JP2000508886A - 腫瘍または転移性状態への腫瘍進行についてスクリーニングする方法 - Google Patents

腫瘍または転移性状態への腫瘍進行についてスクリーニングする方法

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Abstract

(57)【要約】 腫瘍または転移状態への腫瘍進行についてスクリーニングする方法を開示する。このスクリーニング法は、DNAサンプルのフーリエ変換−赤外(FT-IR)分光によって得られたスペクトルデータの主成分分析(PCA)によるDNAの特徴付けに基づく。この方法は、広範なDNAサンプルおよびガン型に適用可能である。

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍または転移性状態への腫瘍進行についてスクリーニングする方法 技術分野 本発明は、概して、腫瘍または転移性状態への腫瘍の進行についてスクリーニ ングすることに関する。より詳細には、本発明は、DNAサンプルのフーリエ変換 −赤外分光によって得られるスペクトルデータの主成分分析に基づいてDNAを特 徴づけることに関する。 発明の背景 最近の25年以上にわたる莫大な財政上および人的資源の両方の出費にもかかわ らず、新たな腫瘍もしくは腫瘍へ進行するであろう前ガン性状態または前ガン状 態もしくは腫瘍の再発の検出は、人類の実現されない目標のままである。特に、 初期段階で検出された場合、多くのガンは処置可能であるが、信頼できるスクリ ーニング手順の欠如のために多くの患者において検出されされないで進行すると いう事実がいらだたしい。さらに、非転移性原発性腫瘍(または非ガン性疾患状 態)を転移性腫瘍と区別するか、または転移性状態への進行を予測する信頼でき るスクリーニング手順に対する必要性は、深刻である。腫瘍の転移は、ガン患者 における処置不成功の主な原因である。それは、原発性新生物からの細胞の脱離 、循環中への侵入、そして局所的で離れた組織部位での最終的な定着を含む複雑 なプロセスである。 しばしば、医師は、どうしても、用心のあまり間違い、そして、転移性状態へ 進行する傾向を有する腫瘍として疾患状態を同定することなく、患者のクオリテ ィー・オブ・ライフに劇的な影響を与える外科的または他の手順を患者が受ける ことを求める。例示の目的のために、２つの特定のガン(前立腺ガンおよび乳ガ ン)が、より詳細に記載され、そして新たなアプローチ(これは、本明細書中で開 示される発明が提供する)を必要とするガンの代表である。 前立腺ガンは、男性における主な死亡原因である。従って、この疾患の病因な らびに発ガンの早期にその発生を予測するための技術の開発における熱心な関心 が、存在する。前立腺ガン(その最も一般的な形態は、腺ガンである)の病因は、 ほとんど知られていない。しかし、いくつかの研究は、可能性のある因子として 腫瘍抑制遺伝子TP53の不活化および変化したDNAメチル化パターンに集中してい る。さらに、フリーラジカル(これは、ホルモンの酸化還元サイクルから発生す る)が、最近、前立腺ガンに関連づけられている。これは、水酸基ラジカル(・OH )(例えば、種々の研究で発ガン性に結びつけられてきた、8-ヒドロキシグアニン (8-OH-Gua)および8-ヒドロキシアデニン(8-OH-Ade))が、DNAに変異原性変化を生 じることを示す証拠と一致する。これらの知見にもかかわらず、DNAの・OH修飾 と前立腺ガンとの間の可能性のある関連性の理解は、実質的には存在しない。 前立腺組織は、良性の前立腺肥大(BPH)の領域を含み得る。それは、しばしば 、前立腺ガンを伴うが、悪性前病変として認められていない。BPHの病因は、知 られていなし、前立腺ガンとの関係も同じである。前立腺ガンの予測または診断 への現時のアプローチにおける困難さに起因して、当該分野で改善された方法に 対する必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たし、そして他の関連する 利点をさらに提供する。 乳ガンは、女性における主な死亡原因であり、そして女性における最も通常の 悪性腫瘍である。乳ガンを発症する発生率は上昇している。９人の女性のうち１ 人は、その疾患と診断される。乳ガンを処置するための標準的なアプローチは、 外科手術、放射線および化学療法に集中している。特定の悪性腫瘍において、こ れらのアプローチは成功し、そして治癒を達成している。しかし、診断が特定の 段階を過ぎる場合、乳ガンは最も頻繁に不治である。浸潤性腺管ガンが、転移し 得る乳ガンの通常の形態である。早期の検出への代替のアプローチが必要とされ る。乳ガンの予測または診断への現時のアプローチにおける困難性に起因して、 当該分野で改善された方法についての必要性が存在する。本発明は、この必要性 を満たし、そして他の関連する利点をさらに提供する。 発明の要旨 簡略に言えば、本発明は、腫瘍または転移性状態への腫瘍進行についてスクリ ーニングする方法および環境の遺伝子毒性を評価する方法を提供する。本発明は 、広範な種々のDNAサンプルおよびガンに、ならびに広範な種々の遺伝子毒性環 境に適用可能である。 一つの局面において、本発明は、以下の工程：(ａ)DNAサンプルをフーリエ変 換−赤外(FT-IR)分光に供し、FT-IRスペクトルデータを得る工程；(ｂ)主成分分 析(PCA)によって工程(ａ)のFT-IRスペクトルデータを分析する工程；および(ｃ) 工程(ｂ)のPCAを、非ガン性、非転移性腫瘍または転移性腫瘍サンプル由来のDNA サンプルについてのFT-IRスペクトルのPCAと比較する工程、を包含する、腫瘍ま たは転移性状態への腫瘍進行をスクリーニングする方法を提供する。 別の局面において、本発明は、以下の工程：(ａ)環境における第１の生物のDN Aサンプルをフーリエ変換−赤外(FT-IR)分光に供し、FT-IRスペクトルデータを 得る工程；(ｂ)主成分分析(PCA)によって工程(ａ)のFT-IRスペクトルデータを分 析する工程；および(ｃ)工程(ｂ)のPCAと、(１)工程(ａ)の環境中への導入前の 第１の生物、または(２)非汚染環境中の第２の生物のDNAサンプルについてのFT- IRスペクトルのPCAとを比較する工程、を包含する、環境の遺伝子毒性を評価す るための方法を提供する。 本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面への参 照によって明らかである。 図面の簡単な説明 図１は、正常(●)、良性前立腺肥大(「BPH」)(▲)、および前立腺ガン(■)の各 点の明瞭なクラスター形成を示す、PCA/FT-IRスペクトル分析によって得られる 二次元PCプロットを示す。特に、前立腺病変群は両方とも、正常前立腺のDNAの 点の右に見出される。異常値を丸で囲む。 図2A〜Cは、前立腺ガン対正常組織(図2A)、BPH対正常組織(図2B)、および前立 腺ガン対BPH(図2C)の平均スペクトルの比較を示す。各パネル(Ａ〜Ｃ)の下部の プロットは、不等分散ｔ検定に基づく、各波数での平均吸光度の差の統計学的有 意性を示す。Ｐ値を、log10スケールでプロットする。 図3A〜Cは、正常組織対前立腺ガン(図3A)、正常組織対BPH(図3B)、およびBPH 対前立腺ガン(図3C)として分類されるDNAの確率を示すＳ字状曲線を示す。曲線 は、下記の表２に示すロジスティック回帰モデルに基づく。予測される確率は、 狭い範囲で極めて迅速に上昇する。これは、群間の高度な識別、および正常から BPHへの進行および正常から前立腺ガンへの進行に関連するDNA構造における急激 な変化を反映する。各サンプルをその予想される確率でプロットする。 図４は、PC1、2、3の三次元プロットである。ここで各球は、DNA吸光度スペク トルを表し、そして球の位置は、スペクトルの「形状」(これは、吸光度ピークの 高さ、幅、および位置を含む)によって決定される。プロットの上部の胸部の非 侵襲性腺管ガン(「IDC」)球(内側に点)のコアクラスターは、より分散し、かつよ り大きいIDCmクラスター(球の内側に縦線)より有意に小さく、そして乳房縮小形 成組織(「RMT」)(球の内側に曲線)および転移性侵襲性腺管ガン(「IDCm」)クラスタ ーは実質的に重なり、そしてサイズにおいて統計的に差はない。 図5Aは、２つの空間的に密接するIDCスペクトル(図5Bの三次元のPCAプロット 上のＡおよびＢを示す矢印を参照)を示す。ここで、図5Bにおいて示される２つ の重ね書きされたスペクトルは、規格化吸光度が平均でわずか３％異なる。この ことは、PCAの高い特異性、および、空間的に密接する球がほとんど同一のスペ クトルプロフィールを有するという事実を示す。RMT、IDC、およびIDCm球を、上 記の図４に応じて標識する。 図6Aおよび6Bは、平均IDCコアクラスターのスペクトルプロフィールと比較し た２つのIDC異常値(図５で同定された)のスペクトルプロフィールを示す；「１」( 図6A)は、多病巣性ガンを示し(一つの病巣は、高度な悪性腫瘍印環細胞ガンであ る)、そして「２」(図6B)は、両側性乳ガンを示す。各症例において、平均スペク トルと異常値スペクトルとの劇的な差は、PC分析に関連する顕著な構造的特異性 を示すスペクトル領域のほとんどにわたって明らかである(波数−構造の関連に ついての本文を参照)。 図７は、PC2対PC1をプロットするグラフでRMT(白球)、IDC(球の内側に点)、お よびIDCm(球の内側に縦線)標本についてのスペクトルの重心計算を示し、そして RMT重心からIDC重心への方向ベクトルおよびIDC重心からIDCm重心への方向ベク トルを示す。 図８は、平均RMT、IDC、およびIDCm種についての重心スペクトルオーバーレイ を示す。 図９は、平均を引いた後の平均RMT、IDC、およびIDCm種についての重心スペク トルオーバーレイを示す。従って、これは、種間のスペクトル差を強調する。 図10は、FT-IR方法論に基づくガンの予想確率を示す。 図11は、最初の３つのPCスコアから得られる点のクラスターの三次元投射を示 す。これは、基本的に清潔なコントロール環境に住むイギリス人の一人(QMH群− PC2線の左に黒球)または化学的に汚染された都会の環境に住むイギリス人(DUW群 )からのDNAのスペクトルの特徴をまとめる。 図12A〜Cは、QMH群およびDUW群の各々についての平均スペクトルの比較を示す 。各パネルの下のプロットは、不等分散ｔ検定に基づく、各波数での平均吸光度 の差の統計学的有意性を示す。Ｐ値を、log10スケールでプロットする。 図13A〜Cは、QMH群およびDUW群の個々のスペクトルの重なりを示す。 発明の詳細な説明 上記のように、本発明は、ある局面において、腫瘍または転移状態への腫瘍進 行についてスクリーニングする方法に関する。この方法はDNAの分析に基づく。D NAはすべての生物において偏在しているので、本発明の方法は、特定のDNAサン プルの使用に限定されない。したがって、広範なガンがスクリーニングされ得る 。ガンの代表例には、乳ガン、泌尿生殖器ガン、メラノーマ、肝臓ガン、腎臓ガ ン、膵臓ガン、肺ガン、循環系ガン、神経系ガン、または結腸直腸ガンが含まれ る。泌尿生殖器ガンには、前立腺ガン、子宮頸部ガン、卵巣ガン、膀胱ガンまた は子宮内膜ガンが含まれる。神経系ガンには脳ガンが含まれる。 本明細書中で使用される場合、用語「〜についてスクリーニング」には、検出す ること、モニターすること、診断すること、または予知すること(予想すること) が含まれる。DNAは、本明細書に記載のとおりに分析され、腫瘍についてスクリ ーニングされる。本明細書中で使用される場合、「腫瘍」は、初めて存在してもよ いし、または再発でもよく、あるいは発生もしくは再発の過程であってもよい。 最後のシナリオ(すなわち、過程)は、臨床的発現の前に、ガンの危険の評価およ びガンの危険への洞察の機会を表わす。本発明は、たとえ、ガン細胞が、なお現 在利用可能な方法論に基づいて出現しなければならなくても、それが形成される 可能性を予測するために使用され得る。DNAはまた、本明細書に記載のとおりに 、分析され、転移状態への腫瘍進行についてスクリーニングされる。転移状態へ の腫瘍の進行とは、終点(すなわち、転移状態)および終点への途上の任意の中間 点をいう。 「DNAサンプル」は、任意の供給源中のDNAまたは任意の供給源に由来するDNAで ある。DNAは、種々の供給源(組織供給源または液体供給源を含む)から取り出さ れ得る。組織供給源には、器官または膜あるいは皮膚からの組織が含まれる。液 体供給源には、全血、血清、血漿、尿、滑液、唾液、喀痰、脳脊髄液、またはそ れらの画分が含まれる。組織サンプルに関して、例えば、組織は、生検(例えば 、注射針生検)により生物から取り出され得、そしてDNAが抽出され得、すべて当 業者に周知の技術による。同様なDNAが、公知の技術を使用して液体供給源から 抽出され得る。DNAの抽出/単離が好ましいが、DNAは、本発明を実施するために 、抽出/単離される必要はない。フーリエ変換−赤外(FT-IR)分光を使用してDNA を直接調べることが可能である。例えば、IRスキャンを細胞核に特異的に限定す ることによって、高濃度のスペクトルプロフィールを作成し得る。したがって、 DNAサンプルは抽出/単離されたDNAであってもよいし、またはサンプルはDNAを含 んでもよい。 DNAの後の分析のために組織を保存することが可能である。例えば、摘出され た組織は、液体窒素中で直ぐに凍結され、そして−80℃に維持され得る。このよ うな組織からのDNAの単離後、DNAは、通常、脱イオン水に溶解され、そしてFT-I R分光のために部分に分注される。代表的には、アリコートを、凍結乾燥により 完全に乾燥させ、純粋窒素でパージし、そして真空密封ガラスバイアルに保存す る。 本発明の範囲内では、DNAサンプルをFT-IR分光にかけ、そしてFT-IRスペクト ルデータを主成分分析により分析する。サンプル中のDNAの特徴付けの出発点は 、１セットのIRスペクトルである。各スペクトルは、それぞれの整数波数(すな わち、一般には、4000〜700cm-1、そして代表的には、2000〜700cm-1)における 数値 吸光度を示す。DNAサンプルの赤外(IR)スペクトルを、IR顕微鏡および広範囲水 銀-カドニウム-テルル化物検出器を備えたフーリエ変換-IR分光計(例えば、Perk in-Elmer System 2000(The Perkin-Elmer Corp.，Norwalk，CT))を用いて得る。 DNAを、一般に、相対湿度約60％未満の雰囲気下のフッ化バリウム上に置き、平 坦化して透明フィルムを作製する。IR顕微鏡を肉眼観察モードで使用して、サン プルの均一で透明な部分を選択して、伝導スペクトルを得る際の散乱またはウェ ッジ効果を避ける。一般に、各分析を、３〜５μgのDNAについて３連で実行し、 そしてスペクトルをコンピュータで平均する。一般に、４cm-1の分解能での256 スキャンを、各分析について実行し、4000〜700cm-1の周波数範囲でスペクトル を得る。代表的には、ガラスバイアルを破壊してからIRスペクトルを得るまで３ 〜５分が経過する。代表的には、DNA標本は、厚さが変化し、多様なセットの吸 光度またはスペクトル強度を生じる。どのIRスペクトルも、特異的な塩基対を示 す1703cm-1バンドを示さない。この事実は、サンプルが異常形態であるＤ形状を 獲得したことを示す。 IRスペクトルを伝導単位で得、そしてデータ処理のために吸光度単位に変換す る。例えば、分光計を制御しIRスペクトルを得るために、Infrared Data Manage rソフトウエアパッケージ(The Perkin-Elmer Corp.)を使用し得る。さらに、運 転後(postrun)のスペクトログラフデータ分析を実行するために、GRAMS/2000ソ フトウエアパッケージ(Galactic Industries Corp.，Salem，NH)を使用し得る。 各スペクトルを、4000〜700cm-1のすべての波数についての特異的吸光度を含む スプレッドシート形式に変換する。 IRデータを処理する際に、一般に、バックグランドの吸光度の影響を除去する ために、すべてのスペクトルについてベースライン調整を使用する。これをなす ために、(例えば、範囲2000〜700cm-1について)最低点を中心にした11波数にわ たる平均吸光度を、すべての周波数の吸光度から差し引く。さらに、一般に、IR データを規格化する。規格化に有用な周波数範囲2000〜700cm-1における十分に 確立した参照ピークが存在しないので、一般には、規格化は、すべての吸光度を 、目的の範囲での一定の平均強度に変換することによって達成される。例えば、 1750〜700cm-1の領域(1051波数のスパン)は、代表的には、分析の主要領域とし て、 本発明において選択される。なぜなら、それが広範囲に変化する吸光度を含むか らである。上記のベースラインの除去後、スペクトル中のすべての波数における 吸光度を、そのスペクトルについての1750〜700cm-1の範囲の平均吸光度で割り 、すべてのスペクトルについて平均スペクトル強度1.0を得る。一般に、すべて のさらなる分析を、これらのベースラインとされた規格化スペクトル(しかし、 平均が除去されていない分析もまた可能である)について実行される。 本発明では、スペクトル間の変動およびこの変動のサブグループ(例えば、ガ ン対非ガン)に対する関係を研究するために、因子分析が使用される。特に、FT- IR分光により獲得されたスペクトルデータを、主成分分析(PCA)統計学的アプロ ーチを使用して分析する。PCAは、互いに独立し、そして元の長い変数リストに おけるほとんどの情報を捕捉する数個の変数(主成分スコアまたはPC)を明らかに する目的で単一セットの変数に適用される統計学的手順である(例えば、Timm，N ．H．Multivalent Analysis，Timm，N.H.編，1975，Brooks/Cole，Monterey，CA ，528〜570頁)。PCAは、スペクトルを通じて変化する主要な特徴をまとめる数個 のPCを生じる。例えば、５個の主成分(すなわち、５次元)は、FT-IRスペクトル の1051次元(すべてのスペクトルの総平均が各スペクトルから差し引いかれた)を 記述するに十分であり得、そして２または３次元の視覚的図表で足りる。PCAは 、多くの基本的なおよび進歩した統計学的プログラム(例えば、SASおよびS-Plus )において利用可能である。 全体分析は、一般に、３群(非ガンサンプル、非転移性腫瘍サンプル、および 転移性腫瘍サンプル由来のDNA)のそれぞれからのコアクラスターを用いて実施さ れるが、３群すべてを使用しない可能性がある(例えば、３群のうちの２群、ま たは非ガンサンプル対すべての腫瘍サンプル(転移性か否かにかかわらず))。ク ラスター分析を使用して、コア群において他のものとは離れて位置する特定の群 のメンバーを同定する。この隔離された群のメンバーはすべて、平均規格化吸光 度における少なくとも12％の差を表すユークリッド距離で、その群中で他のもの から離れて位置する。この差は、スペクトルを従来の方法でプロットした場合、 肉眼で気づく差である。コアクラスターは、より通常に遭遇するDNAの構造的表 現型であると考えられ得る。一方、隔離された群のメンバーは、サンプルを用い て研究するに十分な数で存在しないが、含まれる場合には分析に過剰に影響する 、頻繁でない表現型を表す。 非ガン(NC)が非転移性腫瘍(NMT)へ進行するためのDNA構造変化が非転移性腫瘍 (NMT)が、転移性腫瘍(MT)へ進行するための変化と同一であるかどうかの決定を 、点の群から統計学的に導出される重心に基づいて試験する。この重心は、1750 から700cm-1までの1051の個々の波数の平均吸光度のベクトルである。２つの進 行が同様である場合、３群の重心は、二次元空間および三次元空間にならぶ。 公式では、cos(θ)＝1.0という仮説を検定する。ここで、θは、NCの重心から NMTの重心までを示すベクトルｘと、NMTの重心からMTの重心までを示すベクトル ｙとの間の角度である。cos(θ)は、cos(θ)＝xy/(|x|・|y|)によって規定される 。ベクトルｘは波数に連動し、そして各波数でNMTスペクトルの平均規格化吸光 度とNCスペクトルの平均規格化吸光度との間の差を含む。ベクトルｙは、MTスペ クトル−NMTスペクトルについての対応する差を示す。角度θ＝０[これはcos(θ )＝1.0と等価である]は、MTが、NC→NMT進行の「実質的に一直線に進む」持続であ ること、および重心が直線にならぶことを示す。一方、θ≠０は、NMT→MT進行 が、異なる組(suite)のスペクトル(構造)変化を含むことを示す。cos(θ)＝1.0 という仮説を、ブートストラップ法(EfronおよびGong，Am.Stat．37:36-48，198 3)を使用して検定した。ブートストラップ法は、NC、NMT、およびMTコアクラス ターからの置換を伴う再サンプリングおよび各再サンプリングについてのcos(θ )の計算を包含する。 NCおよびNMTコアクラスターが引き出される集団が、異なる重心(すなわち、異 なる平均吸光度スペクトル)を有するかどうかを決定するために、NC重心とNMT重 心との間の距離について、NCサンプルおよびNMTサンプルの間で標識をランダム に並べ換え、そして重心間の距離を再計算して順列検定を実行する。同様な順列 検定を、NMT重心とMT重心との間の距離について実行する。最後に、３つのコア クラスターのサイズを、各スペクトルからそのクラスター重心までの距離につい てKruskal-Wallis AN0VA検定およびMann-Whitney(MW)検定を使用して比較する。 (Kruskal-Wallis検定およびMW検定のＰ値は、サンプル値がそれらのサンプル平 均と比較される場合に導入されるいくらかの統計学的依存性のために、概算であ る。) 主成分分析により分析したDNAの赤外スペクトルの波数−吸光度関係(すなわち 、FT-IRスペクトルデータのPCA)を、空間中の点として表現し得る。各点は、DNA 構造の高度に識別可能な尺度を表わす。これらのPCスコアを２次元プロットおよ び３次元プロット中にプロットし得る。プロット中のスペクトルの位置は、その スペクトルが、いかにそのプロット中の他のスペクトルと異なるかまたは同様で あるかを記述する。異なる群のスペクトルについての異なるプロットシンボルま たはクラスターは、スペクトルのクラスター化を強調するのを助ける。さらに、 ２群のスペクトルを分析する場合、ロジスティック回帰を使用して、それらのPC スコアに基づいてスペクトルを分類するためのモデルを開発し得る。ロジスティ ック回帰は、分類のために通常使用される方法であり、多くの統計学的ソフトウ エアパッケージ(例えば、SASおよびS-Plus)において入手可能である。PCスコア は予測変数(predictor)であり、その結果は標本を分類するために使用され得る 等式(モデル)である。各標本を、非ガン群に対してガン群(例えば)である数値確 率でタグする。この分析の結果を、予測等式を使用して、ガンの危険スコア(推 定確率のロジット(logit))がＸ軸上で、推定確率がＹ軸上であるＳ字状曲線とし てプロットし得る。新たな標本についての確率もまた計算し得る。カット点(例 えば、0.5以上の確率)を選択することによって、すべての標本を、ガンまたは非 ガン(例えば)として分類し得る。分類の感度および特異性もまた標準的な方法を 使用して計算し得る。 本発明は、FT-IRスペクトルデータのPCAによってDNAサンプルを分析し、そし て驚くべきことに非ガン(「正常」)DNAの非転移性腫瘍(「原発性腫瘍」)DNAへの進行 の方向は、原発性腫瘍の転移性腫瘍への進行の方向とは有意に異なることを示す 。目的のDNAサンプルについてのFT-IRスペクトルのPCAと、既知の非ガン、非転 移性腫瘍および転移性腫瘍サンプル由来のDNAサンプルについてのFT-IRスペクト ルのPCAとの比較によって、目的のサンプルが、これら３つの状態のうちの１つ であるか、または腫瘍状態の１つに向けて進行中であるかを決定し得る。 例えば、本発明は、前立腺ガンの予測または検出のための方法を提供する。本 発明は、フーリエ変換−赤外(FT-IR)分光の主成分分析(PCA)を用いる技術(PCA/F T-IR技術)を正常な前立腺、良性前立腺肥大(BPH)および腺ガンに由来するDNAに 適用する。以下に詳述するように、これらの組織のそれぞれに由来するDNAを表 わす点のクラスターを、主成分(PC)スコアの二次元プロットにおいて完全に分離 した。このことは、DNAにおける有意で特異的な構造的改変は、正常組織からBPH および正常組織から前立腺ガンの進行において生じること、およびこの改変がこ の２つの進行のそれぞれについて固有であることを示す。構造的変化は、主に、 核酸の振動、ホスホジエステルおよびデオキシリボース構造を表わす空間領域に 反映される。BPHまたは腺ガンに対する正常前立腺の分離および分類は、赤外ス ペクトルのロジスティック回帰モデルを使用して使用されている。同様に、DNA スペクトルのロジスティック回帰モデルを本明細書中で使用して、BPHと前立腺 ガンとの関係を評価する。 前立腺組織由来のDNAの本特徴付けにおいて、主成分分析(PCA)により分析され る赤外スペクトルの波数−吸光度関係を、空間中の点として表わす。各点は、DN Aの機能的な群の振動および回転運動を変化させ、したがってこの点の空間的向 きを変化させる、DNAの構造的改変の高度に識別可能な尺度を表わす。前立腺組 織へのPCA/FT-IR技術の適用は、正常な前立腺組織、BPHおよび腺ガン(前立腺ガ ン)由来のDNAを表す点のクラスターの実質的に完全な分離を提供する。BPHおよ び前立腺ガンへの正常な前立腺組織の進行は、明確に異なるDNAにおける構造的 変化を包含するようである。赤外スペクトルデータのロジスティック回帰に基づ くモデルを使用して、組織がBPHまたは腺ガンである確率を計算する。驚くべき ことに、このモデルは、正常対ガンおよび正常対BPHの分類に関しては100％の、 そしてBPH対ガンに関しては100％近い感度および特異性を有する。したがって、 本発明は、PCA／FT-IR技術が、危険予測および臨床適用についての適用可能性を 有する、正常な前立腺組織、BPHおよび前立腺ガンを識別するに強力な手段であ ることを示す。 本発明の最もポピュラーな使用は、ガンに関して個々の生物の健康を評価する ことであり得るようであるが、他の使用も存在することは種々の分野の当業者に 明らかである。例えば、本発明は、環境災害(environmental hazard)の分析を可 能にする。未知の遺伝子毒性の環境への曝露後の生物のDNAを(本明細書に記載の とおりに)分析し、そしてそのプロフィールを、その環境への導入前のその生物 のDNAから得られるプロフィールと比較すること(または、非汚染環境中の生物と 比較すること)によって、その環境の遺伝子毒性の評価を行い得る。好ましい実 施態様において、非汚染環境中の生物の種は、未知の遺伝子毒性の環境中の生物 の種と同一である。本明細書中で使用する場合、用語「非汚染環境」には、化学的 に汚染されていないかまたは特定の汚染物質が存在しないことを包含する。 限定のためではなく例示のために以下の実施例を提供する。 実施例 実施例１ 前立腺ガン Ａ．組織入手、DNA単離およびPCA/FT-IRスペクトル分析：摘出後、各組織を液 体窒素中で素早く冷凍した(flash frozen)。全ての組織を、使用に先立って−80 ℃に保ち、そして酸化を防ぐために抽出手順の間、純窒素雰囲気下でDNAを保持 した。DNAをこの組織から単離し、そしてFT-IR分光用にアリコート(約20μl)に 分割した。各DNAサンプルを、凍結乾燥により完全に乾燥し、純窒素でパージし 、そして真空密閉ガラスバイアル中に−80℃で貯蔵した。合計31の組織サンプル を使用した。事故死した個体から得た前立腺組織の５つのサンプルを、組織学的 に試験し、そして正常であることを確認した。これらはコントロールとして用い た。良性の前立腺肥大(BPH)の18のサンプルと、腺ガン(ガン)の８つのサンプル を試験サンプルとして用い、各サンプルは組織学的に同定された病変の部分を含 む。全てのサンプルを、Cooperative Human Tissue Network，Cleveland，OHか ら関連の病理データとともに得た。 I-series顕微鏡(The Perkin-Elmer Corp.，Norwalk，CT)を備えるPerkin-Elme r System 2000を用いてIRスペクトルを得た。PCA/FT-IRスペクトル分析に関して 、各スペクトルを、上記のように1750〜700cm-1の範囲にわたって規格化した。 これにより、平均が1.0である各波数に関する相対吸光度値を得た。ユークリッ ド距離を、全体のスペクトルに関してか、または準領域(sub-region)かどちらか の １対のスペクトル間の差を定義するために用いた。この基準距離測定を、考慮し た波数(例えば、全体のスペクトル領域1750〜700cm-1に関して1051)それぞれに おけるスペクトル間の吸光度の差の平方和の平方根として定義する。ユークリッ ド距離はまた、パーセントとしてより記述的な形式で表現され得る。このパーセ ントの分子は、領域に関する波数の数の平方根によって除されたユークリッド距 離である。任意の領域について、このパーセントに関してここで用いられる分母 は、1750〜700cm-1の間の平均規格化吸光度であり、これはどの場合においても1 .0である。 主成分(PC)分析(PCA)を、変数(各波数におけるスペクトル吸光度)のオリジナ ルの長いリストの情報のほとんどを取り込む数個の変数(成分)を同定するために 用いた。この変数の数の減少は、多くの個人のテストの点数(例えば、読解と算 術)が単一の学業成績に統合される、教育の試験方法に類似している。４つのPC スコア(例えば、４次元)は、規格化されたスペクトルの1051次元を記述するのに 十分であることが見出された。PCスコアは、各スペクトルから減算された全ての スペクトルの総平均を用いて計算された。ノンパラメトリックSpearman相関係数 は、患者の年齢およびGleasonスコアとのPCスコアの関連を評価するために用い られた。ノンパラメトリック分析は、いくつかの分布が歪んでいるか、または正 規分布「ベル型」ではないために使用され、この歪みはPearson相関係数から推定 される場合、統計学的有意性に偏りを導き得る。 ２つの症例(これは異常値であった)を、これらの分析から省略し、29の症例を 残した。省略されたBPHサンプルおよび省略されたガンサンプルは、含まれた症 例とは大きく異なるスペクトルを有していた。最も類似するスペクトルからのそ れらのユークリッド距離は、それぞれ52％および41％であった。他のスペクトル の全ては、それらの「最近傍の」スペクトルと、せいぜい21％異なり、スペクトル の大半は11％未満だけ異なっていた。２つの異常値スペクトルは、1650cm-1の付 近の領域に劇的に減少した吸光度を示し、核酸の振動を表していた。 Kruskal-Wallis検定およびMann-Whitney検定を、３群が類似の多様性を有する かどうかを決定するために用いた。多様性を、その群の重心までのスペクトルの 平均距離として定義した。順列検定を、３群が別々にクラスターを形成する(群 のスペクトル特性の内部類似性を表す)傾向があるかどうかを決定するために用 いた。自身の群(正常、BPHまたはガンのいずれか)内で、その最近傍のものまで の各スペクトルの距離を計算し、そして全てのスペクトルに関して、これらの最 近傍距離の平均を検定統計量とした。この検定を、群のメンバーとしての標識を 103回ランダムに並べ替えて、各回ごとに検定統計量を再計算することにより実 行した。群のランダムな再標識によって得られたものより小さな最近傍スペクト ルまでの測定距離は、クラスター形成の指標である。この検定のノンパラメトリ ックな順位をベースとするものを、順位として各距離を表現することにより実行 した。各スペクトルに関して、他のスペクトルまでの距離を順位付けし、そして 順列検定を、距離を順位に置き換えたこと以外は上記のように行った。この検定 統計量は平均順位である。再度、群のランダムな再標識によって得られた平均よ り小さな再近傍スペクトルへの測定平均順位は、クラスター形成の指標である。 距離を用いた検定および順位を用いた検定の両方を全体のスペクトル(1750〜700 cm-1)りおよびいくつかの準領域に関して実行した。 最終的に、ロジスティック回帰分析を、PCスコアがDNA群(正常対BPH、正常対 ガン、およびBPH対ガン)の間で識別するために用いられ得るかどうかを決定する ためのモデルとして用いた。ロジスティック回帰分析は危険スコアを与え、これ はPCスコアの線形結合であり、およびサンプルが、想定された２群のうちの１つ に存在する予想確率(例えば、BPHが正常と比較された場合のBPHが存在する可能 性)である。これらの予想確率は、選択された確率カット点とともに、サンプル を分類するために使用され得、そして感度および特異性、または正確に分類され たサンプルの割合の推定値を提供し得る。各分析に関して、カット点は感度およ び特異性を共に最大にするように選択された。 Ｂ．PCプロットにおけるクラスター形成：PCA/FT-IRスペクトル分析は、1051 の波数にわたってスペクトル変動の合計90％を説明する４つの成分(１症例当た り４つのPCスコア)を与えた。すなわち、29のスペクトルの特徴の大半は、４つ のPCスコア(標識されたPC1、PC2、PC3、PC4)で記述され得る。最初の２つのPCス コアは変動の76％を説明し、そして２次元表示(図１)に関して適切であった。図 １は、３群が明確にクラスター形成されたことを示す。この分析から省略された ２つの異常値もまたこのプロットに表示され、そして主要なクラスターの右に現 れる。 異常値の点から他の点までの実際の距離は、他の次元によって表される差のた めに、この２次元プロットに示されるものよりも大きい。群のクラスター形成の 順列検定(1750〜700cm-1)は、距離計測に基づいた場合、P＝0.1を与え、そして ノンパラメトリック順位技法を用いた場合、P＝0.01を与えた(表１)。順位法に よって得られたより大きな有意性は、それらの群のコアから１つまたは２つの症 例の相対的分離(順位計測以上に距離計測に影響する配置)に起因する(図１)。こ の技法を用いて、有意なクラスター形成が２つのスペクトル領域に関して得られ る：1174〜1000cm-1(ホスホジエステル-デオキシリボース構造のPO2 -およびC-O 基の強い伸張振動に当たる)および1499〜1310cm-1(弱いNH振動および核酸のCH面 内変形に当たる)。これらの領域に関する平均距離および平均順位のＰ値は、0.0 2〜＜0.001の範囲であった(表１)。得られた有意水準は、３群の観測されたクラ スター形成が偶然起こったという帰無仮説を強く棄却する。全体として、この発 見は、DNAがクラスター形成を生じるように変化し、そして結果的に正常な前立 腺、BPHおよび前立腺ガンDNAの間の識別を示す(図１；表１および２)。 詳細な比較は以下の対の群のスペクトル間でなされた：正常対ガン、正常対BP H、およびBPH対ガン。群間での平均規格化吸光度における差の統計学的有意性は 、不等分散ｔ検定を用いて、1750〜700cm-1間の各波数に関して評価された(図２ ；A〜C)。このプロットは２群のそれぞれに関する平均スペクトルの比較および ｔ検定からのＰ値を示す。P≦0.05を有する領域は、P＞0.05を有する領域より、 偶然に起因する可能性がさらに少ない群間(例えば、正常対ガン)の差を表す。群 間のスペクトル比較のそれぞれは、ホスホジエステル-デオキシリボース構造お よび核酸の振動に当たるスペクトル領域における統計学的有意差を示す。ホスホ ジエステル-デオキシリボース構造に関する吸光度に有意差を有するスペクトル 領域は類似している(約1050〜1000cm-1)；しかし、核酸に関連する吸光度は群間 で変化する。すなわち、正常−ガン比較に関して、有意差の領域は主に約1475〜 1400cm-1(C=O伸張およびNH屈曲振動)であるが、一方、正常−BPH比較に関しては 、それは約1600〜1500cm-1である。BPH−ガンに関する比較は約1500cm-1に集中 する。 正常−BPH比較およびBPH−ガン比較に関して、有意差は約1175〜1120cm-1の間に 見られ、この領域はPO2基の対称伸張振動を恐らく含む。これらのスペクトル領 域の全ての平均の差は、図２の群当たりの平均スペクトルのプロットから明らか である。構造的な改変は、PCプロット(図１)およびクラスター間の明確な識別( 表１)における、点の空間的な分布の中心である。 1同じ群の最近傍までの平均ユークリッド距離は、パーセントとして表した。2 同じ群の最近傍までの各スペクトルのユークリッド距離の平均順位。 Ｃ．クラスターの多様性：群の重心までの平均距離として表される３群の多様 性は、有意には異なっていなかった(p=0.8)。しかし、正常前立腺群は、BPH群( 平均距離＝14.5％)または前立腺ガン群(平均距離＝13.9％)よりわずかに多様で はなかった(平均距離＝11.7％)。初期の腫瘍に生じた増加した構造的多様性は、 おそらく悪性の細胞集団を潜在的に引き起こすDNA形態を選択することにおいて 重要な要因である。 Ｄ．群の分類：PCスコアは、ロジスティック回帰を用いて群の対を比較する場 合に、患者を数群に分類するために容易に用いられ得る。ロジスティック回帰モ デル(表２)は、PCスコアの値をこの式に代入した場合に、危険スコア「R」を与え る式である。Rは以下の標準統計式によって確率に変換される：確率＝exp(R)/[1 +exp(R)]。カット点が選択され、そして確率がこのカット点を上回った場合、こ の症例はBPHとして分類される。実際のカット点を以下に記す。表２に示される ように、正常対ガンおよび正常対BPHに関するモデルは、各群を100％および全体 として100％正確に分類する(各症例のＰ値は＜0.001であった)。0.1以上の予想 確率について「ガン」と指摘することに基づけば、ガン対BPHに関する正確な分類 率は、90％に近かった。(0.15〜0.41の確率カット点は、BPH対ガンの比較におい て同様の正確な分類率を達成する。)表２のモデルに基づいた予想確率を図３に 示す。個々の危険スコアは適切なPCモデル(表２)を基にし、そして上記のように 、予想確率は危険スコアの数学的関数である。全てのBPHおよびガンの症例は1.0 に極めて近い予想確率を有し、そして全ての正常症例は、BPHまたはガンを正常 症例に比較した場合、0.002以下の予想確率を有する。予想確率におけるこれら の顕著な識別は、図１に示すように、群の明確な分離を確認する。ガンをBPHと 比較する場合、予想されるガン確率は0.42〜1.00の範囲であり、そして予想され るBPH確率は0.00〜0.65の範囲であった。 分析から省略された２つの異常値は、この発見を支持する傾向にある。異常な BPHおよびガンの点はPCプロットの右にある(図１)。これは、正常からBPHおよび 正常からガンへの進行で見られる同じ方向であり、異常値DNAがより高い構造改 変を有することを示唆する。表２に示されるモデルが２つの異常値を分類するた めの用いられる場合、BPH異常値は、正常対BPHのモデルを用いて、1.0に近い予 想BPH確率で正確に分類される。ガン異常値もまた、1.0に近い予想BPH確率で正 常対ガンのモデルにおいて正確に分類される。BPH対ガンのモデルにおいて、BPH 異常値は０に近い予想ガン確率で正確に分類される；しかし、ガン異常値は０に 近いガン確率でBPHとして誤って分類される。 *症例の確率が特定の群に分けられるという帰無仮説に関するＰ値は、PCスコア に無関係である。 Ｅ．年齢とGleasonスコアとの関係：年齢は、これらの群間の顕著な識別の生 成に関する因子ではないようである。しかし、前立腺ガンの発生は、50歳を超え ると顕著に増加する。これらの３群の年齢の範囲は、正常について16〜73歳(n＝ ５)；BHD、58〜73(ｎ＝17)；およびガン、61〜76(ｎ＝７)であった。年齢と４つ のPCスコアの各々とのSpearman相関の間には、統計的有意性はなかった(Ｐ＜0.0 5)。全てにおいて、これら３群の各々において、ならびにこれらの群の全ての対 (例えば、正常とBPH組織との組み合せにおける各PCスコアに相関する年齢)にお いて、および29症例のプールされたセット全体において、各PCスコアに相関する 年齢からなる28の相関が考慮された。Spearman相関は、大きさが0.01〜0.59の範 囲(Ｐ＝0.09〜Ｐ＝1.0)であった。最も有意な相関は、正常とガンとを組み合わ せた群における年齢とPC4との間でｒ＝−0.51であった(Ｐ＝0.09)。PC4がロジ スティック回帰分析から除外され、そしてモデルがPC1〜PC3に基づく場合、表２ のＰ値に対応するＰ値は、上から下へ、Ｐ＜0.001、Ｐ＜0.001およびＰ＝0.005 であり、これは、これらの群間の非ランダムな識別を再度支持した。PC4に基づ くこれらの結果、および年齢と他のPCスコアとの間の弱いまたは有意でない相関 は、これらの群間を識別するためのスペクトルの使用可能性における、年齢のい かなる役割も支持しない。 腫瘍の状態を分類するための微視的に表される構成的変化を使用するGleason スコアは、PCスコアとほとんど関連性を有さなかった。しかし、ｎ＝７のガン症 例に基づけば、強い関連性以外を検出する制限された力が存在した。PCスコア１ 〜４とGleasonスコアとのSpearman相関は、−0.49〜＋0.26の範囲(Ｐ＝0.2〜0.8 )であった。 Ｆ．確率のロジスティック回帰モデル：前立腺についてのＳ字状曲線(図３)は 、正常状態およびガン状態と正常状態およびBPH状態との間で急激な移行を示す 。これらの移行は、中間的確率の症例の欠如により特徴づけられ、これは、図１ におけるこれらの群の明確な分離に対応する。従って、DNAの修飾におけるいく つかの点で、ガン確率の急速な増加を導く重要な構造変化が、明らかに起きる。 BPHは、前立腺ガンに病因学的に関連することは知られていない。しかし、BPH 対前立腺ガン曲線(図３Ｃ)が中間的確率を有するいくつかの場合を示すことは興 味深い。図１における症例の相対的配置はまた、BPHが前立腺ガンの直接の前兆 であるという議論のある見解に対するいくつかの洞察を提供する。この知見は、 正常群から始まり、BPH群がガン群を「超えて」位置するというこのコンセプトを 支持しない。この位置付けは、BPHからガンへの移行が、ガンと関連することが 示されているいくつかのスペクトル遷移の逆転を伴うこと、またはガンへの進行 における逆転を模倣するBPH DNAのさらなる変化が存在することを示唆する。あ るいは、修飾により、種々の非新生物病変(BPHを含む)を導くDNA構造をもたらし 得る。BPHは、前立腺ガンの直接の前兆であり得ないが、PCA/FT-IRスペクトル分 析は、BPH DNAの構造的状態に基づいて、前立腺ガンの発生を予期する有望な手 段を提供し得る。 正常対ガンの曲線および正常対BPHの曲線における移行状態の不在は、興味深 い。これは、０％と100％確率との間のDNA値を有する「移行」組織(図３、Ａ〜Ｃ) が本研究の部分でなかった事実のためのようである。 前立腺での証拠は、DNA構造が、微環境における因子(特に・OH)に応答して進行 的に変化することを示唆し、この因子は、議論上、細胞病変、前立腺腫瘍(腺ガ ン)およびBPHの発達に病因学的に関連するようである。これらの組織の遺伝的不 安定性または同様にガンの危険性の増加を未然に防ぐか治すための介入は、細胞 のレドックス状態および・OH濃度を制御することに焦点を当てるべきである。こ れらのアプローチは、H2O2から・OHへの鉄触媒転化の制御(Imlayら、Science 240 :640-642，1998)；ホルモンのレドックスサイクルによる・OH生成の調節(Hanおよ びLiehr、carcinogenesis 16:2571-2574，1995)および環境的生体異物(Bagchiら 、Toxicology 104:129-140，1995)；ならびに抗酸化剤／還元剤治療(Amesら,Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 90:7915-7922，1993;Bastら、Am．J．Med．91(Suppl ．3C):2S-13S，1991)を含み得る。 実施例２ 乳ガン Ａ．組織獲得、DNA単離、およびPCA/FT-IRスペクトル分析：組織を、Seattle 病院およびCooperative Human Tissue Network(Cleveland，OH)から得た。胸部 の侵襲性腺管ガンを有するがリンパ節の関与を有さない(IDC)12人の患者から計1 2の組織を得た。これらのうち、１つは多巣性(第２の病巣は、印環細胞ガンであ り、これは評価されなかった)であり、そして１つは、両側性の乳ガン(その一方 を評価した)。侵襲性腺管ガンを有し、転移性ガンに関して陽性の１以上のリン パ節を有する(IDCm)25人の患者から計25の組織を得た。記載された２つのIDCを 除いて、非転移性群および転移性群には、異常な組織学は起こらなかった。腫瘍 サイズは、病理学報告で記録したように、腫瘍の最大寸法を基準とした。ガンで ない乳組織(RMT)を、乳腺肥大手術(乳房縮小形成術)を経験した21人の患者から 得た。ルーティン的な病理学は、これらの組織にところどころの非新生物(例え ば、線維性嚢胞)病変以外の細胞変化を示さなかった。 摘出後、各組織を液体窒素中でフラッシュ凍結(flash frozen)し、そして−8 0℃で保存した。この組織からDNAを単離し、脱イオン水に溶解し、そしてFT-IR 分光用のアリコートとした(約20μg)。各DNAサンプルを、凍結乾燥により完全に 乾燥し、純粋な窒素でパージし、そして−80℃で、脱気され密封されたガラスバ イアル中に保存した。全てのサンプルを、FT-IR分析で分析した。 IRスペクトルを、１-シリーズ顕微鏡を備えるPerkin-Elmer System 2000(The Perkin-Elmer Corp.，Norwalk CT)を用いて得た。各スペクトルを、2000〜700cm-1 の各整数波数での吸収により特定した。1750から700cm-1までの間隔(これは、 スペクトルの中の主要な変化を全て含む)のみを、この分析に含ませた。ベース ライン調整および規格化を行った。１つのRMTを２つのセクションで表した。こ れらの２つの調整され規格化されたスペクトルの平均をこれらの分析において使 用した。乗法規格化因子を、1750〜700cm-1での吸光度に適用した。重水素交換 を用いても、吸湿性がDNAのスペクトル特性に寄与することの示唆は見出されな かった。 Ｂ．統計的分析：FT-IR分析を用いる全DNA構造の分析のために、主成分分析(P CA)を用いた。PCA方法論は、互いに独立であり、かつ変数のオリジナルの長いリ スト中の大部分の情報を捕捉するいくつかの変数(成分)を発見する目的で、１セ ットの変数に適用される統計的手順である。この方法論は、関係する変数の数を 著しく減少させ得る。PCは、全母集団に対する分散の最大量を占める第１のPC( 変数の一次結合)を見出すことにより総分散を分配する。次いで、PCA方法論は、 第１のPCに依存しない二次結合を見出し、それによってそれは分散の次に大きな 量を占める。この手順は、多くの独立するPCAが、総分散の重要な部分を説明す ることが見出されるまで続けられる。この文脈内で、PCAは、スペクトルの集合 にわたる吸光度−波数変化の主要な特徴を同定し、そしてその変化を簡潔に記述 するための方法であった。 PCAを用いると、スペクトルに対して「構築ブロック(building block)」として 作用するいくつかの成分を同定し得る。PCAの後、各スペクトルは、いくつかのP Cスコアにより表され得る。PCAを、個々のスペクトルから減じられる総平均スペ クトルを用いて行った。分析の前に、データセットの(平均値付近の)総変化の少 なくとも90％を説明するのに十分な成分を保つことを決定した。スペクトル間の 差のいくらかが年齢によるものであるかどうかを決定するために、年齢と各PCス コアとの間の相関を計算した。ガン群および非ガン群(IDCm，IDCおよびRMT)のス ペクトルの関係を視覚化するために、最初の３つのPCスコアに基づいてプロット を構築した。これらの２次元および３次元プロットは、任意の単一の標本データ セットの最も有意な成分のうちの２または３を同時に試験することを可能し、そ して、互いの各データセットの意義ある比較を可能にする。 Ｃ．スペクトルプロフィールの主成分分析：スペクトルプロフィールは、IDCm 群のかなりの多様性およびIDC群の同質性を明らかにした。図４は、PCAに基づく スペクトルの３次元表記を示す。このプロットにおける位置は、主にピークの高 さ、幅、および位置として表される吸収スペクトルにより決定される。このプロ ットの上部にはIDCのコアクラスターが存在する(黄色の丸で示される)。このプ ロットの左下部には２つのIDCがコアクラスターから十分に離れた異常値である 。特に、１)印環細胞ガンの第２の病巣を有するIDC、および２)両側性の乳ガン が存在する。このプロットから明らかなように、IDCmクラスター(マゼンタ)およ びRTMクラスター(青)は、コアIDCクラスターよりかなり大きく、これは、かなり のスペクトル多様性を示す。 クラスターのサイズは測定され得、そしてそのスペクトルの多様性は、クラス ターの重心からのメンバーまでの平均距離により表され得る。この距離は、クラ スターメンバーと、そのクラスターの平均スペクトル(その重心に位置する)との 間の、波数当たりの規格化された吸光度におけるおよその％差として表され得る 。％差として表される距離は、以下のように計算される：ａ)1750〜700cm-1の波 数にわたる規格化された吸光度における差の二乗平均を100％に合わせ、次いで これを、ｂ)1.0(大部分のスペクトルに対する近似平均規格化吸光度)で割る。ク ラスターサイズの比較のために、各群の重心から異常に離れた距離に位置する３ つのRMT、３つのIDCmおよび２つのIDCを、RTM、IDCmおよびIDCのコアクラスター を規定するために除いた。全ての異常値は、これらのクラスターの任意のメンバ ーとは少なくとも20％の差を有した。残りの症例の重心および距離に基づいて、 スペクトル多様性(重心からの平均距離)は、IDCm群について12.4％、IDC群につ いて7.3％、およびRMT群について9.2％であった。群間の多様性の差についての およそのＰ値は、異常値を除いた中心までの距離を比較するMann-Whitney検定に 基づいた：IDC対IDCmについてＰ＝0.003、RMT対IDCmについてＰ＝0.04、およびR MT対IDCについてＰ＝0.4。(これらのＰ値は、距離間の依存性が、共有重心の計 算により導入されるので近似値である。) 58サンプル(RMT、Ｎ＝21；IDCm、Ｎ＝25；IDC、Ｎ＝12)の初期PCAに基づいて 、４つの異常値を検出した。すなわち、FT-IRスペクトルが群の残りのものから 著しく離れ、かつ異常値のPCスコアを有した標本を検出した。PCAを繰り返して 、まずこれらの４つの異常値を除去した。次いで、PCスコアを、他と同様の方法 でこれらの異常値について計算した(54サンプルの総平均スペクトルを減じ、次 いで各々の残余のスペクトルをPC固有ベクトルに投影する)。54サンプルの吸光 度における変化の91％が最初の５つの成分により説明されることが見出された。 これは、スペクトル間の変化が高度に体系化されることを意味する。1750から70 0cm-1までの1051の波数は、1051次元の変化を潜在的に構成する。この変化の90 ％超が、わずか５次元により表され得る。 PCスコアと年齢との弱い相関のみが存在したが、いくつかの相関は、組合わさ れた全てのサンプルについて統計的に有意であった。年齢とPCスコアとの間の相 関は、以下の通りであった：成分および年齢についてｒ=0.21(Ｐ＝0.1)、成分２ についてｒ＝0.29(Ｐ＝0.003)、成分３についてｒ＝0.03(Ｐ＝0.8)、成分４につ いてｒ＝0.25(Ｐ＝0.06)、および成分５についてｒ＝0.30(Ｐ＝0.02)。これらの 相関の小ささは、年齢によるスペクトル構造への影響は非常に小さいことを示唆 する。さらに、統計的に有意な相関(PC-2およびPC-5)でさえ、人為的結果である ようである。なぜなら、ガン群および非ガン群それぞれにおけるPCスコアと年齢 との間の相関は、非常に弱く(大きさが0.18未満)、そして有意でない(最小Ｐ＝0 .4)からである。実質的に真の相関の検出を可能にするべく全ての群について年 齢の範囲が広い：全てのサンプルについて17〜89、ガン(IDCmおよびIDC)につい て26〜89、およびRMTについて17〜63。PCスコアと陽性のリンパ節の数または割 合との統計的に有意な相関もなかった。 図５Ａは、図５Ｂに示される３次元PCAプロット上にて近接して位置する２つ の「異常値」(図４における「Ａ」および「Ｂ」)の重ねたスペクトルを示す。実際のス ペクトルは、規格化された吸光度平均でわずか３％異なり、スペクトル表現型の 特徴付けにおいて高い精度を示唆する。前述の２つのIDC異常値はまた、スペク トルプロフィールがコアIDCクラスターとは異なる。図６Ａおよび６Ｂは、IDCコ アクラスターの平均規格化スペクトル上に重ね書きされたこれら２つのスペクト ルを示す。スペクトル領域の大部分にわたって差異が著しいが、特に以下の領域 において差異が著しい：1700〜1350cm-1、約1240cm-1でのピーク、および約1180 〜900cm-1。これらの領域は、一般的にその塩基のN-HおよびC-O振動、ホスホジ エステル基のPO2非対称伸縮振動、およびデオキシリボースのC-O振動を表す。 関連するデータセット(例えば、IDC標本)の重心が計算され得、ここで、その 重心は特定の種の標本に関連するスペクトルの加重平均とみなされることは、上 記された。このような活量は、分析された３つのタイプの標本のPC1およびおよ びPC2値について図７に示される。この図において、RMT標本の重心からIDC標本 の重心へのベクトルが、このグラフの左側に示され、そしてRMT状態からIDC状態 へのスペクトルプロフィールのシフトを表す。この方向は、初期の方向を継続し 、そしてIDC重心からIDCm重心へのベクトルとの比較のための参照を確立する。 ベクトル回転の程度(RMT-IDCベクトルと比較して)を表３に示す。 従って、IDC状態からIDCm状態へのDNAへの効果が、分析されたスペクトルにわ たって広がるだけでなく、比較的一貫性があることが理解され得る。さらに、こ の方向の変化の暗示は、DNAへの攻撃が続くにつれて、明確な、定量可能な、 そして予想可能なDNAスペクトルプロフィールの、１つの状態から別の状態への 動きがあるという主張に支持を与える。 図８および９は、標本の３つの種の間におけるスペクトルの区別を強調するた めに提供されている。図８において、それぞれの種についてのそれぞれの重心に 対するスペクトルが示される。これらの曲線から総平均を引算した後、図９にお いて最もよく示されるように、それぞれの種についての平均の偏差が、種の間で 特徴的な固有のスペクトルを容易に識別可能にする。 図１０においては、FT-IRで得られたデータセットを用いて、一般的にＳ字形 の曲線が確立される。非ガンからガンへの移行はシャープであり、このことは、 曲線上のサンプルの「位置」に依存して、ガンの発現は、究極的には比較的小さい 刺激により開始され得ることを示している。 Ｄ．組織獲得および長期間貯蔵のための別の手段：FT-IR分析のための種を得 るためおよび保存するための上記の方法に対する代替的手段としては、獲得およ び初期の調製の後に、種をパラフィンブロックに包埋することが望ましい場合が ある。標本の分析が望ましい場合、パラフィンに包埋された組織(PET)は、脱ワ ックスされ、そして通常の技術(例えば、フェノールおよび／またはクロロホル ム溶液の適用)を用いることにより、DNAが単離される。標本の純度を測定した後 、FT-IRによる分析のために、DNAは、水溶液中に配置され、真空下で乾燥され、 そしてフッ化バリウムウインドウに塗布される。 スペクトル分析のためのPET標本の使用は、DNA分析のために利用可能なサンプ ルの数を非常に増大させる。なぜならそれは、分析のための特殊なバイオプシー を待ち、そして得ることを必要とせず(標本は、最近においては、容易に貯蔵さ れ得そして取り出され得る)、そして同一組織標本の遡及的なフォローアップ研 究が迅速かつ経済的に行われることを可能にするからである。 実施例３ 肝臓ガン Ａ．材料および方法：比較的清浄な田舎の環境[Quartermaster Harbor、WA]お よび化学的に汚染された都会的な環境[Duwamish River、Seattle、WA]から、イ ングリッシュソウル(English sole)を得た。それらの肝臓を組織学的に試験し、 そしてガンがないことが分かった。しかしそれらは、汚染された環境由来の魚に 特徴的な様々な非腫瘍性の病変を含んでいた。 Duwamish Riverは、重工業地帯を通って、Puget Soundに流れ込む。沈殿物は 様々な発ガン物質および他の生体異物(例えば、多核芳香族炭化水素および塩素 化除草剤残留物)を含む。しかし、修復プログラムは、沈殿物汚染を減少させる ように進行中である。 ２つのソウルの群(DUW93、n=8；およびDUW95、n=10)を、Duwamish Riverから 得た。修復プログラムのために、DUW95サンプルは、DUW93サンプルよりも顕著に 少ないが、QMHサンプルよりは多い沈殿物汚染を反映することが予想される。Qua rtermaster Harbor、WAからの魚は、コントロールとしての役割をした(QMH、n=7 )。QMH、DUW95およびDUW93の魚の長さ±SDは、それぞれ、29.5±4.2cm、23.6±1 .6cm、および24.1±0.8cmであった。重量は、254.3±115.0g，125.6±16.2g、お よび125.0±22.5gであった。 肝臓組織からのDNAの単離およびFT-IRスペクトルのPCA分析を、上記のように 行った。それぞれのFT-IRスペクトルを、1750〜700cm-1の範囲にわたって規格化 した。PCAを使用して、オリジナルの、長いリストの変数(1750から700cm-1まで の1051の波数のそれぞれでのスペクトル吸収)のほとんどの情報を捕捉するいく つかの変数(成分)を同定した。PCスコアは、それぞれのスペクトルから引き算さ れた全てのスペクトルの総平均で計算された。従って、PCスコアは、総平均スペ クトルから異なるにつれて、スペクトルの(構造的な)特徴の変動を示す。Kruska l-Wallis(KW)検定およびMann-Whitney(MW)検定を使用して、PCスコアの群間の相 違の統計的な有意性を計算した。同じ手順を用いてスペクトル多様性の相違につ いて検定し、これは、群について、スペクトルから群重心までの平均距離として 規定された。不等分散ｔ検定を用いて群間の平均規格化吸収を比較した。ｔ検定 は、1750から700cm-1までの1051の波数のそれぞれにおいて行われた。長さおよ び質量に反映される魚の年齢は、強力に交絡する変数であり、そしてこの可能性 は、分析にアドレスされた。 Ｂ．結果：図１１は、汚染されていないことがわかっている場所から得た標本 (青い球−PC2ラインの左の暗い球)；汚染されていることがわかっている領域か ら得た標本(黄色い球−PC2ラインの左の明るい球)；および汚染沈殿物を除去す るための有意な清掃および／または環境運動の前の汚染されていることがわかっ ている同一の領域から得た標本(えび茶色の球−PC2ラインの右の中程度の濃さの 球)を用いた、最初の３つのPCスコアについてのPCAを示す。図の精査により理解 され得るように、胸組織において遭遇する分布に似た分布が、魚の肝臓のDNAに 存在する。 最初の３つのPCスコアに由来する点のクラスターは、QMHおよびDUW群からのDN Aのスペクトルの特徴を要約し、３次元投影図に示される(図11)。すべての群がP Cスコアの同一の平均値(従って、同様のスペクトル)を有するという仮説は、棄 却され(KW P値＜0.001)、そして任意の２群がPCスコアの同一の平均値を有する という仮説も棄却される(MW P値0.04〜＜0.001)。３群は、重なることなく別々 である(図11)。PC1およびPC2は、合わされて、スペクトル変動の94％の割合を占 め、従って遭遇するスペクトルの多様性を示すための良好な手段を提供する。PC 3は、表示目的のために使用される(図11)が、それは、スペクトル変動の３％を 説明するに過ぎない。 群間の相違は、多くの頻度で発生する。図12の各パネルの上部は、２群(QMH-D UW93；QMH-DUW95；およびDUW95-DUW93)のそれぞれについての平均スペクトルを 示す。パネルの底部は、１波数につき１つのＰ値で、各スペクトル比較について のＰ値を示す。比較は、1051の波数の78〜87％で、Ｐ＜0.05を得、従って、DUW9 3およびDUW95群からのDNAの構造が、互いに、そしてQMH群から顕著に異なること を実証している。従って、この発見は、実質的に、平均の、規格化されたスペク トルが群間で同じであるという帰無仮説を無効にする。スペクトル相違は、PO2 構造の非対称伸縮振動(≒1240cm-1)に関して顕著である。このスペクトル領域に おけるバンドは、QMH群に存在するが、DUW93およびDUW95群でのスペクトルでは 実質的に失われている。他の主要な相違は、核酸(≒1700〜1450cm-1)およびデオ キシリボース(≒1150cm〜950cm-1)に関する振動を示すスペクトル領域において 明らかである。 PCスコアを基にして、サンプルが100％正確に群に分類され得る(分離される) ことが自明である(図11、表４)。 図11は、QMH群と比較して、DUW93およびDUW95の群において、スペクトルの多 様性(点の広がりに注意)が実質的に大きいことを示す。群間で変動する多様性お よびそれらを分離するスペクトル相違はまた、図13において明らかである。図13 では、個々のスペクトルまたはそれぞれの群が重ね書きされている。QMHスペク トルの密接性(tightness)およびQMHからDuwamish River群へのスペクトル多様性 の増加は、およそ1700〜1450cm-1の領域で顕著であり、これは、核酸の強力なC- O伸縮およびNH2屈折振動を含む。また、DUW93群において、他の群と比較して、 核酸の弱いNH振動およびCH平面内変形に帰属される、1400cm-1領域での吸収およ びスペクトル多様性の明白な増加がある。およそ1150〜950cm-1の領域は、デオ キシリボースに関する強力な伸縮振動を含み、QMHからDUW95に、スペクトル多様 性が増加するが、DUW93群では、密接している(tighten)。スペクトル特性間の 相違は、表４に示される群間の区別およびおよび図11における増加するクラスタ ーの多様性と一致する。 多様性相違に関する形式的な検定(すべての群が群重心からの同じ平均距離を 有するという帰無仮説についてのKW検定)は、Ｐ＝0.002を得、群間の等しくない 多様性を強力に示唆している。重心までのこれらの平均距離は、多様性を測定す る尺度を提供する。より大きな平均距離は、群がより広がっていること(図11)； すなわち、スペクトルがより多様性であることを示す。DUW95群は、QMH群の平均 距離の４倍の平均距離を有し、４倍大きい多様性を示す(表５)。３つのうち２つ のペア(pairwise)の多様性の比較は有意である(p<0.05)；しかしながら、DUW95 およびDUW93の群間の比較は、有意ではない(MW P値=0.2)が、DUW93群(最も変更 された塩基構造を有するDNAを表す)は、DUW95群よりも多様性である。 Ｐ値についての帰無仮説：(1)３群はすべて、同じ平均多様性、KW P値＝0.0 02を有する；(2)平均QMH=平均DUW95、MW P値＝0.003；(3)平均QMH=平均DU W95、MW P値=0.2 群の多様性が変化することは、年齢の変数によるものではないようである。QM H群は、長さおよび質量において最も多様性であったが、最小のスペクトル多様 性を示す。QMH群は、DUW95およびDUW93群のそれよりも２〜５倍長い、長さSD、 および５〜７倍大きい、質量SDを示す。しかし、QMHスペクトルからそれらの重 心までの平均距離は、Duwarmish群のそれよりも２〜４倍小さい。年齢がスペク トル多様性の有意な因子であるならば、これらの結果は、非常に矛盾する。長さ および質量もまた、場所によりもたらされるスペクトルの相違における影響をほ とんど有さないようである(図11)。回帰分析において、長さおよび質量の組合せ は、PC1の変動の７％およびPC2の変動の40％を説明するだけである。スペクトル の多様性を説明する際に、PC1は、非常に、より重要な成分である。長さおよび 質量は、全体のスペクトル変動の約９％を説明するに過ぎないが、場所は、77％ を説明する。 QMH、DUW95およびDUW93の魚から単離されたDNA構造は、PCプロットが完全なク ラスターの分離を明らかにする(図11)ということにおいてそれぞれ独特である。 さらに、露出された群からのDNAは、実質的に、コントロール群のものよりも多 様性であり、そしてDUW93群は、DUW95群よりも多様性である(表５、図11)。これ らの区別は、有意に年齢関連ではないが、異なる環境因子によりDNA中に誘導さ れる構造的特徴から起こり易い。環境因子の中で、クラスター分離および多様性 の相違に寄与しやすいのは、沈殿物の毒性化学物質への露出のタイプ、程度およ び期間である。スペクトルの領域において３群間に発生する著しい相違は、核酸 およびホスホジエステル-デオキシリボース構造に帰属され(図12および13)、こ れらの構造の変化がクラスターの分離および群間の多様性の相違に実質的に寄与 したことを示唆している。 ２つのDuwamish River群を代表するクラスターの多様性には、参照群の密な(t ight)クラスターと比較して、統計的に有意な増加があった(図11、表５)。増加 した多様性は、それが悪性の細胞表現型を生じるDNA形態の選択のためのステー ジを設定するという点で、発ガンにおいて特に重要であり得る。露出された魚群 の高度の多様性は、同じ機能を果たし得る。 PCプロットのクラスター分離は、上記、前立腺ガン(実施例１)および乳ガン( 実施例２)の研究で記載された。例えば、前立腺において、正常組織からのDNAお よび腺ガン組織からのDNAの間で完全な区別が達成された。同様に、本実施例に おいてもクラスター間での完全な区別が得られ、これによりDNA構造が、DNAの新 しい形態を示す独特な特性を有することが実証された。Duwamish Riverの魚が 肝臓腫瘍になり易いことを考慮すると、DUW95およびDUW93群に見いだされたDNA の明確に異なる形態は、ガンの進行において、重要なステージを構築するようで ある。 本実施例は、環境化学物質に露出されたイングリッシュソウルのDNAへの損傷 が、DNAの新たな、多様な形態を導くことを示している。これらの新たな形態は 、発ガンにおいて中心的な役割を果たし得、そして究極的には、魚の集団におけ る肝臓ガンの発生に寄与し得る。さらに、この結果は、環境化学物質が、上記の 、乳ガンおよび前立腺ガンに見いだされるDNAの新たな形態を生成する役割を果 たすかどうかの問題を提起する。 本明細書中に記載されたすべての刊行物および特許出願は、本明細書中におい て、同じ範囲において、それぞれの個々の刊行物または特許出願が特別にそして 個々に参考として援用されるかのように、参考として援用される。 前述したことから、説明の目的のために、本発明の特定の実施態様が本明細書 中に記載されたが、様々な改変が、本発明の精神および範囲から離れることなく なされ得ることが明らかである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ６０／０３５，７５７ (32)優先日 平成９年１月６日(1997．1．6) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．腫瘍または転移状態への腫瘍進行についてスクリーニングする方法であって ： (ａ)DNAサンプルをフーリエ変換−赤外(FT-IR)分光にかけてFT-IRスペクトル データを得る工程； (ｂ)工程(ａ)のFT-IRスペクトルデータを主成分分析(PCA)により分析する工程 ；および (ｃ)工程(ｂ)のPCAを、非ガン、非転移性腫瘍または転移性腫瘍サンプル由来 のDNAサンプルについてのFT-IRスペクトルのPCAと比較する工程 を包含する、方法。 ２．前記腫瘍が、乳ガン、泌尿生殖器ガン、メラノーマ、肝臓ガン、腎臓ガン、 膵臓ガン、肺ガン、血液関連ガン、脳ガン、または結腸直腸ガンである、請求項 １に記載の方法。 ３．前記泌尿生殖器ガンが、前立腺ガン、卵巣ガン、または子宮内膜ガンである 、請求項２に記載の方法。 ４．前記泌尿生殖器ガンが前立腺ガンである、請求項２に記載の方法。 ５．前記腫瘍が乳ガンである、請求項２に記載の方法。 ６．環境の遺伝子毒性を評価する方法であって： (ａ)環境における第１の生物のDNAサンプルを、フーリエ変換−赤外(FT-IR)分 光にかけてFT-IRスペクトルデータを得る工程； (ｂ)工程(ａ)のFT-IRスペクトルデータを主成分分析(PCA)により分析する工程 ；および (ｃ)工程(ｂ)のPCAを、(１)工程(ａ)の環境への導入前の該第１の生物、また は(２)非汚染環境中の第２の生物のDNAサンプルについてのFT-IRスペクトルのPC Aと比較する工程 を包含する、方法。
JP09533717A 1996-03-18 1997-03-18 腫瘍または転移性状態への腫瘍進行についてスクリーニングする方法 Pending JP2000508886A (ja)

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