【発明の詳細な説明】
ＡＡＶベクターの生産系
本発明は、ＡＡＶベクターの生産に好適な系およびその使用に関する。
遺伝子治療法を行なうために、外来遺伝子を細胞のゲノムに導入することがで
き、かつ細胞にとって有毒でないベクターを持つことは重要である。かかるベク
ターとしては、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｓ）である。
ＡＡＶｓは、パルボウイルス科に属する一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶ
ｓは、複製のために、ヘルパーウイルス、具体的にはアデノウイルスまたはヘル
ペスウイルスを必要とする。ヘルパーウイルスの非存在下では、ＡＡＶｓは、宿
主細胞のゲノム、具体的には、第１９染色体の特異的な部位に組み込む。
ＡＡＶｓのゲノムは直鎖状であり、約４６８０ヌクレオチドの長さを有する。
それは、構造遺伝子および非構造遺伝子をコードする２つの読み枠を含有する。
構造遺伝子をｃａｐ遺伝子と称する。それは、Ｐ４０プロモーターにより制御さ
れ、３つのカプシド蛋白質をコードする。非構造遺伝子をｒｅｐ遺伝子と称し、
Ｒｅｐ蛋白質であるＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコ
ードする。前者２つの蛋白質は、Ｐ５プロモーターの制御下で発現し、一方、Ｒ
ｅｐ５２およびＲｅｐ４０の発現は、Ｐ１９プロモーターにより制御されている
。Ｒｅｐ蛋白質の機能は、とりわけ、ＡＡＶゲノムの複製と転写の制御により表
わされる。
しかしながら、ＡＡＶｓの生産は、極めて問題が多い。特に、大量の組換えＡ
ＡＶｓ（ｒＡＡＶｓ）、即ち外来ＤＮＡを含むＡＡＶｓを調製することは、困難
である。アデノウイルスをｒＡＡＶｓ用のベクターとして使用する試みでも、満
足な結果を得ていない。
したがって、本発明の目的は、ｒＡＡＶｓを大量に提供することができる試薬
（Ｍｉｔｔｅｌ）を提供することにある。
本発明によれば、これは、請求項に規定された主題により達成される。
したがって、本発明の主題は、外来遺伝子を含有するベクターと、（ａ）シス
または（ｂ）トランスで存在してＡＡＶベクターまたはその一部のＤＮＡ複製に
関して発現が遅延されるＡＡＶのｒｅｐ６８／７８配列とを含有する系に関する
。
本発明は、ＡＡＶのＲｅｐタンパク質６８および７８がＡＡＶ ＤＮＡの複製
を減じ、かつこの減損が該Ｒｅｐタンパク質６８および７８をコードする配列の
遅延した発現により妨げられうるという出願人の発見に基づく。
「ＡＡＶベクター」という語句は、ＡＡＶベクターまたはその一部のＤＮＡ複
製に関係して遅延しない様式で発現したＡＡＶのｒｅｐ６８／７８配列を含まな
いいかなるＡＡＶベクターにも適用する。「ＡＡＶベクターの一部」という語句
は、ＡＡＶベクターのいかなる部分、具体的には、そのｃａｐ配列ならびにＲｅ
ｐタンパク質４０および５０をコードする配列に関する。
「ＡＡＶのｒｅｐ６８／７８配列」という語句は、本発明の系がＡＡＶベクタ
ーまたはその一部のＤＮＡ複製に関係して発現が遅延されるｒｅｐ６８配列およ
び／またはｒｅｐ７８配列を含有するという事実をいう。
「外来ＤＮＡ」という語句は、前記ＡＡＶベクターに組み込んでもよいいかな
る外来ＤＮＡをも含有する。該外来ＤＮＡはコードしていなくてもよく、コード
していてもよい。前者の場合、該外来ＤＮＡは、ＤＮＡ複製および／または転写
のレギュレーターであってもよく、制御エレメントであってもよい。後者の場合
、外来ＤＮＡが発現可能であることが好ましく、発現が、組織特異的なプロモー
ターもしくは腫瘍特異的なプロモーターなどの構成プロモーターまたは誘導可能
なプロモーターにより制御されることが特に有利である。さらに、外来ＤＮＡは
診断用および／または治療用タンパク質をコードしてもよい。治療用タンパク質
としては、例えば、腫瘍壊死因子；インターフェロン；インターロイキン；リン
フォカイン；成長因子；凝固因子および代謝酵素などの血漿タンパク質；ならび
にレセプターなどが挙げられる。特に、外来ＤＮＡは細胞の免疫原性を増加させ
うるタンパク質をコードしていてもよい。これらは、腫瘍細胞を欠いているタン
パク質、例えばサイトカイン類、ＩＬ−２、インターフェロンおよびＧＭ−ＣＳ
Ｆなど、ならびに補助剌激分子、Ｂ７−１など、腫瘍関連抗原、例えば、ＭＡＧ
Ｅ１、チロシナーゼ、リンホン−特異的イディオタイプならびにウイルスタンパ
ク質、例えば、ヒトパピローマウイルスのＥ７タンパク質およびエプスタイン−
バールウイルスのＥＢＮＡ３タンパク質などであってもよい。該外来ＤＮＡはＡ
ＡＶベクターのいかなる部位に組み込まれていてもよい。好ましくは、複数の外
来ＤＮＡｓが１つのＡＡＶベクターに存在していてもよい。
本発明の系は、（ａ）ＡＡＶベクターと、シスで、即ち、該ＡＡＶベクター上
で、ＡＡＶベクターまたはその一部のＤＮＡ複製に関係して遅延した様式で発現
する本発明のＡＡＶのｒｅｐ６８／７８配列とを含有する。かかるＡＡＶベクタ
ーは慣用の方法により得ることができる。ＡＡＶのＲｅｐタンパク質をコードす
るＤＮＡを有するＡＡＶベクターを基本として用いることが好ましい。かかるＡ
ＡＶベクターにおいて、ＡＡＶのｒｅｐ６８配列およびｒｅｐ７８配列の内因性
のＰ５プロモーターを、ＡＡＶベクターまたはその一部のＤＮＡ複製後に活性で
あるものにより置き換えることができる。かかるプロモーターは、例えば、アデ
ノウイルスまたはその誘導体の「主要後期プロモーター」である。誘導可能なプ
ロモーター、例えば、メタロチオネインプロモーターまたはその誘導体をＡＡＶ
のｒｅｐ６８配列およびｒｅｐ７８配列の内因性のＰ５プロモーターの代わりに
使用することもできる。
好ましい態様として、該ＡＡＶベクターは、（ａ）ＡＡＶベクターの機能性、
具体的には、その複製を減じないいかなる試薬であってもよい試薬（Ｉ）に存在
する。試薬（Ｉ）は、好ましくは、例えば、ウイルスベクターもしくはプラスミ
ドベクターなどのベクターまたは細胞である。
本発明の系は、（ｂ）ＡＡＶベクターと、トランスで、即ち、該ＡＡＶベクタ
ーから離れて、ＡＡＶベクターまたはその一部のＤＮＡ複製に関係して遅延した
様式で発現する本発明のＡＡＶのｒｅｐ６８／７８配列とを含有する。ＡＡＶの
ｒｅｐ６８／７８配列は、好ましくは試薬（ＩＩ）に存在する。それは、ＡＡＶ
のｒｅｐ６８／７８配列の機能性、具体的にはその遅延した発現を減じないいか
なる試薬であってもよい。後者を（ａ）に記載のように得ることができる。試薬
（ＩＩ）は、例えば、ウイルスベクターもしくはプラスミドベクターなどのベク
ター、または細胞が有利である。
（ｂ）において、ＡＡＶベクターが試薬（Ｉ）に存在し、ＡＡＶのｒｅｐ６８
／７８配列は試薬（ＩＩ）に存在することが特に好ましい。試薬（Ｉ）および（
ＩＩ）は前記の意味を有していてもよいが、同時に細胞であってはならない。試
薬（Ｉ）および（ＩＩ）が、例えば、アデノウイルスベクター、またはアデノウ
イルスベクターとワクシニアウイルスベクターとの組み合わせなどのウイルスベ
クターであることが有利である。該ウイルスベクターは互いに相補的であること
が特に好ましい。ウイルスベクターは下記に試薬（Ｉ）および（ＩＩ）として記
載される。これは実施例により考慮されるべきである。
試薬（Ｉ）は、アデノウイルスのＥ１配列の代わりに、ＡＡＶのＩＴＲ配列を
有するＡＡＶベクターと外来ＤＮＡとを含むアデノウイルスベクターである。
試薬（ＩＩ）は、アデノウイルスのＥ３配列の代わりに、ＡＡＶのｒｅｐとｃ
ａｐ配列とを含むアデノウイルスベクターであり、ＡＡＶのｒｅｐ６８／７８配
列は、ＡＡＶベクターまたはその一部のＤＮＡ複製の後に活性なプロモーター、
例えば、アデノウイルスの「主要後期プロモーター」によって制御され、ＡＡＶ
のｒｅｐ４０配列およびｒｅｐ５２配列は、内因性のｐ１９プロモーターによっ
て制御され、ＡＡＶのｃａｐ配列は、例えば、ＣＭＶプロモーターなどの構成的
なプロモーターにより制御される；
あるいは
試薬（ＩＩ）は２つのアデノウイルスベクターの組み合わせであり、そのうちの
１つはアデノウイルスのＥ３配列の代わりにＡＡＶのｒｅｐ配列を含み、ＡＡＶ
のｒｅｐ６８／７８配列は、アデノウイルスの「主要後期プロモーター」により
制御され、ＡＡＶのｒｅｐ４０およびｒｅｐ５２配列は、内因性のｐ１９プロモ
ーターにより制御され、もう一方は、アデノウイルスのＥ４配列の代わりにＣＭ
Ｖプロモーターにより制御されるＡＡＶのｃａｐ配列を含む；
あるいは
試薬（ＩＩ）は、アデノウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターの
組み合わせであり、前者は、アデノウイルスのＥ３配列の代わりに、内因性のｐ
１９プロモーターの制御下のＡＡＶのｒｅｐ４０およびｒｅｐ５２配列、ならび
にＣＭＶプロモーターの制御下のＡＡＶのｃａｐ配列を含み、後者は、ＡＡＶの
ｒｅｐ６８／７８配列を含む。該ワクシニアウイルスベクターは、アデノウイル
スベクターのＤＮＡ複製が完全にまたは部分的に完了するまで添加しない。
本発明の系は、大量に組換えＡＡＶｓ（ｒＡＡＶｓ）を調製するのに適してい
る。この目的のために、本発明の系は、ｒＡＡＶｓの複製が可能な細胞に導入さ
れる。これらは、例えば、２９３細胞である。ついで、該細胞をアデノウイルス
などのヘルパーウイルスで感染する。これは本発明の系がｒＡＡＶｓの複製に必
要な全てのエレメントを提供する場合には省略してもよい。これは特に本発明の
系が、試薬（Ｉ）および（ＩＩ）がウイルスベクター、具体的にはアデノウイル
スベクターまたはアデノウイルスベクターとワクシニアウイルスベクターとの組
み合わせであり、それらが互いに補足し合う別法（ｂ）に存在する場合に見出さ
れる。さらに、相補性は、試薬の１つがウイルスベクターであり、もう一方の試
薬がそのＤＮＡがウイルスベクター中で欠失しているタンパク質を提供する細胞
であるならば、供与されてもよい。
本発明により、診断法および／または治療法に使用することができるｒＡＡＶ
ｓを提供することが可能である。かかる方法は、外来ＤＮＡを選択することによ
り、よく計算された様式で行なうことができる。
本発明を実施例により説明する。実施例：本発明の系の調製
（ａ）ＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ配列（ｒｅｐ／ｃａｐ発現カセット）がアデノウ
イルスゲノムのＥ１領域に組み込まれた組換えアデノウイルスの調製。ベット（
Ｂｅｔｔ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，
１９９４，８８０２−８８０６による方法が参照される。ＡＡＶのｒｅｐ６８／
７８配列は、遅延した発現を達成させるために、「主要後期プロモーター」によ
り制御される。ＡＡＶのｒｅｐ４０／５２配列は、内因性のｐ１９プロモーター
の制御下のままである。ＡＡＶのｃａｐ配列はＣＭＶプロモーターにより制御さ
れる。さらに、ｍＲＮＡｓの５’−非翻訳領域中のｃａｐ配列は、つづくアデノ
ウイルスｍＲＮＡｓの５’−非翻訳領域由来の配列を含む。ｒｅｐ／ｃａｐ発現カセットの生産
ｒｅｐ遺伝子の部分配列（１８８２−２２８０位）をプライマー５’−ＣＧＣ
ＣＧＧＡＡＧＣＴＴＣＧＡＴＣＡＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＡＧ−３’および５’
−ＧＣＧＧＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＴＧＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＴＧＴＣＴＴＡ
Ｔ−３’を用い、ＡＡＶゲノムを含むマトリックス（例えば、ｐＳＶＯｒｉＡＡ
Ｖなど）からＰＣＲにより増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｓａ ｌＩを用いて切り出
し、同じ酵素を用いて切り出したプラスミドｐＵＣ１９に挿入する。ｐＵＣ１９
ＲｅｐｄｕｐＩを得る。つづくアデノウイルスｍＲＮＡの５’−非翻訳リーダー
のｃＤＮＡ配列を、プライマー５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＣＡＧＣＴＧＡＣＴＣ
ＴＣＴＴＣＣＧＣＡＴＣＧＣＴＧ−３’および５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡ
ＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＧＧＴＴＴＴＣＣＧＡＴＣ−３’を用いてプ
ラスミドｐＭＰＣＶ２（ローガン（Ｌｏｇａｎ）とシェンク（Ｓｈｅｎｋ），１
９
８４）からＰＣＲで増幅し、隣接する制限酵素部位をさらなるクローニングを行
なう為に適合させる。増幅物をＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩを用いて切り出し、同じ酵
素を用いて切り出したプラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入
し、ベクターｐＣＥＰ４−ＣＭＶＬを生じる。ＥｃｏＲＩ／Ｓａ ｌＩを用いて
ＣＥＰ４−ＣＭＶリーダーから、リーダーと共に、ＣＭＶプロモーターを切り出
し、同じ制限酵素により直鎖状にしたｐＵＣ１９ＲｅｐｄｕｐＩに挿入する。ｐ
ＲｅｐｄｕｐＩ−ＣＭＶＬを生じる。ｒｅｐ部分配列とＣＭＶプロモーターとア
デノリーダーを含む領域を、得られたｐＲｅｐｄｕｐＩ−ＣＭＶリーダーからＨ
ｉｎｄＩＩＩを用いて切り出し、部分的にＨｉｎｄＩＩＩ切断したｐＳＶＯｒｉ
ＡＡＶ（チオリニら（Ｃｈｉｏｒｉｎｉ），１９９５）に挿入する。ｐＲｅｐＣ
ＭＶＬＣａｐを生じる。適切な位置および適切な方向での挿入は、適切な制限切
断によりチェックされる。
この手順により、ＣＭＶプロモーターをｐＲｅｐＣＭＶＬＣａｐのｒｅｐ配列
とｃａｐ配列との間に挿入し、ｒｅｐの読み枠の分断が部分配列の重複により妨
げられ、ＣＭＶプロモーターがｐＳＶＯｒｉＡＡＶのＡＡＶ配列の１８８３位の
ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に挿入される。このＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は、ｐ４０
プロモーターの転写開始点とｃａｐ配列の５’−スプライシングシグナルとの間
に位置する。
ｐＲｅｐＣＭＶＬＣａｐはＳｐｅＩを用いて直鎖状にし、Ｔ４エキソヌクレア
ーゼで処理する。Ｔ４エキソヌクレアーゼ処理の時系列は、様々な大きさの欠失
領域の形成を可能にする。構築物は、残りの配列がｒｅｐ６８／７８配列の転写
開始である２８８位とこれらの配列の開始コドンである３２１位との間で始まる
ように、ＡＡＶゲノムの５’領域が２８８〜３２１位の間の点まで欠失されるさ
らなるプロセッシングに使用される。ＸｂａＩ、ＮｏｔＩ、ＳｐｅＩおよびＢｇ
ＩＩＩ制限部位を有するポリリンカー配列はｐＲｅｐＣＭＶＬＣａｐ*が該形成
するように、合成リンカーにより欠失領域に挿入される。主要後期プロモーター
を該形成物を用いて増幅する。主要後期プロモーターをプライマー５’−ＣＧＴ
ＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＣＧＧＴＣＣＴＣＣＴＣＧＴＡＴＡＧＡＡＡ
ＣＴ−３’および５’−ＧＣＡＧＡＴＣＴＡＣＴＡＧＴＣＴＣＧＡＧＡＧＧＴＴ
ＴＴＣＣＧＡＴＣＣＧＧＴＣＧ−３’を用いて、ｐＭＰＣＶ２（ローガンとシェ
ンク，１９８４）から増幅し、ついでＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩを用いて切り出した
。ＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩを用いてｐＲｅｐＣＭＶＬＣａｐ*を切り出し、ｐＭＬ
ＰＲｅｐＣＭＶＬＣａｐを形成するように主要後期プロモーターを適当な方向で
挿入する。
ｒｅｐカセットは、ｒｅｐ配列にあり、さらにタンパク質ｒｅｐ４０およびｒ
ｅｐ５２の発現を制御する内因性ｐ１９プロモーターを有するが、ｒｅｐ６８／
７８の配列のみは主要後期プロモーターにより制御される。ｒｅｐ／ｃａｐ発現カセットを有する組換えアデノウイルスの調製
ＸｂａＩ／Ｃ１ａＩを用いて、ｒｅｐ／ｃａｐ発現カセットをｐＭＬＰＲｅｐ
ＣＭＶＬＣａｐから切り出し、同じ酵素で直鎖状にしたベクターｐΔＥｌｓｐｌ
Ａ（ベットら，１９９５）に挿入する。このプラスミドは、マップユニット０〜
０．９および９．８〜１５．８の間のアデノウイルス５型の配列を含み、ＥｌＡ
領域は外来遺伝子の挿入のためにポリリンカー配列により置換されている。
感染性組換えアデノウイルスのゲノムは、マップユニット０と０．５との間、
３．７〜７８．３および８５．８〜１００のアデノウイルス配列を含むｐＢＨＧ
１０ならびにｒｅｐ／ｃａｐ配列を含むｐΔＥｌｓｐｌＡ誘導体上のアデノウイ
ルスの配列のオーバーラップする領域の間のインビボ組換えにより形成されても
よい。２９３細胞における２つのプラスミドの共形質転換を行ない、ＥｌＡ遺伝
子を補足する。形質導入後数日間、明らかになる細胞変性効果は、組換えアデノ
ウイルスの生成を示す。細胞変性効果を示す２９３細胞を、凍結融解により破砕
し、組換えウイルス（Ａｄｒｅｐ／ｃａｐ）をダブルプラーク精製によりライゼ
ートから単離する。個々のクローンを２９３培養物での連続継代により増幅する
。ｒｅｐおよびｃａｐの発現パターンをウエスタンブロッティングによりキャラ
クタライズする。
（ｂ）ｒＡＡＶゲノムに組み込まれた組換えアデノウイルスの調製
例えば、隣接するＡＡＶ ＩＴＲ配列を有するルシフェラーゼレポーター遺伝
子などの外来ＤＮＡをアデノウイルスのＥｌＡ領域に組み込む。ＩＴＲ配列を有
する発現カセットをＰｖｕＩＩを用いて、ｐＥＭＢＬ８ベクターのＡＡＶ ＩＴ
Ｒ配列に隣接する、ＣＭＶプロモーターの制御下のルシフェラーゼレポーター遺
伝子を含むベクターｐＡＡＶＣＭＶＬｕｃ（マース（Ｍａａｓ）ら、投稿中を参
照せよ）から切り出す。この断片をＥｃｏＲＶ切断した平滑末端化ｐΔＥｌｓｐ
ｌＡに組み込む。ｐΔＥｌｓｐｌＡ−Ｌｕｃを生じる。組換えアデノウイルス（
ＡｄＡＡＬｕｃ）をｐΔＥｌｓｐｌＡ−ＬｕｃとｐＢＨＧ１０の共形質転換によ
り、（ａ）に記載したように、２９３細胞中でインビボ組換えで調製する。
（ｃ）Ａｄｒｅｐ／ｃａｐとＡｄＡＡＶＬｕｃとを有する２９３細胞の感染によ
る組換えＡＡＶベクターの生産
４×１０8個の２９３細胞は、８０％のコンフルエンスになるまで培養し、少
量の無血清培地中、Ａｄｒｅｐ／ｃａｐとＡｄＡＡＶＬｕｃをそれぞれｍ．ｏ．
ｉ．１０で、同時に感染させた。完全培地を感染後２時間で添加する。感染３日
後、細胞をセルスクレーパーで培養容器の表面から除去する；懸濁物を、２００
ｇ、室温で５分間遠心分離する。細胞ペレットを２８ｍｌのＴＤ緩衝液（１４０
ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，０．７ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4，２５ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ／Ｃｌ，ｐＨ７．４）に懸濁し、ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナ
トリウムおよび２ｍｌの０．２５％トリプシン溶液を添加する。細胞を破砕する
ために、ライゼートを３７℃で３０分間インキュベートし、ついでダウン
スホモジナイザーで処理する。ＣｓＣｌで１．４ｇ／ｍｌの密度に調製し、ライ
ゼートを１３０，０００ｇ、２０℃で２４時間の密度差勾配遠心分離に供する。
１．３７０５〜１．３７５０の屈折率を有する画分をコレクティングラップで集
め、合わせて、さらに同じ条件の密度勾配遠心分離に供する。１．３７０５〜１
．３７５０の屈折率を有する画分を再び集め、０．９％ＮａＣｌ溶液に対して透
析する。得られたＡＡＶライゼートを、例えばルシフェラーゼ発現試験などの生
物学的試験に使用することができる。 Production Systems The invention of DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION AAV vectors, of the preferred system and its use for the production of AAV vectors. In order to perform gene therapy, it is important to have a vector that can introduce foreign genes into the genome of the cell and that is not toxic to the cell. Such vectors are, for example, adeno-associated viruses (AAVs). AAVs are single-stranded DNA viruses belonging to the Parvoviridae family. AAVs require a helper virus, specifically an adenovirus or herpes virus, for replication. In the absence of helper virus, AAVs integrate into the host cell genome, specifically at a specific site on chromosome 19. The genome of AAVs is linear and has a length of about 4680 nucleotides. It contains two reading frames encoding structural and nonstructural genes. The structural gene is called a cap gene. It is controlled by the P40 promoter and encodes three capsid proteins. The non-structural gene is called a rep gene, and encodes Rep proteins Rep78, Rep68, Rep52 and Rep40. The former two proteins are expressed under the control of the P5 promoter, while the expression of Rep52 and Rep40 is controlled by the P19 promoter. The function of the Rep protein is expressed, inter alia, by controlling the replication and transcription of the AAV genome. However, production of AAVs is extremely problematic. In particular, it is difficult to prepare large amounts of recombinant AAVs (rAAVs), that is, AAVs containing foreign DNA. Attempts to use adenoviruses as vectors for rAAVs have not yielded satisfactory results. Therefore, an object of the present invention is to provide a reagent (Mittel) capable of providing a large amount of rAAVs. According to the invention, this is achieved by the subject-matter defined in the claims. Thus, the subject of the present invention is a vector containing a foreign gene and (a) the rep68 / 78 sequence of AAV, which is present in cis or (b) trans and whose expression is delayed with respect to DNA replication of the AAV vector or a part thereof And a system containing The present invention is based on Applicants' discovery that AAV Rep proteins 68 and 78 reduce AAV DNA replication and that this impairment can be prevented by delayed expression of sequences encoding the Rep proteins 68 and 78. The phrase "AAV vector" applies to any AAV vector that does not contain the rep68 / 78 sequence of AAV expressed in a manner that does not delay DNA replication of the AAV vector or portions thereof. The phrase "part of the AAV vector" relates to any part of the AAV vector, specifically its cap sequence and the sequence encoding Rep proteins 40 and 50. The phrase "AAV rep68 / 78 sequences" refers to the fact that the systems of the invention contain rep68 and / or rep78 sequences whose expression is delayed in relation to DNA replication of the AAV vector or a portion thereof. The phrase "foreign DNA" includes any foreign DNA that may be incorporated into the AAV vector. The foreign DNA may not be encoded, or may be encoded. In the former case, the foreign DNA may be a regulator of DNA replication and / or transcription, or may be a control element. In the latter case, it is preferred that the foreign DNA can be expressed, and it is particularly advantageous that the expression is controlled by a constitutive or inducible promoter, such as a tissue-specific or tumor-specific promoter. Further, the foreign DNA may encode a diagnostic and / or therapeutic protein. Therapeutic proteins include, for example, tumor necrosis factor; interferon; interleukin; lymphokine; growth factor; plasma proteins such as coagulation factors and metabolic enzymes; and receptors. In particular, the foreign DNA may encode a protein that can increase the immunogenicity of the cell. These include proteins lacking tumor cells, such as cytokines, IL-2, interferons and GM-CSF, and tumor-associated antigens such as co-stimulatory molecules, B7-1, such as MAG E1, tyrosinase, lymphone. -Specific idiotypes and viral proteins, such as the human papillomavirus E7 protein and the Epstein-Barr virus EBNA3 protein. The foreign DNA may be integrated at any site of the AAV vector. Preferably, a plurality of foreign DNAs may be present in one AAV vector. The system of the invention comprises (a) a rep68 / AAV vector of the invention expressed in cis, ie on the AAV vector, in a delayed manner in relation to DNA replication of the AAV vector or a part thereof. 78 sequences. Such an AAV vector can be obtained by a conventional method. Preferably, an AAV vector having a DNA encoding the AAV Rep protein is used as a basis. In such AAV vectors, the endogenous P5 promoter of the AAV rep68 and rep78 sequences can be replaced by one that is active after DNA replication of the AAV vector or a portion thereof. Such a promoter is, for example, the “major late promoter” of an adenovirus or a derivative thereof. An inducible promoter, such as a metallothionein promoter or derivative thereof, can also be used in place of the endogenous P5 promoter of the AAV rep68 and rep78 sequences. In a preferred embodiment, the AAV vector is present in (a) reagent (I), which can be any reagent that does not reduce the functionality of the AAV vector, specifically its replication. The reagent (I) is preferably a vector such as a virus vector or a plasmid vector or a cell. The system of the invention comprises (b) the AAV vector and the rep68 of the AAV of the invention expressed in trans, ie, away from the AAV vector, in a delayed manner in relation to DNA replication of the AAV vector or a portion thereof. / 78 sequences. The AAV rep68 / 78 sequence is preferably present in reagent (II). It can be any reagent that does not reduce the functionality of the rep68 / 78 sequence of AAV, specifically its delayed expression. The latter can be obtained as described in (a). Reagent (II) is advantageously, for example, a vector such as a viral vector or a plasmid vector, or a cell. In (b) it is particularly preferred that the AAV vector is present in reagent (I) and the rep68 / 78 sequence of AAV is present in reagent (II). Reagents (I) and (II) may have the meanings described above, but must not be cells at the same time. Advantageously, reagents (I) and (II) are viral vectors, such as, for example, an adenovirus vector or a combination of an adenovirus vector and a vaccinia virus vector. It is particularly preferred that the viral vectors are complementary to each other. Viral vectors are described below as reagents (I) and (II). This should be taken into account by the examples. Reagent (I) is an adenovirus vector containing an AAV vector having an AAV ITR sequence and foreign DNA instead of the adenovirus E1 sequence. Reagent (II) is an adenovirus vector containing the AAV rep and cap sequences in place of the adenovirus E3 sequence, and the AAV rep68 / 78 sequence is obtained after DNA replication of the AAV vector or a part thereof. The active promoter is controlled by the "major late promoter" of the adenovirus, the rep40 and rep52 sequences of the AAV are controlled by the endogenous p19 promoter, and the cap sequence of the AAV is constitutive, such as the CMV promoter. Alternatively, reagent (II) is a combination of two adenovirus vectors, one of which contains the AAV rep sequence instead of the adenovirus E3 sequence and the AAV rep68 / 78 sequence The adenovirus "major" The AAV rep40 and rep52 sequences are controlled by the endogenous p19 promoter, and the other contains the AAV cap sequence controlled by the CMV promoter instead of the adenovirus E4 sequence; Alternatively, reagent (II) is a combination of an adenovirus vector and a vaccinia virus vector, the former comprising, instead of the adenovirus E3 sequence, the rep40 and rep52 sequences of AAV under the control of the endogenous p19 promoter, and CMV It contains the AAV cap sequence under the control of the promoter, the latter containing the AAV rep68 / 78 sequence. The vaccinia virus vector is not added until the DNA replication of the adenovirus vector is completely or partially completed. The system of the present invention is suitable for preparing recombinant AAVs (rAAVs) in large quantities. To this end, the system of the invention is introduced into cells capable of replicating rAAVs. These are, for example, 293 cells. The cells are then infected with a helper virus such as an adenovirus. This may be omitted if the system of the invention provides all the elements necessary for the replication of rAAVs. This is especially true if the system according to the invention is such that the reagents (I) and (II) are a viral vector, in particular an adenovirus vector or a combination of an adenovirus vector and a vaccinia virus vector, which alternatives complement each other. Found when present in (b). In addition, complementarity may be provided if one of the reagents is a viral vector and the other reagent is a cell that provides a protein whose DNA has been deleted in the viral vector. According to the present invention, it is possible to provide rAAVs that can be used in diagnostic and / or therapeutic methods. Such methods can be performed in a well-calculated manner by selecting foreign DNA. The present invention will be described with reference to examples. Example: Preparation of the system of the invention (a) Preparation of a recombinant adenovirus in which the rep / cap sequence of the AAV (rep / cap expression cassette) has been integrated into the E1 region of the adenovirus genome. See Bett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , U.S. S. A. 91, 1994, 8802-8806. The AAV rep68 / 78 sequence is controlled by the "major late promoter" to achieve delayed expression. The AAV rep40 / 52 sequence remains under the control of the endogenous p19 promoter. The AAV cap sequence is controlled by the CMV promoter. In addition, the cap sequence in the 5'-untranslated region of the mRNAs includes sequences from the 5'-untranslated regions of the adenovirus mRNAs that follow. Production of rep / cap Expression Cassette Using the primers 5′-CGC CGGAAGCTTCGATCAACTACGCCAGACAG-3 ′ and 5′-GCGGGCGTCGACTTTGAGCTTCCACCACTGTCTTA T-3 ′, a partial sequence of the rep gene (positions 1882-2280) was used, and the AAV genome containing the AAV genome, for example, VAA, VAp, VAVA ), By PCR, and excised with HindIII / SalI, and inserted into the plasmid pUC19 excised with the same enzymes. Obtain pUC19 RepdupI. The cDNA sequence of the 5'-untranslated leader of the adenovirus mRNA was then ligated with the plasmids pMPCLVh, plasmids pMPCvgS (PMPCVk, S) using the primers 5'-CGGGGTACCCAGCTGAACTC TCTCCGCATCGCTG-3 'and 5'-CGCGGATCCGAATTCAAGCTTCTCGAGAGGTTTTCCGATCGT'. 198) by PCR and the adjacent restriction sites are adapted for further cloning. The amplified product is excised with KpnI / BamHI and inserted into the plasmid pCEP4 (Invitrogen) excised with the same enzymes, resulting in the vector pCEP4-CMVL. Using EcoRI / SalI, the CMV promoter is excised from the CEP4-CMV leader together with the leader, and inserted into pUC19RepdupI which has been linearized with the same restriction enzymes. Produces pRedupI-CMVL. A region containing the rep partial sequence, the CMV promoter, and the adeno leader is excised from the obtained pRepdupI-CMV leader using HindIII, and inserted into pSVOri AAV (Chiorini et al., 1995) partially cut with HindIII. Produces pRepC MVLCap. Insertion in the proper position and in the proper orientation is checked by proper restriction cutting. According to this procedure, the CMV promoter was inserted between the rep sequence and the cap sequence of pRepCMVLCap, the division of the rep reading frame was prevented by overlapping of partial sequences, and the CMV promoter was linked to the HindIII restriction site at position 1883 of the AAV sequence of pSVOriAAV. Is inserted into. This HindIII restriction site is located between the transcription start point of the p40 promoter and the 5'-splicing signal of the cap sequence. pRepCMVLCap is linearized with SpeI and treated with T4 exonuclease. The timeline of T4 exonuclease treatment allows for the formation of variable sized deletion regions. The construct was constructed such that the 5 'region of the AAV genome was between positions 288 and 321 so that the remaining sequence started between position 288, the start of transcription of the rep68 / 78 sequences, and position 321, the start codon of these sequences. Used for further processing which is deleted up to the point. A polylinker sequence with XbaI, NotI, SpeI and BgIII restriction sites is inserted into the deleted region by a synthetic linker, as does pRepCMVLCap * . The major late promoter is amplified using the construct. The major late promoter was amplified with pMPCV2 (logan and B), amplified with pMPCV2 (logan and B) and amplified with p84. The pRepCMVLCap * is excised with BglII / XbaI and the major late promoter is inserted in the appropriate orientation to form pMLPRepCMVLCap. The rep cassette is in the rep sequence and has an endogenous p19 promoter that controls the expression of the proteins rep40 and rep52, but only the sequence of rep68 / 78 is controlled by the major late promoter. Preparation of Recombinant Adenovirus Having rep / cap Expression Cassette Using XbaI / C1aI, the rep / cap expression cassette was excised from pMLPLep CMVLCap and inserted into the vector pΔElspl A (Bett et al., 1995) linearized with the same enzymes. I do. This plasmid contains the sequence of adenovirus type 5 between map units 0-0.9 and 9.8-15.8, the ElA region being replaced by a polylinker sequence for insertion of a foreign gene. The genome of the infectious recombinant adenovirus was pBHG10 containing adenoviral sequences between 3.7 and 78.3 and 85.8-100 between map units 0 and 0.5, and pΔElsplA containing rep / cap sequences. It may be formed by in vivo recombination between overlapping regions of adenovirus sequences on the derivative. Two plasmids are co-transformed in 293 cells to supplement the ElA gene. Cytopathic effects that become evident several days after transduction indicate the production of recombinant adenovirus. 293 cells showing cytopathic effect are disrupted by freeze-thawing and recombinant virus (Adrep / cap) is isolated from the lysate by double plaque purification. Individual clones are amplified by serial passage in 293 cultures. The expression patterns of rep and cap are characterized by Western blotting. (B) Preparation of a recombinant adenovirus integrated into the rAAV genome For example, a foreign DNA such as a luciferase reporter gene having an adjacent AAV ITR sequence is integrated into the ElA region of the adenovirus. The expression cassette with the ITR sequence was transformed using the PvuII from the vector pAAVCMVLuc (Maas et al., In the post) containing the luciferase reporter gene under the control of the CMV promoter, flanking the AAV ITR sequence of the pEMBL8 vector. cut. This fragment is incorporated into EcoRV-cut blunt-ended pΔElspIA. This produces pΔElsplA-Luc. Recombinant adenovirus (AdAALuc) is prepared in vivo recombination in 293 cells as described in (a) by co-transformation of pΔElsplA-Luc with pBHG10. (C) Production of recombinant AAV vector by infection of 293 cells with Adrep / cap and AdAAVLuc 4 × 10 8 293 cells were cultured until 80% confluence and adrep in a small amount of serum-free medium. / Cap and AdAAVLuc, respectively. o. i. At the same time, they were infected at 10. Complete medium is added 2 hours after infection. Three days after infection, the cells are removed from the surface of the culture vessel with a cell scraper; the suspension is centrifuged at 200 g for 5 minutes at room temperature. The cell pellet was suspended in 28 ml of TD buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.7 mM K 2 HPO 4 , 25 mM Tris / Cl, pH 7.4) and mixed with 10 ml of 10% (w / v) deoxycholic acid. Add sodium and 2 ml of a 0.25% trypsin solution. The lysate is incubated at 37 ° C. for 30 minutes to disrupt the cells, and then treated with a Dounce homogenizer. Adjust to a density of 1.4 g / ml with CsCl and subject the lysate to density gradient centrifugation at 130,000 g at 20 ° C. for 24 hours. Fractions having a refractive index between 1.3705 and 1.3750 are collected on collecting wraps, combined and subjected to density gradient centrifugation under the same conditions. 1.3705-1. The fraction with a refractive index of 3750 is collected again and dialyzed against 0.9% NaCl solution. The obtained AAV lysate can be used for a biological test such as a luciferase expression test.
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項
【提出日】平成１０年１月１２日（１９９８．１．１２）
【補正内容】
請求の範囲
１． 外来ＤＮＡを含有するＡＡＶベクターと、（ａ）シスまたは（ｂ）トラン
スで存在し、かつ細胞内で安定に組み込まれていない、遅延して発現するＡＡＶ
のｒｅｐ６８／７８配列とを含有してなる系。
２． 外来ＤＮＡを発現させることができることを特徴とする、請求項１記載の
系。
３． 外来ＤＮＡが構成的なプロモーターまたは誘導可能なプロモーターにより
制御されることを特徴とする、請求項１または２記載の系。
４． （ａ）において、ＡＡＶベクターおよびＡＡＶのｒｅｐ６８／７８配列が
試薬（Ｉ）に存在することを特徴とする、請求項１〜３いずれか記載の系。
５． 試薬（Ｉ）が細胞またはベクターであることを特徴とする、請求項４記載
の系。
６． ベクターがウイルスベクターまたはプラスミドベクターであることを特徴
とする、請求項５記載の系。
７． （ｂ）において、ＡＡＶベクターが試薬（Ｉ）に存在し、かつＡＡＶのｒ
ｐ６８／７８配列が試薬（ＩＩ）に存在することを特徴とする、請求項１〜３い
ずれか記載の系。
８． 試薬（Ｉ）および試薬（ＩＩ）が細胞および／またはベクターであり、該
試薬（Ｉ）および試薬（ＩＩ）が同時に細胞でないことを特徴とする、請求項７
記載の系。
９． ベクターがウイルスベクターおよび／またはプラスミドベクターであるこ
とを特徴とする、請求項８記載の系。
１０． ウイルスベクターがアデノウイルスベクターであることを特徴とする、
請求項９記載の系。
１１． 試薬（Ｉ）中のウイルスベクターがアデノウイルスベクターであり、か
つ試薬（ＩＩ）中のウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターであること
を特徴とする、請求項９記載の系。
１２． 請求項１〜１１いずれか記載の系のＡＡＶベクターの生産のための使用
。[Procedural Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Date of Submission] January 12, 1998 (1998.1.12) [Contents of Amendment] Claims 1. An AAV vector containing foreign DNA and (a) a rep68 / 78 sequence of AAV that is present in cis or (b) trans and that is not stably integrated in cells and that is expressed slowly. system. 2. 2. The system according to claim 1, wherein the system is capable of expressing foreign DNA. 3. 3. The system according to claim 1, wherein the foreign DNA is controlled by a constitutive promoter or an inducible promoter. 4. The system according to any one of claims 1 to 3, wherein in (a), the AAV vector and the rep68 / 78 sequence of AAV are present in the reagent (I). 5. The system according to claim 4, wherein the reagent (I) is a cell or a vector. 6. The system according to claim 5, wherein the vector is a viral vector or a plasmid vector. 7. The system according to any one of claims 1 to 3, wherein in (b), the AAV vector is present in the reagent (I), and the AAV rp68 / 78 sequence is present in the reagent (II). 8. The system according to claim 7, wherein the reagent (I) and the reagent (II) are cells and / or vectors, and the reagent (I) and the reagent (II) are not cells at the same time. 9. 9. The system according to claim 8, wherein the vector is a viral vector and / or a plasmid vector. 10. 10. The system according to claim 9, wherein the virus vector is an adenovirus vector. 11. 10. The system according to claim 9, wherein the virus vector in the reagent (I) is an adenovirus vector and the virus vector in the reagent (II) is a vaccinia virus vector. 12. Use of a system according to any of claims 1 to 11 for the production of an AAV vector.
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(72)発明者 ハレック，ミヒャエル
ドイツ連邦共和国 ミュンヘン デー―
80538 シュテルンシュトラーセ 20────────────────────────────────────────────────── ───
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(72) Inventor Harek, Michael
Munich Day, Germany
80538 Sternstrasse 20