【発明の詳細な説明】
ファンコーニ遺伝子II
本発明は、ファンコーニ貧血（FA）に関連する、病態生理学的な関連遺伝子、
それによってコードされているポリペプチド、このポリペプチドに対する抗体、
ならびにその核酸、ポリペプチド、および抗体の薬学的使用に関する。
FAは、進行性汎血球減少、先天性奇形、および腫瘍病の危険が高いという特徴
をもつ、稀な遺伝病である（GlanzおよびFraser、J．Med．Genet．19（1982）41
2-416；AuerbachおよびAllen、Cancer Genet.Cytogenet.51（1991）1-12）。こ
の病気は、約300,000人に1人が発症する。
この病気の分子的基盤は不明であるが、DNA架橋試薬の染色体異常誘発効果に
対する過敏性が、FA遺伝子型の優れたマーカーとなる（AuerbachおよびWolmann
、Nature 261（1976）494-496）。FAの患者からの細胞は、正常な細胞に対して
は低い染色体異常誘発効果を示す濃度のマイトマイシンC（MMC）またはジエポキ
シブタン（DEB）と接触させると、多数の染色分体切断および染色分体の置換を
示す（SasakiおよびTonomura、Cancer Res．33(1973)，1829-1836；ならびにAue
rbach、Exp.Hematol．21(1993)，731）。FAのリンパ球および線維芽細胞をMMCと
共にインキュベートすると、G2期移行の遅れと完全な停止が表れ、細胞周期のG2
期における欠陥が明らかになる（Kubbiesら、Am．J．Hum．Genet．37(1985)，10
22；Hoehnら、ファンコーニ貧血、臨床的、細胞発生学的、および実験的な側面
（Fanconi Anaemia，Clinical，Cytogenic and Experimental Aspects）(1989)
，Springer Verlag Berlin-Heidelberg；Seyschabら、Blood 85(1995)，2233-22
37）。
現在、FA集団には、少なくとも5つの異なった相補グループがあることが知ら
れている（Duckworth-Rysieckiら、Somatic Cell Mol.Genet.11(1985),35；Stra
thdeeら、Nature 356(1992)，763；Joenjeら、Blood 86(1995)，2156-2160）。
相補グループAおよびCに対する遺伝子が、近年報告された（Strathdeeら、Natur
e 356(1992)，763；Lo Ten Folら、Nature Genet．14(1996)，320-323；国際公
開公報第93/22435号；Pronkら、Nature Genet．11(1995)，338-340）が、FA-Aお
よびFA-Cタンパク質の作用の分子機構のタイプは、まだ不明である（Gavishら
、Am．J．Hum.Genet．53(1993)，685；Yamashitaら、Proc．Natl．Acad．Sci．U
SA 91(1994)，6712；Youssoufianら、J．Biol．Chem．270(1995)，9876-9882）
。さらに、FADの相補グループについては、染色体上の位置が特定されている（W
hitneyら、Nature Genet．11(1995)，341-343）。
本発明の目的は、DNA制御のカスケード（例えば細胞周期異常、DNA修復、腫瘍
形成/腫瘍の進行）に関与する新規の遺伝子で、ファンコーニ貧血の病態生理学
的表現型に関連する遺伝子を同定することであった。
本発明は、ファンコーニ遺伝子IIと名付けられた、２つの新規ポリペプチドを
コードする遺伝子の同定、クローニング、および特徴決定について説明する。こ
の遺伝子の配列は、正常な線維芽細胞とFA線維芽細胞とを比較したディファレン
シャルディスプレイ法（リアング（Liang）とパーディ（Pardee）、Science 257
(1992)，967-971）を用いて発見されたものである。ファンコーニ遺伝子IIは、F
A線維芽細胞では発現しないが正常線維芽細胞では発現している。ファンコーニ
遺伝子II、それによってコードされているポリペプチドおよびこのポリペプチド
に対する抗体は、細胞周期、細胞活性化、細胞周期の進行、DNA修復、血球減少
、腫瘍形成、および腫瘍の進行の異常に、直接的または間接的に関連する病気を
診断、治療、または予防する薬剤として適している。
本発明の主題は、
（ａ）配列番号：1に示された塩基配列、もしくはそのタンパク質コード部分、
（ｂ）遺伝子コード縮退の範囲内にある、（ａ）の配列に相当する塩基配列、ま
たは
（ｃ）ストリンジェントな条件下で、（ａ）および/もしくは（ｂ）の配列とハ
イブリダイズする塩基配列
を含む核酸である。
配列番号：1に示されている塩基配列の一部を含む３つのcDNA配列W44613、W44
574、g1664579、1966が、EMBLのESTデータバンクに記載されている。これらの配
列は、本発明の主題ではない。これらの３つの配列はいずれも、開始コドンが抜
けているためにオープンリーディングフレームが示されておらず、本発明に記載
されている完全長の塩基配列も、その機能的なタンパク質コード領域も開示され
ていない。さらに、これら３つの配列は、5'側非翻訳領域を持っておらず、また
、リーディングフレームのフレームシフトをもたらす欠失を含んでいる。そのう
え、上記の３つの配列については、生物学的機能が開示されていない。
配列番号：1に示されている塩基配列は、長さ223アミノ酸と165アミノ酸のポ
リペプチドに相当する、２つのオープンリーディングフレームをもっている。こ
れらのポリペプチドは、配列番号：2に示したアミノ酸配列のアミノ酸1位から22
3位まで、またはアミノ酸59位から223位までに及んでいる。
配列番号：１において、ヌクレオチドY、すなわちCまたはTがヌクレオチド491
位に、また塩基S、すなわちCまたはGがヌクレオチド514位に存在する。
配列番号：1に示された塩基配列と、遺伝子コード縮退の範囲内でこの配列に
相当する塩基配列に加えて、本発明は、前記の配列の一つとハイブリダイズする
塩基配列にも関する。本発明において、「ハイブリダイゼーション」という用語
は、サムブルック（Sambrook）ら、（分子クローニング：実験マニュアル（Mole
cular Cloning.A Laboratory Manual）、コールドスプリングハーバー研究所出
版（Cold Spring Harbor Laboratory Press）(1989)，1.101-1.104）と同じよう
に用いられている。ストリンジェントなハイブリダイゼーションとは、50℃、好
ましくは55℃、特に好ましくは62℃、また、最も好ましくは68℃で、1×SSCおよ
び0.1％SDSにより1時間洗浄、特に55℃、好ましくは55℃、特に好ましくは62℃
、最も好ましくは68℃で、0.2×SSCおよび0.1％SDSで1時間洗浄した後でも陽性
のハイブリダイゼーションシグナルが見られることを、好ましくは意味する。こ
のような洗浄条件の下で、配列番号：1に示された塩基配列、または遺伝子コー
ド縮退の範囲内でこの配列に相当する塩基配列とハイブリダイズする塩基配列は
、本発明に係る塩基配列である。
本発明に係る塩基配列は、好ましくはDNAである。しかし、RNA、またはペプチ
ド性核酸のような核酸類似化合物も含まれうる。本発明に係る核酸は、特に好ま
しくは、配列番号：1に示された塩基配列のタンパク質コード部分、または、配
列番号：1に示された塩基配列、もしくはこの配列の、好ましくは少なくとも20
塩基、および特に好ましくは少なくとも50塩基の長さの部分と、80％よりも高い
、好ましくは90％よりも高い、最も好ましくは95％よりも高い相同性をもつ配列
を含
む。
本発明のさらに別の主題は、上記の核酸によってコードされているポリペプチ
ドである。これらのポリペプチドは、好ましくは、（ａ）配列番号：2に示され
るアミノ酸1位〜223位のアミノ酸配列をもつか、（ｂ）配列番号：２に示される
アミノ酸59位〜223位のアミノ酸配列をもつか、または（ｃ）（ａ）もしくは（
ｂ）に示されたアミノ酸配列の一つに、70％よりも高い、好ましくは80％よりも
高い、特に好ましくは90％よりも高い相同性をもつ。
本発明に係る核酸は、好ましくは哺乳動物、特にヒトから得ることができる。
これらは、既知の方法によるハイブリダイゼーション用のプローブおよび/また
はプライマーとして、配列番号：1に示された塩基配列の短い断片を用い既知の
技術によって単離することができる。さらに本発明に係る核酸は、例えば2’-O-
アルキル化ヌクレオチド構成単位などの修飾されたヌクレオチド構成単位を、通
常のヌクレオチド構成単位の代わりに選択的に用いることのできる化学合成によ
っても調製することができる。部分的または完全に修飾ヌクレオチド構成単位に
より構成される核酸は、例えばアンチセンス核酸またはリボザイムのような治療
薬として用いることができる。
本発明はまた、本発明に係る核酸に対応する塩基配列のペプチド性核酸などの
核酸類似化合物も含む。
本発明のさらなる主題は、本発明に係る核酸を少なくとも1コピー含むベクタ
ーである。このベクターは、本発明に係るDNA配列がその上に存在する所望の原
核生物または真核生物のいずれのベクターでもよく、好ましくは本発明に係るDN
A配列が発現シグナル（プロモーター、オペレーター、エンハンサーなど）の制
御下に存在するものである。原核生物ベクターの例として、バクテリオファージ
などの染色体ベクターおよびプラスミドなどの染色体外ベクターがあるが、環状
プラスミドが特に好ましい。適当な原核生物ベクターについて、例えばサムブル
ック（Sambrook）ら、前記、第1〜4章で説明されている。
本発明に係るベクターは、特に好ましくは、例えば酵母用ベクター、または高
等生物の細胞に適したベクター（例えばプラスミドベクター、ウイルスベクター
、植物ベクター）などの真核生物ベクターである。このようなベクターは、分子
生物学の分野における当業者に公知であるので、本明細書ではこれ以上詳細に明
示しない。これに関しては、特にサムブルック（Sambrook）ら、前記、第16章が
参考文献となる。
配列番号：2に示されたポリペプチドに加えて、本発明はまた、その変異タン
パク質、変異体、および断片に関する。これらは、配列番号：2に示されている
アミノ酸配列とは、個々のアミノ酸、またはアミノ酸の短い断片が置換、欠失、
および/または挿入されていることによって異なる配列として理解される。
「変異体」という用語には、ファンコーニポリペプチドIIの天然の対立遺伝子
変異体またはスプライス変異体、ならびに組換えDNA技術によって（特に、化学
的に合成されたオリゴヌクレオチドを用いるインビトロ突然変異誘発によって）
作出されたタンパク質で、生物学的および/もしくは免疫学的活性に関して配列
番号：2に示されたタンパク質と本質的に一致するタンパク質が含まれる。また
この用語には、化学的に修飾されたポリペプチドも含まれる。これらには、それ
らの末端および/または反応性アミノ酸側基が、アセチル化もしくはアミド化な
どのアシル化によって修飾されたポリペプチドが含まれる。
本発明はまた、配列番号：1に示された配列の少なくとも20ヌクレオチド長の
部分を含むベクターに関する。この部分は、好ましくは配列番号：1に示された
配列のタンパク質コード領域から得られた塩基配列、またはタンパク質の発現に
必須の領域から得られた塩基配列をもつ。これらの核酸は、治療用に用いること
のできる、好ましくは、最長50ヌクレオチドのアンチセンス核酸を製造するのに
特に適している。
本発明のさらなる主題は、本発明に係る核酸、または本発明に係るベクターに
よって形質転換された細胞である。この細胞は、真核細胞でも、原核細胞でもよ
い。核酸により細胞を形質転換する方法は、当技術分野で一般的な技術であるた
め、これ以上詳細に明示しない。好ましい細胞の例は真核細胞であり、特に動物
細胞、特に好ましくは哺乳動物細胞である。
本発明のさらなる主題は、本発明に係るポリペプチド、またはこのポリペプチ
ドの断片を、抗体を産生するための免疫原として使用することである。この場合
、完全長のポリペプチドまたはその断片で実験動物を免疫した後、それによって
できたポリクローナル抗血清を単離することにより、通常の方式で抗体を製造す
ることができる。モノクローナル抗体は、ケーラーとミルシュタイン（Koehler
and Milstein）の方法またはそれをさらに改善した方法に従った細胞融合によっ
て、実験動物の抗体産生細胞から既知の方式で得ることができる。また、ヒトの
モノクローナル抗体も、既知の方法によって製造することができる。
組換えファンコーニIIタンパク質またはペプチド断片、特にそのN末端またはC
末端ペプチドが、免疫原として好ましい。
このように、本発明のさらなる主題は、ファンコーニIIタンパク質またはその
変異体に対する抗体で、好ましくはFACタンパク質などの別のファンコーニ関連
タンパク質と交差反応を示さない抗体である。この抗体は、特に好ましくは全長
ポリペプチド、または、配列番号：2に示されているアミノ酸配列の1〜40位、59
〜120位、もしくは205〜223位のアミノ酸に相当するペプチド配列に対して作製
されたものである。
ファンコーニIIタンパク質、それをコードする核酸およびそれらに対する抗体
を調製することは、これらのタンパク質のエフェクターを特異的に検索するため
に必須な条件である。本発明に係るポリペプチドに対して、阻害的効果または活
性化効果をもつ物質は、このポリペプチドによって調節される細胞機能に選択的
に影響を及ぼすことができる。その結果、それらを用いて、例えば血球減少症や
腫瘍などの関連する臨床像を治療することができる。このため本発明の主題には
、ファンコーニIIタンパク質のエフェクターを同定するための方法で、このタン
パク質を発現している細胞を、例えば低分子物質などエフェクターの可能性のあ
るさまざまな物質に接触させ、この細胞が例えば細胞活性化、細胞阻害、細胞増
殖、および/または細胞における遺伝的変化などの変化を起していないかを解析
する方法も含まれる。このようにして、ファンコーニIIタンパク質の結合標的を
同定することもできる。
ファンコーニIIタンパク質の欠損によって起こる臨床像の場合には、例えばウ
イルスベクターなどのベクターによって、適当な標的組織の中にファンコーニII
タンパク質をコードする核酸を移行させることを含む遺伝子治療を行うことが可
能である。他方、ファンコーニIIタンパク質の発現を制御できないために起こる
病状は、この発現をブロックする遺伝子治療によって治療することができる。
さらに提示された結果により、ファンコーニIIタンパク質の活性の変化に、原
因として、または間接的に関連する病気の標的診断の基礎も提供される。これら
の検査は、遺伝子レベルもしくは転写レベルなどの核酸レベルでの検出を行うた
めの特異的核酸プローブ、またはポリペプチドレベルでの検出を行うためのファ
ンコーニIIタンパク質に対する抗体を用いて行うことができる。
このように本発明は、有効成分として上記の核酸、ベクター、細胞、ポリペプ
チド、および抗体を含む薬学的組成物に関する。
本発明に係る薬学的組成物は、一般的な薬学的担体物質、補助物質、および/
または添加剤と、選択的には、有効成分をさらに含むこともできる。この薬学的
組成物は、特に細胞周期の異常、細胞活性化の異常、細胞周期の進行の異常、DN
A修復異常、血球減少、腫瘍形成、および/または腫瘍の進行に関連した病気を診
断、治療、または予防するために用いることができる。さらに、本発明に係る組
成物を用いて、このような病気に関する各個人の素因を診断すること、特に、血
球減少症および/または腫瘍病の危険性を診断することもできる。
さらに、本発明のさらなる主題は、患者または患者から得られた体液もしくは
組織のサンプルなどのサンプルを本発明に係る薬学的組成物に接触させ、本発明
に係る核酸の塩基配列および/または発現を定性的または定量的に測定する、上
記の病気を診断するための方法である。例えば、核酸のハイブリダイゼーション
用プローブを用いて、もしくは逆転写/PCR法によって核酸レベルで、または、細
胞化学もしくは組織化学的な方法を用い、抗体によってタンパク質レベルで、こ
れらの測定方法を行うことができる。この薬学的組成物は、特に好ましくは、血
球減少症、腫瘍、もしくはその他の増殖関連病の発症、または当該病態生理学的
変化に関する素因の有無を確認するためのマーカーとして用いられる。
最後に、本発明はまた、前記の病気の一つを治療または予防するための方法で
、病気に対して有効な用量の有効成分を含む、本発明に係る薬学的組成物を患者
に投与する方法に関する。治療目的に適した薬学的組成物の具体例は、例えば双
特異的抗体、および抗体毒素または抗体-酵素結合体である。治療目的のための
さらに好ましい薬学的組成物は、アンチセンス核酸、遺伝子治療用ベクター、ま
た
はその他の低分子量のアクチベーターもしくはインヒビターである。
本発明は、以下の実施例と配列表によって、さらに明らかになる。
配列番号：１は、大きい方のオープンリーディングフレームがヌクレオチド25
6位から924位にまで、小さい方のオープンリーディングフレームがヌクレオチド
430位から924位にまで及ぶ、ファンコーニ遺伝子IIをコードする遺伝情報を含む
塩基配列を示したものである。
配列番号：２は、大きい方のオープンリーディングフレームがアミノ酸1位か
ら223位にまで、小さい方のオープンリーディングフレームがアミノ酸59位から2
23位にまで及ぶ、配列番号：１に示した塩基配列のオープンリーディングフレー
ムのアミノ酸配列を示したものである。
実施例 実施例1： 細胞培養
二倍体の初期ヒト線維芽細胞H94-38およびH94-17は、胎児の肺組織から分離さ
れ、D.シンドラー（ビュルツブルグ大学（University of Wuerzburg））によっ
て提供された。H94-38細胞は、細胞周期の解析によって、ファンコーニ貧血の表
現型であると診断され、G2期が延長されるとともに、MMCを加えるとG2期停止の
増加が見られる。相補性試験によって、H94-38細胞は、ファンコーニ相補グルー
プのA、B、C、およびDには属さないが、おそらく相補グループEに属することが
分かる。H94-17対照細胞は、MMC感受性の上昇を示さない。
10％ウシ胎児血清（Hyclone、米国、ユタ州、ローガン）を添加した、イール
の塩類（Earle's salt）（BRL）米国メリーランド州ゲティスバーグ）を含むMEM
培地中、37℃、7％CO2および95％の湿度で細胞を培養した。RNAを調製するため
、血清を吸引除去（0.1％）させることにより、細胞を同調させ、48時間後に10
％ウシ胎児血清により刺激した。さらに30時間後、細胞は半集密状態になり、RN
A単離のために回収した。
BrdUを含む培地で30時間の培養期間の後、増殖アッセイ法で、細胞周期状態を
解析するために、これらの培養細胞の一部を採取した。キュビエ（Kubbies）に
より述べられているように（Radbruch，A．（編）フローサイトメトリーと細胞
選別
（Flow Cytometryand Cell Sorting）、スプリンガー・フェアラーク、ベルリン
-ハイデルベルク（Springer Verlag Berlin-Heidelberg）1992、pp 75〜85）、
高分解フローサイトメトリーBrdUヘキストクエンチ法により、細胞周期G0/G1、S
およびG2/M期における細胞数を測定した。実施例2： mRNA ディファレンシャルディスプレイ
mRNAディファレンシャルディスプレイには、ジェン・ハンター社（Gen Hunter
）（米国マサチューセッツ州ブルックリン）のRNAキットを用いた。使用説明書
にしたがい、トリピュア（Tripure）試薬（Boehringer，Mannheim，GmbH，GER）
を用いて、同調させた細胞培養液から全RNAを単離した。RNAは、使用時まで70％
エタノールで覆われたイソプロパノール沈殿RNAペレットとして-80℃で保存した
。1×DNAse I反応緩衝液中で1〜5μｇの全RNAにDNAse Ｉ（Boehringer Mannheim
，GmbH）を加え、37℃で30分間インキュベートした。
このRNAサンプルの260nmでの吸光度を測定して定量を行い、アガロースゲル上
で解析した。逆転写には、0.2μｇの全RNAを用いた。1×106個の線維芽細胞から
、全部で8μｇの全RNAを単離した。
RNAの逆転写は、1×逆転写緩衝液、20μＭの各dNTP、および２μＭの各一塩基
アンカープライマー、T11A、T11G、またはT11Cの中で、各場合につき、２０μｌ
の反応混合液を二本分行った。この溶液を65℃で5分間加熱し、37℃で10分間冷
却してから、100Uのモロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）逆転写酵素を加えた
。37℃で1時間インキュベートした後、この混合液を75℃で5分間加熱してから、
-20℃に保存した。
PCRは、逆転写混合液の10分の1量、２μＭのdNTP、0.2μＭの各T11Nプライマ
ー、0.2μＭのアービトラリー配列のプライマー、10μCiのα[35S]dATP、および
1UのTaq-DNAポリメラーゼ（Boehringer，Mannheim，GmbH）を含む反応溶液の中
で行った。PCRは、パーキンエルマー2400ジーン・アンプ（Perkin-Elmer 2400 G
ene Amp）を用い、94℃で30秒、40℃で2分、72℃で30秒を40サイクル、最後に72
℃で5分行った。ジェン・ハンター社（Gen Hunter）（HindIII制限酵素部位をも
つ13量体）、オペロン社（0peron）（米国、カリフォルニア州アラメダ）、およ
びジェノシ
ス社（Genosys）（米国テキサス州ザ・ウッドランズ）の、さまざまなアービト
ラリープライマー（いずれの場合も、GC含量60〜70％の10量体プライマー）を用
いた。
5〜6％変性ポリアクリルアミド配列決定用ゲル上で分離する前に、配列決定用
ゲル泳動バッファー中で、80℃で2分間、サンプルを変性させた。各サンプルに
つき、PCR実験を二回ずつ行い、同一のポリアクリルアミドゲル上でそれらを順
番に分離した。示差的に発現された遺伝子を解析するため、オートラジオグラフ
ィーにより、乾燥させたゲルを解析した。
示差的に発現された遺伝子に対応する再現性のあるバンドを、ゲルから切り出
した。100μｌの滅菌水中で15分間煮沸してゲル切片からcDNAを溶出させた。グ
リコーゲン存在下でのエタノール沈殿により、上清中のDNAを集めた。その後、2
0μMのdNTP濃度を用い、反応混合液が放射性同位元素を含まないという点を除い
て、上記と同様に、対応するプライマーとPCR条件とを用いて、DNAを再増幅させ
た。
このようにして得られたPCR増幅断片をアガロースゲル上で分離し、対応する
ゲル切片を0.45μｍのミリポア社のデュラポア（Durapore）膜チューブにて遠心
分離して溶出した。このサンプルは、ノザン解析のため、-20℃にて保存した。
このようにして、プライマーの106の異なる組み合わせから、そのうちの43本
が再増幅されたバンドである全部で60本のバンドが得られたが、これらは、FA細
胞と対照細胞において示差的に発現された遺伝子に対応する。この示差的な発現
は、再現性があった。実施例3： ノザン解析
サムブルック（Sambrook）ら（（1989）前記）による標準的な方法によって、
ノザンブロット解析を行った。核酸を、10×SSCを用いて、下方向に向けられた
毛細管移行によって、正に荷電したナイロン膜（Boehringer Mannheim GmbH）上
に移動させ、架橋した。
アービトラリー配列をもつ6量体プライマーを用い、ハイ-プライム（Hi-Prime
）標識キット（Boehringer，Mannheim，GmbH）によって標識して、PCRの再増幅
混合液から直接的に特異的プローブを標識した。G50セファデックス（G50 Sepha
de
x）スピンカラムにより、遊離のヌクレオチドを分離した。
このようにして作出されたプローブを、全RNAとハイブリダイズさせた。42℃
で16〜20時間ハイブリダイゼーションさせた後、フィルターを室温で15分間、1
×SSC、0.1％SDSで2回洗浄し、その後50℃で1時間、1×SSC、0.1％SDSで洗浄し
た。そして、この膜をオートラジオグラフィーで調べた。
ノザン解析により、約1020bpの長さのPCR断片に示差的な発現があることが示
された。
培養細胞および組織サンプルにおけるノザン解析により、対照線維芽細胞では
約1Kbの長さをもつ主要なバンドと、しばしば、おそらくスプライス変異体によ
るものと考えられるおよそ約700bpの長さを持つさらに別のバンドまたは一つだ
け生じるバンドが明らかとなった。これらのバンドは、試験したFA線維芽細胞で
は見られなかった。両変異体は、腫瘍細胞系HeLaにおいて強く発現していた。他
の腫瘍細胞系では発現は見られなかった（例えばRajiまたはK562）。胚線維芽細
胞においては、眼の色素外皮軟骨から、唯一、比較的大きいバンドが見つかった
。実施例4： 示差的に発現されたmRNA種に対応するDD-PCR断片の特徴分析
ノザンブロットで差があることが分かったPCR断片を、使用説明書に従い、TA
クローニングキット（INVITR0GEN）を用いて登録商標pCR2.1に連結してから、こ
の構築物によって、大腸菌株INVαF'を形質転換した。示差的な断片とベクター
とを含むプラスミドを有するクローンを、サムブルック（Sambrook）ら、（1989
，コールドスプリングハーバー研究所出版（Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess）、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）ニューヨーク州）
による標準的な方法によって培養し、このプラスミドを単離した。
見つけられた5'側領域の塩基配列を、新しい改良型RACE法（Frohmann，M．A.
，(1994)）によって増幅した。このために、20%PEG/DMSO(1:1，W/V)存在下で、
幅し、上記したところにしたがって、登録商標ベクターpCR2.1の中にライゲーシ
ョンし、配列を決定した。同一の塩基配列をもつ380塩基の重複領域と、RACE断
片
得られたことから、どちらの断片も同じmRNAに由来するという事実が証明された
。このようにして得られたファンコーニ遺伝子IIのcDNAを、上記のごとく、登録
商標ベクターpCR2.1にライゲーションして配列決定した。実施例３で説明したよ
うにしてノザンブロット解析を行い、全ファンコーニ遺伝子IImRNAの示差的な発
現を明らかにした。実施例5 発現構築物の調製と発現
ここでは、FA-II遺伝子の長い方の変異型の発現を実施例として説明する。し
かしながら、この方法は、FA-II遺伝子の短い方の型にも適用することができる
。
実施例4で説明した、配列番号：２の1位〜223位のアミノ酸配列をコードするF
A-II遺伝子を、標準的な方法（サムブルック（Sambrook）、フリッツ（Fritsch
）、マニアティス（Maniatis）、（分子クローニング：実験マニュアル（Molecu
lar Cloning．A Laboratory Manual）、第２版、コールドスプリングハーバー（
Cold Spring Harbor）,1989）によって真核細胞発現ベクターpCDNA3（インビト
ロジェン社（Invitrogen））に再クローニングした。この発現は、CMVのプロモ
ーター/エンハンサーおよびBGHポリAシグナルによって調節されていた。選抜用
遺伝子として、Neo遺伝子が（SV40発現カセットの調節下で）用いられている。
CHO細胞を用い、安定したFA-II発現細胞系を調製した。このために、20μｇの
リポフェクタミン（Gibco；750μｌのMEM-アルファ培地中）を、10μｇのDNA（7
50μｌのMEM-アルファ培地中）と混合して、室温で45分間インキュベートし、そ
の後、6mlのMEM-アルファ培地で希釈した。この混合液を、T75細胞培養瓶（Nunc
）のMEM-アルファ培地（Gibco）中の5×106個のCHO細胞に6時間加えた。インキ
ュベー
ションは、37℃で行った。その後、細胞をMEM-アルファ/10%FCS（ウシ胎児血清
）で洗浄して、新鮮な培地中で37℃にて48時間培養した。続いて、１mg/mlのネ
オマイシン（G418）（Boehringer，Mannheim）を加えて選択圧をかけた。生き残
った細胞を、FACS（Becton Dickinson）によって、新鮮な培地を含む96穴の培養
プレート（Nunc）中で単一細胞としてクローニングし、安定的にトランスフェク
トされたCHOクローンが確立されるまで、G418選択圧をかけてさらに培養した。
選抜用遺伝子としてDHFRを用いることにより、安定的にトランスフェクトされ
たCHO細胞系を得ることに加えてFA-II遺伝子の遺伝子増幅を行うことが可能とな
る。実施例6： 抗体産生
ここでは、実施例５で既に説明したように、FA-IIタンパク質の長い方を実例
に用いた、抗体の作製について説明する。この方法はまた、FA-IIタンパク質の
短い方の型にも適用される。
配列番号：２の1位〜223位のアミノ酸配列を有する組換えヒトFA-IIタンパク
質（CHO細胞の中で調製された）で、BALB/cマウスを腹腔内免疫した。フロイン
トの完全アジュバントの中で一次免疫を行い、追加免疫はすべて、フロイントの
不完全アジュバントの中で行った。用量は、50〜100μｇであった。追加免疫は
、血清価が1：50,000になるまで、約4週間の間隔で行った。
次に、ミエローマ細胞系P3XX63.Ag8.653により、免疫した動物の脾細胞を不死
化した。標準的な方法（J．Imunol．Methods 39(1980)，285〜308）により融合
を行った。ミエローマ細胞に対する脾細胞の融合割合は1：1であった。融合産物
を24穴の細胞培養皿（Nunc）の、RPMI/10% FCSに基づいたHA培地（Boehringer M
annheim）に播いた。融合してから2週間後、陽性の一次培養液を、96穴の細胞培
養プレート（Nunc）にてRPMI/10% FCS中で、FACS法（Becton Dickinson）により
個々の細胞をクローン化した。
モノクローナル抗体を得るために、このようにして得られたハイブリドーマ細
胞のクローンをインビボで展開した。このために、5×106個のハイブリドーマ細
胞を、プリスタン（Sigma Chemical Company）で予め処理したマウスの腹腔内に
接種した。10〜21日後、各マウスから、2〜3mlの腹水を取り出し、それから定法
によってモノクローナル抗体を単離した。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Fanconi Gene II
The present invention relates to pathophysiologically relevant genes related to Fanconi anemia (FA),
A polypeptide encoded thereby, an antibody against this polypeptide,
And the pharmaceutical uses of the nucleic acids, polypeptides, and antibodies.
FA is characterized by an increased risk of progressive pancytopenia, congenital malformations, and tumor disease
(Glanz and Fraser, J. Med. Genet. 19 (1982) 41
2-416; Auerbach and Allen, Cancer Genet. Cytogenet. 51 (1991) 1-12). This
The disease affects about 1 in 300,000 people.
Although the molecular basis of the disease is unknown, the effects of DNA crosslinking
Hypersensitivity is an excellent marker for FA genotype (Auerbach and Wolmann
, Nature 261 (1976) 494-496). Cells from FA patients are
Is a concentration of mitomycin C (MMC) or
When contacted with sibutane (DEB), multiple chromatid breaks and chromatid replacements occur.
(Sasaki and Tonomura, Cancer Res. 33 (1973), 1829-1836; and Aue
rbach, Exp. Hematol. 21 (1993), 731). FA lymphocytes and fibroblasts with MMC
Incubation together results in a delayed and complete arrest of the G2 phase,
Deficiency in the anagen phase becomes apparent (Kubbies et al., Am.
22; Hoehn et al., Fanconi anemia, clinical, cytogenetic, and experimental aspects
(Fanconi Anaemia, Clinical, Cytogenic and Experimental Aspects) (1989)
, Springer Verlag Berlin-Heidelberg; Seyschab et al., Blood 85 (1995), 2233-22.
37).
It is now known that the FA population has at least five different complementary groups.
(Duckworth-Rysiecki et al., Somatic Cell Mol. Genet. 11 (1985), 35; Stra
thdee et al., Nature 356 (1992), 763; Joenje et al., Blood 86 (1995), 2156-2160).
Genes for complementation groups A and C have recently been reported (Strathdee et al., Natur
e 356 (1992), 763; Lo Ten Fol et al., Nature Genet. 14 (1996), 320-323;
WO 93/22435; Pronk et al., Nature Genet. 11 (1995), 338-340)
And the type of molecular mechanism of action of the FA-C protein is still unknown (Gavish et al.).
, Am. J. Hum. Genet. 53 (1993), 685; Yamashita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 91 (1994), 6712; Youssoufian et al. Biol. Chem. 270 (1995), 9876-9882)
. Furthermore, the chromosomal location of the complementary group of FAD has been identified (W
hitney et al., Nature Genet. 11 (1995), 341-343).
It is an object of the present invention to provide a cascade of DNA regulation (eg, cell cycle abnormalities, DNA repair,
Is a novel gene involved in the formation / tumor progression) of the pathophysiology of Fanconi anemia.
Was to identify genes associated with the genetic phenotype.
The present invention relates to two novel polypeptides, designated Fanconi gene II.
The identification, cloning, and characterization of the encoding gene is described. This
The sequence of the gene is different from normal fibroblasts compared to FA fibroblasts.
The Charal Display Method (Liang and Pardee, Science 257)
(1992), 967-971). Fanconi Gene II is F
It is not expressed in A fibroblasts but is expressed in normal fibroblasts. Fanconi
Gene II, the polypeptide encoded thereby and the polypeptide
Antibodies against cell cycle, cell activation, cell cycle progression, DNA repair, cytopenia
Diseases that are directly or indirectly associated with abnormalities in tumor formation, tumor formation, and tumor progression
Suitable as a diagnostic, therapeutic, or prophylactic agent.
The subject of the present invention is
(A) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a protein coding portion thereof,
(B) a base sequence corresponding to the sequence of (a) within the range of gene code degeneracy, or
Or
(C) Under stringent conditions, the sequence of (a) and / or (b)
Nucleotide sequence to hybridize
A nucleic acid comprising:
Three cDNA sequences W44613 and W44 containing a part of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
574, g1664579 and 1966 are described in the EMBL EST data bank. These arrangements
The columns are not the subject of the present invention. All three of these sequences have a missing start codon.
The open reading frame is not shown due to the
The full-length base sequence and its functional protein coding region are also disclosed.
Not. Furthermore, these three sequences do not have a 5 'untranslated region,
, Including a deletion that results in a frameshift of the reading frame. Sou
However, no biological function is disclosed for the above three sequences.
The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 has a length of 223 amino acids and a length of 165 amino acids.
It has two open reading frames, corresponding to the repeptides. This
These polypeptides correspond to amino acids 1 to 22 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
It extends to position 3 or amino acids 59 to 223.
In SEQ ID NO: 1, nucleotide Y, ie, C or T is nucleotide 491
Position, and base S, ie, C or G, is present at nucleotide position 514.
The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and this sequence within the scope of the genetic code degeneracy
In addition to the corresponding base sequence, the invention hybridizes to one of the above sequences
It also relates to the base sequence. In the present invention, the term "hybridization"
Are described in Sambrook et al., (Molecular Cloning: Experimental Manual (Mole
Molecular Cloning.A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory
Same as the edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press) (1989), 1.101-1.104)
It is used for Stringent hybridization means that
Preferably at 55 ° C., particularly preferably at 62 ° C. and most preferably at 68 ° C., with 1 × SSC and
And 0.1% SDS for 1 hour, especially 55 ° C, preferably 55 ° C, particularly preferably 62 ° C
Positive even after washing for 1 hour with 0.2 × SSC and 0.1% SDS, most preferably at 68 ° C.
Preferably means that a hybridization signal of This
Under the washing conditions as described above, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1
The nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence corresponding to this sequence within the range of degeneracy is
And a base sequence according to the present invention.
The base sequence according to the present invention is preferably DNA. But RNA, or pepti
Nucleic acid analogs such as nucleic acids may be included. The nucleic acids according to the present invention are particularly preferred.
Alternatively, the protein coding portion of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the sequence
SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence of this sequence, preferably at least 20
Bases, and particularly preferably at least 50 bases in length and greater than 80%
Sequences with homology preferably greater than 90%, most preferably greater than 95%
Including
No.
Yet another subject of the invention is a polypeptide encoded by the nucleic acid described above.
Is. These polypeptides are preferably represented by (a) SEQ ID NO: 2
The amino acid sequence of amino acids 1 to 223, or (b) represented by SEQ ID NO: 2.
Has an amino acid sequence of amino acids 59 to 223, or (c) (a) or (
b) one of the amino acid sequences shown in b) is higher than 70%, preferably higher than 80%
It has a high, particularly preferably more than 90%, homology.
The nucleic acids according to the invention can preferably be obtained from mammals, in particular from humans.
These are probes for hybridization by known methods and / or
Is a known primer using a short fragment of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 as a primer.
Can be isolated by techniques. Further, the nucleic acid according to the present invention is, for example, 2'-O-
Modified nucleotide units, such as alkylated nucleotide units, can be passed through
Chemical synthesis that can be used selectively in place of ordinary nucleotide building blocks
Can also be prepared. Partially or fully modified nucleotide building blocks
The nucleic acid composed of a therapeutic such as an antisense nucleic acid or ribozyme
Can be used as medicine.
The present invention also relates to a peptide nucleic acid having a nucleotide sequence corresponding to the nucleic acid according to the present invention.
Also includes nucleic acid analogs.
A further subject of the invention is a vector comprising at least one copy of the nucleic acid according to the invention.
It is. This vector contains the desired source on which the DNA sequence according to the invention is present.
Either a eukaryotic or eukaryotic vector may be used, preferably the DN according to the present invention.
A sequence controls expression signals (promoter, operator, enhancer, etc.)
It is under your control. Examples of prokaryotic vectors include bacteriophage
There are chromosomal vectors such as
Plasmids are particularly preferred. For suitable prokaryotic vectors, e.g.
See Sambrook et al., Supra, Chapters 1-4.
The vector according to the present invention is particularly preferably, for example, a vector for yeast,
Vectors suitable for cells of the same organism (eg, plasmid vectors, viral vectors
, Plant vectors). Such a vector is a molecule
It is well known to those skilled in the field of biology and will not be described in further detail herein.
Not shown. In this regard, in particular, Sambrook et al., Supra, Chapter 16,
Will be a reference.
In addition to the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 2, the present invention also includes
It relates to proteins, variants, and fragments. These are shown in SEQ ID NO: 2
Amino acid sequence is defined as the substitution, deletion,
It is understood as a sequence that differs depending on and / or insertion.
The term "variant" includes the natural allele of Fanconi polypeptide II
Mutant or splice variant, as well as recombinant DNA technology (especially
By in vitro mutagenesis using chemically synthesized oligonucleotides)
Created protein, sequenced for biological and / or immunological activity
Proteins that essentially correspond to the protein shown in No. 2 are included. Also
The term also includes chemically modified polypeptides. These have it
Their terminal and / or reactive amino acid side groups are not acetylated or amidated
Polypeptides modified by any acylation are included.
The present invention also provides at least 20 nucleotides in length of the sequence shown in SEQ ID NO: 1.
A vector comprising the moiety. This part is preferably shown in SEQ ID NO: 1.
Base sequence obtained from the protein coding region of the sequence, or expression of protein
It has a nucleotide sequence obtained from an essential region. Use these nucleic acids for therapeutic purposes
To produce antisense nucleic acids, preferably up to 50 nucleotides in length.
Particularly suitable.
A further subject of the invention is the nucleic acid according to the invention or the vector according to the invention.
Thus, it is a transformed cell. This cell can be eukaryotic or prokaryotic
No. Transforming cells with nucleic acids is a common technique in the art.
Therefore, it will not be described in further detail. Examples of preferred cells are eukaryotic cells, especially animals
Cells, particularly preferably mammalian cells.
A further subject of the invention is a polypeptide according to the invention, or a polypeptide thereof.
To use the fragments of the antibody as immunogens to produce antibodies. in this case
Immunizing a laboratory animal with a full-length polypeptide or fragment thereof, thereby
Antibodies can be produced in the usual manner by isolating the resulting polyclonal antiserum.
Can be Monoclonal antibodies are available from Koehler and Milstein (Koehler).
and Milstein) or cell fusion according to a further improved method.
Thus, it can be obtained in a known manner from antibody-producing cells of a laboratory animal. Also, human
Monoclonal antibodies can also be produced by known methods.
Recombinant Fanconi II protein or peptide fragment, especially its N-terminus or C
Terminal peptides are preferred as immunogens.
Thus, a further subject of the present invention is a Fanconi II protein or a protein thereof.
Antibody to the variant, preferably related to another Fanconi such as FAC protein
An antibody that does not show cross-reactivity with proteins. This antibody is particularly preferably full length
Positions 1-40 of the polypeptide or amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 59
Prepared for peptide sequences corresponding to amino acids at positions ~ 120 or 205-223
It was done.
Fanconi II proteins, nucleic acids encoding them and antibodies thereto
To specifically search for effectors of these proteins
This is an essential condition. The polypeptide according to the present invention has an inhibitory effect or activity.
Substances with a sexualizing effect are selective for cellular functions regulated by this polypeptide
Can affect. As a result, using them, for example,
Relevant clinical features such as tumors can be treated. Therefore, the subject of the present invention
This method is used to identify the effectors of the Fanconi II protein.
Cells expressing protein may be used as potential effectors, e.g.
Contact with a variety of substances, such as cell activation, cell inhibition,
Analyzes for changes, such as genetic changes in cells and / or cells
The method of doing is also included. In this way, the binding target of Fanconi II protein
It can also be identified.
In the case of clinical features caused by a lack of Fanconi II protein, for example,
Depending on the vector, such as the ils vector, Fanconi II
Can perform gene therapy, including transferring nucleic acids encoding proteins
Noh. On the other hand, it occurs because the expression of Fanconi II protein cannot be controlled
The condition can be treated by gene therapy that blocks this expression.
In addition, the presented results show that changes in the activity of Fanconi II protein
Also provided is a basis for targeted diagnosis of disease as a cause or indirectly related disease. these
Tests are performed at the nucleic acid level, such as at the gene or transcription level.
Specific nucleic acid probes or polypeptides for detection at the polypeptide level.
It can be performed using an antibody against Nconi II protein.
As described above, the present invention provides, as an active ingredient, the above-described nucleic acid, vector, cell, or polypeptide.
And a pharmaceutical composition comprising the antibody.
Pharmaceutical compositions according to the present invention include common pharmaceutical carrier substances, auxiliary substances, and / or
Alternatively, it may further contain an additive and, optionally, an active ingredient. This pharmaceutical
The composition is particularly suitable for abnormal cell cycle, abnormal cell activation, abnormal cell cycle progression, DN
A Diagnose diseases associated with abnormal repair, cytopenia, tumor formation, and / or tumor progression
Can be used to prevent, treat, or prevent. Further, the pair according to the present invention
Diagnosis of an individual's predisposition to such a disease using an adult, especially blood
The risk of cytopenia and / or tumor disease can also be diagnosed.
Furthermore, a further subject of the invention is a patient or a bodily fluid obtained from a patient or
A sample such as a tissue sample is brought into contact with the pharmaceutical composition according to the present invention.
Qualitatively or quantitatively measuring the nucleotide sequence and / or expression of the nucleic acid according to
This is a method for diagnosing the above diseases. For example, nucleic acid hybridization
At the nucleic acid level using a probe or by reverse transcription / PCR, or
At the protein level, using antibodies, using cell or chemistry methods.
These measurement methods can be performed. The pharmaceutical composition is particularly preferably blood
Development of cytopenias, tumors, or other growth-related diseases, or the pathophysiological
Used as a marker to confirm the presence or absence of a predisposition to change.
Finally, the present invention also relates to a method for treating or preventing one of the aforementioned diseases.
A pharmaceutical composition according to the invention comprising a disease-effective dose of the active ingredient,
To a method of administering to a subject. Specific examples of pharmaceutical compositions suitable for therapeutic purposes include, for example,
Specific antibodies, and antibody toxins or antibody-enzyme conjugates. For therapeutic purposes
More preferred pharmaceutical compositions include antisense nucleic acids, gene therapy vectors, and the like.
Was
Is another low molecular weight activator or inhibitor.
The present invention will be further clarified by the following Examples and Sequence Listing.
SEQ ID NO: 1 has the larger open reading frame at nucleotide 25
From position 6 to position 924, the smaller open reading frame is a nucleotide
Contains genetic information encoding Fanconi gene II, ranging from positions 430 to 924
This shows the base sequence.
SEQ ID NO: 2 shows whether the larger open reading frame is amino acid position 1.
223 to the small open reading frame from amino acid 59 to 2
An open reading frame of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 extending to position 23
1 shows the amino acid sequence of the gene.
Example Example 1: Cell culture
Diploid early human fibroblasts H94-38 and H94-17 were isolated from fetal lung tissue
By D. Schindler (University of Wuerzburg)
Provided. H94-38 cells were analyzed by cell cycle analysis to determine the level of Fanconi anemia.
G2 phase is prolonged, and when MMC is added, G2 phase arrest is diagnosed.
There is an increase. By complementation testing, H94-38 cells were transformed into Fanconi complementation glue.
Do not belong to groups A, B, C, and D, but possibly belong to complementation group E
I understand. H94-17 control cells do not show increased MMC sensitivity.
Eel supplemented with 10% fetal calf serum (Hyclone, Logan, Utah, USA)
Containing Earle's salt (BRL) in Gettysburg, MD, USA
37 ° C, 7% CO in mediumTwoAnd the cells were cultured at 95% humidity. To prepare RNA
The cells were synchronized by aspirating the serum (0.1%) and the cells were
Stimulated with% fetal calf serum. After another 30 hours, the cells are semiconfluent and RN
Collected for A isolation.
After a 30-hour incubation period in medium containing BrdU, the cell cycle status is determined by a proliferation assay.
Some of these cultured cells were collected for analysis. In Cubies
As described by Radbruch, A. (eds.) Flow cytometry and cells
Sorting
(Flow Cytometry and Cell Sorting), Springer Verlag, Berlin
-Heidelberg (Springer Verlag Berlin-Heidelberg) 1992, pp 75-85),
Cell cycle G0 / G1, S by high resolution flow cytometry BrdU Hoechst quench
And the number of cells in the G2 / M phase was measured.Example 2: mRNA Differential display
mRNA differential displays include Gen Hunter
) (Brooklyn, MA, USA) was used. Instructions for use
Tripure reagent (Boehringer, Mannheim, GmbH, GER)
Was used to isolate total RNA from synchronized cell cultures. RNA is 70% until use
Stored at -80 ° C as isopropanol precipitated RNA pellets covered with ethanol
. 1-5 μg of total RNA was added to DNAse I (Boehringer Mannheim) in 1 × DNAse I reaction buffer.
, GmbH) and incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
Quantification is performed by measuring the absorbance of this RNA sample at 260 nm and running on an agarose gel.
Was analyzed. For reverse transcription, 0.2 μg of total RNA was used. 1 × 106Individual fibroblasts
A total of 8 μg of total RNA was isolated.
Reverse transcription of RNA was performed using 1 × reverse transcription buffer, 20 μM of each dNTP, and 2 μM of each single base.
Anchor primer, T11A, T11G or T1120 μl in each case in C
Was used for two reaction mixtures. Heat the solution at 65 ° C for 5 minutes and cool at 37 ° C for 10 minutes
And then added 100U of Moloney murine leukemia virus (MMLV) reverse transcriptase.
. After incubating at 37 ° C for 1 hour, heat the mixture at 75 ° C for 5 minutes,
Stored at -20 ° C.
PCR was performed using 1/10 volume of the reverse transcription mixture, 2 μM dNTP, 0.2 μM T11N primer
-, 0.2 μM arbitrary sequence primer, 10 μCi α [35S] dATP, and
In a reaction solution containing 1 U of Taq-DNA polymerase (Boehringer, Mannheim, GmbH)
I went in. PCR was performed on a Perkin-Elmer 2400 G
ene Amp) for 40 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 40 ° C for 2 minutes, 72 ° C for 30 seconds, and finally 72
C. for 5 minutes. Gen Hunter (HindIII restriction site
Operon (0peron) (Alameda, CA, USA) and
And Genos
A variety of arbiters from Genosys (The Woodlands, Texas, USA)
Rally primers (in each case, 10-mer primers with 60-70% GC content)
Was.
Before separating on a 5-6% denaturing polyacrylamide sequencing gel,
Samples were denatured in gel running buffer at 80 ° C. for 2 minutes. For each sample
And perform the PCR experiments twice, and order them on the same polyacrylamide gel.
Separated. Autoradiograph to analyze differentially expressed genes
The gel thus dried was analyzed.
Reproducible bands corresponding to differentially expressed genes are excised from the gel
did. The cDNA was eluted from the gel slice by boiling in 100 μl of sterile water for 15 minutes. G
DNA in the supernatant was collected by ethanol precipitation in the presence of lycogen. Then 2
Use a 0 μM dNTP concentration, except that the reaction mixture is free of radioisotopes
As above, the DNA was re-amplified using the corresponding primers and PCR conditions.
Was.
The PCR amplified fragment thus obtained is separated on an agarose gel and the corresponding
The gel section is centrifuged in a 0.45 μm Millipore Durapore membrane tube.
Separated and eluted. This sample was stored at −20 ° C. for Northern analysis.
In this way, from 106 different combinations of primers, 43 of them
A total of 60 bands were obtained, which were re-amplified bands.
Corresponds to genes differentially expressed in vesicles and control cells. This differential expression
Was reproducible.Example 3: Northern analysis
According to the standard method by Sambrook et al. ((1989) supra),
Northern blot analysis was performed. Nucleic acids were directed down using 10 × SSC
On a positively charged nylon membrane (Boehringer Mannheim GmbH) by capillary transfer
And crosslinked.
Using a hexamer primer with an arbitrary sequence, high-prime (Hi-Prime
) Labeling with labeling kit (Boehringer, Mannheim, GmbH) and re-amplification of PCR
Specific probes were labeled directly from the mixture. G50 Sephadex
de
x) Free nucleotides were separated by spin column.
The probe thus produced was hybridized with total RNA. 42 ℃
For 16-20 hours, then filter at room temperature for 15 minutes
Wash twice with × SSC, 0.1% SDS, and then with 1 × SSC, 0.1% SDS at 50 ° C. for 1 hour.
Was. The film was examined by autoradiography.
Northern analysis shows differential expression of a PCR fragment approximately 1020 bp in length.
Was done.
Northern analysis of cultured cell and tissue samples showed that control fibroblasts
A major band about 1 Kb in length, often due to splice variants
Yet another band or one with a length of about 700bp which is considered to be
The band that caused the burn was evident. These bands were observed in the tested FA fibroblasts.
Was not seen. Both mutants were strongly expressed in the tumor cell line HeLa. other
No expression was found in any of the tumor cell lines (eg Raji or K562). Embryo fibroblast
In the vesicle, the only relatively large band was found in the pigmented cartilage of the eye
.Example 4: Characterization of DD-PCR fragments corresponding to differentially expressed mRNA species
PCR fragments that were found to be different by Northern blot were
After ligating to the registered trademark pCR2.1 using the cloning kit (INVITR0GEN),
E. coli strain INVαF ′ was transformed with this construct. Differential fragments and vectors
Clones containing a plasmid containing
, Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess), Cold Spring Harbor (New York)
And the plasmid was isolated by standard methods according to
The nucleotide sequence of the 5′-side region found was identified by a new and improved RACE method (Frohmann, M.A.
, (1994)). For this purpose, in the presence of 20% PEG / DMSO (1: 1, W / V)
Ligated into the registered vector pCR2.1 as described above.
And sequenced. 380 base overlap region with the same base sequence and RACE cleavage
Piece
The results proved that both fragments were derived from the same mRNA.
. The cDNA of Fanconi gene II thus obtained was registered as described above.
Ligation into the trademark vector pCR2.1 and sequencing. As described in the third embodiment.
Northern blot analysis was performed to confirm the differential expression of all Fanconi gene II mRNA.
Revealed the reality.Example 5 Preparation and expression of expression constructs
Here, the expression of the longer mutant of the FA-II gene will be described as an example. I
However, this method can also be applied to the shorter form of the FA-II gene
.
F encoding the amino acid sequence at positions 1 to 223 of SEQ ID NO: 2 described in Example 4.
The A-II gene was prepared using standard methods (Sambrook, Fritsch).
), Maniatis, (Molecular Cloning: Experimental Manual (Molecu
lar Cloning. A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor (
Cold Spring Harbor), 1989), the eukaryotic cell expression vector pCDNA3 (in vitro
Was re-cloned into Invitrogen. This expression is based on the CMV promoter.
Protein / enhancer and BGH polyA signal. For selection
As gene, the Neo gene has been used (under the control of the SV40 expression cassette).
A stable FA-II expressing cell line was prepared using CHO cells. For this, 20 μg
Lipofectamine (Gibco; 750 μl in MEM-alpha medium) was supplemented with 10 μg of DNA (7
50 μl of MEM-alpha medium) and incubate at room temperature for 45 minutes.
After that, the mixture was diluted with 6 ml of MEM-alpha medium. This mixture was added to a T75 cell culture bottle (Nunc
5) in MEM-alpha medium (Gibco)6CHO cells were added for 6 hours. ink
Quebet
Was performed at 37 ° C. The cells were then transferred to MEM-alpha / 10% FCS (fetal bovine serum).
) And cultured in fresh medium at 37 ° C. for 48 hours. Subsequently, 1 mg / ml
Omycin (G418) (Boehringer, Mannheim) was added and a selective pressure was applied. Survive
Cultured cells in 96 wells containing fresh medium by FACS (Becton Dickinson)
Cloned as a single cell in a plate (Nunc) and stably transfect
The cells were further cultured under G418 selection pressure until the isolated CHO clones were established.
By using DHFR as a selection gene, stable transfection is achieved.
CHO cell line and gene amplification of FA-II gene
You.Example 6: Antibody production
Here, as described in Example 5, the longer version of the FA-II protein is used as an example.
The production of the antibody used in Example 1 will be described. This method also provides for FA-II protein
Also applies to the shorter type.
Recombinant human FA-II protein having the amino acid sequence of positions 1 to 223 of SEQ ID NO: 2
BALB / c mice were immunized intraperitoneally with quality (prepared in CHO cells). Freund
Primary immunizations are performed in complete adjuvant, and all boosts are performed in Freund's
Performed in incomplete adjuvant. The dose was 50-100 μg. Booster
Approximately four weeks until the serum titer reached 1: 50,000.
Next, the myeloma cell line P3XX63.Ag8.653 immortalizes the spleen cells of the immunized animal.
It has become. Fusion by standard method (J. Imunol. Methods 39 (1980), 285-308)
Was done. The fusion ratio of spleen cells to myeloma cells was 1: 1. Fusion product
In a 24-well cell culture dish (Nunc) in RPMI / 10% FCS-based HA medium (Boehringer M
annheim). Two weeks after the fusion, the positive primary culture was transferred to a 96-well cell culture medium.
FACS method (Becton Dickinson) in RPMI / 10% FCS on nutrient plate (Nunc)
Individual cells were cloned.
To obtain monoclonal antibodies, the hybridoma cells thus obtained
Vesicular clones were developed in vivo. For this, 5 × 106Hybridoma fine
Vesicles were injected intraperitoneally into mice previously treated with pristane (Sigma Chemical Company).
Inoculated. After 10-21 days, remove 2-3 ml of ascites from each mouse and then routinely
Isolates the monoclonal antibody.
【手続補正書】
【提出日】平成１１年１０月７日（１９９９．１０．７）
【補正内容】
請求の範囲
1．EMBLのESTデータバンクで明示されている、寄託番号W44613、W44574、および
g1664579の塩基配列とは異なる、下記の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）を含む核
酸：
（ａ）配列番号：1に示した塩基配列、もしくはそのタンパク質コード部分、
（ｂ）遺伝子コードの縮重の範囲内にある、（ａ）の配列に相当する塩基配列
、または
（ｃ）ストリンジェントな条件下で、（ａ）および/もしくは（ｂ）の配列と
ハイブリダイズする塩基配列。2 ．「EMBLのESTデータバンクで明示されている、寄託番号W44613、W44574、およ びg1664579の塩基配列とは異なる」という条件を考慮する必要のない請求項１記 載の核酸によってコードされているポリペプチド。 3 ．請求項2記載のポリペプチドに対する抗体。 4 ．細胞周期、細胞活性化、細胞周期の進行、DNA修復、血球減少、腫瘍形成、お よび/もしくは腫瘍の進行の異常に関連した病気、または該病気の素因を持つこ とに関連した病気を診断するための方法であって、患者または患者から採取され たサンプルを、下記(a)、(b)、(c)、(d)、および/若しくは(e)を有効成分として 含む薬学的組成物またはさらに一般的な薬学的担体物質、補助物質、および/も しくは添加剤を含む薬学的組成物と接触させ、「EMBLのESTデータバンクで明示 されている、寄託番号W44613、W44574、およびg1664579の塩基配列とは異なる という条件を考慮する必要のない請求項1記載の核酸の塩基配列および/または発 現を測定する方法。 （a）「EMBLのESTデータバンクで明示されている、寄託番号W44613、W44574、お よびg1664579の塩基配列とは異なる」という条件を考慮する必要のない請求項1 に記載の核酸 （b）(a)に記載の核酸若しくはその一部のコピーを少なくとも一つ含むベクター 、または適当な宿主細胞の中で核酸を発現させることができる該ベクター （c）(a)に記載の核酸または(b)に記載のベクターにより形質転換されている細 胞 （d）(a)に記載の核酸によってコードされているポリペプチド、該ポリペプチド において、(i)配列番号：２の1位〜223位に示したアミノ酸配列、(ii)配列番号 ：２に示したアミノ酸59立〜223位のアミノ酸配列、または(iii)(i)もしく（ii ）に係るアミノ酸配列の一つに70%よりも高い相同性を有するアミノ酸配列を有 するポリペプチド、またはこれらポリペプチドのアミノ酸配列を含む修飾された ポリペプチド （e）(a)に記載の核酸によってコードされているポリペプチド、もしくは該ポリ ペプチドにおいて、(i)配列番号：２の1位〜223位に示したアミノ酸配列、(ii) 配列番号：２に示したアミノ酸59位〜223位のアミノ酸配列、もしく(iii)(i)も しくは（ii）に係るアミノ酸配列の一つに70％よりも高い相同性を有するアミノ 酸配列を有するポリペプチドに対する抗体、または該抗体であって、全長ポリペ プチド若しくは配列番号：2の1〜40位、59〜120位、もしくは205〜223位のアミ ノ酸に対応するペプチド配列に対する抗体。 5 ．請求項2記載のタンパク質のエフェクターを同定するための方法であって、該 タンパク質を発現する細胞を、エフェクターの可能性があるさまざまな物質に接 触させ、該細胞の変化を解析する方法。 [Procedure amendment] [Date of submission] October 7, 1999 (1999.10.7) [Content of amendment] Claims 1. Nucleic acids differing from the base sequences of accession numbers W44613, W44574, and g1664579, as specified in the EMBL EST databank, comprising the following (a), (b), or (c): (a) SEQ ID NO: (B) a nucleotide sequence corresponding to the sequence (a) within the degeneracy of the genetic code, or (c) a stringent condition under stringent conditions. A nucleotide sequence that hybridizes to the sequence of a) and / or (b). 2 . Poly "is manifested in EST data bank of EMBL, accession number W44613, W44574, Oyo the nucleotide sequence of beauty g1664579 different" is encoded by a nucleic acid of unnecessary claim 1 Symbol placement consider the condition that peptide. 3 ． An antibody against the polypeptide according to claim 2. 4 ． Cell cycle, cell activation, cell cycle progression, DNA repair, cytopenias, tumorigenesis, diagnosing diseases Contact and / or associated with abnormal disease progression of a tumor, or a predisposition for the disease associated with the child A pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, the following (a), (b), (c), (d), and / or (e) : or more common pharmaceutical carrier substances, auxiliary substances, and / also properly is contacted with a pharmaceutical composition comprising an additive, are manifested in EST data bank "EMBL, accession number W44613, W44574, and g1664579 the nucleotide sequence is manifested in the method. (a) "EST databank EMBL measuring the nucleotide sequence and / or expression of nucleic acids need not claim 1 wherein consider the condition that different, accession No. W44613, W44574, different from the base sequence of you and g1664579 " The expression of the nucleic acid in a vector containing at least one copy of the nucleic acid according to claim 1 or a part thereof , or a suitable host cell, in which it is not necessary to consider the condition it polypeptide encoded by a nucleic acid according to cells that have been transformed (d) (a) with the vector according to the nucleic acid or (b) according to the vector (c) (a) capable, the In the polypeptide , (i) the amino acid sequence shown in positions 1 to 223 of SEQ ID NO: 2, (ii) the amino acid sequence of amino acids 59 to 223 shown in SEQ ID NO : 2, or (iii) (i) Moshiku polypeptides have a single amino acid sequence having high homology than 70% of the amino acid sequence according to (ii) or modified polypeptide comprising the amino acid sequences of these polypeptides, (e) (a) Polypep encoded by the nucleic acid according to 1) De, or in the polypeptide, (i) SEQ ID NO: 2 at position 1 to 223 of amino acid sequence shown in, (ii) SEQ ID NO: 2 amino acid positions 59 to 223 of the amino acid sequence shown in, Moshiku ( iii) (i) be properly is an antibody or the antibody, body to a polypeptide having an amino acid sequence having high homology than 70% in one of the amino acid sequence according to (ii), the full length polypeptide or sequence ID NO: 2 from 1 to 40 positions, from 59 to 120 positions, or 205 to 223 of the antibody against the peptide sequence corresponding to the amino acid. 5 ． A method for identifying effectors of a protein according to claim 2, a cell expressing the protein, to come in contact in a variety of substances of potential effectors, a method of analyzing changes in the cells.
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
// Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
21/08 21/08
Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
33/50 33/50 Ｚ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，
ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ
Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ
，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ
，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，
ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ
Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ
，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，
ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ
Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ
，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，
ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ
Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ
(72)発明者 プラニッツアー シモン
ドイツ国 ベルリン パシンガー ストラ
ッセ 54──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) G01N 33/53 G01N 33/53 D // C12P 21/02 C12P 21/02 C 21/08 21/08 G01N 33/15 G01N 33/15 Z 33/50 33/50 Z (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU , MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, L) S, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, Y, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, GM, GW, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR , KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Planitzer Simon Berlin Pasinger Strasse 54 Germany