JP2000512495A

JP2000512495A - 迅速に増殖している細胞中のｄｎａ複製に干渉する癌治療用の化合物及びこのような化合物のスクリーニング方法

Info

Publication number: JP2000512495A
Application number: JP10501213A
Authority: JP
Inventors: キムネイスミス; シモネッタピアッティ; ジョンディフリー
Original assignee: ベーリンガーインゲルハイムインターナショナルゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1996-06-13
Filing date: 1997-06-12
Publication date: 2000-09-26
Also published as: EP0812594A1; US20020034770A1; WO1997047327A1; EP0914164A1; CA2251575A1

Abstract

(57)【要約】ＤＮＡ複製を抑制することにより腫瘍細胞を死滅させる能力のために癌治療に使用するための、Ｓ期及び／またはＭ期を促進するサイクリン依存性キナーゼを活性化する細胞の能力を損なわないで動物細胞中で前複製複合体を形成または維持するcdc6タンパク質の機能に干渉する化合物。このような化合物のスクリーニング方法。染色体重複がＳ期促進Cdkとして知られている特別なサイクリン依存性キナーゼの後期G1における活性化により誘発されるというかなりの証拠が今ある。本発明の目的はＤＮＡ複製に関係するメカニズムを更に研究することであり、得られた結果の利用は、通常の化学療法とは反対に、ＤＮＡそれ自体を損傷しないが、ＤＮＡ複製に干渉する。

Description

【発明の詳細な説明】迅速に増殖している細胞中のＤＮＡ複製に干渉する癌治療用の化合物及びこのような化合物のスクリーニング方法技術分野本発明は一般に癌治療の分野に関する。染色体重複は、Ｓ期促進Cdkとして知られている、特別なサイクリン依存性キナーゼの後期G1における活性化により誘発されるというかなりの証拠が見出された。本発明の目的はＤＮＡ複製に関係するメカニズムを更に研究し、得られた結果を利用して、通常の化学療法とは反対に、ＤＮＡそれ自体を損傷しないが、ＤＮＡ複製に干渉する癌治療の新規な概念を提供することにある。背景技術出芽酵母サッカロミセス・セレビジエでは、Ｓ期へのエントリーは単一キナーゼサブユニット、Cdk1/Cdc28との６種の不安定なＢ型サイクリン、C1b1-6の一種の会合により生成されたCdkに依存する(Schwobら，1994)。サイクリンB/Cdk1キナーゼはまた有糸分裂スピンドルの集合及び酵母中の後期の開始に必要とされる (Suranaら，1991;Fitchら，1992;Schwob及びNasmyth，1993)。６種のサイクリンB/Cdk1キナーゼの全ては細胞が後期を完結する際に不活化される(Amonら，1994;Irnigerら，1995)。その後のG1期間中のそれらの再活性化はサイクリン遺伝子の周期的転写(Koch及びNasmyth，1994)、サイクリンＢタンパク質分解の停止(Amonら，1994)、及び最も重要なp40^SIC1の破壊（そうしないと、３成分p40^SIC1／サイクリンＢ／Cdk1複合体の形成によりサイクリンB/Cdk1キナーゼを抑制する）(Mendenhall，1993;Schwobら，1994)を伴う。p40^SIC1タンパク質分解に必要とされる、CDC4及びCDC34のような遺伝子中の全ての６種のＢ型サイクリンの不活化または突然変異は、細胞をG1に静止させ、一方、SIC1遺伝子の不活化はＳ期を適度に進行する(Schwobら，1994)。後生動物中の均等なＳ期促進CdkはＳ期特異性キナーゼサブユニットCdk2とＥ型サイクリンとして知られているサイクリンの同様の組の間の複合体であることが明らかである。 Clb5/及びClb6/Cdk1キナーゼは通常酵母中でＳ期を誘発するものと考えられている(Epstein及びCross，1992;Schwob及びNasmyth，1993)。これらはCLB5及びCL B6 mRNAを後期G1に蓄積させる転写調節のために出現する最初のＢ型サイクリンである。CLB3及びCLB4はＳ期及びG2期に転写され、一方、CLB1及びCLB2はG2期及びＭ期に転写される(Koch及びNasmyth，1994)。CLB5及びCLB6の両方の欠失は致死性ではないが、Ｓ期を約30分だけ遅延させ(Schwob及びNasmyth，1993)、即ち、後のClbが蓄積するのに充分な時間を有するまで遅延させる。６種のＳ期促進サイクリンB/Cdk1キナーゼの一種またはその他が後期G1におけるp40^SIC1破壊の時間から後期中のサイクリンＢタンパク質分解の活性化まで活性であり、しかも起点が酵母細胞サイクルのこの広いウィンドー中に一度だけでも点火する(fire)ことが見出された。Ｓ期促進CdkはG1に染色体重複を誘発するが、G2細胞中では誘発しないことが可能である。何とならば、Ｓ期促進Cdkに適した基質はG1細胞中にのみ存在し得るからであろう。ＤＮＡ複製起点に結合するタンパク質はCdkに重要な基質であるかもしれず、それらの利用可能性は細胞サイクル中に変化し得る。複製開始点認識複合体(ORC)と称される大きいマルチサブユニット複合体が酵母起点に結合し、酵母起源の活性に必要とされる(Bell及びStillman，1992;Micklemら，1993;Liangら，1995;Foxら，1995)。ORCは細胞サイクルのあらゆる段階で起点に結合されるが(Diffley及びCocker，1992)、隣接クロマチンのDNaseI感受性がサイクル中に変化する(Diffleyら，1994)。ORCに隣接する配列はG1中にDNaseIから保護されるが、G2またはＭ期中に保護されない。起点の複製前の“保護された”状態がClb/Cdk1キナーゼの不活化後に有糸分裂の終了時に生じ、Ｓ期の開始または中間まで持続する(Diffleyら，1994)。起点の複製前の状態の形成及び維持はCDC6遺伝子によりコードされた不安定なタンパク質の合成に依存し(Cockerら，1996)、これはＤＮＡ複製の開始に必須である(Hartwell，1976;Bueno及びRussell，1992;Piattiら，1995)。cdc6突然変異体中のミニクロモソームの複製の欠陥は余分の起点を加えることにより軽減され、Cdc6p（CdC6タンパク質）が起点で作用することを示唆する(Hogan及びKoshlan d，1992)。Cdc6転写はサイクル中に２回のバースト：有糸分裂の終了時（複製後状態から複製前状態への起点のスイッチと一致する）、そして後期G1に起こる(Zwerschkeら，1994;piattiら，1995)。de novo Cdc6タンパク質を合成しないで有糸分裂から出る細胞はそれらの起点で複製前の状態を樹立することができない(Cockerら，1996)とともに、予定どおりにＳ期促進Cdkを活性化するにもかかわらず、ＤＮＡ複製を開始することができない。このような細胞は有糸分裂スピンドル上の未複製染色体の配列とともに進行し、最後に“還元的(reduction al)”後期を受ける(Piattiら，1995)。これらのデータは、Cdc6p合成がORCに隣接するタンパク質複合体（複製前の複合体またはpre-RC）の集合に必要とされることを示唆する。有糸分裂の終了時または後期G1（その時、Cdc6合成の第二バーストがある）におけるこのようなpre- RCの形成はＤＮＡ複製の開始に必要とされる二つの工程の最初であり得る。第二工程はサイクリンB/Cdk1キナーゼの活性化である。この概念によれば、G2細胞ではなく、G1細胞中のpre-RCの存在は、Ｓ期促進CdkがG1細胞のみをＳ期に入るように誘発する理由を説明し得る。こうして、起点点火(firing)の際のpre-RCの解体及びそれらがＳ期、G2期及びＭ期中にリフォームすることができないことは細胞サイクル中の再複製を阻止するのに重要な役割を有し得る。発明の開示酵母細胞がどのようにしてpre-RCの形成を後期後の短い期間に制限するのかについて取り組むために、細胞サイクル中に、Cdc6タンパク質がpre-RCを形成し、ＤＮＡ複製を促進することができる時について研究を行なった。Cdc6phaは後期の終了（その時、Ｂ型サイクリンが破壊される）と、その後のＳ期の開始とおおよそ一致する時点（その時、Clb5-6/Cdk1キナーゼが再活性化される）の間の、細胞サイクルの狭いウィンドー中に合成された時にのみＤＮＡ複製を誘導することができることが示し得る。それ故、後期G1には“ノーリターンの時点”があり、その後にCdc6タンパク質がＤＮＡ複製を促進する能力を失う。何とならば、おそらくそれが最早pre-RCを形成することができないからである。その発明の実験で得られたデータは、pre-RCの集合がＤＮＡ複製を誘発するサイクリンB/Cdk1キナーゼの同じ組により抑制されるという提案(Dahmannら，1995)と一致する。本発明の実験において、下記の結果が得られた。 1) Cdc6p合成はノコダゾール静止細胞中ではなく、α因子中でpre-RCの形成を促進することができる。細胞が有糸分裂から出る際またはその後の後期G1中のCdc6pのde novo合成は出芽酵母中のＤＮＡ複製に必要であるが、細胞サイクルのその他の局面中の進行には必要ではないことが示された。G1中にCdc6を合成することができない細胞は有糸分裂スピンドルの形成とともに進行し、それらの未複製染色体を母細胞及び娘細胞にタンデムで分離する(Piattiら，1995)。有糸分裂性Clb/Cdk1キナーゼの不活化（CLB1、３、及び４を欠いており、CLB2のts対立遺伝子を有する株の温度を上昇することによる）（これらは有糸分裂スピンドルの集合に必要とされる）は、Cdc6の剥奪された細胞の異常な核分裂を阻止したが、驚くことに、それらの迅速な死滅を阻止しなかった。即ち、それらはCdc6及びClb2機能が回復された時にコロニーを形成する能力を失った（Piattiら，1995中の図６を参照のこと）。この実験が繰り返され、細胞のＤＮＡ含量が不全回復期間中にFACS分析により測定された。細胞はCdc6合成が許容温度（これはClb2機能を回復する）へのシフトの 0.5時間前に回復された時でさえもそれらの染色体を複製することができないことがわかった（データは示されていない）。これらのデータから、Cdc6合成が細胞サイクルの或る段階中にのみＤＮＡ複製を促進することができたことを説明し得る。Clb1-4の剥奪された細胞は細胞サイクルの段階（その間に、Cdc6が複製前複合体(pre-RC)の形成を促進することができない）で静止し得る。これを更に研究するために、フェロモンにより“G1”様状態で静止された細胞中のde novo Cdc6合成に応答するpre-RCの形成を、ノコダゾールによる“G2”または“M”期様状態で静止された細胞中のpre-RCの形成と比較した。細胞を静止する前のCdc6合成の欠如のために、これらの二つの段階は通常のG1状態またはG2/M状態に相当しない。G1細胞は通常複製起点でpre-RCを有し、ノコダゾール静止細胞は通常複製された染色体を有する。その実験を行うために、機能性Cdc6タンパク質のみをユビキチンに融台し、GAL1-10プロモーターから発現された株(GAL-ubiCDC6)を使用した。また、その株は37℃におけるインキュベーションにより細胞の静止を後期に生じるcdc15突然変異を含んでいた。α因子の存在下で、ガラクトースの不在下の25℃へのシフトダウン後に、細胞はCdc6タンパク質を生じないで同調的に次のG1期に入った。これは２μｍ起点でpre-RCを欠いている未出芽細胞の培養物を生じた（図１）。次いで培養物を分け、半分を 90分間にわたって、依然としてガラクトースを欠いているがノコダゾールを含む培地中でインキュベートし、これにより、出芽及び高レベルのClb/Cdk1キナーゼを含むがpre-RCを欠いている未複製染色体を含む細胞を静止させた。ガラクトースの添加によるCdc6合成の再活性化はα因子静止培養物中でpre-RCの形成を誘導したが（ORCにより結合された配列に隣接するDNaseＩDNA配列からの保護により測定されたように）、ノコダゾール静止培養物中では誘導しなかった。それ故、ノコダゾール静止細胞中にpre-RCを検出することができなかったこと(Di-ffeley ら，1994）は、ＤＮＡ複製それ自体のためではない。これらのデータは、Cdc6合成の先の欠如がそれらの染色体の複製を阻止した時でさえも、de novo Cdc6合成が細胞（その状態がG2期細胞またはＭ期細胞の状態に似ている）中でpre-RCの形成を誘導することができないことを示唆する。 2) 遅延Cdc6合成はＤＮＡ複製を促進することができない次の実験は、ＤＮＡを促進するCdc6の能力の細胞サイクル依存性を更に正確に測定するように設計した。Cdc6タンパク質を欠いているG1細胞の同調された集団が生じられ、細胞サイクル中のこれらの細胞のその後の進行中に自由にCdc6合成を活性化した。ts cdc15突然変異を使用して、細胞を後期に同調した。図2Aは無傷CDC6遺伝子を含む細胞中のcdc15静止からの解放後の期間中のFACS分析により測定された細胞ＤＮＡ含量を示す。細胞ば2C DNA含量で開始し（出芽細胞の夫々の末端にある1C染色体クラスター／核のため）、全部ではないとしても殆どの細胞がＤＮＡを複製し、その後にそれらが細胞分裂を完結する。1C DNA含量を有する細胞の一時的蓄積が見られないが（細胞が複製の前に分裂したのではないかと予想されたように）、その代わりに4C DNA含量を有する細胞（即ち、二つの2C核を含む細胞）の一時的蓄積が見られた。FACSプロフィールを使用してこの期間中の核のＤＮＡ含量を推定するために、単一または二重の染色体クラスター／核を有する夫々の時点の細胞のフラクション、即ち、単核(U)細胞及び二核(B)細胞を測定した。全ての4C細胞が二核であり、かつ全ての1C細胞が還元性後期（後を参照のこと）を未だ受けなかった単核細胞であると仮定して、解放後に第一サイクル中に複製した核の％（％2C）は式：％2C=100.(2.C₄+U-C₁)/(U+2.B) （式中、C₁、C₂、及びC₄は1C、2C、または4C DNA含量を有する夫々の時点の細胞のフラクションである）を使用して計算し得る（物質及び方法を参照のこと）。この式の適用は、殆どの核がcdc15静止中に1C DNA含量を有し、解放後60分以内にそれらのＤＮＡを重複することを示す。この実験を、cdc15 GAL-ubiCDC6株で繰り返した。細胞を制限温度にシフトすることにより、最初の細胞が後期で同調され、次いでガラクトースを培地から除去することにより、Cdc6合成が抑制され、30分後に、温度を低下することにより細胞がそれらの有糸分裂静止から解放された（依然としてガラクトースの不在下にある）。これらの状況下で、細胞がde novo Cdc6合成の不在下でそれらの後期静止から出て、その結果として、それらはＳ期に入ることができなかった。核は解放後の少なくとも120分間にわたって1C DNA含量を保持したが（図2B）、続いて(210〜240分間)それらは還元後期を受けて1C未満のＤＮＡ含量を有する核を生じた。細胞が25℃に戻った時の培地へのガラクトースの再度の添加は、核の85％をCDC6⁺細胞と同様の速度諭で複製させ、これはcdc15解放の時点のGALプロモーターからのCdc6のde novo合成がＳ期を誘導するのに充分であることを実証する（図2C）。これらのデータは、pre-RCの形成(これはcdc15解放中のCdc6合成の不在下で起こらない(Cockerら，1996))がＳ期へのエントリーに必須であることを示す。次いで、GAL-ubiCDC6誘導の時間を変えて、図２中の実験を繰り返した。即ち、細胞が37℃で静止され、Cdc6合成が抑制され、cdc15静止からの解放後０、10 、20、30分等で再度誘導された。図3Aは夫々の時点についてその後120分中にそれらのＤＮＡを複製した核の％を示す。全ての細胞が解放後の20分までガラクトースの添加後にＤＮＡを複製する能力を保持し、細胞の幾つかが30分までにその能力を失い、ほんの二三の細胞が40分までそれを保持した。Cdc6（この時点ではユビキチンに融合されでいない）の合成が代わりにメチオニン抑制性MET3プロモーターにより調節される株を使用して、この実験を繰り返した。再度、細胞は後期 cdc15静止からの解放の40分後にCdc6合成の誘導後にＤＮＡを複製する能力を失った（データは示されていない）。これらのデータは、cdc15解放後の30〜40分の間に“ノーリターンの時点”が存在し、その後にCDC6転写の誘導がＤＮＡ複製を誘導するのに有効ではないことを示唆する。この時点は細胞が通常Ｓ期に入り、充分に機能性であるCDC6遺伝子を有した時間付近であることは重要ある。細胞が“ノーリターンの時点”後にＤＮＡ複製を誘導することができないことは単に充分なCdc6タンパク質を合成することができないことのためではないのかという疑問に取り組んだ。後期G1中に野生型細胞中でつくられたCDC6タンパク質は、細胞が細胞サイクルを進行するにつれて迅速に分解されることが既に示されていた(Piattiら，1995)。こうして、CDC6タンパク質は細胞サイクルのこの段階におけるCdc6タンパク質分解の速度の増加のために“ノーリターンの時点”を経過した細胞中で蓄積することができないかもしれなかった。それ故、唯一の機能性CDC6遺伝子がGAL1-10プロモーターの制御下のHA標識バージョン(GAL-HA3CDC6) である株を使用して、先の実験を繰り返した。HA標識遺伝子は充分に機能性である。何とならば、これらの細胞は通常ガラクトース培地中で増殖するからである。エピトープ標識が本発明者らにcdc15解放後の種々の時点における誘導の30分後にウェスタンブロッティングによりCdc6タンパク質の蓄積を追跡させた。また、これらの細胞は、たとえそれらが時間経過中にCdc6タンパク質を蓄積する能力を保持したとしでも（図3C）、解放の40分後にガラクトース誘導に応答してＤＮＡを複製する能力を失った（図3B）。実際に、高レベルのHA3Cdc6が解放の20分後（その時点でガラクトースが殆どの細胞を複製するように誘導する）よりもcd c 15解放の60分後（その時間まで細胞が複製することができない）に蓄積した。こうして、“ノーリターンの時点”後のCdc6の増大されたタンパク質分解は、それを経過した細胞がde novo Cdc6合成に応答してＤＮＡを複製することができないことの原因ではない。 3) Cdc6がその機能を遂行する時の測定 Cdc6がpre-RCの形成後のＤＮＡ複製に必要とされるか否かに取り組むために、野生型細胞及び温度感受性cdc6-1細胞を許容温度でα因子中に静止させ、37℃で２時間インキュベートし(その状況下で、pre-RCが消失する(Cockerら，1996))、次いで37℃でフェロモンブロックから解放した。野生型細胞はそれらのＤＮＡを同調的に複製し、一方、cdc6突然変異体はたとえあったとしても極めて不十分に複製した（データは示されていない）。両方の培養物が同様の速度論で出芽した。それ故、たとえ細胞が既にpre-RCを形成したとしても、CDC6はフェロモン誘導 G1静止中にその複製機能を履行することができない。それ故、CDC6はCdk1が不活性である早期G1中にpre-RCの形成及び維持に必要であるだけでなく、Cdk1が後期 G1で活性化される時にその後のＤＮＡ複製に必要である。 4) “ノーリターンの時点”はＳ期促進CDKの活性化に依存する “ノーリターンの時点”は後期G1におけるCln1,2/及びClb5,6/Cdk1キナーゼの活性化とおよそ合致する。Dahmannら(1995)はClb/Cdk1キナーゼが二重の役割を有すると仮定した。それらは既にpre-RCを形成した起点を誘発してＤＮＡ複製を開始させるとともに、それらは同時にpre-RCのde novo形成を阻止する。Ｓ期促進Clb/CdkがCdc6を複製の誘導から阻止するのに関与した場合、CLB5及びCLB6の不活化は“ノーリターンの時点”を遅延すべきである。何とならば、それらが細胞サイクル中に発現される最初のＢ型サイクリン遺伝子であるからである(Schwo b及びNasmyth，1993)。Ｓ期エントリーはclb5 clb6二重突然変異体中で約30分だけ、即ち、Clb1-4/Cdk1キナーゼのその後の蓄積まで遅延される(Schwobら，1994 )。また、この遅延がcdc15静止からの解放中に見られる。CLB5 CLB6 cdc15細胞はそれらの解放の約45分後に複製を開始し、一方、c1b5 clb 6 cdc15突然変異体は、clb2/Cdk1キナーゼの出芽及び活性化が予定どおり起こるとしても、90分まで開始しない(図4A及びB)。また、CLB5及びCLB6の欠失は、cdc15静止からの解放後の時間の長さを延長し、その間にCdc6の誘導がＤＮＡ複製を促進することができた（図3Aと4Cを比較のこと）。CLB5 CLB6細胞の50％が30分で“ノーリターンの時点”を経過し、一方、clb5 clb6二重突然変異体では60分までその均等の時点に達しなかった。cdc15 MET-CDC6細胞及びcdc15 c1b5 clb6 MET-CDC6細胞の“ノーリターンの時点”を比較して、非常に似ている結果が得られた。こうして、Clb5及びClb6活性の損失は“ノーリターンの時点”中の経過をＳ期エントリーの遅延と同様である程度まで遅延する。この知見は、Cln/Cdk1キナーゼ［これらはまたClbキナーゼのアクチベーターとしてＳ期エントリーに必要とされる( Amonら，1994;Dirickら，1995)］が“ノーリターンの時点”中の経過を促進するのに充分ではないことを意味する。何とならば、それらの活性化の速度論はCLB5 及び6の欠失により影響されないからである。Clbs1-4はclb5 clb6二重突然変異体中でClbs 5及び6のＳ期促進機能を呈する。それらはまたClbs5及び6から“ノーリターンの時点”中の経過を促進するという機能を呈することが推定された。この推定は、ノコダゾールブロックされた細胞中の全ての６種のClb/Cdklキナーゼの抑制がpre-RCを誘導するのに充分であるという知見(Dahmannら，1995）と合致する。 5) Cdc6pはClb/Cdk1キナーゼとin vivoで相互作用するヒストンH1キナーゼ活性はそのＣ末端でHA3エピトープで標識され、それ自体のプロモーターから発現されたCdc6タンパク質のバージョンと同時免疫沈殿する（図5A）。許容条件または制限条件下でインキュベートされた種々のcdc突然変異体の細胞に由来するエキス中のCdc6関連キナーゼが分析され、活性キナーゼが非許容温度でインキュベートされたcdc28-13及びCDC4-1突然変異体細胞から調製されたエキスを除く全てのエキス中に見られた（図5B）。ウェスタン分析は、Cd c6pがこれらのエキス中に同様のレベルで存在することを示した（図5B）。幾つかのデータは、Cdc6と関連する活性がClb/Cdk1キナーゼに相当することを示唆する。第一に、これらのキナーゼはおそらくp40^SIC1タンパク質の蓄積(Schwobら， 1994)及びSIC1回復Cdc6関連キナーゼ活性の欠失（図5B）のためにcdc4-1細胞中で不活性である。第二に、GALプロモーターから発現された氾標識Cdc6(GAL-HA3C DC6)と関連するキナーゼ活性がcdc28-4サイクル培養物中に殆どまたは全く見られなかった（図5C）。第三に、そのキナーゼは精製p40^SIC1の添加により抑制された（図5D）。第四に、Cdc28タンパク質はGAL-HA3CDC6細胞からのエキス中で Cdc6pと同時免疫沈殿した（図5E）。これらのデータは、Ｓ期、G2期またはＭ期につくられたCdc6pがClb/Cdk1キナーゼと会合することを示唆する。この会合はC dc6を細胞サイクルのこれらの段階中にpre-RCを起点で形成することから阻止するのに役立つかもしれない。それ故、“ノーリターンの時点”は、Cdc6タンパク質（存在し、または生産された場合）がClb/Cdk1キナーゼと会合する細胞サイクル中の時点に相当し得る。Cdc6pがin vivoでこれらのキナーゼの標的であるか否かは未だ知られでいない。しかしながら、それはin vitroでClb/Cdc28キナーゼによりリン酸化し得るが、Cln/Cdc28キナーゼによりリン酸化し得ない（データは示されていない）。 6) ORCはARSと会合する in vivoの特定のＤＮＡ配列とのORC、Cdc6、及びMcm7の会合を測定するために、ホルムアルデヒドで処理した細胞からのエキスを調製し、クロマチンを500bp の平均サイズに剪断し、PCRを使用して免疫沈殿したmyc標識タンパク質に結合した特定の配列の存在量を測定した。PCRプライマーの四つの組をARS1の周囲の三つの領域及びARS1を含む一つの領域を増幅するのに使用した。同様の操作をARS3 05について使用した。これらの二つの起点の両方は全てではないとしても殆どのＳ期中で一度に点火する(Campbell及びNewlon，1991)。夫々の遺伝子座からの全ての四つのフラグメントが、myc特異性抗体を使用して免疫沈殿されなかった剪断されたクロマチンから同様に増幅された。対照的に、ARS1及びARS305を含むフラグメントがOrc2-mycを発現する細胞からつくられた免疫沈殿から優先的に増幅された。ARSを含むフラグメントのこの優先的増幅はCse1-mycを発現する細胞またはmyc標識タンパク質を発現しない細胞から調製された免疫沈殿では起こらなかった(図7A〜及びB)。また、ARSフラグメントの優先的増幅はホルムアルデヒドによる処理及び免疫沈殿操作中の抗myc抗体の含有に依存した（図7A）。ARS305 ではなく、ARS1の優先的増幅（同じＤＮＡ製剤から）はin vitroのORC結合及びi n vivoの点火を大きく減少するARS1のACS中の点突然変異により無効にされた(Ma rahrens及びStillman，1994;Rao及びStillman，1995)(図7C)。また、それはARS1機能を低下するＢ要素突然変異の組み合わせにより無効にされた。これらのデータは、Orc2pに架橋されたＤＮＡの免疫沈殿がin vivoのORCの起点の占有の信頼できる測定方法であることを実証する。また、それらは、ORCがクロマチン中の多くの部位と会合しないことを示す。in vivoのその結合はARS配列に制限し得る。 7) Cdc6p及びMcm7pは細胞サイクル依存様式で起点と会合する同じ操作が、Cdc6p及びMcm7pが起点と特異的に会合するか否かを試験するのに使用された。ARSを含むが、隣接するものを含まないフラグメントがCdc6-mycを発現する細胞からの抗myc免疫沈殿中で優先的に増幅された。更に、ARS305配列ではなく、ARS1配列の優先的増幅はARS及びARS1におけるＢ要素突然変異により無効にされた(図7B及びC)。これは、Cdc6pがORCのようにin vivoでARS配列と特異的に会合することを示唆する。ARSとのCdc6pの会合が、細胞サイクル中の進行中、水ひにより単離された未発芽G1細胞として測定された（図8A）。会合は、おそらく有糸分裂の終了時のCdc6合成のバーストの結果として、小さい未発芽細胞の開始培養物中で既に高かった。それはG1の多くについて高く留まり、Ｓ期の開始時に減少し、G2及び中期中に低く留まったが、細胞質分裂直前の終期中に再度出現した。このパターンは起点におけるCdc6依存フットプリントのパターン(Dif fleyら，1994)に似ている。後者は水ひされた細胞中で測定されず、その結果、直接の比較が可能ではない。 Mcm7-mycを発現する細胞を使用する実験の同様の組（図7B、7C、及び8B）は、 Mcm7pがG1中にARS1及びARS305と会合するが、それらの隣接配列と会合しないことを示す。Mcm7pはＳ期中に起点を出て（これはCdc6pより若干遅い）、終期まで再度出現しない。この会合のパターンは核内のMcm7pの蓄積により平行にされる。それは終期中に核内に蓄積し、G1中にそこに留まるが、G2期及びＭ期中に細胞質中で蓄積する(Dalton及びWhitbread，1995;図8B)。 8) 起点とのMcm7pの会合はCdc6pに依存する起点とのMcm7pの会合の細胞サイクルプロフィールはCdc6pのそれと似ている。細胞サイクル中に起点に結合されるORCと違って、Cdc6p及びMcm7pの両方は主としてG1中にのみ結合される。Cdc6pはG2期及びＭ期中に迅速に分解されるが、Swi 5及びAce2による転写活性化のために、細胞が有糸分裂を完結する際にde novo合成される(Piattiら，1995)。有糸分裂の終了時のCdc6pの急な再蓄積がおそらく終期中のARSにおけるその到達を説明する。それは細胞サククルのこの段階におけるARS配列とのMcm7pの会合を促進することの原因であり得るのではないだろうか？それがあり得る手掛かりはツメガエル(Xenopus)エキス中のクロマチンへのM cm3pのローディングがCdc6pの免疫枯渇により無効にされるという最近の観察(Co lemanら，1996)から生じる。しかしながら、この研究は、Cdc6pの免疫枯渇がクロマチンへのMcm3pのローディングに必要とされる付加的な因子を枯渇する可能性を排除しなかった。酵母中の染色体及びそれらの起点へのMcm7pのローディングがCdc6pに依存するか否かを証明するために、内因性CDC6遺伝子が欠失され(Dcdc6)、GALプロモーターの制御下でユビキチン-CDC6融合(GAL-ubi-CDC6)により置換（別の遺伝子座ではあるが）されたMcm7-myc発現株が構築された。この株からの細胞はガラクトースの存在下でのみCdc6pを合成し、ＤＮＡを複製する(Piattiら，1996)。ガラクトースからラフィノースに既に75分間シフトされた培養物から、遠心水ひにより、Cdc6pを欠いている未発芽G1細胞の集団が単離され、次いでこれが二つに分けられ、半分がガラクトースの存在下でインキュベートされ、他の半分がガラクトースの不在下でインキュベートされた（図９）。同じ方法で処理された野生型細胞と違って、Mcm7pが未発芽G1細胞の開始培養物（０分）中のARS1またはARS305 で殆どまたは全く検出し得なかった。ガラクトースの不在下で増殖された細胞が細胞サイクル中に進行するにつれて、この状況が続いた。予想されたように、これらの細胞はそれらのＤＮＡを複製することができなかった。しかしながら、ガラクトースの存在下で増殖された培養物中では、Mcm7pが20分以内にARS1及びARS 305に出現した。細胞がＳ期に入るまで、それがこれらの起点で存続し、次いでC dc6pの継続した合成にもかかわらず消失した（G2期及びＭ期中）。これらの二つの集団中で染色体に結合されたMcm7pの量がまた比較された。Mcm7pはガラクトース誘導後の30分以内に染色体で検出され、それは後期G1またはＳ期の開始まで存続した。対照的に、それはガラクトースの不在下で増殖された細胞から単離された染色体ではいずれの時点にも検出し得なかった。それ故、Cdc6pのd e novo合成が酵母染色体及びそれらの起点へのMcm7pのローディングに必須であると結論し得る。また、in situ免疫蛍光による２種の培養物中のMcm7-mycの細胞位置の測定は、Cdc6pが染色体起点へのMcm7pのローディングに直接必要とされるのか、或いはそれが核に入るために単に必要とされるのかを評価することを可能にした。Mc m7pはCdc6pを欠いたG1細胞の開始集団中の殆どの細胞の核内で濃縮されたが、野生型細胞と比べて若干低い程度と考えられた（図９）。それ故、Cdc6pは核内のM cm7pの蓄積に必要とされず、これは終期中のCdc6p合成と一致する。更に、20分間のガラクトースによる誘導は、それがMcm7pを起点にローディングさせたにもかかわらず、核と細胞質の間でMcm7pの分布に殆ど差がなかった。核内のMcm7pの蓄積は起点へのそのローディングに充分ではない。Cdc6pは核内に既に存在するM cm7pの起点へのローディングを促進するのに必要とされる。以上の結果から、実質的に下記の結論が導かれる。 1) pre-RCの形成及びＤＮＡ複製を促進するCdc6の能力は細胞サイクルのG1期に制限される de novo Cdc6タンパク質合成はＤＮＡの複製起点のクロマチン構造の変化に必要とされ、これは通常細胞が有糸分裂から出て、G1に入る際に起こる(Cockerら，1996)。起点周囲のDNaseI感受性のパターンは、複製開始点認識複合体(ORC)が細胞サイクル中に起点に結合するが、別の因子、おそらくCdc6それ自体がその後のサイクルにおいて有糸分裂からの退出とＤＮＡ複製の再開の間の間隔でそれを結合することを示唆する(Diffleyら，1994)。Cdc6タンパク質はin vitroで0RCと相互作用することが示されていた(Liangら，1995)。Cdc6はＤＮＡ複製の開始に必要とされるが、それは細胞サイクル進行のその他の局面、例えば、有糸分裂スピンドルの形成または更には細胞の反対の極への未複製染色体のこれらのスピンドルに関する移動に必要とされない(Piattiら，1995)。これらの知見は、有糸分裂の終了時またはその後のG1中にCdc6合成により媒介される複製起点の状態の変化が後期G1におけるClb/Cdk1キナーゼの活性化により誘発されるＤＮＡ複製のその後の開始に必須であることを示唆する。それ故、酵母におけるＤＮＡ複製の開始は２工程プロセス：Cdc6合成により誘導される前複製複合体(pre-RC)の起点における形成、続いてClb特異性Cdkインヒビターp40^SIC1の分解(Schwobら，19 94)によるClb/Cdk1キナーゼの活性化と考えられる。本発明の実験は、これらの二つのプロセスが正確な順序で起こる必要があるか否かに取り組む。Cdc6タンパク質がG1中につくられない時でさえも、Clb/Cdk1キナーゼが予定どおりに活性化される。Cdc6合成が既にClb/Cdk1キナーゼを活性化した細胞について回復される時に何が起こるのか？これはＤＮＡ複製を促進するのに有効であるのか？ＤＮＡ複製を促進する際の異なる細胞サイクル段階におけるCdc6合成の有効性が研究され、“ノーリターンの時点”が発見され、その後にde novo Cdc6合成はＤＮＡ複製を誘導することができない。この“ノーリターンの時点”はClb5及びClb6の不活化により遅延され、これらは通常細胞サイクル中に現れる最初のClbである。しかしながら、“ノーリターンの時点”中の経過はCdc7タンパク質キナーゼの活性に依存せず（データは示されていない）、これはまたＤＮＡ複製の開始及び複製前状態から複製後状態への起点のスイッチに必要である。データは、“ノーリターンの時点”が細胞サイクルの或る時点（その後に、Cdc6タンパク質が最早ＤＮＡ複製起点でpre-RCの形成を誘導することができない）に相当し、かつ細胞サイクル状態におけるこのスイッチの原因の重要なイベントがClb/Cdk1キナーゼの活性化であることを示唆する。“ノーリターンの時点”はClb/Cdk1活性化と一致するだけでなく、それらの活性化が遅延される時に遅延される。 Dahmannら(1995)は、p40^SIC1Cdkインヒビターの過剰生産によりノコダゾール中で静止された細胞中のClb/Cdk1キナーゼの不活化が起点でpre-RCの形成を誘導するのに充分であることを示した。結果として、彼らは、Clb/Cdk1キナーゼがＳ期の開始に二つの反対の役割：pre-RCのde novo形成を抑制すること及びpre-RC を既に形成した起点からのみ開始を誘発することを有することを提案した。Cdc2 またはＢ型サイクリンCdc13について欠損のS.ポンベ細胞の再複製、またはCdc13 /Cdc2キナーゼインヒビターRum1の過剰生産がこの仮説と一致する(Broekら， 1991;Haylesら，1994;Moreno及びNurse，1994)。このモデルによれば、pre-RCの形成の前（即ち、Cdc6タンパク質のde novo合成の前）のClb/Cdk1キナーゼの活性化はその系を巧みに処理し、ＤＮＡ複製の開始を阻止する。上記の結果は、Cl b/Cdk1活性化に対するCdc6合成のタイミングが実際に重要であることを示す。“ ノーリターンの時点”は、Clb/Cdk1キナーゼが充分に活性になって起点でpre-RC の形成を抑制する細胞サイクルの時点に相当し得る。本発明の実験はClb/Cdk1活性化に対しCdc6合成を遅延することの結果に集中した。しかしながら、Clb/Cdk1キナーゼがpre-RCの形成を抑制するという仮説は、 Cdc6合成が遅延される時だけでなく、Clb/Cdk1キナーゼが早期に活性化される時の災難を予測する。その他の実験において、SIC1遺伝子（これはG1中のそれらの活性化を遅延するClb/Cdk1キナーゼのインヒビターをコードする）を欠失することの複製に関する効果が分析された。sic1突然変異体は野生型細胞よりも若干早くＤＮＡ複製を開始するが、Ｓ期中では更に遅く進行する。更に、染色体及びミニ染色体はsic1突然変異体中で高度に不安定であり、この欠損はCLB5及びCLB6の欠失または染色体への余分の起点の付加により抑制される。こうして、Clb/Cdk1 キナーゼの早期の活性化はCdc6合成の遅延に同様の効果を有する。また、それは起点が点火する効率を低下する。 2) G2中にpre-RCの形成を阻止する因子細胞が“ノーリターンの時点”を経過した後にのみGAL-CDC6を発現する細胞中のＤＮＡ複製の欠如は、それらが充分なCdc6タンパク質を蓄積することができないためではない。GAL-CDC6の誘導は多くのCdc6pをこの時点を経過しなかった細胞中よりもこの時点を長く経過した細胞中に蓄積させる（図3C）。Cdc6pは不安定なタンパク質であり、それは通常Ｓ期及びG2期中に細胞から消失するが、これは主としてCDC6転写の調節のためである。Cdc6が連続的に合成され、タンパク質レベルが（GALプロモーターからの発現のために）サイクル中に一定に留まる条件下で、多くのCdc6タンパク質がＳ期、G2期、及びＭ期(Piattiら，1996)よりも後期及び早期G1細胞の核内に蓄積したことが注目し得る。Cdc6の迅速なタンパク質分解は一部このパターンを原因とするものと考えられる。何とならば、Cdc6 タンパク質がCdc6分解の欠損であるcdc4突然変異体(Piattiら，1996)の培養物をサイクルする際に細胞サイクルの殆どの段階で核内で高レベルまで蓄積したからである。 Cdc6の細胞分布の細胞サイクル調節はCdc46/Mcmタンパク質（これらはまた起点の点火に必要とされ、またG2中に細胞質中に蓄積する）のそれと似ている。しかしながら、Cdc6が“ノーリターンの時点”を経過した細胞中で機能することができないことは核内のその不十分な蓄積のためであるかどうかは疑わしい。Cdc6 タンパク質は実際にはCDC4⁺細胞中の核から排除されず、細胞が後期を受けるまで再複製を阻止するブロックをバイパスしないで25℃で増殖するcdc4突然変異体細胞のG2核内で非常に高いレベルまで蓄積する(Piattiら，1996)。実験の結果は、Cdc6がG1中でのみ合成され、野生型細胞中で迅速に分解される理由について疑問を生じる。これは菌類細胞サイクルの保存された特徴であると考えられる。何とならば、S.ポンベ中のCdc18pレベルが同様の様式で調節されるからである（Ni shitani及びNurse，1995;Muzi-Falconiら，1996）。再複製のブロックはG2中の核からのCdc6の不在に依存しないことが示された。それにもかかわらず、それは、このような細胞が再複製を阻止する忠実度に寄与し得る。 Cdc6が“ノーリターンの時点”を経過した細胞中でＤＮＡ複製を促進することができないことは、抑制因子とのその会合または修飾によるその抑制のためであり得る。Cdc6がClb/Cdk1キナーゼと会合するという知見がこれに関して重要であり得る。これらのキナーゼによるCdc6のリン酸化はそれがpre-RCを形成することから阻止し得る。また、Cdc6と会合したClb/Cdk1キナーゼは、リン酸化により、 pre-RC形成に必要とざれるその他のCdc6相互作用タンパク質（例えば、ORCの員）を抑制し得る。 “ノーリターンの時点”を経過した細胞がpre-RCを形成することができず、またde novo Cdc6に応答して複製を促進することができないことはまたpre-RCを形成し、またはそれらからＤＮＡ複製を開始するのに必要とされるその他のタンパク質のこれらの細胞中の不活性に由来し得る。例えば、Cdc46/Mcmクラスのタンパク質（これらは起点点火に必須である）がG2中に細胞質中に見られる。また、本発明の実験で得られたデータは、核内のMcmタンパク質の濃度の低下またはクロマチンを結合するそれらの能力の低下が“ノーリターンの時点”に寄与し得ることを確認する。 3) 真核生物複製サイクルを誘導する因子染色体重複を誘導するメカニズムに主要な要件は、それが複製起点を姉妹染色分体分離の継続ラウンド間に１回だけでも点火させるべきであることである。また、バクテリアは複製をマス倍加毎に１回に制限する必要があるが、それらがこれを行うメカニズムは単一のＤＮＡ複製起点のみのそれらの所有のために異なる。バクテリア点火メカニズムの不完全は不運ではない。何とならば、単一起点からの予定どおりではない開始が完全ゲノムの複製をもたらすからである。即ち、それは遺伝子の過大または過少の提示をもたらさない。この簡単な装置の下側は、複製がマス倍加よりも長くを要し得ることであり、この問題は先のラウンドからの姉妹染色分体が分離される前に複製を再開することのみにより解決し得る。それ故、ゲノムが多染色体（これらの夫々が多重起点から複製される）で保有される真核生物により使用されるメカニズムは、バクテリアにより使用されるメカニズムより極めて有効である必要がある。真核生物細胞が有効な“一度だけ”の点火装置を得るが、二三のハードな面を得る方法について多くの考察があった。 S.セレビジエにおける複製に関する現在の知識は、実際に使用される装置の粗大な概略を最初に組み立てるのに充分である（図６及びDahmanら，1995を参照のこと）。開始は特定の部位からであり、二つの型の因子：起点またはそれらの周囲の配列に結合するORCタンパク質及びCdc6タンパク質並びにCdc46/Mcmタンパク質のような因子並びにClb/Cdk1キナーゼ及びCdc7キナーゼのようなＳ期促進因子（後期G1中のそれらの活性化は実際にＤＮＡ複製の開始を誘発する）に依存する。起点及びそれらの周囲のクロマチンは、Diffleyら，1994;Cockerら，1996により仮定されたように、二つの状態：後複製状態（それらがORC単独により結合される）、及び前複製状態（それらがORCそしてまたCdc6タンパク質及びMcmタンパク質により結合される）で存在する。後者は前複製複合体または前開始複合体と称される。前複製状態の起点のみがClb/Cdk1キナーゼによりＤＮＡ複製を開始するように誘発し得る。この“一度だけ”の複製装置の主要な局面は第一に起点の二つの状態の間の転移を支配するメカニズムであり、第二にClb/Cdk1キナーゼの活性の急な変動を生じるメカニズムである。pre-RCは開始それ自体またはそれら中の複製により破壊され、新しいpre-RCの形成が開始を誘発するClb/Cdk1 キナーゼのまさに同じ組により抑制されることが提案される。このスキームによれば、複製サイクルがClb/Cdk1サイクルにより誘導される。それは低いClb/Cdk1 活性の期間(G1)で開始し、それがpre-RCの形成を可能にする。Clb/Cdk1キナーゼの活性化は低いClb/Cdk1活性の先の期間中に形成したpre-RCから複製を誘発し、同時に新しいpre-RCの形成をブロックする（Ｓ期）。高いClb/Cdk1キナーゼ活性のその後の期間（G2/M期）はpre-RCの形成に対するブロックを維持する。そのサイクルはClb/Cdk1キナーゼの最終の不活化及び姉妹染色分体(Irnigerら，1995) の分離を促進する同複合体(APC)により少なくとも一部媒介される低いキナーゼ状態へのリエントリーにより完結される。開始に関するClb/Cdk1キナーゼの拮抗効果は、このサイクル中に細胞がpre-RCを形成できるとともにそれらからＤＮＡ複製の開始を複製することができる段階がないことを確実にする。サイクリン破壊及び姉妹染色分体分離の促進の両方におけるAPCの関与が再複製を染色体分離と連関させるのに重要であり得る。装置の運動量、即ち、ＤＮＡ複製の継続ラウンドはClb/Cdk1キナーゼの活性の変動のみにより維持し得る。それは、運動（即ち、複製のラウンド）がClb/Cdk1 キナーゼの交互の不活化及び再活性化により誘導される往復動装置である。この意味で、それは往復動蒸気エンジンに非常に似ており、その蒸気はキナーゼ活性に相当し、そのピストンは起点に相当する。蒸気、即ち、キナーゼは、それ（即ち、起点）が既に下方の状態（即ち、pre-RCを含む）に戻った場合にピストンを上向きに誘導する（即ち、複製を誘導する）ことのみにより作用し得る。アップ状態（複製を開始した起点）からの経過はピストンを含むチャンバー（即ち、細胞）からの蒸気の排出（即ち、キナーゼの不活化）に依存する。往復動蒸気エンジンの本質は、ピストンがチャンバーからの蒸気の先の排出によりダウン状態に戻った場合にのみ、チャンバーへの蒸気の加入が仕事を行うことである。同様に、Clb/Cdk1キナーゼは、それらの先の不活化がpre-RCの形成を可能にした場合にのみ複製を誘導する。丁度、ピストンが膨張及び収縮のサイクル中に一度移動することができる際に、起点がまたキナーゼ活性化及び不活化のサイクル中に一度だけ点火することができる。細胞サイクルエンジン（Murray及びHunt，1993）が存在する場合、これが確かにそれの主要部分であり得る。タイミングが“往復動”蒸気エンジンの操作に重要である。Clb/Cdk1キナーゼが再活性化される前に、Cdc6が合成される必要があるという知見の意味は、タイミングがまたS.セレビジエ中の“往復動”複製サイクルに重要であることを示唆する。本発明の目的は癌治療用化合物を提供することにある。本発明の実験は、酵母細胞で例示される真核生物細胞中のＤＮＡ複製の開始が２工程プロセス：第一に前複製複合体の将来の複製起点における形成及び第二にＳ期促進サイクリン依存性キナーゼ(Diffeleyら，1994;Schwobら，1994;Coc-ker ら，1996)の活性化であることを示した。不安定なタンパク質Cdc6の合成が酵母起点におけるpre-RCの形成及びＤＮＡ複製のその後の開始に必須である。本発明は、細胞サイクル中にCdc6の合成が前複製複合体を形成し、それによりＤＮＡ複製の新しいラウンドを誘導するのに有効である時の研究の結果に基いている。本発明の実験は、Cdc6が細胞サイクルの期間(Ｓ期及びＭ期促進サイクリン依存性キナーゼが不活性である)(即ち、G1期)中に合成される必要があることを示した。これらのギナーゼが活性になった後のCdc6の合成はＤＮＡ複製の新しいラウンドを誘導するのに有効ではないことが示された。Cdc6の剥奪された細胞はＳ期及びＭ期促進ギナーゼの活性化とともに進行し、有糸分裂に入り、更にはＤＮＡ複製を受けないで後期を受けようと試み、これは致死イベントである(Ke- llyら，1993;Piattiら，1995）。これらの結果から導かれる重要な結諭は、Ｓ期またはＭ期促進サイクリン依存性キナーゼが活性になる細胞サイクル期間中にCd c6機能との一時的干渉が増殖細胞を死滅するのに有効であるが、静止細胞に効果を有しないことである。本発明は腫瘍細胞の増殖に干渉する方法を提供する。この方法は腫瘍細胞、即ち、迅速に増殖する細胞に毒性であるが、その薬剤で治療される患者の非分裂腫瘍細胞または徐々に分裂する非腫瘍細胞に無害である薬剤を同定することを可能にする新規な概念に基いている。本発明はこの新規な観察の利用に基いている腫瘍細胞の死滅方法を提供する。最初のCD6突然変異が単離されて以来(Hartwell，1976)、CDC6が適当なＤＮＡ複製に必須であり、CDC6遺伝子の機能の損失が細胞サイクル静止をもたらすことが知られていたが、本発明の実験は短期間にわたるCdc6機能との干渉がまたＤＮＡ複製及び有糸分裂を誘導するサイクリン依存性キナーゼ(Cdk)を活性化するプロセスにある細胞にとって致死イベントであることを初めて示す。また、本発明の実験はこの現象のメカニズムを示唆する。こうして、pre-RCを形成または維持するCdc6の能力に干渉する薬剤（またはpre-RCを破壊する薬剤）の適用は、薬剤の存在下で、更には薬剤が除去された時でさえもＳ期及びＭ期促進Cdkを活性化するように進行する細胞に致死性である。前複製複合体を形成または維持するCD C6の能力に干渉する薬剤の、例えば、12〜24時間の、反復した一時的適用はその薬剤の存在下でＳ期及びＭ期促進サイクリン依存性キナーゼを活性化する迅速に増殖する腫瘍細胞に致死性であるが、これらのキナーゼが不活性であるG1状態で極めて長く費やす静止宿主細胞または更には遅く分裂する宿主細胞に殆どまたは全く効果を有しないであろう。本発明の実験の結果は出芽酵母サッカロミセス・セレビジエ中でこの原理の証明を与える。細胞からそれらの励起有糸分裂と次のサイクル中のＳ期促進Cdkの再活性化の間の単に40分間にわたってCdc6機能を剥奪することは致死性イベントであることが実証された。ＤＮＡ複製の開始に直接関係した成分の殆ど、例えば、Ｓ期促進サイクリン依存性キナーゼ、複製開始点認識複合体(ORC)、Cdc6、及びMcmタンパク質（これらはＤＮＡ結合タンパク質である）が菌類細胞と動物細胞の間で高度に保存されることが判明したので、本発明の実験の結果による出芽酵母における原理のこの証明はヒト細胞について高度に妥当である。本発明は、酵母で発見されたCdc6機能及び前複製複合体の集合、またはそれらの抑制の夫々に関する原理がまたヒト細胞についても有効であるという仮説の有効性に基いている。酵母とツメガエルのような離れた関係の生物中の相同遺伝子の同定は今までのところ常に相同哺乳類遺伝子の同定をもたらした。それ故、Cdc6のツメガエル同族体に関する最近の論文(Dunphy,W.，Meeting“The Cell Cycle”，Cold Spring Harbour，1996年５月 )は、高等真核生物細胞、そしてまたヒト細胞中のＤＮＡ複製がまたＳ期及びＭ期促進Cdkが不活性であるG1期中のCdc6の存在及び活性に依存するという証明である。それ故、前複製複合体を集合する細胞の能力の一時的抑制は、それが増殖する酵母細胞に致死性であるのと同じ程度に迅速に分裂するヒト細胞に致死性である。複製起点は哺乳類細胞では未だに充分に特性決定されておらず、或る局面において、酵母起点について異なることが判明し得る。それにもかかわらず、真核細胞中の複製メカニズムの報告された保存に基いて、それらは同種タンパク質機能に関与する同様の原理に従って作用することが仮定されるべきである。本発明は、癌の治療のための、Ｓ期及び／またはＭ期を促進するサイクリン依存性キナーゼを活性化する細胞の能力を損なわないで動物細胞中で前複製複合体を形成または維持するcdc6pの機能に干渉する化合物の使用を提供する。以下に、前複製複合体を形成または維持するcdc6pの機能に干渉する化合物をまた“cdc6pインヒビター”と称する。上記概念の利用において、本発明は動物細胞中でCdc6媒介前複製複合体形成及び維持に干渉し得る癌治療用化合物を同定するためのスクリーニング方法を更に提供する。本発明の一実施態様において、このスクリーニング方法は前複製複合体の形成の検出に基いている。例はクロマチンへのCdc6タンパク質の形成がCdc6に対して誘導された抗体により検出されるアッセイである。酵母cdc6タンパク質がクローン化され(Zhouら，1989)、その公表された酵母配列に基いて、相同ヒトタンパク質が当業界で知られている方法、例えば、ヒトｃＤＮＡライブラリーを酵母配列に由来するＤＮＡプローブによりスクリーニングすることにより、またはPCR技術により得られる。ヒトCDC6 cDNAを得る別法は“ 発現クローニング”と称される当業界で知られている方法による相同ヒトｃＤＮＡの発現による酵母中のcdc6(ts)対立遺伝子の機能相補性である。次いでヒトCD C6 cDNAが好適な宿主中で既知の方法に従って発現し得る(Maniatisら，1982)。こうして得られたヒトcdc6タンパク質またはそのアミノ酸配列から誘導されたペプチドがその後に既知の方法に従って使用されて抗体、好ましくはモノクローナル抗体を得、これらは通常のハイブリドーマ技術により産生される（例えば、Harlow及びLane，1988を参照のこと）。 Cdc6p及びMcm7pはS.セレビジエではG1中に複製起点と特異的に会合するが、G2 中に会合しないことが本発明の実験で示された。起点とのMcm7の会合はCdc6に依存する。 Cdc6の結合はクロマチンへのMcmタンパク質の結合の前提条件であることが判明されていたので、Cdc6活性はまたクロマチンへのMcmタンパク質の結合を測定することにより間接的に測定し得る。このようなアッセイは、塗抹され、固定されたクロマチンに結合されたmcmタンパク質の量のin situ免疫蛍光による測定に基き得る。前複製複合体の形成を検出することによりcdc6pインヒビターを同定するためのアッセイは、ヒト生細胞を使用して行い得る。この目的のために、迅速に分裂する細胞、例えば、腫瘍細胞系からの細胞が増殖され、クロマチンへの一種以上のタンパク質の結合に充分な期間にわたって試験物質とともにインキュベートされる。次いで細胞が溶解され、例えば、カバースリップに固定され、クロマチンへのcdc6p及び／またはmcmタンパク質の結合が上記のように測定される。同調された細胞（これらはcdc6p合成の前の細胞サイクルの段階にある）の使用が有利である。関係する薬剤は細胞サイクルの狭いウィンドー中にのみ存在する活性に特異性であることが必要であるので、まさにこのウィンドーを与えるin vitro系がまた cdc6pインヒビターを同定するのに有益である。このようなスクリーニングアッセイはミクロタイタ・プレートアッセイとして行われてもよく、そのアッセイでは、ツメガエル卵エギス(Blow,J.J.及びLaskey,R.A.，1988)（これはＤＮＡを複製することができ、ぞれ故、cdc6p、及びクロマチン、例えば、ツメガエル精子クロマチンをまた含む）は、cdc6pが前複製複合体を形成するのに充分な期間にわたって、試験物質の存在下でインキュベートされる。そのインキュベーション期間後に、クロマチンへのCdc6タンパク質の集合が、免疫蛍光標識を有する抗cd c6抗体を使用して、簡単な免疫学的方法、例えば、in situ免疫蛍光により測定し得る。複製することができるX.L.エキスに関する文献を参照のこと。アッセイ系中のツメガエル成分の使用は動物細胞中で潜在的な薬剤の効力を得るのに極めて有益である。in vitroツメガエル系を使用するスクリーニングアッセイにおいてクロマヂンへのcdc6pの結合のインヒビターとして同定された化合物がツメガエル組織培養細胞について迅速に試験されて迅速にサイクルする体細胞に関するそれらの効果を確認し得る。しかしながら、ヒト細胞からのエキス中のpre-RCの形成についてin vitroアッセイを使用して化合物を試験することが好ましいであろう。これを行うために、 G1細胞から単離された精子クロマチンまたは核が高レベルのcdc6p及びサイクリン依存性キナーゼインヒビター、例えば、P21またはP27を発現するヒト細胞から調製されたエキスに添加されるであろう。ヒトタンパク質が酵母cdc6突然変異の致死性を救済することがわかった場合、酵母細胞が酵母細胞中のヒトcdc6タンパク質の機能を分析するのに使用し得る。本発明に従って使用し得る、cdc6pインヒビターを同定するための酵母をベースとするスクリーニングアッセイの例は、Liangら，1995により行われた実験の種類に基いており、彼らはcdc6が酵母中のorc突然変異のマルチサプレッサーであり、即ち、orc突然変異を有する細胞がそれらの増殖のためにcdc6pの過剰発現を必要とすることを示した。こうして、orc突然変異を有するサッカロミセス・セレビジエ細胞、例えば、Liangら，1995により記載されたorc-5突然変異体またはorc-2突然変異体、及びCDC6配列（好ましくはヒト配列）を含み、その結果、c dc6pを過剰発現する誘導プラスミド、例えば、ガラクトース誘導プラスミドがスクリーニングアッセイに使用し得る。酵母細胞が増殖され、試験物質とともにインキュベートされる。細胞を死滅させる物質がcdc6機能のインヒビターの候補である。 cdc6同族体の機能を分析する（そしてそれによりその機能に干渉する薬剤をスクリーニングする）別の手段は分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ中で有糸分裂の不在下でＤＮＡ複製の多ラウンドを誘導するCDC6/cdc18同族体の能力に基いている(Muzi-Falconiら，1996，Nishitani及びNurse，1995)。試験物質によるcd c6機能の抑制はＤＮＡ含量の増加を無効にし、これが通常の手段、例えば、DAPI （４，６−ジアミド−２−フェニルインドール−二塩酸塩）による染色により測定し得る。 cdc6機能をブロックするとともに、サイクリン依存性キナーゼの活性を損なわない薬剤についての上記スクリーニング方法の結果を狭くするために、対照を行うことが必要である。好適な対照は、これらのキナーゼが依然として活性であり、cdc6機能に干渉する薬剤の存在下で活性化し得ることを示す。このような対照アッセイは、例えば、H1ヒストンリン酸化、及び／または免疫蛍光標識を有する抗サイクリン抗体によるこれらのキナーゼの関連サイクリン（サイクリンＥ及びＡ）の蓄積によるキナーゼ活性(CDK2)の検出に基いてもよい。対照は一次スクリーンと平行に行われてもよい。このような対照は二次スクリーニング工程で行われることが好ましい。キナーゼ活性を保持しながらクロマチンへの結合を抑制し、かつ／または細胞を関連サイクリン(ClnE、ClnE)を蓄積することから阻止しない化学化合物がキナーゼ機能及び活性化を損なわないで残しつつcdc6活性をブロックするという要件を満足する。 pre-RCの検出に基く本発明のスクリーニング方法はcdc6p機能に干渉する薬剤を同定するだけでなく、Ｓ期促進Cdkを早期に活性になるようにする薬剤を同定することが予想される。このような薬剤はCdk抑制性タンパク質に干渉し、迅速に分裂する腫瘍細胞に同等に毒性であり得ると予想される。何とならば、Cdkの早期活性化はまたpre-RCに干渉するからであろう。薬剤スクリーニングと平行して、酵母を用いて行われた本発明の実験の種類を動物細胞中で行うことが有益である。これは遺伝子のバージョン（その転写が、例えば、テトラサイクリン系を使用して自由に誘導でき、即ち、始動されたり、停止されたりできる）によりマウス胚幹細胞の内因性CdC6遺伝子を置換することにより行い得る。この型の実験の実施可能性の前提条件は、マウスCdc6遺伝子の単一コピーであるこどが判明することである。これはサザンハイブリダイゼーションの如き通常の方法により確認し得る。本発明に従って同定された薬剤はcdc6機能に対するインヒビターであり、こうして薬剤がその効果を与えている時に迅速な細胞サイクルを行っているその他の細胞に毒性であり得ることが留意されるべきである。このような細胞、即ち、幹細胞、特に赤血球始原細胞及び血小板始原細胞のような骨髄からの幹細胞に対する望ましくない副作用を阻止するために、このような細胞に特異性のシグナリング経路に干渉する付加的な薬剤が適用されてもよく、その結果、Ｓ期促進キナーゼの活性化が腫瘍細胞に影響しないで阻止され、非腫瘍細胞が細胞サイクルのG1 期に静止されるとともに、cdc6pインヒビターがその効果を奏する。両方の薬剤による患者の治療は低キナーゼ状態で幹細胞をブロックし、抗Cdc6薬剤が最早活性ではない時にそれらにpre-RCを集合させるが、それは腫瘍細胞中でpre-RCを抑制する抗cdc6薬剤の致死性を悪化しないであろう。可能な例はシクロスポリンのような免疫抑制薬剤を使用することであり、それらは、それらの作用の様式のために、それらが低キナーゼ状態の腫瘍細胞をブロックする際よりもこのような状態の骨髄細胞をブロックするのにおそらく有効である。正常細胞を保護するこの概念は本発明の酵母実験で立証され、その実験はα−因子による低サイクリン依存性キナーゼ状態の酵母細胞のブロッキングが細胞を“ノーリターンの時点”を経過することから阻止し、それによりCdc6の合成のブロッキングと関連する致死性を軽減することを示した。図面の簡単な説明図１：pre-RCはG2/M中に形成し得ない。図２：後期有糸分裂でCdc6の剥奪された細胞は次の細胞サイクルで複製することができないが、“還元的”後期を受ける。図３：細胞はＳ期エントリーの時期で“ノーリターンの時点”を通過し、その後 Cdc6合成がＤＮＡ複製を促進することができない。図４：CLB5及びCLB6の欠失がＳ期エントリーの遅延及び“ノーリターンの時点” の同様の遅延を生じる。図５：Ｂ型サイクリン依存性Cdc28キナーゼがＳ期、G2期及びＭ期中にin vivoで Cdc6pと会合する。図６：酵母におけるpre-RC/Cdk1サイクル図７：ARSとのOrc2タンパク質、Cdc6タンパク質及びMcm7タンパク質のin vivoの会合がホルムアルデヒド架橋及びその後の免疫沈殿により検出される。図８：ARSとのCdc6p及びMcm7pの会合の細胞サイクル調節図９：ARS及びクロマチンとのMcm7pの会合がCdc6pの存在に依存する。発明を実施するための最良の形態特に示されない場合、下記の物質及び方法が実施例に使用された。 i)株、培地及び試薬全ての酵母株はW303（HMLa、HMRa、ho、ade2-1、trp1-1、leu2-3,112、his3-1 1,15、ura3、ssd1）の誘導体であり、またはW303に少なくとも３回戻し交雑された。実施例2B及びCに記載された実験（これらの場合、0.1％のガラクトースがYE PR培地に添加された）を除いて、細胞が２％のグルコース(YEPD)、２％のラフィノース(YEPR)または２％のラフィノース＋２％のガラクトース(YEPRG)を示されたように補給されたYEP培地（１％の酵母エキス、２％のバクトペプトン、50mg/ lのアデニン）中で増殖された。メチオニンを欠いている合成培地(-Met培地)はアミノ酸、アデニン、ウラシル及び２％のグルコースを補給された酵母窒素塩基 (0.8％)である。 ii）プラスミド構築物及び遺伝子操作通常の技術(Mortimer及びHawthorne，1969)が遺伝子交雑及びＤＮＡ操作(Ma-n iatisら，1982)に使用された。GAL-ubiCDC6構築物(C2835)を生成するために、CD C6のATGがPCRにより導入されたBamHI部位により置換された。その後、CDC6の2kb BamHI/(NdeI)HindIIIフラグメントがYIplac211（Gustav Ammererからの親切な贈答品）中でGAL-ubiR-MCM1融合のMCM1フラグメントを置換するのに使用された。得られたプラスミドがW303のURA3遺伝子座で単一コピーの組込みのためにApa Ｉで切断された。次いでこの株がK4055（cdc6::hisG、trp1::TRP1 MET-CDC6、Pi attiら，1995）に交雑されて、胞子形成後に、株K4675（cdc6::hisG、ura3::URA 3 GAL-ubiCDC6）を生成した。K4675がcdc15-2株(K1994)またはcdc7-1株(K2033) に交雑されて、胞子形成後に、株K5032（MATa、cdc15-2、cdc6::hisG、ura3::UR A3 GAL-ubiCDC6）、K5033（MATa、cdc15-2、cdc6::hisG、ura3::URA3 GAL-ubiCD C6）及びK5029（MATa、cdc7-1、cdc6::hisG、ura3::URA3 GAL-ubiCDC6）を生成した。ここに使用したCDC6のＣ末端HA3標識バージョンは、それがHis標識（プラスミドC2838）を含まない以外は、前記のもの(Piattiら，1995)と同様である。 C2838がW303のCDC6遺伝子座で単一コピーで組込まれて、その遺伝子のトランケートされた未標識バージョンにより隣接されたCDC6の完全長標識バージョン(株K 4528)を生成した。K4528が種々のcdc突然変異体に交雑されて、相当する二倍体の胞子形成後に、実施例５に使用された株を生成した。トリプルHA NotIカセット(Tyersら，1992)をCDC6のATG後に挿入することによりGAL-HA3CDC6(C2837)がつくられ、この場合、NotI部位がPCRにより導入された。次いで標識遺伝子(CDC6のNdeI部位で終了する)がCLB5リーダー配列の70bpを含むGAL1-10プロモーターの下流でYiplac211中でクローン化された。続いて、そのプラスミドがCDC6遺伝子座(一つのコピーで、株K5095、または五つのコピーで、株K4527)における組込みのためにBclIで切断され、またはURA3（株5761）における組込みのためにStuIで切断された。K5761がK4143(cdc15-2、cdc6::hisG、trp1 ::TRP1 MET-CDC6)に交雑されて胞子形成後に株K5763（cdc15-2、cdc6::hisG、ur a3::URA3 GAL-HA3CDC6）を生成した。 iii)細胞同調技術 cdc15-2ブロック／解放実験を行うために、細胞が指数的成長相まで増殖され、濾過され、予め温められた培地に接種された。細胞サイクル静止が37℃で３時間のインキュベーションにより得られ、次いで細胞が再度濾過され、25℃で解放された。CDC6合成がGAL1-10プロモーター(GAL-ubiCDC6またはGAL-HA3CDC6)により調節される場合、細胞が濾過により回収され、予め温められたYEPR培地中で37 ℃で30分間にわたっでインキュベートされ（GALプロモーター・オフ）、その後にYEPR中で25℃で解放された。誘導のために、２％のガラクトース（または実施例3B及びCに記載された実験では0.1％）が異なる時点で細胞のアリコートに添加された。 CDC6発現がMET3プロモーター(MET-CDC6)により誘導された場合、CDC6合成の許容条件及び非許容条件が夫々-Met培地及びYEPD+2％メチオニンの使用により得られたことを除いて、細胞が上記のように処理された。 cdc15ブロックからの解放後に示された細胞分離欠陥ために、細胞の一部は細胞分裂の前に複製し始め、FACSプロフィールで4Cピークを生じ、一方、その他の部分はＳ期に入る前に分裂する。4C DNA含量を有する細胞は二核である必要があり、一方、1C DNA含量を有する細胞は単核である必要がある。2C DNA含量を有する細胞は二核または単核であってもよい。それ故、ＤＮＡ複製を受けることができる細胞のフラクションを更に正確に定量するために、解放後の夫々の時点（２時間まで）で、細胞のフラクションが1C DNA含量、2C DNA含量または4C DNA含量でFACSによりスコアーを付けられ、そして同じ細胞サンプルについて単核細胞vs 二核細胞のフラクション（プロピジウムヨージド染色細胞について免疫蛍光により測定されたような）によりスコアーを付けられた。これは本発明者らが下記の数式を使用することにより2C核（即ち、複製した核）の％を求めることを可能にした。％2C＝100.(2.C₄+U-C₁)/(U+2.B) （式中、C₁、C₂、及びC₄は1C、2C、または4C DNA含量を有する夫々の時点の細胞のフラクションであり、かつＵ及びＢは夫々単核細胞及び二核細胞のフラクションである）この数式の結果はcdc15解放直後のＳ期中に複製した核のフラクションを信頼できる程に反映することが仮定し得るが、細胞サイクルのその後の段階中のその適用は或る種の制限を有する。実際に、Ｓ期を完結した後、細胞のフラクションが先の細胞分離を完結する前に有糸分裂を受けて、２より多い核を有する細胞を生じる。これらの細胞は簡素化のために二核としてスコアーを付けられたので、これらの細胞が出現し始める時、2C核の％は過大推定されるようになる。何とならば、4C DNA含量を有する細胞の一部が二つの2C核ではなく四つの1C核を有するからである。別の制限がＤＮＡ複製の不在下で後期を受けるCdc6剥奪細胞の特徴から生じる。この場合、1C細胞は単核である必要があるという仮説は最早真実であることを保てない。Cdc6を欠いている細胞では、計算が<1C DNA含量を有する細胞の出現により更に複雑にされる。それ故、上記式がこれらの細胞に適用される場合、その結果は負の数であり得る。結諭すると、上記式はcdc15解放後の最初のＳ期中にＤＮＡ複製を受けた核のフラクションを推定するのにのみ信頼できる程に適用し得ると言い得る。図6A及びBに記載されたノコダゾール静止／解放実験について、YEPRG中で指数的に成長している細胞が25℃で2.5時間にわたって5mg/mlのノコダゾール（及び最終濃度１％のDMSO）とともにインキュベートされた。次いで細胞が濾過され、３倍容のYEPR+1％のDMSOで洗浄され、25℃でYEPR+2mg/mlのα因子（図6A）または37℃でYEPR（図6B）中で３時間にわたってインキュベートされた。その後、細胞が二つに分けられ、半分が２％のガラクトースの存在下で15分間にわたってインキュベートされた。続いて、細胞が25℃で２時間にわたってα因子またはcdc7 ブロックからYEPRG培地またはYEPR培地に濾過により解放された。 iv）in vivoフットプリンティング YEPRG中で指数的に成長しているK5033細胞(MATa、CDC15-2、cdc6::hisG、ura3 ::URA3 GAL-ubiCDC6)が37℃で３時間のインキュベーションにより静止され、次いで90分間にわたってYEPD+α因子(10mg/ml)に解放された。次いで培養物のアリコートがYEPRG+α因子に移され、一方、その他がα因子からYEPD+ノコダゾール( 20mg/ml)に解放された。90分後に、細胞サンプルがin vivoフットプリンティングのために取り出され、ノコダゾールを含む培養物の一部が90分間にわたってYE PRG+ノコダゾールに移された。夫々の条件から、2m起点に関するフットプリンティング実験が50mlの培養物(2x10⁷細胞/ml)についてDiffleyら，1994に従って行われた。 v)ノーザンブロット分析及びウェスタンブロット分析 Cross及びTinkelenberg（1991）並びにPriceら(1991)により記載された方法が夫々ＲＮＡ単離及びノーザンブロット分析に使用された。ウェスタンブロット分析について、タンパク質抽出物がSuranaら(1993)（図2C 及ひ4B）に記載されたようにして、またはTCA沈殿(Foianiら，1994)(実施例5B) により調製された。全抽出物50-150mgがイモビロンＰ膜（ミリポア）に移された。HA標識Cdc6が12CA5 MAb（1:100）で検出され、一方、myc標識Cdc6がMAb 9E10 （1:200）により検出された。シグナルが前記のようにして増幅された(Piattiら，1995)。抗SWi6 Abが1:100,000で使用され、抗Cdc28 Abが1:1000希釈で使用された。二次抗体がアメーシャムから購入され、タンパク質が製造業者に従って増進されたケミルミネセンス系により検出された。 vi）免疫沈殿アッセイ及びキナーゼアッセイタンパク質抽出物がSchwobら，1994のようにして調製された。Clb2キナーゼアッセイについて、全タンパク質100mgが抗Cdc28 Ab（1:30、Amonら，1992）を使用して免疫沈殿された。Cdc6会合キナーゼを分析するために、HA3Cdc6またはCdc 6HA3が図の脚注に示された量のタンパク質抽出物から12CA5 Ab（1:10）で免疫沈殿された。ヒストンH1キナーゼ活性が前記のように測定された(Schwobら，1994) 。 vii）ARS配列と関連タンパク質の間のin vivo会合の検出これらの操作はHecht,A.ら，1996;Strahl-Bolsingerら，1997により記載された方法に基いており、若干改良した。酵母細胞50ミリリットル(1.0-2.0’10⁷細胞/ml)が室温で15分間にわたって１％のホルムアルデヒドで架橋された。125mM のグリシンの添加及び５分間のインキュベーション後に、細胞が回収され、トリス緩衝食塩水で３回洗浄された。細胞破壊が溶解緩衝液（上記参考文献を参照のこと）400-800ml中でガラスビーズで行われた。そしてモデルAS1プローブを備えたミクロ超音波細胞ディスラプター（コンテス）を使用して、細胞エキスが夫々 15秒で４回音波処理された（クロマチンが500bpの平均サイズに剪断される）。免疫沈殿がラットモノクローナル抗マウス免疫グロブリン（ダイナビーズM-450 、ダイナール）で被覆され、製造業者のプロトコルに従って前もって9E11（抗my c抗体）または12CA5(抗HA抗体)とともに３−８時間インキュベートされた磁気ビーズ(2.0’10⁷ビーズ）で行われた。関連myc標識タンパク質の90％より多くが先に架橋しないでこの操作により免疫沈殿され、50-60％が架橋後に免疫沈殿されることが確認された。沈殿が洗浄され、上記文献に記載されたようにしてＤＮＡ精製のために処理された。PCRが夫々抗町c抗体または抗HA抗体により免疫沈殿された物質1/30-1/10または1/10（この量は上記PCRサイクル下でプラトー相に達しないでPCR産物を増幅するように最適化される）、または先の架橋を含む全細胞エキスに由来するＤＮＡサンプル1/6000を用いて50mlの容積で行われた。Taqポリメラーゼ(GIBCO/BRL)及び相当する緩衝液系が使用された。PCRプライマーが約 50％GC含量を有する20merとして設計されて、ARS1を含む領域について夫々350、310、270及び228bpのサイズの染色体IVの左テロメアから454.5、458.5 、462.5（ARS1を含む）及び466.5kbに位置するゲノム配列を増幅し、またARS305 を含む領域について夫々240、270、310及び346bpのサイズの染色体IIIの左テロメアから30.5、34.5、37.5及び39.5（ARS305を含む）kbに位置するゲノム配列を増幅するように設計された。プライマーの四つの対が夫々のPCR反応に一緒に使用された。夫々のプライマーの最終濃度（これは全ゲノムがあらゆる濃度で鋳型として使用された時に夫々のフラグメントを均等に増幅するように設定された）は、ARS1を含む領域中で350bpまたは270bpを増幅するプライマー（夫々、450nM または180nMが使用された）以外は300nMであった。PCRサイクルにおいて、94℃ で３分間の初期変性、続いて94℃で１分間の変性、53℃で１分間のアニール、72 ℃で２分間の重合、及び72℃で７分間の最終伸長による30サイクルが行われた。プライマー−ダイマー形成を避けるために、“熱開始”操作が製造業者のプロトコルに従って抗Taq抗体（Taq開始抗体、クロンテク）により行われた。PCR産物の30％が2.3％のアガロースゲル中で分離され、0.2mg/mlのエチジウムブロミドで視覚化された。ゲル・プリント2000i（バイオフォトニクス）を使用して、ゲルが写真撮影された。 viii）その他の技術フローサイトメトリーＤＮＡ定量がEpstein及びCross(1992)に従ってベクトン −ディキンソンFacscanで測定された。in situ免疫蛍光及び顕微鏡写真撮影がNa smythら(1990)に従って行われた。myc12Cdc6の免疫染色を検出するために、9E10 MAbが1:5希釈で使用され、CY3結合抗マウスAb（1:200、シグマ）を使用して、シグナルが間接免疫蛍光により検出された。実施例１ pre-RCがG2/Mに形成し得ない。 cdc15 GAL-ubiCDC6（K5033）細胞をCdc6タンパク質を剥奪した後にα因子またはノコダゾール中で静止した（物質及び方法を参照のこと）。静止中に、Cdc6タンパク質の合成をガラクトース培地へのシフトにより再度誘導した。図１中の三角形は次第に増加する濃度のDNAse Ｉを示す。ORC誘導超感受性部位の位置をアステリスクとして示す。実施例２後期有糸分裂中Cdc6の剥奪された細胞は次の細胞サイクル中に複製することができないが、“還元的”後期を受ける。 YEPRG培地中で増殖しているcdc15（K1993）及びcdc15 GAL-ubiCDC6細胞（K503 2）を37℃で３時間のインキュベーションにより静止した。その後、細胞を濾過し、37℃でYEPR中で再度懸濁させ、30’後（時間＝０）に、25℃でYEPR(図2A及びB)またはYEPRG培地（図2C）中に解放した。図2D）に、図2A）、B)及びC)に記載された同じ実験について、下記の数式で計算した2C核（即ち、ＤＮＡ複製を受けた核）のフラクションを示す。％2C=100．(2.C₄+U-C₁)/(U+2.B)（式中、C₁、C₂ 、及びC₄は1C、2C、または4C DNA含量を有する夫々の時点の細胞のフラクションであり、かつＵ及びＢは夫々単核細胞及び二核細胞のフラクションである）（物質及び方法を参照のこと）。実施例３細胞はＳ期エントリーの時期に“ノーリターンの時点”を経過し、その後にCdc6 合成がＤＮＡ複製を促進することができない。 A）cdc15(K1993)細胞及びcdc15 GAL-ubiCDC6（K5032）細胞を実施例２のようにして処理した。YEPR中のcdc15静止からの解放(t=0)後に、10’間隔で取り出されたcdc15 GAL-ubiCDC6培養物のアリコート（図3A中、右に示される）に２％のガラクトースを補給してCdc6合成を再度誘導した。夫々の独立の培養物について、細胞サンプルを２時間にわたって30分毎にFACSにより分析した。夫々の時点の2C 核のフラクションを、実施例２に記載された式を使用して計算した（図2D）。図 3Aの右に示された時間は、培養物の夫々のアリコートがガラクトース培地に移された時間を表す。 B）0.1％のガラクトースを使用してCdc6合成を再度誘導した以外は、A)で使用したのと同じ実験操作をGAL-HA3CDC6株(K5763)に適用した（図3B）。B)と同じ実験条件下で、異なる時点のHA3Cdc6の発現を誘導の30’後にウェスタン分析により評価した。Swi6pを内部ローディング対照として使用した（図3C）。実施例４ CLB5及びCLB6の欠失はＳ期エントリーの遅延及び“ノーリターンの時点”の同様の遅延を生じる。 YEPD中で増殖しているcdc15（K1993）及びcdc15 clb5 clb6（K5027）細胞を37 ℃で3.5時間にわたって静止し、次いで25℃で解放した。異なる時点で、細胞サンプルをFACS分析及び出芽インデックス（図4A）のため、またClb2依存性ヒストンH1キナーゼ活性（図4B）を分析するために取り出した。C)cdc15 clb5 clb6GAL -ubiCDC6細胞(K5231)を実施例３でK5032について記載されたようにして処理した。YEPRへのcdc15静止からの解放(t=0)後に、10分間の間隔で取り出されたK5321 培養物のアリコートに２％のガラクトースを補給し、YEPRG中で180分間にわたってインキュベートした。夫々の個々の培養物から、細胞サンプルをFACS分析のために30分毎に回収し、実施例２に記載された式を使用して、2C核のフラクションを評価した。結果を図4Cに示す。実施例５Ｂ型サイクリン依存性Cdc28キナーゼがＳ期、G2期及びＭ期中にin vivoでCdc6p と会合する。 A)未標識CDC6（K699）またはCDC6のHA3標識バージョン(CDC6HA3、K4528)を含む野生型細胞からの細胞エキスを12CA5 Abの存在下(+Ab)または不在下(-Ab)でインキュベートした。免疫沈殿後に、ヒストンH1キナーゼを分析した（図5A）。 B)全てCDC6HA3遺伝子を含む、K4528(野生型)、K5275(cdc28-13)、K5082(cdc34-2 )、K5272(cdc7-1)、K5074(cdc34-2、sic1)、K5279(cdc15-2)細胞をYEPD中で25℃ で増殖させ、37℃で3.5時間にわたって静止させた。また、K4528細胞を80mMのヒドロキシ尿素(HU)を含むYEPD中で25℃で3.5時間にわたってインキュベートした。細胞ザンプルを12CA5 Abによるウェスタンブロット（図5Bの下のパネル）、キナーゼアッセイ及びFACS分析（示されていない）のために回収した。Ｃ（ローディング対照）は12CA5 Abと交差反応するタンパク質である。キナーゼアッセイについて、Cdc6pをタンパク質抽出物0.5mgから12CA5 Abで免疫沈殿させ、ヒストンH1キナーゼ活性を測定した（図5B）。 C）Cdc6会合キナーゼはCDC28に依存性である。両方がGAL-HA3CDC6の５コピーを含む野生型(WT、K4527)及びcdc28-4（K5472）細胞をYEPR中で増殖させ、YEPRG中で25℃で４時間にわたって誘導した。また、K5472細胞をYEPR中で37℃で３時間にわたって静止させ、またはYEPRG中で１時間にわたって25℃でインキュベートし、次いで37℃で３時間にわたって静止させた。夫々の条件について、タンパク質抽出物0.2mgを12CA5 Abで免疫沈殿させ、会合キナーゼ活性を測定した（図5CR ：ラフィノース、Ｇ：ガラクトース）。 D）Cdc6会合キナーゼをp40^SIC1により抑制する。YEPR中25℃で増殖され、または YEPRG中４時間誘導されたK4527からのタンパク質抽出物1mgを12CA5 Abで免疫沈殿させ、最後の洗浄工程の前に四つのアリコートに分けた。キナーゼ活性を示された量の精製p40^SIC1の不在下または存在下で測定した。Ｒ：ラフィノース、Ｇ：ガラクトース。p40^SIC1の添加はおそらく非特異性キナーゼによるp40^SIC1のリン酸化のために二つの付加的なシグナルの出現を生じる。E）Cdc28pはCdc6pと同時免疫沈殿する。Cdc6pをYEPR中25℃で増殖され、YEPRG中４時間誘導されたK452 7細胞のタンパク質抽出物(5mg)から12CA5 Abで免疫沈殿させた。プロテインＡ− セファロースビーズをSDS緩衝液中で沸騰させ、Cdc28 Ab(1:500)を使用してウェスタンブロットにより分析した（図5D、Ｒ：ラフィノース、Ｇ：ガラクトース）。実施例６ ARSとのOrcタンパク質、Cdc6タンパク質及びMcm7タンパク質のin vivo会合これらの会合をホルムアルデヒド架橋及びその後の免疫沈殿により検出した。（A）ARS1及びARS305とのOrc2pのin vivo会合。PCRを同時沈殿したクロマチンフラグメント（図7A、レーン１−４）、鋳型のための先の架橋（レーン５、８）またはその連続の４倍希釈（レーン６、７、９、10）による全細胞エキス(WCE)からのＤＮＡサンブル及びARS1の周囲の三つの領域及びARS1を含む領域を増幅するためのプライマーの四つの組を用いて行った（上部）。同様の操作をARS305について使用した（下部）。これらのＤＮＡサンプルを細胞から調製し、これらを Orc2のmyc標識を用いて(K6447、レーン２−４、８−10)または用いずに(K699、レーン１、５−７)YEPR中で25℃で非同調的に培養した。免疫沈殿操作を先の架橋を用いて（レーン１−３）または用いずに（レーン４）、抗myc抗体を用いて（レーン１、３、４）または用いずに（レーン２）行った。 (B)ARS1(図7B上部)及びARS305（下部）とのCdc6p及びMcm7pのin vivo会合。PCR を同時免疫沈殿したクロマチンフラグメント（レーン１−８）、先の架橋による WCEからのＤＮＡサンプル（レーン９−12）を用いて行った。これらのサンプルをmyc標識を用いずに(K699、レーン１、９)またはMcm（K6210、レーン２−４、1 0）、Cdc6（K6302、レーン５−７、11）またはCse1（K6182、レーン８、12）についてそれらを用いて非同調的に増殖している細胞から調製した。免疫沈殿操作を先の架橋を用いて（レーン１−３、５、６、８）または用いずに（レーン４、７）、抗myc抗体を用いて（レーン１、３、４、６−８）または用いずに（レーン２、５）行った。（C）ARS1突然変異はARS1（図7C上部）とのOrc2p、Cdc6p及びMcm7pのin vivo会合を無効にするが、ARS305（下部）とのその会合を無効にしない。PCRを同時免疫沈殿したクロマチンフラグメント（レーン１−12）、先の架橋によるWCEからのＤＮＡサンプル（レーン13−15）を用いて行った。これらのサンプルをmyc標識を用いずに（レーン１−３）またはOrc2（レーン４−６）、Mcm7（レーン７− ９、13−15）またはCdc6（レーン10−12）に融合されたそれらを用いて非同調細胞から調製した。これらの細胞は野生型ARS1（レーン１ K6653、レーン４ K6649 、レーン７＋13 K6670、レーン10 K6675）、要素Ａ中の突然変異（レーン２ K66 38、レーン５ K6641、レーン８＋14K 6639、レーン11 K6673）またはARS1中に要素B1-3中の突然変異（レーン３ K6667、レーン６ K6662、レーン９＋15 K6666、レーン12 K6672）を宿している。無myc-標識、Orc2-myc、Cdc6-mycを発現する株のWCEからのＤＮＡを用いるPCRはMcm7-mycの場合の結果と同様の結果を生じた（データは示されていない）。ARS1突然変異体及びその野生型の中で、FACSにより測定したＤＮＡ含量に有意差がなかった。実施例７ ARSとのCdc6p及びMcm7pの会合の細胞サイクル調節（A）細胞サイクル同調細胞中のARS1とのCdc6pのin vivo会合。Cdc6-mycホモ接合二倍体の小さいG1細胞(K6691)を遠心水ひにより単離し、次いでYEPR中で25℃ で解放した。PCRの鋳型ＤＮＡを免疫沈殿(0-200分)またはWCE後の夫々の時点で同じ容積のサンプルに由来するホルムアルデヒド架橋細胞から調製した（結果を図8Aに示す。最も左のレーンは０分のサンプルを示す）。その他の時点でWCEからのＤＮＡは０分と殆ど同じ結果を示す（データは示されていない）。出芽細胞及び長いスピンドルを有する細胞の％、並びにFACSにより測定したＤＮＡ含量をまた示す。（B）細胞サイクル同調細胞中のARS1（図8B上部）及びARS305（下部）とのMcm7p のin vivo会合。Mcm7-mycホモ接合二倍体の小さいG1細胞(K6465)を遠心水ひにより単離し、次いでYEPR中で25℃で解放した。PCRの鋳型ＤＮＡを(A)と同じ方法で調製した。出芽細胞、長いスピンドルを有する細胞及びMcm7pの核蓄積を示す細胞の％並びにFACSにより測定したＤＮＡ含量をまた示す。実施例８ ARS及びクロマチンどのMcm7pの会合はCdc6pの存在に依存する。 GAL-ubi-CDC6・Dcdc6・MCM7-mycホモ接合二倍体の早期G1細胞(K6484)を、75分間にわたって培地からのガラクトースの除去によりCdc6pを枯渇した後に遠心水ひにより単離した。続いてそれらをYEPR（Gal-）またはYEPRGal(Gal+)培地中で2 5℃で解放した。 ARS1（図９上部）及びARS305（下部）とのMcm7pのin vivo会合。PCRの鋳型ＤＮＡを示された時点で図8Aと同じ方法で調製した。出芽細胞及びMcm7pの核蓄積を示す細胞の％並びにFACSにより測定したＤＮＡ含量をまた示す。また、in situ免疫蛍光による２種の培養物中のMcm7-mycの細胞位置の測定はまたMcm7pが野生型細胞に比べて若干低い程度ではあるが、Cdc6pを欠いたG1細胞の開始集団中の殆どの細胞の核中で濃縮されることを示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ 1/48 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者ディフリージョンイギリスハートシャーエイエル３５ジェイエイチセントアルバンスフォーリーレーン 90

Claims

【特許請求の範囲】 1. 迅速に分裂する細胞、特に腫瘍細胞を、ＤＮＡ複製を抑制することにより死滅させる方法に使用するための、Ｓ期及び／またはＭ期を促進するサイクリン依存性キナーゼを活性化する細胞の能力を損なうことなく、動物細胞中で前複製複合体を形成または維持するcdc6タンパク質の機能に干渉する化合物。 2. 癌治療に使用するための、請求の範囲第１項に記載の化合物。 3. 動物細胞中でＤＮＡ複製に干渉する能力を有する請求の範囲第１項に記載の化合物のスクリーニング方法であって、試験化合物をＤＮＡ複製に必要とされる成分を含む基質に適用し、前複製複合体を形成または維持するcdc6タンパク質の能力に関する基質の効果を直接または間接に測定することを特徴とする、前記スクリーニング方法。 4. ＤＮＡを複製することができる卵エキスとクロマチンの混合物を含む基質を、cdc6pが前複製複合体を形成するのに充分な期間にわたって、試験化合物とともにインキュベートし、クロマチンへのCdc6タンパク質の集合を直接に測定する、請求の範囲第３項に記載の方法。 5. ヒト精子タロマチンまたはヒトG1細胞から単離された核、高レベルのcdc6p を発現するヒト細胞から調製されたエキス、及びサイクリン依存性キナーゼインヒビターの混合物を含む基質を、cdc6pが前複製複合体を形成するのに充分な期間にわたって試験化合物とともにインキュベートし、クロマチンへのCdc6 タンパク質の集合を直接に測定する、請求の範囲第３項に記載の方法。 6. クロマチンへのCdc6タンパク質の集合を抗cdc6抗体により測定する、請求の範囲第４項または第５項に記載の方法。 7. 抗cdc6抗体が蛍光標識を有する、請求の範囲第６項に記載の方法。 8. 基質が、迅速に分裂する動物細胞、特に腫瘍細胞系に由来するヒト細胞を含み、cdc6pが前複製複合体を形成するのに充分な期間にわたって試験化合物の存在下で細胞をインキユベートし、細胞を溶解し、クロマチンへのCdc6タンパク質の集合を直接に測定する、請求の範囲第３項に記載の方法。 9. 基質が、orc突然変異及びヒトCDC6配列を含む誘導プラスミドを有する酵母細胞を含み、その結果それらがcdc6pを過剰発現し、細胞を増殖させ、試験物質とともにインキュベートし、cdc6p機能を抑制する化合物の効果を細胞の生存度を測定することにより間接的に測定する、請求の範囲第３項に記載の方法。 10．Ｓ期及び／またはＭ期を促進するサイクリン依存性キナーゼの活性化を損なわない化合物の能力を、キナーゼ活性及び／またはサイクリン蓄積を測定することにより測定する、請求の範囲第３項〜第９項のいずれか一項に記載の方法。 11．請求の範囲第１項に記載の化合物を活性成分として含むことを特徴とする、医薬組成物。