【発明の詳細な説明】
テスト要素用定量的分析評価システム
本発明は、
ａ）テスト要素を位置決めするテスト要素用ホルダ、
ｂ）分析物に特異的に結合する標識物質を含む試料添加ゾーンと、分析物と標識
物質から形成される複合体を固定化するために使用される領域を含む検出ゾーン
とを有するテスト要素、
ｃ）テスト要素の検出ゾーンに光を照射する照射装置、
ｄ）一つの面に複数のセンサが配置されているか、または複数のセンサが一列に
配置され、その線状アレーを移動装置によってセンサの列に対して横方向に移動
させながら面を走査するかのいずれかのセンサアレー、
ｅ）アナログセンサ信号をデジタル信号に変換するための変換器、
ｆ）分析物の濃度を決定するためにデジタル信号を評価する評価ユニット、
ｇ）評価結果を表示するための表示装置
からなるテスト要素を使用して分析物を位置分析的
本発明は、透過測定または反射測定により定量的に評価するテスト要素の分野
に関する。
従来技術において、テスト要素の検出ゾーンに光を照射し、検出ゾーンから反
射する光または検出ゾーンを透過する光を統合的に測定し、その光強度から分析
物の濃度を計算するテスト要素の定量的評価システムがかなり
前から知られている。この測定法では光線を個々のセンサで検出するため、検出
ゾーンの情報内容は全体として
ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−０ ６４６ ７８４にテスト要素を評価するた
めのビデオシステムが述べられている。このシステムではテスト要素は使用者に
よって支持体に配置される。テスト要素の評価は予め位置決めをしないで行われ
るため、使用されるビデオシステムは、検出ゾーンが確実に映像画面内に入るよ
う、支持体全体を覆わなければならない。このシステムは、使用者が位置決めを
する必要がないので、使用者には親切であるが、本来の検査対象域を評価するた
めに用いられるビデオシステムのセンサの数が比較的少ないため、分析結果の精
度は著しく劣る。テスト要素を配置する際に使用者が望む自由度を保証するには
、記載の装置は大きな開口部を設けなければならず、それに伴って妨害光線が侵
入するおそれがある。このように、記載されている装置は、測定される信号が大
きく、高い精度が要求されない場合のみの定量的評価に適している。
ドキュメントＥＰ−Ｂ−０ ４３７ ９６８およびＤＥ ３２４７３５５には
薄層クロマトグラムを評価するための装置が記載されている。ＤＥ ３２４７３
５５の装置は薄層クロマトプレートを走査するためのスキャナを対象としている
。個々のセンサが観測する平面エレメントの大きさは約0.05ないし0.2mmである
。すでにこの特許出願でビデオシステムによる薄層クロマトグラムの評価の可能
性が指摘されている。しかし、薄層プレート全体に均質な光を照射することは非
常に難しく、単色
光では実質的に全く不可能と思われるので、正確に定量的評価を行なうことは困
難であり、それゆえ、このシステムは排斥されている。しかし、その後のヨーロ
ッパ特許ドキュメントＥＰ−Ｂ−０ ４３７ ９６８では、薄層クロマトグラフ
ィーの定量的評価を行なうビデオ式デンシトメータが提案されている。高速で映
像を取り込むよう改良が施され、それによってシステムの変動が抑制され、評価
が可能となっている。
薄層クロマトグラフィーの分野で使用されている配置は、最もよい事例で、ナ
ノモル程度の感度を持っている。これは、薄層クロマトグラフィーで形成される
バンド幅が、各場合で使用する分析物と、とりわけ薄層プレートをコーティング
する材料とに著しく依存することから生ずる。同じ材料を使用しても、ロットに
特異的な変動によってバンド幅と位置は変動する。そのうえ、クロマトグラフィ
ー特性が極めてよく似た物質によって検出が妨害される可能性がある。薄層クロ
マトグラフィーによる物質定量のもう一つの欠点は、バンド幅が比較的広い点に
ある。すなわち、濃度が薄くなるほど光学的なノイズの割合が大きくなるため、
この評価分析精度を低下させるのである。
本発明の目的は、濃度が極めて低い（ピコモル）臨床関係の分析物でも高い精
度で定量が可能となるよう、既存のテスト要素分析用装置を改良することであっ
た。本発明のさらなる目的は、この目的に適合し、操作が簡単で安価な装置を考
案することであった。
体液中のタンパク質、医薬、麻薬または代謝物質などのきわめて低濃度の分析
物を決定する場合、低濃度であ
るがゆえに、きわめて高感度の検出反応が必要であるという点が問題になる。と
りわけこのような分析では、しばしば、非常によく似た化合物が分析物よりも高
濃度で存在するため、それらを明確に区別しうるか、または目的とする分析物だ
けを選択的に検出しうることが必要である。臨床検査室では、多くの分析物に対
してこのような検査を実施することは現在の技術水準に属しているが、テスト要
素を用いてこのように低濃度の分析物を日常的な業務として定量分析することは
従来不可能であった。しかしながら、本発明のシステムによれば、10-12mol/ｌ
領域の分析物濃度でも定量的な検出が可能であることが立証された。
本発明で使用可能なテスト要素は、従来技術では免疫学的テスト要素と呼ばれ
ている。本発明に好適なテスト要素は、担持材料上に１または複数の吸収性マト
リックスを有し、それらのマトリックスは、液体がすべてのマトリックスを貫流
することができるよう、担持材料上に配置されている。好適なテスト要素は試料
添加ゾーンと検出ゾーンを有する。さらに、赤血球などの妨害物質を分離するた
めのゾーンを有していてもよい。テスト要素の担持材料は、その上にマトリック
スを固定し配置全体を取扱い可能にしうるものでなければならない。したがって
、担持材料は充分な剛直性を示し、実施される検査に対して化学的に不活性であ
ることが望まれる。とりわけ、たとえばポリスチレン製のプラスチックホイル(k
unststoffolien)が好適であることが明らかにされている。
担持材料上には、１または複数のマトリックスをたと
えば両面テープまたは溶融接着剤で固定することができる。マトリックスは、液
体移動区間を形成し、かつ試料添加ゾーンに添加される液体が毛細管力で検出ゾ
ーンに到達するように担持材料上に配置されている。液体の移動を助けるために
液体をよく吸収する材料で構成されたいわゆる吸引ゾーンを検出ゾーンに隣接し
て設けるとよいことが立証されている。
試料添加ゾーンには分析物に特異的に結合する標識物質が存在している。たと
えば、糖類を検出しなければならない場合、特異的に結合する物質として、対応
するレクチンを使用することができる。ＤＮＡまたはＲＮＡを検出する場合、特
異的に結合しうる物質として相補ＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖が考慮される。特異的
に結合しうる物質の中でとくに重要な物質群は、抗原である対応の分析物に結合
する抗体または抗体フラグメントである。そのほかにも特異的に結合しうる物質
が従来技術において知られている。
本発明によれば、特異的に結合しうる物質は標識を有する。反射または透過に
よる光学的評価においては、発色団または発色蛍光団が考慮される。従来技術に
おいて、適合する色素がよく知られている。本発明による応用に対しては、金に
よる標識が本発明にはとくに好適であることが明らかにされている。用語「標識
」は、それ自体は無色であるが化学反応によりまたは着色物質に特異的に結合す
ることによって検出可能な物質群も含む。
試料添加ゾーンに存在する標識物質は、試料が添加されるとできるだけ速やか
かつ完全にマトリックス材料から放出され、液体の流れにのって移動することが
重要で
ある。このためには、マトリックス材料としてとくに多孔性材料、繊維材料また
は非繊維材料が適していることが明らかにされている。具体例としては紙、フリ
ース、多孔性プラスチック層またはメンブランがあげられる。ガラス繊維および
／またはポリエステル繊維などの合成繊維および／または合成フリース(zellwol
le)を高い割合で含む繊維状のマトリックスがとくに好適であることが明らかに
されている。
液体が移動する間に、検出すべき分析物と標識物質から複合体が形成され、液
体の流れとともに移動する。この複合体は液体の流れとともに検出ゾーンを通過
する。検出ゾーンは、光を照射しその反射光または透過光によって検出されるゾ
ーンである。したがって、検出過程が妨害を受けないためには、検出ゾーンはで
きるだけ光学的に均質であることが要求される。もし不均質であったとしても、
検出反応の前後で均質性に変化がない限り、不均質性はある程度まで分析時に考
慮することは可能である。しかし検出ゾーンが湿潤してから初めて現れるような
光学的不均質は避けなければならない。
既に試料添加ゾーンについてあげた材料も、検出ゾーンの材料として好適であ
る。検出ゾーンは、分析物と標識物質から形成される複合体の固定化に利用され
る領域を有する。この領域は、複合体と結合する物質を検出ゾーンに適用するこ
とによって製造することができる。複合体と結合する物質は、流れの方向に対し
てこれを横切るように線状または細い帯状に適用するとよいことが明らかにされ
ている。分析物の濃度がおおよそ１０-12mol／ｌの場合、線の幅は10分の数ミリ
メートルないし数
ミリメートル、好ましくは0.5ｍｍないし１mmが非常に好適であることが立証さ
れている。複合体と結合する物質はマトリックス材料に結合しなければならず、
それによって複合体の固定化が可能になる。複合体と結合する物質は、たとえば
インクジェット法による細管を使うかまたはエアブラシで所望の幅に適用するこ
とができる。この領域の検出ゾーンがニトロセルロースまたはニトロセルロース
エステルで構成されていれば、非常に多数の物質、とくにタンパク質または核酸
がこれらに対して吸収的(absorptiv)に強く結合するため好ましいことが明らか
にされている。このように、特異的に結合する物質を純粋な吸収によってマトリ
ックスに充分な強さで結合することができる。もちろん、複合体を固定化する物
質を共有結合によってマトリックスに結合することも可能である。
本発明の範囲内で利用可能なテスト要素の構造に関する情報は、ＥＰ−Ａ−０
３２３ ６０５およびＥＰ−Ａ−０ １８６ ７９９に述べられている。これ
らの文献では、とくにマトリックス材料、発色団または発色蛍光団、特異的に結
合する物質、分析物と標識物質から構成される複合体を固定化するための物質、
およびこのテスト要素の製造法があますことなく述べられている。
標識物質の量は分析物の量に対して過剰に用いられるのが有利であり、そうす
ることによって、分析物の標識物質に対する定量的な結合を評価することができ
る。分析物と標識物質から形成される複合体を固定化するために利用される物質
は、分析結果に誤差が入るのを避けるため、標識物質にできるだけ結合しないも
のが望ましい。
分析物と標識物質から構成される複合体を含む試料液が固定化ゾーンを通過する
間に液体から複合体が捕捉されるのに対して、結合しなかった標識物質はさらに
移動する。試料添加ゾーンに添加される分析物の量または試料の量は、結合しな
かった標識物質が検出ゾーンの領域からその外へ移動するのに充分な量とすべき
である。そのようにすれば、分析物と結合しなかった標識物質による分析結果の
誤差を避けられる。試料の量が充分でない場合、水、等張食塩溶液、界面活性剤
溶液などの補助液を試料添加ゾーンに添加することができる。
本発明の範囲において、前記タイプのテスト要素を使用すれば、分析物の量、
すなわち分析物と標識物質から構成される複合体の量を、比較的小さくて明確に
定められた領域に濃縮することができるという利点がもたらされる。この領域で
は分析物の濃度が低くても、信号−雑音比の高いより好ましい信号レベルが得ら
れる。たとえば薄層クロマトグラムの場合がそうであるように、検出すべき標識
がより広い範囲に分布した時に有利になるだろう。また、分析物の標識に特異的
に結合しうる物質を使用し、形成される複合体を特異的に固定化することは、分
析物がその他の物質から分離されるという利点となる。
本発明によるテスト要素は、テスト要素が保持されるハウジングの中に好都合
に位置する。前記ハウジングは、試料液を試料添加ゾーンに添加するための開口
部と、検出ゾーンに光学的にアクセスすることができる開口部を有する。通常、
前記ハウジングは下部と上部からなり、その間にテスト要素がはめ込まれている
。テスト要素はハウジング内の所定の位置に位置するよう、支柱などで
確保される。ハウジングはテスト要素を機械的に安定化させ、より簡単に位置決
めできるようにし、そして、開口部を通してテスト要素の必要な位置にアクセス
可能とすることに役立つ。機械的な安定性を高めるためには充分な剛性を有する
材料が使用される。本発明では、ポリエチレンまたはポリスチレンなどのプラス
チックがとくに対象となる。ハウジングの別の重要な利点は、使用者に対する感
染の危険が軽減することである。
試料液と反応したテスト要素を評価するには、位置によって分析評価が可能な
装置を使用する。この装置はテスト要素または検出ゾーンを位置決めするように
テスト要素を位置するハウジングのためのホルダからなる。たとえばホルダとし
て差し込みユニットを利用することができる。テスト要素を停止端部まで挿入す
れば、テスト要素は平面内に位置決めされる。垂直方向に位置決めするためには
、テスト要素を上から基礎台に向かって押し込むことも好ましい。
本発明にしたがうシステムは、テスト要素の検出ゾーンに光を当てるための光
照射装置をさらに含む。この照射装置は波長領域の広いスペクトルを有すること
もできる。しかし照射装置のスペクトル幅は狭い方が好ましい。とくに発光ダイ
オードが有利であることが明らかにされている。たとえばハロゲンランプとスペ
クトルフィルタの組み合わせも適している。
照射装置は検出ゾーンに当てる光が可能な限り均質になるように取り付けられ
る。これは、検出ゾーンの面に平行な平面上に発光ダイオードを円形に配置する
ことによって実現され、発光ダイオードの光線円錐体は検出ゾ
ーンの平面を向いている。発光ダイオードの焦点は検出ゾーンに合わせる必要は
ない。
照射装置の波長領域は、標識物質の標識の吸収範囲に合致するように選ぶと有
利であることが示されている。金粒子で標識された赤色の物質の場合、光源には
緑色の発光ダイオードが適することはよく知られている。しかしとくに青色発光
ダイオードが好適である。測定値を採取している間、光の強さができるだけ一定
になるよう、たとえば適当な電流でパルス制御するといったような光源制御法は
、従来から知られている。この場合、測定は光パルスのプラトー層を使って実施
される。
照射装置を用いて検出ゾーンを照射し、その反射光または透過光をセンサアレ
ーで検出する。本発明によるセンサアレーは、二次元アレー、たとえばＣＣＤア
レー、または移動装置によってセンサの列に対して横方向に移動する線状アレー
のいずれかであって、面上を走査する。二次元センサアレーはビデオカメラに使
用されているためにすでに比較的安く入手できる。本発明にしたがう好適なアレ
ーは、少なくとも250,000個の単位センサを有するべきである。検出ゾーンの大
きさが１cm×１cmの場合、位置分析能はあらゆる方向に対して約0.1mmである。
分析能を上げることは評価精度にとって有利に働く。
線状アレーを使用する場合は、古いタイプの移動装置によって、センサ列に対
して横方向にセンサアレーを移動させることもできるが、光学的なアレンジメン
トによって検出ゾーンの個々の縞(streifen)を線状アレー上に結像することも可
能である。これには、たとえばＤＥ ３
２４７３５５による装置が適している。Ｐ １９５２０６０６．１にしたがう装
置もとくに有効に用いることができる。しかし、二次元センサアレーは、装置に
可動部分を必要としない利点がある。しかし、１列当たり数1000個の像点を分析
しなければならない場合は、一次元アレーの方が格段に値段が安く、制御も容易
である。
本発明の本質部分は、検出ゾーン、とりわけ固定化ゾーンを囲む領域で位置分
析評価が充分な数のセンサで行われる点にある。このためには、個々のセンサが
充分な数だけ必要であるばかりか、検出ゾーンの正しい像がセンサアレーに結像
される必要がある。検出ゾーンの像は、可能な限りセンサアレーの面または線状
アレーによる走査面を満たすようにすべきである。本発明にしたがう配置は、薄
層クロマトグラムの定量的評価と比較して、検出可能な信号の現れる領域が固定
化ゾーンによって予め決められるという利点を持つ。それゆえ、センサアレーが
最適に利用されるように、検出ゾーンとセンサアレーの大きさ、および光学的結
像手段を整合することができる。それは通常、検出ゾーンをセンサアレー上に結
像するために弱い縮小光学系(schwache Verkleinerungsoptik)を用いることで実
現される。レンズを有する光学系の従来のデザインに加えて、一方の端の断面が
検出ゾーンの大きさと形に合致し、他方の端の断面がセンサアレーの大きさと形
に合致する複数の光伝導ファイバーからなる画像変換器を使うと有利であること
が明らかにされている。このような画像変換器は、たとえばスコット(Schott)社
やガリレオ・エレクトロ−オプティクス・コーポレーション(Galileo Electro-O
ptics Corporation)から入手す
ることができる。
本発明にしたがうシステムで反射光による評価を実施する場合、照射装置を画
像システムの周辺に配置するのが好ましい。たとえば、レンズの周囲に発光ダイ
オードを円形に集めて配置することができる。発光ダイオードをこのように配置
することで、照射の均質性は改善される。４ないし３０個の発光ダイオードが好
適であることが明らかにされている。
本発明にしたがうシステムは、センサのアナログ信号を変換するためにこの信
号をデジタル信号に変換する変換器を備えている。このような変換器は従来技術
でよく知られており、通常、アナログ−デジタル変換器と称されている。センサ
のデジタル信号は評価装置、一般的にはマイクロコンピュータで評価される。
本発明にしたがうテスト要素においては検出信号の分布が存在し、それは基本
的には固定化ゾーンの形態によって決定される。標識物質の濃度は、試料添加ゾ
ーンに面する領域では大きいのに対して、吸引マトリックスに向かって減少する
。統合的な測定はこの種のテスト要素の正確な定量的評価に充分ではないことが
わかっている。それに対して、本発明による位置分析評価ではきわめて正確な定
量的評価が可能であることが示されている。本発明にしたがう評価では、各セン
サの信号が物質量に変換され、個別の測定から物質の総量が求められる。テスト
要素に添加された試料の量が分かっていれば、分析物の濃度が決定できる。位置
分析的測定の利点は、濃度と拡散反射または透過との間に直線関係がなくても、
それを考慮に入れることができる点にある。この評価の精度
は、センサアレーの個々のセンサによって検出される領域内の濃度がどの程度一
定であるかに依存する。さらに、前記テスト要素を評価する場合、その評価のさ
らなる利点は、固定化ゾーンの形態によって標識物質の分布曲線が実質的に予め
決められる、ということである。それゆえ、測定値に基づいてスプライン関数を
適合させることができ、その結果、固定化された標識物質量を計算する時、個々
の測定値を補間することが可能になる。このことは、個々のセンサによって検出
される面内部の標識物質の濃度または量が比較的大きく変動することを示唆して
おり、２つの隣接するセンサの信号が比較的離れている時に、とくに分析精度を
向上させる。
検出すべき物質および特異的に結合する標識物質から形成される複合体を固定
化するために、対称性が高いゾーン、たとえば線を選ぶなら、この対称性を考慮
することで分析精度の改善が可能になる。固定化ゾーンを線として形成する場合
、線に対して垂直に走るセンサアレーに平行な列に沿って信号は非常によく似た
パターンを示すことになろう。この情報に基づけば、信号パターンがひずむテス
ト要素の辺縁ゾーンは、認知されて消去される。こうした消去は、信号の最大振
幅(signalhubes)が、検出信号の中心部（検出線の中央部）における信号の最大
振幅の５％以下である列に対して実施すれば有効である。さらに、テスト要素の
不均質性も認知、考慮または消去することができる。この指標に基づいて信号パ
ターンが適合するセンサアレーの列の位置がわかれば、分析装置はこの列と等価
な行を平均して、それに基づいてそのあとに続く計算を実行するので、テスト要
素の分析は
加速できる。
それに対して、行の間で平均された信号は、検出線に対して垂直方向の信号パ
ターンを反映する列を再び表示する。一般に、分析用テスト要素には紙やフリー
スなどの明るい材料が使用され、検査の実施で検出ゾーンは着色する。それゆえ
、拡散反射の測定によって決定される分析用テスト要素に沿った信号パターンは
検出ゾーンの位置で最小となる。
テスト要素の位置分析評価の別の利点は、バックグラウンドの補正が可能であ
るという点である。テスト要素を統合的に分析する方法では、検出すべき物質に
関係がない検出ゾーンの着色によって生じるバックグラウンドは一定なものとし
てしか考慮できない。それに対して、本発明の位置分析評価では信号の分布に基
づいて分析される領域を適切に限定することができるので、選択した領域外のバ
ックグラウンドは測定結果に影響を及ぼさない。評価領域を限定するには、測定
した信号曲線を解析し、決められた閾値より上および下にあるセンサの信号は後
で行なう計算で考慮の対象としない。評価領域を限定するための指標として、閾
値の代わりに信号曲線の傾きを使用することもできる。あるいは、評価領域を限
定するために、拡散反射曲線における最小点までの最大距離が設定される。関数
曲線によって近似することができる既に上で述べた信号パターンに基づいてこの
関数曲線を外挿(Extrapolation)し、閾値の補正に基づいてセンサ信号が考慮さ
れなかった領域を把握することもできる。
評価に供せられるセンサ信号または関数曲線によって決定される値から、評価
装置によって物質量が決定され
る。それは通常、センサ信号を、濃度が分かっている分析物について決定された
信号と比較する形で行われる。拡散反射値または透過値をそれぞれの物質量また
は物質濃度に割り当てることができる検量線の作製は従来技術において広く知ら
れている。
本発明をつぎの図によってより詳細に説明する：
図１：テスト要素の構造
図２：テスト要素を内蔵するハウジングの上面図
図３：テスト要素を内蔵するハウジング断面図
図４：ハウジングが差し込まれたホルダ
図５：本発明にしたがうシステムの断面図
図６：コントロールライン(Kontrollstrich)に対するテスト要素の信号曲線
図１は、担持材料(５)に試料添加ゾーン(１)、赤血球分離ゾーン(２)、検出ゾ
ーン(３)および吸引ゾーン(４)を設けた分析要素を示す。試料添加ゾーン(１)に
は試料添加マトリックス(６)が配置され、部分的に赤血球分離マトリックス(７)
と重なっている。その赤血球分離マトリックス(７)は、検出マトリックス(８)(
検出ゾーン)、その上に固定化物質が線の形態(９)で適用されている、といくら
か重なっている。吸引マトリックス(10)は検出マトリックス(８)と多少重なって
いる。試料添加マトリックス(６)には、検出すべき分析物と複合体を形成するた
めに必要なすべての試薬が収容されている。ここに例として紹介するテスト要素
は、全血からのトロポニンＴの濃度の決定に使用される。トロポニンＴは心筋の
壊死を判定するための重要な指標である。この場合には試料添加ゾーンは重ね合
わせた２つのフリースからなり、その一方には金で標識
したトロポニンＴに対する抗体が含浸させてあり、もう一方のフリースにはビオ
チン化したトロポニンＴに対する抗体が含まれている。検出ゾーンの内部にスト
レプタビジンので構成される線(９)が付されている。
図２はテスト要素を内蔵するハウジング(12)の上面図を示す。ハウジングには
試料添加開口部(13)と検出開口部(14)の２つの開口部が設けてある。両開口部は
テスト要素に向かって狭くなっている。さらに、ハウジングには扱いやすいよう
に把持部(15)が付いている。
図３はテスト要素を内蔵するハウジングの断面を示す。テスト要素はハウジン
グの下部(17)に取り付けられている。ハウジングの上部(16)はハウジング支持部
(18)でハウジング下部(17)の受け台(19)に乗り、それによってハウジングの下部
と上部を所定の距離に保つことができる。テスト要素は位置が動かないよう受け
台(19)と差し込み溝(20)で固定されている。その結果、試料添加ゾーンと検出ゾ
ーンをハウジングの開口部に対して正しい位置に保持することができる。
図３には、さらに、ピペット(22)を使って試料液(23)を試料添加ゾーンに添加
する様子を示す。試料はマトリックス（11および26）から試料液中の分析物と結
合するビオチン化した抗体および金で標識した抗体を放出する。ここで分析物と
前記２種類の抗体から形成される様々な複合体は相互に平衡関係にある。検出す
るためには、ビオチン化した抗体と金で標識した抗体を含むこのような複合体は
とくに重要である。形成された複合体を含む試料液は赤血球分離マトリックス(
７)を通過して検出ゾーン(８)に達する。ここで、検出ゾーンに適用されたス
トレプタビジンの線(９)でビオチン化抗体が固定化される。ビオチンと金標識物
を含む複合体のみが検出可能な信号に寄与する。検出ゾーン(８)の後ろには吸引
フリース(10)が続いている。
図４にはテスト要素を内蔵するハウジングが差し込まれたホルダが示してある
。ホルダは水平な底板(30)を持ち、底板には２つの位置決め端部（31，32）が設
けられている。固定具(33)には板バネ(34)が取り付けてあり、ハウジング(12)を
横から押している。
図５は本発明にしたがうシステムの断面を示している。検出ゾーン(８)および
とりわけ固定化の線(９)は、簡単にレンズとして概略的に示されている光学系(4
0)によってセンサアレー(41)上に結像される。検出ゾーンの照射は、センサアレ
ー(41)の周囲に配置されている発光ダイオード(42)で行われる。マイクロプロセ
ッサ（CPU）はセンサアレーを制御している。センサアレーのアナログ信号は、
Ａ／Ｄ変換器（A/D）でデジタル信号に変換され、マイクロプロセッサ（CPU）へ
送られる。マイクロプロセッサでは分析物の濃度を決定するために、センサ信号
の評価も行われる。分析結果は表示装置（Ｄ）に表示される。
図６はコントロールラインに対するテスト要素の信号曲線を示す。この図には
165列、192行からなる二次元センサアレーのある列の信号を示す。センサアレー
の各行は図のＸ軸に示されている。Ｙ軸は、任意の単位で表した各センサのグレ
ー値(Grauwert)を示す。図６から、臨床検査に関係するトロポニンＴの濃度では
、コントロールラインに対する検出線の信号の振幅は比較的小さい
ことがわかる。このことは、この応用分野にとって位置的に分析した測定が不可
欠であることを明らかにしている。テスト要素の辺縁部、すなわち行数が30より
少ない場合、および170より多い場合、ハウジングの影が原因となって現れる辺
縁効果が顕著になる。このことは、この種のテスト要素において、この効果を補
正または消去できる位置分析評価を使用することが極めて重要であることを示し
ている。符号の説明
(１)試料添加ゾーン
(２)赤血球分離ゾーン
(３)検出ゾーン
(４)吸引ゾーン
(５)担持材料
(６)試料添加マトリックス
(７)赤血球分離マトリックス
(８)検出マトリックス
(９)線の形態の固定化ゾーン
(10)吸引マトリックス
(11)金標識抗体を含浸した試料添加マトリックス
(12)ハウジング
(13)試料添加開口部
(14)検出開口部
(16)ハウジングの上部
(17)ハウジングの下部
(18)ハウジング支持部（スペーサー）
(19)受け台
(20)差し込み溝
(21)ハウジングの上部のストリップ下
(22)ピペット
(23)試料液
(26)ビオチン標識抗体を含浸した試料添加マトリックス
(30)底板
(31、32)位置決め端部
(33)固定具
(34)板バネ
(40)レンズ系／光学系
(41)センサアレーDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Quantitative analytical evaluation system for test elements The invention comprises: a) a holder for the test element for positioning the test element; b) a sample addition zone containing a label that specifically binds to the analyte; A) a test element having a detection zone including an area used to immobilize a complex formed from an analyte and a label substance; c) an irradiation device for irradiating light to the detection zone of the test element; Either multiple sensors are arranged on the surface, or multiple sensors are arranged in a row, and the linear array is scanned by the moving device in a direction transverse to the array of sensors. E) a converter for converting an analog sensor signal to a digital signal; f) an evaluation unit for evaluating the digital signal to determine the concentration of the analyte; g) an evaluation result. Position analytical analyte using a test element comprising a display device for displaying The invention relates to the field of test elements which are evaluated quantitatively by transmission or reflection measurements. In the prior art, quantifying a test element by irradiating the detection zone of the test element with light, integrally measuring the light reflected from or transmitted through the detection zone, and calculating the concentration of the analyte from the light intensity. Objective rating systems have been known for some time. In this measurement method, the light beam is detected by individual sensors, so the information content of the detection zone as a whole is European patent application EP-A-0 646 784 describes a video system for evaluating test elements. In this system, the test element is placed on a support by the user. Since the evaluation of the test elements is performed without prior positioning, the video system used must cover the entire support to ensure that the detection zone is within the image screen. This system is friendly to the user because there is no need for the user to perform positioning, but the analysis results are relatively small due to the relatively small number of sensors in the video system used to evaluate the original test area. Is significantly inferior in accuracy. In order to guarantee the degree of freedom desired by the user when arranging the test elements, the described device must be provided with a large opening, with the potential for interfering light rays to enter. Thus, the described device is suitable for quantitative evaluation only when the measured signal is large and high accuracy is not required. Documents EP-B-0 437 968 and DE 3247355 describe devices for evaluating thin-layer chromatograms. The device of DE 32473 55 is directed to a scanner for scanning thin-layer chromatographic plates. The size of the planar element observed by each sensor is about 0.05 to 0.2 mm. The possibility of evaluating thin-layer chromatograms with a video system has already been pointed out in this patent application. However, it is very difficult to illuminate the entire thin layer plate with homogeneous light, and it seems to be virtually impossible at all with monochromatic light, so it is difficult to make an accurate quantitative evaluation. The system has been rejected. However, a subsequent European patent document EP-B-0 437 968 proposes a video densitometer for the quantitative evaluation of thin-layer chromatography. Improvements have been made to capture video at high speeds, thereby reducing system variability and enabling evaluation. Arrangements used in the field of thin-layer chromatography have, in the best case, sensitivity on the order of nanomolar. This results from the fact that the bandwidth formed by thin-layer chromatography is significantly dependent on the analyte used in each case, and in particular on the material coating the thin-layer plate. Even with the same material, the bandwidth and position will vary due to lot-specific variations. Moreover, detection can be hindered by substances with very similar chromatographic properties. Another disadvantage of substance quantification by thin layer chromatography is the relatively wide bandwidth. That is, as the density decreases, the ratio of optical noise increases, and the accuracy of the evaluation and analysis decreases. It was an object of the present invention to improve existing test element analyzers so that even very low concentrations (picomolar) of clinically relevant analytes can be quantified with high accuracy. A further object of the present invention was to devise a device which is adapted for this purpose, simple to operate and inexpensive. When determining very low concentrations of analytes, such as proteins, drugs, narcotics or metabolites in body fluids, the problem is that very low concentrations require very sensitive detection reactions. In particular, in such assays, very similar compounds are often present at higher concentrations than the analyte, so that they can be clearly distinguished or selectively detect only the analyte of interest. is necessary. Performing such tests on many analytes in clinical laboratories is at the state of the art, but using test elements to achieve such low concentrations of analytes is a routine task. Quantitative analysis has heretofore been impossible. However, according to the system of the present invention, 10 -12 It has been demonstrated that quantitative detection is possible even with analyte concentrations in the mol / l region. Test elements that can be used in the present invention are referred to in the prior art as immunological test elements. Test elements suitable for the present invention have one or more absorbent matrices on the support material, the matrices being disposed on the support material such that liquid can flow through all the matrices. . A preferred test element has a sample addition zone and a detection zone. Further, it may have a zone for separating interfering substances such as red blood cells. The carrier material of the test element must be such that the matrix can be fixed thereon and the whole arrangement can be handled. Accordingly, it is desirable that the carrier material exhibit sufficient rigidity and be chemically inert to the test being performed. In particular, plastic foils (kunststoffolien), for example made of polystyrene, have proven suitable. One or more matrices can be fixed on the carrier material, for example with double-sided tape or a molten adhesive. The matrix forms a liquid transfer zone and is arranged on the carrier material such that the liquid added to the sample application zone reaches the detection zone by capillary force. It has been demonstrated that a so-called suction zone, made of a material that absorbs liquid well, may be provided adjacent to the detection zone in order to assist the movement of the liquid. A labeling substance that specifically binds to the analyte is present in the sample addition zone. For example, if a saccharide has to be detected, the corresponding lectin can be used as a substance that specifically binds. When detecting DNA or RNA, a complementary DNA strand or RNA strand is considered as a substance that can specifically bind. A particularly important group of substances that can specifically bind are antibodies or antibody fragments that bind to the corresponding analyte, which is an antigen. Other substances that can specifically bind are known in the prior art. According to the present invention, the substance capable of specifically binding has a label. In optical evaluation by reflection or transmission, chromophores or chromophores are considered. Suitable dyes are well known in the prior art. For applications according to the invention, gold marking has proved to be particularly suitable for the invention. The term "label" also includes a group of substances that are colorless in themselves but are detectable by chemical reaction or by specifically binding to a colored substance. It is important that the labeling substance present in the sample addition zone is released from the matrix material as quickly and completely as possible when the sample is added, and moves with the flow of the liquid. For this purpose, porous, fibrous or non-fibrous materials have proved to be particularly suitable as matrix materials. Specific examples include paper, fleece, porous plastic layers or membranes. Fibrous matrices containing a high proportion of synthetic fibers and / or synthetic fleeces, such as glass fibers and / or polyester fibers, have proven to be particularly suitable. During the movement of the liquid, a complex is formed from the analyte to be detected and the labeling substance and moves with the flow of the liquid. This complex passes through the detection zone with the flow of the liquid. The detection zone is a zone that is irradiated with light and detected by reflected light or transmitted light. The detection zone must therefore be as optically homogeneous as possible so that the detection process is not disturbed. Even if heterogeneous, the heterogeneity can be considered to some extent in the analysis as long as there is no change in homogeneity before and after the detection reaction. However, optical inhomogeneities that only appear after the detection zone has been wetted must be avoided. The materials already mentioned for the sample addition zone are also suitable as the material for the detection zone. The detection zone has an area used for immobilizing a complex formed from the analyte and the labeling substance. This region can be produced by applying a substance that binds the complex to the detection zone. It has been found that the substance that binds to the complex may be applied in a linear or narrow band across the flow direction. Analyte concentration of approximately 10 -12 In the case of mol / l, a line width of a few tenths of a millimeter to a few millimeters, preferably 0.5 mm to 1 mm, has proven very suitable. The substance that binds to the complex must bind to the matrix material, which allows immobilization of the complex. The substance that binds to the composite can be applied to the desired width using, for example, a capillary by an inkjet method or by airbrush. If the detection zone in this region is composed of nitrocellulose or nitrocellulose ester, it has been proved that a very large number of substances, especially proteins or nucleic acids, are strongly and absorptivly bound to them. ing. In this way, the specifically binding substance can be bound to the matrix with sufficient strength by pure absorption. Of course, the substance for immobilizing the complex can be bound to the matrix by a covalent bond. Information on the structure of test elements that can be used within the scope of the invention is described in EP-A-0 323 605 and EP-A-0 186 799. These documents describe, inter alia, matrix materials, chromophores or chromophores, substances that bind specifically, substances for immobilizing the complex consisting of analyte and label, and methods for the production of this test element. It is stated without fuss. The amount of label is advantageously used in excess relative to the amount of analyte, so that the quantitative binding of the analyte to the label can be assessed. It is desirable that the substance used to immobilize the complex formed from the analyte and the labeling substance does not bind to the labeling substance as much as possible in order to avoid errors in the analysis results. While the sample solution containing the complex composed of the analyte and the labeling substance passes through the immobilization zone, the complex is captured from the liquid, while the unbound labeling substance moves further. The amount of analyte or sample added to the sample addition zone should be sufficient to allow unbound label to move out of the area of the detection zone. In this way, errors in the analysis results due to the labeling substance that did not bind to the analyte can be avoided. If the sample volume is not sufficient, auxiliary liquids such as water, isotonic saline solution, surfactant solution, etc. can be added to the sample addition zone. Within the scope of the present invention, the use of a test element of the above type enriches the amount of analyte, i.e. the amount of complex composed of analyte and label, in a relatively small and well-defined area. This provides the advantage of being able to In this region, a more favorable signal level with a high signal-to-noise ratio is obtained even at low analyte concentrations. It will be advantageous when the label to be detected is more widely distributed, as is the case, for example, with thin-layer chromatograms. Also, the use of a substance that can specifically bind to the label of the analyte and the specific immobilization of the complex formed has the advantage that the analyte is separated from other substances. The test element according to the invention is conveniently located in a housing in which the test element is held. The housing has an opening for adding a sample liquid to the sample addition zone and an opening for optically accessing the detection zone. Usually, the housing comprises a lower part and an upper part, between which the test element is fitted. The test element is secured by a post or the like so as to be located at a predetermined position in the housing. The housing serves to mechanically stabilize the test element, to make it easier to position and to make the required position of the test element accessible through the opening. A material having sufficient rigidity is used to enhance mechanical stability. In the present invention, plastics such as polyethylene or polystyrene are of particular interest. Another important advantage of the housing is that it reduces the risk of infection for the user. In order to evaluate the test element that has reacted with the sample liquid, an apparatus capable of performing an analytical evaluation by position is used. The device comprises a holder for a housing in which a test element or a test element is positioned to position a detection zone. For example, a plug-in unit can be used as a holder. When the test element is inserted to the stop end, the test element is positioned in the plane. For vertical positioning, it is also preferable to push the test element from above towards the base. The system according to the invention further comprises a light emitting device for illuminating the detection zone of the test element. The illuminator can also have a broad spectrum in the wavelength range. However, it is preferable that the spectrum width of the irradiation device is narrow. In particular, light-emitting diodes have proven to be advantageous. For example, a combination of a halogen lamp and a spectral filter is also suitable. The illumination device is mounted such that the light falling on the detection zone is as homogeneous as possible. This is achieved by arranging the light-emitting diodes in a circle on a plane parallel to the plane of the detection zone, the light cone of the light-emitting diodes facing the plane of the detection zone. The light emitting diode need not be focused on the detection zone. It has been shown that it is advantageous to select the wavelength range of the irradiation device so as to match the absorption range of the label of the labeling substance. For a red substance labeled with gold particles, it is well known that a green light emitting diode is suitable as a light source. However, blue light-emitting diodes are particularly preferred. Light source control methods, such as pulse control with an appropriate current, so that the light intensity is as constant as possible while taking measurements are known in the art. In this case, the measurement is performed using the plateau layer of the light pulse. The detection zone is irradiated using an irradiation device, and the reflected light or transmitted light is detected by a sensor array. A sensor array according to the present invention is either a two-dimensional array, for example a CCD array, or a linear array that is moved laterally with respect to a row of sensors by a moving device, and scans over a surface. Two-dimensional sensor arrays are already relatively inexpensive because they are used in video cameras. A preferred array according to the present invention should have at least 250,000 unit sensors. When the size of the detection zone is 1 cm × 1 cm, the position resolution is about 0.1 mm in all directions. Increasing the analytical power has an advantage for the evaluation accuracy. If a linear array is used, the older type of moving device can move the sensor array laterally with respect to the sensor array, but the optical arrangement arranges the individual streifens in the detection zone. It is also possible to image on a shaped array. A device according to DE 3 247 355 is suitable for this, for example. The device according to P 19520606.1 can be used particularly effectively. However, a two-dimensional sensor array has the advantage that no moving parts are required in the device. However, when several thousand image points must be analyzed per column, a one-dimensional array is much cheaper and easier to control. An essential part of the present invention is that the location analysis is performed with a sufficient number of sensors in the area surrounding the detection zone, especially the immobilization zone. This requires not only a sufficient number of individual sensors, but also a correct image of the detection zone to be imaged on the sensor array. The image of the detection zone should fill as far as possible the surface of the sensor array or the scanning plane of the linear array. The arrangement according to the invention has the advantage that, compared to a quantitative evaluation of the thin-layer chromatogram, the area in which the detectable signal appears is predetermined by the immobilization zone. Therefore, the detection zone and the size of the sensor array and the optical imaging means can be matched so that the sensor array is optimally used. It is usually realized by using weak reduction optics (schwache Verkleinerungsoptik) to image the detection zone on the sensor array. In addition to the conventional design of an optical system with a lens, a plurality of photoconductive fibers whose cross section at one end matches the size and shape of the detection zone and whose cross section at the other end matches the size and shape of the sensor array. The use of different image converters has proven to be advantageous. Such image converters are available, for example, from Schott and Galileo Electro-Optics Corporation. If the evaluation according to the reflected light is carried out in a system according to the invention, it is preferred that the illuminating device is arranged around the imaging system. For example, light emitting diodes can be arranged in a circle around the lens. By arranging the light emitting diodes in this way, the homogeneity of the illumination is improved. Four to thirty light emitting diodes have proven to be suitable. The system according to the invention comprises a converter for converting an analog signal of the sensor into a digital signal in order to convert this signal. Such converters are well known in the art and are commonly referred to as analog-to-digital converters. The digital signal of the sensor is evaluated by an evaluation device, generally a microcomputer. In the test element according to the invention, there is a distribution of the detection signal, which is basically determined by the configuration of the immobilization zone. The concentration of the label decreases in the area facing the sample application zone, whereas it decreases towards the suction matrix. It has been found that integrated measurements are not sufficient for accurate quantitative evaluation of such test elements. On the other hand, it has been shown that the position analysis evaluation according to the present invention enables extremely accurate quantitative evaluation. In the evaluation according to the invention, the signal of each sensor is converted into a substance quantity and the total quantity of the substance is determined from individual measurements. If the amount of sample added to the test element is known, the concentration of the analyte can be determined. The advantage of a positional analysis measurement is that it can take into account even if there is no linear relationship between concentration and diffuse reflection or transmission. The accuracy of this evaluation depends on how constant the density in the area detected by the individual sensors of the sensor array is. Furthermore, when evaluating the test element, a further advantage of the evaluation is that the shape of the immobilization zone substantially determines the distribution curve of the labeling substance. Therefore, it is possible to adapt the spline function based on the measured values, so that when calculating the amount of immobilized label, it is possible to interpolate the individual measured values. This suggests that the concentration or amount of label within the surface detected by each sensor varies relatively widely, especially when the signals of two adjacent sensors are relatively far apart. Improve accuracy. If a highly symmetric zone, for example a line, is chosen to immobilize the complex formed from the substance to be detected and the labeling substance that specifically binds, the analysis accuracy can be improved by considering this symmetry. Will be possible. If the immobilization zone is formed as a line, the signals along a row parallel to the sensor array running perpendicular to the line will show a very similar pattern. Based on this information, the marginal zones of the test element where the signal pattern is distorted are recognized and eliminated. Such an erasure is effective if the maximum amplitude of the signal (signalhubes) is performed on a column where the maximum amplitude of the signal at the center of the detection signal (the center of the detection line) is 5% or less. In addition, the heterogeneity of the test elements can be recognized, taken into account or eliminated. Once the position of the column of the sensor array to which the signal pattern matches based on this index is known, the analyzer will average the row equivalent to this column and perform subsequent calculations based on it, so that the test element Analysis can be accelerated. In contrast, the signal averaged between the rows redisplays the column reflecting the signal pattern perpendicular to the detection line. Generally, a light material such as paper or fleece is used for the test element for analysis, and the detection zone is colored when the inspection is performed. Therefore, the signal pattern along the analytical test element as determined by the diffuse reflection measurement is minimal at the location of the detection zone. Another advantage of position analysis evaluation of test elements is that background correction is possible. In the integrated analysis of test elements, the background caused by the coloring of the detection zone irrespective of the substance to be detected can only be considered as constant. On the other hand, in the position analysis evaluation of the present invention, the region to be analyzed based on the signal distribution can be appropriately limited, so that the background outside the selected region does not affect the measurement result. In order to limit the evaluation area, the measured signal curve is analyzed, and the signals of the sensors above and below a determined threshold are not taken into account in subsequent calculations. As an index for limiting the evaluation area, the slope of the signal curve can be used instead of the threshold. Alternatively, the maximum distance to the minimum point in the diffuse reflection curve is set to limit the evaluation area. It is also possible to extrapolate this function curve based on the signal pattern already described above, which can be approximated by a function curve, and to grasp the area where the sensor signal was not considered based on the threshold correction. The substance quantity is determined by the evaluation device from the values determined by the sensor signal or the function curve to be evaluated. It is usually done in a way that compares the sensor signal with a signal determined for an analyte of known concentration. The creation of calibration curves that can assign a diffuse reflection value or a transmission value to a respective substance quantity or substance concentration is widely known in the prior art. The invention is explained in more detail by the following figures: FIG. 1: Structure of the test element FIG. 2: Top view of the housing containing the test element FIG. 3: Cross-sectional view of the housing containing the test element FIG. 4: Housing inserted FIG. 5: Cross-section of the system according to the invention FIG. 6: Signal curve of the test element with respect to the control line (Kontrollstrich) FIG. 1 shows the loading material (5) with sample addition zone (1), red blood cell separation zone (2) , An analysis element provided with a detection zone (3) and a suction zone (4). A sample addition matrix (6) is arranged in the sample addition zone (1), and partially overlaps the red blood cell separation matrix (7). The erythrocyte separation matrix (7) overlaps somewhat with the detection matrix (8) (detection zone), on which the immobilized substance is applied in the form of a line (9). The suction matrix (10) slightly overlaps the detection matrix (8). The sample loading matrix (6) contains all the reagents necessary to form a complex with the analyte to be detected. The test element introduced here by way of example is used for determining the concentration of troponin T from whole blood. Troponin T is an important index for determining necrosis of myocardium. In this case, the sample addition zone consisted of two superimposed fleeces, one impregnated with an antibody against troponin T labeled with gold, and the other fleece containing an antibody against biotinylated troponin T. Have been. A line (9) composed of streptavidin is provided inside the detection zone. FIG. 2 shows a top view of the housing (12) containing the test elements. The housing is provided with two openings, a sample addition opening (13) and a detection opening (14). Both openings narrow toward the test element. Further, the housing has a grip portion (15) for easy handling. FIG. 3 shows a cross section of a housing containing a test element. The test element is mounted on the lower part (17) of the housing. The upper part (16) of the housing rides on the cradle (19) of the lower part (17) of the housing at the housing support part (18), whereby the lower part and the upper part of the housing can be kept at a predetermined distance. The test element is fixed by a cradle (19) and a slot (20) so that the position does not move. As a result, the sample addition zone and the detection zone can be held at correct positions with respect to the opening of the housing. FIG. 3 shows a state in which the sample liquid (23) is further added to the sample addition zone using the pipette (22). The sample releases from the matrix (11 and 26) a biotinylated antibody and a gold-labeled antibody that binds to the analyte in the sample solution. Here, the analyte and the various complexes formed from the two antibodies are in equilibrium with each other. For detection, such a complex comprising a biotinylated antibody and an antibody labeled with gold is of particular importance. The sample solution containing the formed complex passes through the red blood cell separation matrix (7) and reaches the detection zone (8). Here, the biotinylated antibody is immobilized with the streptavidin line (9) applied to the detection zone. Only the complex containing biotin and the gold label contributes to the detectable signal. Behind the detection zone (8) is a suction fleece (10). FIG. 4 shows a holder into which a housing containing the test elements is inserted. The holder has a horizontal bottom plate (30), which is provided with two positioning ends (31, 32). A leaf spring (34) is attached to the fixture (33), and presses the housing (12) from the side. FIG. 5 shows a cross section of a system according to the invention. The detection zone (8) and in particular the immobilization line (9) are imaged on the sensor array (41) by an optical system (40), which is simply schematically shown as a lens. The irradiation of the detection zone is performed by a light emitting diode (42) arranged around the sensor array (41). A microprocessor (CPU) controls the sensor array. The analog signal of the sensor array is converted into a digital signal by an A / D converter (A / D) and sent to a microprocessor (CPU). The microprocessor also evaluates the sensor signal to determine the concentration of the analyte. The analysis result is displayed on the display device (D). FIG. 6 shows the signal curve of the test element for the control line. This figure shows a signal of a certain column of a two-dimensional sensor array having 165 columns and 192 rows. Each row of the sensor array is shown on the X-axis in the figure. The Y axis indicates a gray value (Grauwert) of each sensor expressed in an arbitrary unit. FIG. 6 shows that the amplitude of the signal of the detection line with respect to the control line is relatively small at the concentration of troponin T related to the clinical test. This demonstrates that positionally analyzed measurements are essential for this application. If the edges of the test element, i.e. the number of rows is less than 30 and more than 170, the edge effects appearing due to the shadow of the housing become pronounced. This indicates that it is very important to use a position analysis evaluation that can correct or eliminate this effect in such test elements. Explanation of reference numerals (1) Sample addition zone (2) Red blood cell separation zone (3) Detection zone (4) Suction zone (5) Carrier material (6) Sample addition matrix (7) Red blood cell separation matrix (8) Detection matrix (9) Form of line (10) Suction matrix (11) Sample loading matrix impregnated with gold-labeled antibody (12) Housing (13) Sample loading opening (14) Detection opening (16) Upper housing (17) Lower housing (18) Housing support (spacer) (19) Cradle (20) Insertion groove (21) Under the upper strip of the housing (22) Pipette (23) Sample liquid (26) Sample addition matrix impregnated with biotin-labeled antibody ( 30) Bottom plate (31, 32) Positioning end (33) Fixture (34) Leaf spring (40) Lens system / optical system (41) Sensor array
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フロントページの続き
(72)発明者 ゲンツシュ、ズサンネ
ドイツ連邦共和国、デー―68519 フィー
ルンハイム、ベートーベンシュトラーセ
45
(72)発明者 ハール、ハンス―ペーター
ドイツ連邦共和国、デー―69168 ヴィー
スロッホ、ヴァルトシュトラーセ ２
(72)発明者 ヘンドラー、エイリッヒ
ドイツ連邦共和国、デー―68623 ラムパ
ータイム、ヨハン―ステルツ―シュトラー
セ 81────────────────────────────────────────────────── ───
Continuation of front page
(72) Inventors Gentush, Zusanne
Germany, Day 68519 Fees
Lunheim, Beethovenstrasse
45
(72) Inventor Haar, Hans-Peter
Germany, Day 69168 Vee
Sloch, Waldstrasse 2
(72) Inventors Hendler, Erich
Day 68823 Lampa, Germany
-Time, Johann-Steelz-Streller
C 81