JP2000508882A

JP2000508882A - New staphylokinase derivatives

Info

Publication number: JP2000508882A
Application number: JP8520739A
Authority: JP
Inventors: コレン，デジレ・ジョゼ
Original assignee: KU Leuven Research and Development
Current assignee: KU Leuven Research and Development
Priority date: 1995-01-06
Filing date: 1996-01-03
Publication date: 2000-07-18
Anticipated expiration: 2016-01-03
Also published as: JP3399963B2

Abstract

(57)【要約】スタフィロキナーゼの生物活性を提供するコード配列の部分を少なくとも含むＤＮＡフラグメントをつくることにより発明の誘導体を製造する方法である。野生型アミノ酸の１以上のコドンを他のアミノ酸のコドンで置換するために、ＤＮＡフラグメントのインビトロ部位特異的変異形成を行い、適当なベクター中の変異ＤＮＡをクローニングし、該ベクターで適当な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし、ＤＮＡフラグメントを発現するのに適した条件で該細胞を培養する。望ましくは、ＤＮＡフラグメントはプラスミドｐＭＥＸ６０２ＳａｋＢの４５３ｂＰのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントであり、インビトロ部位特異的変異形成はプラスミドｐＭ／ｃおよび修復欠失Ｅ.ｃｏｌｉ株ＷＫ６ＭｕｔＳを用いてオリゴヌクレオチド特異的変異形成系により行われ、そして変異ＤＮＡフラグメントがＥ.ｃｏｌｉ株ＷＫ６で発現される。本発明はまた、動脈血栓症の処置のため発明のスタフィロキナーゼ誘導体の少なくとも一つを適当な賦形剤と共に含む医薬組成物に関する。 (57) [Summary] A method for producing a derivative of the invention by making a DNA fragment containing at least a portion of the coding sequence that provides for the biological activity of staphylokinase. In order to replace one or more codons of a wild-type amino acid with a codon of another amino acid, in vitro site-directed mutagenesis of a DNA fragment is carried out, and the mutated DNA in a suitable vector is cloned. Are transformed or transfected and the cells are cultured under conditions suitable for expressing the DNA fragment. Preferably, the DNA fragment is a 453 bp EcoRI-HindIII fragment of the plasmid pMEX602SakB, and the in vitro site-directed mutagenesis is performed by an oligonucleotide-directed mutagenesis system using the plasmid pM / c and the repair-deleted E. coli strain WK6MutS. And the mutated DNA fragment is expressed in E. coli strain WK6. The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising at least one staphylokinase derivative according to the invention together with a suitable excipient for the treatment of arterial thrombosis.

Description

【発明の詳細な説明】新規スタフィロキナーゼ誘導体本発明は、低下した免疫原性を有する新規スタフィロキナーゼ誘導体、その製造、動脈血栓症の処置での使用および動脈血栓症の処置のための医薬組成物の製剤に関する。より詳細には、心筋梗塞の処置のための医薬組成物の製剤に遺伝子工学スタフィロキナーゼ誘導体を使用することに関する。心循環系疾患の血栓合併症は死亡および機能障害の一つの主な原因であり、それ故、血栓症（すなわち、血栓の薬理学的不溶）は、心筋梗塞、脳血栓症および血管塞栓症などの生命を脅かす疾患の発症に大きい影響を与える。血栓溶解剤は、プラスミノーゲンすなわち血中における線維素溶解系の非活性の前酵素をタンパク質溶解性酵素プラスミンに変えるプラスミノーゲン・アクチベーターである。プラスミンは、血栓の線維素を溶解するが、止血系の正常因子を不活化して、いわゆる“溶解状態”を引き起こす可能性がある。しかし、生理的線維素溶解は、組織−型プラスミノーゲン・アクチベーター、線維素、プラスミン（プラスミノーゲン）およびα₂−アンチプラスミンの特殊分子間相互作用の結果としてフィブリンー配向である（１、２）。最近、６種の血栓溶解剤について、急性心筋梗塞の患者での臨床使用および臨床試験が認められている。それらは、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組換え組織型プラスミノーゲン・アクチベーター（ｒｔ−ＰＡ）またはその誘導体、アニソレイテドプラスミノーゲン・スタフィロキナーゼ・アクチベーター複合体（ＡＰＳＡＣ）、組換え単鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン・アクチベーター（ｒｓｃｕ−ＰＡ，組換えプロウロキナーゼ）および組換えスタフィロキナーゼ（Ｓａｋ）である（２、３）。急性心筋梗塞の患者において、梗塞の大きさの減少、心室機能の保持および死亡率の低下がストレプトキナーゼ、ｒｔ−ＰＡおよびＡＰＳＡＣによる処置の後にみられた（２）。治療に最近よく用いられている血栓溶解剤のひとつはスプレプトキナーゼであり、これはβ−溶血性連鎖球菌により分泌されるＭ_γ４５,０００のタンパク質である。しかし、その投与は広範な全身的フィブリノーゲン崩壊に関連し、そして、９０分以内で約５０％の冠状動脈再疎通からすると、進行性の急性心筋梗塞の患者における冠状血栓症に対する効果は限られている（２）。さらに、スプレプトキナーゼは、処置患者の約５％でアレルギー反応をもたらし、数カ月あるいは数年間その再使用ができないような特殊な抗体形成を一貫して起こす（４）。スタフィロキナーゼ、すなわちStaphylococcus aureusのある株から産生されるタンパク質は、４０年以上前に前線維素溶解性を有することが知られ（５−７）、急性心筋梗塞の患者において強力な血栓溶解剤になるとみられる（８）。スタフィロキナーゼ遺伝子は、バクテリオファージｓａｋφＣ（９）、ｓａｋ４２Ｄ（１０）および溶原性Staphylococcus aureusのゲノムＤＮＡ（ｓａｋＳＴＡＲ）（１１）からクローン化されている。これは、Escherichia coli中でλＰＲプロモーターおよびそれ自身の翻訳シグナルの調整の下に、およびBacillus sub tilisまたはEscherichia coli中で、その天然プロモーターおよび翻訳シグナルの調整の下にも、発現されて、それぞれ外質部分または培養培地に遺伝子産生物の蓄積をもたらす（１０−１３）。スタフィロキナーゼ遺伝子は、完全な長さの天然スタフィロキナーゼのＮＨ₂ −末残基に対応する２８アミノ酸を有する１６３アミノ酸のタンパク質をコードする（１０、１４、１５）。野生型変種ＳａｋＳＴＡＲのタンパク質配列（１５）は図１に示す。ｓａｋφＣ，ｓａｋ４２ＤおよびｓａｋＳＴＡＲ遺伝子のコード領域において４ヌクレオチドの相違のみが認められ、うち一つはサイレント突然変異であった（１０、１４、１５）。スタフィロキナーゼのいくつかの分子形は、わずかに相違するＭγ(１６,５００−１８,０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上）および等電点で精製されている（１１ −１３）。成熟スタフィロキナーゼの低Ｍγ誘導体は、６（Ｓａｋ−Δ６）又は１０（Ｓａｋ−Δ１０）ＮＨ₂−末アミノ酸を欠失して、得られた。緩衝培地におけるプラスミン（プラスミノーゲン）との相互作用に際して、成熟スタフィロキナーゼ（ＮＨ₂−末Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）は、迅速に、かつ定量的にＳａｋ −Δ１０（ＮＨ₂−末Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−）に転換する。成熟スタフィロキナーゼおよびＳａｋ−Δ１０は、同じ線維素溶解活性を有することが示された（１１、１２）。２６位のアミノ酸はスタフィロキナーゼによるプラスミノーゲンの活性にとって決定的に重要なようである。事実、２６位の特殊なＭｅｔをＡｒｇまたＶａｌで置換すると機能的活性は消失し、一方、ＬｅｕまたはＣｙｓでの置換は活性にほとんど、又は全く効果を及ぼさない（１６）。単一のアミノ酸の交換は突然変異体タンパク質の溶液構造の顕著な変化をもたらさないので、この相違する結果のメカニスムは謎である。血漿培地において、スタフィロキナーゼは関連フィブリノーゲンの減成なしにフィブリン血餅を溶解し得る（１７−１９）。このスタフィロキナーゼのフィブリン特異性は、フィブリンに結合するプラスミン・スタフィロキナーゼ複合体の α₂−アンチプラスミンによる低下した阻害の結果であり、α₂−アンチプラスミンによる阻害、およびα₂−アンチプラスミンによる循環プラスミノゲーン・スタフィロキナーゼのプラスミン・スタフィロキナーゼへの転換の阻止に続き、プラスミン・スタフィロキナーゼからプラスミン・スタフィロキナーゼが再循環している（２０−２２）。いくつかの実験動物モデルにおいて、スタフィロキナーゼは、全血または血漿の血餅の溶解についてストレプトキナーゼと同じ強さのようてあるが、血小板に富む、あるいは退縮した血栓の溶解については有意により強力である（２３、２４）。血栓症の動物モデルにおけるスタフィロキナーゼで得られた有望な結果が、急性心筋梗塞の患者についてのパイロット規模での検定の根拠になっている（３、２５）。急性心筋梗塞の患者５人に組換えスタフィロキナーゼ（ＳａｋＳＴＡＲ）１０ｍｇを３０分以上かけて静脈注射したところ、４人で脈管撮影により冠状動脈の再疎通が４０分以内に認められた。血漿フィブリノーゲンおよびα₂−アンチプラスミン値は影響されず（４０分で元の値の９０−９５％）、そしてアレルギー反応は観察されなかった（３）。次の組の５人の急性冠状閉塞患者においては、３０分以上かけてのスタフィロキナーゼ（ＳａｋＳＴＡＲ）１０ｍｇの静脈投与は、２０分以内にすべての患者で再疎通をもたらし、関連フィブリノーゲンの減成はなかった（２５）。２４時間のコントロール脈管撮影は再疎通が持続することを示した。スタフィロキナーゼ（ＳａｋＳＴＡＲ）の免疫原性をストレプトキナーゼと比較してイヌ（２３）およびヒヒ（２４）で試験した。凝集物において、これらの動物実験データはストレプトキナーゼに比してスタフィロキナーゼの免疫原性が低いことを示唆した。しかし、３０分以上かけてスタフィロキナーゼ１０ｍｇを静脈に注入された最初の５人おいて、スタフィロキナーゼ（ＳａｋＳＴＡＲ）に対する中和抗体の力価が出発時点および注入６日までは低くかったが、１４−３５日で抗体の高い力価（１２−４２ｇ／ｍｌ血漿のスタフィロキナーゼ中和力価）が継続的に認められた（３）。この結果は第２のパイロット試験において５人で完全に確認された（２５）。免疫原性に関して、ヒトでの最初の観察は動物実験における経験ほど期待を抱かせるものではなかった。このように、スプレプトキナーゼと同様に、スタフィロキナーゼの投与は単独使用に限定されよう。しかし、スタフィロキナーゼおよびスプレプトキナーゼに対して生じる抗体の交叉反応性がないこと（２６、２７）は、両物質の投与が相互に排他的でないであろうことを示唆する。ストレプトキナーゼ及びスタフィロキナーゼの内在免疫原性は、これらの無制限な使用を妨げる。以前から高い抗体力価を有する患者がこれらの血栓溶解効果に反応しないばかりでなく、アレルギー性の副作用および時には生命に危険を及ぼすアナフィラキシーが生じることがある。ストレプトキナーゼおよびスタフィロキナーゼは異型タンパク質であるので、その免疫原性がタンパク質工学により低減できるかは明白でない。事実、ストレプトキナーゼからの活性な低分子量フラグメントの生成に成功した例は、報告されていない。スタフィロキナーゼにおいて、ＮＨ₂−末の１７アミノ酸またはＣＯＯＨ−末の２アミノ酸の欠失は分子を不活性化し、加えるに、分子は部位特異の突然変異生成による不活性化に非常に敏感となる（２５、２９）。これにもかかわらず、驚くべきことに、野生型スタフィロキナーゼ変種ＳａｋＳＴＡＲ（８，１５）が分子の不活性化なしに３非重複の免疫優性エピトープを含み、うち少なくとも２つは特殊な部位特異的変異生成により消失され得る。これらの遺伝子工学スタフィロキナーゼ変種は、野生型スタフィロキナーゼよりも、野生型スタフィロキナーゼで処置された患者において誘発された抗体に活性が低く、かつ有意に免疫原性が低く、これはウサギおよびヒヒのモデル及び末梢動脈閉塞の患者において明らかにされた。本発明は、野生型スタフィロキナーゼに比して、低下した免疫原性を示すスタフィロキナーゼ誘導体に関する。この誘導体は、基本的には野生型スタフィロキナーゼまたはその修飾体のアミノ酸配列を有するが、誘導体の生物活性を破壊することなしに、少なくとも一つのエピトープが消失している。本発明の一つの実施態様において、誘導体は基本的に図１に示されるアミノ酸配列を有し、そのうち、１以上の下線クラスターにおいて１以上のアミノ酸が対応するエピトープを変える他のアミノ酸で置換されている。望ましくは、アミノ酸はアラニンで置換されている。エピトープを変えることにより、３エピトープのクラスターＩ、ＩＩおよびＩＩＩの１以上に対するモノクローナル抗体パネルとの誘導体の反応性が低下する。これは、野生型アミノ酸をアラニンで置換することによりスタフィロキナーゼの抗原性が低下することを示している。本発明は特に、図１において、下線クラスター８でのアミノ酸、７４位のＬｙｓ、７５位のＧｌｕ、および７７位のＡｒｇが対応するエピトープを変えるアラニンで置換されているアミノ酸配列を有するスタフィロキナーゼ誘導体Ｍ８、図１において、下線クラスター３でのアミノ酸、３５位のＬｙｓおよび３８位のＧｌｕが対応するエピトープを変えるアラニンで置換されているアミノ酸配列を有するスタフィロキナーゼ誘導体Ｍ３、図１において、下線クラスター９でのアミノ酸、８０位のＧｌｕおよび８２位のＡｓｐが対応するエピトープを変えるアラニンで置換されているアミノ酸配列を有するスタフィロキナーゼ誘導体Ｍ９、図１において、下線クラスター３および８でのアミノ酸、３５位のＬｙｓ、３８位のＧｌｕ、７４位のＬｙｓ、７５位のＧｌｕおよび７７位のＡｒｇが対応するエピトープを変えるアラニンで置換されているアミノ酸配列を有するスタフィロキナーゼ誘導体Ｍ３.８、および図１において、下線クラスター８および９でのアミノ酸、７４位のＬｙｓ、７５位のＧｌｕ、７７位のＡｒｇ、８０位のＧｌｕおよび８２位のＡｓｐが対応するエピトープを変えるアラニンで置換されているアミノ酸配列を有するスタフィロキナーゼ誘導体Ｍ８.９に関する。ここで、Ｍ３.８およびＭ８.９は、破壊された２エピトープを有する二重変異体である。本発明は、低下された免疫原性を有する遺伝子工学によるスタフィロキナーゼの変種がストレプトキナーゼまたは野生型スタフィロキナーゼに実際的に代わり得る血栓溶解剤となり得ることを示す。本発明はまた、スタフィロキナーゼの生物活性を提供するそのコード配列の部分を少なくとも含むＤＮＡフラグメントをつくることにより、発明の誘導体を製造する方法に関する。すなわち、野生型アミノ酸の１以上のコドンを他のアミノ酸のコドンで置換するために、ＤＮＡフラグメント上でインビトロ部位特異的変異形成を行い、適当なベクター中の変異ＤＮＡフラグメントをクローニングし、ベクターで適当な宿主細胞を形質転換すなわちトランスフェクトし、ＤＮＡフラグメントを発現するのに適した条件で宿主細胞を培養する。好ましくは、ＤＮＡフラグメントがプラスミドｐＭＥＸ６０２ＳＡＫの４５３ｂｐのＥｃｏＲＩ− ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントであり、プラスミドｐＭａ／ｃおよび修復欠失Ｅ．ｃｏｌｉ株ＷＫ６Ｍｕｔｓを用いてインビトロ部位特異的変異形成をオリゴヌクレオチド特異的変異形成系により行い、変異ＤＮＡフラグメントをＥ．ｃｏｌｉ株ＷＫ６内でクローンする。本発明はまた、動脈血栓症の治療のために、少なくとも1種の本発明スタフィロキナーゼ誘導体を適当な賦形剤と共に含む医薬組成物に関する。活性成分として低下した免疫原性のスタフィロキナーゼ変種を含有する医薬組成物は、ヒトおよび動物の動脈血栓症の処置の実際において粉末または溶液の形状を取り、静脈内および動脈内投与して用いられる。これらの組成物は、活性化合物と中性的な薬学的に許容される賦形剤（水性または非水性溶媒、安定剤、乳化剤、洗剤、添加剤など）とを、さらに、要すれば色素とも、結合させること（例えば、混合、溶解など）により製造される。治療的組成物の活性成分の濃度は、０.１−１００％と広く、疾患の性質および投与形態により異なる。また、投与されるべき活性成分の量は体重当たり０.０５−１.０ｍｇの範囲である。さらに、本発明は、動脈血栓症、特に心筋梗塞の処置にスタフィロキナーゼ誘導体を使用すること、および動脈血栓症、特に心筋梗塞の処置のための医薬組成物の製造にスタフィロキナーゼ誘導体を使用することに関する。上記および下記において“誘導体”、“変異体”および“変種”は相互に変換して用いられる。本発明は下記実施例により詳細に示すが、発明の範囲を限定するものではない。本発明を基にして、いくつもの変形および改良は当業者にとって明らかであろう。併合変異体３.８および併合変異体８.９から出発する無作為の突然変異生成は、低下した免疫原性を有し、可能な増大した機能活性を有する他の変異体を生成するようであり、一方、エピトープ中和クラスターにおける別の突然変異生成は、低下した免疫原性を有する他の変異体をもたらすであろう。実施例１野生型スタフィロキナーゼのエピトープ地図化１７匹のネズミの野生型スタフィロキナーゼ（ＳａｋＳＴＡＲ変種）に対するモノクローナル抗体のエピトープ特異性をＢＩＡｃｏｒｅ（商標）機器（Pharma cia，Biosensor AB，Uppsala，Sweden）を用いて実時間生物特異的相互作用分析（ＢＩＡ）によって測定した。ＳａｋＳＴＡＲに対するモノクローナル抗体は基ｃマウスは、完全フロインド・アジュバント中の１０μｇＳａｋＳＴＡＲの皮下注射により、次いで２週間後に非完全フロインド・アジュバント中の１０μｇＳａｋＳＴＡＲの腹腔内注射によって免疫化される。少なくとも６週間の間隔をおいた後、細胞融合の４日および２日前に食塩水中の１０μｇのＳａｋＳＴＡＲがマウスの腹腔内に投与される。脾臓細胞を摘出し、Fazekas de St．GrothおよびScheidegger（３１）に従って、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ.８−６.５.３ミエロする。ハイポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地での選択後、上清を、スタフィロキナーゼでコートしたミクロタイター・プレートを用いて１−部位非競合ミクロ−ＥＬＩＳＡを有する特異的抗原産生のためにスクリーニングした。結合免疫グロブリンは、ホースラディッシュ・パーオキシダーゼ（ＨＰ）−結合ウサギ抗−マウスＩｇＧで検出した。陽性クローンは、プリスタン初回免疫ＢＡＬＢ／ｃマウス中の腹水液の産生に用いられた。モノクローナル抗体のＩｇＧ分画はタンパク質Ａ−セファロース上のアフィニティ・クロマトグラフィーによって、腹水から精製された。この生物特異的相互作用分析法は、表面プラスモン共鳴に基づき、標識を用いることなしに実時間で相互作用を直接測定することができる（３５）。スタフィロキナーゼ（ＳａｋＳＴＡＲ）はアミン結合キット（Pharmacia Biosensor AB）を用いて製造業者の勧めるように、センサー・チップＣＭ５の表面に固定化した。この方法により、リガンド中の第１級アミノ基をセンサー・チップのカルボキシメチル化デキストラン表面に結合する（３６）。固定化は、ｐＨ５.０で１０ｍＭのＮａ−アセテート中の濃度１０μｇ／ｍｌのタンパク質溶液から、６分間で５μｌ／分の流速で実施された。これは、スタフィロキナーゼ分子（約０.０７ｐｍｏｌｅ／ｍｍ²に対応）の１,０００−１,５００ＲＵ（共鳴単位）の共有結合をもたらした（３７）。第２相互作用因子（被検体、すなわちモノクローナル抗体）をセンサーの溶液に注入した。遊離被検体の濃度はセンサー表面を通過する２０℃の溶液の継続流によって一定に保たれた。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，３．４ｍＭのＥＤＴＡ，０.１５ＭのＮａＣｌおよび０.００５％界面活性剤中、ｐＨ７.２の各被検体の少なくとも４濃度（範囲０−４００ｎＭまたは０−５０μ Ｍ）を関連相中に流速５μｌ／分で６分間で注入した。サンプルを緩衝液により、流速５μｌ／分で６−３０分間で置き換えた。各サイクル後、センサー・チップの表面を１５ｍＭのＨＣｌ５μｌの注入により再生した。連関（ｋ_ass）および解離（ｋ_diss）の比率定数は、他に詳細を記載したように（３８）、センサー・グラムから導かれる。ｋ_assとｋ_dissの比から計算される平衡関連定数（Ｋ_A ）は、試験する１７モノクローナル抗体の野生型スタフィロキナーゼへの結合のため、０.６および＞２５×１０⁹Ｍ^-1（中央値１０¹⁰Ｍ^-1）間の範囲にあった（表１）。表１において、“ＩＤ”欄は種々のスタフィロキナーゼ誘導体を表す。“１７Ｇ１１”、“２６Ａ２”などは、表示されたエピトープ・クラスターＩ、II、II Iに結合しているモノクローナル抗体を意味する。“変種”欄には、アミノ酸の１文字コードにおける変異アミノ酸およびその位置を示す。エピトープ・クラスターＩは抗体１７Ｇ１１，２６Ａ２，３０Ａ２，２Ｂ１２および３Ｇ１０により認識され、エピトープ・クラスターIIは抗体２９Ｃ１，１８Ｆ１２，１４Ｈ５，２８Ｈ４，２０Ｄ６，３２Ｂ２および７Ｆ１０により認識され、エピトープ・クラスターIIIは抗体７Ｈ１１，２５Ｅ１，４０Ｃ８，２４Ｃ４および１Ａ１０により認識される。分離エピトープに対するモノクローナル抗体は夫々独立に結合し、密接に関連するエピトープに対するモノクローナル抗体は夫々の結合に干渉する。従って、パネル・モノクローナル抗体のエピトープ特異性は、抗原に同時に結合するモノクローナル抗体の組の活性を検査することにより最も簡易に測定される。実時間生物特異的相互作用分析（ＢＩＡ）は、センサー・チップ表面に結合するスタフィロキナーゼに対するモノクローナル抗体の組の競合的結合を測定するために用いられる。分析は、使用書１０１（Pharmacia Biosensor AB）記載のように行われた。組分け結合試験において、図２に示すように、１７モノクローナル抗体を抗原に対する３−非重複のエピトープを表す３グループに分割した。これらのエピトープの独立性は、モノクローナル抗体２６Ａ２、２８Ｈ４および２４Ｃ４の追加結合の直接表示により確認した。表１に示すように抗体はそのエピトープ特異性に従って配列した。実施例２スタフィロキナーゼの“アラニンについてチャージ・クラスター”変種の構築および地図化 “アラニンについてチャージ・クラスター”スキャンにおいて、疎水性チャージ・アミノ酸のクラスターを目標とした。スタフィロキナーゼ（ＳａｋＳＴＡＲ）は、４５チャージ・アミノ酸（２Ｈｉｓ，１４Ｇｌｕ，８Ａｓｐ，１Ａｒｇおよび２０Ｌｙｓ）を含む。これらのチャージ残基は、図１に要約するように、２または３アミノ酸のクラスターにおいてＡｌａに対して突然変異形成された。図１において下線のチャージ・アミノ酸がアラニンにより置換された２１変異体の全てをクラスター内の短い垂直線で示す。変異体は部位特異的変異形成によりつくられ、下記するようにＥ.ｃｏｌｉ中で発現される。制限酵素はPharmacia,Uppsala,SwedenまたはBoehringer Mannhei m(Mannheim,Germany)から購入した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｅ.ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩのクルノウフラグメントおよびアルカリ・フォスファターゼはBoeh ringer Mannheimから取得した。オリゴヌクレオチド特異的変異形成系およびｐＭａ／ｃプラスミドはCorvas(Ghent,Belgium)から提供を受けた（３９）。発現ベクターｐＭＥＸ６０２ＳａｋＢはInstitut fur Molekulare Biotechnologie， Jena，Germanyから提供を受けた（２５）。Ｍ１２３Ｋ０７ペルパーファージはP romega(Leiden,The Netherlands)から購入した。ルリア・ブロス生育培地はLife Technologies(Merelbeke，Belgium)から購入した。プラスミノーゲンは、別に記載するようにヒト血漿から精製した（４０）。酵素反応は供給者が勧める条件で実施した。プラスミドＤＮＡはＱＩＡＧＥＮ −精製プロトコル（Westburg,Leusden,The Netherlandsにより提供）を用いて分離した。Ｅ.ｃｏｌｉの形質変換はカルシウムリン酸塩法を使用して行った。ＤＮＡ配列検定はジデオキシ鎖終末反応および自動レーザ一蛍光Ａ.Ｌ.Ｆ.（商標）（Pharmacia）を用いて実施した。Ｋ８６、Ｅ８８（Ｍ１０）までの変異体Ｄ５，Ｋ６（Ｍ２０）についての部位特異的変異形成は、ｐＭａ／ｃを用いて、修復欠失Ｅ.ｃｏｌｉｎＷＫ６ＭｕｔＳを用いて実施された。プラスミドｐＭａ／ｃまたは誘導体の増殖、単鎖ＤＮＡの製造および発現は、Ｅ.ｃｏｌｉＷＫ６において行われた（３９）。Ｋ１３４，Ｋ１３５，Ｋ１３６（Ｍ１９）までの変異体Ｄ９３，Ｋ９４（Ｍ１１）は、上記のようにInstitut fur Molekulare Biotec hnologie Jena，Germanyにおいて構築された。色素原性基質（Ｓ２４０３）Ｌ− ピログルタミル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−リジン−Ｐ−ニトロアナリン塩酸塩はChromogenixから購入した。¹²⁵Ｉ−標識フィブリノーゲンはAmershamから購入した。ＳａｋＳＴＡＲの全コード領域を含む４５３塩基対ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは、プラスミドｐＭＥＸ６０２ＳａｋＢ（アンピンリン耐性）から切り出し、ｐＭＣ−ＳＴＡＲを生じるｐＭｃ５−８プラスミド（クロラムフェニコール耐性）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ位にクローン化した。インビトロ部位特異的変異形成のために、この構築物の単鎖ＤＮＡをＥ.ｃｏｌｉでのｐＭｃ−ＳＴＡＲの形質変換およびヘルパー・ファージＭ１３Ｋ０７の一夜培養物の注入により製造した。注入４時間後、細胞ＰＥＧ−沈降およびフェノール−クロロホルム抽出により培地から分離した。次いで、単鎖ｐＭｃ−ＳＴＡＲを、単鎖ｐＭａ（ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）ベクターＤＮＡおよび制限部位を生成または消失するサイレント突然変異を有する、適当な２８−４８塩基の合成オリゴヌクレオチドとバイブリダイズした。延長反応は記載のＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントで実施された。Ｅ.ｃｏｌｉＷＫ６ＭｕｔＳの形質変換およびアンピシリン選別の後に、コロニーは、ニトロセルロース膜上で生育され、もとの位置で変性され、そしてＤＮＡは、各々放射標識変異オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド２０−３０ｎｇのＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ標識のために［γ³²Ｐ］−ＡＴＰ１.５×１０⁸ｃｐｍ）を用いて、室温で一夜ハイブリダイズした。濾物を０.１％ＳＤＳおよび２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０.２× ＳＳＣ，０.１×ＳＳＣを含む溶液を用いて４２℃で洗った。プラスミドＤＮＡは、細菌培養物型各陽性クローンから抽出し、制限酵素消化により解析した。所望の突然変異は、Ａ.Ｌ.Ｆ.（商標）を用いて完全コード配列の配列検定により確認した。変異ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントは、ｐＴａｑプロモーターを含有するｐＭＥＸ６０２ＳａｋＢ発現ベクター中に連結された。変異タンパク質は、細胞内で、そしてこのベクターで形質変換されたＥ.ｃｏｌｉＷＫ６細胞中の溶解形において製造された。変異体は、カチオン交換および疎水性相互反応クロマトグラフィーを用いて、超音波処理細菌抽出物から精製された（２５）。ＳａｋＳＴＡＲ変異体は１０−８０ｍｇ／ｌの範囲の収量で、出発物質の１５ −８８％の回収として、得られる。精製物は非還元１０−１５％勾配ゲル上の電気泳動において純粋であった（表示せず）。ＮＨ₂−末アミノ酸分析は、成熟スタフィロキナーゼのＳｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ配列を確認した。これらのスタフィロキナーゼ変異体の生化学的特性についてより詳細は別に報告する（４１）。タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄにより測定した。ＳａｋＳＴＡＲ溶液の線維素溶解能は、ＳａｋＳＴＡＲ溶液８０μｌとグル−プラスミノーゲン溶液１００μｌの混合物（最終濃度０.５ｍＭ）を用いて、ミクロタイター・プレート中で実施された色素原基質検定により測定された。３０分、３７℃でのインキュベーション後、生じたプラスミノーゲンは、Ｓ２４０３の３０ｐｌの添加（最終濃度１μＭ）および４０５ｍｍでの吸収測定により定量された。活性は、内部標準（ロットＳＴＡＮ５）と比較するホモ・ユニット（ＨＵ）で表された。これは、アミノ酸組成により測定されるタンパク質のｍｇ当たり１００，０００ＨＵの活性が割り当てられる（１１）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、１０−１５％勾配ゲルおよび青着色を用いて、Phast System（商標）（Pharmacia,Uppsala,Sweden）で実施された。サンプルの還元は、１％ＳＤＳおよび１％ジチオエリスリトールの存在下に１００℃で３分間加熱することにより行われた。変異体Ｍ３.８およびＭ８.９の構築、製造および精製は下記するように実施された。構築に用いるオリゴヌクレオチド５'−ＡＴＡＧＣＡＡＴＧＣＡＴＴＴＣＣＴＧＣＡＣＴＡＴＣＡＡＣ−３'(Ｍ３) 、５'−ＣＴＡＡＴＴＣＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＡＣＧＣＴＧＣＡＴＡＴＧＣＴＧＴＣＧＣＡＴＣ−３'（Ｍ８）および５'−ＴＴＴＧＣＧＣＴＴＧＧＣＧＣＣＡＡＴＧＣＡＡＣＴＡＣＴＣＴＡＡＡＣＴＣＴＴＴＡＴＡＴ−３'（Ｍ９）は、Pha rmacia Biotechにより通常的に合成された。変異体Ｍ３.８の構築において、単鎖ｐＭｃ−ＳＴＡＲおよびｐＭａ５−８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントがギャップ両面ＤＮＡ分子を製造するために用いられた。この分子は２８塩基の合成オリゴヌクレオチドＭ３（ＮｓｉＩ制限部位を含有）とハイブリダイズされた。延長反応は、記載のＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントおよびリガーゼで行われた。Ｅ.ｃｏｌｉＷＫ６ＭｕｔＳの形質導入およびアンピシリン選別の後、８１コロニーは、ニトロセルロース膜上で生育され、もとの位置で変性され、そしてＤＮＡは、各々放射標識変異オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド２０−３０ｎｇのＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ標識のために［γ³²Ｐ］−ＡＴＰ１.５×１０⁸ｃｐｍ）を用いて、室温で一夜ハイブリダイズした。濾物を０.１％ＳＤＳおよび２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０.２×ＳＳＣ，０.１×ＳＳＣを含む溶液を用いて４２℃で洗った。１６陽性から選択した１クローンのＤＮＡを細菌培養物１５０ｍｌから製造し、そしてＮｓｉｌおよびＰｖｕｌでの制限酵素消化により分析した。Ｍ３突然変異（ｐＭａ−ＳＴＡＲ３）は、Ａ.Ｌ.Ｆ.（商標）を用いて完全コード領域の配列検定により確認した。次いで、単鎖ＤＮＡを、上記のように、Ｅ.ｃｏｌｉ中ｐＭａ−ＳＴＡＲ３の形質変換により製造した。単鎖ｐＭａ−ＳＴＡＲ３を、上記のように、ｐＭｃ（ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）およびＮｄｅＩ制限部位を含有する４０基合成オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした。Ｅ.ｃｏｌｉＷＫ６ＭｕｔＳの形質変換およびクロラムフェニコール選別の後、１００コロニーをニトロセルロース膜上で生育し、標識Ｍ８オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした。陽性のクローン（７のうち２）を生育し、１陽性クローンを生じる制限酵素消化（ＮｓｉＩ−ＨｉｎｄＩＩＩａｎｄＮｄｅＩ）により解析した。２重変異体Ｍ３.８をｐＭＥＸ６０２ＳａｋＢ発現ベクターに組み入れる。ＤＮＡの１２ミニ製造中、６が正の制限パターンを有した。そのクローンのうち１つ（ｐＭＥＸＳａｋＳＴＡＲ.Ｍ３８）は配列決定され、ＩＰＴＧ誘導ｔａｃプロモーターおよびタンデム中の２Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列の制御下に変異体Ｍ３.８の製造に用いられる。組換えプラスミドｐＭＥＸＳａｋＳＴＡＲ.Ｍ３８で形質変換されたＥ.ｃｏｌｉＷＫ６細胞の懸濁液１００μｌを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有のＬＢ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）１００ｍｌ中でインキュベートした。混合物を一夜３７℃で２００ｒｐｍで撹拌しながらインキュベートして、６００ｎｍで約５吸収単位の細胞密度となった。２０ｍｌを分別して、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地の２１容積（５１フラスコ中）に移した。混合物を２００μＭのＩＰＴＧの添加前に撹拌しながら、３時間３７℃でインキュベートした。これは、Ｍ３.８の誘導のためであり、４時間進行せしめた。細胞を２０分間４,０００ｒｐｍの遠心分離で採取し、０.０１Ｍリン酸塩緩衝液１／１０量に再懸濁し、０℃で超音波処理により破壊した。細胞片を３０分間、２０,０００ｒｐｍの遠心分離で除去し、そして上清を−２０℃で使用まで保存した。細菌培養物２０−３０１から集めた細胞溶解物（容量２１）をｐＨ５.９に調整し、０.２２μｍＳａｒｔｏｒｉｕｓフィルターを通して濾過滅菌し、０.５ＭのＮａＯＨおよび滅菌０.０１Ｍリン酸塩緩衝液であらかじめ調整し、流速１２ｍｌ／分および層中４℃で、ＳＰ−セファローズの５×２５ｃｍカラムにかけた。カラムを緩衝液２−３１で洗い、勾配０−１Ｍの５００ｍｌおよび１−２Ｍの２５０ｍｌの塩で、流速１０ｍｌ／分、４℃で溶出した。Ｍ３.８含有フラクションは、ＳＤＳゲル電気泳動で局在するが、集めて（約２００ｍｌ）、滅菌した０.０１Ｍリン酸塩緩衝液１５１、ｐＨ８.０、４℃で透析した。透析した物質は４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、濾過殺菌し、流速の２.５×１２ｃｍカラムにかけた。０.５ＭＮａＯＨおよび殺菌した０.０１リン酸緩衝液、ｐＨ８.０、流速３ｍｌ／分、４℃であらかじめ調整し、Ｑ−セファローズカラムを０.０１Ｍリン酸塩緩衝液約６００ｍｌで、ｐＨ８.０、流速８ｍｌ／分で洗い、勾配０−０.１７Ｍの３０ｍｌ、０.１７−０.２Ｍの１００ｍｌおよび０.２− １.５Ｍの２００ｍｌの塩、流速４ｍｌ／分で溶出した。Ｍ３.８含有フラクションは、ＳＤＳゲル電気泳動で局在するが、集めて、タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍｌに調整し、物質を０.２２μｍミリポア・フィルターを通して濾過殺菌した。Ｍ３.８の３製造の収量は、特異活性４５,０００±５,２００ＨＵ／ｍｇを有する純タンパク質８０±２５ｍｇ（平均±ＳＤ）であった。変異体Ｍ８．９の構築において、単鎖ｐＭｃ−ＳＴＡＲおよびｐＭａ５−８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントがギャップ両面ＤＮＡ分子を製造するために用いられた。この分子は４２塩基の合成オリゴヌクレオチドＭ９（ＮｓｉＩ制限部位を含有）とハイブリダイズされた。延長反応は、記載のＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントおよびリガーゼで行われた。Ｅ.ｃｏｌｉＷＫ６Ｍｕｔｓの形質導入およびアンピシリン選別の後、コロニーは、ニトロセルロース膜上で生育され、もとの位置で変性され、そしてＤＮＡは、放射標識変異オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド２０−３０ｎｇのＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ標識のために［γ³²Ｐ］−ＡＴＰ１.５×１０⁸ｃｐｍ）を用いて、室温で一夜ハイブリダイズした。濾物を０.１％ＳＤＳおよび２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０.２×ＳＳＣ，０.１×ＳＳＣを含む溶液を用いて４２℃で洗った。４陽性から選択した２クローンのＤＮＡ（ｐＭＡ−ＳＴＡＲ９）は、Ａ.Ｌ.Ｆ .（商標）を用いて、ヌクレオチド配列解析により特徴付けた。ｐＭａ−ＳＴＡＲ９からのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ挿入体をｐＭＥＸ６０２ＳａｋＢ発現ベクターに連絡した。クローンをプローブとして放射標識のＭオリゴヌクレオチドでイン・シツ・ハイブリデイションによりスクリーニングした。一つのクローンｐＭＥＸＳａｋＳＴＡＲ.Ｍ９がヌクレオチド配列分析により特徴づけられ、次いで変異体Ｍ８.９の構築に用いられた。Ｍ８.９を構築するために、突然変異８をＭ９中ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により導入した。ＰＣＲは、５Ｕ酵素および下記のプライマの各々１μｇを用いて、全量１００ｐｌで行われた。オリゴヌクレオチドII＝５'−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧ、オリゴヌクレオチドII＝５'−ＴＡＴＡＴＡＡＴＡＴＴＣＧＡＣＡＴＡＧＴＡＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴ−３'、オリゴヌクレオチドIV＝５'−ＴＡＴＣＣＣＧＧＧＣＡＴＴＡＧＡＴＧＣＧＡＣＡＧＣＡＴＡＴＧＣＡＧＣＧＴＴＴＧＣＡＧＴＡ−３'およびオリゴヌクレオチドＶ＝５'−ＣＡＡＡＡＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣ−３'。ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの濃度は２００μＭであった。変性は１分間９４℃で、アニーリングは２分間５５℃で、伸長は１.５分７２℃で行われた。３０循環後、サンプルを１０分間７２℃でインキュベートし、４℃に冷した。最初のＰＣＲ反応においてｐＭＥＸＳａｋＳＴＡＲ.Ｍ９２ｎｇがオリゴヌクレオチドIVおよびＶをプライマーとして用いて増幅した。ＰＣＲアンプリコンをＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｐｒｅｐ−Ａ−ｇｅｎｅキット（Bio-Rad La boratories,Hercules,CA,USA）を用いて１.５％アガロースゲル中の電気泳動の後に精製した。得たフラグメントを、高速ＤＮＡ連結キット（Boehringer Mannh eim）を用いてｐＵＣ１８（Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden）のＳｍａI−ＨｉｎｄＩＩＩ部位中にクローンした。Ｅ.ｃｏｌｉＷＫ６細胞中の形質変換後、１２コロニーからのＤＮＡをつくり、ＥｃｏＲＩａｎｄＨｉｎｄＩＩＩで消化するとき、１２すべてが約２３０塩基対のフラグメントを生成した。これらのＤＮＡの一つ（ｐＵＣ１８−Ｍ８９Δ）を第２ＰＣＲ産生物のクローニングに用いた（下記参照）。第２ＰＣＲはオリゴヌクレオチドIIおよびIIIをプライマーとして用いｐＭＥＸＳａｋＳＴＡＲ.Ｍ９の２ｎｇで行った。ＰＣＲ反応産生物はＳｓｐｌおよびＥｃｏＲＩで消化し、さらに、上記のように精製した。得たフラグメントをｐＵＣ１８−Ｍ８９ΔのＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ部位に連結せしめた。Ｅ.ｃｏｌｉＷＫ６細胞中での形質変換後、ＤＮＡ製造のために６クローンを選択した。６中５は、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの消化後、約４５３塩基対のフラグメントを生成した。この全変異体Ｍ８.９をコードするフラグメントは、発現ベクターｐＭＥＸ６０２ＳａｋＢのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位へクローンした。Ｅ.ｃｏｌｉＷＫ６細胞の形質変換後、６コロニーからのＤＮＡを、すべての例において約４５３塩基対のフラグメントを生成するＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの消化により、解析した。これらのＤＮＡの一つはさらにヌクレオチド配列分析により特徴を明らかにした。アンピシリンμｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍｌ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を組換えプラスミドｐＭＥＸＳａｋＳＴＡＲ.Ｍ８９で形質変換したＥ.ｃｏｌｉＷＫ６細胞の懸濁液１００μｌで接種した。混合物を一夜３７℃で２００ｒｐｍで撹拌しながらインキュベートして、６００ｎｍで約５吸収単位の細胞密度となった。４ｍｌを分別して、１５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有“ＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈ”培地の２１容積（ＳＬバフル・フラスコ中）を接種するために用いた。培養物を２０時間３７℃、１４０ｒｐｍでインキュベートし、約４.１０⁹ 細胞／ｍｌの最終細胞濃度となった。細胞を２０分間４,０００ｒｐｍの遠心分離で採取し、０.０１Ｍリン酸緩衝液１／５量に再懸濁し、ｐＨ６.５、０℃で超音波処理により破壊した。ｐＨを５.８に調整し、そして細胞片を３０分間、２０,０００ｒｐｍの遠心分離で除去し、そして上清を−２０℃で使用まで保存した。集めた細胞溶解物（１,８００ｍｌ）をｐＨ５.８に調整し、０.５ＭのＮａＯＨおよび新鮮０.０１Ｍリン酸塩、２.５ＭのＮａＣｌ緩衝液であらかじめ調整し、ｐＨ７.５、流速２ｍｌ／分、４℃で、ＳＰ−セファローズの２.５×２０ｃｍカラムにかけた。カラムを緩衝液５００μｌで洗い、勾配０−１Ｍの２００ｍｌの塩で、流速６ｍｌ／分、溶出した。集めたＭ８.９フラクションは、ＳＤＳゲル電気泳動で同定されるが、固体ＮａＣｌで２.５Ｍに調整し、０.５ＭＮａＯＨおよび新しい０.０１Ｍリン酸塩、２.５ＭのＮａＣｌ緩衝液でｐＨ７.５にあらかじめ調整し、流速２ｍｌ／分および４℃でフェニルーセファローズの２.５×２０ｃｍカラム上、疎水相互作用クロマトグラフィーにかけた。カラムを緩衝液約５００ｍｌで洗い、０.０１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ６.５で溶出した。Ｍ８.９含有フラクションは、ＳＤＳゲル電気泳動で局在するが、集めて、０.０１Ｍリン酸塩緩衝液２１、ｐＨ９．０、で透析した。透析した物質は４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、０. ５ＭのＮａＯＨおよび新鮮０.０１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ９.０、流速２ｍｌ／分、４℃であらかじめ調整して、Ｑ−セファローズ流速の１.６×５ｃｍカラムにかけた。カラムを０.０１Ｍリン酸塩緩衝液約１５０ｍｌで、ｐＨ９.０で洗い、勾配０−０.１７ＭのＮａＣｌ１００ｍｌの塩、流速４ｍｌ／分で溶出した。Ｍ８.９含有フラクションは、ＳＤＳゲル電気泳動で局在するが、集めて、タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍｌに調整し、物質を０.２２μｍミリポア・フィルターを通して濾過殺菌した。Ｍ８.９の３製造の収量は、特異活性５１,０００±３, ５００ＨＵ／ｍｇを有する純タンパク質７３±１７ｍｇ（平均±ＳＤ）であった。色素原基質検定で測定した種々のＳａｋＳＴＡＲ変異体の線維素溶解活性を表１にまとめる。図１に示した２１変異体のうち、Ｅ９９，Ｅ１００（Ｍ１３）およびＥ９９，Ｅ１００，Ｅ１０２（Ｍ１４）は純粋な形では得られなかった。Ｋ１１，Ｄ１３，Ｄ１４（Ｍ１），Ｅ４６，Ｋ５０（Ｍ４）および６５，Ｄ６９（Ｍ７）は活性がなかった。表１にまとめた１６変異体は野生型ＳａｋＳＴＡＲと共に詳細に試験された。これらの変異体のうち、モノクローナル抗体パネルと反応したＤ５，Ｋ６（Ｍ２０），Ｋ８，Ｋ１０（Ｍ２１），Ｄ３３，Ｋ３５（Ｍ２），Ｋ５７，Ｅ５８，Ｋ５９（Ｍ５），Ｅ６１，Ｅ６５（Ｍ６），Ｋ８６，Ｅ８８（Ｍ１０），Ｄ９３，Ｋ９４，（Ｍ１１），Ｋ９６，Ｋ９７，Ｋ９８（Ｍ１２），Ｅ１０８，Ｋ１０９（Ｍ１５），Ｄ１１５、Ｅ１１８，Ｈ１１９（Ｍ１６），Ｈ１１９，Ｋ１２１（Ｍ１７），Ｋ１３０（Ｍ１８）およびＥ１３４，Ｋ１３５，Ｋ１３６（Ｍ１９）はＳａｋＳＴＡＲと同様の状態であった。しかし、Ｋ３５，Ｅ３８（Ｍ３）およびＥ８０，Ｄ８２（Ｍ９）は抗体クラスター７Ｈ１１，２５Ｅ１，４０Ｃ８とあまり反応せず、Ｋ７４，Ｅ７５，Ｒ７７（Ｍ８）は２６Ａ２，３０Ａ２，２Ｂ１２および３Ｇ１０とあまり反応しなかった。エピトープ消失の効果は、変異体Ｋ３５，Ｅ３８／Ｋ７４，Ｅ７５，Ｒ７７（Ｍ３.８）ａｎｄＫ７４，Ｅ７５，Ｒ７７／Ｅ８０，Ｄ８２（Ｍ８．９）で明白であり、これは両方の元の分子のモノクローナル抗体との低下した反応性と結合していた。実施例３ＳａｋＳＴＡＲでの処置の患者において誘発される、抗体野生型および“アラニンについてチャージ・クラスター”スタフィロキナーゼ変種での吸収急性心筋梗塞の患者のＳａｋＳＴＡＲで治療後に生じる誘発抗体のエピトープ特異性についての情報を得るために、１６患者から血漿サンプルをバイオ特異の相互作用分析によるＳａｋＳＴＡＲ結合基の測定前に、単−および結合“アラニンについてチャージ・クラスター”変異体の２折分子過剰（スタフィロキナーゼ中和活性以上）で吸収した。これらのサンプルにおけるスタフィロキナーゼ中和活性は下記のように測定した。増加した濃度の野生型または変異体ＳａｋＳＴＡＲ（０.２−１０００μｇ／ｍｌを含む容量５０μｌ）をクエン酸処理ヒト血漿３００μｌおよび緩衝またテスト血漿５０μｌの混合物に加え、すぐにトロンビン（５０ＮＩＨ単位／ｍｌ）およびＣａＣｌ₂（２５ｍＭ）を含む混合物血漿の血栓溶解時間を測定し、ＳａｋＳＴＡＲ分子の濃度に対して図示する。この曲線から、２０分で完全な血栓溶解を生じるプラスミノーゲン・アクチベーターの濃度が求められた。中和活性力価は、テスト血漿と緩衝値との差異として測定され、μｇ／ｍｌテスト血漿で表示される。結果を表２に要約する。野生型ＳａｋＳＴＡＲはすべてのサンプルから結合抗体の９０％以上を吸収するが、不完全な吸収が４患者で変異体Ｋ３５，Ｅ３８（Ｍ３）に、１２患者で変異体Ｋ７４，Ｅ７５，Ｒ７７（Ｍ８）に、５患者で変異体Ｅ８０，Ｄ８２（Ｍ９）に認められた。結合変異体Ｋ３５，Ｅ３８／Ｋ７４，Ｅ７５，Ｒ７７（Ｍ３.８）およびＫ７４，Ｅ７５，Ｒ７７／Ｅ８０，Ｄ８２（Ｍ８.９）での吸収は１３患者で９０％以下の抗体（１６患者については夫々平均値６８および６５％）を除去し、一方、予測されたように、結合変異体（Ｍ８およびＭ３またはＭ９）の元の分子の混合物は９０％を越える抗体において一貫して吸収した。実施例４野生型スタフィロキナーゼ（ＳａｋＳＴＡＲ）、変異体Ｋ３５，Ｅ３.８（Ｍ３），Ｋ７４，Ｅ７５，Ｒ７７（Ｍ８）およびＥ８０，Ｄ８２（Ｍ９）および併合変異体Ｋ３５，Ｅ３８／Ｋ７４，Ｅ７５Ｒ７７（Ｍ３.８）およびＫ７４，Ｅ７５，Ｒ７７／Ｅ８０，Ｄ８２（Ｍ８.９）で免疫されたウサギにおけるスタフィロキナーゼ“アニリンについてチャージ・クラスター”変種の免疫原性ＳａｋＳＴＡＲ対ＳａｋＳＴＡＲ変異体Ｍ３，Ｍ８，Ｍ９，Ｍ３.８およびＭ８.９の比較免疫原性を、ＳａｋＳＴＡＲにウサギの４または８匹群を割り付け、変異体には８匹群を割り付けて、調べた。週０の時点で（開始時点の血栓溶解能を測定）ＳａｋＳＴＡＲ４００μｇ／ｋｇおよび変異体２００−１,０００μ ｇ／ｋｇの静脈注入によって免疫を生じせしめ、週２の時点で完全フロンド・アジュバント中の、そして週３および５の時点で不完全フロンド・アジュバント中の同じ薬剤４００μｇを注入した。免疫原性は、６週の時点で血漿中のスタフィロキナーゼー中和活性および残る血栓溶解力の測定により定量化した。簡単には、血漿中のスタフィロキナーゼ中和活性は、増加した濃度の野生型または変異体ＳａｋＳＴＡＲ（０.２−１０００μｇ／ｍｌを含む容量５０μｌ）をクエン酸処理ヒト血漿３００μｌおよび緩衝またはテスト血漿５０μｌの混合物に加え、すぐにトロンビン（５０ＮＩＨ単位／ｍｌ）およびＣａＣｌ₂（２５ｍＭ）を含む混合物血漿の血栓溶解時間を測定し、ＳａｋＳＴＡＲ分子の濃度に対して図示する。この曲線から、２０分で完全な血栓溶解を生じるプラスミノーゲン・アクチベーターの濃度が求められた。中和活性力価は、テスト血漿と緩衝値との差異として測定され、μｇ／ｍｌテスト血漿で表示される。血栓溶解性は、¹²⁵Ｉ−フィブリンラベル血小板−少量ウサギ血漿血栓０.３ｍｌを用いて、体外動脈−静脈ループに挿入して試験した。従って、露出した大腿動脈に４フレンチ・カテーテル（Portex white,Portex,Hythe,UK）をつなぎ、耳の静脈につなぐために２つの皮下シリンジを通して結合した。体外ループを経る血流は嬬動ポンプで１０ｍｌ／分に保持した。¹²⁵Ｉ−フィブリン・ラベル血漿・血餅をループに挿入した２つのシリンジの各々に導入した。血漿・血餅はごく少量（約１.５μＣｉ）¹²⁵Ｉ−標識ヒト・フィブリノーゲン液（Amersham,Bucki nghamshire,UK）を有する血小板−少量血漿０.３ｍｌとウシ・トロンビン（１５ＮＩＨ単位／ｍｌ）および０.５ＭＣａＣｌ₂との混合物０.０７ｍ１と混合し、次いで３０分間３７℃でインキュベートした。注入開始３０分前に、リドグレル（結合・スロンボキサン合成阻害剤およびプロスタグランジン・エンドパーオキサイド・レセプター・アンタゴニスト）（４３）７.５ｍｇ／ｋｇを、体外ループでの血小板沈着を防ぐために静脈内ボーラスとして投与した。動物をヘパリン（実験中、２００単位／ｋｇ／時間の持続的注入により３００単位／ｋｇ）により抗凝固化し、ＳａｋＳＴＡＲ４００μｇ／ｋｇ（４または８ウサギ）またはＳａｋＳＴＡＲ変異体２００−１０００μｇ／ｋｇ（８ウサギ）の注入に無作為に割り付けた。６週間後、ＳａｋＳＴＡＲ変異体割り付けウサギの半分を同じＳａｋＳＴＡＲ変異体で処理し、残りの半分は野生型ＳａｋＳＴＡＲで再び処理した。一方、ＳａｋＳＴＡＲで免疫化したウサギは、ＳａｋＳＴＡＲ変異体（この対照群が４ウサギのとき）で処理するか、または野生型ＳａｋＳＴＡＲまたはＳａｋＳＴＡＲ変異体（この対照群が８ウサギのとき）のいずれかに無作為化した。血栓溶解剤は１時間以上で１０％ボーラスおよび９０％注入として静脈から与えた。血餅溶解時間経過を、体外ループ上に設置した２つの３×０.５インチＮａＩ／タリウム結晶（Bicron,Newbury,OH）を用いて、外部ガンマ−計数により監視した。シンチレーション結晶をＣａｎｂｅｒｒａ−Ｓ１００系（Canberra-Packard ,Meriden,CT）に結合し、データを別記のように（４４）に解析した。実験の終了時に、残る血餅を放射アイソトープ含量を測るために回収した。動物実験は、血栓および止血に関する米国生理学会および国際委員会の指針（４５）に合わせて行った。ＳａｋＳＴＡＲおよび夫々の単−変異体（Ｍ３，Ｍ８およびＭ９）の免疫原性は表３Ａに比較した結果は平均±ＳＤで表す。変異体Ｍ３のウサギ８匹において開始時点の中和活性はＳａｋＳＴＡＲおよびＭ３の両方に対して０.０±０.０μｇ／ｍｌであった。Ｍ３の２００μｇ／ｋｇの注入は７６±２３％血餅溶解を起こした。これら８匹は、２週で完全フロンド・アジュバント５００μｌ、３および５週で不完全フロンド・アジュバント５００μｌに懸濁したＭ３で免疫された。６週で血漿中和活性は、ＳａｋＳＴＡＲに対して１１±６.７μｇ／ｍｌおよびＭ３に対して１１±７.２μｇ／ｍｌに増加された。６週で、無作為に選択されたこれらのウサギのうち４匹へのＳａｋＳＴＡＲ４００μｇ／ｋｇ注入は血餅溶解が１８±２７％となり、一方、他の４匹へのＭ３の２００μｇ／ｋｇ注入は１６±１７％であった。ＳａｋＳＴＡＲのウサギ４匹において、出発時点の中和活性は、ＳａｋＳＴＡＲに対して０.２±０.２ μｇ／ｍｌおよびＭ３に対して０.０±０.０μｇ／ｍｌであった。ＳａｋＳＴＡＲの４００μｇ／ｋｇの静脈注入は開始時点の８９±８.６％溶解を生じた。次いでこれら４匹は完全（２週）または不完全（３または５週）フロンド・アジュバントに懸濁したＳａｋＳＴＡＲ４００μｇで免疫した。６週で血漿中和活性は、ＳａｋＳＴＡＲに対して３５±２３μｇ／ｍｌおよびＭ３に対して１９±１３ μｇ／ｍｌに増加された。６週でのこれら４ウサギへのＳａｋＳＴＡＲ.Ｍ３の２００μｇ／ｋｇの静脈注入は９.３±８.２％溶解を起こす。変異体Ｍ８のウサギ８匹において出発時点の中和活性はＳａｋＳＴＡＲに対して１.４±０．２μｇ／ｍｌおよびＭ３に対して０.６±０.５μｇ／ｍｌであった。Ｍ８の１０００μｇ／ｋｇの注入は４１±１３％血餅溶解を起こした。これら８匹は、２週で完全フロンド・アジュバントに懸濁したＭ３の４００μｇ、および３および５週で不完全フロンド・アジュバント５００μｌに懸濁した同量で免疫された。６週で血漿中和活性は、ＳａｋＳＴＡＲに対して３.８±１.８μｇ／ｍｌおよびＭ８に対して５.９±２.７μｇ／ｍｌに増加された。これらのウサギのうち４匹へのＳａｋＳＴＡＲ４００μｇ／ｋｇ注入は血餅溶解が４９±２８％となり、一方、他の４匹へのＭ８の１０００μｇ／ｋｇ注入は２４±１１％であった。ＳａｋＳＴＡＲのウサギ８匹において、出発時点の中和活性は、ＳａｋＳＴＡＲに対して０.９±０.６μｇ／ｍｌおよびＭ８に対して０.６±０.３μｇ／ｍｌであった。ＳａｋＳＴＡＲの４００μｇ／ｋｇの静脈注入は開始時点の６８± １８％溶解を生じた。次いでこれらのウサギは完全（２週）または不完全（３または５週）フロンド・アジュバントに懸濁したＳａｋＳＴＡＲ４００μｇで免疫した。６週で血漿中和活性は、ＳａｋＳＴＡＲに対して５９±４７μｇ／ｍｌおよびＭ８に対して２２±１６μｇ／ｍｌに増加され、一方、４００μｇ／ｋｇのＳａｋＳＴＡＲの残る血栓溶解効力は７.５±２.４％に、１,０００μｇ／ｋｇのＭ８のそれは４.１±４.８％に低下した。変異体Ｍ９のウサギ８匹において、出発時点の血漿中の中和活性はＳａｋＳＴＡＲに対して０.２±０.０５μｇ／ｍｌおよびＭ９に対して０.０３±０.０５μ ｇ／ｍｌであった。Ｍ９の４００μｇ／ｋｇの注入は７２±１１％血餅溶解を起こした。これら８匹は、２週で完全フロンド・アジュバントに懸濁した４００μ ｇＭ９で、３および５週で不完全フロンド・アジュバントに懸濁した同量のＭ９で免疫された。６週で血漿中和活性は、ＳａｋＳＴＡＲに対して８.０±４.６μ ｇ／ｍｌおよびＭ９に対して３.５±２.６μｇ／ｍｌに増加された。６週で、これらのウサギのうち４匹へのＳａｋＳＴＡＲ４００μｇ／ｋｇ注入は血餅溶解が５３±１１％となり、一方、他の４匹へのＭ９の４００μｇ／ｋｇ注入は４０± ７.８％溶解であった。ＳａｋＳＴＡＲの対照のウサギ４匹において、出発時点の血漿中の中和活性は、ＳａｋＳＴＡＲに対して０.１±０.０５μｇ／ｍｌおよびＭ９に対して０.０５±０.０６μｇ／ｍｌであった。ＳａｋＳＴＡＲの４００ μｇ／ｋｇの静脈注入は開始時点７８±１３％溶解を生じた。次いでこれら４匹は、完全（２週）または不完全（３または５週）フロンド・アジュバントに懸濁したＳａｋＳＴＡＲ４００μｇで免疫した。６週で血漿中和活性は、ＳａｋＳＴＡＲに対して１６±５.０μｇ／ｍｌおよびＭ９に対して１２±９.１μｇ／ｍｌに増加された。Ｍ９の血栓溶解効力は２４±３３％に低下した。ＳａｋＳＴＡＲの対二重変異体Ｍ３.８およびＭ８.９の免疫原性は表３Ｂに比較した。変異体Ｍ３.８のウサギ８匹において、開始時点の血漿中の中和活性はＳａｋＳＴＡＲに対して０.６±０.３μｇ／ｍｌおよびＭ３.８に対して３.５± ２.０μｇ／ｍｌであった。Ｍ３.８の１０００μｇ／ｋｇの注入は５３±１３％血餅溶解を起こした。これら８匹は、２週で完全フロンド・アジュバントに懸濁した４００μｇＭ３.８で、３および５週で不完全フロンド・アジュバントに懸濁した同量のＭ３.８で免疫された。６週で血漿中和活性は、ＳａｋＳＴＡＲに対して１.７±０.７μｇ／ｍｌおよびＭ３.８に対して６.１±３.０μｇ／ｍｌに増加したのみであった。これらのウサギのうち４匹へのＳａｋＳＴＡＲ４００ μｇ／ｋｇ注入は血餅溶解が７７±１８％となり、一方、他の４匹へのＭ３.８の１０００μｇ／ｋｇ注入は５９±２５％であった。ＳａｋＳＴＡＲのウサギ８匹において、開始時点の血漿中の中和活性は、ＳａｋＳＴＡＲに対して０.６± ０.４μｇ／ｍｌおよびＭ３.８に対して２.０±２.０μｇ／ｍｌであった。ＳａｋＳＴＡＲの４００μｇ／ｋｇの静脈注入は開始時点の８０±１０％溶解を生じた。次いでこれらウサギは、完全（２週）または不完全（３または５週）フロンド・アジュバントに懸濁したＳａｋＳＴＡＲ４００μｇで免疫した。６週で血漿中和活性は、ＳａｋＳＴＡＲに対して２０±１５μｇ／ｍｌおよびＭ３.８に対して２１±２２μｇ／ｍｌに増加された。一方、４００μｇ／ｋｇＳａｋＳＴＡＲの残る血栓溶解効力は８.５±５.７％に、１,０００μｇ／ｋｇのＭ３.８のそれは３０±２９に低下した。変異体Ｍ８.９のウサギ８匹において、出発時点の血漿中の中和活性はＳａｋＳＴＡＲに対して０.３±０.２μｇ／ｍｌであり、およびＭ８.９に対して１.６ ±０.５μｇ／ｍｌであった。Ｍ８.９の２００μｇ／ｋｇの注入は３９±１３％血餅溶解を起こした。これら８匹は、２週で完全フロンド・アジュバントまたは、３および５週で不完全フロンド・アジュバントに懸濁した４００μｇのＭ８.９で免疫された。６週で血漿中和活性は、ＳａｋＳＴＡＲに対して２.５±１.５μ ｇ／ｍｌおよびＭ８.９に対して４.９±１.３μｇ／ｍｌに増加したのみであった。６週で、これらのウサギのうち４匹へのＳａｋＳＴＡＲ４００μｇ／ｋg注入は血餅溶解が５１±３５％となり、一方、他の４匹へのＭ８.９の８００μｇ／ｋｇ注入は３９±１２％であった。ＳａｋＳＴＡＲの対照のウサギ４匹において、前処置中和活性は、ＳａｋＳＴＡＲに対して０.７±０.３μｇ／ｍｌおよびＭ８.９に対して０.７±０.３μｇ／ｍｌであった。ＳａｋＳＴＡＲの４００μ ｇ／ｋｇの静脈注入は開始時点の６７±１９％溶解を生じた。次いでこれら４匹は完全（２週）または不完全（３または５週）フロンド・アジュバントに懸濁したＳａｋＳＴＡＲ４００μｇで免疫した。６週で血漿中和活性は、ＳａｋＳＴＡＲに対して２０±１５μｇ／ｍｌおよびＭ８.９に対して１８±１５μｇ／ｍｌに増加された。一方、Ｍ８.９の残る血栓溶解効力は３１±３０％しか低下しなかった。これらの結果は、ＳａｋＳＴＡＲおよび選択変異体の、この直接比較試験において、特に二重変異体（Ｍ３.８およびＭ８.９）がＳａｋＳＴＡＲよりも顕著に低い抗体−関連中和活性および溶解抵抗を誘発することを示している。実施例５ヒヒにおけるＳａｋＳＴＡＲとＭ３.８の比較免疫原性中和抗体の誘発および血栓溶解の難治性に関して、ＳａｋＳＴＡＲおよびＭ３ .８の比較免疫原性をヒヒで検討した。動物実験は、血栓および止血に関する米国生理学会および国際委員会の指針（４５）に合わせて行った。麻酔し挿管したヒヒにおいて、体外動脈−静脈循環を、脛側または上腕動脈から末梢静脈に体外ポリエチレン・ループを通して結ぶことにより形成した。蠕動ポンプによって体外ループを通した血流の持続的監視を保持し、新鮮¹²⁵Ｉフィブリン−ラベル・ヒヒ・血漿・血餅を夫々含む２つの皮下シリンジを挿入した。ＳａｋＳＴＡＲまたは変異体Ｍ３.８注入中における血餅溶解の時間経過をシリンジ上の外部ガンマ−計数により持続的に監視した。別に、アイソトープ回収バランスは、実験終了点における全血液放射活性プラス回収トロンビン中の放射活性の合計を、血餅中のもとから存在の放射活性と比較した。各血栓溶解試験の前に、体外系における血小板の沈着を防ぐために、ヒヒにリドグレルの静脈ボールスを与えた。血栓溶解試験中、３００ＩＵ／ｋｇボールスに続いて２００ＩＵ／ｋｇ注入で静脈にヘパリンを投与した。１２匹の雄ヒヒ（Ｐａｐｉｏｈａｍａｄｒｙａｓ）を出発点（週０）にＳａｋＳＴＡＲ（グループ１）または変異体Ｍ３.８（グループ２）の５０μｇ／ｋｇの処置に無作為に割り付け、１時間以上で１０％ボールスを静脈注入し、そして出発点血栓溶解効力を２時間で血餅からの放射活性の消失を監視して検定した。ヒヒをＳａｋＳＴＡＲ（グループ１）または変異体Ｍ３.８（グループ２）の５００μｇを皮下投与で免疫した。これらは２週では完全フロイド・アジュバントに、３および５週では不完全フロイド・アジュバントに懸濁されている。６週後に、血栓溶解効力を体外血栓溶解モデルを用いて、４時間、定量した。すなわち、開始時点で処置し、続いてＳａｋＳＴＡＲで免疫したグループ１の６匹のうち３匹および開始時点で処置し、続いてＭ３.８で免疫したグループ２の６匹のうち３匹を無作為に選択し、１０％ボールスで１時間以上で静脈注入によりＳａｋＳＴＡＲ５０μｇ／ｋｇをまず与え、ＳａｋＳＴＡＲ−注入の開始２時間後に同じ量のＭ３.８を与えた（夫々、グループ１Ａおよび２Ａ）。残りの６匹には、順序を逆にして同じように処置した。すなわち、最初にＭ３.８、次いでＳａｋＳＴＡＲである（夫々、グループ１Ｂおよび２Ｂ）。１８週後、血栓溶解効力をフィブリン・血餅からの放射活性の消失を３時間、監視することにより３回測定した。ＳａｋＳＴＡＲで免疫した６匹中３匹に２.５分以上で静脈内ボールスとしてＳａｋＳＴＡＲ２５０μｇ／ｋｇを与え、一方、ＳａｋＳＴＡＲで免疫した残りの３匹にはＭ３.８の同量を与えた（グループ１Ｂ）。Ｍ３.８で免疫した６匹中、３匹にはＳａｋＳＴＡＲ２５０μｇ／ｋｇを静脈ボールスで与え(グループ２Ａ)、残りの３匹には同量のＭ３.８を与えた（グループ２Ｂ）。血液サンプルをクエン酸塩を入れた試験管（最終濃度０.０１Ｍ）に、出発点およびその後のいくつかの時点に、活性部分的トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、フィブリノーゲン、α₂−アンチプラスミン（実験の出発および終了点）およびＳａｋＳＴＡＲ−およびＭ３.８−中和活性（血栓溶解注入前）に採取した。従って、ＳａｋＳＴＡＲまたはＭ３.８の増加量（０.２−１,０００μｇ／ｍｌ）を含む５０μｌ量）を、クエン酸処理ヒト血漿３００μｌおよび緩衝液または試験ヒヒ血漿５０μｌの混合物に加え、直ちに、トロンビン（５０ＮＩＨμ ／ｍｌ）およびＣａＣｌ₂（２５ｍＭ）の混合物１００μｌを加えた。血漿血餅溶解時間を測定し、ＳａｋＳＴＡＲおよびＭ３.８の濃度に対して記入した。この曲線から２０分で完全な血餅溶解を生じるプラスミノーゲン・活性化剤の濃度を測定した。中和活性は試験血漿と緩衝値との差異により定め、μｇ／ｍｌ血漿中で表した。全身的なフィブリノーゲンは低下しておらず、またα₂−アンチプラスミンも枯渇せず、両者の全フィブリン−特異性を反映していた。６週間後、グループ１のＳａｋＳＴＡＲ−中和活性は、グループ２のＭ３.８ −中和活性より有意に高かった。グループ１では、中和活性がＭ３.８よりもＳａｋＳＴＡＲに対して、迅速にかつ有意に明白に生じ、一方、グループ２においてＭ３.８−中和活性はＳａｋＳＴＡＲ中和活性を越えなかった（表４）。８週から、グループ１ではグループ２よりも有意に大きい中和活性がＳａｋＳＴＡＲおよびＭ３.８のいずれかに対しても生じた（表４）。開始時点で、６匹のヒヒ（グループ１）において５０μｇ／ｋｇのＳａｋＳＴＡＲが１時間以上で静脈注入され、２時間以上で７７±２.９％血餅溶解を誘発し、他の６匹（グループ２）のヒヒにおいて、５０μ／ｋｇＭ３.８が２時間以上で８３±３.６％血餅溶解を誘発した（平均±ＳＥＭ．ｐ＝０.２）。６週後、５０μｇ／ｋｇのＳａｋＳＴＡＲの２時間以上の溶解効力は、１時間以上の静脈注入で、ＳａｋＳＴＡＲで免疫した３匹のヒヒ（グループ１Ａ）において９. ２±１.０％に低下し、Ｍ３.８で免疫した３匹のヒヒ（グループ２Ａ）において８.５±３.２％に低下し、一方、２時間以上の５０μｇ／ｋｇ静脈注入のＭ３. ８の溶解効力は、ＳａｋＳＴＡＲで免疫した３匹のヒヒ（グループ１Ｂ）において１０±６.９％に、Ｍ３.８で免疫した３匹のヒヒ（グループ２Ｂ）において１１± ７.４％に低下した（全グループにおけるＰ＜０.００１に対応開始時点溶解；グループ間Ｐ＝ＮＳ）。最初の血栓溶解注入の開始２時間後、他の薬剤５０μｇ／ｋｇを１時間以上の静脈注入し、比較残渣溶解効力を得たグループ１Ａおよび２ＡにおいてＭ３.８での２時間以上の血餅溶解は夫々７.７±１５％および１１± ５.７％であり、グループ１Ｂおよび２ＢにおいてＳａｋＳＴＡＲでの２時間以上の血餅溶解は夫々、１３±２.７および１２±２.１％であった。１８週で、２５０μｇ／ｋｇＳａｋＳＴＡＲの静脈ボールス注は、ＳａｋＳＴＡＲで免疫した３匹のヒヒ（グループ１Ａ）において３時間以上で３９±５.３％血餅溶解をおこし、一方、Ｍ３.８で免疫した３匹のヒヒ（グループ２Ｂ）において２５０μｇ／ｋｇのＭ３.８の残渣血栓溶解効力は有意に大きかった。すなわち、３時間以上の血餅溶解６８±４.５％であった（Ｐ＜０.００５）。２５０μｇ／ｋｇのＳａｋＳＴＡＲは、Ｍ３.８で免疫した３匹のヒヒにおいて５８ ±９.５％の３時間以上の血餅溶解を生じ（グループ２Ａ；Ｐ＝０.８ｖｓグループ１Ａ）、一方、ＳａｋＳＴＡＲで免疫した３匹のヒヒ（グループ１Ｂ）において２５０μｇ／ｋｇＭ３.８による３時間以上の血餅溶解は３９±３.６％（Ｐ＝０.０００５ｖｓグループ２Ｂ）であった。集めた解析は、１８週で投与剤に関係なく、ＳａｋＳＴＡＲで免疫したグループ１について３時間以上の残渣溶解が３９±３.０％、Ｍ３.８で免疫されたグループ２について６３±５.２％であった（Ｐ＜０.０００５）。試験の期間を通じて、血栓溶解効力は対応する中和活性に逆相関した（Ｓｐｅａｒｍａｎ γ＝−０.８３；Ｐ＜０.０００１）。このように、ヒヒにおいて変異Ｍ３.８は比較的活性であり、フィブリン−特異的であるが、野生型ＳａｋＳＴＡＲよりも有意に抗原性が低い。これは、免疫後の血漿中の中和活性の誘発がより遅いことおよび血栓溶解効力の回復がより速いことにより証拠づけられる。これらの霊長類での結果は、ウサギにおける上記の観察を確認し、および拡張する。実施例６末梢動脈閉塞患者におけるＭ３.８およびＭ８.９対ＳａｋＳＴＡＲの比較血栓溶解効力および免疫原性血管造影で末梢動脈またはバイパス移植に動脈閉塞の認められる患者について、ＳａｋＳＴＡＲ（ｎ＝８）、Ｍ３.８（ｎ＝４）およびＭ８.９（ｎ＝４）を動脈内または閉塞血栓の近接部に２ｍｇのボールスとして投与し、１時間当たり１ｍｇの注入を続けた。患者はインフォームド・コンセントが与えられた後に試験され、プロトコールはＬｅｕｖｅｎ大学のヒト試験委員会で承認されている。採用および除外の判定基準は、組換えスタフィロキナーゼ分子での４８時間以内の再処理が許される以外は、基本的に上記の通りである（４６）。ヘパリン、アスピリンおよび経口抗凝固剤の併用の抗血栓処置は上記の通りである（４６）。閉塞末梢動脈またはバイパス移植の開出は、野生型および変種ＳａｋＳＴＡＲの動脈注内の前、その間に少なくとも４時間毎および終了時点と定期的に調べられた。注入終了時における対象の血管の造影での開出は、主要な試験終了点となった。血栓溶解剤の投与は、適当な血管がなされたとき、合併症でその中止を要したときおよび２つの連結する血管造影が血餅溶解の進行を示さなかったときに、終了される。再疎通は、前に閉塞した部位を通る活発な前進流の回復するのに充分な血餅溶解と定義された。経皮移植血管形成術などの補助的血管内処置は、血栓が充分に溶解したと、あるいは、さらに血栓溶解が期待されないと、試験者が判断したときに行われた。血圧および心拍数は、ＳａｋＳＴＡＲ、Ｍ３.８またはＭ８.９の注入の前、その間および後に測定された。血液サンプルは、血管造影の前、終了時および６時間後に採取された。末梢血数、プロトロンビン時間（ＰＴ）、ａＰＴＴ、フィブリノーゲン、α₂−抗プラスミン、プラスミノーゲン、および生化学的な肝および腎機能試験がなされた。ＳａｋＳＴＡＲ−中和、Ｍ３.８−中和およびＭ８.９ −中和活性、抗−ＳａｋＳＴＡＲ、抗−Ｍ３.８および抗−Ｍ８.９ＩｇＧおよびＩｇＭが入院中および退院後に採取の血液サンプルについて周期的に測定された。臨床上の追跡は血栓の再発とアレルギー反応および大きい出血（すなわち、輸血または外科的コントロールの必要、＞１０％のヘマトクリットの低下または頭部内出血）などの副作用に焦点があてられた。血管造影によるＰＡＯ、期間１ −１２０日および長さ８−５０ｃｍの患者４−８人のグループ（４１−７３才）をＭ３.８、Ｍ８.９またはＳａｋＳＴＡＲで処置された。野生型ＳａｋＳＴＡＲ投与の１患者（ＷＡＬ）で２ｍｇボールス投与の５分後にアナフラキシーが生じた。注入を直ちに中止すると、血圧は、血漿増量剤の注入２０分以内に正常に回復した。この患者は表５−７の平均±ＳＥＭには計算されていない。Ｍ８.９投与の１患者で３０時間後に再閉塞が生じた。これは変種６.５ｍｇで処置された。この患者は、２−３週後に７.８μｇ／ｍｌのＭ８.９中和活性および２７０μ ｇ／ｍｌの特異的な抗−Ｍ８.９ＩｇＧを生じた。個々の患者の関連基礎特性を表５に示す。ＰＡＯの多くは大腿部膝窩筋レベルであった。すべて正常所在の血栓であった。２例の移植および２例の腸骨ステント閉塞を含んでいた。跛行困難が９人、慢性虚血残痛が２名、亜急性虚血が４名および急性虚血が１名あった。表６に個々の処置および結果を要約する。５.５−１３ｍｇの３.５−１１時間での動脈内注入で完全な再疎通が１３例、部分的再疎通が１例、改善なしが１例であった。補充の脈管内処置（主にＰＴＡ）が１２例でおこなわれ、１例での血栓溶解後、直ちに補充の外科処置がなされた。血管造影の終了後の血栓症は４例で生じた。最初の患者は３０分後にＭ８.９の６.５ｍｇで再処置され、成功であった。第２の患者は大動脈−腸骨筋のバイパス移植を受けた。第３の患者はγｔ −ＰＡ４０ｍｇで２０時間後に再疎通し、第４の患者は血栓が明白に吸収された。出血合併症はないか、あるいは右四頭筋内に血腫が生じた患者を除くと、血管造影穿刺部位に弱から中程度の血腫に限られていた。他の脈管内処置に関した合併症は、１例で血栓溶解剤の早期の休止を要する遠位塞栓があり、動脈切開がなされた。大腿動脈閉塞の１例で６時間以上、注入ＳａｋＳＴＡＲ８.０ｍｇに抵抗を示し、その後にＰＴＡにより処理できた（表６）。循環するフィブリノーゲン、プラスミノーゲンおよびα₂−抗プラスミノーゲンの値は、ＳａｋＳＴＡＲ分子の注入中、未変化で留まっており（表７）、これは、用いた量での薬剤の絶対的フィブリン特異性を表している。実質的インビボ・フィブリン消化が生じ、Ｄ−２量体レベルの上昇により証拠づけられた。動脈内ヘパリン治療はａＰＴＴを延長した（表７）。抗体−関連ＳａｋＳＴＡＲ−，Ｍ３.８−およびＭ８.９−中和活性および抗− ＳａｋＳＴＡＲ、Ｍ３.８−およびＭ８.９−特異ＩｇＧは開始時点および注入後１週間は低かった（表８）。第２週から中和活性レベルは、Ｍ３.８およびＭ８．９で処置した患者において、中央値が血漿ｍｌ当たり夫々２.９μｇおよび３. ３μｇ中和ＳａｋＳＴＡＲ変種に増加した。これは、ＳａｋＳＴＡＲ処置の患者における中央値のｍｌ当たり９.１μｇ中和野生型ＳａｋＳＴＡＲよりも有意に低かった（変種ｖｓ野生型についてＰ＝０.０３、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙランク・サム・テストによる）。ＳａｋＳＴＡＲ特異ＩｇＧレベルは、Ｍ３.８およびＭ８.９処置の患者において夫々５１および３１μｇ／ｍｌ血漿の中央値に増加し、これはＳａｋＳＴＡＲ処置患者における中央値よりも有意に低い（変種ｖｓ野生型についてＰ＝０.０１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙランク・サム・テストによる）。このように、末梢動脈閉塞の患者におけるＭ３.８およびＭ８.９の５.５−１３ｍｇの投与はＳａｋＳＴＡＲよりも有意に低い中和抗体および特異的抗−スタフィロキナーゼＩｇＧを誘発した。これらの変種は、タンパク質工学による組換えスタフィロキナーゼに対する液素性反応の低下があるだろうとの考えの証明を提供する。図の説明図１は、野生型スタフィロキナーゼおよびＳａｋＳＴＡＲのタンパク質配列。成熟のすべての長さのスタフィロキナーゼについてのＮＨ₂−末からの番号付を示す。試験した“アラニンについてチャージ・クラスター”変種を表した。図２は、ＳａｋＳＴＡＲに対する１７のネズミ・モノクローナル抗体パネルのエピトープ特異性を図形的に表す。参考文献 1．Collen D:On the regulation and control of fibrinolysis．Edward Kowal ski Memorial Lecture.Thromb Haemostas 43:77-79，1980. 2．Collen D，Lijnen HR:Basic and clinical aspects of fibrinolysis and th rombolysis．Blood 78:3114-3124，1991. 3．Collen D，Van de Werf F:Coronary thrombolysis with recombinant staphy lokinase in patients with evolving myocardial infarction.Circulation 87: 1850-1853，1993. 4．Vanderschueren S，Collen D:Immunogeniciteit van streptokinase enimpli caties voor gebruik．Tijdschr Geneesk 50:1639-1644，1994. 5．Lack CH:Staphylokinase:an activator of plasma protease．Nature 161:55 9，1948. 6．Lewis JH，Ferguson JH:A proteolytic enzyme system of the blood．III． Activation of dog serum profibrinolysin by staphylokinase．Am J Physiol 166:594，1951. 7．Winkler KC，DeWaart J，Grootsen C，Zegers BJM，Tellier NF，Vertegt CD ：Lysogenic conversion of staphylococci to loss of beta-toxin．J Gen Mic robiol39:321，1965. 8．Collen D，Lijnen HR:Staphylokinase，a fibrin specific plasminogenacti vator with therapeutic potential？Blood 84:680-686,1994. 9．Sako T，Sawaki S，Sakurai T，Ito S，Yoshizawa Y，Kondo I:Cloning and expression of the staphlokinase gene of Staphylococcus aureus in Escheri chia coli．Molec Gen Genet 190:271-277，1983. 10．Behnke D，Gerlach D:Cloning and expression in Escherichiacoli,Bacill us subtilis，and Streptococcus sanguis of a gene for staphylokinase a ba cterial plasminogen activator．Molec Gen Genet 210:528-534，1987. 11．Collen D，Silence K，Demarsin E，De Mol M，Lijnen HR:Isolation and c haracterization of natural and recombinant staphylokinase．Fibrinolysis 6:203-213，1992. 12．Sako T:Overproduction of staphylokinase in Escherichia coli and its characterization．Eur J Biochem 149:557-563，1985. 13．Gerlach D，Kraft R．Behnke D:Purification and characterization of th e bacterial plasminogen activator staphylokinase secreted by a recombina nt bacillus subtilis．Zbl Bakt Mikr Hyg 269:314,-322 1988. 14．Sako T，Tsuchida N:Nucleotide sequence of thestaphylokinase gene fro m Staphylococcus aureus．Nucleic Acids Res 11:7679-7693，1983. 15．Collen D，Zhao ZA，Holvoet P，Marynen P:Primary structure and gene s tructure of staphylokinase．Fibrinolysis 6:226-231，1992. Vetterman S，Collen D，Lijnen HR:Functional properties of recombinant st aphylokinase variants obtained by site-specific mutagenesis of methionin e 26．Biochim Biophys Acta 1204:235-242，1994. 17．Sakai M，Watanuki M，Matsuo O:Mechanism of fibrin-spectfic fibrinoly sis by staphylokinase:participation of α₂-plasmininhibitor.Biochem Biop hys Res Comm 162:830-837，1989. 18．Matsuo O，Okada K，Fukao H,Tomioka Y，Ueshima S，Watanuki M，Sakai M :Thrombolytic properties of staphylokinase．Blood 76:925-929，1990. 19．Lijnen HR，Vanlloef B．De Cock F，Okada K，Ueshima S，Matsuo O,Colle n D:On the mechanism of fibrin-specific plasminogen activation by staphy lokinase．J Biol Chem266:11826-11832，1991. 20．Lijnen HR，Van Hoef B，Matsuo O，Collen D:On themolecular interactio ns between plasminogen-staphylokinase，α₂-antiplasmin and fibrin．Bioch im Biophys Acta 1118:144-148，1992. 21．Silence K，Collen D，Lijnen HR:Interaction between staphylokinase, plasmin(ogen)and α₂-antiplasmin．Recycling of staphylokinase after neut ralization of the plasmin-staphylokinase complex by α₂-antiplasmin.J Bi ol Chem 268:9811-9816，1993. 22．Silence K，Collen D，Lijnen HR:Regulation by α₂-antiplasmin and fib rin of the activation of plasminogen with recombinant staphylokinase in plasma．Blood 82:1175-1183，1993. 23．Collen D，De Cock F，Vanlinthout I，Declerck PJ，Lijnen HR，Stassen JM:Comparative thrombolytic and immunogenic properties of staphylokinase and streptokinase．Fibrinolysis 6:232-242，1992. 24．Collen D，De Cock F，Stassen JM:Comparative immunogenicity and throm bolytic properties toward arterial and venous thrombi of streptokinase a nd recombinant staphylokinase in baboons．Circulation 87:996-1006，1993. Vanderschueren S，Van de Werf F，Michoel A，Collen D，Behnke D:High yiel d production and purification of recombinant staphylokinase for thrombol ytic therapy．Bio/technology 12:185-189,1994. 26．Declerck PJ，Vanderschueren S，Billiet J，Moreau H,Collen D:Prevalen ce and induction of circul atingantibodies against recombinant staphylok inase．Thromb Haemostas 71:129-133，1994. 27．Vanderschueren SMF，Stassen JM，CollenO:On the immunogenicity of rec ombinant staphylokinase in patients and in animal models．Thromb Haemost as 72:297-301，1994. 28．White H:Thrombolytic treatment for recurrent myocardial infarction.B r Med J 302:429-430，1991. B:Functional significance of NH₂-and COOH-terminal regions of staphyloki nase in plasminogen activation．Submitted. strategies and procedures．Methods Enzymol 73:3-46，1981. 31．de St．Groth SF，Scheidegger D:Production of monoclonal antibodies:s trategies and tactics．J Immunol Methods 35:1-21，1980. 32．Nakane PK，Kawaoi A:Peroxidase-labeled antibody．A new method for co njugation．J Histochem Cytochem 22:1084-1091，1974. 33．Anderson N，Potter M:Induction of plasmacell tumours in Balb-cmice w ith 2，6，10，14 tetramethylpentadecane(pristane)．Nature 222:994-995，1 969. 34．Ey PL，Prowse SJ，Jenkin CR:Isolation of pure IgG₁，IgG_2a and IgG_2b immunoglobulins from mouse serum using proteinA-Sepharose. Immunochemistry 15:429-436,1978. The integration of surface plasmon resonance detection，general biospeci fic interface chemistry and microfluidics into one analytical system．Ad v Biosensors 2:291-336，1992. carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction a nalysis in surface plasmon resonance sensors．Anal Biochem 198:268-277， 1991. 37．BIAcore system manual，5-2，Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden. 38．Karlsson R，Michaelsson A，Mattsson L:Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical sys tem．J Immunol Methods 145:229-240，1991. 39．Stanssens P，Opsomer C，Mc Keown Y，Kramer W，Zabeau M，Friz MJ:Effi cient oligonucleotide-directed construction of mutations in expression v ectors by the gapped duplex DNA method using alternating selectable mark ers．Nucleic Acids Res 17:4441-4454,1989. 40．Deutsch DG,Mertz ET:Plasminogen:purification from human plasma by af finity chromatography．Science 170:1095-1096，1970. 41．SilenceK，Hartmann M，GUhrs KH Gase A，Schlott B,Collen D，Lijnen HR :Structure-function relationships in staphylokinase as revealed by “clu stered-charge-to-alanine”mutagenesis．J Biol Chem(in press). 42．Bradford MM:A rapid and sensitive method for the quantitation of mic rogram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye bindi ng．Anal Biochem 72:248，1976. 43．De Clerck F，Beetens J，de Chaffoy de Courcelles D，Freyne E,Janssen PA:R68070:thromboxane A2 synthetase inhibition and thromboxane A2/prost aglandin endoperoxide receptor blockade combined in one molecule．I．Bio chemical profile in vitro．Thromb Haemost 61:35-42,1989. 44．Stassen JM，Vanlinthout I，Lijnen HR，Collen D: A hamster pulmonary embolism model for the evaluation of the thrombolytic and pharmacokineti c properties of thrombolytic agents．Fibrinolysis 4(Suppl 2):15-21，1990 . 45．Giles AR:Guidelines for the use of animals in biomedical research.Th romb Haemost 58:1078-1084,1987. 46．Vanderschueren S，Stockx L，Wilms G，Lacroix H,Verhaeghe R，Vermylen J，Collen D:Thromboly tictherapy of peripheral arterial occlusion with recombinant staphylokinase．Circulation 92:2050 2057，1995. 47．Vanderschueren S，Barrios L，Kerdsinchai P，Van den Heuvel P,Hermans L，Vrolix M，De Man F，Benit E，Muyldermans L，Collen D，Van deWerf F:A randomized trial of recombinant staphylokinase versus alteplase for coro nary artery patency in acute myocardial infarction.Circulation 92:2044-2 049，1995.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION New staphylokinase derivatives The present invention relates to novel staphylokinase derivatives having reduced immunogenicity, , Use in the treatment of arterial thrombosis and production of a pharmaceutical composition for the treatment of arterial thrombosis Agent. More particularly, the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of myocardial infarction It relates to using engineering staphylokinase derivatives. Thrombotic complications of cardiovascular disease are one of the leading causes of death and dysfunction, and Thus, thrombosis (ie, the pharmacological insolubility of a thrombus) is associated with myocardial infarction, cerebral thrombosis and Significantly affects the development of life-threatening diseases such as vascular embolism. Thrombolytics Plasminogen, the inactive proenzyme of the fibrinolytic system in the blood, A plasminogen activator that converts to the plasmin, a protein-soluble enzyme . Plasmin dissolves fibrin in the thrombus, but inactivates normal factors in the hemostatic system, It can cause a so-called "dissolution state". However, physiological fibrinolysis , Tissue-type plasminogen activator, fibrin, plasmin (plasmin Nogen) and α_Two-As a result of the special intermolecular interaction of antiplasmin, It is in the twirline orientation (1, 2). Recently, six types of thrombolytic agents have been clinically used in patients with acute myocardial infarction. Floor testing is permitted. They are streptokinase, urokinase, recombinant Tissue type plasminogen activator (rt-PA) or a derivative thereof, Anisolated plasminogen / staphylokinase / activator complex (APSAC), recombinant single-chain urokinase-type plasminogen activator -(Rscu-PA, recombinant pro-urokinase) and recombinant staphylokiner Ze (Sak) (2, 3). In patients with acute myocardial infarction, Reduction, retention of ventricular function and reduced mortality are due to streptokinase, rt-PA and And after treatment with APSAC (2). One of the most commonly used thrombolytic agents for treatment is spread kinase. This is the M secreted by β-hemolytic streptococci._γ45,000 proteins It is. However, its administration is associated with extensive systemic fibrinogen breakdown, and However, from about 50% coronary recanalization within 90 minutes, progressive acute myocardial infarction The effect on coronary thrombosis in patients with is limited (2). In addition, spray Putokinase causes an allergic reaction in about 5% of treated patients, Consistently produces specialized antibodies that cannot be reused for several years (4). Staphylokinase, produced from a strain of Staphylococcus aureus Proteins have been known to have profibrinolytic properties more than 40 years ago (5-7 ), And appears to be a powerful thrombolytic agent in patients with acute myocardial infarction (8). S The tafirokinase gene is derived from bacteriophage sakφC (9), sak42 D (10) and genomic DNA of lysogenic Staphylococcus aureus (sakSTA R) (11). This is due to the λPR in Escherichia coli. Under the control of the promoter and its own translation signal, and in the Bacillus sub In tilis or Escherichia coli, its native promoter and translation signal The expression of the gene product in the extracellular part or culture medium, respectively, is also regulated (10-13). The staphylokinase gene is the full-length native staphylokinase NH_Two Encoding a 163 amino acid protein having 28 amino acids corresponding to the last residue (10, 14, 15). Protein sequence of wild-type variant SakSTAR (15 ) Are shown in FIG. Coding of the sakφC, sak42D and sakSTAR genes Only four nucleotide differences were observed in the It was a mutation (10, 14, 15). Some molecular forms of staphylokinase have slightly different Mγ (16,50 0-18,000, on SDS-PAGE) and purified at isoelectric point (11 -13). The low Mγ derivative of mature staphylokinase is 6 (Sak-Δ6) or 10 (Sak-Δ10) NH_Two-Obtained by deleting the last amino acid. In buffer medium Mature staphylo on interaction with plasmin (plasminogen) Kinase (NH_Two-Ser-Ser-Ser) quickly and quantitatively k −Δ10 (NH_Two-Lys-Gly-Asp-). Mature staphylo Kinase and Sak-Δ10 were shown to have the same fibrinolytic activity (11, 12). Amino acid at position 26 is involved in the activity of plasminogen by staphylokinase. Seems critical. In fact, the special Met at position 26 was replaced by Arg and Val Substitution results in loss of functional activity, whereas substitution with Leu or Cys reduces activity. Has little or no effect (16). Single amino acid exchange suddenly changes This divergent result does not result in significant changes in the solution structure of the heterologous protein. The mechanism is a mystery. Staphylokinase in plasma medium without associated fibrinogen degradation The fibrin clot can be lysed (17-19). This staphylokinase fib Phosphorus specificity is determined by the plasmin-staphylokinase complex binding to fibrin. α_TwoThe result of reduced inhibition by antiplasmin, α_Two-Antiplasmy Inhibition and α_TwoCirculating plasminogen by antiplasmin Following the prevention of the conversion of tafilokinase to plasmin staphylokinase, Recycling of plasmin staphylokinase from rasmin staphylokinase (20-22). In some experimental animal models, staphylokiner Is as strong as streptokinase in lysing whole blood or plasma clots. Despite this, the dissolution of platelet-rich or regressed thrombi is significantly more significant. It is powerful (23, 24). The promising results obtained with staphylokinase in animal models of thrombosis are Is the basis for a pilot-scale test for patients with refractory myocardial infarction (3, 25). Five patients with acute myocardial infarction received recombinant staphylokinase (SakSTAR ) Intravenous injection of 10 mg over 30 minutes, coronal coronary angiography in 4 patients Arterial recanalization was observed within 40 minutes. Plasma fibrinogen and α_Two-A The nipplasmin level was not affected (90-95% of the original value at 40 minutes) and No Luggy reaction was observed (3). The next set of five patients with acute coronary obstruction Of staphylokinase (SakSTAR) 10 mg over 30 minutes pulse Administration resulted in recanalization in all patients within 20 minutes, with associated fibrinogen Was not degraded (25). 24-hour control angiography maintains recanalization It was shown. Compares the immunogenicity of staphylokinase (SakSTAR) with streptokinase In comparison dogs (23) and baboons (24) were tested. In aggregates, these Animal data show that staphylokinase is more immunogenic than streptokinase. Suggested low. However, over 30 minutes more than 10mg of staphylokinase In the first 5 patients injected intravenously, staphylokinase (SakSTAR) Neutralizing antibody titers against were low at the start and by day 6 of injection, but were lower at 14-3. High titer of antibody in 5 days (12-42 g / ml staphylokinase neutralizing titer of plasma ) Was continuously observed (3). This result is 5 people in the second pilot test (25). The first observations in humans regarding immunogenicity are animal It was not as exciting as the experience in the experiment. Thus, the spread Like kinases, administration of staphylokinase will be limited to single use. Only And cross-reaction of antibodies to staphylokinase and spread kinase Incompatibility (26,27) means that administration of both substances will not be mutually exclusive Suggest that. The intrinsic immunogenicity of streptokinase and staphylokinase is Prevent limited use. Patients with previously high antibody titers have these thrombolytic effects Not only do they not respond to Blurred anaphylaxis may occur. Streptokinase and staphy Since rokinase is an atypical protein, its immunogenicity is It is not clear if it can be reduced. In fact, active low molecular weight proteins from streptokinase No successful cases of fragmentation have been reported. Staphylokinase And NH_TwoDeletion of the last 17 amino acids or two amino acids of the COOH-terminal In addition, the molecule is highly resistant to inactivation by site-directed mutagenesis. (25, 29). Nevertheless, surprisingly, the wild-type staphylokinase variant Sak STAR (8,15) shows three non-overlapping immunodominant epitopes without inactivation of the molecule And at least two of which can be eliminated by special site-directed mutagenesis. This These genetically engineered staphylokinase variants are more abundant than wild-type staphylokinase. Activates antibodies elicited in patients treated with wild-type staphylokinase Low and significantly lower immunogenicity, which is consistent with rabbit and baboon models and peripheral motility Revealed in patients with pulse obstruction. The present invention is directed to a staphylokinase having reduced immunogenicity as compared to wild-type staphylokinase. It relates to a filokinase derivative. This derivative is basically a wild-type Has the amino acid sequence of the enzyme or its modification, but destroys the biological activity of the derivative Without doing so, at least one epitope has been lost. One fruit of the present invention In an embodiment, the derivative has essentially the amino acid sequence shown in FIG. The epitope corresponding to one or more amino acids in one or more underlined clusters It has been replaced with another amino acid that changes. Desirably, amino acids are replaced with alanine Have been. By changing the epitopes, the three epitope clusters I, I Reactivity of derivatives with monoclonal antibody panels to one or more of I and III Decrease. This is achieved by replacing the wild-type amino acid with alanine. This shows that the antigenicity of rokinase is reduced. The invention is particularly directed to the amino acid at underlined cluster 8, Ly at position 74 in FIG. s, Glu at position 75, and Arg at position 77 alter the corresponding epitope Staphylokinase derivative M8 having an amino acid sequence substituted with nin, figure 1, the amino acid at underlined cluster 3, Lys at position 35 and G at position 38 has an amino acid sequence in which lu is substituted with alanine which alters the corresponding epitope. The staphylokinase derivative M3, shown in FIG. No acid, Glu at position 80 and Asp at position 82 alter the corresponding epitope Staphylokinase derivative M9 having an amino acid sequence substituted with nin, figure 1, the amino acids at underlined clusters 3 and 8, Lys at position 35, position 38 Glu at position 74, Lys at position 74, Glu at position 75 and Arg at position 77 correspond to Staphylo having an amino acid sequence substituted with alanine altering pitopes Kinase derivative M3.8 and in FIG. 1 the underlined clusters 8 and 9 Amino acids, Lys at position 74, Glu at position 75, Arg at position 77, Glu at position 80 And Asp at position 82 are replaced with an alanine altering the corresponding epitope The present invention relates to a staphylokinase derivative M8.9 having an amino acid sequence. Where M 3.8 and M8.9 are double mutants with two disrupted epitopes. The present invention relates to genetically engineered staphylokinase with reduced immunogenicity Variant practically replaces streptokinase or wild-type staphylokinase This shows that the resulting thrombolytic agent can be obtained. The present invention also relates to portions of the coding sequence that provide for the biological activity of staphylokinase. To produce a derivative of the invention by making a DNA fragment containing at least On how to build. That is, one or more codons of a wild-type amino acid In vitro site-specific modifications on DNA fragments to replace with acid codons Performing dysplasia, cloning the mutant DNA fragment in a suitable vector, The appropriate host cells are transformed or transfected with the vector and the DNA The host cells under conditions suitable for expressing the fragment. Preferably, DNA The fragment is the 453 bp EcoRI- of the plasmid pMEX602SAK. HindIII fragment, plasmid pMa / c and repair deleted E. coli. In vitro site-directed mutagenesis using E. coli strain WK6Muts The mutant DNA fragment was obtained by E. coli reotide-specific mutagenesis. coli Clone in strain WK6. The present invention also provides at least one of the inventive studies for the treatment of arterial thrombosis. Pharmaceutical compositions comprising rokinase derivatives together with suitable excipients. As an active ingredient Pharmaceutical compositions containing reduced immunogenic staphylokinase variants are useful in humans and And in the form of a powder or solution in the treatment of arterial thrombosis in animals and veins It is used by intra- and intra-arterial administration. These compositions are active and neutral Pharmaceutically acceptable excipients (aqueous or non-aqueous solvents, stabilizers, emulsifiers, detergents, Additives, etc.) and, if necessary, a dye (eg, mixing, Dissolution). The concentration of the active ingredient in the therapeutic composition is between 0.1-10. It varies widely depending on the nature of the disease and the mode of administration. The activity to be administered The amount of the sexual component ranges from 0.05 to 1.0 mg per body weight. Furthermore, the present invention relates to the induction of staphylokinase for the treatment of arterial thrombosis, especially myocardial infarction. Use of a conductor and a pharmaceutical composition for the treatment of arterial thrombosis, especially myocardial infarction The use of staphylokinase derivatives in the manufacture of products. Above and below, "derivative", "variant" and "variant" are interchangeable Used as The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, which do not limit the scope of the invention. . Based on the present invention, numerous modifications and improvements will be apparent to those skilled in the art. U. Random mutagenesis starting from combination variant 3.8 and combination variant 8.9 Produces other variants with reduced immunogenicity and possible increased functional activity But another mutagenesis in the epitope neutralizing cluster Will result in other variants with reduced immunogenicity.Example 1 Epitope mapping of wild-type staphylokinase Against 17 murine wild-type staphylokinase (SakSTAR variant) The epitope specificity of the monoclonal antibody was determined using a BIAcore ™ instrument (Pharma Real-time biospecific interaction analysis using cia, Biosensor AB, Uppsala, Sweden) (BIA). Monoclonal antibodies to SakSTAR c mice were treated with 10 μg SakSTAR skin in complete Freund's adjuvant. 10 μg in incomplete Freund's adjuvant by lower injection, then 2 weeks later Immunized by intraperitoneal injection of SakSTAR. At least every 6 weeks 4 and 2 days prior to cell fusion, 10 μg SakSTA in saline. R is administered intraperitoneally to mice. The spleen cells were excised and Fazekas de St. Groth you And P3X63-Ag.8-6.5.3 myero according to Scheidegger (31) I do. After selection in hypoxanthine, aminopterin, thymidine medium, the supernatant was Using a microtiter plate coated with staphylokinase, one-site non- Screened for specific antigen production with competitive micro-ELISA. The bound immunoglobulin is horseradish peroxidase (HP) -bound Detected with rabbit anti-mouse IgG. Positive clone, Pristane primary immunization BA Used for production of ascites fluid in LB / c mice. IgG content of monoclonal antibody Fractions were analyzed by affinity chromatography on protein A-Sepharose. And purified from ascites. This biospecific interaction assay uses labels based on surface plasmon resonance. Interactions can be measured directly in real time without having to do so (35). Stuffy Rokinase (SakSTAR) is an amine binding kit (Pharmacia Biosensor AB) And immobilized on the surface of the sensor chip CM5 as recommended by the manufacturer. . By this method, the primary amino group in the ligand is replaced with the carboxyl group of the sensor chip. It binds to the surface of the methylated dextran (36). Immobilization was performed at pH 5.0 for 10 from a 10 μg / ml protein solution in mM Na-acetate for 6 minutes At a flow rate of 5 μl / min. This is a staphylokinase molecule (approximately 0.0 7 pmole / mm^Two1,000-1500 RU (resonance unit) Binding occurred (37). Second interactor (analyte, ie, monochromator) Antibody) was injected into the solution of the sensor. Free analyte concentration passes through the sensor surface The solution was kept constant by a continuous flow of 20 ° C solution. 10 mM HEPES, 3 . In 4 mM EDTA, 0.15 M NaCl and 0.005% detergent, p H7.2 at least 4 concentrations for each analyte (range 0-400 nM or 0-50 μM) M) was injected into the relevant phase at a flow rate of 5 μl / min for 6 minutes. Sample with buffer For 6-30 minutes at a flow rate of 5 μl / min. After each cycle, the sensor chip The surface of the pump was regenerated by injection of 5 μl of 15 mM HCl. Association (k_ass) And dissociation (k_diss) Ratio constants as described elsewhere (38) -Derived from gram. k_assAnd k_dissEquilibrium-related constant (K_A ) Shows the binding of 17 monoclonal antibodies to be tested to wild-type staphylokinase. 0.6 and> 25 × 10⁹M^-1(Median 10^TenM^-1) Was in the range ( Table 1). In Table 1, the "ID" column represents various staphylokinase derivatives. “17 G11 "," 26A2 ", etc. represent the indicated epitope clusters I, II, II. Means a monoclonal antibody binding to I. In the "Variants" column, the amino acid Shows the mutated amino acids and their positions in the one letter code. Epitope class Tar I was determined by antibodies 17G11, 26A2, 30A2, 2B12 and 3G10. Recognized, Epitope Cluster II was derived from antibodies 29C1, 18F12, 14H5, 28H4, 20D6, 32B2 and 7F10, Raster III was conjugated to antibodies 7H11, 25E1, 40C8, 24C4 and 1A10. More recognized. Monoclonal antibodies against isolated epitopes bind independently and are closely related Monoclonal antibodies directed against the respective epitope interfere with each binding. Therefore, The epitope specificity of panel monoclonal antibodies is It is most easily measured by examining the activity of a set of clonal antibodies. Real time Bio-Specific Interaction Analysis (BIA) is a method for binding staples to the surface of a sensor chip. To determine the competitive binding of a set of monoclonal antibodies to irokinase Can be. The analysis was performed as described in the usage document 101 (Pharmacia Biosensor AB). Was. In the combination binding test, as shown in FIG. It was divided into three groups representing three non-overlapping epitopes for the antigen. These d The independence of the pitopes was determined by the monoclonal antibodies 26A2, 28H4 and 24C4. This was confirmed by direct indication of the additional bond. As shown in Table 1, antibodies are characterized by their epitopes. Sequenced according to isomerism.Example 2 Construction of a variant of staphylokinase "Alanine-charge cluster" And mapping “Charge cluster for alanine” scan shows hydrophobic char The target was a cluster of di-amino acids. Staphylokinase (SakSTAR ) Are 45 charged amino acids (2His, 14Glu, 8Asp, 1Arg, etc.) And 20Lys). These charged residues, as summarized in FIG. Mutated to Ala in clusters of 2 or 3 amino acids. In FIG. 1, 21 mutants in which the underlined charge amino acid is replaced by alanine Are indicated by short vertical lines in the cluster. Mutants are made by site-directed mutagenesis and are described in E. coli as described below. Is expressed in Restriction enzymes are Pharmacia, Uppsala, Sweden or Boehringer Mannhei m (Mannheim, Germany). T4 DNA ligase, E. coli DNA Kournow fragment of remelase I and alkaline phosphatase were Ringer Obtained from Mannheim. Oligonucleotide-specific mutagenesis system and p Ma / c plasmid was provided by Corvas (Ghent, Belgium) (39). Expression The vector pMEX602SakB is for Institut fur Molekulare Biotechnologie, Provided by Jena and Germany (25). M123K07 perperphage is P romega (Leiden, The Netherlands). Luria Broth Growth Medium is Life Technologies (Merelbeke, Belgium). Plasminogen is separately Purified from human plasma as described (40). Enzymatic reactions were performed under conditions recommended by the supplier. Plasmid DNA is QIAGEN -Use a purification protocol (provided by Westburg, Leusden, The Netherlands) Released. E. coli transformation was performed using the calcium phosphate method. D The NA sequence assay was performed by dideoxy chain termination reaction and automated laser monofluorescence ALF (trademark). ) (Pharmacia). Mutant D up to K86, E88 (M10) 5, site-directed mutagenesis for K6 (M20) was modified using pMa / c. It was performed using the double-deleted E. coli WK6MutS. Plasmid pMa / Propagation of c or derivative, production and expression of single-stranded DNA is performed by E. coli WK6. (39). Mutations up to K134, K135, K136 (M19) Body D93, K94 (M11) was obtained from Institut fur Molekulare Biotec as described above. hnologie Jena, built in Germany. Chromogenic substrate (S2403) L- Pyroglutamyl-L-phenylalanyl-L-lysine-P-nitroanaline hydrochloride Salt was purchased from Chromogenix.¹²⁵I-labeled fibrinogen is purchased from Amersham. Entered. 453 bp EcoRI-HindII containing the entire coding region of SakSTAR The I fragment was from plasmid pMEX602SakB (ampinline resistance). From the pMc5-8 plasmid (chloramphe) resulting in pMC-STAR. Nicole resistance) at the EcoRI-HindIII position. In vitro For site-directed mutagenesis, the single-stranded DNA of this construct was converted to pM in E. coli. Transformation of c-STAR and of overnight culture of helper phage M13K07 Manufactured by injection. 4 hours after injection, cell PEG-sedimentation and phenol-cloth Separated from the medium by roform extraction. Then, the single-chain pMc-STAR was Generate pMa (EcoRI-HindIII) vector DNA and restriction sites. Suitable 28-48 base synthetic oligos with or without silent mutations Hybridized with nucleotides. The extension reaction is performed using the K of the described DNA polymerase. Performed on the Lenow fragment. Transformation of E. coli WK6MutS And after ampicillin sorting, colonies are grown on nitrocellulose membrane , Are denatured in situ, and the DNA is each radiolabeled mutated oligonucleotide (Oligonucleotide 20-30ng T4 polynucleotide kinase label For [γ³²P] -ATP 1.5 × 10⁸cpm) at room temperature overnight Bridged. The filtrate was washed with 0.1% SDS and 2 × SSC, 1 × SSC, 0.2 × Washing was performed at 42 ° C. using a solution containing SSC and 0.1 × SSC. Plasmid DNA Was extracted from each positive clone of the bacterial culture type and analyzed by restriction enzyme digestion. Place The desired mutation was determined by sequence testing of the complete coding sequence using ALF ™. confirmed. The mutated HindIII-EcoRI fragment contains the pTaq promoter. Ligated into the pMEX602SakB expression vector. Mutant proteins , In cells and in E. coli WK6 cells transformed with this vector. Manufactured in dissolved form. Variants are used for cation exchange and hydrophobic interaction chromatography. Purified from sonicated bacterial extracts using matography (25). The SakSTAR mutant has a yield in the range of 10-80 mg / l and a starting material of 15%. Obtained as -88% recovery. Purified product was run on a non-reducing 10-15% gradient gel. Pure on electrophoresis (not shown). NH_Two-Amino acid analysis for mature The Ser-Ser-Ser-Phe-Asp sequence of Tafilokinase was confirmed. More details on the biochemical properties of these staphylokinase variants will be reported separately (41). Protein concentration was measured by Bradford. SakSTAR solution line The fibrinolytic ability was determined by comparing the SakSTAR solution with 80 μl and the glu-plasminogen solution with Using 0 μl of the mixture (final concentration 0.5 mM) in microtiter plates Chromogenic substrate assay performed as described above. Incubation at 37 ° C for 30 minutes After the addition of plasminogen, the addition of 30 pl of S2403 (final concentration) (1 μM) and absorption at 405 mm. Activity is internal standard (Lot STAN5) compared to homo unit (HU). this is, 100,000 HU activity / mg protein as measured by amino acid composition Sex is assigned (11). SDS-PAGE was performed on 10-15% gradient gels and Performed on Phast System ™ (Pharmacia, Uppsala, Sweden) using blue and blue coloration Was done. Reduction of the sample is due to the presence of 1% SDS and 1% dithioerythritol This was done by heating down at 100 ° C. for 3 minutes. Construction, production and purification of mutants M3.8 and M8.9 were performed as described below. Was. Oligonucleotides used for construction 5'-ATAGCAATGCATTTCCTGCACTATCAAC-3 '(M3) , 5'-CTAATTCAACTCTGCAACGCTGCATATGCT GTCGCATC-3 '(M8) and 5'-TTTGCGCTTGGCGCCA ATGCAACTACTCTAAACTCTTTATAT-3 '(M9) is Normally synthesized by rmacia Biotech. In the construction of mutant M3.8, single chain pMc-STAR and pMa5-8 EcoRI-HindIII fragment produces gapped double-sided DNA molecules Used for This molecule is a 28-base synthetic oligonucleotide M3 (Nsi I restriction site). The extension reaction was performed using the described DNA polymer. Performed with the Klenow fragment of the lase and ligase. E. coliW After transduction of K6MutS and ampicillin selection, 81 colonies were nitro Grown on cellulose membrane, denatured in situ, and the DNA was Labeled mutant oligonucleotides (20-30 ng of T4 polynucleotide [Γ for labeling kinases³²P] -ATP 1.5 × 10⁸cpm) And hybridized overnight at room temperature. The filtrate was washed with 0.1% SDS and 2 × S SC, 1 × SSC, 0.2 × SSC, 0.1 × SSC at 42 ° C. washed. DNA of one clone selected from 16 positives was extracted from 150 ml of bacterial culture. Manufactured and analyzed by restriction digestion with Nsil and Pvul. M3 The mutation (pMa-STAR3) was constructed using ALF ™ to encode the complete coding region. The area was confirmed by sequence test. The single-stranded DNA was then converted to E.co. Produced by transformation of pMa-STAR3 in li. Single chain pMa-STAR3 With pMc (EcoRI-HindIII) and NdeI restriction as described above. Hybridized with 40 synthetic oligonucleotides containing the site. E.co After transformation of liWK6MutS and chloramphenicol selection, 100 cells Ronnie is grown on nitrocellulose membrane and labeled M8 oligonucleotide and hybrid Redidized. Grow positive clones (2 out of 7) and generate 1 positive clone Analysis by restriction enzyme digestion (NsiI-HindIII and NdeI). Was. The double mutant M3.8 is incorporated into the pMEX602SakB expression vector. Of the 12 mini-productions of DNA, 6 had a positive restriction pattern. Out of that clone One (pMEXSakSTAR.M38) was sequenced and IPTG induced tac Under the control of a promoter and 2 Shine-Dalgarno sequences in tandem Used to produce mutant M3.8. E. col transformed with the recombinant plasmid pMEXSakSTAR.M38 100 μl of the iWK6 cell suspension was added to L containing 100 μg / ml ampicillin. Incubated in 100 ml of B medium (Gibco / BRL). Mix one Incubate at 37 ° C with shaking at 200 rpm overnight, and The cell density was in absorption units. Separate 20 ml, and add 100 μg / ml Transferred to 21 volumes (in 51 flasks) of LB medium containing phosphorus. 200 μM mixture Incubated at 37 ° C. for 3 hours with agitation before the addition of IPTG. this Was for induction of M3.8 and allowed to proceed for 4 hours. Place cells at 4,000 for 20 minutes Collect by centrifugation at 0 rpm and resuspend in 1/10 volume of 0.01M phosphate buffer At 0 ° C. by sonication. Remove cell debris for 30 minutes at 20,000 rpm Removed by centrifugation and stored the supernatant at -20 ° C until use. Cell lysate (volume 21) collected from bacterial culture 20-301 was adjusted to pH 5.9. And sterile filtered through a 0.22 μm Sartorius filter. M NaOH and sterile 0.01 M phosphate buffer, flow rate 1 Apply a 5 x 25 cm column of SP-Sepharose at 2 ml / min and 4 ° C in the bed. Was. The column was washed with buffer 2-31, 500 ml of a gradient 0-1M and 1-2M. And eluted at 4 ° C. with a flow rate of 10 ml / min. M3.8 containing fract The solution is localized by SDS gel electrophoresis, but collected (about 200 ml), sterilized, Dialysed against 0.01M phosphate buffer 151, pH 8.0, 4 ° C. Dialyzed substance Is centrifuged at 4000 rpm for 30 minutes, sterilized by filtration, at a flow rate of 2.5 × 12 cm. Applied to the column. 0.5 M NaOH and sterile 0.01 phosphate buffer, pH 8.0, flow rate 3 ml / min, pre-adjusted at 4 ° C., Q-Sepharose column Wash with about 600 ml of 0.01M phosphate buffer at pH 8.0 at a flow rate of 8 ml / min. Gradient 0-0.17M 30ml, 0.17-0.2M 100ml and 0.2- Elution was performed with 200 ml of 1.5 M salt at a flow rate of 4 ml / min. Fraction containing M3.8 Is localized by SDS gel electrophoresis, but is collected and brought to a protein concentration of 1 mg / m and the material was filter sterilized through a 0.22 μm Millipore filter. The yield of 3 preparations of M3.8 has a specific activity of 45,000 ± 5,200 HU / mg. 80 ± 25 mg of pure protein (mean ± SD). In the construction of mutant M8.9, single chain pMc-STAR and pMa5-8 EcoRI-HindIII fragment produces gapped double-sided DNA molecules Used to This molecule is a 42-base synthetic oligonucleotide M9 (Ns (containing the iI restriction site). The extension reaction was performed using the DNA Performed with Klenow fragment of melase and ligase. E. coli After transduction of WK6Muts and ampicillin selection, colonies were colonized with nitrose. Grown on reulose membrane, denatured in situ, and the DNA is radiolabeled. Different oligonucleotides (20-30 ng of T4 polynucleotide [Γ³²P] -ATP 1.5 × 10⁸cpm) And hybridized overnight at room temperature. The filtrate was washed with 0.1% SDS and 2 × SSC, Washed at 42 ° C. using a solution containing 1 × SSC, 0.2 × SSC, 0.1 × SSC . The DNA (pMA-STAR9) of two clones selected from 4 positives was ALF ™ was used for nucleotide sequence analysis. pMa-STA The EcoRI-HindIII insert from R9 was inserted into the pMEX602SakB expression vector. Was contacted. Radiolabeled M oligonucleotide using clone as probe Was screened by in situ hybridization. One clone pMEXSakSTAR.M9 has been characterized by nucleotide sequence analysis. Used to construct mutant M8.9. To construct M8.9, mutation 8 was introduced into the polymerase chain reaction (PC R). PCR was performed using 1 μg of each of the 5U enzyme and the following primers. And performed in a total volume of 100 pl. Oligonucleotide II = 5'-CAGGA AACAGAATTCAGGAG, oligonucleotide II = 5'-TATATA ATATTCGACATAGATTATTAATTTTT-3 ', Oligonucleotide Pide IV = 5'-TATCCCGGGGCATTAGATGCGACAGCATAT GCAGCGTTTGCAGTA-3 ′ and oligonucleotide V = 5′-CA AAACAGCCCAAGCTTCATTTCATCAGC-3 ′. dATP, d The concentration of CTP, dGTP and dTTP was 200 μM. Denaturation 9 per minute At 4 ° C., annealing was performed at 55 ° C. for 2 minutes and extension was performed at 72 ° C. for 1.5 minutes. 3 After 0 cycles, the samples were incubated for 10 minutes at 72 ° C and cooled to 4 ° C. the first 2 ng of pMEXSakSTAR.M9 in the PCR reaction Amplification was performed using primers IV and V as primers. Sma PCR amplicon I and HindIII, digested with Prep-A-gene kit (Bio-Rad Lad boratories, Hercules, CA, USA) on a 1.5% agarose gel. Later purified. The obtained fragment is subjected to a high-speed DNA ligation kit (Boehringer Mannh eim) using pUC18 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) with SmaI-H. Cloned into the indIII site. After transformation in E. coli WK6 cells, DNA from 12 colonies was prepared and digested with EcoRI and HindIII. When assembled, all 12 produced fragments of about 230 base pairs. these One of the DNAs (pUC18-M89Δ) was used for cloning the second PCR product (See below). Second PCR primers oligonucleotides II and III The test was performed with 2 ng of pMEXSakSTAR.M9. PCR reaction product Was digested with Sspl and EcoRI and further purified as described above. Got The fragment was ligated to the SmaI-EcoRI site of pUC18-M89Δ. . After transformation in E. coli WK6 cells, six clones were used for DNA production. Selected. 5 out of 6 contains approximately 453 salts after digestion with EcoRI and HindIII. A base pair fragment was generated. A fragment encoding this whole mutant M8.9 The EcoRI-HindIII site of the expression vector pMEX602SakB Cloned. After transformation of E. coli WK6 cells, DN from 6 colonies A is an EcoRI that generates a fragment of about 453 base pairs in all cases. And by digestion with HindIII. One of these DNAs Characterized by nucleotide sequence analysis. 100 ml of LB medium (GIBCO / BRL) containing μg / ml of ampicillin E. coli W transformed with the recombinant plasmid pMEXSakSTAR.M89 The cells were inoculated with 100 μl of a suspension of K6 cells. Mix the mixture at 37 ° C overnight at 200 rpm Incubate with agitation to achieve a cell density of about 5 absorption units at 600 nm. Was. 4 ml was fractionated, and “Terrific containing 150 μg / ml ampicillin was used. Used to inoculate 21 volumes (in SL baffle flasks) of Broth "medium Was. The culture was incubated for 20 hours at 37 ° C., 140 rpm, about 4.10⁹ A final cell concentration of cells / ml was reached. Centrifuge cells at 4,000 rpm for 20 minutes Collected in isolation, resuspended in 1/5 volume of 0.01M phosphate buffer, pH 6.5, above 0 ° C. Broken by sonication. The pH was adjusted to 5.8 and the cell debris was Remove by centrifugation at 000 rpm and store the supernatant at -20 ° C until use. Was. The collected cell lysate (1,800 ml) was adjusted to pH 5.8 and 0.5 M NaO H and fresh 0.01 M phosphate, pre-conditioned with 2.5 M NaCl buffer. PH 7.5, flow rate 2 ml / min, 4 ° C., 2.5 × 20 cm of SP-Sepharose Applied to the column. The column is washed with 500 μl of buffer and a gradient of 0-1 M in 200 ml At a flow rate of 6 ml / min. The collected M8.9 fraction is identified by SDS gel electrophoresis, Adjusted to 2.5M with aCl, 0.5M NaOH and fresh 0.01M phosphoric acid Salt, pre-adjusted to pH 7.5 with 2.5 M NaCl buffer, flow rate 2 ml / min Hydrophobic interaction on a 2.5 × 20 cm column of phenyl-sepharose at 4 ° C. Chromatography. The column was washed with about 500 ml of buffer, and Eluted with M phosphate buffer, pH 6.5. The fraction containing M8.9 was SD Localized by S-gel electrophoresis, but collected and collected in 0.01 M phosphate buffer 21, pH 9 . Dialysis at 0. The dialyzed material was centrifuged at 4000 rpm for 30 minutes, and 5M NaOH and fresh 0.01M phosphate buffer, pH 9.0, flow rate 2ml / min Pre-adjusted at 4 ° C. to a 1.6 × 5 cm column with Q-Sepharose flow rate I took it. Wash the column with about 150 ml of 0.01 M phosphate buffer at pH 9.0. Eluted with a gradient of 0-0.17M NaCl in 100 ml salt at a flow rate of 4 ml / min. The fraction containing M8.9 was localized by SDS gel electrophoresis. The protein concentration was adjusted to 1 mg / ml and the substance was filtered to 0.22 μm Millipore filter. And sterilized by filtration. The yield of 3 preparations of M8.9 was 51,000 ± 3, specific activity. 73 ± 17 mg of pure protein with 500 HU / mg (mean ± SD) . Table 3 shows the fibrinolytic activity of various SakSTAR mutants measured in the chromogenic substrate assay. Put together in 1. Of the 21 mutants shown in FIG. 1, E99, E100 (M13) and E99, E100, E102 (M14) were not obtained in pure form. K11, D13 , D14 (M1), E46, K50 (M4) and 65, D69 (M7) are active But Did not. The 16 variants summarized in Table 1 were tested in detail with wild-type SakSTAR Was done. Among these mutants, D5, K that reacted with the monoclonal antibody panel 6 (M20), K8, K10 (M21), D33, K35 (M2), K57, E 58, K59 (M5), E61, E65 (M6), K86, E88 (M10), D93, K94, (M11), K96, K97, K98 (M12), E108, K109 (M15), D115, E118, H119 (M16), H119, K 121 (M17), K130 (M18) and E134, K135, K136 ( M19) was in the same state as SakSTAR. However, K35, E38 (M 3) and E80, D82 (M9) are antibody clusters 7H11, 25E1, 40 Not very reactive with C8, K74, E75, R77 (M8) 26A2, 30A2 , 2B12 and 3G10. The effect of epitope disappearance is Mutants K35, E38 / K74, E75, R77 (M3.8) and K74, E75, R77 / E80, D82 (M8.9), which is clear for both originals. The molecule was associated with reduced reactivity with the monoclonal antibody.Example 3 Antibody wild-type and "Alani" elicited in patients treated with SakSTAR Absorption by charge cluster "staphylokinase variant" Epitopes of induced antibodies generated after treatment with SakSTAR in patients with acute myocardial infarction Plasma samples from 16 patients were biospecific for information on specificity. Prior to the determination of the SakSTAR binding group by interaction analysis, the single- and coupled "Alani" About the charge cluster “mutant” with two-fold molecular excess (staphylokinase) (More than neutralizing activity). Staphylokinase neutralization in these samples Activity was measured as follows. Increased concentration of wild-type or mutant SakSTA R (50 μl containing 0.2-1000 μg / ml) citrated human plasma Add to the mixture of 300 μl and buffer or 50 μl of test plasma, immediately add thrombi. (50 NIH units / ml) and CaCl_Two(25 mM) The thrombolysis time is measured and plotted against the concentration of SakSTAR molecule. This curve From the concentration of plasminogen activator, which causes complete thrombolysis in 20 minutes Degree was required. Neutralizing activity titer is measured as the difference between test plasma and buffer , Expressed in μg / ml test plasma. The results are summarized in Table 2. Wild-type SakSTAR binds Absorbs more than 90% of the body, but incomplete absorption results in mutant K35, E38 (4 M3), mutant K74, E75, R77 (M8) in 12 patients, mutant in 5 patients It was found in bodies E80 and D82 (M9). Binding mutants K35, E38 / K74, E75, R77 (M3.8) and K74, E75, R77 / E80, D82 ( The absorption at M8.9 was less than 90% in 13 patients (average in 16 patients, respectively). (Mean 68 and 65%) while removing the binding mutant (M8 And a mixture of the original molecules of M3 or M9) is consistent in more than 90% of the antibodies And absorbed.Example 4 Wild-type staphylokinase (SakSTAR), mutant K35, E3.8 (M3 ), K74, E75, R77 (M8) and E80, D82 (M9) and merging Mutants K35, E38 / K74, E75 R77 (M3.8) and K74, E Stuff in rabbits immunized with 75, R77 / E80, D82 (M8.9) Immunogenicity of a variant of the tyrokinase "Charge cluster for aniline" SakSTAR vs. SakSTAR Mutants M3, M8, M9, M3.8 and M A comparative immunogenicity of 8.9 was assigned to groups of 4 or 8 rabbits on SakSTAR. The mutants were divided into eight groups and examined. At week 0 (thrombolysis at start) SakSTAR 400 μg / kg and mutant 200-1,000 μm Immunization was achieved by intravenous g / kg infusion and at week 2 complete frontal access. In adjuvant and incomplete Freund's adjuvant at 3 and 5 weeks Of the same drug was injected. Immunogenicity was determined by plasma staphy at 6 weeks. It was quantified by measuring rokinase-neutralizing activity and remaining thrombolytic power. Briefly, staphylokinase-neutralizing activity in plasma increases with increasing concentrations of wild-type. Or mutant SakSTAR (50 μl containing 0.2-1000 μg / ml) Of 300 μl of citrated human plasma and 50 μl of buffered or test plasma Immediately, thrombin (50 NIH units / ml) and CaCl 2_Two(25 mM) and the thrombus lysis time of the mixture plasma containing the SakSTAR molecule was measured. This is illustrated in FIG. From this curve, it can be seen that plasminnow produces complete thrombolysis in 20 minutes. Gen activator concentrations were determined. Neutralizing activity titer is measured with test plasma and buffer It is measured as the difference from the value and is expressed in μg / ml test plasma. Thrombolytic properties are:¹²⁵I-fibrin-labeled platelets-small volume rabbit plasma thrombus 0.3 m and tested in an extracorporeal arterial-venous loop. Therefore, the exposed thigh Connect a 4 French catheter (Portex white, Portex, Hythe, UK) to the artery and ear And connected via two subcutaneous syringes to connect to the vein. Go through an extracorporeal loop The blood flow was maintained at 10 ml / min with a Tsumagu pump.¹²⁵I-fibrin-labeled plasma -The clot was introduced into each of the two syringes inserted into the loop. Plasma and blood clots are very Small amount (about 1.5μCi)¹²⁵I-labeled human fibrinogen solution (Amersham, Bucki nghamshire, UK) 0.3 ml of platelet-small plasma and bovine thrombin (15 NIH units / ml) and 0.5M CaCl_TwoMixture with 0.07 ml of And then incubated for 30 minutes at 37 ° C. 30 minutes before the start of infusion, (Binding / thromboxane synthesis inhibitor and prostaglandin / endoperiod) (43) 7.5 mg / kg It was administered as an intravenous bolus to prevent platelet deposition on the lip. Hepari animals (300 units / kg by continuous infusion of 200 units / kg / hour during the experiment) More anticoagulated, SakSTAR 400 μg / kg (4 or 8 rabbits) or SakSTAR mutant randomized to 200-1000 μg / kg (8 rabbits) injection Assigned to. Six weeks later, half of the SakSTAR mutant-assigned rabbits were treatment with the akSTAR mutant and the other half again with the wild-type SakSTAR Was. On the other hand, a rabbit immunized with SakSTAR is a SakSTAR mutant (this (When the control group is 4 rabbits) or wild-type SakSTAR or S randomized to any of the akSTAR mutants (when this control group was 8 rabbits) . Thrombolytics given intravenously as a 10% bolus and 90% infusion over 1 hour I got it. The clot lysis time course was measured by two 3 x 0.5 inch N placed on an extracorporeal loop. aI / Monitoring by external gamma-count using thallium crystals (Bicron, Newbury, OH). Was. The scintillation crystal was used for the Canberra-S100 system (Canberra-Packard). , Meriden, CT) and the data analyzed as described elsewhere (44). End of experiment At the end, the remaining clot was collected for measuring radioisotope content. Animal experiments Aligned with guidelines from the American Physiological Society and the International Commission on Thrombosis and Hemostasis (45) I went. Immunogenicity of SakSTAR and each single-mutant (M3, M8 and M9) Is the mean ± SD as compared to Table 3A. Neutralizing activity at the start in eight mutant M3 rabbits was SakSTAR and 0.0 ± 0.0 μg / ml for both M3. 200 μg / kg of M3 Injection caused clot lysis of 76 ± 23%. These eight animals were completely frowned in two weeks 500 μl of adjuvant, incomplete Freund's adjuvant 50 at 3 and 5 weeks Immunized with M3 suspended in 0 μl. At 6 weeks, the plasma neutralizing activity was changed to SakSTAR. Increased to 11 ± 6.7 μg / ml for M3 and 11 ± 7.2 μg / ml for M3 Was done. At 6 weeks, SakST to 4 of these randomly selected rabbits AR 400 μg / kg infusion resulted in clot lysis of 18 ± 27%, while the other 4 animals 200 μg / kg injection of M3 was 16 ± 17%. SakSTAR's Husa In four giants, the neutralizing activity at the start was 0.2 ± 0.2 against SakSTAR. μg / ml and 0.0 ± 0.0 μg / ml for M3. SakSTA An intravenous infusion of 400 μg / kg of R resulted in 89 ± 8.6% lysis at the start. Next These four animals are complete (2 weeks) or incomplete (3 or 5 weeks) Immunization was performed with 400 μg of SakSTAR suspended in bunt. The plasma neutralizing activity at 6 weeks , 35 ± 23 μg / ml for SakSTAR and 19 ± 13 for M3. It was increased to μg / ml. SakSTAR.M3 to these 4 rabbits at 6 weeks Intravenous infusion of 200 μg / kg causes 9.3 ± 8.2% lysis. Neutralizing activity at the start in 8 mutant M8 rabbits was relative to SakSTAR 1.4 ± 0.2 μg / ml and 0.6 ± 0.5 μg / ml for M3. Was. Injection of M8 at 1000 μg / kg caused 41 ± 13% clot lysis. this 8 Animals received 400 μg of M3 suspended in complete Freund's adjuvant at 2 weeks, and Immunize at 3 and 5 weeks with the same volume suspended in 500 μl incomplete Freund's adjuvant Was done. At 6 weeks, the plasma neutralizing activity was 3.8 ± 1.8 μg / m against SakSTAR. It was increased to 5.9 ± 2.7 μg / ml for 1 and M8. Of these rabbits Injection of 400 μg / kg SakSTAR into 4 of them resulted in clot lysis of 49 ± 28%. On the other hand, the injection of 1000 μg / kg of M8 into the other four animals was 24 ± 11%. Was. In eight SakSTAR rabbits, the neutralizing activity at the time of starting was SakST 0.9 ± 0.6 μg / ml for AR and 0.6 ± 0.3 μg / m for M8 l. 400 μg / kg intravenous infusion of SakSTAR was 68 ± 18% dissolution occurred. These rabbits are then either complete (2 weeks) or incomplete (3 weeks). Or 5 weeks) Immunization with 400 μg of SakSTAR suspended in Freund's adjuvant did. At week 6, the plasma neutralizing activity was 59 ± 47 μg / ml against SakSTAR. And M8 to 22 ± 16 μg / ml, while 400 μg / kg The remaining thrombolytic efficacy of SakSTAR is 7.5 ± 2.4% to 1,000 μg / kg Of M8 decreased to 4.1 ± 4.8%. In eight rabbits of mutant M9, the neutralizing activity in the plasma at the time of starting was SakST. 0.2 ± 0.05 μg / ml for AR and 0.03 ± 0.05 μm for M9 g / ml. Injection of 400 μg / kg of M9 resulted in 72 ± 11% clot lysis. I did it. These 8 animals were 400 μl suspended in complete Freund's adjuvant at 2 weeks. gM9, the same amount of M9 suspended in incomplete Freund's adjuvant at 3 and 5 weeks Immune with At week 6, the plasma neutralizing activity was 8.0 ± 4.6 μm against SakSTAR. g / ml and 3.5 ± 2.6 μg / ml for M9. Six weeks, this Injection of 400 μg / kg SakSTAR into 4 of these rabbits resulted in clot lysis 53 ± 11%, while 400 μg / kg infusion of M9 into the other four animals was 40 ± 11%. It was 7.8% dissolved. Starting point in 4 SakSTAR control rabbits Neutralization activity in plasma was 0.1 ± 0.05 μg / ml against SakSTAR. 0.05 ± 0.06 μg / ml for M9 and M9. SakSTAR 400 Intravenous infusion of μg / kg resulted in 78 ± 13% lysis at the start. Then these four Is suspended in complete (2 weeks) or incomplete (3 or 5 weeks) Frond adjuvant Immunized with 400 μg of SakSTAR. At 6 weeks, the plasma neutralizing activity was 16 ± 5.0 μg / ml for AR and 12 ± 9.1 μg / ml for M9 Was increased. The thrombolytic efficacy of M9 dropped to 24 ± 33%. The immunogenicity of the SakSTAR double mutants M3.8 and M8.9 is compared to Table 3B. Compared. In 8 rabbits with mutant M3.8, the neutralizing activity in plasma at the start was 0.6 ± 0.3 μg / ml for SakSTAR and 3.5 ± for M3.8. 2.0 μg / ml. Injection of 1000 μg / kg of M3.8 is 53 ± 13% Clot dissolution occurred. These 8 animals were suspended in Complete Freund's Adjuvant in 2 weeks With incomplete Freund's adjuvant at 3 and 5 weeks with 400 μg M3.8 It was immunized with the same amount of turbid M3.8. At 6 weeks, the plasma neutralizing activity was changed to SakSTAR. 1.7 ± 0.7 μg / ml for M3.8 and 6.1 ± 3.0 μg / ml for M3.8 Only increased. SakSTAR400 to 4 of these rabbits The μg / kg infusion resulted in a clot lysis of 77 ± 18%, while M3.8 in the other 4 animals 1000 μg / kg injection was 59 ± 25%. Rabbit 8 of SakSTAR In animals, the neutralizing activity in the plasma at the start was 0.6 ± against SakSTAR. It was 2.0 ± 2.0 μg / ml for 0.4 μg / ml and M3.8. Sa Intravenous infusion of 400 μg / kg of kSTAR results in 80 ± 10% lysis at start Was. The rabbits are then given complete (2 weeks) or incomplete (3 or 5 weeks) Freon Immunization was performed with 400 μg of SakSTAR suspended in de adjuvant. Plasma at 6 weeks Neutralizing activity was 20 ± 15 μg / ml against SakSTAR and against M3.8. To 21 ± 22 μg / ml. On the other hand, 400 μg / kg SakSTA The remaining thrombolytic efficacy of R is 8.5 ± 5.7% that of M3.8 at 1,000 μg / kg. It dropped to 30 ± 29. In eight rabbits with mutant M8.9, the neutralizing activity in the plasma at the time of starting was Sak 0.3 ± 0.2 μg / ml for STAR and 1.6 for M8.9. ± 0.5 μg / ml. Injection of 200 μg / kg of M8.9 was 39 ± 13% Clot dissolution occurred. These 8 animals were completely Freund's adjuvant or , 400 μg M8.9 suspended in incomplete Freund's adjuvant at 3 and 5 weeks Immune with At 6 weeks, the plasma neutralizing activity was 2.5 ± 1.5 μm against SakSTAR. g / ml and only 4.9 ± 1.3 μg / ml for M8.9. Was. At week 6, SakSTAR 400 μg / kg injected into 4 of these rabbits Injection resulted in a clot lysis of 51 ± 35%, while 800 μg of M8.9 in the other 4 animals / Kg injection was 39 ± 12%. SakStar's four control rabbit smells Thus, the pretreatment neutralizing activity was 0.7 ± 0.3 μg / ml against SakSTAR and It was 0.7 ± 0.3 μg / ml for M8.9. 400μ of SakSTAR Intravenous infusion of g / kg resulted in 67 ± 19% lysis at the start. Then these four Suspended in complete (2 weeks) or incomplete (3 or 5 weeks) Frond adjuvant Immunized with 400 μg of SakSTAR. At week 6, the plasma neutralizing activity was SakSTA 20 ± 15 μg / ml for R and 18 ± 15 μg / ml for M8.9 Was increased. On the other hand, the remaining thrombolytic efficacy of M8.9 decreased only 31 ± 30%. won. These results were included in this direct comparison study of SakSTAR and selected mutants. In particular, the double mutants (M3.8 and M8.9) were significantly more pronounced than SakSTAR. It shows that it induces low antibody-related neutralizing activity and lysis resistance.Example 5 Comparative immunogenicity of SakSTAR and M3.8 in baboons For induction of neutralizing antibodies and refractory thrombolysis, SakSTAR and M3 The comparative immunogenicity of .8 was examined in baboons. Animal studies are based on guidelines from the American Physiological Society and the International Commission on thrombus and hemostasis ( 45). In anesthetized and intubated baboons, extracorporeal arterial-venous circulation was Ligature from the tibia or brachial artery to the peripheral vein through an extracorporeal polyethylene loop And formed. Peristaltic pump for continuous monitoring of blood flow through the extracorporeal loop Hold and fresh¹²⁵I fibrin-two skins each containing a label, baboon, plasma, and clot The lower syringe was inserted. Blood during SakSTAR or mutant M3.8 injection The time course of rice cake dissolution was continuously monitored by external gamma-counting on the syringe. Another To Isotope recovery balance is the total blood radioactivity plus recovery at the end of the experiment. The sum of the radioactivity in thrombin was compared to the radioactivity that was originally present in the clot. Before each thrombolysis test, baboons should be removed to prevent platelet deposition in the extracorporeal system. Dogrell was given a venous ball. During thrombolysis test, 300 IU / kg bolus Followed by intravenous administration of heparin at 200 IU / kg infusion. Twelve male baboons (Papio hammadryas) start at week 0 (Sa) 50 μg / k of kSTAR (group 1) or mutant M3.8 (group 2) g at random for 10% bolus over 1 hour The starting point thrombolytic efficacy was assayed by monitoring the loss of radioactivity from the clot in 2 hours. . Baboons were isolated from SakSTAR (group 1) or mutant M3.8 (group 2). 500 μg was immunized by subcutaneous administration. These are complete Floyd adjuvants in two weeks At 3 and 5 weeks, it is suspended in incomplete Floyd's adjuvant. 6 weeks Later, the thrombolytic efficacy was quantified for 4 hours using an in vitro thrombolytic model. Sand Six animals from group 1 treated at the start and subsequently immunized with SakSTAR 3 and 6 of group 2 treated at the start and subsequently immunized with M3.8 Three of them were selected at random, and Sa was given by intravenous infusion at 1% or more with 10% bols. kSTAR 50 μg / kg is given first and 2 hours after the start of SakSTAR-infusion The same amount of M3.8 was given (groups 1A and 2A, respectively). The remaining six The same procedure was followed, but in reverse order. That is, first M3.8, then Sa kSTAR (groups 1B and 2B, respectively). 18 weeks later, thrombolytic efficacy Was measured three times by monitoring the disappearance of radioactivity from fibrin / clot for 3 hours. Specified. Intravenous bolus in 2.5 out of 3 animals out of 6 immunized with SakSTAR As SakSTAR 250 μg / kg, while immunizing with SakSTAR The remaining three animals received the same dose of M3.8 (Group 1B). Immunized with M3.8 Three of the six animals received 250 μg / kg of SakSTAR by intravenous bore (glu). Group 2A) and the remaining three animals received the same amount of M3.8 (group 2B). Blood samples were placed in citrate-containing tubes (final concentration 0.01 M) as a starting point. And at some time thereafter, the active partial thromboplastin time (aPT T), fibrinogen, α_Two-Antiplasmin (start and end point of the experiment) And SakSTAR- and M3.8-neutralizing activity (before thrombolytic injection) Was. Therefore, the increase in SakSTAR or M3.8 (0.2-1,000 μg / ml) containing 300 μl of citrated human plasma and buffer. Or 50 μl of test baboon plasma, and immediately add thrombin (50 NIH μm). / Ml) and CaCl_Two100 μl of the mixture (25 mM) was added. Plasma clot The dissolution time was measured and entered for the concentrations of SakSTAR and M3.8. This Plasminogen activator concentration that causes complete clot lysis in 20 minutes from curve Was measured. Neutralizing activity was determined by the difference between the test plasma and the buffer value, and was expressed in μg / ml plasma. Expressed in. Systemic fibrinogen is not reduced and α_Two-Antiplasmin also It was not depleted, reflecting the overall fibrin-specificity of both. After 6 weeks, the SakSTAR-neutralizing activity of Group 1 was higher than the M3.8 of Group 2. -Significantly higher than the neutralizing activity. In group 1, the neutralizing activity was lower than that of M3.8. For akSTAR, it occurred quickly and significantly more clearly, while in group 2 Thus, the M3.8-neutralizing activity did not exceed the SakSTAR neutralizing activity (Table 4). 8 weeks Thus, in group 1, the significantly higher neutralizing activity than in group 2 was SakSTAR. And M3.8 (Table 4). At the start, 50 μg / kg SakST in 6 baboons (group 1) AR is intravenously injected over 1 hour and induces 77 ± 2.9% clot lysis over 2 hours In another six baboons (Group 2), 50 μ / kg M3.8 was given for 2 hours. As described above, 83 ± 3.6% clot lysis was induced (mean ± SEM.p = 0.2). 6 weeks later , 50 μg / kg SakSTAR dissolution efficacy for more than 2 hours 9. In three baboons (Group 1A) immunized with SakSTAR by pulse infusion, 9. In 3 baboons (group 2A) immunized with M3.8, which fell to 2 ± 1.0% 8.5 ± 3.2%, while M3 with 50 μg / kg intravenous infusion over 2 hours. The lytic potency of 8 was determined in 3 baboons (Group 1B) immunized with SakSTAR. 10 ± 6.9% in 3 baboons immunized with M3.8 (group 2B). 1 ± 7.4% (dissolved at the start corresponding to P <0.001 in all groups; P between loops = NS). Two hours after the start of the first thrombolytic infusion, 50 μg / kg injected intravenously for 1 hour or more to obtain comparative residue dissolving efficacy in groups 1A and 2 In A, clot lysis with M3.8 for 2 hours or more was 7.7 ± 15% and 11 ± respectively. 5.7% for groups 1B and 2B for more than 2 hours on SakSTAR The upper clot lysis was 13 ± 2.7 and 12 ± 2.1%, respectively. At 18 weeks, an intravenous bolus injection of 250 μg / kg SakSTAR was performed with SakST. 39 ± 5.3 over 3 hours in 3 baboons immunized with AR (group 1A) % Clot lysis while giving 3 baboons (group 2B) immunized with M3.8 The residual thrombolytic efficacy of 250 μg / kg of M3.8 was significantly greater. You That is, clot lysis over 3 hours was 68 ± 4.5% (P <0.005). 25 0 μg / kg SakSTAR was 58% in three baboons immunized with M3.8. A clot lysis of ± 9.5% for 3 hours or more occurred (Group 2A; P = 0.8 vs. glue) Step 1A), while three baboons immunized with SakSTAR (group 1B) Clot lysis for more than 3 hours with 250 μg / kg M3.8 at 39 ± 3.6% (P = 0.0005 vs group 2B). Analyzes collected will be available at 18 weeks Regardless of residue lysis over 3 hours for SakSTAR immunized group 1 Is 39 ± 3.0% and 63 ± 5.2% for group 2 immunized with M3.8. (P <0.0005). Throughout the duration of the test, thrombolytic efficacy was inversely correlated with the corresponding neutralizing activity (Spe arman γ = −0.83; P <0.0001). Thus, the mutation M3.8 is relatively active in baboons, and fibrin-specific. Although unusual, it is significantly less antigenic than wild-type SakSTAR. This is immune Slower induction of plasma neutralizing activity and faster recovery of thrombolytic efficacy after Is evidenced by the fact that Results in these primates confirm the above observations in rabbits and extend I do.Example 6 Comparative thrombolysis of M3.8 and M8.9 versus SakSTAR in patients with peripheral arterial occlusion Efficacy and immunogenicity Patients with arterial occlusion due to peripheral artery or bypass graft on angiography , SakSTAR (n = 8), M3.8 (n = 4) and M8.9 (n = 4) Administered as a 2 mg bolus intravenously or in close proximity to an occluded thrombus, 1 hour per hour The infusion of mg was continued. Patient is tested after giving informed consent The protocol has been approved by the Human Testing Committee at Leuven University. Picking The criteria for inclusion and exclusion are within 48 hours with the recombinant staphylokinase molecule. Except that reprocessing is allowed, it is basically as described above (46). Heparin, ass Antithrombotic treatment of a combination of pilin and an oral anticoagulant is as described above (46). Opening of an occluded peripheral artery or bypass graft can be performed with wild-type and variant SakSTAR. Before and during the intra-arterial infusion at least every 4 hours and periodically at the end Was. Contrast enhancement of the subject's blood vessels at the end of the infusion is a major study endpoint. Was. Administration of a thrombolytic agent should be discontinued due to complications when an appropriate blood vessel is made. And when two connected angiograms show no progression of clot lysis Is terminated. Recanalization is used to restore active forward flow through previously occluded sites. It was defined as sufficient clot lysis. Auxiliary endovascular procedures, such as percutaneous graft angioplasty, If the thrombus was sufficiently dissolved or thrombus dissolution was not expected, the tester Was made when judged. Blood pressure and heart rate should be monitored before infusion of SakSTAR, M3.8 or M8.9. Measured during and after. Blood samples before, at the end and at 6 o'clock Soon collected. Peripheral blood count, prothrombin time (PT), aPTT, five Linogen, α_Two-Antiplasmin, plasminogen, and biochemical liver and A renal function test was performed. SakSTAR-neutralization, M3.8-neutralization and M8.9 -Neutralizing activity, anti-SakSTAR, anti-M3.8 and anti-M8.9 IgG and And IgM are measured periodically on blood samples taken during and after hospital admission. Was. Clinical follow-up indicates thrombotic recurrence and allergic reactions and major bleeding (ie, Need for blood transfusion or surgical control,> 10% reduction in hematocrit or Side effects such as intracranial hemorrhage were focused. PAO by angiography, period 1 A group of 4-8 patients (41-73 years) 120 days and 8-50 cm long Were treated with M3.8, M8.9 or SakSTAR. Wild type SakSTAR Anaphylaxis occurred 5 minutes after administration of 2 mg boles in one patient (WAL) Was. If the infusion is stopped immediately, blood pressure will return to normal within 20 minutes of infusion of the plasma expander. Restored. This patient is not calculated in the mean ± SEM of Tables 5-7. M8.9 throw One patient received reocclusion after 30 hours. It was treated with 6.5 mg of the variant . The patient had 7.8 μg / ml M8.9 neutralizing activity and 270 μg after 2-3 weeks. g / ml of specific anti-M8.9 IgG was produced. The relevant basic characteristics of the individual patients are shown in Table 5. Most PAOs are at the level of the thigh popliteal muscle Met. All were thrombus in normal locations. Two implants and two iliac stainlesss G occlusion was included. 9 lameness difficulties, 2 chronic ischemic residual pain, 4 subacute ischemia And one patient with acute ischemia. Table 6 summarizes the individual treatments and results. 5.5-13 mg for 3.5-11 hours 13 cases of complete recanalization, 1 case of partial recanalization, 1 case of no improvement due to intraarterial infusion Met. Supplemental endovascular treatment (mainly PTA) was performed in 12 cases and blood in 1 case Immediately after thrombolysis, replacement surgery was performed. 4 cases of thrombosis after completion of angiography It occurred in. The first patient was retreated 30 minutes later with 6.5 mg of M8.9 and was successful. Was. A second patient received an aortic-iliac muscle bypass graft. The third patient is γt -Reopening after 20 hours with PA 40 mg, the fourth patient has apparently absorbed the thrombus . Excluding patients with no bleeding complications or hematoma in the right quadriceps, The site of contrast puncture was limited to weak to moderate hematomas. Other intravascular procedures Complications include distal embolism requiring early withdrawal of the thrombolytic agent in one case and no arteriotomy. Was done. In one case of femoral artery occlusion, for more than 6 hours, inject SakSTAR 8.0 mg. Showed anti-potency and could be subsequently treated with PTA (Table 6). Circulating fibrinogen, plasminogen and α_Two-Anti-plasminogene Values remained unchanged during the injection of the SakSTAR molecule (Table 7). Represents the absolute fibrin specificity of the drug at the amounts used. Substantially in vivo ・ Fibrin digestion occurred, evidenced by elevated D-dimer levels. In the artery Heparin treatment prolonged aPTT (Table 7). Antibodies-related SakSTAR-, M3.8- and M8.9-neutralizing activity and anti- SakSTAR, M3.8- and M8.9-specific IgG at start and after injection One week was low (Table 8). From week 2 the neutralizing activity levels were M3.8 and M8 . In patients treated with No. 9, the median was 2.9 μg / ml and 3.9 μg / ml plasma, respectively. Increased to 3 μg neutralized SakSTAR variant. This is a SakSTAR treated patient Significantly more than 9.1 μg neutralized wild type SakSTAR / ml Low (P = 0.03 for variant vs. wild type, Mann-Whitney la Nk Sum test). SakSTAR-specific IgG levels were M3.8 and And median values of 51 and 31 μg / ml plasma in M8.9 treated patients, respectively. Which is significantly lower than the median in SakSTAR-treated patients (variant vs. wild-type P = 0.01, Mann-Whitney Rank Sam Te Strike). Thus, 5.5-1 of M3.8 and M8.9 in patients with peripheral arterial occlusion. Administration of 3 mg significantly lowers neutralizing antibodies and specific anti-stars than SakSTAR. Filokinase IgG was induced. These variants have been engineered by protein engineering Proof of the belief that there will be a reduction in the humoral response to staphylokinase provide. Figure description FIG. 1 shows the protein sequences of wild-type staphylokinase and SakSTAR. NH for mature length staphylokinase_Two-Numbering from the end Show. The "charge cluster for alanine" variant tested was represented. FIG. 2 shows a panel of 17 murine monoclonal antibodies against SakSTAR. Epitope specificity is represented graphically. References 1． Collen D: On the regulation and control of fibrinolysis. Edward Kowal ski Memorial Lecture. Thromb Haemostas 43: 77-79, 1980. 2． Collen D, Lijnen HR: Basic and clinical aspects of fibrinolysis and th rombolysis. Blood 78: 3114-3124, 1991. 3． Collen D, Van de Werf F: Coronary thrombolysis with recombinant staphy lokinase in patients with evolving myocardial infarction.Circulation 87: 1850-1853, 1993. Four. Vanderschueren S, Collen D: Immunogeniciteit van streptokinase enimpli caties voor gebruik. Tijdschr Geneesk 50: 1639-1644, 1994. Five. Lack CH: Staphylokinase: an activator of plasma protease. Nature 161: 55 9, 1948. 6． Lewis JH, Ferguson JH: A proteolytic enzyme system of the blood. III. Activation of dog serum profibrinolysin by staphylokinase. Am J Physiol 166: 594, 1951. 7． Winkler KC, DeWaart J, Grootsen C, Zegers BJM, Tellier NF, Vertegt CD : Lysogenic conversion of staphylococci to loss of beta-toxin. J Gen Mic robiol39: 321, 1965. 8． Collen D, Lijnen HR: Staphylokinase, a fibrin specific plasminogenacti vator with therapeutic potential? Blood 84: 680-686, 1994. 9． Sako T, Sawaki S, Sakurai T, Ito S, Yoshizawa Y, Kondo I: Cloning and expression of the staphlokinase gene of Staphylococcus aureus in Escheri chia coli. Molec Gen Genet 190: 271-277, 1983. Ten. Behnke D, Gerlach D: Cloning and expression in Escherichiacoli, Bacill us subtilis, and Streptococcus sanguis of a gene for staphylokinase a ba cterial plasminogen activator. Molec Gen Genet 210: 528-534, 1987. 11． Collen D, Silence K, Demarsin E, De Mol M, Lijnen HR: Isolation and c haracterization of natural and recombinant staphylokinase. Fibrinolysis 6: 203-213, 1992. 12． Sako T: Overproduction of staphylokinase in Escherichia coli and its characterization. Eur J Biochem 149: 557-563, 1985. 13. Gerlach D, Kraft R. Behnke D: Purification and characterization of th e bacterial plasminogen activator staphylokinase secreted by a recombina nt bacillus subtilis. Zbl Bakt Mikr Hyg 269: 314, -322 1988. 14. Sako T, Tsuchida N: Nucleotide sequence of thestaphylokinase gene fro m Staphylococcus aureus. Nucleic Acids Res 11: 7679-7693, 1983. 15． Collen D, Zhao ZA, Holvoet P, Marynen P: Primary structure and genes tructure of staphylokinase. Fibrinolysis 6: 226-231, 1992. Vetterman S, Collen D, Lijnen HR: Functional properties of recombinant st aphylokinase variants obtained by site-specific mutagenesis of methionin e 26. Biochim Biophys Acta 1204: 235-242, 1994. 17． Sakai M, Watanuki M, Matsuo O: Mechanism of fibrin-spectfic fibrinoly sis by staphylokinase: participation of α_Two-plasmininhibitor.Biochem Biop hys Res Comm 162: 830-837, 1989. 18． Matsuo O, Okada K, Fukao H, Tomioka Y, Ueshima S, Watanuki M, Sakai M : Thrombolytic properties of staphylokinase. Blood 76: 925-929, 1990. 19. Lijnen HR, Vanlloef B. De Cock F, Okada K, Ueshima S, Matsuo O, Colle n D: On the mechanism of fibrin-specific plasminogen activation by staphy lokinase. J Biol Chem 266: 11826-11832, 1991. 20. Lijnen HR, Van Hoef B, Matsuo O, Collen D: On themolecular interactio ns between plasminogen-staphylokinase, α_Two-antiplasmin and fibrin. Bioch im Biophys Acta 1118: 144-148, 1992. twenty one. Silence K, Collen D, Lijnen HR: Interaction between staphylokinase, plasmin (ogen) and α_Two-antiplasmin. Recycling of staphylokinase after neut ralization of the plasmin-staphylokinase complex by α_Two-antiplasmin.J Bi ol Chem 268: 9811-9816, 1993. twenty two. Silence K, Collen D, Lijnen HR: Regulation by α_Two-antiplasmin and fib rin of the activation of plasminogen with recombinant staphylokinase in plasma. Blood 82: 1175-1183, 1993. twenty three. Collen D, De Cock F, Vanlinthout I, Declerck PJ, Lijnen HR, Stassen JM: Comparative thrombolytic and immunogenic properties of staphylokinase and streptokinase. Fibrinolysis 6: 232-242, 1992. twenty four. Collen D, De Cock F, Stassen JM: Comparative immunogenicity and throm bolytic properties toward arterial and venous thrombi of streptokinase a nd recombinant staphylokinase in baboons. Circulation 87: 996-1006, 1993. Vanderschueren S, Van de Werf F, Michael A, Collen D, Behnke D: High yiel d production and purification of recombinant staphylokinase for thrombol ytic therapy. Bio / technology 12: 185-189, 1994. 26. Declerck PJ, Vanderschueren S, Billiet J, Moreau H, Collen D: Prevalen ce and induction of circul atingantibodies against recombinant staphylok inase. Thromb Haemostas 71: 129-133, 1994. 27. Vanderschueren SMF, Stassen JM, CollenO: On the immunogenicity of rec ombinant staphylokinase in patients and in animal models. Thromb Haemost as 72: 297-301, 1994. 28. White H: Thrombolytic treatment for recurrent myocardial infarction.B r Med J 302: 429-430, 1991. B: Functional significance of NH_Two-and COOH-terminal regions of staphyloki nase in plasminogen activation. Submitted. strategies and procedures. Methods Enzymol 73: 3-46, 1981. 31. de St. Groth SF, Scheidegger D: Production of monoclonal antibodies: s trategies and tactics. J Immunol Methods 35: 1-21, 1980. 32. Nakane PK, Kawaoi A: Peroxidase-labeled antibody. A new method for co njugation. J Histochem Cytochem 22: 1084-1091, 1974. 33. Anderson N, Potter M: Induction of plasmacell tumours in Balb-cmice w ith 2, 6, 10, 14 tetramethylpentadecane (pristane). Nature 222: 994-995, 1 969. 34. Ey PL, Browse SJ, Jenkin CR: Isolation of pure IgG₁, IgG_2a and IgG_2b immunoglobulins from mouse serum using proteinA-Sepharose. Immunochemistry 15: 429-436, 1978. The integration of surface plasmon resonance detection, general biospeci fic interface chemistry and microfluidics into one analytical system. Ad v Biosensors 2: 291-336, 1992. carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction a nalysis in surface plasmon resonance sensors. Anal Biochem 198: 268-277, 1991. 37. BIAcore system manual, 5-2, Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden. 38. Karlsson R, Michaelsson A, Mattsson L: Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical sys tem. J Immunol Methods 145: 229-240, 1991. 39. Stanssens P, Opsomer C, Mc Keown Y, Kramer W, Zabeau M, Friz MJ: Effi cient oligonucleotide-directed construction of mutations in expression v ectors by the gapped duplex DNA method using alternating selectable mark ers. Nucleic Acids Res 17: 4441-4454,1989. 40. Deutsch DG, Mertz ET: Plasminogen: purification from human plasma by af finity chromatography. Science 170: 1095-1096, 1970. 41. SilenceK, Hartmann M, GUhrs KH Gase A, Schlott B, Collen D, Lijnen HR : Structure-function relationships in staphylokinase as revealed by “clu stered-charge-to-alanine ”mutagenesis. J Biol Chem (in press). 42. Bradford MM: A rapid and sensitive method for the quantitation of mic rogram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye bindi ng. Anal Biochem 72: 248, 1976. 43. De Clerck F, Beetens J, de Chaffoy de Courcelles D, Freyne E, Janssen PA: R68070: thromboxane A2 synthetase inhibition and thromboxane A2 / prost aglandin endoperoxide receptor blockade combined in one molecule. I. Bio chemical profile in vitro. Thromb Haemost 61: 35-42,1989. 44. Stassen JM, Vanlinthout I, Lijnen HR, Collen D: A hamster pulmonary embolism model for the evaluation of the thrombolytic and pharmacokineti c properties of thrombolytic agents. Fibrinolysis 4 (Suppl 2): 15-21, 1990 . 45. Giles AR: Guidelines for the use of animals in biomedical research.Th romb Haemost 58: 1078-1084,1987. 46. Vanderschueren S, Stockx L, Wilms G, Lacroix H, Verhaeghe R, Vermylen J, Collen D: Thromboly tictherapy of peripheral arterial occlusion with recombinant staphylokinase. Circulation 92: 2050 2057, 1995. 47. Vanderschueren S, Barrios L, Kerdsinchai P, Van den Heuvel P, Hermans L, Vrolix M, De Man F, Benit E, Muyldermans L, Collen D, Van deWerf F: A randomized trial of recombinant staphylokinase versus alteplase for coro nary artery patency in acute myocardial infarction.Circulation 92: 2044-2 049, 1995.

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１１月１１日（１９９６．１１．１１）【補正内容】請求の範囲１．野生型スタフィロキナーゼに比して低下した免疫原性を示すスタフィロキナーゼ誘導体。２．基本的に野生型スタフィロキナーゼまたはその修飾体のアミノ酸配列を有するが、その中において少なくとも１つの免疫優性エピトープが誘導体の活性を壊さないで欠失している、請求項１のスタフィロキナーゼ誘導体。３．基本的に図１に記されたアミノ酸配列を有し、その中で１以上の下線を引いたクラスターの１以上のアミノ酸が対応するエピトープを破壊する他のアミノ酸で置換されている、請求項１または２のスタフィロキナーゼ誘導体。４．基本的に図１に記されたアミノ酸配列を有し、その中で１以上の下線を引いたクラスターの１以上のアミノ酸が対応するエピトープを破壊するアラニンで置換されている、請求項３のスタフィロキナーゼ誘導体。５．基本的に図１に記されたアミノ酸配列を有し、その中で１以上のアミノ酸がエピトープのクラスターＩに対するモノクローナル抗体パネル（例えば、抗体１７Ｇ１１，２６Ａ２，３０Ａ２，２Ｂ１２および３Ｇ１０を含む）との誘導体の反応性を低下せしめるアラニンで置換されている、請求項１−４のいずれかのスタフィロキナーゼ誘導体。６．基本的に図１に記されたアミノ酸配列を有し、その中で１以上のアミノ酸がエピトープのクラスターIIIに対するモノクローナル抗体パネル（例えば、抗体７Ｈ１１，２５Ｅ１，４０Ｃ８，２４Ｃ４および１Ａ１０を含む）との誘導体の反応性を低下せしめるアラニンで置換されている、請求項１−４のいずれかのスタフィロキナーゼ誘導体。７．基本的に図１に記されたアミノ酸配列を有し、その中で１以上のアミノ酸がエピトープのクラスターＩおよびIIIに対するモノクローナル抗体パネルとの誘導体の反応性を低下せしめるアラニンで置換されている、請求項１−４のいずれかのスタフィロキナーゼ誘導体。８．図１に記されたアミノ酸配列を有し、その中で下線を引いたクラスター８におけるアミノ酸、７４位のＬｙｓ、７５位のＧｌｕおよび７７位のＡｒｇが対応するエピトープを変えるアラニンで置換されている、スタフィロキナーゼ誘導体Ｍ８。９．図１に記されたアミノ酸配列を有し、その中で下線を引いたクラスター３におけるアミノ酸、３５位のＬｙｓおよび３８位のＧｌｕが対応するエピトープを変えるアラニンで置換されている、スタフィロキナーゼ誘導体Ｍ３。１０．図１に記されたアミノ酸配列を有し、その中で下線を引いたクラスター９におけるアミノ酸、８０位のＧｌｕおよび８２位のＡｓｐが対応するエピトープを変えるアラニンで置換されている、スタフィロキナーゼ誘導体Ｍ９。１１．図１に記されたアミノ酸配列を有し、その中で下線を引いたクラスター３および８におけるアミノ酸、３５位のＬｙｓ、３８位のＧｌｕ、７４位のＬｙｓ、７５位のＧｌｕおよび７７位のＡｒｇが対応するエピトープを変えるアラニンで置換されている、スタフィロキナーゼ誘導体Ｍ３.８。１２．図１に記されたアミノ酸配列を有し、その中で下線を引いたクラスター８および９におけるアミノ酸、７４位のＬｙｓ、７５位のＧｌｕ、７７位のＡｒｇ、８０位のＧｌｕおよび８２位のＡｓｐが対応するエピトープを変えるアラニンで置換されている、スタフィロキナーゼ誘導体Ｍ８.９。１３．工程、ａ．スタフィロキナーゼの生物活性を提供する、少なくともそのコード配列の部分を含むＤＮＡフラグメントを製造し、ｂ．野生型アミノ酸の１以上のコドンを他のアミノ酸のコドンで置換するために、インビトロ部位特異的変異形成を行い、ｃ．適当なベクター内で変異フラグメントをクローニングし、ｄ．該ベクターで適当な宿主細胞を形質転換すなわちトランスフェクトし、ｅ．該ＤＮＡフラグメントを発現するのに適した条件で該宿主細胞を培養する、を含む請求項１−１２のいずれかのスタフィロキナーゼ誘導体を製造する方法。１４．ＤＮＡフラグメントがプラスミドｐＭＥＸ６０２ＳＡＫの４５３ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントであり、プラスミドｐＭａ／ｃおよび修復欠失Ｅ．ｃｏｌｉ株ＷＫ６ＭｕｔＳを用いてインビトロ部位特異的変異形成をオリゴヌクレオチド特異的変異形成系により行い、該変異ＤＮＡフラグメントをＥ．ｃｏｌｉ株ＷＫ６内で発現する、請求項１３の方法。１５．請求項１−１２のいずれかのスタフィロキナーゼ誘導体の少なくとも１つを適当な賦形剤と共に含む医薬組成物。１６．動脈血栓症を処置するための請求項１５の医薬組成物。１７．動脈血栓症の処置に使用するための請求項１−１２のいずれかのスタフィロキナーゼ誘導体。１８．動脈血栓症の処置のための医薬組成物の製造における請求項１−１２のいずれかのスタフィロキナーゼ誘導体の使用。【手続補正書】【提出日】１９９９年８月５日（１９９９．８．５）【補正内容】明細書中、次の箇所を補正する。（１）２８頁９行および１０行、「上記の」とあるを「従前に記載された」と訂正する。（２）同頁１１行および１３行、「開出」とあるを「開通」と訂正する。（３）同頁１４行、「血管」の後に「の開通」を挿入する。[Procedure of Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Submission date] November 11, 1996 (1996.11.11) [Correction contents] The scope of the claims 1. Staphylococci with reduced immunogenicity compared to wild-type staphylokinase Nase derivative. 2. Basically has the amino acid sequence of wild-type staphylokinase or its modified form. Wherein at least one immunodominant epitope modifies the activity of the derivative. 2. The staphylokinase derivative of claim 1, which is deleted without breaking. 3. Basically has the amino acid sequence shown in FIG. 1, and one or more underlined therein. Other amino acids where one or more amino acids of the cluster that destroyed the corresponding epitope The staphylokinase derivative according to claim 1 or 2, which is substituted with an acid. 4. Basically has the amino acid sequence shown in FIG. 1, and one or more underlined therein. Alanine in which one or more amino acids in the cluster 4. The staphylokinase derivative of claim 3, which is substituted. 5. Basically has the amino acid sequence shown in FIG. 1, wherein one or more amino acids Are monoclonal antibody panels against cluster I of epitopes (eg, antibodies 17G11, 26A2, 30A2, 2B12 and 3G10) 5. The compound according to claim 1, which is substituted with alanine which reduces the reactivity of Staphylokinase derivatives. 6. Basically has the amino acid sequence shown in FIG. 1, wherein one or more amino acids Are monoclonal antibody panels against cluster III of the epitope (eg, Derivatives of the form 7H11, 25E1, 40C8, 24C4 and 1A10) 5. The compound according to claim 1, which is substituted with alanine which reduces the reactivity of Staphylokinase derivatives. 7. Basically has the amino acid sequence shown in FIG. 1, wherein one or more amino acids With monoclonal antibody panels against epitope clusters I and III 5. The method according to claim 1, wherein the derivative is substituted with alanine which reduces the reactivity of the derivative. A staphylokinase derivative. 8. Cluster 8 having the amino acid sequence depicted in FIG. 1 and underlined therein The amino acid at position 74, Lys at position 74, Glu at position 75 and Arg at position 77 Staphylokinase induction replaced by alanine altering the corresponding epitope Body M8. 9. Cluster 3 which has the amino acid sequence shown in FIG. 1 and is underlined therein Corresponding to the amino acid at position 35, Lys at position 35 and Glu at position 38 Staphylokinase derivative M3, which is substituted with alanine which changes 10. Clusters having the amino acid sequence shown in FIG. 1 and underlined therein The amino acid at 9, Glu at position 80 and Asp at position 82 correspond to the epitope Staphylokinase derivative M9, which is substituted with alanine that changes the group. 11. Clusters having the amino acid sequence shown in FIG. 1 and underlined therein Amino acids at 3 and 8, Lys at position 35, Glu at position 38, Ly at position 74 s, Glu at position 75 and Arg at position 77 alter the corresponding epitope Staphylokinase derivative M3.8, which is substituted with 12. Clusters having the amino acid sequence shown in FIG. 1 and underlined therein Amino acids at 8 and 9, Lys at position 74, Glu at position 75, Ar at position 77 g, Glu at position 80 and Asani at position 82 alter the corresponding epitope Staphylokinase derivative M8.9, which is substituted with 13. Process, a. At least a portion of its coding sequence that provides staphylokinase biological activity Producing a DNA fragment containing b. To replace one or more codons of a wild-type amino acid with a codon of another amino acid Performing in vitro site-specific mutagenesis, c. Cloning the mutant fragment in a suitable vector, d. Transforming or transfecting a suitable host cell with the vector, e. Culturing the host cell under conditions suitable for expressing the DNA fragment; A method for producing the staphylokinase derivative according to any one of claims 1 to 12, which comprises: 14． The DNA fragment is the 453 bp plasmid pMEX602SAK. EcoRI-HindIII fragment, plasmid pMa / c and Repair-defective E. In vitro site-directed mutagenesis using E. coli strain WK6MutS Is performed by an oligonucleotide-specific mutagenesis system, and the mutated DNA fragment To E. 14. The method of claim 13, which is expressed in E. coli strain WK6. 15. 13. At least one of the staphylokinase derivatives according to any of claims 1-12. A pharmaceutical composition comprising one of the above with a suitable excipient. 16. 16. The pharmaceutical composition according to claim 15, for treating arterial thrombosis. 17． 13. The stuff according to any of claims 1-12 for use in treating arterial thrombosis. Irokinase derivatives. 18. 13. The method of claim 1-12, in the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of arterial thrombosis. Use of any staphylokinase derivative. [Procedure amendment] [Submission date] August 5, 1999 (1999.8.5) [Correction contents] In the description, the following parts are amended. (1) Page 28, lines 9 and 10, "above" is corrected to "previously described" Correct. (2) Lines 11 and 13 of the same page, "open" are corrected to "open". (3) Insert “open” after “blood vessel” on line 14 of the same page.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号９５２０１５３１．１ (32)優先日平成７年６月９日(1995．6．9) (33)優先権主張国ヨーロッパ特許庁（ＥＰ） (31)優先権主張番号７／２９９７８１ (32)優先日平成７年11月17日(1995．11．17) (33)優先権主張国日本（ＪＰ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (31) Priority claim number 952015531.1 (32) Priority date June 9, 1995 (June 9, 1995) (33) Countries claiming priority European Patent Office (EP) (31) Priority claim number 7 / 299,781 (32) Priority date November 17, 1995 (November 17, 1995) (33) Priority claim country Japan (JP) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, U G), EA (AZ, BY, KZ, RU, TJ, TM), A L, AM, AT, AU, AZ, BB, BG, BR, BY , CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IS, JP, KE, KG, K P, KR, KZ, LK, LR, LS, LT, LU, LV , MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, S K, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ , VN

Claims

[Claims] 1. Staphylococci with reduced immunogenicity compared to wild-type staphylokinase Nase derivative. 2. Basically has the amino acid sequence of wild-type staphylokinase or its modified form. Wherein at least one immunodominant epitope modifies the activity of the derivative. 2. The staphylokinase derivative of claim 1, which is deleted without breaking. 3. Basically has the amino acid sequence shown in FIG. 1, and one or more underlined therein. Other amino acids where one or more amino acids of the cluster that destroyed the corresponding epitope 2. The staphylokinase derivative of claim 1, which is substituted with an acid. 4. Basically has the amino acid sequence shown in FIG. 1, and one or more underlined therein. Alanine in which one or more amino acids in the cluster 4. The staphylokinase derivative of claim 3, which is substituted. 5. Basically has the amino acid sequence shown in FIG. 1, wherein one or more amino acids Is the anti-derivative of the panel of monoclonal antibodies against cluster I of the epitope. 2. The staphylokinase of claim 1, wherein the staphylokinase is substituted with alanine which reduces responsiveness. Derivatives. 6. Basically has the amino acid sequence shown in FIG. 1, wherein one or more amino acids Is derived from a panel of monoclonal antibodies against cluster III of the epitope 2. The staphylokiner of claim 1, wherein the staphylokiner is substituted with an alanine that reduces reactivity. Ze derivative. 7. Basically has the amino acid sequence shown in FIG. 1, wherein one or more amino acids Reduces the reactivity of derivatives with monoclonal antibody panels I and III 2. The staphylokinase derivative of claim 1, which is substituted with lanine. 8. Cluster-8 having the amino acid sequence depicted in FIG. 1 and underlined therein The amino acid at position 74, Lys at position 74, Glu at position 75 and Arg at position 77 Staphylokinase induction replaced by alanine altering the corresponding epitope Body M8. 9. Cluster 3 which has the amino acid sequence shown in FIG. 1 and is underlined therein Corresponding to the amino acid at position 35, Lys at position 35 and Glu at position 38 Staphylokinase derivative M3, which is substituted with alanine which changes 10. Clusters having the amino acid sequence shown in FIG. 1 and underlined therein The amino acid at 9, Glu at position 80 and Asp at position 82 correspond to the epitope Staphylokinase derivative M9, which is substituted with alanine that changes the group. 11. Clusters having the amino acid sequence shown in FIG. 1 and underlined therein Amino acids at 3 and 8, Lys at position 35, Glu at position 38, Ly at position 74 s, Glu at position 75 and Arg at position 77 alter the corresponding epitope Staphylokinase derivative M3.8, which is substituted with 12. Clusters having the amino acid sequence shown in FIG. 1 and underlined therein Amino acids at 8 and 9, Lys at position 74, Glu at position 75, Ar at position 77 g, G1u at position 80 and Asani at position 82 alter the corresponding epitope Staphylokinase derivative M8.9, which is substituted with 13. Process, a. At least a portion of its coding sequence that provides staphylokinase biological activity Producing a DNA fragment containing b. To replace one or more codons of a wild-type amino acid with a codon of another amino acid Performing in vitro site-specific mutagenesis, c. Cloning the mutant fragment in a suitable vector, d. Transforming or transfecting a suitable host cell with the vector, e. Culturing the host cell under conditions suitable for expressing the DNA fragment; A method for producing the staphylokinase derivative according to claim 1, comprising: 14． The DNA fragment is the 453 bp plasmid pMEX602SAK. EcoRI-HindIII fragment, plasmid pMa / c and Repair-defective E. In vitro site-directed mutagenesis using E. coli strain WK6MutS Is performed by an oligonucleotide-specific mutagenesis system, and the mutated DNA fragment To E. 14. The method of claim 13, which is expressed in E. coli strain WK6. 15. A pharmaceutically acceptable carrier comprising at least one of the staphylokinase derivatives of claim 1. And a pharmaceutical composition comprising the same. 16. 16. The pharmaceutical composition according to claim 15, for treating arterial thrombosis.