each other in order to facilitate the operation in the subsequent steps.
【0021】プローブA1〜Anは、標的核酸N1〜Nnから任
意に選択した第一の部分配列F1〜Fnと相補的な配列F1’
〜Fn’を有しているので、標的核酸N1〜NnとプローブA1
〜Anを混合すると、プローブA1〜Anは対応する標的核酸
N1〜Nn中のF1’〜Fn’とハイブリダイズすることができ
る。The probes A1 to An comprise a sequence F1 'complementary to the first partial sequences F1 to Fn arbitrarily selected from the target nucleic acids N1 to Nn.
~ Fn ', the target nucleic acids N1 to Nn and the probe A1
When ~ A is mixed, the probes A1 ~ An
It can hybridize with F1 'to Fn' in N1 to Nn.
【0022】ここで「相補的な配列」とは、適切な条件
下において、所定の標的核酸のみに特異的にハイブリダ
イズし得る配列を意味する。Here, the term "complementary sequence" means a sequence capable of specifically hybridizing only to a predetermined target nucleic acid under appropriate conditions.
【0023】各プローブA1〜Anには、標的核酸N1〜Nnの
検出又は定量を可能とするために、標的物質11が連結
されている。好ましい標識物質は、FITC等の蛍光物質、
発光物質、32P等の放射性物質、高吸収性物質、高光反
射性物質、高電位性物質、磁性物質、及び色素である
が、これらに限定されない。特に蛍光物質、放射性物
質、及び色素は好ましい標的物質である。なお、プロー
ブA1〜Anには、各々異なる標的物質を結合することも可
能である。A target substance 11 is linked to each of the probes A1 to An in order to enable detection or quantification of the target nucleic acids N1 to Nn. Preferred labeling substances are fluorescent substances such as FITC,
A light emitting substance, a radioactive substance such as 32 P, a highly absorbent substance, a high light reflective substance, a high potential substance, a magnetic substance, and a dye, but are not limited thereto. In particular, fluorescent substances, radioactive substances, and dyes are preferred target substances. Note that different target substances can be bound to the probes A1 to An, respectively.
【0024】プローブB1〜Bnは、標的核酸N1〜Nnから任
意に選択した第二の部分配列と相補的な配列を有してい
るので、標的核酸N1〜NnとプローブB1〜Bnを混合する
と、プローブB1〜Bnは対応する標的核酸N1〜Nn中のS1’
〜Sn’とハイブリダイズすることができる。ここで、
「相補的な配列」とは前述のとおりである。Since the probes B1 to Bn have a sequence complementary to the second partial sequence arbitrarily selected from the target nucleic acids N1 to Nn, when the target nucleic acids N1 to Nn and the probes B1 to Bn are mixed, Probes B1 to Bn correspond to S1 ′ in corresponding target nucleic acids N1 to Nn.
~ Sn 'can be hybridized. here,
The “complementary sequence” is as described above.
【0025】各プローブB1〜Bnには、後の工程でプロー
ブB1〜Bn及びプローブB1〜Bnが連結された配列を特異的
に回収するために、夫々フラッグ配列FL1〜FLnが連結さ
れている。フラッグ配列の塩基数及び配列は任意のもの
であり得るが、同様の至適ハイブリダイゼーション条件
を有する組み合わせとなるように選択することが好まし
い。Flag sequences FL1 to FLn are connected to the probes B1 to Bn, respectively, in order to specifically recover the probes B1 to Bn and the sequences to which the probes B1 to Bn are connected in a later step. Although the number of bases and the sequence of the flag sequence may be arbitrary, it is preferable to select a combination having the same optimal hybridization conditions.
【0026】フラッグ配列FL1〜FLnは、標的核酸N1〜Nn
の検出又は定量を容易にするために、少なくとも一部、
好ましくは全てが異なるものであることが好ましい。し
かし、前記プローブA1〜Anに複数種の標識物質を結合せ
しめたときには、標識物質による特異的な検出又は定量
が可能となるので、各フラッグ配列の一部又は全部を同
じ配列にすることもできる。The flag sequences FL1 to FLn correspond to the target nucleic acids N1 to Nn.
At least in part, to facilitate detection or quantification of
Preferably, they are all different. However, when a plurality of types of labeling substances are bound to the probes A1 to An, specific detection or quantification by the labeling substance becomes possible, so that a part or all of each flag sequence can be the same sequence. .
【0027】前述のように、各標的核酸N1〜Nn中の第一
の部分配列F1〜Fnと第二の部分配列S1〜Snは隣接するよ
うに選択するのが好ましいので、F1〜FnとS1〜Snをこの
ように選択すれば、プローブB1〜BnとプローブA1〜An
は、互いに隣接して、対応する標的核酸N1〜Nnにハイブ
リダイズすることになる。従って、プローブB1〜Bn中の
各フラッグ配列は、図1に示されているように、プロー
ブA1〜An中の各標識物質と対向しない末端に連結するこ
とが好ましい。As described above, since the first partial sequence F1 to Fn and the second partial sequence S1 to Sn in each of the target nucleic acids N1 to Nn are preferably selected to be adjacent to each other, F1 to Fn and S1 ~ Sn is selected in this way, the probe B1 ~ Bn and the probe A1 ~ An
Will hybridize to the corresponding target nucleic acids N1-Nn adjacent to each other. Therefore, as shown in FIG. 1, each flag sequence in the probes B1 to Bn is preferably linked to an end that does not face each labeling substance in the probes A1 to An.
【0028】本方法の第二工程では、対応する各標的核
酸N1〜NnにプローブA1〜AnとプローブB1〜Bnをハイブリ
ダイズさせ、プローブA1〜AnとプローブB1〜Bnをライゲ
ートする工程である。In the second step of the present method, the probes A1 to An and the probes B1 to Bn are hybridized to the corresponding target nucleic acids N1 to Nn, and the probes A1 to An and the probes B1 to Bn are ligated.
【0029】各プローブを対応する標的核酸にハイブリ
ダイズさせるには、標的核酸が一本鎖ならば、別段の処
理を行わずに、標的核酸を含む試料と両プローブ群を混
合すればよい。標的核酸N1〜Nnが二本鎖である場合に
は、例えば90℃程度の高温で数分間静置して、相補的結
合を解離せしめた後に、両プローブ群を添加し、例えば
50℃程度の温度で2〜3時間静置することにより、ハイブ
リダイズを行えばよい。勿論、ハイブリダイゼーション
の条件、すなわち使用する緩衝液の種類、温度条件、時
間等は標的核酸の種類に応じて適宜選択し得ることは、
当業者であれば自明であろう。In order to hybridize each probe to the corresponding target nucleic acid, if the target nucleic acid is single-stranded, a sample containing the target nucleic acid and both probe groups may be mixed without performing any additional treatment. When the target nucleic acids N1 to Nn are double-stranded, for example, the mixture is allowed to stand at a high temperature of about 90 ° C. for several minutes to dissociate complementary bonds, and then both probe groups are added.
The hybridization may be performed by leaving the mixture at a temperature of about 50 ° C. for 2 to 3 hours. Of course, hybridization conditions, that is, the type of buffer used, temperature conditions, time, etc. can be appropriately selected according to the type of target nucleic acid.
Those skilled in the art will be self-evident.
【0030】ハイブリダイゼーションを行うと、プロー
ブA1〜AnとプローブB1〜Bnは対応する標的核酸N1〜Nnに
結合するので、リガーゼ等を作用させれば、連結部12を
介してプローブA1〜AnとプローブB1〜Bnを連結すること
により、プローブA1+B1、プローブA2+B2、…プローブ
A1+Bn(以下プローブ(A1+B1)〜(An+Bn)と略記する)
を作出することが可能となる。When hybridization is performed, the probes A1 to An and the probes B1 to Bn bind to the corresponding target nucleic acids N1 to Nn. Therefore, if a ligase or the like is applied, the probes A1 to An By connecting probes B1 to Bn, probe A1 + B1, probe A2 + B2, ... probe
A1 + Bn (hereinafter abbreviated as probe (A1 + B1) to (An + Bn))
Can be created.
【0031】両プローブ群の連結するために使用し得る
好適なリガーゼには、サーマス・アクアティカス(Therm
us aquaticus)のTaqDNAリガーゼが含まれるが、これに
限定されず、標的核酸の種類に応じて任意のDNAリガー
ゼ又はRNAリガーゼを使用し得る。Suitable ligases which can be used to ligate both probe groups include Thermus Aquaticus (Therm
us aquaticus), but not limited thereto, and any DNA ligase or RNA ligase may be used depending on the type of target nucleic acid.
【0032】また、酵素的な手法に変えて、化学的な手
法で両プローブ群を連結してもよい。Alternatively, both probe groups may be linked by a chemical method instead of the enzymatic method.
【0033】プローブA1〜AnとプローブB1〜Bnが隣接し
ていないときには、DNAポリメラーゼ又はRNAポリメラー
ゼによって、好ましくはTaqポリメラーゼ等の耐熱性DNA
ポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に
よって、両プローブ群の間隙に核酸塩基を導入した後
に、酵素的な手法又は化学的な手法で両プローブ群を連
結してもよい。When the probes A1 to An and the probes B1 to Bn are not adjacent to each other, a DNA polymerase or an RNA polymerase, preferably a thermostable DNA such as Taq polymerase is used.
After introducing a nucleobase into the gap between both probe groups by polymerase chain reaction (PCR) using a polymerase, both probe groups may be connected by an enzymatic technique or a chemical technique.
【0034】第三の工程では、対応する標的核酸から各
プローブ(A1+B1)〜(An+Bn)を解離させる。プローブの
解離は、熱的変性及び化学的変性を含む変性処理によっ
て達成される。熱的変性によりプローブを解離させる場
合には、生理的条件下では、85℃以上、好ましくは90℃
以上の温度にすればよいが、当業者であれば、プローブ
中のGC含量に応じて、適切な温度を選択し得ることは自
明であろう。In the third step, each probe (A1 + B1) to (An + Bn) is dissociated from the corresponding target nucleic acid. Probe dissociation is achieved by denaturation treatments, including thermal denaturation and chemical denaturation. When dissociating the probe by thermal denaturation, under physiological conditions, 85 ° C. or more, preferably 90 ° C.
The above temperature may be used, but it will be obvious to those skilled in the art that an appropriate temperature can be selected according to the GC content in the probe.
【0035】なお、標的核酸にハイブリダイズしたプロ
ーブの末端が、標的核酸の末端からさらに延出して一本
鎖領域を形成していれば、変性処理工程は省略すること
は可能であるが、通常は変性処理工程を加えることが望
ましいであろう。The denaturation step can be omitted if the end of the probe hybridized to the target nucleic acid further extends from the end of the target nucleic acid to form a single-stranded region. It would be desirable to add a denaturation step.
【0036】第四の工程では、プローブ(A1+B1)〜(An
+Bn)を特異的に回収し、標的核酸を検出又は定量する
操作を行う。In the fourth step, probes (A1 + B1) to (An
+ Bn) is specifically recovered, and an operation of detecting or quantifying the target nucleic acid is performed.
【0037】プローブ(A1+B1)〜(An+Bn)を特異的に回
収するためには、フラッグ配列FL1〜FLnと相補的な配列
FL1’〜FLn’を固相化せしめた固相担体を用いる方法が
極めて好ましい。フラッグ配列と相補的な配列を固相化
すべき固相担体には、シリコンやガラス等の基板、粒
子、試験管やバイアル瓶等の容器、繊維、キャピラリー
等の毛管を含む管、アフィニティーカラム、フィルタ
ー、電極等が含まれるが、これらに限定されない。好ま
しい固相担体は、シリコン基板、粒子、及びキャピラリ
ーである。To specifically recover the probes (A1 + B1) to (An + Bn), a sequence complementary to the flag sequences FL1 to FLn
A method using a solid support on which FL1 'to FLn' are immobilized is extremely preferable. The solid phase carrier to which the sequence complementary to the flag sequence should be immobilized includes substrates such as silicon and glass, particles, containers such as test tubes and vials, tubes including capillaries such as fibers and capillaries, affinity columns, and filters. , Electrodes, etc., but are not limited thereto. Preferred solid supports are silicon substrates, particles, and capillaries.
【0038】前述のように、フラッグ配列FL1〜FLnはプ
ローブBの中に含まれる人為的な配列であるから、プロ
ーブ(A1+B1)〜(An+Bn)とのハイブリダイゼーションの
特異性が向上するように、FL1〜FLnを選択することがで
きる。As described above, since the flag sequences FL1 to FLn are artificial sequences contained in the probe B, the flag sequences FL1 to FLn are designed to improve the specificity of hybridization with the probes (A1 + B1) to (An + Bn). FL1 to FLn can be selected.
【0039】より具体的には、プローブ(A1+B1)〜(An
+Bn)のGC含量や核酸塩基の組成等を適切に選択すれ
ば、各プローブの至適ハイブリダイゼーション条件(例
えば温度、塩濃度等)を均一にそろえることができるた
め、誤対合が発生する確率が著しく減少又は喪失し、特
異性が極めて向上することになる。More specifically, the probes (A1 + B1) to (An
The optimal hybridization conditions (eg, temperature, salt concentration, etc.) for each probe can be uniformly adjusted by appropriately selecting the GC content of + Bn), the composition of the nucleic acid base, and the like. Will be significantly reduced or lost, and the specificity will be greatly improved.
【0040】これに対して、標的核酸の相補的配列を固
相化する従来の核酸検出方法では、固相化されている各
プローブの至適ハイブリダイゼーション条件は全く異な
るので、全てのプローブに適した条件を設定することは
不可能であり、特異性が低下する。On the other hand, in the conventional nucleic acid detection method in which the complementary sequence of the target nucleic acid is immobilized, the optimal hybridization conditions for each immobilized probe are completely different, so that it is suitable for all probes. It is impossible to set the conditions that have been set, and the specificity is reduced.
【0041】また、フラッグ配列は変化させずに、第一
の部分配列と第二の部分配列のみを変化させれば、一種
類の固相担体で所望の標的核酸を検出・定量することが
可能となるので、本方法は汎用性が高い。If only the first partial sequence and the second partial sequence are changed without changing the flag sequence, it is possible to detect and quantify a desired target nucleic acid with one kind of solid phase carrier. Therefore, the method is highly versatile.
【0042】以上の操作によって特異的に回収されたプ
ローブ(A1+B1)〜(An+Bn)には、標識物質が連結されて
いるので、標識物質に応じた適切な方法によりプローブ
(A1+B1)〜(An+Bn)を検出又は定量できる。ライゲーシ
ョンは、標的核酸とハイブリダイズしなければ起こらな
いので、プローブ(A1+B1)〜(An+Bn)を検出又は定量す
れば、間接的に各標的核酸を検出又は定量し得ることに
なる。Since the labeling substance is linked to the probes (A1 + B1) to (An + Bn) specifically recovered by the above operation, the probe is prepared by an appropriate method according to the labeling substance.
(A1 + B1) to (An + Bn) can be detected or quantified. Since ligation must occur after hybridization with the target nucleic acid, detection or quantification of the probes (A1 + B1) to (An + Bn) enables indirect detection or quantification of each target nucleic acid.
【0043】次に、図2を参照しながら、本発明の方法
の別の実施態様を説明する。Next, another embodiment of the method of the present invention will be described with reference to FIG.
【0044】本方法の第一の工程では、図1に記載の方
法の第一の工程と基本的に同じであり、標的核酸N1〜Nn
を検出又は定量すべき試料と、プローブA1〜Anを含む第
一のプローブ群と、プローブB1〜Bnを含む第二のプロー
ブ群とを混合する操作を行うが、プローブA1〜Anがタグ
配列Tg1〜Tgnを具備している点のみが異なる。The first step of the present method is basically the same as the first step of the method shown in FIG. 1, and the target nucleic acids N1 to Nn
The sample to be detected or quantified, the first probe group including the probes A1 to An, the operation of mixing the second probe group including the probes B1 to Bn is performed, the probe A1 to An is the tag sequence Tg1 The only difference is that Tgn.
【0045】タグ配列は、塩基配列の他、ビオチン等の
小分子、抗体等のタンパク質等、特定の物質と特異的に
結合し得る任意の物質であり得る。The tag sequence may be any substance that can specifically bind to a specific substance such as a small molecule such as biotin, a protein such as an antibody, etc., in addition to the base sequence.
【0046】ハイブリダイゼーション及びライゲーショ
ンを行う第二の工程、フラッグ配列によるプローブ(A1
+B1)〜(An+Bn)の回収を行う第三の工程は、図1に記載
の方法の対応する工程と基本的に同じである。なお、図
2では、変性処理過程は省略してあるが、変性処理過程
を行ってもよく、通常は変性処理過程を行うことが好ま
しい。In the second step of hybridization and ligation, a probe (A1
The third step of recovering (+ B1) to (An + Bn) is basically the same as the corresponding step of the method described in FIG. In FIG. 2, the denaturation process is omitted, but the denaturation process may be performed, and it is usually preferable to perform the denaturation process.
【0047】第四の工程は、プローブ(A1+B1)〜(An+B
n)とともに副次的に回収された遊離のプローブB1〜Bnに
は存在しないTg1〜Tgnの相補的配列Tg1’〜Tgn’を利用
して、プローブ(A1+B1)〜(An+Bn)のみを選択し、検出
又は定量する工程である。In the fourth step, probes (A1 + B1) to (An + B
n) using the complementary sequence Tg1 ′ to Tgn ′ of Tg1 to Tgn that is not present in the free probe B1 to Bn collected secondarily together with the probe (A1 + B1) to (An + Bn), This is the step of detecting or quantifying.
【0048】遊離のプローブB1〜BnがFL1’〜FLn’にハ
イブリダイズしているために、FL1〜FLnにハイブリダイ
ズしたプローブ(A1+B1)〜(An+Bn)の絶対量が減少して
いる第三の工程とは異なり、第四の工程では、プローブ
(A1+B1)〜(An+Bn)のみがハイブリダイズしているの
で、固相化されたプローブ(図ではTg1’〜Tgn’)にハ
イブリダイズする標識物質の絶対量が増大し、高い感度
で標的核酸を検出又は定量することが可能となる。Since the free probes B1 to Bn hybridized to FL1 ′ to FLn ′, the absolute amount of the probe (A1 + B1) to (An + Bn) hybridized to FL1 to FLn was reduced. Unlike the process, in the fourth process, the probe
Since only (A1 + B1) to (An + Bn) are hybridized, the absolute amount of the labeling substance that hybridizes to the immobilized probe (Tg1 ′ to Tgn ′ in the figure) increases, and the target nucleic acid can be detected with high sensitivity. It can be detected or quantified.
【0049】図2では、第三の工程の後に、プローブ(A
1+B1)〜(An+Bn)をそのまま解離させているが、少なく
ともタグ配列を含むように、プローブ(A1+B1)〜(An+B
n)を切断してもよいことは自明であろう。In FIG. 2, after the third step, the probe (A
1 + B1) to (An + Bn) are dissociated as they are, but the probes (A1 + B1) to (An + B
It will be obvious that n) may be truncated.
【0050】[0050]
【発明の効果】以上のように、本発明は、特異性及び簡
便性に優れ、且つ汎用性が向上した核酸の検出又は定量
方法を提供する。As described above, the present invention provides a method for detecting or quantifying a nucleic acid which is excellent in specificity and simplicity and has improved versatility.
【図1】本発明の一実施態様を示す図。FIG. 1 is a diagram showing one embodiment of the present invention.
【図2】本発明の別の実施態様を示す図。FIG. 2 is a diagram showing another embodiment of the present invention.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) G01N 33/566 C12M 1/00 A // C12M 1/00 1/40 B 1/40 C12N 15/00 A Fターム(参考) 4B024 AA11 AA19 CA01 CA09 CA11 HA08 HA12 HA13 4B029 AA23 BB20 CC03 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ42 QQ52 QR01 QR31 QR32 QR56 QR66 QR82 QS34 QX02 QX07 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) G01N 33/566 C12M 1/00 A // C12M 1/00 1/40 B 1/40 C12N 15/00 A F-term (Reference) 4B024 AA11 AA19 CA01 CA09 CA11 HA08 HA12 HA13 4B029 AA23 BB20 CC03 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ42 QQ52 QR01 QR31 QR32 QR56 QR66 QR82 QS34 QX02 QX07
Claims (9)
〜Nn(nは2以上の整数)を検出又は定量する方法であ
って、 a) 前記標的核酸N1〜Nn中の第一の部分配列F1〜Fnに相
補的な配列F1’〜Fn’と、各F1’〜Fn’に連結された標
識物質を備えたプローブA1〜Anを含む第一のプローブ群
と、 前記標的核酸N1〜Nn中の第二の部分配列S1〜Snに相補的
な配列S1’〜Sn’と、各S1’〜Sn’に連結されたフラッ
グ配列FL1〜FLnとを備えたプローブB1〜Bnを含む第二の
プローブ群とを準備する工程と、 b)前記第一のプローブ群と、前記第二のプローブ群と、
前記試料とを混合して、前記標的核酸N1〜Nn中の前記第
一の部分配列F1〜Fnに前記プローブA1〜Anをハイブリダ
イズさせるとともに、前記第二の部分配列S1〜Snに前記
プローブB1〜Bnをハイブリダイズさせる工程と、 c) 前記標的核酸N1〜Nnにハイブリダイズした前記プロ
ーブA1〜Anと前記プローブB1〜Bnをライゲートして、プ
ローブ(A1+B1)〜(An+Bn)を作出する工程と、 d) 前記フラッグ配列FL1〜Flnを該配列と相補的な配列
FL1’〜FLn’にハイブリダイズさせることにより、前記
プローブ(A1+B1)〜(An+Bn)を回収する工程と、 e) 回収した前記プローブ(A1+B1)〜(An+Bn)中の前記
標識物質を検出又は定量することにより、前記試料中の
標的核酸N1〜Nnを検出又は定量する工程と、を具備する
方法。1. A target nucleic acid N1 in a sample having a predetermined sequence
To Nn (n is an integer of 2 or more), comprising: a) sequences F1 ′ to Fn ′ that are complementary to the first partial sequences F1 to Fn in the target nucleic acids N1 to Nn; A first probe group including probes A1 to An having a labeling substance linked to each of F1 'to Fn', and a sequence S1 complementary to second partial sequences S1 to Sn in the target nucleic acids N1 to Nn. Preparing a second probe group including probes B1 to Bn having '~ Sn' and a flag sequence FL1 to FLn connected to each of S1 'to Sn', b) the first probe Group, the second probe group,
By mixing the sample, the probes A1 to An are hybridized to the first partial sequences F1 to Fn in the target nucleic acids N1 to Nn, and the probe B1 is hybridized to the second partial sequences S1 to Sn. And Bn hybridizing, c) ligating the probes A1 to An and the probes B1 to Bn hybridized to the target nucleic acids N1 to Nn, the probes (A1 + B1) to (An + Bn) And d) a sequence complementary to said flag sequence FL1-Fln.
Recovering the probes (A1 + B1) to (An + Bn) by hybridizing to FL1 ′ to FLn ′, and e) removing the labeled substance in the collected probes (A1 + B1) to (An + Bn). Detecting or quantifying the target nucleic acids N1 to Nn in the sample by detection or quantification.
さらに、プローブ(A1+B1)〜(An+Bn)と前記標的核酸分
子からなるハイブリッドを変性させる工程を具備するこ
とを特徴とする方法。2. After step c) of the method according to claim 1,
The method further comprises a step of denaturing a hybrid consisting of probes (A1 + B1) to (An + Bn) and the target nucleic acid molecule.
備えていることと、 ステップd)の後に、タグ配列を該配列と相補的な配列に
ハイブリダイズさせることにより、前記プローブ(A1+B
1)〜(An+Bn)を回収する工程を具備していることを特徴
とする方法。3. The method according to claim 1, wherein at least one of the probes A1 to An has a tag sequence, and after step d), complements the tag sequence with the sequence. By hybridizing to the specific sequence, the probe (A1 + B
1) A method comprising a step of recovering (An + Bn).
であって、前記フラッグ配列の相補的配列が固相担体に
固相化された核酸分離装置を用いて、前記プローブ(A1+
An)〜(An+Bn)の回収を行うことを特徴とする方法。4. The method according to claim 1, wherein a sequence complementary to the flag sequence is immobilized on a solid support, and the probe ( A1 +
A method characterized by recovering (An) to (An + Bn).
あって、前記固相担体が基板、粒子、管、繊維からなる
群から選択されることを特徴とする方法。5. The method according to claim 1, wherein the solid support is selected from the group consisting of a substrate, a particle, a tube, and a fiber.
であって、前記第一の部分配列F1〜Fnと、各F1〜Fnに対
応する前記第二の部分配列S1〜Snが隣接していることを
特徴とする方法。6. The method according to claim 1, wherein the first partial sequences F1 to Fn and the second partial sequences S1 to Sn corresponding to each of the F1 to Fn. Are adjacent.
であって、前記プローブA1〜Anと、A1〜Anに対応する前
記プローブB1〜Bnのライゲートが、リガーゼによって行
われることを特徴とする方法。7. The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the probes A1 to An and the probes B1 to Bn corresponding to A1 to An are ligated by ligase. A method characterized by the following.
ゼによるライゲートの前に、PCRによって前記プローブA
1〜Anと前記プローブB1〜Bnを伸長せしめる操作を行う
ことを特徴とする方法。8. The method of claim 7, wherein the probe A is ligated by ligase prior to ligating the probe A by PCR.
A method comprising performing an operation to extend 1 to An and the probes B1 to Bn.
であって、前記標的物質が蛍光物質、発光物質、色素、
及び放射性同位元素からなる群から選択されることを特
徴とする方法。9. The method according to any one of claims 1 to 8, wherein the target substance is a fluorescent substance, a luminescent substance, a dye,
And radioactive isotopes.
Priority Applications (1)
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---|---|---|---|
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