JP2000512502A - Genes that confer disease resistance on plants and their use - Google Patents

Genes that confer disease resistance on plants and their use

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アール． ジョンソン，ジェイ
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マーレイ エリス，ダニエル
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ノバルティス アクチェンゲゼルシャフト
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Abstract

(57)【要約】 本発明はSAR経路の重要成分であり、且つ化学及び生物学的誘導剤と一緒になって植物にSAR遺伝子発現及び広域病気耐性を誘導する遺伝子(NIM１と命名)の位置及び特性を考慮する。本発明は更にNIM１遺伝子で形質転換された植物、並びに当該遺伝子を遺伝子導入植物を構築するために採用する方法及び植物において広域病気耐性を誘導することのできる化合物についてのスクリーニングアッセイにおいて当該遺伝子を採用する方法を考慮する。   (57) [Summary] The present invention takes into account the location and properties of a gene (designated NIM1) that is a key component of the SAR pathway and, in conjunction with chemical and biological inducers, induces SAR gene expression and broad-spectrum disease resistance in plants. The present invention further provides a plant transformed with the NIM1 gene, a method for employing the gene for constructing a transgenic plant, and a screening assay for a compound capable of inducing broad-range disease resistance in the plant. Consider how to do it.

Description

【発明の詳細な説明】 植物に病気耐性を授ける遺伝子及びその利用 本発明は植物における病気耐性並びに植物の病気耐性を同定する及び植物に病 気耐性を授けることに関する。より詳しくは、本発明は植物における広域な病気 的性に関与する遺伝子の同定、単離及び特性決定に関する。 植物は常にウィルス、細菌、真菌及び線虫類等の多種多様な病原生物により攻 撃されている。作物植物は極めて傷つき易く、なぜならそれらは通常遺伝子的に 均質な単栽培物として成長するからである；病気に冒されると、その損失は著し いものとなりうる。 しかしながら、ほとんどの植物は病原生物に対するそれ自体の先天的な防御機 構をもっている。植物病原体に対する抵抗の自然な変異は植物繁殖者及び病理学 的により同定され、そして数多くの作物植物に供与されている。このような自然 な病気耐性遺伝子は往々にして病原体に対する高レベルな耐性又は免疫力を供与 する。 多くの植物種において、壊死病原体による一次接種は植物をその後の感染に対 して免疫化しうる。この後天的な病気耐性は1901年に最初に発表され、そして自 然における植物の保存において重要な役割を果たしているものと考えられた。植 物の免疫力の極めてよく特定された例はタバコ、アラビドプシス（Arabidopsis ）及びキュウリの如き植物における全身後天的耐性（SAR）及び誘導耐性の表現 型である。これらの系においては、壊死病原体による接種はその病原体による並 びにその他の幾多の農業的に重要な細菌、真菌及びウィルス病原体による二次的 な感染に対する全身防御をもたらす。 全身後天的耐性は化学的免疫化合物、即ち植物において免疫応答 を誘導する一定の化学物質によって誘引されうる。かかる化合物は天然起源のも の、例えばサリチル酸（SA）又は合成化学物質、例えば２，６−ジクロロイソニ コチン酸(INA)及びベンゾ（１，２，３）チアジアゾル−７−カルボチオン酸Ｓ −メチルエステル(BTH)でありうる。病原体又は免疫化合物による処置は、最も よく特性決定された種であるタバコにおいて少なくとも９組の遺伝子の発現を誘 導する。多種多様な遺伝子がその他の植物において発現されうる。免疫化合物に より誘導されたSAR関連遺伝子の誘導レベルはバックグランドの10,000倍ほどの 高さである。特に、SARは病原関連（PR）遺伝子等のSAR遺伝子の発現を特徴とす る。 SAR遺伝子は病原体による感染の後に誘導される。これらの遺伝子の一部は植 物に全身後天的耐性を供与するのに役割を果たしている。これらの植物のタンパ ク質はウィルス、細菌及び真菌等の様々な病原体による感染に応答して大量に誘 導される。PRタンパク質はタバコモザイクウィルス(TMV)による感染に敏感に反 応するタバコ植物（ニコチアナ・タバキュム(Nicotiana tabacum)において初め て発見された。その後、PRタンパク質は数多くの植物種において見い出されてい る（Redolfiら（1983）Neth J Plant Pathol 89：２45-254；Van Loon（1985）P lant Mol ．Biol ．４：111-116；及びUknesら（1992）Plant Cell ４：645-656参 照のこと）。かかるタンパク質は病原体による感染に対する植物の共通の防御的 全身応答であると信じられている。 病原関連タンパク質には、限定することなく、SAR8.2ａ及びSAR8.2ｂタンパク 質、酸性及び塩基性形態のタバコPR−Ｉａ，PR−Ｉｂ及びPR−Ｉｃ；PR−１’， PR−２，PR−２’，PR−２''，PR−Ｎ，PR−Ｏ，PR−Ｏ’，PR−４，PR−Ｐ，PR −Ｑ，PR−Ｓ及びPR−Ｒ主要タンパク質；キュウリペルオキシダーゼ；塩基性キ ュウリペルオ キシダーゼ；PR−Ｐ又はPR−Ｑの塩基性対応部であるキチナーゼ；PR−２，PR− Ｎ又はPR−Ｏの塩基性対応部であるベーター１，３−グルカナーゼ（グルカンエ ンド−１，３−ベーターグルコシダーゼEC３．２．１．39）；並びにキュウリ由 来の病原誘導性キチナーゼが挙げられる。かかるPRタンパク質は例えばUknesら （1992）The Plant Cell ４：645-656及びその中の引用文献に開示されている。 SAR又はSAR様遺伝子は全身後天的耐性を示す全ての植物種において発現される 。かかる遺伝子の発現は既知のSAR DNA配列によるプローブングによって決定で きうる。例えば、Lawtonら（1992）Proceedings of the Second European Feder ation of Plant Pathology（1983）：Mechanisms of Defence Responses in Pla nts ；B．Fritig and M．Legrand（編）、Kluwer Academic Publishers，Dordrec ht，pp．410-420；Uknesら（1992）The Plant Cell ４：645-656；及びWardら（ 1991）The Plant Cell ３：1085-1094を参照のこと。ハイブリダイゼーション及 びクローニングの方法は当業界において周知である。例えばMolecular Cloning ，A Laboratory Manual 、第２版、Vol．1-3，Sambrookら（編）Cold Spring Har bor Labor atory Press(1989)及びその中の引用文献を参照のこと。 他方、かかるSAR又はSAR様遺伝子はタンパク質スクリーニング、＋／−スクリ ーニング等のその他の方法によって見い出せうる。例えばLiang and Pardee（19 92）Science 257：967-971；及びSt．John and Davis（1979）Cell 16：443参照 のこと。 幾多の研究並びに精巧且つ多労な作物保護手段、例えば植物の遺伝子的形質転 換等の利用にもかかわらず、病気による損害は年間１00億ドルであり続けている 。病気耐性遺伝子は今までにクローニングされているが、このような遺伝子によ り形質転換された遺伝子導入植物は典型的には特定の病原体種の一定の株に対す る耐性のみと なっている。SARに関与する遺伝子のクローニングの努力にもかかわらず、広域 な病気耐性を制御する遺伝子は単離及び特性決定されていない。 いくつかの系統立った証拠は内因性的に生産されたSAが、病原体感染の認識を SARの発症に結びつけるシグナル伝達経路に関与していることを示唆している。 病原体に応答してSAを蓄積する能力を保持しているが、SAR遺伝子を誘導する能 力又はSAもしくはINAの適用後の耐性を失っている突然変異体がDelaneyらProc ． Natl．Acad．Sci ．92：6602-6606(1995)及び内容を引用することで本明細書に組 入れるWO94/16077に記載されている。 これらの突然変異体は、野生形態においてはSAR遺伝子発現及びSAR自体を制御 する遺伝子を含むことがこの度発見された。本発明は当該突然変異遺伝子が突然 変異植物に対して広域な病気感受性を授け、そしてそれらを病原体及び化学誘導 剤に対して非誘導性にすることを認識した。 本発明は野生型（NIM１）遺伝子の同定、単離及び特性決定に関連し、その遺 伝子は生物及び化学誘導剤に対して応答性な植物におけるSAR又はSAR遺伝子発現 の活性化を及ぼす。 突然変異アラビドプシス植物において突然変異遺伝子が同定された。これらの 植物は、それらが全身後天的耐性（SAR）に関連する遺伝子を発現せず、またSAR を発現できない点で病原体感染に対するその正常な応答において無能であること が見い出されている。これらの突然変異体はラベル化nim１（非誘導性免疫力の ため）である欠陥遺伝子を含む。 本発明は更に広域な病気耐性を有する遺伝子導入植物を構築するためのクロー ニングしたNIM１遺伝子及びその変異体の利用並びにそれらにより生産された遺 伝子導入植物に関連する。本発明は更に 植物において広域な病気耐性を誘導することのできる化合物を同定するためのス クリーニング方法におけるクローニングしたNIM１遺伝子及びその変異体の利用 を考慮する。 図面の簡単な説明 図１は野生型及びnim１遺伝子におけるPR遺伝子発現の誘導に対する化学誘導 剤の効果を示す。 図２は感染の開始から６日間にわたる病原体感染Ws−０及びnim1植物における PR-１遺伝子発現を示す。 図３はＰ．シリンゲ（P.syringae）で感染させたWs−０及びnim1植物における SA蓄積レベルを示す。 図４はAFLP及びSSLP分析により決定されたNIM１領域の遺伝子地図を示す。 図５はYACクローン分析により決定されたNIM１領域の物理地図を示す。 図６は伸長Ｐ１／BACコンティグ（contig）の物理地図を示す。 図７は隣接AFLPマーカー及びYACとの関連におけるＰ１及びBACクローンの位置 を記載した物理地図を示す。 図８はNIM１遺伝子を含む更に伸長させたＰ１／BACコンティグの物理地図を示 す。 図９はNIM１領域の総合的な遺伝子及び物理詳細地図を示す。 図10はNIM１領域の総合地図を示す。 図11は新たなAFLPマーカーを含むNIM１領域の総合地図を示す。 図12は組換Ｄ169及びＣ105の模式図である。 図13はNIM１領域におけるBAC，YAC及びコスミドを含む組換体を表示した、NIM １を中心とする染色体領域の全体地図である。 図14はNIM１遺伝子を含むクローンBAC−04の9.9kbの領域の配 列を示す。 図15は様々な対立遺伝子における変化を含むNIM１遺伝子の核酸配列及びNIM１ 遺伝子生成物のアミノ酸配列を示す。 図16はnim１の野生型及び突然変異対立形質（アレル）におけるINA，BTH，SA 及び病原体により誘導されたNIM１の発現を示す。 図17はnim１突然変異体及び野生型植物におけるPR−１の発現を示す。 図18は様々なnim１突然変異体の病気耐性を示す。 図19はNIM１タンパク質及び４種のコメ遺伝子配列のcDNAタンパク質生成物の 発現配列Tag領域のアミノ酸配列対比である（SEQ IDNO：３を参照のこと）。定 義 AA ：アミノ酸 AFLP：増幅したフラグメント長多形体 avrRpt２：シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）から単離した 非ビルレント遺伝子Rpt２ BAC ：細菌性人工染色体 BTH ：ベンゾ（１，２，３）チアジアゾル−７−カルボチオン酸Ｓ−メチルエ ステル Col ：アラビドプシス・エコタイプ・コロンビア （Arabidopsis ecotype Columbia） ECs ：酵素の組合せ INA ：２，６−ジクロロイソニコチン酸 Ler ：アラビドプシス・エコタイプ・ランズバーグ・エレクタ （Arabidopsis ecotype Landsberg erecta） NIM1：植物に病気耐性を授ける野生型遺伝子 nim ：植物に病気感受性を授けるNIM１の突然変異対立形質 nim1：突然変異植物系 ORF ：オープンリーディングフレーム PCs ：プライマーの組合せ SA ：サリチル酸 SAR ：全身後天的耐性 SSLP：単純配列長多形体 Ws−０：アラビドプシス・エコタイプ・ワッシルウスキジャ （Arapidosis ecotype Wassilewskija） YAC ：酵母人工染色体 NIM１遺伝子はマッピング及び歩行技術によりクローニングされ、それらは この遺伝子が〜105kb領域に含まれていることを示した（図13及び表16参照）。 この領域は左側のＬ84.６ｂマーカー及び右側のＬ84.T2マーカーにより描かれて いる。この105kb領域由来の野生型DNAから作った３種の重複コスミドのみがnim １突然変異表現型を補完した（図13及び表16）。これら３種のコスミドは図13に 示すコスミドクローンＤ７の左端及びコスミドＤ５の右端により規定される9.9k bの領域においてのみ重複する。この105kb領域のその他の領域に対して設けられ た幾多のその他のコスミドはnim１表現型を補完しなかった（図13及び表16）。N IM１遺伝子に対するほぼ全長のcDNAクローンは適当なイントロン−エキツン境界 を示唆し、且つ遺伝子生成物のアミノ酸配列を規定する。9.9kbの相補性領域内 のNIM１遺伝子領域のみが様々なnim１突然変異対立形質において配列変異を有し ていた（表18）。３種のその他の潜在的な遺伝子領域はnim１表現型に関連する 配列変化を示さなかった。NIM１遺伝子領域において見い出された配列変化は遺 伝子生成物の機能の改変又は損失と一致した。特定の突然変異対立形質における NIM1遺伝子領域に対する変化の程度はnim１対立形質の観察された生理 学的な程度と大まかに相関していた。NIM１領域のみが検出可能なRNA（転写）を 有し、そしてこのRNAは病原におけるNIM１の生理学的な役割と一致する豊富な変 化を示した（表18及び図16）。 本発明は単離された遺伝子フラグメントNIM１遺伝子に関連し、これは植物に おける全身後天的耐性(SAR)経路の重要な成分である。NIM１遺伝子は化学及び生 物学的誘導剤によるSARの活性化に関係し、そしてかかる誘導剤と一緒に、SAR及 びSAR遺伝子発現のために必要である。 NIM遺伝子の位置は突然変異nim１遺伝子を担持することで知られる突然変異植 物のゲノムの分子生物学的分析により決定され、ここで当該突然変異nim１遺伝 子は宿主植物を多種多様な病原体に対して著しく感受性にし、そして病原体及び SARの化学誘導剤に対して応答できなくしてしまうものである。 nim１突然変異体は宿主植物の病原体の幾多の株及び病原タイプ並びに通常 は宿主植物には感染しないが、その他の宿主には感染する病原体に対して感受性 であるという点で「万能病気感受性」（UDS）植物として有用である。これらは 種子又はその他の生物学的材料を突然変異誘発剤で処理し、次いで子孫植物を全 身後天的応答の既知の化学誘導剤(例えばINA)で処理することによりUDS表現型に ついての子孫植物を選別し、それからその植物を既知の病原体で感染させること により作り上げることができる。非誘導性突然変異体はこのような環境下で重篤 な病気症状を発症し、一方非突然変異体は化学化合物により全身後天的耐性へと 誘導される。nim突然変異体は化学及び照射突然変異誘発により作られた突然変 異集団並びにＴ−DNA挿入及びトランスポゾン誘導突然変異誘発により作られた 突然変異集団からも同様に選択されうる。 突然変異植物系を作るための技術は当業界において公知である。 nim植物表現型は植物における広域な病気耐性の発現を可能にする単離された遺 伝子フラグメントを同定するための道具として利用される。 本発明はnim１遺伝子であるNIM１遺伝子の突然変異遺伝子を含んで成る単離さ れたDNA分子を含んで成る。 SAR遺伝子の構成的発現のために必要な野生型NIM１遺伝子を単離するためのni m１突然変異体又は植物の利用に従い、耐性的特徴を、生産及び品質に重要なそ の他の特徴と組合せて、繁殖を通じて植物系の中に組入れることができる。例え ば、Welsh J．R.，Fundamentals of Plant Genetics and Breeding，John Wiley & Sons，NY（1981）；Crop Breeding，Wood D．R．（Ed.）American Society o f Agronomy Madison，Wisconsin（1983）；Mayo O.，The Theory of Plant Bree ding 、第２版、Clarendon Press，Oxford（1987）；Singh，D．P.，Breeding fo r Resistance to Diseases and Insect Pests ，Springer-Verlag，NY（1986）； 及びWricke and Weber,Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding ，Walter de Gruyter and Co.，Berlin(1986)を参照のこと。 本発明の更なる目的は本発明に係るNIM１遺伝子生成物及びその変異体のアミ ノ酸配列をコードする異種DNA分子に作用可能式に連結された植物において活性 なプロモーターを含んで成るキメラ遺伝子である。 植物発現カセットの構築及び植物への外来DNAの導入のための方法論は当業界 において一般に発表されている。一般に、植物への外来DNAの導入については、 外来DNAの輸送のためにTiプラスミドベクターが利用されている。かかる輸送の ために更に利用されているのは直接DNA取込み、リポソーム、エレクトロポレー ション、マイクロインジェクション及びマイクロプロジェクチルである。かかる 方法は当業界において公開されている。例えば、Bilangら（1991）Gene 100：24 7-250；Scheidら（1991）Mol ．Gen．Genet．228：104-112；Guercheら（1987） Plant Science 52：111-116；Neuhauseら（1987）Theor ．Appl．Genet．75：30- 36；Kleinら（1987）Nature 327：70-73；Howellら（1980）Science 208：1265 ；Horschら（1985）Science 227：1229-1231；DeBlockら（1989）Plant Physiol ogy 91：694-701；Methods for Plant Molecular Biology（Weissbach and Weis sbach，eds.）Academic Press，Inc．(1988)及びMethods in Plant Molecular B iology （Schuler and Zielinski、編）Academic Press，Inc．(1989)を参照のこ と。また、内容を引用することで本明細書に組入れる米国特許出願第08/438,666 号、1995年５月10日出願及びWO93/07278号を参照のこと。形質転換の方法は形質 転換すべき植物細胞に依存するであろうことが理解される。 更に、発現カセットの成分は発現性を高めるために改質を施されうることが認 識されている。例えば、トランケーション配列、ヌクレオチド置換又はその他の 改質が採用されうる。かかる改質発現系により形質転換された植物細胞はかくし てSARの活性化のために必要なSAR遺伝子の過剰発現又は構成的発現を示すであろ う。 SAR遺伝子発現の誘導を及ぼすことにより植物に病気耐性を授けるDNA分子又は 遺伝子フラグメントは慣用の組換DNA技術を利用して植物又は細菌細胞の中に組 込むことができる。一般に、これはDNA分子がそれに対して異種である（即ち、 通常は存在していない）発現系の中にDNA分子を挿入することを包括する。この 異種DNA分子は適正な配向及び適正なリーディングフレーム内で発現系又はベク ターの中に挿入する。このベクターは挿入したタンパク質コード配列の転写及び 翻訳のための必須要素を含む。当業界において公知 の数多くのベクター系、例えばプラスミド、バクテリオファージウィルス及びそ の他の改質ウィルスが利用されうる。適当なベクターには、限定することなく、 ウィルスベクター、例えばラムダベクター系Igtll，Igt10及びシャロン４；プラ スミドベクター、例えばpBI121，pBR322，pACYC177，pACYC184，pARシリーズ、p KK223-3，pUC8，pUC9，pUC18，pUC19，pLG339，pRK290，pKC37，pKC101，pCDNAI I；及びその他の類似の系である。DNA配列はManiatisら、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual ，Cold Spring Laboratory，Cold Spring Harbor，New York (1982)に記載の如き当業界における標準的なクローニング手順を利用してベクタ ーの中にクローニングすることができる。 本発明の更なる目的は本発明に係るキメラ遺伝子を含んで成る組換べクターで ある。 本発明の遺伝子又は遺伝子フラグメントの効率的な発現を得るため、プロモー ターは発現ベクターの中に存在していなければならない。RNAポリメラーゼは通 常プロモーターに結合し、そして遺伝子の転写を開始させる。プロモーターはそ の強度、即ち転写を促進する能力において異なる。利用する宿主細胞系に依存し て、幾多の適当なプロモーターの任意のものを使用してよい。適当なプロモータ ーにはユビキノン、nosプロモーター、小サブユニットリブロースビスホスフェ ートカルボキシラーゼ遺伝子プロモーター、小サブユニットクロロフィルＡ／Ｂ 結合性ポリペプチドプロモーター、カリフラワーモザイクウィルスの35Ｓプロモ ーター、及び植物遺伝子から単離したプロモーターが挙げられる。この小サブユ ニット材料を開示するC．E．Vallejos、ら「Localization in the Tomato Genom e of DNA Restriction Fragments Containing Sequences Homologous to the RR NA(45S)，the major chlorophyll A/BBinding Poly peptide and the Ribulose Bisphosphate Carboxylase Genes,」Genetics 112： 93-105(1986)を参照のこと。nosプロモーター及びカリフラワーモザイクウィル ス35Ｓプロモーターは当業界において公知である。 本発明の病気耐性遺伝子が発現系の中にクローニングできたら、それは植物細 胞の中に容易に形質転換できる。形質転換のために適当な植物組織には葉組織、 根組織及びプロトプラストが挙げられる。 アグロバクテリア(Agrobacterium)属由来の細菌が植物細胞の形質転換のため に利用できうる。かかる細菌の適当な種にはアグロバクテリア・トゥメファシエ ンス（A．tumefaciens）及びアグロバクテリア・リゾゲンス（A．rhizogens）が 挙げられる。アグロバクテリア・トゥメファシエンス（例えば、LBA 4404又はEH A 105株）は植物を形質転換するその周知の能力により極めて有用である。 遺伝子で植物細胞を形質転換するその他のアプローチには不活性又は生物学的 に活性な粒子を植物組織及び細胞に噴射することを包括する。この技術は全てSa nfordらの米国特許第4,945,050；5,036,006；及び5,100,792号に開示されている 。一般に、この手順は不活性又は生物学的に活性な粒子を細胞に対し、細胞の外 層に浸透し且つ細胞の内部に組込まれるのに効率的な条件下で噴射することを含 む。不活性粒子を利用する場合、ベクターは細胞の中に、その粒子を所望の遺伝 子を含むベクターでコーティングすることにより導入できうる。他方、この標的 細胞をベクターで被覆し、これによりベクターが粒子の足跡を介してベクターが 細胞の中に運び込まれるようにすることができる。生物学的に活性な粒子（例え ば乾燥酵母細胞、乾燥細菌又はバクテリオファージはそれぞれ導入すべきDNAを 含む）も植物細胞組織の中に噴射することができる。 本発明の単離された遺伝子フラグメントは多種多様な植物細胞、例えば裸子植 物、単子葉植物及び双子葉植物に対して病気耐性を授けるために利用できうる。 当該遺伝子はこのような広いクラスに属する任意の植物細胞の中に挿入すること ができるが、これは作物植物細胞、例えばコメ、コムギ、オオムギ、ライムギ、 トウモロコシ、ポテト、ニンジン、サツマイモ、テンサイ、インゲン豆属の実（ bean）、エンドウマメ、チコリ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリ 、ターニップ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、 ナス、コショウ、セロリー、ニンジン、スカッシュ、カボチャ、ズッキーニ、キ ュウリ、リンゴ、ナシ、クインス、メロン、プラム、チェリー、モモ、ネクタリ ン、アプリコット、イチゴ、グレープ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナッ プル、アボガド、パパイヤ、マンゴ、バナナ、ダイズ、タバコ、トマト、モロコ シ及びサトウキビにおいて極めて有用である。 本発明の発現系は適当な条件下で事実上全ての作物植物を形質転換するのに利 用できうる。形質転換細胞は完全植物へと、その遺伝子が不完全な遺伝子導入植 物に対して病気耐性を授けるようにして、再生することができる。前述の通り、 この発現系は病気耐性遺伝子が連続的又は構成的に発現されるように改質させる ことができる。 形質転換 当該系は形質転換及び再生できうる任意の植物において利用できる。形質転換 及び再生のためのかかる方法は当業界において公知である。上述の引用文献と同 様に、An，G．Watson，B．D.，and Chiang，C．C．Transformation of 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tabacina）；細菌、例えばシュードモナス・シリン ゲ及びシュードモナス・タバチ(P．tabaci)、昆虫、例えばアブラムシ、例えば マイズス・ペルシカエ（Myzus persicae）；及び鱗翅類、例えばヘリオスス(He1 iothus)種；及び線虫類、例えばメロイドジン・インコグニタ(Meloidogyne inco gnita)が挙げられる。本発明の方法はトウモロコシの数多くの病気生物、例えば 限定することなく、線毛ウドン粉病原体、例えばスクレロプソラ・マクロスポラ (Scleropthora macrospora)、スクレロプソラ・レイシア（S．rayissiae）、ス クレロスプラ・グラミニコラ（Sclerospora graminicola)、ペロノスクレロスポ ラ・ソーギ（Peronosclerospora sorghi）、ペロノスクレロスポラ・フィリピネ ンシス（P．philippinensis)、ペロノスクレロスポラ・サッカリ(P．sacchari) 及びペロノスクレロスポリス・メイディス(P．maydis)；さび病原体、例えばプ ッシニア・ソルフィ(Puccinia sorphi)、プッシニア・ポリソラ(P．polysora)及 びフィソペラ・ゼア(Physopella z eae)；その他の真菌類、例えばセルコスポラ・ゼア−メイディス（Cercospora z eae-maydis）、コレトトリカム・グラミニコラ（Colletotrichum graminicola） 、フサリウム・モノリフォルメ（Fusarium monoliforme）、ジッベレラ・ゼア(G ibberella zeae)、エキセロヒルム・ターチカム（Exserohilum turcicam）、カ バチエル・ゼア(Kabatiellu zeae)及びビポラリス・メイディス（Bioplaris may dis）；及び細菌、例えばアーウィニア・スチュワルチイ（Erwinia stewartii) 、に対して有用である。配列表の説明 SEQ ID NO：１−図14の9919bpゲノム配列 SEQ ID NO：２−図15の5655bpゲノム配列 SEQ ID NO：３−SEQ ID NO：２のcdsによりコードされる野生 型 NIMタンパク質のAA配列 SEQ ID NO：４−図19のコメ−１AA配列33−155 SEQ ID NO：５−図19のコメ−１AA配列215−328 SEQ ID NO：６−図19のコメ−２AA配列33−155 SEQ ID NO：７−図19のコメ−２AA配列208−288 SEQ ID NO：８−図19のコメ−３AA配列33−155 SEQ ID NO：９−図19のコメ−３AA配列208−288 SEQ ID NO：10−図19のコメ−４AA配列33−155 SEQ ID NO：11−図19のコメ−４AA配列215−271寄託物 以下のベクター分子はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション12301 Parklawn Drive Rockville，MD 20852米国に下記の日付で寄託してある： プラスミドBAC−04はATCCに1996年５月８日、ATCC 97543として寄託。 プラスミドＰ１−18はATCCに1996年７月13日、ATCC 97606として寄託。 コスミドＤ７はATCCに1996年９月25日、ATCC 97736として寄託。実施例 実施例１ 地図ベースクローニングによるNIMクローンの同定。アラビドプシスにおけるN IM１の高解像度遺伝子マッピング及び物理マッピング。 １．植物材料及びnim１突然変異体の単離 nim１突然変異体はDelaneyら（1995）PNAS 92，6602-6606に記載の通り、２ つのアラビドプシス・エコタイプWs−０植物集団から単離した。一方の突然変異 集団はエチルメタンスルホネート(EMS)突然変異種子（Lehle，Round Rock，TXよ り購入）に由来するＭ２ライブラリーの形態にあり、そして他方はオハイオ州大 学Arabidopsis Biological Resource Center（コロンバス、OH）より入手した種 子に由来するＴ−DNA集団の形態にある。 非誘導性免疫力の(nim１)突然変異体についてのスクリーニングの基礎はビル レント病原体に対する耐性がINA(２，６ジクロロイソニコチン酸）により誘導さ れる植物についての突然変異植物集団のスクリーニングにある（Metrauxら、199 1：Advances in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interactions．Vol 1， 432-439，Hennecke and Verma、編；Kessmannら1993；Mode of action of agroc hemicals．Y．Honma編；Vernooijら1995 Molec．Pl．Microbe Interaction 8，2 28-234）。 突然変異集団由来の植物を高密度で大トレーの中で商業用のプランティングミ ックスにおいて生育させた。植物が２週令となったと き、トレーに0.25mg／mlのINAを吹き付けた。４日後、植物にペロノスポラ・パ ラシチカ単離体EmWa（EmWa）の胞子懸濁物を５×104〜１×105個の胞子／mlで吹 き付けた。この真菌は通常、これらの植物においてINA又は類似の化合物により 耐性が最初に誘導されていない限り、アラビドプシスWs−０エコタイプに対して ビルレントである。 低湿度環境内でのインキュベーション後、目に見える病的症状を有する植物が 、典型的には感染の７日後に同定された。これらの植物は、耐性誘導化学物質の 適用にもかかわらず真菌に対する耐性を示さず、従って潜在的なnim(非免疫力) 突然変異植物であった。360,000個の植物から、75個の潜在的nim突然変異体が同 定された。 これらの潜在的な突然変異植物をフラットから取り出し、低湿条件に置き、そ して結実期に入らせた。この種子由来の植物を真菌EmWaに対する感受性について と同じ方法で、ここでもINAにより前処理してからスクリーニングした。６つのn im系がかくして同定された。一つの系(min１）はＴ−DNA集団から、そして５つ の系がEMS集団から単離された。 ２．INA及びその他の病気耐性の化学誘導剤に対する植物応答の評価 ｉ nim１の表現型分析 サリチル酸（SA）及びベンゾ（１，２，３）チアジアゾル−７−カルボチオ酸 Ｓ−メチルエステル(BTH)はINAと同様に、野生型植物において広域な病気耐性、 いわゆる全身後天的耐性(SAR)を誘導する二種類の化学物質である。INAはnim１ 植物において耐性を誘導しないため、これらの植物をSA及びBTHにより前処理し てからその病気耐性応答についても評価した。 植物に、１，５もしくは15mMのSA又は0.25mg／mlのBTHを吹き付 け、そして５日後にEmWaを負荷接種した（上述の実施例１に記載の通り）。SA及 びBTHは共に、これらの植物上での病気症状の存在及び真菌増殖により明らかな 通り、nim１植物を真菌感染から守ることができなかった。即ち、nim１植物はど のSAR誘導化学物質に対しても応答性でなく、突然変異が耐性誘導経路における これらの化学物質の導入点よりも下流にあることを意味する。 nim１を２種類の非適合性Ｐ．パラシチカ単離物Wela及びNoco（即ち、これ らの真菌株は野生型Ws−０植物に病気を及ぼさない）による感染に対するその病 気応答についても評価した。nim１植物にWela又はNocoの５〜10×104個の胞子／ mlの分生子懸濁物を吹き付け、そして７日間高湿のもとでインキュベーションし た。野生型植物とは異なり、nim１植物はWela及びNoco感染の双方に応答して病 的症状を示した。これらの症状は壊死的な斑点形成及びつる形成であり、多少の 胞子形成が伴った。ラクトフェノールブルー染色の後、真菌の菌糸がnim１植物 の葉に容易に認められるようになった。即ち、nim１植物は通常非適合性である Ｐ．パラシチカ単離物に対して感受性である。この結果は、nim１植物が化学的 に誘導される病気耐性において無能となっているのみならず、通常は非病原性で ある微生物に対する天然の耐性においても無能となっていることを示す。 ii． nim１の生化学分析 SA，INA及びBTHはSAR、並びにアラビドプシスにおける病原関連遺伝子PR−１ ，PR−２及びPR−５等のSAR遺伝子の発現を誘導する。これらの化合物はnim１に おける病気耐性を誘導しないため（上記実施例１，２に記載）、この突然変異系 をSA，INA又はBTHで処理してからSAR遺伝子発現について分析した。 nim１植物をSA，INA又はBTHで処理した後、植物組織を回収し 、そしてPR−１，PR−２及びPR−５遺伝子由来のRNAの蓄積について分析した。 従って、全RNAを処理組織から単離し、そしてアガロースゲル上で電気泳動させ た。三重ゲルブロットを用意し、そしてそれぞれをDelaneyら、1995，PNAS 92， 6602-6606に記載の通りにして３種のSAR遺伝子のいづれかについてのプローブと ハイブリダイズさせた。野生型植物の場合と異なり、これらの化学物質は図１に 示す通り、nim１植物におけるこれら３種のSAR遺伝子のいづれからもRNA蓄積を 誘導しなかった。まとめると、これらの結果はこれらの化学物質がnim１植物に おいてSARもSAR遺伝子発現も誘導しないことを示唆する。 これらの化学物質がnim１植物においてSARもSAR遺伝子発現も誘導しないため 、病原体感染が野生型植物におけるようにこれらの植物においてもSAR遺伝子発 現を誘導しうるかを調べることは注目すべきである。Ws−０及びnim１植物に上 述の通りにEmWa胞子を吹き付け、そして組織をいくつかの時点でRNA分析のため に集めた。野生型Ws−０植物の病原体感染（EmWa）は感染させて４日以内に図２ に示すようにPR−１遺伝子発現を誘導した。しかしながら、nim１植物において は、PR−１遺伝子発現は感染６日後まで誘導されず、そしてそのレベルはその時 点での野生型と比べて低かった。即ち、病原体感染を経て、nim１植物におけるP R−１遺伝子発現は野生型と比べて遅く、且つ低くなった。 壊死的な反応を及ぼす病原体による野生型植物の感染は感染組織におけるSAの 蓄積をもたらす。この内因性SAはSAR経路におけるシグナル伝達のために必要で あることが示され、即ち内因性SAの抑制は病気耐性の抑制をもたらす。これはSA R経路におけるマーカーとしてのSA蓄積を規定する（Gaffneyら、1993，Science 261 ，754-756）。 nim１植物を、病原体感染してからのSAを蓄積するその能力について試験し た。avrRpt２遺伝子を担持しているシュードモナス・シリンゲトマト株DC 3000 を４週目のnim１植物の葉に注入した。これらの葉はDelaneyら1995，PNAS 92，6 602-6606に記載のSA分析のために２日後に回収した。この分析は、nim１植物が 図３に示すように感染葉において高レベルのSAを蓄積することを示した。未感染 葉もSAを蓄積するが、感染葉ほどのレベルではなく、野生型アラビドプシスにお いて観察されるものと似ていた。このことは、nim突然変異がシグナル伝達経路 においてSAマーカーの下流に位置することを示唆する。このことは予測され、な ぜならINA及びBTH（min１植物において不活性）はSAの下流のSAR経路における成 分を刺激することがわかっているからである（Vernooijら、1995，Molec ．Pl．M icrobe Interaction 8 ，228-234；Friedrichら1996 The Plant Journal印刷中、 及びLawtonら1996 The Plant Journal印刷中）。 更に、実施例１．２に記載の通り、外的適用したSAはnim１をEmWa感染から守ら なかった。 ３．nim１の遺伝子分析 nim１植物を野生型Ws−０植物と戻し交配させ、そしてFI子孫を上述の実施 例１．１に記載の通りにINA前処理してからEmWaに対する耐性について試験した 。どのINA前処理したFI植物も感染症状を有さず、一方nim１コントロール植物は 感染を示した。従って、nim１突然変異は劣性であると決定された。 Ws−０×nim１交配に由来するＦ２集団もINA前処理してからその病気耐性につ いてアッセイした。この集団のうち、約1／4（32／130植物）がINA事前吹き付け 植物のEmWa処理を経て病的症状を示し、そして3／4（98／130植物）が病気を示 さなかった。これらの結果はnim突然変異が単独の遺伝子座を特定することを示 唆し 、そしてこの突然変異の劣性特性を示すＦ１データーと一致する。 ４．NIM座におけるマーカーの同定及びその遺伝子マッピング NIM遺伝子の慣用の地図ベースクローニングのため、突然変異に遺伝子的に近 く連結したマーカーを同定した。これは２段階で成し遂げた。第一は、nim１植 物を異なるアラビドプシスゲノタイプランズバーグエレクタ(Ler)と交配させ、 そしてこの交配に由来するnim１表現型を有するＦ２植物（即ち、NIM座において ホモ接合nim／nimである植物）を同定した。これらより、DNAマーカー付近にLer ゲノタイプを有する植物を分子量分析により同定した。これらの植物は、同定基 準により、マーカーとNIM座との間での組換体である。組換頻度はマーカーとNIM 座との間の遺伝子距離を規定する。 地図ベースクローニングのための第二の予め必要なものはNIM座に遺伝子的に 非常に近いと同定されたマーカー、即ち、ごくわずかな組換を同定するマーカー である。もし遺伝子マーカーが非常に近接していると同定されたら、これらはNI M座に近いゲノムDNAクローンを単離するのに利用できる。このNIM座がクローニ ングしたDNA上に既に存在していないなら、歩行によりクローニングできる。歩 行は遺伝子の両側から始めてよい。これは注目の遺伝子に順々に近い重複クロー ンを獲得することを頼りとする。単独のDNAマーカーが例えば北端から開始する 歩行により得られ、且つそれがこのマーカーと注目の遺伝子との組換がないこと を特定せしめたなら、それはこの遺伝子に非常に近いにちがいない。しかしなが ら、もしマーカーが南端から組換を特定するなら、このマーカーの由来するクロ ーンはこの遺伝子を横断しているにちがいない。これにより注目の遺伝子はクロ ーニングできる。それはこのマーカーと、北端から最少数の組換を特定する最北 端マーカーとの間に位置するにちがい ない。 第一段階において、大量の組換体が遺伝子交配により作製される。第二段階に おいて、NIM遺伝子に近接する組換が分子量マーカーの利用により特定される。 幾多のマーカーが論文に発表されており、そして更なるマーカーを開発するため のいく通りかの方法がある。我々のアプローチはSSLP及びAFLP等のいくつかのマ ーカー系を頼りとする（下記参照）。 ｉ．遺伝子交配 SSLP及びAFLPマーカーに対するNIM遺伝子の染色体位置をマッピングするため 、nim１をLerと交配してマッピング集団を作製した。この交配に由来するＦ２植 物を生育させ、そしてその後のDNA抽出のために葉を回収した。次にＦ２植物を 上述の実施例１．１に記載の通りにしてnim１表現型について評価した。また、 個々のＦ２植物に由来するＦ３集団を生育し、そしてnim表現型について評価し た。DNAを発表の通り（Rogers and Bendich，1988，Plant Molecular Biology M anual，A6，1-10）CTab法によりnim１表現型Ｆ２及びＦ３植物の保存組織から抽 出した。このDNAを下記の通りにしてNIM遺伝子のマッピングのために利用した。 ii．単純配列長多形態マーカー 単純配列長多形態（SSLP）マーカーATHGENA及びngalllは発表されている（Bel l and Ecker，1994，Genomics 19，137-144）。これらのSSLPの検出のために用 いるプライマーを表１に列挙する。 マーカーATHGENEAに対するNIM遺伝子の遺伝子マッピング LerゲノムDNAのPCR 増幅のためのATHGENEA（ｉ）プライマーを利用して205塩基対（bp）バンドが予 測され、一方Ws−０ゲノムDNAでは211bpのバンドが予測される（Belland Ecker ，1994，Genomics 19，137-144）。増幅生成物は通常のアガロースゲルでは分離 が困難であることが証明されている。従って、２通りの方法をこれらのPCRフラ グメントの分離及び検出のために開発した。 第一の方法においては、プライマーセットATHGENEA（１）（表1）を６−カル ボキシローダミンラベル化UTP（dUTP−R110；AB1より入手）の存在下でゲノムDN Aを増幅するのに使用し、ローダミンラベル化PCRフラグメントを得た。PCR反応 はDNAシーケンサーで分析し、それはシングルヌクレオチド解像度でDNAフラグメ ントを検出する。 特異的な試薬は：１×PCRバッファー、２mMのMgCl2，200mMづつのdNTP，２mM のdUTP−R110，ATHGENEA（１）プライマー、0.75mM，10ngのDNA及び0.75単位のT aqポリメラーゼ、20mlの反応容量とした。増幅条件は94℃で３分、それに続く94 ℃で15秒、55℃で15秒及び72℃で30秒を35サイクルとした。これらのサンプルを 、シグナルヌクレオチド(nt.)解像度で蛍光ラベルしたDNAフラグメントを検出す ることができるABI 377 DNAシーケンサーで分析した。これは植物サンプルの遺 伝子型決定を可能にする。205ヌクレオチドのDNAフラグメントがLer DNAより得 られ、そして211ヌクレオチドのバンドがWs−０ DNAから得られた。かくして、 長さにおいて６個のヌクレオチドで相違するDNAフラグメントが簡単に区別でき 、ATHGENEA座でのホモ接合Ws−０、ホモ接合Ler及びヘテロ接合Ws−０／Lerとし てのサンプルの容易なる遺伝子型決定を可能にした。 この系の仕込量を増やすため、多重なスキームを利用した。いくつかのDNAサ ンプルはプライマーセットATHGENEA（１）により上述の通りにPCR増幅させ、一 方その他のサンプルはプライマーセットATHGENEA（２）（表２に列挙）で分析し 、各ケースにおいて６−カルボキシローダミンラベル化dUTPの存在下とした。プ ライマーセットATHGENEA（２）はATHGENEAの公開配列に基づいて作った(Simoens ら、1988，Gene 67，1-11)。このプライマーセットはLer DNA由来の139bpのDNA フラグメント及びWs−０ DNAの145bpバンドを増幅した。プライマーセットATHGE NEA（２）のための増幅反応条件は上記のプライマーセットATHGENEA（１）につ いてのそれと同じとした。 プライマーセットATHGENEA（１）を利用する単一反応物及びプライマーセット ATHGENEA（２）を利用する単一反応物をABI 377 DNAシーケンサーでの電気泳動 の前に混合した。この多重なアプローチ はシーケンサーの一本のレーンにおいて２つのサンプルの遺伝子型決定を可能に し、一方はシーケンサー上の位置145／139 nt．、そして他方は位置211／205 nt ．であった。 第二の方法においては、PCRフラグメントを蛍光色素FAM−６（６−カルボキシ フルオレセイン）（Clntegrated DNA Technologies，Inc.）でラベルしたプライ マーを利用することによりラベルした。ATHGENEA（１）及び（２）プライマーセ ットのフォワードATHGENEAプライマーは配列が同一である（表１参照）。このプ ライマーをFAM−６でラベルし、そして下記の試薬によるPCR増幅反応に利用した （Perkin Elmer）：１×XLバッファー、１mMのMgCl2，200mMづつのdNTP，0.50mM づつのプライマー（フォワードプライマーFAM−６ラベル化）、10ngのゲノムDNA 及び0.5単位のXLポリメラーゼ、20mlの反応容量。サイクル条件は94℃で３分、 それに続く94℃で15秒、59℃で15秒及び72℃で30秒の35サイクルとした。ここで も、プライマーセットATHGENEA（１）を利用する単一反応物及びプライマーセッ トATHGENEA（２）を利用する単一反応物をABI 377 DNAシーケンサーでの電気泳 動の前に混合した。この多重アプローチはシーケンサーの一本のレーンにおける ２つのサンプルの遺伝子型決定を可能にし、一方はシ位置145／139 nt．、そし て他方は位置211／205 nt．であった。 nim１表現型の由来の全てのＦ２及びＦ３サンプルを上述のATHGENEA座での その遺伝子型について評価した。この座でヘテロ接合であったサンプル全てがNI M座とATHGENEA座との組換体である植物を特定した。このようにして評価した114 4 Ｆ２ nim１表現型植物の集団及びＦ３ nim１表現型集団において、98がATHGEN EA座においてヘテロ接合性であり、このSSLP座とNIM１座との遺伝子距離を4.3cM と概算した。これはNIM１座が染色体１の上にあり、ATHGENEAマ ーカーの近くにあることを確立した。 マーカーngalllに対するNIM１遺伝子の遺伝子マッピング SSLPマーカーngalll（Bell and Ecker，1994，Genomics 19，137-144）につい てのSSLPマーカーの２組のプライマーセットをＦ２及びＦ３ nim１表現型植物並 びにコントロールWs−０及びLer植物のゲノムDNAを増幅するために用いた。プラ イマーセットngalll（１）（Bell and Ecker，1994，Genomics 19，137-144に記 載され、且つ表１に列挙）を下記の条件下で利用した：１×PCRバッファー、２m MのMgCl2，20mMづつのdNTP，0.75mMのプライマー、10ngのDNA及び0.75単位のTaq ポリメラーゼ、20mlの反応容量。プライマーセットngalll（２）（表１に列挙、 プライマーセットngalll（１）の誘導体）を異なる条件下で利用した：１×PCR バッファー、1.5mMのMgCl2，200mMづつのdNTP，１mMのプライマー、10ngのDNA及 び１単位のTaqポリメラーゼ、20mlの反応容量。双方の反応物を94℃で１分、続 いて94℃で15秒、55℃で15秒及び72℃で30秒の40サイクルでのインキュベーショ ンにより増幅させた。 サンプルを３〜５％のアガロースゲルで分析した。いづれかのプライマーセッ トによるWs−０DNAの増幅により得られるバンドは146bpであり、一方、Ler DNA の増幅は162bpのバンドを供した。ngalll座においてヘテロ接合性である植物サ ンプルはこのSSLPマーカーとNIM座との組換体である植物を同定した。1144 Ｆ２ nim１表現型植物及びＦ３ nim２表現型集団のうち、239がngalllマーカーにつ いてのヘテロ接合と同定され、SSLPマーカーとNIM座との遺伝子距離は10.4cMと 概算された。これはNIM１座が染色体１上にあることと一致した。ATHGENEA及びn galllの双方においてヘテロ接合であるいくつかのnim１表現型植物が存在してい るため、NIM１座はこれら２つのマーカーの内にあり、ATHGENEAがNIM１座遺伝子 の北 側に位置し、そしてngalllがNIM１座遺伝子の南側に位置していることが決定さ れた。これはNIM１座遺伝子をngalllの約l0cM北、染色体１の85位付近に位置せ しめた（Lister and Dean，1993，Plant J．4，745-750；Bell and Ecker，1994 ，Genomics 19，137-144）。 iii．増幅フラグメント長多形態マーカー NIM１遺伝子の地図ベースクローニングのため、この遺伝子に連続的に近接 している分子マーカーを同定する必要がある。この目的のため、増幅フラグメン ト長多形態（AFLP）マーカーをZabeau and Vos（1993、ヨーロッパ特許出願EP 0 534858）及びVosら(1995，Nucleic Acid Research 23，4407-4414)記載の選択的 制限フラグメント増幅法を利用することにより作製した。 AFLP技術の概略 マッピングにおけるAFLP技術の利用は２種類の遺伝子的に異なるサンプルにお けるDNAバンドのセットの選択的増幅を頼りとする。 得られる任意のバンドが２つの遺伝子型間で異なるという発見は、それらのバン ドをその遺伝子型についてのマーカーとして特定する。マーカーが注目の遺伝子 （突然変異体）と高頻度で一緒に分離しているなら、そのマーカーはこの遺伝子 座に近接している。 複合DNAサンプル中の小セットのDNAフラグメントの選択的増幅は２段階の工程 で達成される。まず、DNAフラグメントをDNAを制限酵素により消化し、そしてそ の末端にアダプターをつなげることにより作製する。次に、アダプターに相補的 な配列と３’伸長（典型的には０〜３個のヌクレオチド）とより成るプライマー を、末端がこれらのプライマーと相補性であるDNAフラグメントのみを増幅する ために用いる。シングルヌクレオチド伸長を利用するなら、各プライマーは全フ ラグメントの約１／４に適合し、全フラグメント の１／16が両端に適合したプライマーを有するであろう。即ち、一定のDNAフラ グメントのセットがこれらのプライマーにより増幅される。更に放射能ラベルす ることにより、目に見えるバンドの更に小さいサブセットが獲得できうる。 AFLP分析 DNAサンプルのAFLP分析のため、50ngのDNAを適当な酵素（通常はEcoRＩ及びMs eＩ；下記参照）で消化し、そしてアダプター（下記表２に列挙）を制限フラグ メント（通常はEcoRＩ及びMseＩ）にライゲーションさせた。これらのプライマ ー並びにYAC，Ｐ１及びBACクローンの配列を以下に詳細する。短い３’伸長（２ 又は３個のヌクレオチド）を有するアダプターに相補性なプライマーを利用し（ プライマー配列は下記）、増幅反応のために鋳型を用いた(反応当り約0.5ngのDN A)。一方のプライマーは放射性ラベルしてあるため（通常はEcoRＩプライマー） 、一組の増幅フラグメントサブセットのみがバンドを分離するために用いたゲル のオートラジオグラフィー分析により見えた。 クローニングしたDNA（YAC，Ｐ１、コスミド）のための増幅条件は下記の通り とした：94℃で30秒（変性）、30秒のアニーリング及び72℃で１分の伸長のサイ クル36回。第一サイクルにおけるアニーリング温度は65℃とし、そして次の12サ イクルにわたりサイクル毎に0.7℃づつ下げ、そして56℃に保った。アラビドプ シス植物のゲノムDNAのため、このDNAをシングルヌクレオチド伸長を有するプラ イマーで増幅させた（いづれのプライマーもラベルしていない）。この増幅反応 のための反応条件は30秒の変性（94℃）、１分のアニーリング（65℃）及び１分 の伸長（72℃）のサイクル20回とした。第二の段階において、第一増幅反応物を 10倍希釈し、そして全長伸長を含むプライマーで下記の条件下で36サイクル再増 幅させた（ 一のラベル化プライマーを用い）：94℃で30秒（変性）、30秒のアニーリング及 び72℃で１分の伸長。第一サイクルにおけるアニーリング温度は65℃とし、そし て次の12サイクルにわたりサイクル毎に0.7℃づつ下げ、そして56℃に保った。 最終反応生成物をポリアクリルアミドゲルで分離し、そしてそのゲルをフィルム に曝露し、放射性ラベル化PCRバンドを識別化させた。この手順を２種類の遺伝 子型に由来するDNAに同時に適用すると、一の遺伝子型又はその他のための診断 となるAFLPバンドが特定される。かかるバンドは情報性AFLPバンド又はAFLPマー カーと呼ぶ。表２はAFLP分析において用いるアダプターを示す。 AFLPマーカーの作製及びNIM１座の詳細マッピング アラビドプシスエコタイプランズバーグエレクタ(Ler)とコロンビア(Col)(Lis ter and Dean，1993，Plant J．4，745-750)との交 配に由来する組換同系交配系の集団をAFLPマーカースクリーニングのために用い た。AFLPスクリーニングのために用いたこれらのプライマーは： これらのプライマーにおける「Ｎ」はこの部分が可変性（Ａ，Ｃ，Ｇ又はＴ） であることを意味し、「Ｗ」はＡ又はＴであることを意味し、そして「Ｘ」はＣ を意味する。８種の考えられるプライマー全てをEcoRＩ−及びMseＩ−プライマ ーの双方のために用いた。これは全部で64（８×８）通りのプライマー組合せ(P Cs)を供し、これを組換同系交配系並びに親遺伝子型Ler及びColに由来するDNAを 上記の通りに増幅するために用いた。増幅反応物を変性ポリアクリルアミドゲル に流し、AFLPフラグメントをサイズにより分け、そしてそのゲルをフィルムに曝 露した。このフィルムを一の遺伝子型のみに存在するバンドについて調べた。即 ち、AFLPマーカーについて調べた。 AFLPマーカー、即ち、当該組換同系交配系の双方の親間で多形態であるDNAフ ラグメントを組換同系交配系集団の遺伝子地図を構築するために用いた。以下の 実施例１．５ｉにはアラビドプシス染色体１上の適当な位置85でのNIM１遺伝子 のマッピングが記載されている。アラビドプシス染色体１の位置81と88との間に マッピングされた（組換同系交配系）AFLPマーカーを当該AFLPマーカーの存在に ついて組換植物を分析し、それ故NIM１遺伝子をより正確にマッピングするため に選定した。この領域由来の７種類のマーカーが情報性であると特定された；そ れらはnim１×Ler交配の双方の親間で多形性であった。６種類のAFLPマーカーは Ler特異性であり、即ち、これらのAFLPマーカーはWs(及びCol)において存在して いなかっ た。一のAFLPマーカーはWs特異性であり、即ち、Col特異性AFLPマーカー（Lerに は非存在）もWsに存在していた。これらのAFLPマーカーはＬ81.1，Ｌ81.2，Ｗ83 .1，Ｌ84，Ｌ84，Ｌ87及びＬ88である（Ｌ−マーカーはエコタイプLerに対して 特異的であり、そしてＷ−マーカーはエコタイプ（col及びWsの双方に対して特 異的である；数字は地図位置を示す）。これらのAFLPマーカーをnim１×Ler交配 由来の組換植物を分析するために用いた（下記参照）。更に、AFLPマーカ−Ｃ86 （Colに特異的な組換同系交配誘導マーカー）をDNAクローンの単離において用い た（下記参照）。表３はこれらのAFLPマーカーを得るために用いたプライマー配 列を列挙する。 表３は組換同系交配系集団に由来するAFLPマーカーのプライマーの組合せを示 す。 この領域の詳細な遺伝子地図を、組換体を種分けすることにより上記のAFLPマ ーカーを用いて構築した。全部で337の組換植物が1144のＦ２ nim１植物から得 られた。これらの組換体をまず北側隣接 AFLPマーカーＬ81.2及びATHGENEA並びに南側隣接マーカーＬ88及びngalllでスク リーニングした。48の植物がホモ接合性nim１／nim１であり、且つATHGENEA及び Ｌ81.2においてヘテロ接合性であり、そして21の植物がホモ接合nim１／nim１で あり、且つngalll及びＬ88においてヘテロ接合性であった。これらの組換植物を 更にNIM領域において９個のAFLPマーカーで分析し、そのマーカーには組換同系 交配系マッピング集団に由来する４つのAFLPマーカー（Ｗ83.1，Ｌ84，Ｌ85及び Ｌ87）並びにYACクローンの分析に由来する５つのAFLPマーカー（Ｗ83.3／Ｗ84. 1，Ｗ84.2，Ｗ85.1，Ｗ86.1及びＬ86；下記参照）が含まれる。 この分析に基づくNIM１の遺伝子地図を図４に示す。見ての通り、27の組換体 がマーカーＷ84.2とNIM１との間に認められ、そして14の組換体がＷ85.1とNIM１ との間に認められた。マーカーＬ85はNIM１に近接して連結されているが、この マーカーはYAC，BAC又はＰ１クローン上には位置しておらず（下記参照）、従っ てNIM１遺伝子の同定のために有用ではなかった。 ５． NIM１領域の物理マッピング ｉ． NIM１に近接に連結したAFLPマーカーを利用してのYACクローンの単離 CICライブラリー、即ち、アラビドプシス・エコタイプ・コロンビアYACライブ ラリー（Bouchezら、1995，6th Int．Conf on Arabidopsis Research，Madison ，WI）をYACクローンについてNIM領域においてスクリーニングした。このライブ ラリーは約2.5個の核ゲノム当量を有し、且つ450kbの平均インサートサイズを有 する。 YACライブラリーを２種類のマーカーでスクリーニングした：Ｗ83.1及びＣ86。 Ｗ83.1はNIM１の北側の最も近接に連結した組換体、同系交配系誘導AFLPマーカ ーであり、そしてＣ86はColに特異的な 組換体、同系交配系誘導AFLPマーカーである（Ler及びWsにおいて非存在）。Ｃ8 6は組換同系交配系集団の地図上のNIM１遺伝子の南側にマッピングされた。この Col AFLPマーカーを近接に連結したLer AFLPマーカーの代わりに用い（図４）、 なぜならこのLer AFLPマーカーはエコタイプ・ランズバーグ・エレクタのみを検 出するマーカーであり、従ってコロンビアYACライブラリーをスクリーニングす るために利用することができないからである。 YACライブラリーは２段階でスクリーニングした。最初に、12枚の96穴マイク ロタイタープレートの各プレートのYACクローンの細胞をプールし（プレートプ ール）、そしてRossら(1991，Nucleic Acids Res ．19，6053)に記載の通りにし てDNA単離のために用いた。これらのプールを両AFLPマーカーでスクリーニング した。次に、各陽性プレートプールから、各列（８クローンのプール）及び各行 （12クローンのプール）のDNAサンプルを、プレートプールが陽性であるAFLPマ ーカーでスクリーニングした。これにより、個々の陽性YACクローンが同定でき た。このスクリーニングは全部で４つのYACクローンを供した。YAC 12F04及びYA C 12H07は北側AFLPマーカーＷ83.1を用いて単離し、そしてYAC 10G07及びYAC 7E 03は南側AFLPマーカーＣ86を用いて単離した（YACクローンの命名については、C IC番号付けが使用される）。YACをAFLPにより「フィンガープリント」し、YAC特 異性AFLPフラグメントを得た。YACのフィンガープリントを比較し、そしてYAC間 の重複を評価するのに用いた（表５及び６も参照のこと）。AFLPフィンガープリ ントに基づき、クローン7E03はクローン10G07により本質的にカバーされ（表５ も参照）、そしてクローン12H07は同様にクローン12F04により本質的にカバーさ れた（表６も参照）。 ii．YACクローンからのAFLPマーカーの作製 上記のAFLPマーカーはNIM１遺伝子から相対的に遺伝子的に遠いため（図３参 照）、NIM遺伝子にもっと近いマーカーを探す研究を開発した。 更なるYAC誘導AFLPマーカーについてのスクリーニングを下記のDNAサンプルで 実施した：単離したYACクローンのDNA（上述の通り、４つのYACが同定されてい る）、YACのない酵母株、並びに３種のアラビドプシス・エコタイプCol，Ler及 びWs。このようにして、YACクローン（酵母株には存在せず、そしてColに存在） に特異的なフラグメントがLer及びWs（下記の実施例１．５において同定された 組換植物の親）における多形性について試験できる。かくして同定された多形性 フラグメントは全て追加のAFLPマーカーであろう。第一AFLPスクリーニングにお いて、酵素の組合せ（EC）EcoRＩ／MseＩを使用した。このスクリーニングにお いて、２つのYACクローン10G07及び7E03（AFLPマーカーＣ86により検出；下記参 照）、YACのない酵母株、並びに３種のアラビドプシス・エコタイプCol，Ler及 びWsをアッセイした。使用した選択的伸長を有するプライマーの組合せは３つの グループに分類でき、そして表４に示す。全部で256（64＋96＋96）通りのプラ イマー組合せをスクリーニングした。 以下の表４において、２種類のクローン10G07及び7E03のAFLPスクリーニング において利用したプライマー配列、YACのない酵母株、並びに３種類のアラビド プシス・エコタイプCol，Ler及びWsを示す。３グループのプライマーの組合せを 利用した。プライマーにおける「Ｎ」はこの部分が可変性であることを示し（Ａ ，Ｃ，Ｇ又はＴ）、「Ｓ」はＣ又はＧを示し、「Ｗ」はＡ又はＴを示し、そして 「Ｙ」はＣ又はＴを示す。 全部で83のCol特異性フラグメントを作製し、その62は双方のYACクローンを共 有していた。３種のフラグメントはWs及びLer間のAFLPマーカー多形性であり、 そのうちの２種はWs AFLPマーカー（ColフラグメントはWsにも存在し、そしてLe rにおいては存在しない）であり、そして１種はLer AFLPマーカー（Colフラグメ ントはLerにも存在し、そしてWsにおいては存在しない）である。これらの結果 を以下の表５に示す。 表５はYAC 10G07及び7E03において検出された共有及び固有のAFLPフラグメン トの数、並びにWs及びLer遺伝子型におけるこれらのフラグメント間での情報性A FLPマーカーの数を示す。 かくしてこのAFLP分析は３種のAFLPマーカーを供した（図４及び下記参照）。 互いに対する及び組換同系交配系誘導AFLPマーカーに対するその絶対位置をこれ らのAFLPマーカーによる組換体の分析に より決定した。 AFLPマーカーについての二次スクリーニングを４つの同定されたYACクローン 全てをアッセイし（下記参照）、且つ酵素組合せPstＩ／MseＩを用いることによ り実施した。使用したプライマーは下記の通りである： このプライマーにおける「Ｎ」はこの部分が可変性であることを示し（Ａ，Ｃ ，Ｇ又はＴ）、そしてこのプライマーにおける「Ｗ」はこれがＡ又はＴであるこ とを示す。全部で144（12×12）通りのプライマーの組合せを４種の単離されたY ACクローン−12F04，12H07，10G07及び7E03；YACのない酵母株；並びに３種のア ラビドプシス・エコタイプCol，Ler及びWsに基づいてスクリーニングした。全部 で219のAFLPフラグメントを位置し、そのうちの144がYACクローン12F04及び12H0 7において存在し（72がクローン12F04に固有であり、72が双方のYAC間で共通し ていた）、そして75がYACクローン10G07及び7E03において存在していた（33がク ローン10G07に固有であり、そして42が２つのYAC間で共通していた）。YACクロ ーンの第一セットに由来する３つのフラグメントは多形性であっ た(Ws AFLPマーカー)。これらの結果を下記の表６に示す。 表６はYACにおいて検出された共有及び固有AFLPフラグメントの数並びにWs及 びLer遺伝子型におけるこれらのフラグメント間の情報性AFLPマーカーの数を示 す。 これらの結果はYACクローン12H07が大きめのYACクローン12F0４の一部であり 、そしてYACクローン7E03が大きめのYACクローン10G07の一部であることを示唆 する。これらのデーターは大きめのYACクローン12F04及び10G07が重複しないこ とを示唆する。これらのデーターはこれらのYACクローンのいづれにおいてもNIM １遺伝子の位置付けを可能としない。NIM領域において302のAFLPフラグメントを 供する400通りのプライマーの組合せを包括する完全スクリーニングは５つの有 用なAFLPマーカーを供し、その４つはWs特異的であり、そして１つはLer特異的 である。これら５つの更なるAFLPマーカーを組換植物の分析によりマッピングし （図４及び下記参照）、そしてＷ84.1（ａ．ｋ．ａ．Ｗ83.3）、Ｗ84.2，Ｗ85.1 ，Ｗ86.1及びＬ86と命名した。 表７にはこれらのAFLPマーカーを得るために用いたプライマー配列を列挙する 。これら５つの更なるAFLPマーカーはＬ81.1からＬ88 に至る領域においてAFLPマーカーの総数を12にまで高めた（図４及び下記参照） 。 表７はYACクローン由来のAFLPマーカーのプライマー組合せを示す。 この情報を遺伝子地図と比べてのYACクローンのおよその位置を伴い図５に示 すように領域の物理地図を構築するのに用いた。この地図はマーカーＷ83.１と Ｗ85.1との間のNIM１座を含む領域が３つのYACクローン12F04及び10G07／7E03に より部分的にカバーされていることを示した。 iii． NIM１遺伝子を含むＰ１／BACコンティグの構築 先の章においては、NIM１領域に連結したAFLPマーカーをどのようにして単離 するか並びにこれらのマーカーに対応するYACをどのように同定及びマッピング するかを記載した。得られた結果はNIM１遺伝子を染色体フラグメントにまで特 定したが、NIM１遺伝子を含む特異的なDNAセグメントの特定にまでは至らない。 隣接AFLPマ ーカーは重複しない別々のYACへとマッピングされた。従って、NIM１遺伝子の正 確な物理的な位置を決定することはできない。それは２つYACのいづれかにある か、又はYAC間のギャップにありうる。別のアプローチを隣接し合うマーカー間 の物理ギャップを埋めるために選定した。Ｐ１及びBACライブラリーを隣接AFLP マーカー間のギャップの橋渡しのために用いた。 ギャップの埋めに用いたライブラリーはLiuら（The Plant J.，7，351-358，1 995）記載のアラビドプシス・エコタイプ・コロンビアＰ１ライブラリー及びCho iら(http/genome-www．stanford，edu/Arabidopsis/ww/Vol2/choi，html)記載の エコタイプ・コロンビアBACライブラリーとした。Ｐ１ライブラリーは約10,000 のクローンより成り、且つ80kbの平均インサートサイズをもち、そしてBACライ ブラリーは約4000のクローンより成り、100kbの平均インサートサイズをもつ。 理論的には、これらのライブラリーは約10の核ゲノム当量を示す（アラビドプシ スのハプロイドゲノムサイズを120Mbと仮定）。 iv．隣接マーカーに対応するＰ１クローンの同定 隣接マーカーWs84.2及びWs85.1を、YACライブラリーのスクリーニングについ て前述したものと類似の戦略を利用するＰ１クローンのプールのスクリーニング に用いた（実施例１．５参照）。マーカーフラグメントを有するＰ１クローンを 選択し、そして「プラスミド」DNAを単離した。様々なＰ１クローンDNAをECs Ec oRＩ／MseＩ及びHindIII／MseＩ並びに選択ヌクレオチドなしのプライマーを用 いてフィンガープリントした。物理地図、即ち、クローンのサイズ及び重複を示 す地図をAFLPフィンガープリントの対比により構築した。固有であるAFLPフラグ メントの数及びクローン間で共通するAFLPフラグメントの数は重複の程度を示唆 する。この地図を図６に 示す。AFLPフィンガープリンティングは２組の重複しないＰ１コンティグが構築 されたことを示し、それぞれは次の隣接マーカーのいづれかを含む：Ｐ１−１及 びＰ１−２含有マーカーWs84.2；Ｐ１−３及びＰ１−４含有マーカーＷ85.1。従 って、隣接マーカー間のギャップは埋められなかった（図６）。 YACコンティグに対するＰ１コンティグの位置をYAC及びＰ１クローンのAFLPフ ィンガープリンティングと上記のYAC特異性Pcの数とにより決定した。Ｐ１クロ ーンＰ１−１及びＰ１−２はYAC CIC12F04と完璧に重複し、YAC CIC12H07とは部 分的にのみ重複した。従って、これらのＰ１クローンYACコンティグCIC12H07／l 2F04上に位置する（図６）。Ｐ１クローンＰ１−３及びＰ１−４はYAC CIC7E03 及びCIC10G07と完璧に重複し、そしてAFLPマーカーＷ86.1が、Ｗ85.1と同様に、 このＰ１コンティグに位置することが示された（図６）。 次に、マーカーＬ85を対応のＰ１及びBACクローンを同定するために用いた。 Ｌ85はエコタイプランズバーグ特異性マーカーであり、従って放射性ラベルされ たＬ85 DNAのＰ１及びBACフィルターに対するコロニーハイブリダイゼーション を採用した。Ｌ85に対するＰ１又はBACクローンハイブリダイゼーションは全く 同定されなかった。このことはＬ85配列がアラビドプシス・エコタイプ・コロン ビアゲノムにおいて欠失している我々の当初の発見を裏付けし、従ってなぜ対応 のクローンが全く同定されないかの最大の説明となる。 ｖ． NIM１隣接Ｐ１コンティグの伸長 隣接Ｐ１コンティグから伸長させるために様々なアプローチを採用した。 YAC CIC12F04（CIC12F04に固有、CIC12H07には存在しない）の南 端に特異的なYAC AFLPフラグメントをライブラリーのプールのAFLPスクリーニン グによりＰ１クローンを同定するために用いた。 １．YAC 10G07に由来し、且つＰ１−４と重複するYAC AFLPフラグメントをＰ １ライブラリーのプールのAFLPスクリーニングによりＰ１クローンと同定するた めに用いた。 ２．Ｐ１クローンＰ１−６由来のEcoRＩ制限フラグメント（段階１のAFLPベー スＰ１ライブラリースクリーニング由来）をBACライブラリーのフィルター上の ハイブリダイゼーションプローブとして用いた。 様々なＰ１及びBACクローンがこのスクリーニングにより得られ、そして全て を選択的ヌクレオチドのないプライマーを用いECs EcoRＩ／MseＩ及びHindIII／ MseＩでAFLP−フィンガープリンティングした。上記の通りにして新しい地図を 構築し、そして図７に示す。表８は隣接YACに位置するAFLPフラグメントを有し 、そして対応のＰ１クローンについてのＰ１−ライブラリーをスクリーニングす るのに用いた様々なAFLP PCsを示す。 表８はＰ１ライブラリーをスクリーニングするために用いた様々なAFLP PCsを 示す。この表の上半分は北側YACに特異的なPCsを示し、そして下半分は南側YAC に特異的なPCsを示す。更に示すのはAFLPフラグメントが検出されたYAC及びＰ１ クローンである。 YAC CIC12F04の南端をカバーし（このYACから突き出ていない）且つマーカー Ｗ84.2を含む約250kbのＰ１／BACコンティグを得た。マーカーＷ85.1及びＷ86.1 を含む約150kbのＰ１コンティグを得た。このコンティグはYAC CIC7E03内に完全 に含まれている。 北Ｐ１／BACコンティグ（WL84.4及びWL84.5、下記及び表11参照）の南端から のマーカーとの組換に基づくNIM１遺伝子AFLPマーカー分析をカバーするＰ１／B ACコンティグの構築は従来の「歩行」工程がNIM１遺伝子含有コンティグの構築 において有効でないことを示した（次章参照）。従って、NIM１遺伝子にわたる 「歩行」の目的で現存の北Ｐ１／BACコンティグを南に伸長し、これはNIM１遺伝 子を含む特異的なDNAセグメントの規定及び単離を可能にするであろう。北Ｐ１ ／BACコンティグの南端に位置するＰ１又はBACクローンをNIM１の近くに位置す るクローン（南境界）を同定する ために用いるハイブリダイゼーションベースアプローチを行った。歩行工程によ り得られる新たなクローンを上記のECs EcoRＩ／MseＩ及びHindIII／MseＩによ るAFLPフィンガープリンティングを用い、現存のコンティグに対してマッピング した。全部で５つの連続歩行工程がNIM１遺伝子を「横断」するのに必要である ようであった。表９は様々な歩行段階において得られるクローンを示す。 表９はＰ１及びBACライブラリーをスクリーニングするのに用いたハイブリダ イゼーションプローブ及びこれらのプローブにハイブリダイゼーションし、且つ 南方向に伸長する選定のクローンを示す様々な歩行工程の概略である。 この歩行作業により得られる様々なクローンの物理地図を図８に示す。約600k bの総距離が初期歩行点マーカーＷ84.2から出発してカバーされた。図８に示す コンティグの南端はNIM１遺伝子を含むようであった（次章参照）。このコンテ ィグはYAC CIC12F04から南300kb以上に広がり、そしてYACc CIC10G07及びCIC7E0 3と重複しないようであり、NIM１遺伝子が隣接コンティグ間のギャップにあ り、且つこのギャップが300kb以上であることを示唆する。 vi． NIM１隣接の総合遺伝子及び物理地図の構築 先の章において、NIM１隣接に連結したAFLPマーカーをどのようにして単離す るか、隣接マーカーに対応するYACをどのようにして同定するか、及び最も近い 北側隣接AFLPマーカーＷ84.2から南550kb伸びたＰ１／BACコンティグをどのよう にして構築するかを述べた。本章はＰ１／BACコンティグからの新たなAFLPマー カーの作製、このコンティグ上のこれらのマーカーの物理的マッピング及び有用 な組換体によるこれらのマーカーの遺伝子マッピングを述べる。 １．Ｐ１／BACコンティグからの新たなAFLPマーカーの作製 先の章に記載の通り、コンティグ伸長のＰ１及びBACクローンをECs EcoRＩ／M seＩ及びHindIII／MseＩを利用するAFLPフィンガープリンティングにより特性決 定した。これは様々なＰ１及びBACクローン間の重複の程度をかなり正確に規定 し、そして更にこれらのクローンに特異的ないくつかのAFLPフラグメントを作製 した。選択ヌクレオチドのないAFLPプライマーをＰ１又はBACクローンの精製プ ラスミドDNAのフィンガープリンティングに用いた。しかしながら、アラビドプ シスにおける検出のためにこれらのＰ１又はBAC特異的AFLPフラグメントを利用 できるようにするには選択ヌクレオチドが必要であろう。増幅制限フラグメント の末端配列を決定することにより、適当な選択塩基を有するAFLPプライマーがア ラビドプシスにおけるＰ１−又はBAC−特異性AFLPフラグメントを増幅するため にデザインすることができる。AFLPフラグメントは全てエコタイプ・コロンビア (Col)に由来し、それ故コロンビアAFLPマーカーがエコタイプ・ランズバーグ・ エレクタ(Ler)とエコタイプ・ワッシルウスキジャのnim１突然変異体(Ws−nim) との交配に由来するNIM１組換体における情報源となるかを決定すべきでもある 。原理的 には、４タイプのAFLPフラグメントがあり、そのうちの２つは下記の表10に示す 有用なマーカーである。 表10は認められたAFLPマーカーのタイプの概略である。（＋）又は（−）はAF LPフラグメントの有無を示す。 一般に、Ｐ１及びBACクローンのフィンガープリンティングは各々のクローン について30〜40のEcoRＩ／MseＩ AFLPフラグメント及び60〜80のHindIII／MseＩ AFLPフラグメントを作製した。個々のフラグメントの末端配列は標準の配列決定 技術により決定した。次に、EcoRＩ又はHindIIIプライマー及びMseＩプライマー の双方についての３個のヌクレオチドの選択伸長を有する特異的AFLPプライマー セットを下記のDNAパネルで試験した： １．AFLPマーカーが由来するＰ１／BACクローン ２ａ．酵母 ２ｂ．YACクローンCIC12F04（Ｐ１〜７由来のAFLPフラグメントについてのみ ） ２ｃ．YACクローンCIC10G07 ３ａ．Col；Ｐ１及びBACライブラリーの起源 ３ｂ．Ler；nim組換体の親１ ３ｃ．Ws−nim：nim組換体の親２ ６個のクローンをそのECs EcoRＩ／MseＩ及びHindIII／MseＩ A FLPフラグメント：BAC−01／Ｐ１−７，Ｐ１−17／Ｐ−18, BAC−04／BAC−06の 配列分析のために選定した。クローンＰ１−７由来のAFLPフラグメントは全てYA C CIC12F04において検出され、このクローンがこのYAC内に完璧に含まれている ことを示唆する。どのＰ１／BAC特異的AFLPフラグメントもYACクローンCIC10G07 において検出されず、Ｐ１／BACコンティグが２つの隣接し合うYACコンティグの 間のギャップを橋渡していないことを示唆する。nim組換体の分析のために選定 したAFLPマーカーを表11に示す。 表11は様々なＰ１及びBACクローンに特異的なAFLP PC由来の選定AFLPマーカー の概要である。「WL」マーカーは同じPCに由来するマーカーであり、そして２種 類のAFLPマーカー、Ws及びLerマーカーを示し、それらはNIM組換体の分析により 反発相(repulsion phase)において完璧に連結されているようである。 ２．新しいAFLPマーカーの物理マッピング 上記のAFLPマーカーを様々なＰ１及びBACクローンにおけるその 存在について検定することにより物理マッピングした。その結果を図９〜11に示 す。 ３．新しいAFLPマーカーの遺伝子マッピング AFLPマーカーを選定した組換体セットで全て分析した。得られる結果を表12ａ ，12ｂ及び12ｃにおいてまとめる。 AFLPマーカーLer 84.8，Ler 84.9ａ，Ler 84.9ｂ及びLer 84.9ｃはNIM１の南 側においてマッピングされることが認められた。組換体は表現型的にnim１（ホ モ接合性、ゲノタイプWs−nim1／Ws−nim1）であり、そしてこれらのAFLPマーカ ーについてヘテロ接合性であることが認められた（Ler特異的AFLPマーカーが検 出され、ゲノタイプはWs−nim1／Lerである）。AFLPマーカーLer 84.8がNIM１に 最も近いことが認められた：単独の組換体(Ｃ−105)のみがヘテロ接合性Ws−nim 1／Ler及びホモ接合性Ws−nim1／Ws−nim1として評価された。AFLPマーカーLer 84.7及びLer 84.6はNIM：１と完璧に一緒に分離するようであった：全ての組換 体が同一のNIM１及びAFLPマーカーゲノタイプを有していた。NIM−１の北側で、 マーカーＬ84.6ｂはNIM１に最も近いようであった：３つのnim１表現型組換植物 、Ｃ−074，Ｄ−169及びＥ−103(表12ｃ)はこのマーカーにおいてヘテロ接合性W s−nim1／Lerであることが認められた。Ｐ１−18，BAC−04及びBAC−06から作製 したコスミドコンティグの助けにより、AFLPマーカーLer 84.6ｂ及びLer 84.8を Ｐ１−18及びBAC−04においてそれぞれマッピングし、そして約110kbの物理距離 をもつことが認められた。これはDNAセグメント上に載っているnim１が推定の長 さ110kbであることを規定する。この分析から、NIM１遺伝子がクローンBAC−04 又はＰ１−18を含むことが決定された。クローンBAC−04及びＰ１−18はATCCに 寄託されており、そしてそれぞれ寄託番号ATCC 97543及びATCC 97606が付与され ている。 vii． NIM１遺伝子の遺伝子及び物理詳細マッピング 先の章はNIM遺伝子を含むDNAセグメントをどのようにしてＰ１／BACコンティ グ上の隣接AFLPマーカー（Ler 84.6及びLer 84.8）の物理マッピングにより描写 できるかを述べてきた。隣接マーカー は２つの重複クローン、Ｐ１−18及びBAC−04上でマッピングされるようであっ た。本章はNIM１遺伝子を含む領域の遺伝子及び物理地図の解像度を高めるため にどのようにして追加のBAC−04特異的及びＰ１−18特異的AFLPマーカーを作製 するかを述べる。 viii．コスミドアレーからの追加のAFLPマーカーの作製 ４種のECを選定してNIM１：PstＩ／MseＩ， Xbaｌ／MseＩ，BstYＩ／MseＩ及 びTaqＩ／MseＩの詳細マッピングについての追加のAFLPマーカーを作製した。Ps tＩ／MseＩ及びXbaＩ／MseＩAFLPフラグメントをクローンＰ１−18及びBAC−04 上に作製し、そしてアラビドプシスにおける検出のために必要な選択配列を決定 した。同様にして、AFLPフラグメント及び選択配列をBstYＩ／MseＩ及びTaqＩ／ MseＩのために決定した；ただし本件においてはこの手順はコスミドDNAを用いて 実施した：BstYＩ／MseＩ（完全NIM１領域）のためにはA11，Ｃ７，Ｅ１及びＥ ８、そしてTaqＩ／MseＩ(NIM１領域の南側)のためにはＤ７，Ｅ８及びＥ６。更 なる遺伝子及び物理マッピングのために選定した情報AFLPマーカーを表13に示す 。この作業において利用した更なるアダプターは表14に示す。 表13はNIM１の遺伝子及び物理詳細マッピングのために用いたAFLPマーカーを 示す。「BstYＩ（Ｔ）」は制限部位を示し、そして対応のプライマーはAGATCT又 はGGATCTのいづれかとした。 表14は新しいAFLPマーカーを同定するために用いた追加のアダプターを示す。 ix．新しいAFLPマーカーからコスミドコンティグに至る物理マッピング。 上記のマーカーを様々なコスミドクローンにおけるその存在を決定することに よりコスミドアレー上で物理マッピングした（図11）。 １．新しいAFLPマーカーの遺伝子マッピング 新しいAFLPマーカーを最も近い北側及び南側組換体のAFLP分析により遺伝子マ ッピングした。最も近い北側(組換体Ｄ169)及び南側 (組換体Ｃ105)組換地図をマッピングした（表15参照）。AFLP分析は組換体Ｄ169 が組換体をマーカーＬ84．Ｙ１の南側、且つマーカーＷ84．Ｙ２の北側に有すこ とを示した。組換体Ｃ105における組地点はマーカーＬ84．Ｔ２及びＬ84.8の間 でマッピングされた。この有用な組換体のセットを利用して、これはNIM１を含 む染色体インターバルの更なる描写を可能にした；隣接する組換地点の間の距離 は60〜90kbであることが認められた（図12）。 ２．コスミドコンティグの構築 nim１植物表現型の補完のため、野生型NIM１遺伝子によるnim１植物の形質 転換が必要である。これはかかる植物を当該遺伝子を含むコスミドで形質転換す ることにより成し遂げられうる。この目的のため、NIM１領域のコスミドコンテ ィグを構築した。アラビドプシスはアグロバクテリアを利用して形質転換させて いるため、使用するコスミドベクターはバイナリーベクターとする。 DNAをBAC−04，BAC−06及びＰ１−18から単離し、そして制限酵素Sau3AＩを用 いて部分消化体を作るのに用いた。20〜25kbのフラグメントをスクロース勾配を 用いて単離し、プールし、そしてdATP及びdGTPでフィル・インした。バイナリー ベクター(04541)をXhoＩで切断し、そしてdCTP及びdTTPでフィル・インした。こ れらのフラグメントを次にベクターにライゲーションさせた。このライゲーショ ン混合物をパッケージングし、そしてＥ．コリへと形質導入せしめた。 このコスミドライブラリーをBAC−04，BAC−06及びＰ１−18クローンでスクリ ーニングし、そして陽性クローンを単離した。これらのコスミドを次にAFLPフィ ンガープリントにかけ、そしてNIM１領域に広がる重複クローンのコンティグへ と並べた。コスミドのインサートサイズを決定し、そして限界制限マッピングを 実施した。その結果を図10に示す。 実施例２ NIM１遺伝子を含むクローンの同定 １．安定形質転換を介する補完 NIM１領域（上記）に広がるクローンから作製したコスミドを三親交配（tri parental mating）によりアグロバクテリアへと移動させた。これらのコスミド を次に真空浸透（Mindrinosら、1994，Ce ll 78，1089-1099）又は標準の根形質転換によりnim１アラビドプシスを形質転 換させるのに用いた。これらの植物由来の種子を回収し、そして選択因子として カナマイシン（又はその他の適当な抗生物質）を有するアガープレート上で発芽 させた。コスミドDNAで形質転換された小植物(plantlets)のみが選択因子を解毒 し、そして生存した。選択を生き抜いた苗木を土壌に移し、そしてnim表現型に ついて試験するか、又はその子孫をnim表現型について試験した。nim表現型をも はや有さない形質転換植物は機能性NIM１遺伝子を含むコスミドを特定した。 ２．一過性発現系における補完 nim１突然変異を補完するDNAクローンの能力を２種類の一過性発現系におい て試験した。 第一の系において、PR１−ルシフェラーゼ(PR１−lux)導入遺伝子を含むnim１ アラビドプシス植物をボンバードメント受容材料として使用する。これらの植物 は、真空浸透によりコロンビア・エコタイプ植物をPR１−lux構築体により形質 転換させ、次いで上記の通りの回収種子のカナマイシン選択により作製した。IN Aにより誘導後にルシフェラーゼ活性を示す形質転換植物を自己繁殖させ（selfe d）、そしてホモ接合植物を作製した。これらをnim１植物と交配させた。一過性 アッセイにおいて、この交配に由来するnim１及びPR１−luxについてホモ接合性 である子孫植物をnim１表現型を補完できるDNAクローンの同定のために用いた。 次に、これらの植物を上記実施例１．１に記載の通りにしてINAでまず処理した 。これらの植物を回収して２日後、表面を滅菌し、そしてGMアガー培地上でプレ ート培養した。葉組織をコスミド、Ｐ１又はNIM１領域由来のBACクローン（又は サブクローン）でボンバードメントに付し、そして１日後、葉のルシフェラーゼ 活性を測定する。ルシフェラ ーゼ活性を誘導するクローンはNIM１遺伝子を含む。 第二の系においては、nim１植物をINAで処理し（上記実施例１．１に記載の通 り）、そして２日後、NIM１遺伝子座領域由来のクローン化DNA（コスミド、Ｐ１ 、BAC及び／又はYACクローン又はサブクローン）及びリポータープラスミドでボ ンバードメントにかける。このリポータープラスミドはアラビドプシスPR１プロ モーター(PR１−lux)により駆動するルシフェラーゼ遺伝子を含む。nim１植物に おいて、INAはPR１プロモーターを活性化せず（上記実施例１．２に記載の通り ）、それ故リポータープラスミド由来のルシフェラーゼ活性を誘導できない。し かしながら、共形質転換したDNAクローンが補完性NIM１遺伝子を含むとき、INA は、ルシフェラーゼ活性の誘導により実証される通り、PR１プロモーターを誘導 する。共ボンバードメントの１日後、完全植物のルシフェラーゼ活性を測定する 。バッググランドレベルを有意に超えるルシフェラーゼ活性を誘導するDNAクロ ーン（コスミド、Ｐ１又はBACクローン又はサブクローン）はNIM１遺伝子を含む 。 ３．nim１表現型系列における転写体の変化 nim１表現型植物はNIM１遺伝子の中に突然変異を有するため、一部の系列に おいて、その遺伝子はmRNAが全く転写されないように、又は異常mRNA（サイズ） が生成されるように改変されていると考えられる。これを試験するため、RNAブ ロット分析をnim１系列で実施する。 RNAをこれらの系列のうちのWs及びLer植物から単離し（水又はINAもしくはBTH 処理の後）、そしてノーザンブロットを調製するのに用いる。これらのブロット をNIM１遺伝子座のDNAコンティグのクローンから単離したDNAフラグメントとハ イブリダイズさせる。異常RNA発現（サイズ又は濃度において異常）を有するnim １系 を特定するDNAフラグメントはNIM１遺伝子（の一部）を特定するようである。こ のDNAフラグメント及び周囲のDNAを配列決定し、そしてcDNAを単離するために用 い（ライブラリースクリーン又は逆転写PCRによる）、これも配列決定する。単 離したフラグメントが由来するクローン又はその単離したcDNAを、安定且つ一過 性の発現系におけるnim１表現型の補完を示すために用いる。 実施例３ NIM１遺伝子のDNA配列の決定 １．ゲノム配列決定 NIM１遺伝子を含みうるゲノムクローンを当業界において公知の方法を利用 して配列決定する。これらにはNIM１領域由来のBAC−04，Ｐ１−18及びコスミド が含まれる。例えば、このコスミドを制限酵素で消化し、そしてそのインサート に由来するフラグメントを汎用のベクター、例えばpUC18又はBluescriptにクロ ーニングする。大きめのＰ１及びBACクローンをランダムに剪断し、そしてフラ グメントを汎用ベクターの中にクローニングする。これらのベクター中のフラグ メントを慣用の方法（例えば「プライマー歩行」又はインサートの欠失の作製） により配列決定する。得られる配列を連続配列へと組立てる。 補完性クローンのインサート配列はNIM１遺伝子を含む。NIM１遺伝子のおよそ の始点及び終点を、DNA配列、TATAボックスの如き配列モチーフ、配列の中に存 在するオープンリーディングフレーム、コドン用法、コスミド補完データー、AF LPマーカーの相対位置及びまとめた追加の関連データーから推定する（下記実施 例４参照）。 ２．cDNA配列決定 NIM１遺伝子（上記実施例２記載）を含むコスミド又は大型のク ローンをcDNAの単離のために用いる。これは野生型アラビドプシス植物のcDNAラ イブラリーのスクリーニングにおいてプローブとしてこれらのクローン（又はDN Aフラグメント）を利用することにより成し遂げられる。単離したcDNAをコスミ ド配列決定について記載した通りに配列決定し、そして補完試験に用いた。これ により、全長cDNAが適当な植物発現ベクターの中に、構成プロモーターの後方に おいてクローニングされる。これらの構築体を上記の一過性アッセイに利用する 。他方、cDNAをバイナリーベクターの中にクローニングし、上記実施例２に記載 の如き、植物組織における発現及びアグロバクテリア媒介植物形質転換を可能に する。NIM１遺伝子を含むcDNA（補完、密接に連結したAFLPマーカーによる単離 、コスミドフラグメントによる単離、又はその他の推定により決定）が配列決定 される。 Ws−０及びnim１植物から遺伝子を単離し、そして配列決定する。これらの遺 伝子は、プローブとして単離されたNIM１遺伝子のフラグメントを用い、cDNAラ イブラリーのコスミドから得る。他方、これらの遺伝子又はcDNAをPCRにより、N IM１−遺伝子特異的プライマー及び鋳型としてのゲノムDNA又はcDNAを用いて単 離する。同様に、その他のnim１系由来のnim１アレル（上記実施例１．１参照） を単離し、そして同じようにして配列決定する。 実施例４ NIM１遺伝子及び推定タンパク質配列の詳細 NIM１遺伝子又はcDNAのDNA配列を上記実施例３に記載の通りにして決定する 。この配列をDNA分析プログラム、例えばGenetics Computer Group（GCG）パッ ケージ、Sequencer又はStadenパッケージ、又は任意の類似のDNA分析プログラム パッケージにおいて見い出せるものを利用して分析する。 詳しくは、遺伝子の始点及び終点を、オープンリーディングフレーム分析、終 止及び潜在的な開始コドン、潜在的なプロモーターモチーフ（例えばTATAボック ス）の存在、ポリアデニル化シグナルの存在、等に基づき決定する。また、推定 アミノ酸をオープンリーディングフレームから推定する。相同性をもつ配列、例 えば転写因子、酵素又はかかる遺伝子もしくはタンパク質のモチーフについての データーベースをサーチするのにDNA及びタンパク質配列の双方を使用する。 実施例５ NIM１相同体の単離 アラビドプシスNIM１遺伝子は、その他の植物種からNIM１相同体を単離するた めのゲノム又はcDNAライブラリーの低ストリンジェンシーハイブリダイゼーショ ンスクリーニングにおいてプローブとして使用できうる。他方、これはアラビド プシスNIM１遺伝子配列を基礎としてデザインされたプライマー及び鋳型として のゲノムDNA又はcDNAを用いるPCR増幅により成し遂げられる。NIM１遺伝子はト ウモロコシ、コムギ、コメ、オオムギ、ナタネ、テンサイ、ポテト、トマト、ソ ラマメ、キュウリ、グレープ、タバコ及びその他の注目の作物から単離し、そし て配列決定できうる。NIM１遺伝子から配列セットが得られたら、PCRにより一層 遠縁の植物種からNIM１相同体を単離するために新しいプライマーをこの遺伝子 の保存部分からデザインすることができる。 実施例６ ゲノムフラグメントによるnim１−１遺伝子の補完 １．コスミドコンティグの構築 NIM１領域のコスミドコンティグをBAC04，BAC06及びＰ１−18由来のCsCl精 製DNAを用いて構築した。３つのクローンのDNAを等モ ル量で混合し、そして制限酵素Sau3Aで部分消化した。20〜25kbのフラグメント をスクロース勾配を利用して単離し、プールし、そしてdATP及びdGTPでフィル・ インした。プラスミドpCLD04541をＴ−DNAコスミドベクターとして用いた。この プラスミドは広宿主域pRK290を基礎とするレプリコン、細菌選択のためのテトラ サイクリン耐性遺伝子及び植物選択のためのnptII遺伝子を含む。このベクター をXhoＩで切断し、そしてdCTP及びdTTPでフィル・インした。調製したフラグメ ントを次にこのベクターにライゲーションさせた。このライゲーション混合物を パッケージングし、そしてＥ．コリ株XL１−blue MR(Stratugene)に形質導入さ せた。得られる形質転換体をBAC04，BAC06及びＰ１−18クローンとのハイブリダ イゼーションによりスクリーニングし、そして陽性クローンを単離した。コスミ ドDNAをこれらのクローンから単離し、そして鋳型DNAをECs EcoRＩ／MseＩ及びH indIII／MseＩを用いて調製した。得られるAFLPフィンガープリントパターンを 分析してコスミドクローンの順序を決定した。nim領域に広がる15の半重複コス ミドのセットを選別した（図13）。このコスミドDNAをEcoRＩ，PstＩ，BssHＩ及 びSgrA１でも制限処理した。これはコスミドインサートのサイズの推定及びAFLP フィンガープリントによる決定に従う様々なコスミド間の重複の確認を可能にす る。 ２． NIM1遺伝子を含むクローンの同定 NIM１領域に広がるクローンから作製したコスミドを、ヘルパー株HB101（pR K2013）との三親交配における接合転移を介してアグロバクテリア・トゥメファ シエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＡGL−１へと移動させた。次いでこれ らのコスミドを用い、真空浸透（Mindrinosら、1994，Cell 78，1089-1099）を 利用してカナマイシン感受性nim１−１アラビドプシス系を形質転換させた。浸 透済 み植物由来の種子を回収し、そして選択因子として50mg／mlのカナマイシンを含 むGMアガープレート上で発芽させた。コスミドDNAで形質転換された小植物のみ が選択因子を解毒し、そして生き抜いた。選択を生き抜いた苗木を栽培してから 約２週間後に土壌に移し、そして下記の通りにnim１表現型について試験した。n im１表現型をもはやもたない形質転換植物は機能性NIM１遺伝子を含むコスミド を特定する。 ３．形質転換のnim１表現型についての試験 土壌に移した植物をファイトトロンの中で、移してから約１週間成育させた。 300μｍのINAをクロミスターを用いて植物を完全に覆うように細いミストで適用 した。２日後、RNA抽出及びPR−１発現分析のために葉を回収した。次に植物に ペロノスポラ・パラシチカ（Peronospora parasitica）（EmWa単離体）をスプレ ーし、そして成育チャンバーの中の多湿条件下で19℃の日中／17℃の夜間温度及 び８ｈ明／16ｈ暗サイクルで成育させた。真菌感染の８〜10日後、植物を評価し 、そして真菌増殖について陽性又は陰性評価した。Ws及びnim１植物を同じよう にして処理し、各実験のためのコントロールとした。 全RNAをLiCl／フェノール抽出バッファー(Verwoerdら、NAR 17：2362)を用い て回収組織から抽出した。RNAサンプルをホルムアルデヒドアガロースゲル上に 泳動させ、そしてGeneScreen Plus（Du Pont）膜にブロッティングした。ブロッ トを32Ｐ−ラベル化PR−１ cDNAプローブとハイブリダイズさせた。得られるブ ロットをフィルム露出させ、どの形質転換体がINA処理後にPR−１発現を誘導で きるかを決定した。これらの結果を表16にまとめる。 表16はコスミドクローンによるnim１表現型の補完を示す。 実施例７ 9.9kbのNIM１遺伝子領域の配列決定 BAC04 DNA(25μｇ；Key Geneより獲得）を配列分析のために用いるDNAの起源 とした。このBACはnim１突然変異を補完する領域を完全に包括するクローンであ ることが示された。DNAをCold Sprin g Harbor由来の手法を利用してランダムに剪断した。簡単には、BAC DNAをネブ ライザーで約２kbの平均分子量へと剪断した。剪断フラグメントの先端をdNTP， Ｔ４DNAポリメラーゼ及びクレノウフラグメント（Boehringer）による二段プロ トコールで修復した。先端修復DNAを１％の低融点アガロースゲルに流し、そし て1.3kbと2.0kbとの間の領域をゲルから切り出した。DNAを凍結−融解アプロー チによりこのゲルフラグメントから単離した。次にDNAをEcoRＶ消化pBRKan Ｆ４ と混合し、そして４℃で一夜かけてライゲーションさせた。pBRKan Ｆ４はKolav i Bhat G．Vanderbilt大学より入手したpBRKan Ｆ１の誘導体である（Blat，K． S.，Gene 134(1)，83-87（1993））。Ｅ．コリ株DH５ａをこのライゲーション混 合物で形質転換させ、そしてこの形質転換混合物をカナマイシン及びＸ−galを 含むプレート上でプレート培養した。1600の白色又は薄い青色のKanRコロニーを プラスミド単離のために選択した。個々のコロニーを1.5mlのTB＋Kan（50μｇ／ ml）を含む96穴深底プレート(Polyfiltronics，＃Ｕ508)の中へと拾い上げた。 プレートにカバーをかけ、そしてローテーティングプラットホームシェーカー上 に37℃で16時間載せておいた。プラスミドDNAをWizard Plus 9600Miniprepシス テム(Promega，＃Ａ7000)を用い、製造者の仕様に従って単離した。 プラスミドをDye Terminator chemistry(Applied Biosystems PRISM Dye Term inator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit，P/N 402078)及びプラスミドの 両鎖を配列決定するためにデザインしたプライマーを用いて配列決定した。デー ターをABI 377 DNAシーケンサー上に集めた。これらの反応体の約75％が有用な 配列情報を提供した。配列をSequencher 3.0(Gene Codes Corporation)，Staden gap 4（Roger Staden，ｅ−メールアドレスrs＠mrc−1mb，ca m．ac．uk)及びPHRED(Phil Green，ｅ−メールアドレスphg＠ｕ．washington．e du)を用いて編集し、そしてコンティグへと組立てた。最大のコンティグ（約76k b）は平均深さ７の独立コール／ベース（independent calls/base）に至る補完 性領域をカバーした。 コスミドＥ１及びＤ７の重複により規定された約9.9kbの領域はnim１領域を含 むことが補完分析により同定された。ベクターの挿入部位に隣接し、且つコスミ ド骨格に特異的なプライマーをオリゴ5.0プライマー分析ソフトウェア（Nationa l Biosciences，Inc.）を利用してデザインした。DNAを酢酸アンモニウム法の改 良（Traynor，P．L.，1990，Bio Techniques 9（6）：676）を利用してコスミド Ｄ７及びＥ１から単離した。このDNAを上記のDye Terminatorchemistryを利用し て配列決定した。得られる配列は補完性領域の終点を決定する。 BamHＩ−EcoRＶフラグメントのトランケーションバージョンも構築し、「遺伝 子３」領域を全く含まない構築体を得た（図13）。以下のアプローチがDNAのBam -Spe領域におけるHindIII部位の存在に基づき必要とされた。BamHＩ−EcoRＶ構 築体をSpeＩで完全に消化し、次いで二重消化のために２つの独立の反応体へと 分けた。一方のアリコートをBamHＩで消化し、他方はHindIIIで消化した。2l8bp のBamHＩ−SpeＩフラグメント及び1588bpのHindIII−SpeＩフラグメントをアガ ロースゲル（Qia Quick Gel抽出キット）から単離し、そしてBamHＩ−HindIII消 化pSGCGO1にライゲーションさせた。DH５ａをこのライゲーション混合物で形質 転換させた。得られるコロニーを、Wizard Magic MiniPreps (Promega)を利用す るDNAの調製の後、HindIIIによる消化により正しいインサートについてスクリー ニングした。正しい構築体を含むクローンをアラビドプシス植物の形質転換のた めにアグロバクテリア株GV3101へとエレクトロポレ ーションした。 実施例８ アレル配列決定によるNIM１遺伝子領域の同定 １．遺伝子分析 nim１表現型を表示する様々な突然変異体の優位を決定するため、野生型植 物由来の花粉をnim−１，−２，−３，−４，−５，−６の柱頭に移した。もし 突然変異が優位なら、得られるＦ１植物においてnim１表現型が観察されるであ ろう。もし突然変異が劣位なら、得られるＦ１植物は野生型表現型を示すであろ う。 表17に示すデーターはnim−１，−２，−３，−４及び−６を野生型と交配さ せると、得られるＦ１が野生型表現型を示すことを示す。かくして、これらの突 然変異は劣位である。対照的に、nim１−５×野生型Ｆ１子孫は全てnim１表現型 を示し、これが優性突然変異であることを示唆する。INA処理後、野生型植物に おいてＰ．パラシチカ小胞子形成は観察されず、一方Ｆ１植物はＰ．パラシチカ の成育及び多少の小胞子形式を支持した。しかしながら、これらのＦ１植物にお けるnim１表現型はnim１−５がホモ接合性であるときにはあまりひどく観察され なかった。 対立性を決定するため、カナマイシン耐性nim１−１突然変異植物由来の花粉 をnim１−２，−３，−４，−５，−６の柱頭に移した。この交配に由来する種 子を25μｇ／mlにてカナマイシンを含むMurashige-Skoog Ｂ５プレート上にプレ ート培養し、種子のハイブリド起源を確認した。カナマイシン耐性（Ｆ１）植物 を土壌に移し、そしてnim１表現型についてアッセイした。nim１−５突然変異体 とWs野生型との交配のＦ１子孫はnim１表現型を示すため、nim１−５×nim１− １ Ｆ２の分析も実施した。 表17において示すように、得られるＦ１植物全てがnim１−１表現型を示した 。かくして、nim１−２，−３，−４，−５，−６における突然変異はnim１−１ により補完されなかった：これらの植物は全て同じ補完群に属し、それ故アレル である。nim１−５×ｎ im１−１由来のＦ２子孫の分析もnim１表現型を示し、nim１−５がnim１アレル であることを確認した。 ２． NIM１領域の配列分析及びサブクローニング NIM１領域を含む9.9kbの領域をSequencher 3.0及びGCGパッケージを利用して ６つのフレーム全てにおけるオープンリーディングフレームの存在について分析 した。大ORFを含む４つ領域が可能性遺伝子として同定された（遺伝子領域１〜 ４）。これら４つの領域を野生型親及び６種類のnim１アレル変異性のDNAからPC R増幅させた。これらの増幅のためのプライマーをオリゴ5.0(National Bioscien ces，Inc.)を利用して選定し、そしてIntegrated DNA Technologies，Inc．によ り合成した。PCR生成物を1.0％のアガロースゲルで分離し、そしてQlAquick Gel 抽出キットを用いて精製した。精製したゲノムPCR生成物を一次増幅のために用 いたプライマー及びこの一次プライマーによりカバーされない任意の領域を配列 決定するためにデザインされた追加のプライマーを利用して直接配列決定した。 これらの遺伝子領域の平均適用範囲は3.5解読／塩基である。 配列をSequencher 3.0を用いて編集し、そして集成した。様々なnim１アレル に特異的な塩基変化は遺伝子領域２と表示された領域においてのみ同定された。 表18に挙げる位置は図14に関連し、且つ図13に示す9.9kbの領域の上部鎖に関 する。図13において１，２，３及び４で記載する遺伝子領域由来のオープンリー ディングフレームを配列決定し、そして種々のnim１アレルにおける変化を表に 示す。記述の変化は、図13に関連する通り、上部鎖５φ〜３φ上にある。 NIM１遺伝子がクローニングされ、そして遺伝子領域２にあることが明らか であり、なぜなら全ての６種のnim１アレルにおける遺 伝子領域２のオープンリーディングフレーム内に配列のアミノ酸変化又は変更が あるからである。同時に、nim１アレルの少なくとも一つが遺伝子領域１，３及 び４内のオープンリーディングフレームにおいて変化を示さなかった。従って、 NIM１でありうる9.9kb領域内の唯一の遺伝子は遺伝子領域２、NIM１遺伝子であ る。 表18のWsセクションはアラビドプシスのコロンビア・エコタイプに対するアラ ビドプシスのWsエコタイプにおける変化を示唆する。図13，14，15及び配列を示 すその他全てが、我々の行った実験において野生型遺伝子を含むアラビドプシス のコロンビアエコタイプに近縁する。その変化は遺伝子２又はNIM１領域内のア ミノ酸変化として示し、且つその他の領域における塩基対の変化として示す。 図13はNIM１遺伝子のクローニングを示し、且つ全9.9kb領域を示す４枚の異な るパネルを示す。図14は図13に示すのと同じ方向における全9.9kb領域の配列を 示す。図15は図13に示す遺伝子領域２である特異的なNIM１遺伝子領域の配列で ある；図15の配列はNIM１遺伝子を含む。図15は一文字コードにおいてアミノ酸 配列を示し、そして当該DNA配列において大文字で得られた全長cDNA及びRACE生 成物を示す。発見されたいくつかのアレル突然変異を当該DNA配列の上に示し、 そして変化した特定のnim１アレルを示している。 当該領域の配列分析及び様々なnim１アレル（下記参照）の配列決定はnim１遺 伝子を含むコスミド領域の同定を可能にする。この領域は〜5.3kbのBamHＩ−Eco RＶ制限フラグメントにより描写される。Ｄ７由来のコスミドDNA及びpBlue Scri ptII(pBSII)由来のプラスミドDNAをBamHＩ及びEcoRＶ（NEB）で消化した。Ｄ７ 由来の５.3kbのフラグメントをアガロースゲルから単離し、そしてQIA quickゲ ル抽出キット(＃28796，Qiagen)を利用して精製した。このフラグメントを一夜 かけてBam−EcoRＶ−消化pBSIIにライゲーショ ンさせ、そしてこのライゲーション混合物をＥ．コリ株DH５ａに形質転換した。 当該インサートを含むコロニーを選択し、DNAを単離し、そしてHindIIIによる消 化により確認を行った。Bam−EcoRＶフラグメントをアラビドプシスへの形質転 換のためにバイナリーベクター(pSGCG01)へと加工した。 ３．４種の遺伝子領域のノーザン分析 同一のノーザンブロットを過去に発表の通り（Delaneyら、1995，PNAS 92，66 02-6606）水−、SA−、BTH−及びINA−処理Ws及びnim１系から単離したサンプル より作った。これらのブロットを９.9kbのNIM１遺伝子領域において同定された ４種類の遺伝子領域から作製したPCR生成物とハイブリダイズさせた。NIM１遺伝 子を含む遺伝子領域（遺伝子領域２）のみがRNAサンプルとの検出可能なハイブ リダイゼーション性を有し、NIM１領域のみが検出可能な転写遺伝子を含むこと を示唆する（図16及び表18）。 表18はnim１アレル配列突然変異を示す。 表に記載の位置は9.9kbの配列を含む図14に関する。全てのアレルnim１−１〜 nim１−６はWS株である。コロンビア−０は野生型である。 我々は遺伝子領域２（図13）が更なる補完実験を行うことにより機能性NIM１ 遺伝子を含むことも実証した。遺伝子領域２を含むBamHＩ／HindIIIゲノムDNAフ ラグメントをコスミドＤ７から単離し、そしてカナマイシン耐性のための遺伝子 を含むバイナリーベクターpSGCG01にクローニングした（図13；Steve Goff、個 人的な連絡）。得られるプラスミドをアグロバクテリア株GV3101に形質転換し、 そして陽性クローンをカナマイシンにより選択した。PCRを利用して選定のコロ ニーがプラスミドを含むかを確認した。カナマイシン感受性nim１−１植物を前 述の通りにこの細菌で浸透せしめた。得られる種子を回収し、そして50μｇ／ml のカナマイシンを含むGMアガー上で栽培した。選択を生き抜いた植物を土壌に移 し、そして補完について試験した。形質転換植物及びコントロールWs及びnim１ 植物に300μｍのINAをスプレーした。２日後、葉をRNA抽出及びPR−１発現分析 のために回収した。次にこの植物にペロノスポラ・パラシチカ（EmWa単離体）を スプレーし、そして前述の通りに成育させた。真菌感染の10日後、植物を評価し 、そして真菌増殖について陽性又は陰性評価した。15種の形質転換植物の全て及 びWsコントロールはINA処理後に真菌増殖について陰性であり、一方nim１コント ロールは真菌増殖について陽性であった。これらの形質転換体及びコントロール についてRNAを上述の通りに抽出し、そして分析した。Wsコントロール及び全て の15種の形質転換体はINA処理後にPR−１遺伝子誘導を示し、一方nim１コントロ ールはINAによりPR−１誘導を示さなかった。 ４． NIM１ cDNAの単離 IYES発現ベクター（Elledgeら、1991，PNAS 88，1731-1735）において作製し たアラビドプシスcDNAライブラリーをプレート培養し、そしてプラークリフトを 実施した。フィルターをnim−１含有遺伝子領域から作製した32Ｐ−ラベル化PCR 生成物とハイブリダイズさせた。14の陽性体が約150,000のプラークのスクリー ニングより同定された。各プラークを精製し、そしてプラスミドDNAを回収した 。cDNAインサートをEcoRＩを用いてベクターから消化追い出しし、アガロースゲ ル精製し、そして配列決定した。最長のcDNAより得た配列を図15に示す。我々が cDNAの５φ末端を得たかを確認するため、Gibco BRL5'RACEキットをその製造者 の仕様に従って使用した。得られるRACE生成物を配列決定し、そして図15に示す 追加の塩基を含むことが見い出された。両cDNAクローンの中に存在し、且つRACE において検出された転写領域を図15で大文字で示す。アレルの変化をDNA鎖の上 に示す。大文字はcDNAクローンの中の又はRACE PCR後に検出された配列の存在を 示す。 実施例９ NIM１遺伝子の特性決定 多重配列アラインメントをClustal V(Higgins，Desmond G．andPaul M．Sharp (1989)，Fast and sensitive multiple sequencealignments on a microcompute r，CABIOS 5：151-153)を用い、Macintosh(1994)用のDNA*（1228 South Park St reet．Madison Wisconsin，53715）Lansergene Biocomputing Softwareパッケー ジの一部として構築した。 NIM１タンパク質の所定の領域はアミノ酸配列において４種のコメcDNAタン パク質生成物と相同性であることが決定された。相同性はGen Bank BLASTサーチ におけるNIM１配列を利用して同定した。 NIM１及びコメcDNA生成物における相同性領域の比較を図19に示す 。NIM１タンパク質フラグメントは４種のコメ生成物と36〜48％の同一性のアミ ノ酸配列を示す。 実施例10 様々なnim１アレルの表現型の特性決定 １．nim１アレルにおける化学反応性の分析 我々はPR遺伝子発現及びペロノスポラ・パラシチカ耐性の化学誘導の観点で様 々なnim１アレル間の相違を分析した（図17及び18参照）。 突然変異植物を化学誘導剤で処理し、そしてPR遺伝子発現及び病気耐性を処理 した。 ２．植物成育及び化学品適用 野生型種子及び各nim１アレル(nim１−１，−２，−３，−４，−５，−６)の 種子を、透明なプラスチックドームでカバーし、且つ暗所で４℃に放置したMetr o Mix 300成育培地上で３日間播種しておいた。３日間の４℃処理後、植物をフ ァイトトロンに２週間入れておいた。栽培して約２週間後、発芽した苗条は４枚 の真葉(true leaf)を供した。次いで植物をH2O，５mMのSA，300μＭのBTH又は30 0μＭのINAで処理した。化学品はクロミスターを用い、苗条を完全に覆うように 細いミストで塗布した。水コントロール植物を成育ファイトトロンにもどし、一 方化学処理した植物は別の場所に、しかしながら同じファイトトロンの中に保っ た。３日後、植物を２つのグループに分けた。第一グループはRNAの抽出及び分 析のために回収した。第二グループにはＰ．パラシチカを接種した。 ３．ペロノスポラ・パラシチカ接種及び分析 Ｐ．パラシチカ単離体「EmWa」はWsエコタイプに適合するP.p.単離体である。 適合性単離体とは特定の宿主に病気を引き起こすことのできるものをいう。Ｐ． パラシチカ単離体「NoCo」はWsに対して 非適合性であるが、コロンビア・エコタイプに対しては適合性である。非適合性 病原体は潜在性宿主により認識され、病気の進展を防ぐ宿主応答を誘導する。化 学品適用の３日後、水及び化学品処理植物に適合性「EmWa」単離体を接種した。 「NoCo」接種は水処理植物に対してのみ行った。接種後、植物に透明プラスチッ クドームをかぶせ、有効なＰ．パラシチカ感染のために必要な高湿度を保ち、そ して19℃の日中／17℃の夜間温度及び８ｈの明／16ｈの暗サイクルで成育チャン バーに入れておいた。 接種後様々な時点において植物を顕微鏡分析して発症を調べた。拡大すると真 菌の胞子形成が非常に早期の発症段階で観察されうる。接種の５ｄ，６ｄ，７ｄ ，11ｄ及び14ｄ目に胞子形成を示す植物／鉢を決定し、そして胞子形成密度も記 録した。 図18はＰ．パラシチカ接種後の様々なnim１アレルの病気評価を示す。最も際 立った時点は接種の５及び６日後である。接種後５日目ではnim１−４は実施し た全ての誘導化学品処理下で〜80％の感染症を示し、このアレル／ゲノタイプが 最悪の病気感受性を有することを示唆する。接種後６日目ではnim−１，−２， −３，−４及び−６は全ての誘導化学品処理下で著しい病気発症率を示した。し かしながら、nim１−５は６日目において全ての処理下でWs野生型より低い感染 症率を有する。nim１−２はBTH後では病気感受性に関して中間体のようであるが 、その他の誘導処理ではそうではないようである。 PR−１遺伝子発現はnim１−４が全ての処理誘導化学品に対して最も応答性が 低く（図17）、nim１−５が誘導剤なしで高まったPR−１発現レベルを示すこと を示唆する。これらのPR−１遺伝子発現の結果はＰ．パラシチカで実施した病気 評価と一致し（図18）、そしてnim１アレルが耐性又は感受性の原因でありうる ことを示唆す る。 以上で得られたサンプルをNIM１遺伝子発現を分析するために用いた（図17） 。野生型植物において、NIM１ mRNAが未処理コントロールサンプルの中に存在 していた。SA，INA，BTHによる処理又は適合性病原体による感染後、NIM１ mRN Aは高レベルへと蓄積した。野生型と比べ、NIM１メッセージ（mRNA）量の相違が nim１アレルにおいて観察された。未処理突然変異植物におけるNIM１ mRNAの量 は、その量が近いnim１−２及び−５を除き、野生型において観察されるものよ りも低かった。nim１−１，−３及び−４は低レベルのNIM１メッセージを有し、 一方nim１−６は非常にわずかなNIM１ mRNAの蓄積を有した。SA，INA又はBTHを 経たNIM１ mRNAの上昇がnim１−１，−２，−３で観察され、nim１−５又は６ では観察されなかった。しかしながら、この上昇は野生型植物において観察され るものよりも低かった。病原体感染の後、NIM１ cDNAプローブにハイブリダイ ズする追加のバンドが野生型及び突然変異体の双方において観察され、そしてNI M１ mRNAレベルはnim１−６を除き、未処理コントロールと比べ高かった。 図18はペロノスポラ・パラシチカの接種後様々な時間での様々なnim１アレル 及びNahG植物の感染等級を介する病気耐性評価を示す。WsWTはWs野生型親系を示 し、それにおいてnim１アレルが認められている。様々なnim１アレルを表に示し 、そしてNahG植物も示す。NahG植物は既に発表されている。（Delaneyら、Scien ce 266，pp．1247-1250(1994)）。NahGアラビドプシスもWO95/19443に記載され ている。 NahG遺伝子はシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）に由来するサリ チル酸をカテコールへと変換し、それ故植物におけるSARの必須シグナル変換成 成であるサリチル酸の蓄積を消失させる 遺伝子である。かくして、NahGアラビドプシス植物は正常SARを示さない。更に 、それらは一般に病原体に対するはるかに高い感受性を示す。従って、NahG植物 はある種の万能感受性コントロールを担う。更に、NahG植物は化学誘導剤INA及 びBTHに対して更に応答する。これは図17の下の２枚のパネルにおいて示す。 図18より、nim１−４及びnim１−６アレルはもっと厳しいようであることがわ かりうる。これはこの結果の章に前述した、また本図の最下部のパネルEmWa BTH パネルに記載の結果から、より早期の時間においてもっと容易に観察できる。更 に、nim１−５アレルはINA及びBTHの双方に対して最大の応答を示し、それ故最 弱のnim１アレルである。 NahG植物はINA及びBTHの双方に対して非常に良好な応答を示し、そしてnim１ −５アレルと非常に似ていた。しかしながら、図における11日目のように遅い時 点では、NahG植物において誘導された病気耐性は消え始め、そしてINAとBTHとの 間では、INA誘導耐性がBTHによりNahG植物において誘導された耐性よりもはるか に早く、且つ厳しく消失するという点で著しい相違がある。これらの実験におい て更に観察されるのは、INA及びBTHがWs〜EmWaにおいて非常に良好な耐性を誘導 し、そしてnim１−１，nim１−２及びその他のnim１アレルが病気耐性の観点で 、SA又はINAに対して事実上応答を示さないことである。 図18にはＰ．パラシチカのEmWa品種による感染後に胞子形成を示す植物のパー センテージが挙げられ、そして各棒グラフは病気耐性を等級づけした感染後の日 数を示す。 SAR遺伝子PR１の発現を分析するノーザン分析も図17に示すように同じサンプ ルで実施した。図17は、高いPR１遺伝子発現により実証される通り、野生型植物 がサリチレート、INA、BTH、そして更 には病原体感染に対して非常に良好な応答を示すことを示す。他方、nim１−１ アレルは病原体を含む全ての化学誘導剤に対して非常に制約された応答しか示さ ない。 病原体誘導はnim１−１アレルにおいて、野生型よりも数倍以上である。nim１ −２，nim１−３及びnim１−６アレルは様々な処理に対してnim１−１アレルと 似た応答を示す。しかしながら、nim１−４アレルは利用した任意の誘導剤に対 する発現を事実上示さない。基本的に、バックグランドレベルが観察される全て である。nim１−５アレルは水によるコントロールと比べ非常に高いバックグラ ンドレベルを示し、そしてそのバックグランドレベルは全ての処理において維持 された。しかしながら、化学誘導剤による誘導はわずか又はなかった。 NahG植物は良好なコントロールを担い、それらがSAの存在下でPR−１を誘導で きないことを示した。他方、INA及びBTHは共にPR−１の非常に強い高レベル発現 を誘導した。病原体感染症の効果はSAのそれと似ていた。EmWa処理NahG植物にお いてはPR−１の発現はなかった。 誘導研究において作られたこれらのRNAサンプルもプローブとして全長cDNAク ローンを用いてNIM１遺伝子によりプローピングした。図16において、INAは野生 型WsアレルにおけるNIM１遺伝子を誘導することがわかる。しかしながら、nim１ −１突然変異アレルはNIM１遺伝子の低い基底レベル発現を示し、そしてINAによ っては誘導されない。これはnim１−３アレル及びnim１−６アレルにおいて観察 されたものと似ていた。nim１−２アレルは未処理サンプルにおいてほぼ正常な レベルを示し、そしてnim１−４アレルのように、野生型サンプルと似た誘導を 示した。nim１−５アレルはNIM１遺伝子の高度な基底レベル発現を示し、そして 化学誘導剤によ り誘導したときははるかに強い発現を示した。 耐性の化学誘導剤又はその他の誘導剤によるNIM１の誘導は病原体防御におけ るその役割と一致し、そして更に我々が9.9kb領域の正しい遺伝子を獲得できた ことを証明する。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Genes that confer disease resistance on plants and their use   The present invention identifies disease resistance in plants and disease resistance in plants and Concerning giving qi tolerance. More specifically, the invention relates to a widespread disease in plants To the identification, isolation and characterization of genes involved in sexuality.   Plants are always attacked by a wide variety of pathogens such as viruses, bacteria, fungi and nematodes. Being shot. Crop plants are extremely vulnerable because they are usually genetically Because they grow as homogeneous monocultures; when ill, their losses are significant. It can be terrible.   However, most plants have their own innate defenses against pathogens Have a structure. Natural Variation in Resistance to Plant Pathogens Is Plant Propagator and Pathology It has been uniquely identified and has been provided to numerous crop plants. Such nature Genes often provide high levels of resistance or immunity to pathogens I do.   In many plant species, primary inoculation with necrotic pathogens will protect plants against subsequent infection. Can be immunized. This acquired disease resistance was first announced in 1901, and It seemed to play an important role in the preservation of natural plants. Planting The most well-identified examples of a substance's immunity are tobacco and Arabidopsis Of systemic acquired resistance (SAR) and induced resistance in plants such as cucumber and cucumber Type. In these systems, inoculation with a necrotic pathogen is moderate for that pathogen. Secondary to many other agriculturally important bacterial, fungal and viral pathogens Provides systemic protection against severe infections.   Systemic acquired resistance is a chemoimmune compound, an immune response in plants Can be attracted by certain chemicals that induce Such compounds are of natural origin For example, salicylic acid (SA) or synthetic chemicals such as 2,6-dichloroisoni Cotinic acid (INA) and benzo (1,2,3) thiadiasol-7-carbothioic acid S -Methyl ester (BTH). Treatment with pathogens or immune compounds is most Induce expression of at least 9 sets of genes in tobacco, a well-characterized species Lead. A wide variety of genes can be expressed in other plants. For immune compounds The induction level of the SAR-related genes induced by Height. In particular, SAR is characterized by the expression of SAR genes such as pathogen-related (PR) genes. You.   The SAR gene is induced after infection by a pathogen. Some of these genes are planted It plays a role in providing whole body acquired resistance to objects. Tampa of these plants Proteins are induced in large quantities in response to infection by various pathogens, such as viruses, bacteria and fungi. Be led. PR protein is sensitive to tobacco mosaic virus (TMV) infection First in responding tobacco plants (Nicotiana tabacum) Was discovered. Since then, PR proteins have been found in many plant species. (Redolfi et al. (1983)Neth J Plant Pathol 89: 245-254; Van Loon (1985)P lant Mol . Biol . 4: 111-116; and Uknes et al. (1992)Plant Cell 4: See 645-656 See). Such proteins are a common defense of plants against infection by pathogens It is believed to be a whole body response.   Pathogen-related proteins include, but are not limited to, SAR8.2a and SAR8.2b proteins Quality, acidic and basic forms of tobacco PR-Ia, PR-Ib and PR-Ic; PR-1 ', PR-2, PR-2 ', PR-2' ', PR-N, PR-O, PR-O', PR-4, PR-P, PR -Q, PR-S and PR-R major proteins; cucumber peroxidase; Uri Peru A chitinase which is a basic counterpart of PR-P or PR-Q; PR-2, PR- Beta-1,3-glucanase (glucanase) which is a basic counterpart of N or PR-O 1,3-beta-glucosidase EC 3.2.1.39); and cucumber Conventional pathogen-inducing chitinases. Such PR proteins are described, for example, by Uknes et al. (1992)The Plant Cell 4: 645-656 and the references therein.   SAR or SAR-like genes are expressed in all plant species exhibiting systemic acquired resistance . Expression of such genes can be determined by probing with known SAR DNA sequences. I can come. For example, Lawton et al. (1992) Proceedings of the Second European Feder ation of Plant Pathology (1983):Mechanisms of Defense Responses in Pla nts B. Fritig and M. Legrand (ed.), Kluwer Academic Publishers, Dordec ht, pp. 410-420; Uknes et al. (1992)The Plant Cell 4: 645-656; and Ward et al. ( 1991)The Plant Cell See 3: 1085-1094. Hybridization and Methods for cloning and cloning are well known in the art. For exampleMolecular Cloning , A Laboratory Manual , Second Edition, Vol. 1-3, Sambrook et al. (Eds.) Cold Spring Har See bor Laboratory Press (1989) and references therein.   On the other hand, such SAR or SAR-like genes can be used for protein screening, +/- Can be found by other methods such as training. For example, Liang and Pardee (19 92)Science 257: 967-971; and St. John and Davis (1979)Cell See 16: 443 That.   Numerous studies and sophisticated and intensive crop protection measures, such as genetic transformation of plants Despite the use of replacements, disease damage continues to be $ 100 billion annually . Disease resistance genes have been cloned so far; Transgenic plants that are typically transformed against certain strains of a particular pathogen species Only resistance Has become. Widespread despite efforts to clone genes involved in SAR Genes controlling various disease resistances have not been isolated and characterized.   Some systematic evidence suggests that endogenously produced SA may not recognize pathogen infection. It suggests that it is involved in a signaling pathway that leads to the development of SAR. Retains the ability to accumulate SA in response to pathogens, but has the ability to induce SAR genes Mutants that have lost force or resistance after the application of SA or INAProc . Natl. Acad. Sci . 92: 6602-6606 (1995) and incorporated herein by reference. WO94 / 16077.   These mutants control SAR gene expression and SAR itself in the wild form It has now been discovered that the gene contains In the present invention, the mutant gene is suddenly Confers broad disease susceptibility to mutant plants and induces them to pathogens and chemicals It was recognized that it was non-inducible to the agent.   The present invention relates to the identification, isolation and characterization of the wild-type (NIM1) gene, Genes are SAR or SAR gene expression in plants responsive to biological and chemical inducers Exerts activation.   Mutant genes have been identified in mutant Arabidopsis plants. these Plants do not express genes associated with systemic acquired resistance (SAR) and Incompetent in its normal response to pathogen infection in that it cannot express Have been found. These mutants are labeled nim1 (non-inducible immunity). Therefore, the defective gene is included.   The present invention also relates to a clone for constructing a transgenic plant having a broad range of disease resistance. Of the NIM1 gene and its mutants Related to transgenic plants. The invention further provides A tool for identifying compounds that can induce broad-spectrum disease resistance in plants Use of cloned NIM1 gene and its mutants in cleaning method Consider. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   Figure 1 shows the chemical induction of PR gene expression in wild-type and nim1 genes. Shows the effect of the agent.   FIG. 2 shows the pathogen-infected Ws-0 and nim1 plants for 6 days from the start of infection. 1 shows PR-1 gene expression.   FIG. In Ws-0 and nim1 plants infected with P. syringae Indicates the SA accumulation level.   FIG. 4 shows a genetic map of the NIM1 region determined by AFLP and SSLP analysis.   FIG. 5 shows a physical map of the NIM1 region determined by YAC clone analysis.   FIG. 6 shows a physical map of the extended P1 / BAC contig.   FIG. 7 shows the position of P1 and BAC clones in relation to adjacent AFLP markers and YAC. Is shown on the physical map.   FIG. 8 shows a physical map of the further expanded P1 / BAC contig containing the NIM1 gene. You.   FIG. 9 shows a comprehensive gene and physical detail map of the NIM1 region.   FIG. 10 shows a comprehensive map of the NIM1 area.   FIG. 11 shows a comprehensive map of the NIM1 region including the new AFLP marker.   FIG. 12 is a schematic diagram of the recombinants D169 and C105.   FIG. 13 shows recombinants containing BAC, YAC and cosmid in the NIM1 region. 1 is an overall map of a chromosome region centered at 1.   FIG. 14 shows the arrangement of the 9.9 kb region of clone BAC-04 containing the NIM1 gene. Indicates a column.   FIG. 15 shows the nucleic acid sequence of the NIM1 gene including changes in various alleles and NIM1 1 shows the amino acid sequence of the gene product.   FIG. 16 shows INA, BTH, and SA in wild-type and mutant alleles (alleles) of nim1. And NIM1 expression induced by the pathogen.   FIG. 17 shows the expression of PR-1 in nim1 mutant and wild type plants.   FIG. 18 shows disease resistance of various nim1 mutants.   FIG. 19 shows the NIM1 protein and the cDNA protein products of the four rice gene sequences. This is a comparison of the amino acid sequence of the tag region of the expressed sequence (see SEQ ID NO: 3).Definition   AA: amino acid   AFLP: amplified fragment length polymorph   avrRpt2: isolated from Pseudomonas syringae             Non-virulent gene Rpt2   BAC: Bacterial artificial chromosome   BTH: S-methylbenzo (1,2,3) thiadiasol-7-carbothioate         Steal   Col: Arabidopsis Ecotype Colombia         (Arabidopsis ecotype Columbia)   ECs: Combination of enzymes   INA: 2,6-dichloroisonicotinic acid   Ler: Arabidopsis Ecotype Ransburg Elekta         (Arabidopsis ecotype Landsberg erecta)   NIM1: Wild-type gene that confers disease resistance on plants   nim: Mutant allele of NIM1 that confers disease susceptibility to plants   nim1: Mutant plant line   ORF: Open reading frame   PCs: primer combinations   SA: salicylic acid   SAR: whole body acquired resistance   SSLP: Simple array length polymorph   Ws-0: Arabidopsis Ecotype / Washil Uskija           (Arapidosis ecotype Wassilewskija)   YAC: Yeast artificial chromosome     The NIM1 gene has been cloned by mapping and walking techniques, This gene was shown to be contained in the 〜105 kb region (see FIG. 13 and Table 16). This area is drawn by the L84.6b marker on the left and the L84.T2 marker on the right. I have. Only three overlapping cosmids made from this 105 kb region wild-type DNA were nim One mutant phenotype was complemented (Figure 13 and Table 16). These three cosmids are shown in FIG. 9.9 kDa defined by the left end of cosmid clone D7 and the right end of cosmid D5 It overlaps only in region b. Provided for the other region of this 105kb region Numerous other cosmids did not complement the nim1 phenotype (FIG. 13 and Table 16). N Near-full-length cDNA clones for the IM1 gene should have appropriate intron-exit boundaries. And defines the amino acid sequence of the gene product. Within the 9.9 kb region of complementarity Only the NIM1 gene region has sequence variation in various nim1 mutant alleles (Table 18). Three other potential gene regions are associated with the nim1 phenotype No sequence change was indicated. Sequence changes found in the NIM1 gene region Consistent with modification or loss of function of the gene product. In specific mutant alleles The degree of change to the NIM1 gene region depends on the observed physiology of the nim1 allele. It was roughly correlated with the clinical extent. RNA (transcription) detectable only in NIM1 region And this RNA has abundant alterations consistent with the physiological role of NIM1 in pathogenesis (Table 18 and FIG. 16).   The present invention relates to the isolated gene fragment NIM1 gene, which is Is an important component of the whole-body acquired resistance (SAR) pathway in humans. NIM1 gene is chemical and raw Involved in the activation of SAR by physical inducers, and together with such inducers And required for SAR gene expression.   The location of the NIM gene is a mutant plant known to carry a mutated nim1 gene. Of the mutant nim1 gene Offspring make host plants significantly more susceptible to a wide variety of pathogens and This makes it impossible to respond to SAR chemical inducers.     The nim1 mutant is a strain of host plant pathogens and Does not infect host plants, but is susceptible to pathogens that infect other hosts Is useful as a “universal disease susceptibility” (UDS) plant. They are The seed or other biological material is treated with a mutagen and the progeny UDS phenotype by treatment with a known chemical inducer of acquired response (eg INA) Screening offspring plants and then infecting them with known pathogens Can be created by Non-inducible mutants are severe in these circumstances Non-mutants develop chemical acquired chemical resistance to systemic acquired resistance Be guided. The nim mutant is a mutation produced by chemical and irradiation mutagenesis. Heterogeneous and produced by T-DNA insertion and transposon-induced mutagenesis It can be similarly selected from a mutant population.   Techniques for making mutant plant lines are known in the art. The nim plant phenotype is an isolated residue that allows for the development of widespread disease resistance in plants It is used as a tool to identify gene fragments.   The present invention relates to an isolated gene comprising a mutant gene of the NIM1 gene, which is the nim1 gene. Comprising isolated DNA molecules.   Ni to isolate the wild-type NIM1 gene required for constitutive expression of the SAR gene In accordance with the use of the m1 mutant or plant, resistant traits were identified as important for production and quality. Can be incorporated into plant systems through reproduction. example For example, Welsh J. R.,Fundamentals of Plant Genetics and Breeding, John Wiley  & Sons, NY (1981);Crop BreedingWood D. R. (Ed.) American Society o f Agronomy Madison, Wisconsin (1983); Mayo O.,The Theory of Plant Bree ding Singh, D., Second Edition, Clarendon Press, Oxford (1987); P.,Breeding fo r Resistance to Diseases and Insect Pests , Springer-Verlag, NY (1986); And Wricke and Weber,Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding See Walter de Gruyter and Co., Berlin (1986).   It is a further object of the present invention to provide an NIM1 gene product Active in plants operably linked to a heterologous DNA molecule encoding a noic acid sequence This is a chimeric gene comprising a novel promoter.   Methodologies for constructing plant expression cassettes and introducing foreign DNA into plants are well known in the art. In the public. Generally, regarding the introduction of foreign DNA into plants, Ti plasmid vectors have been used for transport of foreign DNA. Of such transport Further uses for direct DNA uptake, liposomes, and electroporation , Microinjection and microprojectile. Take Methods are published in the art. For example, Bilang et al. (1991) Gene 100: 24 7-250; Scheid et al. (1991)Mol . Gen. Genet. 228: 104-112; Guerche et al. (1987)Plant Science  52: 111-116; Neuhause et al. (1987)Theor . Appl. Genet. 75: 30- 36; Klein et al. (1987)Nature 327: 70-73; Howell et al. (1980)Science 208: 1265 Horsch et al. (1985)Science 227: 1229-1231; DeBlock et al. (1989)Plant Physiol ogy  91: 694-701;Methods for Plant Molecular Biology(Weissbach and Weis sbach, eds.) Academic Press, Inc. (1988) andMethods in Plant Molecular B iology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press, Inc. (1989) When. Also, U.S. patent application Ser. No. 08 / 438,666, which is incorporated herein by reference. No., filed May 10, 1995 and WO 93/07278. Transformation method is trait It is understood that it will depend on the plant cell to be transformed.   Furthermore, it has been found that the components of the expression cassette can be modified to enhance expression. Is known. For example, truncation sequences, nucleotide substitutions or other Modifications can be employed. Plant cells transformed by such a modified expression system are May show overexpression or constitutive expression of the SAR gene required for SAR activation. U.   DNA molecules that confer disease resistance on plants by inducing SAR gene expression or Gene fragments are assembled into plant or bacterial cells using conventional recombinant DNA techniques. Can be included. Generally, this means that the DNA molecule is foreign to it (ie, (Usually absent) inserting the DNA molecule into an expression system. this Heterologous DNA molecules must be expressed in the correct orientation and in the correct reading frame. Into the monitor. This vector transcribes the inserted protein coding sequence and Contains essential elements for translation. Known in the industry Numerous vector systems such as plasmids, bacteriophage viruses and Other modified viruses can be utilized. Suitable vectors include, without limitation, Viral vectors such as the lambda vector systems Igtll, Igt10 and Sharon 4; Sumid vectors such as pBI121, pBR322, pACYC177, pACYC184, pAR series, p KK223-3, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pRK290, pKC37, pKC101, pCDNAI I; and other similar systems. The DNA sequence is from Maniatis et al.Molecular Cloning : A Laboratory Manual , Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982) using standard cloning procedures in the art as described in the art. Can be cloned into   A further object of the invention is a recombinant vector comprising a chimeric gene according to the invention. is there.   To obtain efficient expression of the gene or gene fragment of the present invention, Must be present in the expression vector. RNA polymerase It binds to a constant promoter and initiates transcription of the gene. The promoter , Ie, the ability to promote transcription. Depends on the host cell system used Thus, any of a number of suitable promoters may be used. Suitable promoter Ubiquinone, nos promoter, small subunit ribulose bisphosphate Carboxylase gene promoter, small subunit chlorophyll A / B Binding polypeptide promoter, cauliflower mosaic virus 35S promoter And promoters isolated from plant genes. This small sub C. discloses a knit material. E. Vallejos, et al. `` Localization in the Tomato Genom e of DNA Restriction Fragments Containing Sequences Homologous to theRR NA (45S), the major chlorophyllA / BBinding Poly peptide and the Ribulose Bisphosphate Carboxylase Genes, ''Genetics 112: 93-105 (1986). nos promoter and cauliflower mosaic will The S35S promoter is known in the art.   Once the disease resistance gene of the present invention has been cloned into an expression system, it is Can be easily transformed into vesicles. Suitable plant tissues for transformation include leaf tissues, Root tissue and protoplasts.   Bacteria from the genus Agrobacterium for plant cell transformation Can be used for Suitable species of such bacteria include Agrobacterium tumefaciae (A. tumefaciens) and Agrobacterium rhizogens (A. rhizogens) No. Agrobacterium tumefaciens (eg, LBA 4404 or EH A 105 strain) is extremely useful because of its well-known ability to transform plants.   Inert or biological for other approaches to transforming plant cells with genes Spraying highly active particles onto plant tissues and cells. This technology is all Sa and nford et al., US Pat. Nos. 4,945,050; 5,036,006; and 5,100,792. . In general, this procedure involves applying inert or biologically active particles to cells Including jetting under conditions that are efficient to penetrate the layer and become incorporated into the cells. No. If inert particles are used, the vector will transfer the particles into the cells as desired. It can be introduced by coating with a vector containing the offspring. On the other hand, this target The cells are coated with the vector, which allows the vector to pass through the footprint of the particles. It can be carried into cells. Biologically active particles (e.g. For example, dried yeast cells, dried bacteria, or bacteriophage ) Can also be injected into the plant cell tissue.   The isolated gene fragments of the present invention can be used in a wide variety of plant cells, such as , Monocots and dicots can be used to confer disease resistance. Insert the gene into any plant cell belonging to such a broad class Can be produced from crop plant cells such as rice, wheat, barley, rye, Corn, potato, carrot, sweet potato, sugar beet, kidney beans bean), peas, chicory, lettuce, cabbage, cauliflower, broccoli , Turnip, radish, spinach, asparagus, onion, garlic, Eggplant, pepper, celery, carrot, squash, pumpkin, zucchini, ki Yuri, apple, pear, quince, melon, plum, cherry, peach, nectari , Apricot, strawberry, grape, raspberry, blackberry, pineapple Pull, avocado, papaya, mango, banana, soybean, tobacco, tomato, moroko Very useful in sugar cane and sugar cane.   The expression system of the present invention is useful for transforming virtually all crop plants under appropriate conditions. Can be used. Transformed cells are transformed into whole plants and transgenic plants whose genes are incomplete. It can be regenerated by conferring disease resistance on things. As mentioned above, This expression system modifies disease resistance genes to be expressed continuously or constitutively be able to. Transformation   The system can be used in any plant that can be transformed and regenerated. Transformation And such methods for regeneration are known in the art. Same as above So, An, G. Watson, B .; D., and Chiang, C. C. Transformation of tobacco , Tomato, potato, and Arabidopsis thaliana using a binary Tivector syste m. Plant Physiol. 81: 301-305, 1986; Fry, J., Barnason, A., and Horsch, R. B. Transformation of Brassica napus with Agrobacterium tumefaciens ba sed vectors. Pl. Cell Rep. 6: 321-325, 1987; Block, M .; d. Genotype inde pendent leaf disc transformation of potato (Solanum tuberosum) using Agr bacterium tumefaciens. Theor. appl. genet. 76: 767-774, 1988; Deblock, M., Brouwer, D. D., and Tenning, P.E. 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See also Plant Science 1994 97: 83-94, 1995 .     nim1 host plants are pathogens other than those to which they normally belong. Because these plants may also be susceptible to these Also have significant uses in genetic and biological research. In addition, U of the nim1 plant The DS phenotype makes them useful for fungicide screening. specific Smell of the host The selected nim1 mutant is a killer that utilizes this host and its pathogens. It has outstanding utility for screening fungal agents. The advantage is a mutant UDS phenotype, which indicates that the host is differentially susceptible to various pathogens and pathogen types. Sexual or may be resistant to some pathogens or types Solve the problems encountered.   Pathogens of the present invention include, but are not limited to, viruses or viroids, such as taba. Ko or cucumber mosaic virus, ring spot virus or necrotic virus, Pelargonium leaf curl virus, red clover spots Viruses such as mottle virus and tomato bushy stunt virus; fungi, For example, Phythophthora parasitica and Peronospo La Tabasina (Peronospora tabacina); a bacterium, such as Pseudomonas sylin And Pseudomonas tabaci, insects such as aphids, such as Myzus persicae; and lepidoptera such as Helios (He1) iothus) species; and nematodes, for example, Meloidogyne incognita gnita). The method of the present invention is useful for many diseased corn organisms, for example, Without limitation, fimbrial powder flour pathogens, such as Scleropsola macrospora (Scleropthora macrospora), S. rayissiae, Sclerospora graminicola, Peronos Clerospo La Sagi (Peronosclerospora sorghi), Peronosclerospora philippine P. philippinensis, P. sacchari And P. maydis; rust pathogens, e.g. Puccinia sorphi, P. polysora and And Physopella z eae); other fungi, such as Cercospora z eae-maydis), Colletotrichum graminicola , Fusarium monoliforme, Gibberella Zea (G ibberella zeae), Exserohilum turcicam, mosquito Kabatiellu zeae and Bipolaris mayis (Bioplaris may) dis); and bacteria, such as Erwinia stewartii Is useful forDescription of Sequence Listing   SEQ ID NO: 1—9919 bp genomic sequence of FIG.   SEQ ID NO: 2—5655 bp genomic sequence of FIG.   SEQ ID NO: 3-wild type encoded by cds of SEQ ID NO: 2 AA sequence of NIM protein   SEQ ID NO: 4-Rice-1AA sequence 33-155 in FIG.   SEQ ID NO: 5-Rice-1AA sequence 215-328 of FIG.   SEQ ID NO: 6-Rice-2AA sequence 33-155 in FIG.   SEQ ID NO: 7—Rice-2AA sequence in FIG. 19 208-288   SEQ ID NO: 8—Rice-3AA sequence 33-155 in FIG.   SEQ ID NO: 9—Rice-3AA sequence 208-288 in FIG.   SEQ ID NO: 10—Rice-4AA sequence 33-155 in FIG.   SEQ ID NO: 11—Rice-4AA sequence 215-271 in FIG. 19Deposit   The following vector molecules are from the American Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive Rockville, MD 20852, deposited with the United States on the following dates:   Plasmid BAC-04 was deposited with the ATCC on May 8, 1996 as ATCC 97543.   Plasmid P1-18 was deposited with the ATCC on July 13, 1996 as ATCC 97606.   Cosmid D7 was deposited with the ATCC on September 25, 1996 as ATCC 97736.Example   Example 1   Identification of NIM clones by map-based cloning. N in Arabidopsis High resolution gene mapping and physical mapping of IM1.   1. Isolation of plant material and nim1 mutant     The nim1 mutant is available from Delaney et al. (1995) PNAS92, 6602-6606, 2 Isolated from two Arabidopsis ecotype Ws-0 plant populations. One mutation The population consisted of ethyl methanesulfonate (EMS) mutant seeds (Lehle, Round Rock, TX And the other is in the form of an M2 library from Ohio University Species obtained from the Arabidopsis Biological Resource Center (Columbus, OH) It is in the form of a T-DNA population derived from offspring.   The basis for screening for non-induced immunity (nim1) mutants was Bill Resistance to rent pathogens is induced by INA (2,6 dichloroisonicotinic acid) Screening of mutant plant populations for plants to be harvested (Metraux et al., 199 1: Advances in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interactions. Vol 1, 432-439, Hennecke and Verma, eds .; Kessmann et al. 1993; Mode of action of agroc. chemicals. Y. Honma, Vernooij et al. 1995 Molec. Pl. Microbe Interaction 8, 2 28-234).   Plants from the mutant population are planted in commercial trays at high density and in large trays. And grew in the box. The plant is two weeks old Then, the tray was sprayed with 0.25 mg / ml INA. Four days later, the plants were replaced with Peronospora pa 5 × 10 5 spore suspensions of Lasica depot EmWa (EmWa)Four~ 1 × 10FiveBlow with individual spores / ml Squeezed. This fungus is usually found in these plants by INA or similar compounds. Unless resistance was first induced, against the Arabidopsis Ws-0 ecotype Virulent.   Plants with visible pathological symptoms after incubation in low humidity environment , Typically 7 days after infection. These plants are responsible for resistance-inducing chemicals. Shows no resistance to fungi despite application, thus potential nim (non-immune) It was a mutant plant. From 360,000 plants, 75 potential nim mutants were identified Was decided.   Remove these potential mutant plants from the flat and place them in low humidity conditions. And let them enter the fruiting season. Sensitivity of seed-derived plants to the fungus EmWa In the same manner as above, screening was again performed after pretreatment with INA. 6 n The im system was thus identified. One line (min1) is from the T-DNA population and 5 Were isolated from the EMS population.   2. Evaluation of plant response to INA and other chemical inducers of disease resistance   Phenotypic analysis of i nim1   Salicylic acid (SA) and benzo (1,2,3) thiadiasol-7-carbothioic acid S-methyl ester (BTH), like INA, has widespread disease resistance in wild-type plants, There are two chemicals that induce so-called systemic acquired resistance (SAR). INA is nim1 These plants were pretreated with SA and BTH to not induce tolerance in the plants. The disease resistance response was then evaluated.   Spray plants with 1, 5 or 15 mM SA or 0.25 mg / ml BTH The mice were challenged 5 days later with EmWa challenge (as described in Example 1 above). SA and And BTH are both manifested by the presence of disease symptoms and fungal growth on these plants. As a result, the nim1 plant could not be protected from fungal infection. That is, nim1 plants Are not responsive to SAR-inducing chemicals, and mutations It means downstream of the point of introduction of these chemicals.     nim1 is classified into two types of incompatible P.N. The Palatika isolates Wela and Noco (ie, These fungal strains do not cause disease in wild-type Ws-0 plants). Qi response was also evaluated. nim1 plant with 5-10 × 10 of Wela or NocoFourIndividual spores / spray conidia suspension and incubate for 7 days under high humidity Was. Unlike wild-type plants, nim1 plants are ill in response to both Wela and Noco infections. Symptoms. These symptoms are necrotic spotting and vine formation, with some There was sporulation. After lactophenol blue staining, the fungal hypha is nim1 plant Leaves were easily recognized. That is, nim1 plants are usually incompatible P. Sensitive to Parasitica isolates. This result indicates that the nim1 plant is chemically Not only are they incompetent in disease resistance induced by It indicates that the natural resistance to a certain microorganism is ineffective.   ii. Biochemical analysis of nim1   SA, INA and BTH are SAR and PR-1 pathogenic genes in Arabidopsis Induces the expression of SAR genes such as PR-2, PR-2 and PR-5. These compounds are in nim1 This mutant system does not induce disease resistance in mice (described in Examples 1 and 2 above). Were treated with SA, INA or BTH and then analyzed for SAR gene expression.     After treating the nim1 plant with SA, INA or BTH, recover the plant tissue And the accumulation of RNA from the PR-1, PR-2 and PR-5 genes was analyzed. Therefore, total RNA was isolated from treated tissues and electrophoresed on agarose gels. Was. Triple gel blots were prepared and each was provided by Delaney et al., 1995, PNAS 92, A probe for any of the three SAR genes as described in 6602-6606 Hybridized. Unlike wild-type plants, these chemicals are shown in Figure 1. As shown, RNA accumulation from all three SAR genes in nim1 plants was observed. Not induced. Taken together, these results indicate that these chemicals are Suggest that neither SAR nor SAR gene expression is induced.   Because these chemicals do not induce SAR or SAR gene expression in nim1 plants SAR gene expression occurs in pathogens in these plants as in wild-type plants It is noteworthy to see if it can induce reality. On Ws-0 and nim1 plants Spray EmWa spores as described, and tissue at some time point for RNA analysis Collected. Pathogen infection (EmWa) of wild-type Ws-0 plants within 4 days of infection The PR-1 gene expression was induced as shown in FIG. However, in the nim1 plant Indicates that PR-1 gene expression is not induced until 6 days after infection, and the level is It was lower than the wild type in terms of. That is, after pathogen infection, P in the nim1 plant R-1 gene expression was slow and low compared to wild type.   Infection of wild-type plants by a necrotic pathogen causes SA Bring accumulation. This endogenous SA is required for signaling in the SAR pathway It has been shown that suppression of endogenous SA results in suppression of disease resistance. This is SA Defines SA accumulation as a marker in the R pathway (Gaffney et al., 1993, Science261 , 754-756).     nim1 plants were tested for their ability to accumulate SA from pathogen infection Was. Pseudomonas syringae tomato strain DC3000 carrying avrRpt2 gene Was injected into the leaves of the nim1 plant at 4 weeks. These leaves are from Delaney et al. 1995, PNAS92, 6 Collected 2 days later for SA analysis as described in 602-6606. This analysis shows that the nim1 plant As shown in FIG. 3, it was shown that high levels of SA were accumulated in the infected leaves. Uninfected Leaves also accumulate SA, but not at levels as high as infected leaves, causing wild-type Arabidopsis. It was similar to what was observed. This indicates that the nim mutation is a signaling pathway Indicates that it is located downstream of the SA marker. This is to be expected, If at all, INA and BTH (inactive in min1 plants) form in the SAR pathway downstream of SA. Because it is known to stimulate the minute (Vernooij et al., 1995,Molec . Pl. M icrobe Interaction 8 228-234; Friedrich et al 1996The Plant JournalDuring printing, And Lawton et al. 1996The Plant JournalPrinting). Furthermore, as described in Example 1.2, externally applied SA protected nim1 from EmWa infection. Did not.   3. Gene analysis of nim1     nim1 plants are backcrossed with wild-type Ws-0 plants and FI progeny are INA pre-treated as described in Example 1.1 before testing for resistance to EmWa . None of the INA-pretreated FI plants have any infection symptoms, while the nim1 control plant Showed infection. Therefore, the nim1 mutation was determined to be recessive.   The F2 population derived from the Ws-0 × nim1 cross was also subjected to INA pretreatment before its disease resistance. And assayed. About 1/4 (32/130 plants) of this group are pre-sprayed with INA EmWa treatment of plants shows pathological symptoms, and 3/4 (98/130 plants) show disease I didn't. These results indicate that the nim mutation identifies a single locus Incitement And is consistent with the F1 data indicating the recessive nature of this mutation.   4. Identification of marker at NIM locus and its gene mapping   Genetically close to the mutation due to conventional map-based cloning of the NIM gene Well linked markers were identified. This was accomplished in two stages. The first is nim1 plant Cross the object with a different Arabidopsis genotype Randsburg Electa (Ler), And an F2 plant with a nim1 phenotype derived from this cross (ie, at the NIM locus Homozygous nim / nim). From these, Ler near the DNA marker Plants with genotypes were identified by molecular weight analysis. These plants are identified By reference, it is a recombinant between the marker and the NIM locus. Recombination frequency is marker and NIM Defines the gene distance from the locus.   A second prerequisite for map-based cloning is genetically at the NIM locus Markers identified as very close, that is, markers that identify very few recombination It is. If genetic markers are identified as being in close proximity, It can be used to isolate genomic DNA clones close to the M locus. This NIM seat is Cloni If it is not already present on the cloned DNA, it can be cloned by walking. Step Rows may start on both sides of the gene. This is an overlapping claw that is closer to the gene of interest Rely on getting A single DNA marker starts, for example, at the northern tip Obtained by walking, and it has no recombination between this marker and the gene of interest If you do, it must be very close to this gene. But If the marker identifies recombination from the southern end, Must have traversed this gene. This makes the gene of interest Training. It is this marker and the northernmost Must be between the end marker Absent.   In the first step, large amounts of recombinants are made by genetic crossing. To the second stage In this regard, recombination close to the NIM gene is identified by using a molecular weight marker. Numerous markers have been published in the paper, and to develop additional markers There are several ways. Our approach includes several tools such as SSLP and AFLP. Relying on a car system (see below).   i. Genetic mating   To map the chromosomal location of the NIM gene for SSLP and AFLP markers , Nim1 was crossed with Ler to create a mapping population. F2 plant derived from this cross The plants were grown and the leaves were collected for subsequent DNA extraction. Next, the F2 plant The nim1 phenotype was evaluated as described in Example 1.1 above. Also, F3 populations from individual F2 plants were grown and evaluated for the nim phenotype. Was. As announced DNA (Rogers and Bendich, 1988, Plant Molecular Biology M anual, A6, 1-10) Extracted from conserved tissues of nim1 phenotype F2 and F3 plants by CTab method. Issued. This DNA was used for NIM gene mapping as follows.   ii. Simple sequence length polymorphic marker   Simple sequence length polymorphism (SSLP) markers ATHGENA and ngalll have been published (Bel l and Ecker, 1994, Genomics 19, 137-144). Used for detection of these SSLPs The primers used are listed in Table 1.   Gene mapping of NIM gene to marker ATHGENEA PCR of Ler genomic DNA A 205 bp band was predicted using ATHGENEA (i) primers for amplification. On the other hand, a 211 bp band is predicted for Ws-0 genomic DNA (Belland Ecker , 1994, Genomics 19, 137-144). Amplification products are separated on a regular agarose gel Has proven to be difficult. Therefore, two methods are used for these PCR procedures. It has been developed for the separation and detection of fragments.   In the first method, primer set ATHGENEA (1) (Table 1) was Genomic DN in the presence of boxy rhodamine labeled UTP (dUTP-R110; obtained from AB1) A was used to amplify A to obtain a rhodamine-labeled PCR fragment. PCR reaction Was analyzed with a DNA sequencer, which analyzed the DNA fragment at single nucleotide resolution. Event is detected.   Specific reagents were: 1x PCR buffer, 2mM MgClTwo, 200 mM dNTPs, 2 mM DUTP-R110, ATHGENEA (1) primer, 0.75 mM, 10 ng DNA and 0.75 unit T The reaction volume was 20 ml for aq polymerase. The amplification conditions were 94 ° C. for 3 minutes, followed by 94 minutes. 35 cycles of 15 seconds at 55 ° C, 15 seconds at 55 ° C and 30 seconds at 72 ° C. These samples Detect fluorescently labeled DNA fragments at signal nucleotide (nt.) Resolution And analyzed on an ABI 377 DNA sequencer. This is the remains of a plant sample Enables gene typing. 205 nucleotide DNA fragment obtained from Ler DNA And a band of 211 nucleotides was obtained from Ws-0 DNA. Thus, DNA fragments differing by 6 nucleotides in length can be easily distinguished And homozygous Ws-0, homozygous Ler and heterozygous Ws-0 / Ler at the ATHGENEA locus. It allowed easy genotyping of all samples.   Multiple schemes were used to increase the charge of this system. Some DNA The sample was amplified by PCR using the primer set ATHGENEA (1) as described above. And other samples were analyzed using the primer set ATHGENEA (2) (listed in Table 2). In each case, it was in the presence of 6-carboxyrhodamine-labeled dUTP. Step Limer set ATHGENEA (2) was created based on the public sequence of ATHGENEA (Simoens Et al., 1988, Gene 67, 1-11). This primer set is 139 bp DNA derived from Ler DNA The fragment and the 145 bp band of Ws-0 DNA were amplified. Primer set ATHGE The amplification reaction conditions for NEA (2) are based on the above primer set ATHGENEA (1). Was the same as it was.   Single reaction using primer set ATHGENEA (1) and primer set Electrophoresis of a single reaction using ATHGENEA (2) using ABI 377 DNA sequencer Mixed before. This multiple approach Enables genotyping of two samples in one lane of sequencer One is at position 145/139 nt. On the sequencer. And the other at position 211/205 nt . Met.   In the second method, the PCR fragment is converted to the fluorescent dye FAM-6 (6-carboxy). Fluorescein) (Clntegrated DNA Technologies, Inc.) Labeled using a marker. ATHGENEA (1) and (2) primer sets The forward ATHGENEA primers have the same sequence (see Table 1). This Primers were labeled with FAM-6 and used in PCR amplification reactions with the following reagents: (Perkin Elmer): 1 × XL buffer, 1 mM MgCl2, 200 mM dNTPs, 0.50 mM Each primer (forward primer FAM-6 labeling), 10ng genomic DNA And 0.5 units of XL polymerase, 20 ml reaction volume. The cycle condition is 94 ° C for 3 minutes, This was followed by 35 cycles of 94 ° C for 15 seconds, 59 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 30 seconds. here A single reaction using primer set ATHGENEA (1) Electrophoresis of a single reaction using ATHGENEA (2) with the ABI 377 DNA sequencer Mix before moving. This multiplex approach works in one lane of the sequencer Allows genotyping of two samples, one of which is at position 145/139 nt. And then And the other at position 211/205 nt. Met.     All F2 and F3 samples from the nim1 phenotype were analyzed at the ATHGENEA locus described above. The genotype was evaluated. All samples that were heterozygous at this locus were NI Plants that were recombinants between the M locus and the ATHGENEA locus were identified. 114 evaluated in this way 4 In the population of F2 nim1 phenotype plants and the population of F3 nim1 phenotype, 98 Heterozygous at the EA locus, the gene distance between the SSLP locus and the NIM1 locus is 4.3 cM. It was estimated. This is because the NIM1 locus is on chromosome 1 and the ATHGENEA Established near the car.   Gene mapping of NIM1 gene to marker ngalll   About SSLP marker ngalll (Bell and Ecker, 1994, Genomics 19, 137-144) The two primer sets of all SSLP markers were combined with the F2 and F3 nim1 phenotype And used to amplify genomic DNA of control Ws-0 and Ler plants. Plastic Immerset ngalll (1) (described in Bell and Ecker, 1994, Genomics 19, 137-144) (Listed and listed in Table 1) under the following conditions: 1 × PCR buffer, 2 m M MgClTwo, 20 mM dNTPs, 0.75 mM primers, 10 ng DNA and 0.75 units Taq Polymerase, 20 ml reaction volume. Primer set ngalll (2) (listed in Table 1, Primer set ngalll (1)) was used under different conditions: 1 × PCR Buffer, 1.5 mM MgClTwo, 200 mM dNTPs, 1 mM primer, 10 ng DNA and And 1 unit of Taq polymerase, reaction volume of 20 ml. Continue both reactions at 94 ° C for 1 minute Incubation at 94 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 30 seconds for 40 cycles. Amplified by   Samples were analyzed on a 3-5% agarose gel. Any primer set The band obtained by amplification of Ws-0 DNA by G.H. Gave a 162 bp band. Plants heterozygous at the ngalll locus Ampoule identified a plant that was a recombinant of this SSLP marker with the NIM locus. 1144 F2  239 of the nim1 phenotype plants and the F3 nim2 phenotype population The gene distance between the SSLP marker and the NIM locus was 10.4 cM. Estimated. This was consistent with the NIM1 locus being on chromosome 1. ATHGENEA and n Several nim1 phenotype plants are present that are heterozygous in both gallls. Therefore, the NIM1 locus is among these two markers, and ATHGENEA is the NIM1 locus gene. North of And that ngalll is located to the south of the NIM1 locus gene. Was. This places the NIM1 locus gene about 10 cM north of ngalll, near position 85 on chromosome 1. (Lister and Dean, 1993, Plant J. 4, 745-750; Bell and Ecker, 1994 , Genomics19, 137-144).   iii. Amplified fragment length polymorphic marker     Continuous proximity to NIM1 gene for map-based cloning It is necessary to identify the molecular marker in question. For this purpose, amplified fragments GLP polymorphism (AFLP) marker by Zabeau and Vos (1993, European Patent Application EP 0 534858) and Vos et al. (1995, Nucleic Acid Research)twenty three, 4407-4414) It was made by utilizing the restriction fragment amplification method.   Outline of AFLP technology   The use of AFLP technology in mapping can be performed on two genetically distinct samples. Relies on the selective amplification of a set of DNA bands to be amplified. The finding that any resulting bands differed between the two genotypes was not Are identified as markers for that genotype. Marker is a gene of interest (Mutant) and the high frequency together, the marker is Close to Zodiac.   Selective amplification of a small set of DNA fragments in a complex DNA sample is a two-step process Is achieved in. First, the DNA fragment is digested with restriction enzymes, It is prepared by connecting an adapter to the end of Then, complementary to the adapter Primer comprising a unique sequence and a 3 'extension (typically from 0 to 3 nucleotides) Amplify only those DNA fragments whose ends are complementary to these primers Used for If using single nucleotide extension, each primer Approximately 1/4 of fragmentation, all fragments Will have matched primers at both ends. That is, a certain DNA fragment A set of fragments is amplified by these primers. Radioactivity label By doing so, a smaller subset of visible bands may be obtained.   AFLP analysis   For AFLP analysis of a DNA sample, 50 ng of DNA is ligated to the appropriate enzyme (usually EcoRI and Ms eI; see below) and digest the adapter (listed in Table 2 below) with the restriction flag. (Usually EcoRI and MseI). These primers And the sequences of the YAC, P1 and BAC clones are detailed below. A short 3 'extension (2 (Or 3 nucleotides) using a primer complementary to the adapter having The primer sequence is shown below), and a template was used for the amplification reaction (about 0.5 ng of DN per reaction). A). One primer is radioactively labeled (usually EcoRI primer) Gels where only one set of amplified fragment subsets was used to separate bands Was visible by autoradiographic analysis.   The amplification conditions for the cloned DNA (YAC, P1, cosmid) are as follows The cycle was as follows: 30 sec at 94 ° C (denaturation), 30 sec annealing and 1 min extension at 72 ° C. Kuru 36 times. The annealing temperature in the first cycle is 65 ° C and the next 12 Decreased by 0.7 ° C per cycle over the cycle and kept at 56 ° C. Arabidop Because of the genomic DNA of cis plants, this DNA is Amplified with imers (neither primer was labeled). This amplification reaction The reaction conditions for denaturation (94 ° C) for 30 seconds, 1 minute annealing (65 ° C) and 1 minute Of elongation (72 ° C.) was performed 20 times. In the second step, the first amplification reaction is Dilute 10-fold and re-incubate 36 times with primers containing full-length extension under the following conditions Width ( (Using one labeled primer): 30 seconds (denaturation) at 94 ° C, 30 seconds annealing and And 72 ° C for 1 minute. The annealing temperature in the first cycle is 65 ° C. The temperature was lowered by 0.7 ° C. per cycle over the next 12 cycles and kept at 56 ° C. The final reaction product is separated on a polyacrylamide gel and the gel is To identify the radiolabeled PCR band. This procedure involves two types of genetics Diagnosis for one genotype or others when applied simultaneously to DNA derived from a genotype AFLP band is specified. Such bands may be informative AFLP bands or AFLP markers. Call it a car. Table 2 shows the adapters used in the AFLP analysis.  Preparation of AFLP marker and detailed mapping of NIM1 locus   Arabidopsis Ecotype Ransburg Elekta (Ler) and Colombia (Col) (Lis ter and Dean, 1993, Plant J.Four, 745-750) A Population of Recombinant Inbred Inbred Lines Used for AFLP Marker Screening Was. These primers used for AFLP screening were:   "N" in these primers indicates that this part is variable (A, C, G or T) , “W” means A or T, and “X” means C Means All eight possible primers were EcoRI- and MseI-primers Used for both This is a total of 64 (8 × 8) primer combinations (P Cs), and transforming the DNA from the recombinant inbred line and the parental Used for amplification as described above. Denature polyacrylamide gel for amplification reaction Run, separate the AFLP fragments by size, and expose the gel to film. Exposed. The film was examined for bands present in only one genotype. Immediately Finally, the AFLP marker was examined.   AFLP marker, a DNA fragment that is polymorphic between both parents of the recombinant inbred line. The fragments were used to construct a genetic map of the transgenic inbred population. below Example 1.5i includes the NIM1 gene at appropriate position 85 on Arabidopsis chromosome 1. Is described. Between positions 81 and 88 on Arabidopsis chromosome 1 The presence of the mapped (recombinant inbred) AFLP marker To analyze transgenic plants and thus more accurately map the NIM1 gene Was selected. Seven markers from this region were identified as informative; They were polymorphic between both parents of the nim1 × Ler cross. The six AFLP markers are Ler specific, i.e. these AFLP markers are present in Ws (and Col) Not Was. One AFLP marker is Ws-specific, that is, a Col-specific AFLP marker (Ler Absent) also existed in Ws. These AFLP markers are L81.1, L81.2, W83 .1, L84, L84, L87 and L88 (L-marker is for ecotype Ler Specific and the W-marker is specific for the ecotype (both col and Ws). (The numbers indicate map locations). Crossing these AFLP markers with nim1 × Ler It was used to analyze transgenic plants of origin (see below). Furthermore, AFLP marker C86 (Recombinant inbred inducing marker specific to Col) is used in DNA clone isolation (See below). Table 3 shows primer arrangements used to obtain these AFLP markers. List columns.   Table 3 shows primer combinations of AFLP markers derived from the recombinant inbred population. You.   A detailed genetic map of this region was obtained by sorting the recombinant Was constructed using In total, 337 transgenic plants were obtained from 1144 F2 nim1 plants. Was done. First, these recombinants are adjacent to the north side AFLP markers L81.2 and ATHGENEA and south adjacent markers L88 and ngalll I was leaning. 48 plants are homozygous nim1 / nim1 and have ATHGENEA and Is heterozygous at L81.2 and 21 plants are homozygous nim1 / nim1 And was heterozygous for ngalll and L88. These transgenic plants Further analysis was performed with 9 AFLP markers in the NIM region. The four AFLP markers (W83.1, L84, L85 and L87) and five AFLP markers (W83.3 / W84. 1, W84.2, W85.1, W86.1 and L86; see below).   FIG. 4 shows a genetic map of NIM1 based on this analysis. As you can see, 27 recombinants Was found between markers W84.2 and NIM1, and 14 recombinants were found between W85.1 and NIM1. And was recognized between. Marker L85 is linked in close proximity to NIM1, The marker is not located on the YAC, BAC or P1 clones (see below) and And was not useful for the identification of the NIM1 gene.   5. Physical mapping of NIM1 area   i. Isolation of YAC clone using AFLP marker closely linked to NIM1   CIC Library, ie Arabidopsis Ecotype Columbia YAC Live Larry (Bouchez et al., 1995, 6th Int. Conf on Arabidopsis Research, Madison , WI) were screened in the NIM region for YAC clones. This live The rally has approximately 2.5 nuclear genome equivalents and an average insert size of 450 kb. I do. The YAC library was screened with two markers: W83.1 and C86. W83.1 is the closest inhabited recombinant on the north side of NIM1, an inbred inducible AFLP marker And C86 is specific to Col It is a recombinant, inbred inducible AFLP marker (absent in Ler and Ws). C8 6 was mapped to the south of the NIM1 gene on the map of the recombinant inbred population. this Using Col AFLP marker instead of Ler AFLP marker linked in close proximity (Fig. 4) Because the Ler AFLP marker only detects the Ecotype Randsburg Erecta And therefore screen the Columbia YAC library. Because it cannot be used for   The YAC library was screened in two steps. First, 12 96-hole microphones Pool the cells of the YAC clone on each plate of the And Ross et al. (1991,Nucleic Acids Res . 19, 6053) And used for DNA isolation. Screen these pools with both AFLP markers did. Next, from each positive plate pool, each column (pool of 8 clones) and each row (12 pools of clones) DNA samples Screening. This allows individual positive YAC clones to be identified. Was. This screen provided a total of four YAC clones. YAC 12F04 and YA C12H07 was isolated using the northern AFLP marker W83.1, and YAC 10G07 and YAC7E 03 was isolated using the southern AFLP marker C86. IC numbering is used). "Fingerprint" YAC by AFLP The isomeric AFLP fragment was obtained. Compare YAC fingerprints, and between YACs (See also Tables 5 and 6). AFLP finger pre Clone 7E03 was essentially covered by clone 10G07 (Table 5). See also clone 12H07, and clone 12F04 is essentially covered by clone 12F04 as well. (See also Table 6).   ii. Preparation of AFLP marker from YAC clone   The above AFLP marker is relatively genetically far from the NIM1 gene (see FIG. 3). )), And developed a study to search for a marker closer to the NIM gene.   Screen for additional YAC-induced AFLP markers with the following DNA samples Performed: DNA of isolated YAC clone (4 YACs identified as described above) ), Yeast strains without YAC, and three Arabidopsis ecotypes Col, Ler and And Ws. In this way, a YAC clone (not present in the yeast strain and present in Col) Specific fragments were identified as Ler and Ws (identified in Example 1.5 below). Can be tested for polymorphism in the parent of the transgenic plant). Polymorphism thus identified All fragments will be additional AFLP markers. First AFLP screening The enzyme combination (EC) EcoRI / MseI was used. This screening And two YAC clones 10G07 and 7E03 (detected by AFLP marker C86; see below) ), Yeast strains without YAC, and three Arabidopsis ecotypes Col, Ler and And Ws were assayed. The primer combinations with selective extension used were three They can be grouped and shown in Table 4. 256 (64 + 96 + 96) plastics in total Immer combinations were screened.   In Table 4 below, AFLP screening of two clones 10G07 and 7E03 Primer sequences, yeast strains without YAC, and three types of arabido Shows the psi ecotypes Col, Ler and Ws. 3 groups of primer combinations used. An "N" in the primer indicates that this portion is variable (A , C, G or T), "S" indicates C or G, "W" indicates A or T, and “Y” indicates C or T.   A total of 83 Col-specific fragments were generated, 62 of which shared both YAC clones. Had. The three fragments are AFLP marker polymorphisms between Ws and Ler, Two of them are Ws AFLP markers (Col fragment is also present in Ws and Le r is not present) and one is the Ler AFLP marker (Col fragment Event is also present in Ler and not in Ws). These results Are shown in Table 5 below.   Table 5 shows the shared and unique AFLP fragments detected in YAC 10G07 and 7E03. Information between these fragments in the Ws and Ler genotypes Shows the number of FLP markers.   Thus, this AFLP analysis provided three AFLP markers (see FIG. 4 and below). Determine its absolute position relative to each other and to the recombinant inbred inducible AFLP marker. Analysis of recombinants using AFLP markers Decided.   Four screened YAC clones for secondary screening for AFLP markers By assaying everything (see below) and using the enzyme combination PstI / MseI Implemented. The primers used are as follows:   The "N" in this primer indicates that this portion is variable (A, C , G or T), and “W” in this primer indicates that it is A or T. And A total of 144 (12 × 12) primer combinations were combined with the four isolated Y AC clones-12F04, 12H07, 10G07 and 7E03; yeast strains without YAC; Screening was based on the Labidopsis ecotypes Col, Ler and Ws. All Located 219 AFLP fragments, of which 144 were YAC clones 12F04 and 12H0. Present in 7 (72 are unique to clone 12F04 and 72 are common to both YACs) And 75 were present in YAC clones 10G07 and 7E03 (33 Loan 10G07 specific and 42 were common between the two YACs). YAC black The three fragments from the first set of (Ws AFLP marker). The results are shown in Table 6 below.   Table 6 shows the number of shared and unique AFLP fragments detected in YAC and Ws and Shows the number of informative AFLP markers between these fragments in You.  These results show that YAC clone 12H07 is part of the larger YAC clone 12F04. Suggests that YAC clone 7E03 is part of the larger YAC clone 10G07 I do. These data demonstrate that the larger YAC clones 12F04 and 10G07 do not overlap. And suggest. These data are based on NIM in any of these YAC clones. Does not allow the positioning of one gene. 302 AFLP fragments in NIM region There are five complete screens covering 400 primer combinations to provide Provide four AFLP markers, four of which are Ws-specific and one is Ler-specific It is. These five additional AFLP markers were mapped by analysis of the recombinant plant (See FIG. 4 and below), and W84.1 (aka W83.3), W84.2, W85.1 , W86.1, and L86.   Table 7 lists the primer sequences used to obtain these AFLP markers. . These five additional AFLP markers are L81.1 to L88 Increased the total number of AFLP markers to 12 in the region leading to (see Figure 4 and below) .   Table 7 shows primer combinations of AFLP markers derived from YAC clones.   This information is shown in FIG. 5 with the approximate location of the YAC clone compared to the genetic map. It was used to construct a physical map of the area. This map is with marker W83.1. The region containing the NIM1 locus between W85. 1 and 3 contains the YAC clones 12F04 and 10G07 / 7E03. Showed that it was more partially covered.   iii. Construction of P1 / BAC contig containing NIM1 gene   In the previous section, how to isolate the AFLP marker linked to the NIM1 region And how to identify and map the YACs corresponding to these markers Is described. The results obtained show that the NIM1 gene can be However, it has not been possible to identify a specific DNA segment containing the NIM1 gene. Adjacent AFLP Were mapped to separate non-overlapping YACs. Therefore, the NIM1 gene The exact physical position cannot be determined. It's in one of two YACs Or may be in a gap between YACs. Another approach between adjacent markers Was chosen to fill the physical gap. Adjacent AFLP with P1 and BAC libraries Used to bridge gaps between markers.   The library used to fill the gap is Liu et al. (The Plant J., 7, 351-358, 1 995) The described Arabidopsis ecotype Columbia P1 library and Cho i et al. (http / genome-www.stanford, edu / Arabidopsis / ww / Vol2 / choi, html) Ecotype Columbia BAC library. About 10,000 P1 libraries Clones, has an average insert size of 80 kb, and The library consists of about 4000 clones and has an average insert size of 100 kb. Theoretically, these libraries show about 10 nuclear genome equivalents (Arabidopsis) Haploid genome size is assumed to be 120 Mb).   iv. Identification of P1 clone corresponding to adjacent marker   The adjacent markers Ws84.2 and Ws85.1 were used for screening the YAC library. A pool of P1 clones using a strategy similar to that described above. (See Example 1.5). P1 clone with marker fragment Selected and "plasmid" DNA was isolated. ECs Ec Using oRI / MseI and HindIII / MseI and primers without selected nucleotides And fingerprinted. Physical map showing clone size and overlap A map was constructed by contrasting the AFLP fingerprints. AFLP flags that are unique Number of fragments and number of AFLP fragments common between clones suggest degree of overlap I do. This map is shown in FIG. Show. AFLP fingerprinting consists of two sets of non-overlapping P1 contigs And each includes any of the following adjacent markers: P1-1 and And P1-2-containing marker Ws84.2; P1-3 and P1-4-containing marker W85.1. Obedience Thus, gaps between adjacent markers were not filled (FIG. 6).   The position of the P1 contig relative to the YAC contig is Determined by swinger printing and the number of YAC-specific PCs described above. P1 black P1-1 and P1-2 completely overlap with YAC CIC12F04, and partly with YAC CIC12H07. Only partially overlapped. Therefore, these P1 clones YAC contig CIC12H07 / 1 Located on 2F04 (FIG. 6). P1 clones P1-3 and P1-4 are YAC CIC7E03 And perfectly overlaps with CIC10G07, and AFLP marker W86.1, like W85.1, It was shown to be located in this P1 contig (FIG. 6).   Next, marker L85 was used to identify the corresponding P1 and BAC clones. L85 is an Ecotype Ransburg specific marker and is therefore radiolabeled Hybridization of the purified L85 DNA to P1 and BAC filters It was adopted. No P1 or BAC clone hybridization to L85 Not identified. This means that the L85 sequence is Arabidopsis Ecotype Colon Support our original finding of deletion in the via genome, and therefore why The largest explanation is that no clones were identified.   v. Extension of NIM1 adjacent P1 contig   Various approaches were taken to extend from the adjacent P1 contig.   South of YAC CIC12F04 (specific to CIC12F04, not present in CIC12H07) End-specific YAC AFLP fragments were used to pool library AFLP screening Used to identify the P1 clone.   1. The YAC AFLP fragment derived from YAC 10G07 and overlapping P1-4 was A pool of one library was identified as a P1 clone by AFLP screening. Used for   2. EcoRI restriction fragment from P1 clone P1-6 (AFLP-based From the P1 library screen) on the filter of the BAC library Used as a hybridization probe.   Various P1 and BAC clones were obtained by this screening and all Using ECs EcoRI / MseI and HindIII / AFLP-fingerprinting with MseI. As above, create a new map And was shown in FIG. Table 8 has AFLP fragments located in adjacent YACs And screening the P1-library for the corresponding P1 clone The various AFLP PCs used to perform   Table 8 lists the various AFLP PCs used to screen the P1 library. Show. The upper half of this table shows PCs specific for northern YAC, and the lower half shows southern YAC Shows PCs specific to. Further shown are YAC and P1 where the AFLP fragment was detected. It is a clone.   Covers the southern end of YAC CIC12F04 (not protruding from this YAC) and marker An approximately 250 kb P1 / BAC contig containing W84.2 was obtained. Markers W85.1 and W86.1 And a P1 contig of about 150 kb was obtained. This contig is completely inside YAC CIC7E03 Included in.   From the southern tip of the northern P1 / BAC contig (WL84.4 and WL84.5, see below and Table 11) P1 / B covering NIM1 gene AFLP marker analysis based on recombination with other markers The conventional "walking" process is the construction of the NIM1 gene-containing contig. Is not valid in the above (see the next section). Thus, spanning the NIM1 gene Extending the existing north P1 / BAC contig to the south for the purpose of "walking" It will allow the definition and isolation of specific DNA segments, including offspring. North P1 / P1 or BAC clone located at the southern end of the BAC contig is located near NIM1 Clones (south border) The hybridization-based approach used for this was performed. Due to the walking process The resulting new clones were cloned using the ECs EcoRI / MseI and HindIII / MseI described above. Use existing AFLP fingerprinting to map to existing contigs did. A total of five consecutive walking steps are required to "cross" the NIM1 gene It seemed. Table 9 shows the clones obtained at various stages of walking.   Table 9 shows the hybridizers used to screen the P1 and BAC libraries. Hybridization probes and hybridization probes, and 1 is a schematic of various walking steps showing selected clones extending in the south direction.   FIG. 8 shows a physical map of various clones obtained by this walking operation. About 600k The total distance of b was covered starting from the initial walking point marker W84.2. Shown in FIG. The southern tip of the contig appeared to contain the NIM1 gene (see next section). This container The rig extends more than 300kb south of YAC CIC12F04, and YACc CIC10G07 and CIC7E0 3 does not seem to overlap, and the NIM1 gene is in the gap between adjacent contigs. And suggest that this gap is 300 kb or more.   vi. Construction of a comprehensive gene and physical map adjacent to NIM1   In the previous section, how to isolate the AFLP marker linked to the NIM1 flanking How to identify the YAC corresponding to the adjacent marker and the closest What is the P1 / BAC contig that extends 550kb south from the northern adjacent AFLP marker W84.2? And then said how to build. This chapter is a new AFLP marker from P1 / BAC contig Car making, physical mapping and usefulness of these markers on this contig The genetic mapping of these markers by various recombinants is described.   1. Creation of new AFLP marker from P1 / BAC contig   As described in the previous section, contig elongation P1 and BAC clones were transformed into ECs EcoRI / M Characterized by AFLP fingerprinting using seI and HindIII / MseI Specified. This quite accurately defines the degree of overlap between the various P1 and BAC clones. And further generate several AFLP fragments specific to these clones did. An AFLP primer without the selected nucleotide was used for purification of P1 or BAC clones. Rasmid DNA was used for fingerprinting. However, Arabidop Use of these P1 or BAC-specific AFLP fragments for detection in cis To be able to do so would require a selection nucleotide. Amplification restriction fragment By determining the terminal sequence of AFLP primers, AFLP primers having appropriate For amplifying P1- or BAC-specific AFLP fragments in Rabidopsis Can be designed. AFLP fragments are all Ecotype Columbia (Col) and therefore the Colombian AFLP marker is Ecotype Ransburg Elimta (Ler) and nim1 mutants of ecotype Wassil Uschija (Ws-nim) Should be a source of information on NIM1 recombinants derived from crosses with . Principle There are four types of AFLP fragments, two of which are shown in Table 10 below. It is a useful marker.   Table 10 is a summary of the types of recognized AFLP markers. (+) Or (-) is AF Indicates the presence or absence of the LP fragment.  Generally, fingerprinting of P1 and BAC clones is 30-40 EcoRI / MseI AFLP fragment and 60-80 HindIII / MseI AFLP fragments were generated. Terminal sequencing of individual fragments is standard sequencing Determined by technology. Next, EcoRI or HindIII primer and MseI primer Specific AFLP primers with selective extension of 3 nucleotides for both The sets were tested on the following DNA panels:   1. P1 / BAC clone derived from AFLP marker   2a. yeast   2b. YAC clone CIC12F04 (only for AFLP fragments derived from P1-7) )   2c. YAC clone CIC10G07   3a. Col; Origin of P1 and BAC libraries   3b. Ler; parent 1 of nim recombinant   3c. Ws-nim: parent 2 of nim recombinant   Six clones were cloned into their ECs EcoRI / MseI and HindIII / MseIA. FLP fragment: BAC-01 / P1-7, P1-17 / P-18, BAC-04 / BAC-06 Selected for sequence analysis. All AFLP fragments derived from clone P1-7 were YA C Detected in CIC12F04, this clone is completely contained within this YAC Suggest that. Any P1 / BAC-specific AFLP fragment can be obtained from YAC clone CIC10G07 And the P1 / BAC contig is not detected in two adjacent YAC contigs. Suggests that it does not bridge the gap between them. Selected for analysis of nim recombinants Table 11 shows the obtained AFLP markers.   Table 11 shows selected AFLP markers from AFLP PC specific for various P1 and BAC clones. It is an outline of. “WL” markers are markers derived from the same PC, and Of AFLP markers, Ws and Ler markers, which are analyzed by NIM recombinants. It appears to be perfectly connected in the repulsion phase.   2. New AFLP marker physical mapping   The above-described AFLP marker was used for its various P1 and BAC clones. Physical mapping was performed by testing for presence. The results are shown in FIGS. You.   3. Gene mapping of new AFLP markers   All AFLP markers were analyzed in the selected recombinant set. The results obtained are shown in Table 12a. , 12b and 12c.   AFLP markers Ler 84.8, Ler 84.9a, Ler 84.9b and Ler 84.9c are south of NIM1. Was mapped on the side. The recombinant is phenotypically nim1 (e Mozygous, genotype Ws-nim1 / Ws-nim1) and these AFLP markers Was found to be heterozygous (Ler-specific AFLP marker was detected). Genotype is Ws-nim1 / Ler). AFLP marker Ler 84.8 becomes NIM1 Closest observed: only single recombinant (C-105) was heterozygous Ws-nim It was evaluated as 1 / Ler and homozygous Ws-nim1 / Ws-nim1. AFLP marker Ler 84.7 and Ler 84.6 seemed to segregate perfectly with NIM: 1: all recombination The bodies had the same NIM1 and AFLP marker genotype. On the north side of NIM-1, Marker L84.6b appeared closest to NIM1: three nim1 phenotypically modified plants , C-074, D-169 and E-103 (Table 12c) show heterozygous W at this marker. It was found to be s-nim1 / Ler. Made from P1-18, BAC-04 and BAC-06 With the help of the cosmid contig, the AFLP markers Ler 84.6b and Ler 84.8 were Mapped in P1-18 and BAC-04, respectively, and a physical distance of about 110 kb Was recognized. This is the estimated length of nim1 on the DNA segment. Stipulates that it is 110 kb. From this analysis, it was found that the NIM1 gene was clone BAC-04. Or it was determined to contain P1-18. Clone BAC-04 and P1-18 are ATCC Deposit Nos. And given deposit numbers ATCC 97543 and ATCC 97606, respectively. ing.   vii. Detailed gene and physical mapping of NIM1 gene   The previous section describes how to create DNA segments containing the NIM gene in P1 / BAC Described by physical mapping of adjacent AFLP markers (Ler 84.6 and Ler 84.8) I've talked about what I can do. Adjacent marker Appears to map on two overlapping clones, P1-18 and BAC-04. Was. This chapter is to improve the resolution of the gene and physical map of the region containing the NIM1 gene. To create additional BAC-04-specific and P1-18-specific AFLP markers State what to do.   viii. Preparation of additional AFLP markers from Cosmid Array   Four ECs were selected and NIM1: PstI / MseI, Xbal / MseI, BstYI / MseI and Additional AFLP markers for detailed mapping of TaqI / MseI were generated. Ps The tI / MseI and XbaI / MseIA AFLP fragments were cloned into clones P1-18 and BAC-04. Generated above and determine the selection sequences required for detection in Arabidopsis did. Similarly, the AFLP fragment and the selected sequence were replaced with BstYI / MseI and TaqI / Determined for MseI; however, in this case this procedure was performed using cosmid DNA. Performed: A11, C7, E1 and E for BstYI / MseI (complete NIM1 region) 8, and D7, E8 and E6 for TaqI / MseI (south side of NIM1 region). Change Table 13 shows the different genes and informational AFLP markers selected for physical mapping . Additional adapters used in this work are shown in Table 14.   Table 13 shows the AFLP markers used for NIM1 gene and physical detailed mapping. Show. "BstYI (T)" indicates a restriction site, and the corresponding primer is AGATCT or Was one of GGATCT.   Table 14 shows the additional adapters used to identify new AFLP markers.   ix. Physical mapping from new AFLP markers to cosmid contigs.   Using the above markers to determine their presence in various cosmid clones Physical mapping was performed on a cosmetic array (Fig. 11).   1. Gene mapping of new AFLP markers   New AFLP markers were identified by AFLP analysis of the nearest northern and southern recombinants. I hopped. Nearest north (recombinant D169) and south (Recombinant C105) The recombinant map was mapped (see Table 15). AFLP analysis was performed on recombinant D169 Marks the recombinant with marker L84. South of Y1, and marker W84. It is on the north side of Y2 Was shown. The assembly point in the recombinant C105 is marker L84. Between T2 and L84.8 Was mapped. Utilizing this useful set of recombinants, this includes NIM1 Further delineation of chromosome intervals; distance between adjacent recombination points Was found to be 60-90 kb (FIG. 12).   2. Construction of cosmid contig     nim1 plant traits with wild-type NIM1 gene to complement the nim1 plant phenotype Conversion is needed. This transforms such plants with a cosmid containing the gene. Can be achieved by doing For this purpose, the cosmid container of the NIM1 region Rig was built. Arabidopsis is transformed using Agrobacterium Therefore, the cosmid vector used is a binary vector.   DNA was isolated from BAC-04, BAC-06 and P1-18 and used with the restriction enzyme Sau3AI. And used to make partial digests. Run a 20-25 kb fragment on a sucrose gradient. Used, pooled and filled in with dATP and dGTP. binary Vector (04541) was cut with XhoI and filled in with dCTP and dTTP. This These fragments were then ligated into the vector. This ligation Packaging the mixture. E. coli was transduced.   This cosmid library was screened with BAC-04, BAC-06 and P1-18 clones. And positive clones were isolated. These cosmids are then Ninger print and contig of overlapping clones spread over NIM1 region And arranged. Determine cosmid insert size, and perform limit-restriction mapping Carried out. The result is shown in FIG.   Example 2     Identification of clone containing NIM1 gene   1. Complement via stable transformation     Cosmids prepared from clones spanning the NIM1 region (above) were cloned into three parents (tri parental mating) to transfer to Agrobacteria. These cosmids Followed by vacuum infiltration (Mindrinos et al., 1994,Ce ll  78, 1089-1099) or nim1 Arabidopsis by standard root transformation Used to replace Collect the seeds from these plants and use them as selection factors Germination on agar plates with kanamycin (or other suitable antibiotic) I let it. Only plantlets transformed with cosmid DNA detoxify the selection factor And survived. Transfer the seedlings that survived the selection to the soil, and to the nim phenotype Or its progeny were tested for the nim phenotype. also nim phenotype Transgenic plants without haya identified a cosmid containing a functional NIM1 gene.   2. Complementation in transient expression systems     The ability of DNA clones to complement the nim1 mutation in two transient expression systems Tested.   In a first system, nim1 containing the PR1-luciferase (PR1-lux) transgene Arabidopsis plants are used as bombardment receiving material. These plants Characterizes Columbia ecotype plants with PR1-lux constructs by vacuum infiltration And then made by kanamycin selection of recovered seeds as described above. IN A. Transgenic plants showing luciferase activity after induction with A are self-propagated (selfe d) and homozygous plants were produced. These were crossed with nim1 plants. Transient In the assay, homozygosity for nim1 and PR1-lux from this cross Was used to identify DNA clones that could complement the nim1 phenotype. These plants were then first treated with INA as described in Example 1.1 above. . Two days after harvesting these plants, the surfaces were sterilized and pre-pressed on GM agar medium. The plate was cultured. The leaf tissue was transformed with a cosmid, P1 or NIM1 BAC clone (or Subclone) and one day later, leaf luciferase Measure activity. Lucifera The clone that induces the ROS activity contains the NIM1 gene.   In a second line, the nim1 plant was treated with INA (as described in Example 1.1 above). ), And two days later, cloned DNA (cosmid, P1 , BAC and / or YAC clone or subclone) and reporter plasmid. Put on the bird. This reporter plasmid is Arabidopsis PR1 pro Includes luciferase gene driven by motor (PR1-lux). nim1 plant INA does not activate the PR1 promoter (as described in Example 1.2 above). ), And therefore cannot induce luciferase activity from the reporter plasmid. I However, when the co-transformed DNA clone contains the complementary NIM1 gene, the INA Induces the PR1 promoter, as demonstrated by induction of luciferase activity I do. One day after co-bombardment, measure luciferase activity in whole plants . DNA clones that induce luciferase activity that significantly exceed background levels Clone (cosmid, P1 or BAC clone or subclone) contains the NIM1 gene .   3. Transcript changes in the nim1 phenotype series     Since the nim1 phenotype plant has a mutation in the NIM1 gene, In the gene, the mRNA is not transcribed at all, or abnormal mRNA (size) Is considered to have been modified to generate. To test this, use RNA RNA Lot analysis is performed on nim1 series.   RNA was isolated from Ws and Ler plants of these lines (water or INA or BTH After processing) and used to prepare Northern blots. These blots And a DNA fragment isolated from a clone of the DNA contig at the NIM1 locus. Let it hybridize. Nim with abnormal RNA expression (abnormal in size or concentration) 1 system It appears that the DNA fragment that specifies (part of) the NIM1 gene. This DNA fragments and surrounding DNA were sequenced and used to isolate cDNA. (By library screen or reverse transcription PCR), which is also sequenced. single The clone from which the isolated fragment was derived or its isolated cDNA was Used to indicate complementation of the nim1 phenotype in a sexual expression system.   Example 3     Determination of DNA sequence of NIM1 gene   1. Genome sequencing     Utilizing genomic clones that may contain the NIM1 gene using methods known in the art And sequence. These include BAC-04, P1-18 from the NIM1 region and cosmids Is included. For example, digest this cosmid with restriction enzymes and insert Fragments from a common vector, such as pUC18 or Bluescript. Training. Large P1 and BAC clones were randomly sheared and Fragment into a universal vector. Flags in these vectors In a conventional manner (eg, "primer walking" or making insert deletions). The sequence is determined by The resulting sequence is assembled into a continuous sequence.   The insert sequence of the complementing clone contains the NIM1 gene. About NIM1 gene Start and end points in the DNA sequence, sequence motifs such as the TATA box, Open reading frames, codon usage, cosmid complement data, AF Estimated from the relative position of the LP marker and additional relevant data summarized (see below). See Example 4).   2. cDNA sequencing     Cosmids containing the NIM1 gene (described in Example 2 above) or large The loan is used for cDNA isolation. This is the cDNA library of a wild-type Arabidopsis plant. These clones (or DNs) as probes in library screening A fragment). Cosmetic isolation of the isolated cDNA Were sequenced as described for sequencing, and used for complementation studies. this Allows the full-length cDNA to be placed in a suitable plant expression vector Is cloned. Use these constructs in the transient assays described above . Alternatively, the cDNA was cloned into a binary vector and described in Example 2 above. Enables expression in plant tissues and Agrobacterium-mediated plant transformation I do. CDNA containing NIM1 gene (complementation, isolation using closely linked AFLP markers) , Isolation by cosmid fragment, or other estimation) Is done.   Genes are isolated from Ws-0 and nim1 plants and sequenced. These remains Using the isolated NIM1 gene fragment as a probe, Obtained from Ibrary Cosmid. On the other hand, these genes or cDNAs are IM1-simply using gene-specific primers and genomic DNA or cDNA as template Let go. Similarly, other nim1 alleles from the nim1 system (see Example 1.1 above) Is isolated and sequenced in the same manner.   Example 4     Details of NIM1 gene and putative protein sequence     The DNA sequence of the NIM1 gene or cDNA is determined as described in Example 3 above. . This sequence is stored in a DNA analysis program such as the Genetics Computer Group (GCG) package. Cage, Sequencer or Staden package, or any similar DNA analysis program Analyze using what can be found in the package.   For more details, open reading frame analysis Stop and potential start codons, potential promoter motifs (eg, TATA box ), The presence of a polyadenylation signal, and the like. Also estimated Amino acids are deduced from the open reading frame. Sequences with homology, eg For example, transcription factors, enzymes or motifs of such genes or proteins. Use both DNA and protein sequences to search databases.   Example 5     Isolation of NIM1 homolog   The Arabidopsis NIM1 gene was used to isolate NIM1 homologs from other plant species. Low stringency hybridization of genomic or cDNA libraries Can be used as a probe in screening. On the other hand, this is Arabid Primers and templates designed based on the psis NIM1 gene sequence By genomic DNA or cDNA amplification. NIM1 gene Corn, wheat, rice, barley, rape, sugar beet, potato, tomato, soybean Isolated from beans, cucumber, grape, tobacco and other crops of interest Can be sequenced. Once a sequence set has been obtained from the NIM1 gene, A new primer for isolating NIM1 homologues from distantly related plant species Can be designed from the preserved part.   Example 6   Complementation of nim1-1 gene by genomic fragment   1. Construction of cosmid contig     Cosmid contigs in the NIM1 region were purified from CsCl purified from BAC04, BAC06 and P1-18. It was constructed using the DNA produced. Isolate DNA from three clones And partially digested with the restriction enzyme Sau3A. 20-25kb fragment Were isolated using a sucrose gradient, pooled and filled with dATP and dGTP. In. Plasmid pCLD04541 was used as a T-DNA cosmid vector. this The plasmid is a replicon based on the broad host range pRK290, a tetraploid for bacterial selection. Includes cyclin resistance gene and nptII gene for plant selection. This vector Was cut with XhoI and filled in with dCTP and dTTP. Fragment prepared The fragment was then ligated to this vector. This ligation mixture Packaging, and E. coli strain XL1-blue MR (Stratugene) I let you. The resulting transformant was hybridized with BAC04, BAC06 and P1-18 clones. Screened by the isolation and positive clones were isolated. Kosumi DNA was isolated from these clones and the template DNA was purified from ECs EcoRI / MseI and H Prepared using indIII / MseI. The resulting AFLP fingerprint pattern Analysis was performed to determine the order of the cosmid clones. 15 semi-overlapping costumes spread over the nim area A set of mids was selected (FIG. 13). This cosmid DNA was used for EcoRI, PstI, BssHI and And SgrA1 were also restricted. This is the size estimation of cosmid inserts and AFLP Allows confirmation of overlap between various cosmids as determined by fingerprint You.   2. Identification of clone containing NIM1 gene     Cosmids made from clones spanning the NIM1 region were transformed into helper strain HB101 (pR K2013) via Agrobacterium tumefa via mating transfer in a three-parent cross Transferred to Agrobacterium tumefaciens AGL-1. Then this Vacuum penetration (Mindrinos et al., 1994, Cell 78, 1089-1099) using these cosmids This was used to transform a kanamycin sensitive nim1-1 Arabidopsis system. Soak Transparent Seed from the plant is recovered and contains 50 mg / ml kanamycin as a selection factor. Germinated on a GM agar plate. Only plantlets transformed with cosmid DNA Detoxified the selection factor and survived. After growing a seedling that survived the selection After about two weeks, they were transferred to soil and tested for the nim1 phenotype as described below. n Transformed plants that no longer have the im1 phenotype are cosmids containing a functional NIM1 gene. To identify.   3. Testing for the nim1 phenotype of transformation   Plants transferred to soil were grown in phytotrons for about one week after transfer. Apply 300μm INA with a thin mist to completely cover the plant using chromister did. Two days later, leaves were harvested for RNA extraction and PR-1 expression analysis. Next to the plant Spray Peronospora parasitica (EmWa isolate) And 19 ° C day / 17 ° C night temperature and humid conditions in a growth chamber. And 8h light / 16h dark cycle. Eight to ten days after the fungal infection, the plants are evaluated And a positive or negative rating for fungal growth. Same for Ws and nim1 plants And served as controls for each experiment.   Total RNA was extracted using LiCl / phenol extraction buffer (Verwoerd et al., NAR 17: 2362) And extracted from the recovered tissue. RNA sample on formaldehyde agarose gel Electrophoresed and blotted onto GeneScreen Plus (Du Pont) membrane. Block To32Hybridized with a P-labeled PR-1 cDNA probe. Obtained The lot was exposed to film and which transformants were able to induce PR-1 expression after INA treatment. Decided to come. Table 16 summarizes these results.   Table 16 shows the complementation of the nim1 phenotype by cosmid clones.  Example 7   Sequencing of NIM1 gene region of 9.9kb   Origin of DNA using BAC04 DNA (25 μg; obtained from Key Gene) for sequence analysis And This BAC is a clone that completely covers the region that complements the nim1 mutation. Rukoto has been shown. Cold Sprin DNA Random shearing was performed using a technique derived from g Harbor. Briefly, neat BAC DNA Sheared to an average molecular weight of about 2 kb with a riser. DNTP, the tip of the shear fragment Two-step process with T4 DNA polymerase and Klenow fragment (Boehringer) Repaired with Tokor. Run the tip repair DNA on a 1% low melting point agarose gel, The region between 1.3 kb and 2.0 kb was excised from the gel. Freeze-thaw DNA The gel was isolated from this gel fragment. Next, the DNA is digested with EcoRV pBRKan F4. And ligated at 4 ° C. overnight. pBRKan F4 is Kolav i Bhat G. It is a derivative of pBRKan F1 obtained from Vanderbilt University (Blat, K. et al. S., Gene 134 (1), 83-87 (1993)). E. FIG. E. coli strain DH5a And transforming the transformation mixture with kanamycin and X-gal. The plate was cultured on the containing plate. 1600 white or pale blue KanR colonies Selected for plasmid isolation. Individual colonies were transferred to 1.5 ml of TB + Kan (50 μg / ml) into a 96-well deep-bottom plate (Polyfiltronics, # U508). Cover the plate and on a rotating platform shaker For 16 hours at 37 ° C. Plasmid DNA from Wizard Plus 9600 Miniprep System (Promega, # A7000) according to the manufacturer's specifications.   Plasmid is transferred to Dye Terminator chemistry (Applied Biosystems PRISM Dye Term inator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, P / N 402078) and plasmid Both strands were sequenced using primers designed for sequencing. Day Were collected on an ABI 377 DNA sequencer. About 75% of these reactants are useful Sequence information was provided. Sequences are sequenced by Sequencer 3.0 (Gene Codes Corporation), Staden  gap 4 (Roger Staden, email address rs @ mrc-1mb, ca m. ac. uk) and PHRED (Phil Green, e-mail address phg＠u.washington.e) edited using du) and assembled into contigs. The largest contig (about 76k b) complement to independent calls / base with an average depth of 7 Sexual area was covered.   The region of about 9.9 kb defined by the overlap of cosmids E1 and D7 contains the nim1 region. Were identified by complementary analysis. Adjacent to the vector insertion site and Oligo 5.0 primer analysis software (Nationa l Biosciences, Inc.). Modification of the ammonium acetate method for DNA Cosmid using Ryo (Traynor, P.L., 1990, Bio Techniques 9 (6): 676) Isolated from D7 and E1. This DNA was obtained using the above dye terminator chemistry. And sequenced. The resulting sequence determines the end of the complementing region.   A truncated version of the BamHI-EcoRV fragment was also constructed and A construct containing no "child 3" region was obtained (FIG. 13). The following approach is DNA Bam -Required due to the presence of a HindIII site in the Spe region. BamHI-EcoRV structure The digest was completely digested with SpeI and then into two independent reactants for double digestion divided. One aliquot was digested with BamHI and the other with HindIII. 2l8bp A BamHI-SpeI fragment and a 1588 bp HindIII-SpeI fragment Isolate from Loose gel (Qia Quick Gel extraction kit) and remove BamHI-HindIII And ligated to pSGCGO1. DH5a was transformed with this ligation mixture. Converted. Use the Wizard Magic MiniPreps (Promega) to obtain colonies. After DNA preparation, screen for correct insert by digestion with HindIII. I did it. Clones containing the correct construct were used to transform Arabidopsis plants. Electroporation into Agrobacterium strain GV3101 Was an option.   Example 8   Identification of NIM1 gene region by allele sequencing  1. Gene analysis     To determine the dominance of various mutants displaying the nim1 phenotype, The pollen from the product was transferred to stigmas of nim-1, -2, -3, -4, -5, -6. if If the mutation is dominant, a nim1 phenotype will be observed in the resulting F1 plant. Would. If the mutation is inferior, the resulting F1 plant will exhibit a wild-type phenotype. U.   The data shown in Table 17 shows that nim-1, -2, -3, -4 and -6 were crossed with the wild type. The results show that the resulting F1 exhibits a wild-type phenotype. Thus, these bumps Mutations are inferior. In contrast, all nim1-5 × wild-type F1 progeny have the nim1 phenotype. , Indicating that this is a dominant mutation. After INA treatment, it becomes a wild type plant In P. No Parasitica microspore formation was observed, while the F1 plants showed P. Parastika Growth and some microspore formats. However, these F1 plants The phenotype of nim1 is too poorly observed when nim1-5 is homozygous. Did not.   To determine allele, pollen from kanamycin resistant nim1-1 mutant plant Was transferred to stigmas of nim1-2, -3, -4, -5, -6. Species derived from this cross The plate was placed on a Murashige-Skoog B5 plate containing kanamycin at 25 μg / ml. The seeds were cultured to confirm the hybrid origin of the seeds. Kanamycin resistant (F1) plants Were transferred to soil and assayed for the nim1 phenotype. nim1-5 mutant And Fs progeny of the cross between Ws and the wild type show the nim1 phenotype. Analysis of 1 F2 was also performed.   As shown in Table 17, all of the resulting F1 plants exhibited the nim1-1 phenotype. . Thus, the mutation in nim1-2, -3, -4, -5, -6 is nim1-1 Were not complemented by: these plants all belonged to the same complementing group and therefore alleles It is. nim1-5 × n Analysis of the F2 progeny from im1-1 also showed a nim1 phenotype, with nim1-5 indicating the nim1 allele. Was confirmed.   2. Sequence analysis and subcloning of NIM1 region   A 9.9 kb region including the NIM1 region using Sequencher 3.0 and GCG package Analyze the presence of open reading frames in all six frames did. Four regions including the large ORF were identified as potential genes (gene region 1 to 4). These four regions were converted from wild-type parent and 6 kinds of nim1 allele mutated DNA to PC. R was amplified. Primers for these amplifications were oligo-5.0 (National Bioscien ces, Inc.) and Integrated DNA Technologies, Inc. By Synthesized. The PCR products were separated on a 1.0% agarose gel and QlAquick Gel Purification was performed using an extraction kit. Use purified genomic PCR products for primary amplification Sequenced primers and any regions not covered by this primary primer Direct sequencing was performed utilizing additional primers designed to determine. The average coverage of these gene regions is 3.5 decodings / base.   Sequences were edited using Sequencher 3.0 and assembled. Various nim1 alleles A base change specific to was identified only in the region designated as gene region 2.   The positions listed in Table 18 relate to Figure 14 and to the upper strand of the 9.9 kb region shown in Figure 13. I do. In FIG. 13, open libraries derived from the gene regions described in 1, 2, 3, and 4 And the changes in the various nim1 alleles are tabulated. Show. The change in description is on the upper chain 5φ-3φ as related to FIG.     NIM1 gene cloned and found to be in gene region 2 Because the remains in all six nim1 alleles Amino acid changes or changes in the sequence within the open reading frame of gene region 2 Because there is. At the same time, at least one of the nim1 alleles No change was found in the open reading frames within and 4. Therefore, The only gene within the 9.9 kb region that can be NIM1 is gene region 2, the NIM1 gene. You.   Table 18 shows the Ws section for Arabidopsis Colombian ecotypes. This suggests a change in the Ws ecotype of bidopsis. Figures 13, 14, 15 and arrangement Everything else in our experiments was Arabidopsis containing the wild-type gene. Closely related to the Colombian ecotype. The change is due to the gene 2 or NIM1 region Shown as amino acid changes and as base pair changes in other regions.   FIG. 13 shows the cloning of the NIM1 gene and shows four different Panel. FIG. 14 shows the sequence of the entire 9.9 kb region in the same direction as shown in FIG. Show. FIG. 15 shows the sequence of the specific NIM1 gene region, which is the gene region 2 shown in FIG. Yes; the sequence of FIG. 15 contains the NIM1 gene. Figure 15 shows amino acids in the one-letter code Sequence and the full-length cDNA and RACE gene obtained in uppercase in the DNA sequence. Indicates a product. Some of the allelic mutations found are shown above the DNA sequence, And the changed specific nim1 allele is shown.   Sequence analysis of the region and sequencing of the various nim1 alleles (see below) were performed on the nim1 family. Allows identification of cosmid regions containing genes. This region is ~ 5.3 kb BamHI-Eco Depicted by RV restriction fragments. D7-derived cosmid DNA and pBlue Scri Plasmid DNA derived from ptII (pBSII) was digested with BamHI and EcoRV (NEB). D7 A 5.3 kb fragment of interest was isolated from an agarose gel and QIA quick gel And purified using an extraction kit (# 28796, Qiagen). This fragment overnight And ligated to Bam-EcoRV-digested pBSII And the ligation mixture was E. coli strain DH5a was transformed. A colony containing the insert was selected, the DNA was isolated, and digested with HindIII. It was confirmed by the conversion. Transformation of Bam-EcoRV fragment into Arabidopsis For conversion, it was processed into a binary vector (pSGCG01).   3.4 Northern analysis of four gene regions   Identical Northern blots have been published previously (Delaney et al., 1995, PNAS 92, 66). 02-6606) Samples isolated from water-, SA-, BTH- and INA-treated Ws and nim1 systems Made more. These blots were identified in the 9.9 kb NIM1 gene region. Hybridization was performed with PCR products prepared from the four gene regions. NIM1 inheritance Only the gene region containing the offspring (gene region 2) is detectable in the RNA sample Contains a transcribed gene that has residibility and only the NIM1 region can be detected (Figure 16 and Table 18).   Table 18 shows nim1 allele sequence mutations.  The positions listed in the table relate to FIG. 14, which contains a 9.9 kb sequence. All alleles nim1-1 ~ nim1-6 is the WS strain. Columbia-0 is wild type.   We found that gene region 2 (Fig. 13) could perform functional NIM1 It has also been demonstrated to contain genes. BamHI / HindIII genomic DNA containing gene region 2 Fragment was isolated from cosmid D7 and the gene for kanamycin resistance (Figure 13: Steve Goff, individual) Personal contact). The resulting plasmid was transformed into Agrobacterium strain GV3101, And positive clones were selected with kanamycin. Roller of selection using PCR It was determined whether the knee contained the plasmid. Before kanamycin sensitive nim1-1 plant The bacteria were infiltrated as described. The resulting seeds are collected and 50 μg / ml Grown on GM agar containing kanamycin. Transfer the surviving plants to the soil And tested for complementation. Transformed plants and control Ws and nim1 Plants were sprayed with 300 μm INA. Two days later, leaves were subjected to RNA extraction and PR-1 expression analysis Collected for Next, we add Peronospora parasitica (EmWa isolate) to this plant. Sprayed and grown as described above. 10 days after the fungal infection, the plants are evaluated And a positive or negative rating for fungal growth. All of the 15 transgenic plants And Ws controls are negative for fungal growth after INA treatment, while nim1 controls. The roll was positive for fungal growth. These transformants and controls RNA was extracted and analyzed as described above. Ws control and all 15 transformants showed PR-1 gene induction after INA treatment, while nim1 control Did not show PR-1 induction by INA.   4. Isolation of NIM1 cDNA   Made in the IYES expression vector (Elledge et al., 1991, PNAS 88, 1731-1735). Plate of the Arabidopsis cDNA library Carried out. Filters were made from nim-1 containing gene regions32P-labeled PCR Hybridized with the product. 14 positives screen about 150,000 plaques Identified by Each plaque was purified and plasmid DNA was recovered . The cDNA insert is digested out of the vector using EcoRI and agarose gel is removed. Purified and sequenced. The sequence obtained from the longest cDNA is shown in FIG. we To confirm that the 5φ end of the cDNA was obtained, use the Gibco BRL5'RACE kit Used according to the specifications. The resulting RACE product was sequenced and shown in FIG. It was found to contain additional bases. Exist in both cDNA clones and RACE The transcription region detected in is shown in uppercase in FIG. Allele changes on the DNA strand Shown in Uppercase letters indicate the presence of sequences detected in cDNA clones or after RACE PCR. Show.   Example 9     Characterization of NIM1 gene   Multiple sequence alignments were performed using Clustal V (Higgins, Desmond G. and Paul M. Sharp (1989), Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcompute r,CABIOS 5: 151-153), DNA for Macintosh (1994)*(1228 South Park St reet. Madison Wisconsin, 53715) Lansergene Biocomputing Software Package Built as part of the di.     The predetermined region of the NIM1 protein has four rice cDNA proteins in the amino acid sequence. It was determined to be homologous to the protein product. Homology is Gen Bank BLAST search Was identified using the NIM1 sequence. A comparison of homology regions in NIM1 and rice cDNA products is shown in FIG. . The NIM1 protein fragment has an amino acid identity of 36-48% with the four rice products. 3 shows the acid sequence.   Example 10   Phenotypic characterization of various nim1 alleles   1. Analysis of chemical reactivity in nim1 allele   We look at the PR gene expression and chemical induction of Peronospora parasitica resistance. Differences between the various nim1 alleles were analyzed (see FIGS. 17 and 18).   Treating mutant plants with chemical inducers and treating PR gene expression and disease resistance did.   2. Plant growth and chemical application   Wild-type seed and each nim1 allele (nim1-1, -2, -3, -4, -5, -6) Metr covered seeds with a clear plastic dome and left at 4 ° C in the dark o Seeded on Mix 300 growth medium for 3 days. After treatment at 4 ° C for 3 days, the plants are I've been in Aittron for two weeks. About 2 weeks after cultivation, 4 shoots germinated Provided true leaves. Then plant HTwoO, 5 mM SA, 300 μM BTH or 30 Treated with 0 μM INA. Use chromisters for chemicals to completely cover shoots It was applied with a fine mist. Return the water control plant to the growing phytotron, Plants are kept elsewhere, but in the same phytotron. Was. After three days, the plants were divided into two groups. The first group consists of RNA extraction and Collected for analysis. The second group has P.I. Parasitica was inoculated.   3. Peronospora parasitica inoculation and analysis   P. Parasitica isolate "EmWa" is a P.p. isolate that fits the Ws ecotype. Compatible isolates are those that can cause disease in a particular host. P. Parasitica isolate "NoCo" against Ws Incompatible, but compatible with the Colombian ecotype. Incompatibility Pathogens are recognized by latent hosts and elicit a host response that prevents disease progression. Conversion Three days after academic application, water and chemical treated plants were inoculated with compatible "EmWa" isolates. "NoCo" inoculation was performed only on water-treated plants. After inoculation, clear plastic Cover with a dome and use effective P.D. Maintain the high humidity required for Grown at 19 ° C day / 17 ° C night temperature and 8h light / 16h dark cycle I put it in the bar.   At various time points after inoculation, plants were examined microscopically for development. True when expanded Fungal sporulation can be observed at a very early onset stage. 5d, 6d, 7d of inoculation The plants / pots showing sporulation at, 11d and 14d are determined and the sporulation density is also noted. Recorded.   FIG. Figure 2 shows disease assessment of various nim1 alleles after Parastika inoculation. Most prominent Standing time is 5 and 6 days after inoculation. On the 5th day after inoculation, nim 1-4 was carried out. ~ 80% of infections under all induced chemical treatments, indicating that this allele / genotype Suggests having the worst disease susceptibility. On the 6th day after inoculation, nim-1, -2, -3, -4 and -6 showed significant disease incidence under all induced chemical treatments. I However, nim1-5 had a lower infection than Ws wild-type on day 6 under all treatments Has a prevalence. nim1-2 seems to be an intermediate in disease susceptibility after BTH This is not the case with other guidance processes.   As for PR-1 gene expression, nim1-4 is most responsive to all treatment-induced chemicals. Low (FIG. 17), nim1-5 shows elevated PR-1 expression levels without inducer Suggests. These PR-1 gene expression results are Diseases carried out in Parasitka Consistent with the assessment (FIG. 18), and the nim1 allele may be responsible for resistance or sensitivity Suggests You.   The sample obtained above was used to analyze NIM1 gene expression (FIG. 17). . NIM1 mRNA is present in untreated control samples in wild-type plants Was. NIM1 mRN after treatment with SA, INA, BTH or infection with a compatible pathogen A accumulated to a high level. Difference in NIM1 message (mRNA) compared to wild type It was observed in the nim1 allele. NIM1 mRNA levels in untreated mutant plants Is better than that observed in the wild type, except for nim1-2 and -5, which are close in amount. It was too low. nim1-1, -3 and -4 have low level NIM1 messages, On the other hand, nim1-6 had very little NIM1 mRNA accumulation. SA, INA or BTH Increased NIM1 mRNA was observed in nim1-1, -2, -3, and nim1-5 or 6 Was not observed. However, this increase was observed in wild-type plants. It was lower than the one. After pathogen infection, hybridize to NIM1 cDNA probe Additional bands were observed in both wild type and mutant, and NI M1 mRNA levels were higher than untreated controls, except for nim1-6.   FIG. 18 shows various nim1 alleles at various times after inoculation of Peronospora parasitica 3 shows the evaluation of disease resistance through infection grade of NahG plants. WsWT indicates Ws wild type parent In which the nim1 allele has been identified. The various nim1 alleles are shown in the table , And also the NahG plant. The NahG plant has already been announced. (Delaney et al., Scien ce 266, pp. 1247-1250 (1994)). NahG Arabidopsis is also described in WO95 / 19443 ing.   NahG gene is a sari derived from Pseudomonas putida Converts tilic acid to catechol, and thus the essential signal transduction of SAR in plants Eliminates the accumulation of salicylic acid Is a gene. Thus, NahG Arabidopsis plants do not show normal SAR. Further , They generally show much higher susceptibility to pathogens. Therefore, the NahG plant Is responsible for some sort of universal sensitivity control. In addition, the NahG plant has the chemical inducers INA and And respond further to BTH. This is shown in the lower two panels of FIG.   From FIG. 18, it can be seen that the nim1-4 and nim1-6 alleles appear to be more severe. I can guess. This is the panel EmWa BTH described at the bottom of this figure, as described earlier in the results section. From the results described in the panel, it is easier to observe at an earlier time. Change In addition, the nim1-5 allele shows the greatest response to both INA and BTH, and therefore It is a weak nim1 allele.   NahG plants show very good response to both INA and BTH, and nim1 It was very similar to the -5 allele. However, as late as the 11th day in the figure In point, the disease resistance induced in NahG plants began to disappear, and the association between INA and BTH Among them, INA-induced resistance is much higher than that induced in NahG plants by BTH There is a significant difference in that they disappear quickly and severely. Smell these experiments What is further observed is that INA and BTH induce very good tolerance in Ws to EmWa And nim1-1, nim1-2 and other nim1 alleles in terms of disease resistance , SA or INA in effect.   FIG. Pars of plants showing sporulation after infection with Parasitica by EmWa varieties The percentages are listed, and each bar graph is the day after infection that graded disease resistance Indicates a number.   The Northern analysis for analyzing the expression of the SAR gene PR1 was performed using the same sample as shown in FIG. Was carried out. FIG. 17 shows wild-type plants as demonstrated by high PR1 gene expression. Are salicylate, INA, BTH, and Shows a very good response to pathogen infection. On the other hand, nim1-1 Alleles only show very restricted responses to all chemical inducers, including pathogens Absent.   Pathogen induction is several times higher in the nim1-1 allele than in the wild type. nim1 -2, nim1-3 and nim1-6 alleles are nim1-1 alleles for various treatments. Show a similar response. However, the nim1-4 allele is not compatible with any of the inducers utilized. Virtually no expression. Basically, all background levels are observed It is. The nim1-5 allele has a very high background compared to the water control. Level, and the background level is maintained in all processes Was done. However, there was little or no induction by the chemical inducer.   NahG plants carry good control and they can induce PR-1 in the presence of SA I couldn't do it. On the other hand, both INA and BTH have very strong high level expression of PR-1 Was induced. The effect of pathogen infection was similar to that of SA. EmWa treated NahG plants Did not express PR-1.   These RNA samples generated in induction studies were also used as probes for full-length cDNA It was probed with the NIM1 gene using a loan. In FIG. 16, INA is wild It is found that NIM1 gene is induced in type Ws allele. However, nim1 The -1 mutant allele shows low basal level expression of the NIM1 gene and Is not induced. This is observed in nim1-3 allele and nim1-6 allele It was similar to what was done. nim1-2 allele is almost normal in untreated samples Levels and induction similar to that of the wild-type sample, as in the nim 1-4 allele. Indicated. The nim1-5 allele exhibits high basal level expression of the NIM1 gene, and By chemical inducer Induced expression was much stronger.   Induction of NIM1 by chemical inducers of resistance or other inducers is a defense in pathogen defense Consistent with its role, and further we were able to obtain the correct gene for the 9.9kb region Prove that.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ６０／０３３，１７７ (32)優先日 平成８年12月13日(1996．12．13) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／７７３，５５９ (32)優先日 平成８年12月27日(1996．12．27) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０３５，０２２ (32)優先日 平成９年１月10日(1997．1．10) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 フレドリッチ，レスリー ベザーズ アメリカ合衆国，ノースカロライナ 27513，ケイリー，ノース ウッドシェッ ド コート 106 (72)発明者 ウェイマン，クリスティアーナ アメリカ合衆国，オレゴン 97202，ポー トランド，サウス イースト サーティフ ォース ストリート 7033 (72)発明者 ジョンソン，ジェイ アール. アメリカ合衆国，ノースカロライナ 27596，ヤングスビル，フォックス ハン ト コート 112 (72)発明者 ロートン，ケイ アン アメリカ合衆国，ノースカロライナ 27612，ローリー，クルックト シュート コート 8016 (72)発明者 エリス，ダニエル マーレイ アメリカ合衆国，ノースカロライナ 27511，ケイリー，メドコン コート 201────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (31) Priority claim number 60 / 033,177 (32) Priority date December 13, 1996 (December 13, 1996) (33) Priority country United States (US) (31) Priority claim number 08 / 773,559 (32) Priority date December 27, 1996 (December 27, 1996) (33) Priority country United States (US) (31) Priority claim number 60 / 035,022 (32) Priority Date January 10, 1997 (1.10.1997) (33) Priority country United States (US) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, S D, SZ, UG), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ , MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU , AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, G B, GE, GH, HU, IL, IS, JP, KE, KG , KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, N O, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG , SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU (72) Inventor Fredrich, Leslie Bethers             North Carolina, United States             27513, Kaley, North Woodshed             De Cote 106 (72) Inventors Weiman, Christiana             United States, Oregon 97202, Po             Toland, South East 3045             Oath Street 7033 (72) Inventors Johnson, JR.             North Carolina, United States             27596, Youngsville, Fox Han             To Coat 112 (72) Inventor Lawton, Kay Ann             North Carolina, United States             27612, Raleigh, Crooked Shoot               Coat 8016 (72) Inventors Ellis, Daniel Murray             North Carolina, United States             27511, Kaley, Medcon Court 201

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． NIM１遺伝子を含んで成る単離されたDNA分子。 ２．SEQ ID NO：２に記載のヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１記載の 単離されたDNA分子。 ３． NIM１遺伝子生成物をコードする約9.9kbの単離されたDNA分子。 ４．SEQ ID NO：１に記載のヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１記載の 単離されたDNA分子。 ５．SEQ ID NO：２に記載のNIM１遺伝子生成物のアミノ酸配列をコードする、 請求項１記載の単離されたDNA分子。 ６． nim１遺伝子である、請求項１記載のNIM１の突然変異体を含んで成る単 離されたDNA分子。 ７．クローンBAC−04，ATCC寄託番号97543。 ８． NIM１遺伝子生成物のアミノ酸配列をコードする異種DNA分子に作用可能 式に連結された植物において活性なプロモーターを含んで成るキメラ遺伝子。 ９．請求項３記載の異種DNAフラグメントに作用可能式に連結された植物にお いて活性なプロモーターを含んで成るキメラ遺伝子。 10．SEQ ID NO：２に記載のアミノ酸配列をコードする異種DNA分子に作用可能 式に連結された植物において活性なプロモーターを含んで成るキメラ遺伝子。 11． nim１遺伝子生成物のアミノ酸配列をコードする異種DNA分子に作用可能 式に連結された植物において活性なプロモーターを含んで成るキメラ遺伝子。 12．請求項８〜11のいづれか１項記載のキメラ遺伝子を含んで成る組換ベクタ ー。 13．前記ベクターが宿主細胞に安定的に組込まれることができる、請求項12記 載の組換ベクター。 14．前記ベクターが植物、植物種子、植物組織又は植物細胞に安定的に組込ま れることができる、請求項12記載の組換ベクター。 15．請求項８〜11のいづれか１項記載のキメラ遺伝子を含んで成る植物発現カ セット。 16．請求項８〜10記載のキメラ遺伝子を含んで成る植物発現カセット。 17．請求項11記載のキメラ遺伝子を含んで成る植物発現カセット。 18．前記キメラ遺伝子を連続的又は構成的に発現する、請求項15〜17記載の植 物発現カセット。 19．請求項８〜11のいづれか１項記載のキメラ遺伝子を含んで成る植物、植物 細胞又はその子孫。 20．広域病気耐性をもつ、請求項８〜10のいづれか１項記載のキメラ遺伝子を 含んで成る植物、植物細胞又はその子孫。 21．請求項11記載のキメラ遺伝子を含んで成る植物、植物細胞又はその子孫。 22．前記植物が裸子植物、単子葉植物及び双子葉植物より成る群から選ばれる 、請求項19記載の植物、植物細胞又はその子孫。 23．前記植物が作物植物である、請求項19記載の植物、植物細胞又はその子孫 。 24．前記植物がコメ、コムギ、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、ポテト、 ニンジン、サツマイモ、テンサイ、インゲン豆の実、エンドウマメ、チコリ、レ タス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリ、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、 アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリー、ニンジン、ス カッシュ、カ ボチャ、ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、クインス、メロン、プラム、チ ェリー、モモ、ネクタリン、アプリコット、イチゴ、グレープ、ラズベリー、ブ ラックベリー、パイナップル、アボガド、パパイヤ、マンゴ、バナナ、ダイズ、 タバコ、トマト、ソーガム及びサトウキビより成る群から選ばれる、請求項23記 載の植物、植物細胞又はその子孫。 25．植物の病気耐性を授ける遺伝子としての、請求項１記載の単離されたDNA 分子の利用。 26．植物に広域病気耐性と誘導することが化合物を同定するためのスクリーニ ング方法における請求項１記載の単離されたDNA分子又はその変異体の利用。 27．植物に広域病気耐性の発現を可能にさせる単離された遺伝子フラグメント を同定するための請求項17記載の植物表現型の利用。 28．植物細胞、植物及びその子孫に病気耐性を授けるための請求項１〜５のい づれか１項記載の単離されたDNA分子の利用。 29．植物細胞、植物及びその子孫に万能病気感受性を授けるための請求項６記 載の単離されたDNA分子の利用。 30．繁殖を通じて植物系に耐性特性を組込むための請求項20記載の耐性植物及 びその子孫の利用。[Claims]   1. An isolated DNA molecule comprising the NIM1 gene.   2. 2. The method of claim 1, comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. An isolated DNA molecule.   3. An approximately 9.9 kb isolated DNA molecule encoding the NIM1 gene product.   4. 2. The method of claim 1, comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. An isolated DNA molecule.   5. Encodes the amino acid sequence of the NIM1 gene product of SEQ ID NO: 2, An isolated DNA molecule according to claim 1.   6. 2. A single gene comprising a mutant of NIM1 according to claim 1 which is the nim1 gene. A separated DNA molecule.   7. Clone BAC-04, ATCC deposit no. 97543.   8. Acts on heterologous DNA molecules encoding the amino acid sequence of the NIM1 gene product A chimeric gene comprising a promoter active in plants linked in a formula.   9. A plant operably linked to the heterologous DNA fragment according to claim 3. And a chimeric gene comprising an active promoter.   Ten. Acts on a heterologous DNA molecule encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 A chimeric gene comprising a promoter active in plants linked in a formula.   11． Acts on heterologous DNA molecules encoding the amino acid sequence of the nim1 gene product A chimeric gene comprising a promoter active in plants linked in a formula.   12． A recombinant vector comprising the chimeric gene according to any one of claims 8 to 11. -   13. The method according to claim 12, wherein the vector is capable of being stably integrated into a host cell. Recombination vector shown.   14. The vector is stably integrated into a plant, plant seed, plant tissue or plant cell 13. The recombinant vector according to claim 12, wherein the recombinant vector can be used.   15． A plant-expressed mosquito comprising the chimeric gene according to any one of claims 8 to 11. set.   16． A plant expression cassette comprising the chimeric gene according to claim 8.   17． A plant expression cassette comprising the chimeric gene according to claim 11.   18． The plant according to claim 15, wherein the chimeric gene is continuously or constitutively expressed. Product expression cassette.   19. A plant or plant comprising the chimeric gene according to any one of claims 8 to 11. Cell or its progeny.   20. The chimeric gene according to any one of claims 8 to 10, which has wide-range disease resistance. A plant, plant cell or progeny comprising the same.   twenty one. A plant, plant cell or progeny thereof comprising the chimeric gene according to claim 11.   twenty two. Said plant is selected from the group consisting of gymnosperms, monocots and dicots 20. The plant, plant cell or progeny thereof according to claim 19.   twenty three. The plant, plant cell or progeny thereof according to claim 19, wherein the plant is a crop plant. .   twenty four. The plant is rice, wheat, barley, rye, corn, potato, Carrots, sweet potatoes, sugar beet, kidney beans, peas, chicory, les Tas, cabbage, cauliflower, broccoli, turnip, radish, spinach, Asparagus, onion, garlic, eggplant, pepper, celery, carrot, savory Kash, mosquito Bocha, zucchini, cucumber, apple, pear, quins, melon, plum, chi Jelly, peach, nectarine, apricot, strawberry, grape, raspberry, peach Rackberry, pineapple, avocado, papaya, mango, banana, soybean, 24. The method according to claim 23, wherein the member is selected from the group consisting of tobacco, tomato, sorghum, and sugarcane. Plant, plant cell or progeny thereof.   twenty five. 2. The isolated DNA according to claim 1, as a gene that confers plant disease resistance. Use of molecules.   26. Screenini to identify compounds that induce widespread disease resistance in plants Use of the isolated DNA molecule according to claim 1 or a mutant thereof in a aging method.   27. An isolated gene fragment that allows plants to develop broad-spectrum disease resistance Use of the plant phenotype according to claim 17 for identifying a plant.   28. 6. The method according to claim 1, which confers disease resistance to plant cells, plants and their progeny. Use of the isolated DNA molecule of any one of claims 1 to 4.   29. 7. The method for conferring universal disease susceptibility on plant cells, plants and their progeny. Use of the isolated DNA molecule described above.   30. 21. A resistant plant and a plant according to claim 20 for incorporating tolerance characteristics into a plant system through breeding. And the use of their descendants.
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