【発明の詳細な説明】
ＤＨＥＡ組合せ療法本発明の概要
本発明によれば、インターロイキン１２および／またはインターロイキン１０
の合成または効果の増強または削減によってインターロイキン１２（ＩＬ−１２
）および／またはインターロイキン１０（ＩＬ−１０）の正常なレベルを修復す
るために使用するための化合物の組合せが提供させる。
本発明の一つの主題によれば、本発明者は米国特許第4,956,355号〔プレンダ
ーガスト(Prandergast)〕に開示されたように、抗ウイルス剤（下記一般式Ｉで
示す）はインターロイキン１０の合成および／または作用を抑制する薬剤との組
合せ療法に使用したとき更なる有益な治療効果を示すことを見出した。インター
ロイキン１０を抑制する薬剤は、この米国特許に記述されたように、スクリーニ
ング・プロトコル（スクリーニングＩＬ−１０）において使用されたときに、イ
ンターロイキン１０抑制を立証する薬剤に加えて環状ＡＭＰ（アデノシン・モノ
ホスフェート）活性を抑制する能力を有する化合物を確認することによって明ら
かにされる。インターロイキン１０の合成は、下記化合物の一種または組合せを
含めて、種々の化合物のいずれかによって抑制される：カナバニン・サルフェー
ト、Ｌ−カナバニン・サルフェート、ヘルビマイシン（Herbimycin）Ａ〔和光純
薬工業（株）〕、ジェニスタイン（Genistein）〔シグマ・ケミカルス・カンパ
ニー(Sigma Chemicals Co.)、セント・ルイス(St．Louis)、ミズーリ（Mo）、米
国〕、セカロン酸Ｄ、イソフラビノイド、サイトカイニン、両親媒性トリテルペ
ノイド、または上記の類似物ならびにインターロイキン１０またはそのペプチド
連鎖のいずれかに対するポリクロナルまたはモノクロナル抗血清。
抗ウイルス剤は下記一般式（Ｉ）を有する１７−ケトステロイド化合物である
。 ここでＲは水素原子であり、R1は水素原子、SO2OM基（ここでＭは水素原子お
よびナトリウム原子からなる群から選ばれる）、スルファチド基（II）（ここで
R2およびR3は夫々同一かまたは異なり、１〜14炭素原子の直鎖状および分枝
状アルキル基から選ばれる）、ホスファチド基（III）
（ここR2およびR3は同一かまたは異なり１〜14炭素原子の直鎖状または分枝状ア
ルキル基から選ばれる）、およびグルクロニド基（IV）
からなる群から選ばれた化学基であり、式（Ｉ）において破線は光学的二重結合
を表わし、５の位置の水素原子はα−またはβ−構造で存在するか、または上記
ステロイド化合物（Ｉ）はα−およびβ−構造の混合物である。R1が水素原子以
外のとき、化合物は共役化合物である。
本発明の他の主題によれば、抗ウイルス剤、抗バクテリア剤、抗マイコプラズ
マ剤または抗細胞内寄生虫剤としての一種またはそれ以上の１７−ケトステロイ
ド化合物を、インターロイキン１０（サイトカイン抑制因子）に対するポリまた
はモノクロナル性抗血清と組合せて、および／またはこの特定のサイトカイン・
インターロイキン１０の合成またはその生物学的機能を効果的に抑制することが
できる、いずれかの化合物と共に、および／またはインターロイキン１０（サイ
トカイン抑制因子）受容体分子ブロック剤と共に用いるときにTh1免疫保護応答
を高める方法が提供される。
たとえば、Th1免疫保護応答は抗ガン剤、抗ウイルス剤、抗転位剤、多くの薬
剤に耐性のあるガン細胞および／またはバクテリア、非耐性バクテリア感染治療
を必要とする患者に要求される。
本発明は又、かかるいずれかの治療を提供するための薬剤の製造に、かかる化
合物の使用を意図するものである。
本発明による薬剤処方物は局所的に、または全身的に投与される。全身的投与
とは、血液中に、または活性成分の投与部位から離れた部位に表われる活性成分
の有効レベルをもたらす、いずれかの投与の形態または経路を意味する。
本発明による全身的投与のための薬剤処方物は、経腸的、腸管外、または局所
的投与のために配合される。事実、これら三種の全ての処方物は活性成分の全身
的投与を達成するために同時に使用することができる。
経口投与のための好適な処方物は、硬質または軟質ゼラチンカプセル、糖衣剤
、丸剤、錠剤（コーティングされた錠剤を含む）、エリキシル剤、懸濁物、シロ
ップまたは吸入剤、および自由な、しかし制御された形状を含む。
経口投与のためのこれら処方物に加えて固体の投薬形状には直腸坐薬を含む。
局所投与に好適な形状は、クリーム、ゲル、ゼリー、粘滑剤、ペーストおよび
軟膏を含む。ケトステロイド化合物は、又、経皮投与のために、例えば全身的投
与を達成するために経皮性絆創膏の形状に処方することができる。
好適な注射用溶液には、静脈内、皮下および筋肉内注射用の溶液が含まれる。
また化合物は、温浸溶液または鼻からの吸入剤またはスプレイの形状で投与され
る。
本発明による薬学的処方物は活性成分の10〜1000mgを含む単位投与量で投与さ
れる。好ましくは、各単位投与量は５〜500mgの各活性成分を含む。本発明によ
れば、薬剤組成物は少なくとも二種の活性成分を含む。
本発明の一態様によれば、１日当り、１単位投与量から10単位投与量の割合い
が組合せ療法で投与される。本発明による組合せ療法は、少なくとも１日継続さ
れ、そしてある場合には、その個人に終身適用される。
一般式（Ｉ）による化合物は米国特許第4,956,355号〔プレンダーガスト(Pren
dergast)〕に開示されており、その全体を参考までに述べる。
式（Ｉ）の化合物において、好ましくはＲおよびR1は夫々水素である。特に好
ましい化合物はデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）であり、ここでＲお
よびR1は夫々水素であり、二重結合が存在する。
本発明の更なる態様においては、化合物（Ｉ）はエピアンドロステロンであり
、ここでＲおよびR1は夫々水素であり、二重結合は存在しない。この５の位置が
不飽和のステロイドは、Ｒの位置が下記ハロゲン（臭素、塩素、フッ素、ヨウ素
）のいずれかによって占められた抗ウイルス剤として合成することもできる。
本発明の更なる態様において、化合物（Ｉ）は１６α−ブロムエピアンドロス
テロンであり、Ｒは臭素であり、R1はＨであり、かつ二重結合が存在する。本発
明の更に更なる態様において、式（Ｉ）による化合物はＲがBrであり、R1がＨで
あり、かつ二重結合は存在しない（すなわち、式（Ｉ）に示した点線で示された
部分に一重結合が存在する）。
他の好ましい化合物はデヒドロエピアンドロステロン・サルフェートであり、
ここでＲはＨであり、R1はSO2-OMであり、Ｍは上記定義したとおりであり、二重
結合が存在する５β−アンドロスタン−３β−オール−１７−オンである。
更に上記に代わる化合物がデヒドロエピアンドロステロン・スルファチド、ホ
スファチドまたはグルクロニドから選択され、ここでＲはＨであり、R1は上記定
義したとおりスルファチド、ホスファチドまたはグルクロニドであり、二重結合
が存在する。特にR1が水素でない場合に、化合物はヘキシル・サルフェート、ド
デシルサルフェート、オクタデシル・サルフェート、オクタデカノイルグリコー
ル・サルフェート、Ｏ−ジヘキサデシルグリセロ・サルフェート、ヘキサデカン
・スルホネート、ジオクタデカノイルグリセロ・ホスフェート、Ｏ−ヘキサデシ
ルグリセロ・ホスフェートのようなＤＨＥＡ共役体である。ヒューストンにおける検討
ＨＩＶ＋の患者におけるＤＨＥＡ使用療法の実験的証拠によって、抗体エリー
ザ(ELISA)法によって測定されたように、ＩＬ−１２レベルが高められ、自然の
キラ一細胞レベルがγ−インターフェロンの合成および存在と共に増大し、ＨＩ
Ｖ ＰＣＲ(ＲＮＡ)測定および定量的培養技術によって測定されたようにＨＩＶ
ウイルス負荷はＤＨＥＡ単独による４週間の治療の後に１ログ(log)以上の低下
が明らかにされた。しかしながら、ウイルス負荷レベルは著しく低下したものの
、Th1免疫改善は起こらなかった。事実、ＤＨＥＡによる、この単独療法によっ
て生じたインターロイキン１２の上昇したレベルに起因して、インターロイキン
１０のレベルが増大し、その結果としてのＴ４〔ヘルパー（helper）〕細胞数の
下落とTh1(遅延型過敏性応答)の消失をもたらした。患者のデータによって証明
されたように、患者における皮膚反応は、いくつかの従前の確信に反してＤＨＥ
Ａ単独療法によって減少方向に制御された。ＤＨＥＡ単独療法によって高められ
たインターロイキン１０の除去によってのみ皮膚反応が修復される。サンフランシスコにおける検討（インビボ）
以下はＨＩＶ疾患の患者における経口ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロ
ン）耐性および薬物動態論の開放された投与量漸増試験において、単独療法とし
てＤＨＥＡ使用の結果である。第１段階ＤＨＥＡ試験（初期症状ＨＩＶ疾患およ
び200〜500 CD4+リンパ球／μＬ）において、コントロールとして偽薬が与えら
れた患者における絶対的ＣＤ４カウントは平均して５細胞／月下落した。これに
対して、第１段階ＤＨＥＡ試験（他の試験における偽薬が投与された患者のそれ
よりも免疫系がより早く減退することが予期されなかった）において検討された
最低投与量の群における患者は31細胞／月の平均ＣＤ４＋下落を示した。組合せ療法を用いるインビボ試験
ＤＨＥＡ単独療法のこのTh1免疫抑制副作用を妨げるために、この抗ウイルス
性ステロイドをインターロイキン１０の合成および／または作用を抑制または妨
害する薬剤と組合せた。この組合せ療法は上記抗ウイルス剤〔一般式（Ｉ）によ
る化合物〕の好ましい使用態様であり、ここで抗ウイルス剤がTh1応答を発生せ
しめる。抗ウイルス療法のTh1抑制的インターロイキン１０免疫副作用を妨げる
組合せ療法の成分は、インターロイキン１０および／または望ましくないインタ
ーロイキン１０の合成または有効性を抑制または妨害する化合物に起因するポリ
クロナルまたはモノクロナル抗血清である。インターロイキン１０を抑制する代
表的化合物は米国特許第5,292,725号〔プレンダーガスト(Prendergast)〕に開示
されており、その全体をここに参考までに加入したが、抗ウイルス単独療法のTh1
免疫抑制副作用を妨げるために組合せ療法において用いられた。
組合せ療法がＨＩＶ＋患者に対して施された場合、各患者血液流からのウイル
ス粒子の除去は単独療法の場合に対して３倍ログ(log)も高められ、一方、Th1（
Ｔ４ペルパー細胞カウント）を80％以上も高めた。セロコンバージョンにおいて
失われた遅延型過敏性応答もまた、回復した。非毒性、非耐性菌株発生抗ウイル
ス性剤としてのＤＨＥＡを、抗血清および／またはインターロイキン１０産生お
よび／またはインターロイキン１０の効果を抑制するために必要な化合物と組合
せて使用する、この組合せ療法は、単独療法としてＤＨＥＡのみの使用によって
従来、達成することのできなかった実質的な治療上の利点を達成することを可能
にする。式（Ｉ）の化合物の抗ウイルス作用と共に、免疫系を上昇方向に制御す
るこの有利な作用（米国特許第4,956,355号〔プレンダーガスト(Prendergast)〕
は、ＨＩＶ治療により広い治療上の有用性を有する。議論
ＤＨＥＡの投与後のサイトカイン生産の状況は、ＤＨＥＡ療法に従来、起因す
るとされた治療上の利点を我々に再検討させた。我々は今や、狼瘡患者および他
のTh1自己免疫条件に対するＤＨＥＡ療法の治療上の利点は、ＤＨＥＡの投与に
よって患者に達成された内因性のインターロイキン１０のレベルの増大に直接的
に関係することを知った。骨髄移植拒絶反応は、ＩＬ−１０レベルを高めるため
のＤＨＥＡ投与によって緩解方向に置かれる。医者の報告
患者：ＲＤ−ＤＯＢ１４／７／１９８３
ＲＤは私が治療している患者である。彼は異質遺伝子型骨髄移植の後に急性骨
髄性赤白血病が緩解傾向にある。彼の主要な疾患問題は腸移植(GUT Graft)対宿
主疾患(Host Disease)であり、重い肺疾患であった。ＲＤの一般的健康は過去３
月以上で改善された。このことは彼が治療を受けたことと一致し、彼は現在、良
好な健康を楽しんでいる。彼の診断以来初めて、彼は学校で一日中楽しむことが
できた。彼はもはや鼻からの吸引を必要とせず、または下痢で苦しむこともない
。彼の肺機能は30％が残存するが、彼の運動許容性は劇的に改善された。彼はも
はや車椅子を必要とせず、軽い運動をすることができる。彼は他の薬剤による治
療を受けておらず、かつ我々の薬物療法をほぼ３か月間受けているので、我々
はこの治療が彼の体にかかる有益な効果を及ぼしていると考えねばならない。治
療開始以前は、彼は一日当り４回、必要に応じて経口ステロイドと共にベントリ
ン（Ventolin）、アトロベント（Atrovent）およびプルミコート(Pulmicort)を
呼吸器に噴霧した。現在では彼は一日当り２回、噴霧するのみである。私は明白
な副作用なしで彼の健康におけるような広範な改善を見たことがない。
我々の実験において、彼らの内因性インターロイキン１０レベルの上昇を達成
した患者は狼瘡の緩解を経験した。これに対してＤＨＥＡを投与されたが、しか
しながら他のサイトカインおよび免疫要因によってインターロイキン１０上昇を
経験しなかった患者は症状の軽減を示さなかった。従って、我々はこれら自己免
疫条件における即時の軽減をもたらす、より直接的な手段は、狼瘡および移植対
宿主疾患の症状の緩解を容易にするために、組換えインターロイキン１０を外因
的に投与することであることを確認した。
従来からＤＨＥＡに帰せられていた潜在的な治療上の利点の他の領域は年配者
における免疫系によるワクチン抗原認識を高めることである。このことは、ワク
チン補助剤としてのＤＨＥＡによる治療効力に対して達成されたインターロイキ
ン１０レベルの我々の分析によって今や確認され、立証された。我々は、組換え
インターロイキン１０を年配者に抗原ワクチンによる治療と共同して、または治
療に先立って抗原ワクチンと共に投与することによって、高められた補助剤効果
を創造し、これは抗体応答を直接的に高めることを確認した。これに対して、Ｄ
ＨＥＡではインターロイキン１０の高められたレベルを生じないチャンスがある
。ＤＨＥＡによる療法の有効性は、代謝、達成された血液レベル、およびワクチ
ン抗原と共に、またはこれに先立ってのＤＨＥＡ投与のタイミングに実際に依存
する。組換えインターロイキン１０の共同投与は、年配者または非常に若い患者
における高められた抗体応答を達成する、より直接的な手段であり、ステロイド
代謝およびＤＨＥＡ単独療法に関連したサイトカイン応答の不明確性を除去する
。このことは、何故にＤＨＥＡが極めてしばしば、特定の条件、たとえば狼瘡、
ＭＳおよびＨＩＶの治療において矛盾した応答を生ずるかを最初に説明するもの
であり、なぜならば真の治療効果は、ステロイドまたはその類似体の投与によっ
て生成したサイトカインのプロフイルおよび免疫反応に依存するからである。従
っ
て、ＤＨＥＡの治療上の有効性は免疫モジュレータとして予測できず、ＤＨＥＡ
治療中または治療前の患者のステロイド代謝およびサイトカイン・プロファイル
の両方に依存する。ステロイドが最初に投与されると、免疫治療応答は患者に極
めて特異的であり、矛盾のない治療上の利益を確実にもたらすとすることができ
ない。望ましい免疫治療応答は要求されたインターロイキン１０サイトカインを
直接的に用いることにより、またはインターロイキン１０抑制剤および／または
特定の抗血清をそれと共に投与することによってのみ達成することができる。こ
のようにして組合せ療法において投与されたＤＨＥＡはインターロイキン１０の
一般的なネガティブな効果なしでインターロイキン１２を高めることを容易にし
、一方、Th1応答は治療上の利点として望ましい。ＤＨＥＡ療法に応答する患者
およびＤＨＥＡ療法に応答しない患者のＤＨＥＡによる実験およびサイトカイン
・プロファイルが、狼瘡の臨床的症状を緩和するために観察された治療上の応答
に、高められたインターロイキン１０が責任ある活性化剤であるという私の発見
に導いた。ＤＨＥＡおよび高められた抗体生産を有するワクチン抗原に応答した
、年配者のサイトカイン・プロファイルによる他の実験では、インターロイキン
１０が高められたワクチン応答の創造に責任のある活性化剤であるという発見に
導いた。一般的には、この患者のプロファイルは通常では、年齢のために減少し
た抗原ワクチンまたは免疫応答を有する。多発性硬化症はTh1自己免疫条件であ
り、Th1免疫応答を下方に制御し、かつ条件の緩解をもたらすためにインターロ
イキン１０を要求する。我々はこの条件のＤＨＥＡ治療に類似した応答を見出し
、狼瘡、すなわち患者の大きな変異性の治療を発見した。多発性硬化症における
症状の何らかの緩解がインターロイキン１０の内因性レベルの著しい上昇を経験
した患者によって確認された。従って、ルウイス(Lewis)・ラットにおける多発
性硬化症モデルに対する組換え型インターロイキン１０の直接的採取が症状の緩
解を立証した。もしもインターロイキン１０がミエリン損害（myelin damage)の
開始に先立って投与されると、症状が全く防止される。
ＨＩＶ＋血液による、ワシントンにおけるインビトロ・ＤＨＥＡ ＩＬ−１２ 検討 ＤＨＥＡがインターロイキン１２の内因性レベルを高めることの、プロトコル （protocol）
ＨＩＶ−特定細胞−介在のＤＨＥＡによる免疫応答の修復
一種類のＨＩＶ−１ネガティブ・コントロール（Ｅ９Ｂ）および３種のＨＩＶ
−１ポジティブな検体（Ｅ９Ｃ、Ｅ９ＥおよびＥ９Ｆ）がｇｐ１２０の存在下に
ＤＨＥＡまたはＩＬ−１２の添加によって刺激された。これら夫々の場合におい
て、ＤＨＥＡによってもたらされた刺激はＩＬ−１２によってもたらされた刺激
と同等であるか、またはより大きかった。しかしながら、刺激をもたらすＤＨＥ
Ａの濃度は試料ごとに変化した。残りの血液試料Ｅ９Ａ（ＨＩＶ−１ネガティブ
）においては、Ｅ９ＤおよびＥ９Ｇ（ＨＩＶ−１ポジティブ）と同様に、ｇｐ１
２０の存在下における増殖がＤＨＥＡまたはＩＬ−１２の添加によって抑制され
た。
ヒトＩＬ−１２は、４０−および３５−ｋＤサブユニットからなる、ジスルフ
イド結合のヘテロダイマー性サイトカインである。このサイトカインのための遺
伝子がクロン化され、精製された組換え型タンパク質が得られた。最近において
、ネズミ・インターロイキン１２（ＩＬ−１２）のマウスへのインビボ投与によ
って、細胞毒性ナチュラル・キラー（ＮＫ）／リンパ球活性化キラー細胞活性の
増大、細胞溶解性Ｔ細胞生成の増強およびインターフェロンγ分泌の誘発をもた
らすことが明らかにされた。この研究において、多数のネズミの腫瘍に対するネ
ズミＩＬ−１２のインビボ活性が評価された。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫の実験的肺転
位または皮下増殖はＩＬ−１２によって腹腔内処理されたマウスにおいて著しく
低減し、生存時間の増加をもたらした。ＩＬ−１２の治療上の有益性は投与量依
存であり、皮下肉腫の治療は、著しい毒性をもたらさない投与量においてＩＬ−
１２によって効果的に行われる。定着した皮下レンカ（Renca)肉腫へのＩＬ−１
２の局所的肉腫周辺注入によって、これら腫瘍の経減と完全な消失をもたらした
。ＩＬ−１２はＮＫ細胞欠損ベージュ(beige)マウスまたは抗無唾液（antiasial
o）ＧＭ１による処理によってＮＫ細胞活性の涸渇したマウスに有効であり、こ
のことはＮＫ細胞がこのサイトカインの抗腫瘍効果を介在する主な細胞タイプで
はないことを示唆している。しかしながら、ＩＬ−１２の効力はヌードマウスに
おいて著しく低下し、Ｔ細胞の掛かり合いを示唆している。更に、ＣＤ４＋Ｔ細
胞ではなく、ＣＤ８＋Ｔ細胞の涸渇はＩＬ−１２の効力を著しく低下させた。こ
れら
の結果は、ＩＬ−１２はインビボにおける抗腫瘍に有効であり、ネズミ腫瘍に対
する抗転位効果を有することを明らかにし、かつ皮下腫瘍に対する抗腫瘍効果の
介在においてＣＤ８＋Ｔ細胞の臨界的役割が明白にされた。ロスアンジェルスにおける患者の検討
インターロイキン１２と発生したＣＤ８＋細胞との掛かり合いが、本特許のた
めに行なわれたＨＩＶ＋患者の検討において証明された。ＣＤＥ８＋細胞集団を
有する患者はヒト・インターロイキン１０に対するポリクロナル抗体の投与によ
ってベースライン値よりも８４％の増加を示し、かつIIIＶウイルス負荷はゼロ
に低下した。インターロイキン１０の除去はＣＤ８＋細胞の増加を可能にし、か
つＨＩＶ特定細胞介在の免疫応答の復活によってＨＩＶウイルス・クリアランス
を可能にした。
ポリクロナル抗血清の詳述
生産仕様
種 類：ウサギの抗ヒトＩＬ−１０
形 状：液体
濃 度：2.7mg／ml
安 定 剤：なし
保 存 剤：なし
滅 菌 性：滅菌濾過
宿 主 種：ウサギ
抗体クラス：免疫グロブリンＧ
使用抗原：組換え型ヒトＩＬ−１０
精製方法：イオン交換クロマトグラフィ
数量化方法：ピアース（Pierce）ＢＣＡタンパク質定量法
特 異 性：ヒトＩＬ−１０
交差反応性：ＷＨＯ標準との交差反応性なし。
ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１Ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ
−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１ａ、ＴＮＦａおよびＧＭ
−ＣＳＦはＥＩＡによって行なった。
貯 蔵：４℃で短期間、−20℃で長期間材料および薬剤
：インターロイキン１２合成を高めるＤＨＥＡの能力を証明する
ために使用。
１．ＩＬ−２ELISA、家庭で入手可能、最低６プレート。
２．ＭＴＳ定量法、プロメガ(Promega)、最低７プレート。
３．ＩＬ−１２研究・開発システム、(#219-IL)５fgが全実験にとって十分で
ある。
４．ヒトＩＬ−１２受容体に対する抗体、Ｒ＆Ｄシステム(AB-233-NA)、ヒト
の凍結乾燥ゴート（goot）１mg。
５．マサチュセッツ（617-498-8647）州、ケンブリッジ、遺伝研究所の、ヒト
ＩＬ−２のｐ４０鎖に対するウサギのポリクロナル抗体。
６．家庭において入手可能な現地産のｇｐ１２０（50fg／バイアル（vial）、
約１mg／ml）。５nM／mlが必要。夫々が２プレートによる二重の定量法につ
いて50fgで十分。
７．正常なヒト（HIV-1ネガティブ）の刺激しないＰＢＭＣ。
８．非応答性ＰＢＭＣを得るための血液の５ＨＩＶ＋サンプル。サンプル当り
５ml。
９．ＤＨＥＡ（デヒドロイソアンドロステロン）、シグマＤ4000、１ｇ。全実
験の実施に十分である。
10．ＤＨＥＡを溶解するための、100％エタノール。
11．Ｒ１０媒体：ＲＰＭＩ、10％ＦＢＳ、50fg／mlゲンタマイシ。
12．偏平産組織培養用クラスター皿、９６のくぼみ（well）、血液試料当り２
個。プロトコル
１．各血液サンプルについてＰＢＭＣsを分離し、細胞カウントを行なう。
２．患者サンプルから入手可能な全ての細胞を使用する。もしも10×106細胞
またはそれ以上が存在する場合には、二つの９６のクボミのプレートにこの
細胞を接種する。10×106においては、0.5×105細胞／ウェルまたは2.5×
105細胞／mlで終了する。より少ない場合には一つのプレートを使用する。
実際にウェル当りに接種した数を記録する。二つのプレートを用いた場合に
は、一つをＩＬ−２検出用とし、ヒトＩＬ−２受容体に対する抗体を受け取
る。他のプレートは細胞増殖試験のために用い、この抗体を受け取らない。
もしも一つのプレートのみを使用する場合には、このプレートに抗体を受理
する。
３．もしも一つのプレートを使用するならば、細胞を２０mlのＲ１０に再び懸
濁する。もしも二つのプレートの場合には、40ml中に再懸濁する。ウェル当
り、アリコート（aliquot）200fL。終夜、放置する。もしも自然の放置が実
用的でない場合には、プラスチック・ラップでプレートを包み、おだやかな
遠心分離を使用する。
４．いずれの特定の媒体を、どのウェルに添加するかを示す概要図を作成する
（ＩＬ−2ELISAに必要なブランクおよび標準のための必要性の故に、生育（
した全ての複製がELISAに使用されないことに注意すべきである）。
５．各実験は16または32mlの媒体および自然のｇｐ１２０の5nM／mlを必要と
する。ＦＷ＝120,000。１６ml当りの添加量：100fg／ml株の９６ｆＬ（媒体
の各ml当り100fg／mlの6fL）。
また、各試験ごとにＲＩ０媒体の12または24mlを使用する。
十分な注意：このことはＰＢＭＣが反応性であるか否かのキイとなるであ
ろう。もしも細胞がｇｐ１２０の存在下に増殖してＩＬ−２を生成し、ｇｐ
１２０なしでは否であれば、これらの細胞は正常で活性な細胞である。もし
も細胞がｇｐ１２０が添加されたか否かにかかわらず、同様な増殖とＩＬ−
２生成の挙動を示せば、この細胞は不活性である。我々がＩＬ−１２および
ＤＨＥＡの効果を見るのは不活性細胞においてのみである。
６．ＩＬ−2ELISAに用いた各サンプルについてｇｐ１２０の16mlおよびＲ10の
12mlに対してＩＬ−２受容体に対する抗体の２fg／mlを加える。
７．ＤＨＥＡの調製。
７．１ ＤＨＥＡの１ｇを１mlの無水エタノール(100％)に加える。37℃の水
浴中で保温する。追加のエタノールを3.47mlになるまで加える。この結果、
１Ｍ溶液が得られる。もしも全3.47mlが溶液化のために必要ないならば、差
異をＲ１０媒体によって調整する。
７．２ 各サンプルについて、ＤＨＥＡを下記濃度にする媒体を必要とする。
10-4、10-6、10-10、10-12。
７．３ 各希釈度で媒体（既にｇｐ１２０および工程６からの抗体を含んでい
る）の2mlを調整し、第２のプレートを用いるときはｇｐ１２０を含むが抗
体を含まない媒体の他の2mlを調整する。10-8には、夫々の媒体の6mlが必要
である。
夫々の希釈度において、ｇｐ１２０を含まず、かつ工程６からの抗体を含
むか、または含まないＲ１０媒体の２×1.5mmを調整する。10-8には夫々3ml
が必要である。
７．４ 希釈する。5ml管を使用する。
Ａ．１Ｍ ＤＨＥＡの20fLをＲ１０媒体の2ml中に採取する＝10-2Ｍ。
Ｂ．10-2Ｍ ＤＨＥＡの20fLを工程7.3の媒体の2ml中に採取する＝−10-4Ｍ
。10-2Ｍ ＤＨＥＡの15fLをＲ１０の1.5ml中に採取する＝10-4Ｍ。
Ｃ．10-4Ｍ ＤＨＥＡの20fLを工程7.3の媒体の2ml中に採取する＝10-6Ｍ。
10-4Ｍ ＤＨＥＡの15fLをＲ１０の1.5ml中に採取する＝10-6Ｍ。
Ｄ．10-6Ｍ ＤＨＥＡの40fLを工程7.3の媒体の4ml中に採取する＝10-8Ｍ。
10-6Ｍ ＤＨＥＡの30fLをＲ１０の3ml中に採取する＝10-8Ｍ。
Ｅ．10-8Ｍ ＤＨＥＡの20fLを工程7.3の媒体の2ml中に採取する＝10-10Ｍ。
10-8Ｍ ＤＨＥＡの15fLをＲ１０媒体の1.5ml中に採取する＝10-10Ｍ。
Ｆ．10-10Ｍ ＤＨＥＡの20fLを工程7.3の媒体の2ml中に採取する＝10-12
Ｍ。10-12Ｍの15fLを採取する。
７．５ 10-8Ｍ ＤＨＥＡ媒体タイプの半分にヒトＩＬ−１２に対する抗体を
加える。
７．６ 各プレートへのＩＬ−１２媒体。
Ａ．ＩＬ−２に対する抗体を含むおよび含まないｇｐ１２０媒体の2mlに組
換え型ＩＬ−１２の10Ｕ／mlを加える。
Ｂ．ＩＬ−２に対する抗体を有する、および有しないＲ１０の1.5mlに組換
え型ＩＬ−１２の10Ｕ／mlを加える。
Ｃ．１ＥＤ50＝１Ｕ。ＩＬ−１２のＥＤ50はこの薬剤を認めた文献中に存在
する。
８．細胞の媒体を吸引除去し、本実験計画による各々のウェルに適切な媒体の
200fLを添加する。余分の媒体を周辺のウェルに置く。プラスチック・ラッ
プでプレートを包み、含水トレイ上に置く。37℃、５％ＣＯ2で保温する。
９．もしも二つのプレートを使用する定量法であるならば、５日後にＩＬ−２
受容体に対する抗体を有しないプレートから媒体を吸引除去する。Ｒ１０媒
体の100fL／ウエルで置換する。細胞増殖試験を４時間の培養により行なう
。
10．ＩＬ−２受容体に対する抗体を含むプレートを７日の後に使用する。ウェ
ル当り100fL採取し、ＩＬ−２ELISAを行なう。
11．試験のためのプレートがただ一つならば、各ウェルからの残余の上清液を
除去、凍結し、次いでＲ１０媒体の100fL／ウェルを加え、７日のポイント
における細胞増殖試験を進める。
12．ＨＩＶ＋サンプルについて進める前に、全ての薬剤が予想どおりに機能す
るか否かを、まず見るためにＨＩＶ−血液からのＰＢＭＣを行なう。
13．他のＨＩＶ−サンプルは全てのＨＩＶ＋サンプルが完結した後にランすべ
きである。
14．データを集め、解析する。プロトコルの概要
タイトル：インターロイキン１０の特定抑制剤として、イソペンテニルアデノ
シン・５'−モノホスフェートと組合せて投与されたＤＨＥＡの臨床試験。
プロテアーゼおよびＲＴ抑制剤に耐性を示した、ＨＩＶ感染者のために特別に
調整した。
イソペンテニルアデノシン・５'−モノホスフェートと組合されたＤＨＥＡを
、ここでは化合物（Ｄ＋Ｉ）と称する。
指 標：ＨＩＶ−１感染の治療。
研究のタイプ：フェーズ(Phase)Ｉ／・臨床的追跡
研究目的：
ａ．病勢が進んだＨＩＶ疾患の人における、投与された化合物（Ｄ＋Ｉ）の安
定性と許容量を決定する。
ｂ．ＨＩＶウイルスの負荷の測定への、化合物（Ｄ＋Ｉ）の投与の影響を決定
する。血清ＰＣＲ（ＲＮＡ）はＨＩＶｐ２４抗原と同じ水準になる（酸解離
法による）。
ｃ．投与された化合物（Ｄ＋Ｉ）の免疫および毒物学的効果を決定する。
ｄ．投与された化合物（Ｄ＋Ｉ）の薬物動態学的効果を決定する。
含まれる判定基準：
ａ．年齢が１８歳またはそれ以上
ｂ．ＨＩＶ−１セロポジティブ（seropositive）
ｃ．72時間〜28日離れた二つの別々の機会に測定した、研究エントリーに先立
つ１か月以内のＣＤ４＋−Ｔ−リンパ球カウントが50〜300細胞／mm3。
ｄ．下記がベースライン実験室値である。
ヘモグロビン＞ｇｇ／dl
ＷＢＣｓ＞1500細胞／μl
好中球 ＞1000細胞／μl
血小板 25,000細胞／μl
ビリルビン＜2.0mg／dl
ＡＳＴ、ＡＬＴ、アルカリ性ホスファターゼ＜正常上限値の５×クレアチ
ニン＜1.5mg／dl
ｅ．従前の抗レトロウイルス治療の歴史は下記のとおり。
ＡＺＴ、ｄｄｌｍｄｄＣまたはｄ４Ｔ単独またはプロテアーゼ抑制剤との
組合せを使用するレトロウイルス治療の従来の歴史に関係し、研究エントリ
ーにおけるような治療を受けていない患者は研究エントリーにおけるこの薬
物投与を中止すべきである。
ｇ．妊娠−分娩能力のある婦人による適切な避妊薬の使用（妊娠−分娩能力の
ある婦人について研究エントリーに先立つ１週間以内に、血清妊娠試験の一
つにネガティブであることが要求される）。
ｈ．研究エントリーにおける高いＰＲＨＩＶＲＮＡ力価の媒体。除外基準
ａ．登録の８週間以内に化学療法の薬剤による以前の治療。
ｂ．明確なAIDSの日和見的感染または他の生命をおびやかす医学的発症を含む
活性で重大な感染。
ｃ．妊娠中または授乳中の女性。
ｄ．研究者の意見が患者を過度の危険にさらしたり、または研究の目的が危険
にさらす、いずれかの状態。
ｅ．研究のエントリーにおいて、インターフェロンまたはステロイドの薬理学
的投与を含む免疫変動療法を受けている場合。安全性基準
：研究の週ごとに、第４週まで下記のパラメータについて分析する（
表１参照）。
ｉ．有害な事柄のドクメンテーションおよびアセスメント。
ii．血液学。
iii．臨床化学および検尿。
iv．化合物（Ｄ＋Ｉ）からの免疫応答結果のアセスメント。
ｖ．ＰＣＲ（ＲＮＡ）およびＤＮＡ基準の治療による変更のアセスメント。有効性基準
ウイルス負荷の基準はＨＩＶ−ｐ２４抗原血、およびＨＩＶ−ＲＮＡ ＰＣＲ
（細胞を含まない血清）および細胞ＨＩＶ−ＤＮＡ分析を含む。
免疫応答における改善はＣＤ４／ＣＤ８比のベースラインからの変化として測
定される。
臨床によるリンパ球カウント、ＷＢＣにおける、およびインターロイキン１０
レベルにおける変化率％は化合物（Ｄ＋Ｉ）が患者の免疫系をＴH−１状態に変
化させうる能力を証明している。
臨床上の利点は全体重の変化、カルノフスキー(Karnofsky)の活動能力基準お
よびベースラインに存在する疾患の徴候や症状の回復によって評価される。
新しい日和見的感染症の緩解または発生率がまとめられる。研究デザイン：
ラベル公開、患者当り1200mg／日の薬剤量の投与、４週間の治療の後に投薬ス
ケジュールおよび有効性の再検討および評価。研究サイズ
：患者５人（全体）−５人の患者に1200mg／日で30日間投与。試験項目：
試験薬剤：化合物（Ｄ＋Ｉ）粒経サイズ分布87％＜５μｍ、100％＜15μｍ、
カプセル当り20Omgの、ゼラチン・カプセルにおける投与。各カプセルは、ＤＨ
ＥＡ600mgおよびイソペンテニルアデノシン５'−モノホスフェート600mgを含む
。
コントロール薬剤 なし
偽薬 なし
化合物（Ｄ＋Ｉ）投与前および投与後の患者データが要求される。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
DHEA combination therapyOverview of the present invention
According to the present invention, interleukin 12 and / or interleukin 10
Of interleukin 12 (IL-12
Restores normal levels of interleukin 10 (IL-10) and / or
To provide a combination of compounds for use.
In accordance with one subject of the present invention, the inventor has filed US Pat. No. 4,956,355 [Render
As disclosed in Prandergast], antiviral agents (general formula I below)
Shows the combination with an agent that suppresses the synthesis and / or action of interleukin 10.
It has been found that when used in combination therapy, it shows a further beneficial therapeutic effect. Inter
Drugs that inhibit leukin 10 are described in US Pat.
When used in a signaling protocol (Screening IL-10),
Cyclic AMP (adenosine mono-
Identification of compounds that have the ability to inhibit (phosphate) activity
It is made. Interleukin 10 is synthesized by using one or a combination of the following compounds.
Inhibited by any of a variety of compounds, including: canavanine sulfate
, L-canavanine sulfate, Herbimycin A [Wako Jun
Yakuhin Kogyo Co., Ltd.), Genistein (Sigma Chemicals Company)
Knee (Sigma Chemicals Co.), St. Louis, Missouri (Mo), USA
Country], secaronic acid D, isoflavinoids, cytokinins, amphiphilic triterpe
Nooids, or analogs thereof, as well as interleukin 10 or peptides thereof
Polyclonal or monoclonal antisera against any of the linkages.
The antiviral agent is a 17-ketosteroid compound having the following general formula (I)
. Where R is a hydrogen atom and R1Is a hydrogen atom, SOTwoOM group (where M is a hydrogen atom or
And a sodium atom), a sulfatide group (II) (where
RTwoAnd RThreeAre the same or different and are straight-chain and branched of 1 to 14 carbon atoms
Selected from linear alkyl groups), phosphatide group (III)
(Here RTwoAnd RThreeAre the same or different and are straight-chain or branched
Or glucuronide group (IV)
A chemical group selected from the group consisting of:
Wherein the hydrogen atom at position 5 is present in an α- or β-structure, or
Steroid compound (I) is a mixture of α- and β-structures. R1Is a hydrogen atom or less
When outside, the compound is a conjugated compound.
According to another subject of the invention, antiviral agents, antibacterial agents, antimycoplasma
One or more 17-ketosteroys as antimicrobial agents or anti-intracellular parasite agents
Compound is used as a poly- or interleukin 10 (cytokine inhibitor).
May be combined with a monoclonal antiserum and / or
To effectively inhibit the synthesis of interleukin 10 or its biological function
And / or with any compound and / or interleukin 10
Thkine when used with a blocker of receptor molecules1Immunoprotective response
Are provided.
For example, Th1Immunoprotective response is anticancer, antiviral, antitranslocation, many drugs
Treatment of cancer cells and / or bacteria resistant to drugs, and non-resistant bacterial infections
Is required for patients in need.
The present invention also relates to the manufacture of a medicament for providing any such treatment.
It is intended for use with compounds.
The pharmaceutical formulation according to the present invention is administered locally or systemically. Systemic administration
Is the active ingredient that appears in the blood or at a site distant from the site where the active ingredient is administered
Means any form or route of administration that results in an effective level of
Pharmaceutical formulations for systemic administration according to the present invention may be enteral, parenteral, or topical.
Formulated for targeted administration. In fact, all three formulations are systemic
Can be used simultaneously to achieve targeted administration.
Suitable formulations for oral administration include hard or soft gelatin capsules, dragees
Pills, tablets (including coated tablets), elixirs, suspensions, syrups
Includes tablets or inhalants, and free but controlled shapes.
In addition to these formulations for oral administration, solid dosage forms include rectal suppositories.
Forms suitable for topical administration include creams, gels, jellies, demulcents, pastes and
Contains ointment. Ketosteroid compounds may also be used for transdermal administration, for example, by systemic administration.
To achieve application, it can be formulated in the form of a transdermal plaster.
Suitable solutions for injection include solutions for intravenous, subcutaneous and intramuscular injection.
The compound may also be administered in the form of a digestion solution or nasal inhalant or spray.
You.
The pharmaceutical formulation according to the present invention is administered in a unit dose containing 10-1000 mg of the active ingredient.
It is. Preferably, each unit dose contains from 5 to 500 mg of each active ingredient. According to the invention
If so, the pharmaceutical composition contains at least two active ingredients.
According to one aspect of the present invention, a rate of 1 to 10 unit doses per day.
Is administered in combination therapy. The combination therapy according to the invention lasts at least one day.
And in some cases apply to the individual for life.
Compounds according to general formula (I) are described in U.S. Pat. No. 4,956,355 [Prendergast
dergast)], which is incorporated by reference in its entirety.
In the compounds of the formula (I), preferably R and R1Is hydrogen. Especially good
A preferred compound is dehydroepiandrosterone (DHEA), where R and
And R1Is hydrogen and each has a double bond.
In a further aspect of the invention, compound (I) is epiandrosterone
, Where R and R1Are each hydrogen and there are no double bonds. These 5 positions
Unsaturated steroids have the following halogen at the R position (bromine, chlorine, fluorine, iodine)
) Can also be synthesized as antiviral agents occupied by any of the above.
In a further embodiment of the present invention, compound (I) is 16α-bromoepiandroth
Is a heron, R is bromine, R1Is H and a double bond is present. Departure
In yet a further further embodiment, the compound according to formula (I) is wherein R is Br;1Is H
And no double bond is present (ie, as indicated by the dotted line in formula (I))
Part has a single bond).
Another preferred compound is dehydroepiandrosterone sulfate,
Where R is H and R1Is SOTwo-OM, M is as defined above, double
5β-Androstan-3β-ol-17-one where the bond is present.
Further alternatives include dehydroepiandrosterone sulfatide, e.
Selected from sftide or glucuronide, where R is H, R1Is the above
Sulfatide, phosphatide or glucuronide as defined, double bond
Exists. Especially R1Is not hydrogen, the compound is hexyl sulfate,
Decyl sulfate, octadecyl sulfate, octadecanoyl glycol
Le sulfate, O-dihexadecyl glycero sulfate, hexadecane
・ Sulfonate, dioctadecanoyl glycerophosphate, O-hexadeci
DHEA conjugates such as luglycerophosphate.Considerations in Houston
Experimental evidence of DHEA use therapy in HIV + patients suggests that antibody
As measured by the ELISA method, IL-12 levels are increased and the natural
Killer cell levels increase with the synthesis and presence of γ-interferon,
V HIV (RNA) measurement and HIV as measured by quantitative culture techniques
Viral load is reduced by more than 1 log after 4 weeks of treatment with DHEA alone
Was revealed. However, although the virus load level was significantly reduced,
No improvement in Th1 immunity occurred. In fact, this monotherapy by DHEA
Due to elevated levels of interleukin 12
10 levels and the resulting increase in T4 [helper] cell count
Fall and Th1(Delayed hypersensitivity response). Proven by patient data
As noted, the skin reaction in patients was, contrary to some previous beliefs, DHE
Controlled in a decreasing direction by A monotherapy. Enhanced by DHEA monotherapy
Only the removal of interleukin 10 restores the skin reaction.Study in San Francisco (in vivo)
The following are oral DHEA (dehydroepiandrosterol) in patients with HIV disease.
In a dose escalation trial with open tolerance and pharmacokinetics,
DHEA results. Phase 1 DHEA study (early symptoms HIV disease and
And 200-500 CD4 + lymphocytes / μL), placebo was given as a control.
Absolute CD4 counts in affected patients dropped on average 5 cells / month. to this
In contrast, the first-stage DHEA study (one of the patients who received placebo in other studies)
The immune system was not expected to decline sooner than before)
Patients in the lowest dose group showed a mean CD4 + decline of 31 cells / month.In vivo studies using combination therapy
This Th of DHEA monotherapy1This antiviral to prevent immunosuppressive side effects
Sex steroids inhibit or prevent the synthesis and / or action of interleukin 10
Combined with harmful drug. This combination therapy is based on the above antiviral agent [general formula (I)].
Compound), wherein the antiviral agent is Th1Generate a response
Close. Antiviral Therapy Th1Prevent inhibitory interleukin 10 immune side effects
The components of the combination therapy may include interleukin 10 and / or
-Polymers caused by compounds that inhibit or prevent the synthesis or effectiveness of Leukin 10
It is a clonal or monoclonal antiserum. Interleukin 10 suppression
Representative compounds are disclosed in U.S. Pat.No. 5,292,725 (Prendergast)
All of which have been included here for reference, but antiviral monotherapy Th1
Used in combination therapy to prevent immunosuppressive side effects.
Viruses from each patient's bloodstream when combination therapy is given to HIV + patients
Particle removal is three times higher than in monotherapy, while Th1(
T4 perper cell count) increased by more than 80%. In seroconversion
The lost delayed hypersensitivity response was also restored. Non-toxic, non-resistant strain generated anti-virus
DHEA as an antibacterial agent may be used to produce antiserum and / or
And / or compound required for suppressing the effect of interleukin 10
This combination therapy is used as a sole therapy by using DHEA alone.
Ability to achieve substantial therapeutic benefits that were previously unattainable
To Together with the antiviral action of the compounds of formula (I), they regulate the immune system in an upward direction
Advantageous action of rum (US Pat. No. 4,956,355 (Prendergast))
Have broader therapeutic utility in HIV treatment.Discussion
The status of cytokine production following administration of DHEA has traditionally been attributed to DHEA therapy.
We have reconsidered the therapeutic benefits identified. We now have lupus patients and others
Th1The therapeutic benefit of DHEA therapy for autoimmune conditions is that DHEA administration
Thus, a direct increase in the level of endogenous interleukin 10 achieved in the patient
I knew it was relevant. Bone marrow transplant rejection to increase IL-10 levels
Is placed in the direction of remission by administration of DHEA.Doctor's report
Patient: RD-DOB14 / 7/1983
RD is the patient I am treating. He had acute bone after allogeneic bone marrow transplantation
Medullary erythroleukemia tends to remit. His main disease problem is intestinal transplantation (GUT Graft) vs. lodging
It was the main disease (Host Disease) and severe lung disease. RD's general health is past 3
Improved over a month. This is consistent with his treatment, and he is now
Enjoying good health. For the first time since his diagnosis, he has fun all day at school
did it. He no longer needs nose aspiration or suffers from diarrhea
. His lung function remains 30%, but his exercise tolerance has improved dramatically. He is
He does not need a wheelchair and can exercise lightly. He is cured by other drugs
We have been receiving no medical treatment and have been on our medication for almost three months,
Must consider that this treatment has a beneficial effect on his body. Cure
Prior to treatment, he was ventilated four times a day with oral steroids as needed.
Ventolin, Atrovent and Pulmicort
Sprayed on respiratory organs. At present he only sprays twice a day. I am obvious
I have not seen such a wide improvement in his health without any serious side effects.
Achieved an increase in their endogenous interleukin 10 levels in our experiments
The patient who experienced lupus remission. DHEA was administered to this.
While increasing interleukin 10 by other cytokines and immune factors
Patients who did not have no reduction in symptoms. Therefore, we have these self-
A more direct means of providing immediate relief in epidemic conditions is lupus and transplantation
To facilitate remission of the symptoms of the host disease, recombinant interleukin 10
It was confirmed that the administration was performed.
Another area of potential therapeutic benefit previously attributed to DHEA is the elderly
Is to increase the recognition of vaccine antigens by the immune system. This is
Interleuke achieved for therapeutic efficacy with DHEA as a tin supplement
This has now been confirmed and substantiated by our 10-level analysis. We recombine
Interleukin 10 can be used to treat elderly patients in conjunction with or
Enhanced adjuvant effect by administering with antigen vaccine prior to treatment
And confirmed that this directly enhanced the antibody response. In contrast, D
HEA has a chance not to produce elevated levels of interleukin 10
. The effectiveness of DHEA therapy depends on metabolism, achieved blood levels, and vaccine.
Actually depends on the timing of DHEA administration with or prior to antigen
I do. Co-administration of recombinant interleukin 10 is not recommended for elderly or very young patients
Steroids are more direct means of achieving an enhanced antibody response in
Eliminates ambiguity in cytokine response associated with metabolism and DHEA monotherapy
. This is why DHEA is very often used in certain conditions, such as lupus,
First to explain whether conflicting responses occur in the treatment of MS and HIV
Because the true therapeutic effect is due to the administration of steroids or their analogs.
This is because it depends on the profile of the cytokine produced and the immune response. Obedience
Tsu
Thus, the therapeutic efficacy of DHEA cannot be predicted as an immune modulator, and DHEA
Steroid metabolism and cytokine profiles in patients during and before treatment
Depends on both. When the steroid is first administered, the immunotherapy response is extremely
Can be as specific as possible and ensure consistent therapeutic benefit.
Absent. The desired immunotherapeutic response requires the required interleukin-10 cytokine.
By direct use or by interleukin 10 inhibitors and / or
It can only be achieved by administering a specific antiserum therewith. This
DHEA administered in combination therapy as in
Facilitates enhancing interleukin 12 without common negative effects
, On the other hand, Th1Response is desirable as a therapeutic benefit. Patients responding to DHEA therapy
With DHEA and cytokines in patients not responding to and DHEA therapy
The profile of the therapeutic response observed to alleviate the clinical symptoms of lupus
My discovery that elevated interleukin 10 is a responsible activator
Led to. Responsive to vaccine antigens with DHEA and enhanced antibody production
In other experiments with cytokine profiles in the elderly, interleukins
To the discovery that 10 is the activator responsible for creating an enhanced vaccine response
lead. Generally, this patient's profile usually decreases due to age
Have an antigen vaccine or immune response. Multiple sclerosis is Th1Under autoimmune conditions
, Th1Interrogation to down regulate the immune response and to alleviate the condition
Request Ikin 10. We found a response similar to DHEA treatment in this condition
Discovered a treatment for lupus, a major variant of the patient. In multiple sclerosis
Any remission of symptoms experiences a marked increase in endogenous levels of interleukin 10
Was confirmed by the patient. Therefore, multiple occurrences in Lewis rats
Direct collection of recombinant interleukin 10 for multiple sclerosis model
The solution was proved. If interleukin 10 could cause myelin damage
If administered prior to initiation, symptoms are completely prevented.
In vitro DHEA IL-12 in Washington with HIV + blood Consideration Protocol for DHEA to Increase Endogenous Levels of Interleukin 12 (Protocol)
Repair of immune response by HIV-specific cell-mediated DHEA
One HIV-1 negative control (E9B) and three HIV
-1 Positive samples (E9C, E9E and E9F) in the presence of gp120
Stimulated by addition of DHEA or IL-12. In each of these cases
Thus, the stimulation provided by DHEA is the stimulation provided by IL-12.
Was equal to or greater than. However, stimulating DHE
The concentration of A varied from sample to sample. The remaining blood sample E9A (HIV-1 negative)
)), Gp1 as well as E9D and E9G (HIV-1 positive)
20 is inhibited by the addition of DHEA or IL-12
Was.
Human IL-12 is a disulfate composed of 40- and 35-kD subunits.
It is an id-linked heterodimeric cytokine. The remains for this cytokine
The gene was cloned and a purified recombinant protein was obtained. Recently
In vivo administration of murine interleukin 12 (IL-12) to mice
The cytotoxic natural killer (NK) / lymphocyte activated killer cell activity
Increased, increased production of cytolytic T cells and induced interferon gamma secretion
Was revealed. In this study, a number of murine tumors were
The in vivo activity of porcine IL-12 was evaluated. Experimental lung metastasis of B16F10 melanoma
Position or subcutaneous growth is marked in mice treated intraperitoneally with IL-12
Reduced, resulting in increased survival time. The therapeutic benefit of IL-12 is dose dependent
And treatment of subcutaneous sarcoma at doses that do not result in significant toxicity
12 effectively. IL-1 on established subcutaneous Renca sarcoma
Two local perisarcoma injections resulted in loss and complete disappearance of these tumors
. IL-12 can be expressed in NK cell-deficient beige mice or antiasial
o) Effective for mice depleted of NK cell activity by treatment with GM1,
NK cells are the main cell type that mediates the antitumor effect of this cytokine.
There is no suggestion. However, the efficacy of IL-12 has been shown in nude mice.
, Significantly suggesting the involvement of T cells. Furthermore, CD4 + T fine
Depletion of CD8 + T cells, but not vesicles, significantly reduced the efficacy of IL-12. This
These
The results show that IL-12 is effective for in vivo antitumor and
Anti-metastatic effect to subcutaneous tumors
The critical role of CD8 + T cells in intervention has been clarified.Examination of patients in Los Angeles
The interaction between interleukin 12 and the generated CD8 + cells is described in the present patent.
Demonstrated in a review of HIV + patients. CDE8 + cell population
Patients with polyclonal antibodies against human interleukin 10
84% above baseline and no IIIV viral load
Has dropped. Removal of interleukin 10 allows expansion of CD8 + cells,
HIV virus clearance by revival of HIV-specific cell-mediated immune response
Enabled.
Detailed description of polyclonal antiserum
Production specifications
Type: rabbit anti-human IL-10
Shape: liquid
Concentration: 2.7mg / ml
Stabilizer: None
Preservative: None
Sterilization: sterile filtration
Host species: rabbit
Antibody class: Immunoglobulin G
Antigen used: recombinant human IL-10
Purification method: ion exchange chromatography
Quantification method: Pierce BCA protein quantification method
Characteristic: human IL-10
Cross-reactivity: no cross-reactivity with WHO standards.
IL-1a, IL-1B, IL-2, IL-3, IL-4, IL
-6, IL-7, IL-8, MIP-1a, TNFa and GM
-CSF was performed by EIA.
Storage: Short term at 4 ℃, Long term at -20 ℃Materials and drugs
: Demonstrates DHEA's ability to enhance interleukin 12 synthesis
Used for.
1. IL-2 ELISA, available at home, minimum 6 plates.
2. MTS assay, Promega, minimum 7 plates.
3. IL-12 R & D system, (# 219-IL) 5fg is enough for all experiments
is there.
4. Antibody against human IL-12 receptor, R & D system (AB-233-NA), human
1 mg of freeze-dried goot.
5. Human at the Institute of Genetics, Cambridge, Massachusetts (617-498-8647)
Rabbit polyclonal antibody against the p40 chain of IL-2.
6. Locally available gp120 (50 fg / vial) available at home
About 1 mg / ml). Requires 5 nM / ml. For each of the two plates,
And 50fg is enough.
7. Unstimulated PBMC from normal human (HIV-1 negative).
8. 5 HIV + sample of blood to obtain non-responsive PBMC. Per sample
5 ml.
9. DHEA (dehydroisoandrosterone), Sigma D4000, 1 g. All fruit
Is sufficient to conduct the experiment.
Ten. 100% ethanol to dissolve DHEA.
11． R10 medium: RPMI, 10% FBS, 50 fg / ml Gentamicin.
12． Flat dish tissue culture cluster dish, 96 wells, 2 per blood sample
Pieces.protocol
1. PBMCs are separated for each blood sample and cell counts are performed.
2. Use all cells available from the patient sample. If 10 × 106cell
Or more, if present, in two 96 Kubomi plates
Inoculate cells. 10 × 106Is 0.5 × 10FiveCells / well or 2.5x
TenFiveEnd with cells / ml. If less, use one plate.
The number actually inoculated per well is recorded. When using two plates
Received antibodies against human IL-2 receptor, one for IL-2 detection
You. Other plates are used for cell proliferation tests and do not receive this antibody.
If only one plate is used, accept the antibody on this plate
I do.
3. If one plate is used, resuspend cells in 20 ml R10.
It becomes cloudy. If two plates, resuspend in 40 ml. Well
Aliquot 200 fL. Leave overnight. If the neglect of nature is real
If not useful, wrap the plate in plastic wrap and
Use centrifugation.
4. Create a schematic showing which specific media to add to which wells
(Due to the need for blanks and standards required for IL-2 ELISA, growth (
Note that not all replicates are used for ELISA).
5. Each experiment requires 16 or 32 ml of medium and 5 nM / ml of native gp120
I do. FW = 120,000. Addition amount per 16 ml: 96 fL of 100 fg / ml strain (vehicle
6 fL of 100 fg / ml per ml).
Also use 12 or 24 ml of RIO media for each test.
PLEASE NOTE: This is key to whether PBMC is reactive
Would. If cells grow in the presence of gp120 to produce IL-2, gp120
If not without 120, these cells are normal and active cells. if
The cells showed similar growth and IL-irrespective of whether gpl20 was added or not.
The cell is inactive if it shows a two-generation behavior. We have IL-12 and
It is only in inactive cells that we see the effect of DHEA.
6. For each sample used in the IL-2 ELISA, 16 ml of gp120 and
Add 12 fg / ml of antibody against IL-2 receptor to 12 ml.
7. Preparation of DHEA.
7.1 Add 1 g of DHEA to 1 ml of absolute ethanol (100%). 37 ℃ water
Keep warm in the bath. Add additional ethanol to 3.47 ml. As a result,
A 1M solution is obtained. If a total of 3.47 ml is not needed for solution,
The difference is adjusted by the R10 medium.
7.2 For each sample, a medium is required to bring DHEA to the following concentrations:
Ten-Four,Ten-6,Ten-Ten,Ten-12.
7.3 At each dilution the medium (already containing gp120 and antibody from step 6)
2 ml), use gp120 when using the second plate,
Prepare another 2ml of medium without body. Ten-8Requires 6ml of each medium
It is.
At each dilution, no gpl20 and no antibody from step 6
Adjust 2 x 1.5 mm of R10 media, with or without. Ten-83ml each
is necessary.
7.4 Dilute. Use 5 ml tubes.
A. Collect 20 fL of 1 M DHEA in 2 ml of R10 medium = 10-2M.
B. Ten-2Take 20 fL of MDHEA in 2 ml of the medium from step 7.3 = -10-FourM
. Ten-2Take 15 fL of MDHEA into 1.5 ml of R10 = 10-FourM.
C. Ten-FourTake 20 fL of MDHEA in 2 ml of the medium from step 7.3 = 10-6M.
Ten-FourTake 15 fL of MDHEA into 1.5 ml of R10 = 10-6M.
D. Ten-6Collect 40 fL of MDHEA in 4 ml of the medium from step 7.3 = 10-8M.
Ten-6Take 30 fL of MDHEA into 3 ml of R10 = 10-8M.
E. FIG. Ten-8Take 20 fL of MDHEA in 2 ml of the medium from step 7.3 = 10-TenM.
Ten-8Take 15 fL of MDHEA in 1.5 ml of R10 medium = 10-TenM.
F. Ten-TenTake 20 fL of MDHEA in 2 ml of the medium from step 7.3 = 10-12
M. Ten-12Collect 15 fL of M.
7.5 10-8Antibodies to human IL-12 in half of the MDHEA vehicle type
Add.
7.6 IL-12 media for each plate.
A. Set up in 2 ml of gp120 medium with and without antibodies to IL-2
Add 10 U / ml of recombinant IL-12.
B. Recombined with 1.5 ml of R10 with and without antibody to IL-2
Add 10 U / ml IL-12.
C. 1ED50= 1U. ED of IL-1250Is present in the literature admitting this drug
I do.
8. Aspirate the cell media and add appropriate media to each well according to the experimental design.
Add 200 fL. Place excess media in surrounding wells. Plastic wrap
Wrap the plate with a pump and place on a wet tray. 37 ℃, 5% COTwoKeep warm.
9. If the assay uses two plates, IL-2 should be used after 5 days.
Aspirate media from plate without antibody to receptor. R10 medium
Replace with 100 fL / well of body. Cell proliferation test is performed by culturing for 4 hours
.
Ten. Plates containing antibodies to the IL-2 receptor are used after 7 days. We
Collect 100 fL per sample and perform IL-2 ELISA.
11． If there is only one plate for the test, remove the remaining supernatant from each well.
Remove, freeze, then add 100 fL / well of R10 medium, point 7 days
Advance cell proliferation test in
12． All drugs work as expected before proceeding with HIV + samples
PBMC from HIV-blood is first performed to see if it is or not.
13. Other HIV-samples should be run after all HIV + samples have been completed.
It is.
14. Collect and analyze data.Protocol overview
Title: Isopentenyl adeno as a specific inhibitor of interleukin 10
Clinical trial of DHEA administered in combination with syn-5'-monophosphate.
Specially for HIV-infected individuals who have shown resistance to proteases and RT inhibitors
It was adjusted.
DHEA in combination with isopentenyl adenosine 5'-monophosphate
Here, it is referred to as compound (D + I).
Indicator: treatment of HIV-1 infection.
Study Type: Phase I / Clinical Follow-up
Purpose of research:
a. Reduced dose of administered compound (D + I) in people with advanced HIV disease
Determine qualitative and acceptable amounts.
b. Determining the Impact of Compound (D + I) Administration on the Measurement of HIV Virus Load
I do. Serum PCR (RNA) is at the same level as HIV p24 antigen (acid dissociation
By law).
c. The immunological and toxicological effects of the administered compound (D + I) are determined.
d. The pharmacokinetic effect of the administered compound (D + I) is determined.
Inclusion criteria:
a. 18 years of age or older
b. HIV-1 seropositive
c. Prior to study entry, measured on two separate occasions 72 to 28 days apart
CD4 + -T-lymphocyte count within one month is 50-300 cells / mmThree.
d. Below are the baseline laboratory values.
Hemoglobin> gg / dl
WBCs> 1500 cells / μl
Neutrophils> 1000 cells / μl
Platelets 25,000 cells / μl
Bilirubin <2.0mg / dl
AST, ALT, alkaline phosphatase <5 x creatine of normal upper limit
Nin <1.5mg / dl
e. The history of previous antiretroviral treatment is as follows.
AZT, ddlmdddC or d4T alone or with protease inhibitors
Research entry related to the traditional history of retroviral therapy using combinations
Patients who have not been treated as in
Should be discontinued.
g. Pregnancy-use of appropriate contraceptives by women of childbearing ability
Within a week prior to study entry for a woman, a serum pregnancy test
Is required to be negative).
h. Medium with high PRHIV RNA titer in study entry.Exclusion criteria
a. Previous treatment with chemotherapy drugs within 8 weeks of enrollment.
b. Includes clear AIDS opportunistic infections or other life-threatening medical episodes
Active and serious infection.
c. Pregnant or lactating women.
d. The opinion of the researcher puts the patient in undue risk or the purpose of the study is dangerous
Exposure to any state.
e. Study entry, interferon or steroid pharmacology
If you are receiving immunomodulatory therapy, including targeted administration.Safety standards
: Analyze the following parameters for each week of the study until week 4 (
See Table 1).
i. Documentation and assessment of harmful things.
ii. Hematology.
iii. Clinical chemistry and urinalysis.
iv. Assessment of immune response results from compound (D + I).
v. Assessment of changes due to PCR (RNA) and DNA based treatments.Effectiveness criteria
The criteria for viral load were HIV-p24 antigenemia, and HIV-RNA PCR.
(Cell-free serum) and cellular HIV-DNA analysis.
Improvement in the immune response is measured as the change in CD4 / CD8 ratio from baseline.
Is determined.
Lymphocyte count by clinical, in WBC, and interleukin 10
The percent change in level indicates that compound (D + I)HChange to -1 state
Demonstrate the ability to be transformed.
Clinical benefits include changes in body weight, Karnofsky's performance criteria and
It is assessed by recovery of signs and symptoms of disease present at baseline.
The remission or incidence of new opportunistic infections is summarized.Study design:
Release of label, administration of 1200 mg / day of drug per patient, 4 weeks of treatment
Review and evaluation of schedule and efficacy.Study size
: 5 patients (total)-5 patients were administered at 1200 mg / day for 30 days.Test items:
Test drug: Compound (D + I) particle size distribution 87% <5 μm, 100% <15 μm,
Administration in gelatin capsules at 200 mg per capsule. Each capsule is DH
Contains 600 mg EA and 600 mg isopentenyl adenosine 5'-monophosphate
.
No control drug
No placebo
Patient data before and after compound (D + I) administration is required.
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｋ 31/195 Ａ６１Ｋ 31/195
31/295 31/295
31/352 31/35 ６０２
31/52 31/52
31/662 31/66 ６０３
31/7004 31/70 ６０１
31/7064 ６１７
39/00 39/00 Ｊ
45/00 45/00
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
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ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme court ゛ (Reference) A61K 31/195 A61K 31/195 31/295 31/295 31/352 31/35 602 31/52 31/52 31/662 31/66 603 31/7004 31/70 601 31/7064 617 39/00 39/00 J 45/00 45/00 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, SD, SZ, UG), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, B , CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR , TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU