JP2000507097A - アルギニンに結合する単離されたｒｎａ分子およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、特定のアミノ酸に対する高いアフィニティーを有する単離されたＲＮＡ分子、該ＲＮＡ分子を単離する方法およびそれらの使用に関する。種々の洗浄および加熱工程を含む方法を介して、前記ＲＮＡ分子を単離する。

Description

【発明の詳細な説明】 アルギニンに結合する単離されたＲＮＡ分子およびその使用 発明の属する技術分野 本発明は、アミノ酸に対して高いアフィニティーまたは強いアフィニティーを 有する単離されたＲＮＡ分子およびその使用に関する。また、本発明の一部は、 前記ＲＮＡ分子を獲得する方法である。発明の背景および従来技術 アミノ酸とＲＮＡとの相互作用は、多くの生物学的系において実質的な役割を 果している。ドレイパー(Draper)、Ann．Rev．Biochem 64:593-620(1995)等を 参照のこと。例えば、アルギニンは、リボザイムのグアノシン結合部位で、Ｇ^{26 4} −Ｃ³¹¹塩基対を接触させるグアノシン補因子の２つのＨ−供与体部位を置換す ることにより、テトラヒメナのグループＩイントロンの自己スプライシング反応 を阻害する。ヤールス(Yarus)、Science 240:1751-1758(1988);ミシェル(Michel )ら、Nature 342:391-395(1989)。最近、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの 校正反応が、ＲＮＡ依存性アミノ酸認識の例として見い出された。シメル(Simme l)ら、Trends Biochem．Sci 20:1-2(1995)。これらの校正反応は、アミノ酸の活 性化およびアミノアシル化のエラーを除去するＲＮＡ依存性の工程に関与する。 ジャクボウスキー(Jakubowski)ら、Microbiol．Rev 56:412-429（1992）。第３ の例は、ＨＩＶ−１ ＴＡＴ蛋白質とＨＩＶ−１ｍＲＮＡの５’末端に位置する ＴＡＲ ＲＮＡのステムループ構造との相互作用である。ＴＡＴの塩基性領域内 のただ１つのアルギニンが、ＴＡＴとＴＡＲの認識に関して決定的である。カル ナン(Calnan)ら、Science 252:1167-1171（1991）。塩基性領域および遊離のア ルギニンに類似の短いオリゴペプチドは、全蛋白質の状況よりも弱い けれども、ＴＡＲに特異的に結合する。ウィークス(Weeks)ら、Science 249:１2 81-1285(1990)。ＴＡＴ−ＴＡＲ相互作用は、蛋白質−ＲＮＡ認識において、蛋 白質の個々のアミノ酸側鎖と相互作用するＲＮＡ構造が関与することを示す最初 の例を提供した。他の、いまだ発見されていないＲＮＡ−蛋白質相互作用は、蛋 白質またはペプチド内のどの単一のアミノ酸側鎖が、特異性、機能性および結合 力をおおまかに決定するためにＲＮＡにより提供される構造上の要素に特異的接 触を形成するかにあるように思われる。ドレイパー、前述。 個々のアミノ酸を特異的に認識するＲＮＡ配列の単離と特徴付けは、生物学的 に関連した蛋白質−ＲＮＡまたはＲＮＡ−アミノ酸相互作用のよりよい理解を促 進するであろう。アミノ酸結合ＲＮＡを得るための強力な道具は、例えば、ファ ムロク(Famulok)ら、Agnew．Chem．Int．Ed．Engl．31:979-988(1992)が教示し ているように、イン・ビトロの選択である。クルグ(Klug)ら、Mol．Biol．Rep20 :97-107(1994);ゴールド(Gold)ら、Ann．Rev．Biochem．64:763-797(1995);ジョ イス(Joyce)、Curr．Opin．Struct．Biol 4:331-336(1994)、これら文献のすべ ては、参照により合体される。固定化トリプトファン、アルギニン、シトルリン およびバリン等のアミノ酸を特異的に認識するＲＮＡアプタマーは、１０¹⁵の異 なるＲＮＡ配列までのプールから抽出された。コンネル(Connell)ら、Biochemis try 32:5497-5502(1993);ファムロク(Famulok)、J．Am．Chem.Soc．116:1698-1 706(1994);マジェスフェルト(Majesfeld)ら、Natur．Struct．Biol．１:287-292 (1994)（これら文献のすべては参照により合体される）を参照のこと。報告され たアフィニティーは、それぞれの場合で得られた他のアミノ酸に対する高いルベ ルの識別力を有し、６０μＭ（ファムロク）から１２ｍＭ（マジェスフェルト） までの範囲であった。これらのアミノ酸結合ＲＮＡの中で、アルギニン特異的ア プタマーは、中性のｐＨで正の電荷を有するアルギニン側鎖が、負に荷電した核 酸との特異的接触を形成するのに特に適するように思われるので、蛋白質−ＲＮ Ａ認識に特に関連するであろう。アボウル−エラ(Aboul −ela）ら、J．Mol．Biol 253:313-332(1995)を参照のこと。例えば、ＨＩＶ− １ Ｒｅｖ蛋白質は、３４〜５０位の間の１７アミノ酸のうち１０アミノ酸がア ルギニンであるという塩基性領域を含む。対応する１７マーのペプチドは、４つ のアルギニンが特異性に重要である全長の蛋白質の状況内と同様の様式で、Ｒｅ ｖ応答要素（ＲＲＥ）ＲＮＡIIＢヘアピンに結合する。クジェムス(Kjems)ら、E MB0Ｊ 11:1119-1129(1992);タン(Tan)ら、Cell 73:1031-1040(1993)をそれぞれ 参照のこと。ＨＩＶ−ＴＡＲ／Ｔａｔ複合体において、アルギニンおよびイソロ イシン残基は、結合と特異性に重大であることがわかった。フランケル(Frankel )、ナガイ(Nagai)ら、編、ＲＮＡ−蛋白質相互作用IRL Press，NewYork，NY 199 4）221-247頁。さらに、ＨＴＬＶ−１のＲｅｘ蛋白質は、アルギニン残基を通じ てその天然のＲＮＡ結合要素ＸＢＥと相互作用する。バスカーヴィレ(Baskervil le)ら、J.Virol 69:7559-7569(1995)。 現在、さらなる研究が行なわれ、特定のアミノ酸分子に対する強いアフィニテ ィーまたは高いアフィニティーを有するＲＮＡ分子の単離を可能にするおよび可 能にした技術開発が生じた。本発明は、参照により合体されるファムロク、J．A m．Chem．Soc．116:1698-1706(1994)に記載の研究開発である。前記記載のプロ トコールの改変を介して、以下の実施例により示されるように、非常に高いアフ ィニティーのＲＮＡ分子を単離することが可能であった。図面の簡単な説明 図１は、本発明により得られた溶出プロトコールの代表例である。好ましい態様の詳細な説明 実施例１ アミノ酸への高いアフィニティー結合をスクリーニングするために、ＲＮＡの ２つのプールを調製した。第１のプール（以下「プール１」と称する）は、参照 により合体されるファムロク、J．Am．Chem．Soc．116(5):1698-1706(1994)に従 って調製した。ファムロクの文献は、１１１ヌクレオチド長の約１０¹⁵のＲＮＡ 分子のプールの製造を教示する。これらの１１１マーを、ランダム化７４マーの インサートとともに、一定の５’および３’配列を用いて調製した。 ファムロクは、とりわけ、高いＬ−シトルリンアフィニティーを有する特定の ＲＮＡ分子（「クローン１６」）を教示する。このクローンは、第２の縮重した プールを調製するための基礎として使用した。７４マーのインサートの調製にお いて、例えば、７０％ＡならびにＧ、ＣおよびＴをそれぞれ１０％等の貯蔵を提 供するために、ホスファルアミダイトの貯蔵は、他の各ホスファルアミダイトを １０％それぞれ加えることを除いて、このプールもファムロクに従って調製した 。（７４マーのインサートを１８マーと１９マーのプライマー結合部位間に置い た）。 次いで、プール２の全体をＰＣＲ増幅に付した。ＰＣＲ増幅を前述のファムロ クに記載のように行ない、そこに記載のプライマー樹脂は、すなわち、 それぞれ５’および３’プライマーとして、 ＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡ ＣＴＣ ＡＣＴＡ ＴＡＧ ＧＡＧ ＣＴＣ ＡＧＣ ＣＴＴ ＣＡＣ ＴＧＣ（配列番号：１）および ＧＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＣＧＴＧＧＴＧＣＣ（配列番号：２）であった。 ６サイクルの増幅を行ない（９４℃ ４分；４２℃ ７分；７２℃ ７分）、次 いで、増幅産物をフェノール／ＣＨＣｌ₃で抽出し、エタノールで沈殿させ、１ ．３ｍｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６；１ｍＭ ＥＤＴＡ 、ｐＨ８０）に溶解した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０でのゲル濾過を行なっ た。ＲＮＡをＰＣＲ産物から転写し、以下の選択プロトコールに使用した。実施例２ 前記実施例１で産生したＲＮＡを、高アフィニティーアミノ酸結合に関して選 択した。しかしながら、これに先立ち、それを精製するために処理した。この手 法は、前記にある。 実施例１の溶液を含むＲＮＡ試料（１０〜１５μｇすなわち０．４ｎｍｏｌの ＲＮＡ）を水で希釈して８０μｌの最終容量にした。次いで、該溶液を９０℃で １０分間加熱し、さらに５分間２３℃まで冷却した後、前選択カラムに添加した 。前選択カラムは、（製造業者の指示に従って）誘導化されたグリシンが結合し 、試料の添加前に数倍のカラム容量の結合緩衝液で平衡化した０．５ｍｌのアガ ロースからなっていた。 ＲＮＡを含む試料を前選択カラムに添加した後、２〜３倍の容量の緩衝液で洗 浄した。この洗浄の効果は、選択カラム（前述）の頂上に直接置いた前選択カラ ムからフロースルーを開始させることである。 前選択カラムの下方に、製造業者の指示に従って誘導化してアガロースに付着 させておいた結合したアルギニン誘導体を有するアガロースの選択カラムを直接 設置した。前もって選択カラムを結合緩衝液でリンスした。ＲＮＡが一旦選択カ ラムに流入すれば、選択スキームを用いて、強固に結合するアプタマーのみを検 出した。まず、該カラムを５倍容量の結合緩衝液で洗浄した。次いで、２０ｍＭ のシトルリン含有結合緩衝液の６倍のカラム容量でカラムを洗浄することにより 逆選択を行なった。次に、遊離のシトルリンと結合アルギニンとの間の競合のス トリンジェンシーを増加させるために、アガロース、よってそれに結合したＲＮ Ａを、２０ｍＭのシトルリン含有溶液の存在下で９０℃に１０分間加熱し、次い で、２３℃に１５分間冷却した。次いで、未結合ＲＮＡを除去するために、２０ ｍＭのシトルリン含有結合緩衝液のさらなる５倍のカラム容量でカラムを溶出し た。 次いで、該カラムを２０ｍＭのアルギニンを含む結合緩衝液の１５倍のカラム 容量で洗浄した後、前記パラメーターを用いて、この溶液の存在下で熱変性させ た。これは、遅い解離速度を有し、よってゆっくり溶出する分子が熱変性の際に 強固な結合剤であると仮定されたのでなされ、これらの強固な結合ＲＮＡ分子は 、カラムから分離されて溶液中の過剰のリガンドの存在下で再生するべきであり 、それにより、マトリックスと結合用リガンド中で官能基を必要とするこれらの 分子の望まない濃縮を避ける。 次いで、該カラムを２０ｍＭのアルギニンを含む結合緩衝液の５倍のカラム容 量で溶出した。溶出されたＲＮＡを、（ａ）フェノールでアミノ酸を除去する工 程、（ｂ）ＲＮＡを沈殿させる工程および次いで、（ｃ）ＲＮＡを増幅させる工 程により回収した。このサイクルを２０回繰り返し、実施例１に記載されたよう に、プール１とプール２の両方で行なった。図１に、サイクル２０からの代表的 な溶出プロフィールを示す。実施例３ サイクル１０およびサイクル２０後に溶出したＲＮＡアプタマーを、前述のフ ァムロクに従ってＰＣＲ増幅に供して、配列を決定した。サイクル１０後の配列 決定した３６クローンの内で、３５％が前述のファムロクに教示されたアルギニ ン結合モチーフを示し、６５％が示さなかった。しかしながら、２０サイクル後 に得られた材料を配列決定したとき、サイクル１０での材料は１つも見出されず 、従来技術の配列は、２０サイクル後に残ったもののようなパートナーアミノ酸 に関するアフィニティーと同様のレベルを有しないことを示す。２０サイクル後 に見られる配列は、配列番号：Ｘ〜Ｙに示される。見い出された３１クローンの 内で、１つの配列が８回見られ、４つの配列がそれぞれ２回見られ、１１の配列 は１回のみであった。 プール１とプール２で見られた配列を比較したときに、わずか１つ、すなわち 、Ａｇ．０６（配列番号：３）が両プールで見られた。また、この分子も、最も 優勢なものであった。実施例４ 次いで、単離されたアプタマーの結合力を決定するために実験を行なった。こ れは、例えば、参照により合体されるロルシュ(Lorsch)ら、Biochemistry 33:97 3-982(1994);フェルシュト(Fersht)、Enzyme Structureand Mechanism，第２版( W．H．Freeman and Co.，New York，1985)、186頁;コナース(Connors)、Binding Constants(Wiley，New York，1987)、314頁等のよく知られた方法を用いて解離 定数を計算することにより決定される。これは、５００μlの容量の透析チャン バーを用いる平衡透析法である。使用したメンブランは、５０００ダルトンの分 子量カットオフを有していた。ＲＮＡ試料を、具体的には１．０μＭの濃度で使 用した。測定は、通常、３つの異なる濃度のＬ−[２，３，４，５−³Ｈ］−アル ギニン−ＨＣｌ（すなわち、２５０、２５および２．５μＭ）で行なわれた。２ ００μｌの試料容量をメンブランのそれぞれの面に用いた。試料を２３℃で一晩 平衡化した後、メンブランの両方の面の容量を決定し、量が同一であることを保 証するように調整した。アリコートを回収し、シンチレーションカウンティング に供した。３つのＲＮＡ分子、すなわち、Ａｇ．０６（配列番号：）ならびに他 の２つの点変異を示す分子、配列番号：４および５を用いた。 アルギニンの比活性を用いて、平衡での結合したリガンドの濃度[ＥＳ]eg、遊 離のアミノ酸[Ｓ]eqおよび遊離のＲＮＡ[Ｅ]egを計算した。Ｋｄは、下記式で定 義される： Ｋｄ＝（[Ｅ]eq×[S]eq）×[ＥＳ]eq^-1 Ａｇ．０６に対する値は、約３３０ｎＭ、すなわち、前述のファムロクの最も強 い結合剤のほとんど２００倍であった。強いアフィニティーは、小さい数値で表 され、より弱いアフィニティーは、より大きい数値で表されることに注意するこ と。特異的な値は、４ｍＭから３３０ｎＭに及び、テオフィリン（３２０ｎＭ） 、シアノコバラミン(cyanco balamine)（８８ｎＭ）ならびにアミノグリコシド 抗生物質トブラマイシン、カナマイシン、リビドマイシンおよびネオマイシン（ ２０ｎＭ〜２２０ｎＭ）等の他の非アミノ酸物質に対するアフィニティー値と同 等である。ジェニソン(Jenison)ら、Science 263:1425-1429(1996)、ローチ(Lo rch)ら、Biohcemistry 33:973-982(1994);ワン(Wang)ら、Chem & Biol2:281-290 (1995);ラト(Lato)ら、Chem & Biol 2:291-303(1995);ワリス(Wallis)ら、Chem & Biol 2:543-552（1995）を参照のこと。実施例５ ＲＮＡ分子がＬ−アルギニンとＤ−アルギニンとの区別ができるかどうかを決 定するために、実験を行なった。アーノルド(Arnold)ら、J．Chromatog 355:1− ２(1986)の分析アフィニティークロマトグラフィ一法を用いて、４．０ｍＭのＤ −アルギニンのアガロースカラムに適用させたとき、ＲＮＡはボイドボリューム に溶出した。このことは、Ｋｄが４ｍＭ、すなわち、アフィニティーが非常に弱 いという結論を導く。したがって、Ａｇ．０６（配列番号：３）のような分子は 、良好な区別を示す。この特別な場合において、それは、１２，０００倍良いオ ーダーである。 前記実施例は、とりわけ、特別なアミノ酸に対する高いアフィニティーを有す る単離されたリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含有する本発明の特別な態様を示す。３ ００ｎＭ程度のアフィニティーを有する単離されたリボ核酸分子が特に好適であ り、約６０μＭよりも大きいことがさらに好ましい。これらのＲＮＡ分子は、い かなるＬ−またはＤ−アミノ酸に対しても強いアフィニティーを有すことができ る。Ｌ−アルギニンに対する高いアフィニティーを有し、Ｌ−アルギニンとＤ− アルギニンおよび／またはＬ−シトルリンとＬ−アルギニンとの区別が可能であ るＲＮＡ分子が特に興味深い。かかるＲＮＡ分子の具体例としては、配列番号： ３〜２０までに示されたものである。 これらのＲＮＡ分子は、当業者にとって明らかな様々な用途を有する。例えば 、ＲＮＡ分子を用いて、この高いアフィニティーを利用して溶液から除去可能な ＲＮＡとアミノ酸との複合体を形成し、同定および／または溶出もしくは他の標 準的な分析技術を介したアミノ酸の定量により、溶液から特定のアミノ酸を除去 したり、特定のアミノ酸の存在または量を決定する。Ｌ−アルギニンとＤ−アル ギニン等のアミノ酸のエナンチオマーを同定および／または分離でき；Ｌ−アル ギニンとＬ−シトルリン等の構造上関連する異なるアミノ酸を分離等できる。 アミノ酸に対する高いアフィニティーを有するＲＮＡ分子を単離する過程は、 本発明の特徴として特に興味深い。この過程の必須の工程は、本明細書で繰り返 す必要のない当該技術分野で認識されている技術を用いて、ＲＮＡ分子または試 料の変性工程の後、固相に変性したＲＮＡを結合させる工程を含む。次に、結合 したＲＮＡを、高いアフィニティー結合剤が求められるアミノ酸でないアミノ酸 溶液と接触させる。次いで、固相に結合して残存しているいかなるＲＮＡも加熱 した後、前述のアミノ酸溶液と２回めの接触をさせる。これらの３つの工程を、 同一または異なるアミノ酸を用いて何サイクルでも繰り返すことができる。例え ば、高いアフィニティーのＬ−アルギニン結合剤を探しているならば、固相に結 合したＲＮＡをＤ−アルギニンと接触させてこれを加熱し、次にＤ−アルギニン と接触させた後、Ｌ−シトルリンを用いてこれらの工程を繰り返す。だいたい５ 〜２０サイクルのサイクルを行なうことが好ましく、１０〜２０サイクルが最も 好ましい。 これらの工程後、残存しているＲＮＡをすべて加熱し、次いで、強いまたは高 いアフィニティー結合剤が求められているアミノ酸の溶液と接触させる。これは 、固相から所望のＲＮＡを溶出するのに役立つ。 これらの過程において、ＲＮＡは、強いアフィニティー結合剤が求められてい るアミノ酸分子により固相に結合していることが好ましい。 前記注意したように、強いまたは高いアフィニティー結合剤は、低いＫｄ値を 有するＲＮＡ分子である。本明細書に記載された発明に関して、強いアフィニテ ィー（または高いアフィニティー）結合剤は、６０μｍ以下のＫｄ値を有するも のである。これらの分子は、１０倍低いオーダー、すなわち、約６．０μｍ以下 のＫｄ値を有することがさらに好ましい。この値は、約５００ｎＭ以下であるこ とがさらに好ましく、約３００ｎＭ以下であることが最も好ましい。 本発明の他の特徴は、当業者にとって明らかであり、本明細書で詳細に述べる 必要はないであろう。 用いた用語と表現は、説明の用語として使用したものであり、限定の用語とし てではなく、示され記載された特徴のいかなる均等物またはその一部を排除する かかる用語と発現の使用を意図するものではなく、本発明の範疇で様々な修正が 可能であることが認識される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．特定のアミノ酸に対する高いアフィニティーを有し、該アフィニティーが約 ６．０μｍ未満である単離されたＲＮＡ分子。 ２．約５００ｎＭ未満のアフィニティーを有する請求項１記載の単離されたＲＮ Ａ分子。 ３．約３００ｎＭ未満のアフィニティーを有する請求項１記載の単離されたＲＮ Ａ分子。 ４．該アミノ酸がアルギニンである請求項１記載の単離されたＲＮＡ分子。 ５．該アミノ酸がＬ−アルギニンである請求項１記載の単離されたＲＮＡ分子。 ６．Ａｇ．０６（配列番号：３）のヌクレオチド配列を有する請求項１記載の単 離されたＲＮＡ分子。 ７．溶液を、固相に結合した請求項１記載の単離されたＲＮＡ分子と接触させる 工程、ここで、該単離されたＲＮＡ分子はアミノ酸に対するアフィニティーを有 する、および 該アミノ酸と固相に結合した該ＲＮＡとの複合体を試料から除去する工程を含む 、溶液からアミノ酸を除去する方法。 ８．アミノ酸のエナンチオマーを含む試料を、固相担体と請求項１記載の単離さ れたＲＮＡ分子との複合体と接触させる工程、ここで該単離されたＲＮＡ分子は 該エナンチオマーの１つに対してアフィニティーを有する、および 該エナンチオマーと固相担体に結合したＲＮＡ分子との複合体を該試料から除去 する工程 を含む、アミノ酸のエナンチオマーを互いに分離する方法。 ９．該エナンチオマーがＬおよびＤ−アルギニンであり、該単離されたＲＮＡ分 子がＬ−アルギニンに対するアフィニティーを有する請求項８記載の方法。 １０．少なくとも２つのアミノ酸を含む試料を、固相担体に結合した請求項１記 載の単離されたＲＮＡ分子と接触させる工程、ここで、該ＲＮＡ分子は第１のア ミノ酸に対するアフィニティーを有する、ならびに 該第１のアミノ酸および固相担体と該ＲＮＡ分子との該複合体との複合体を該試 料から除去する工程 を含む、少なくとも１つの追加のアミノ酸を含む試料から第１のアミノ酸を分離 する方法。 １１．該第１のアミノ酸がアルギニンであり、該追加のアミノ酸がシトルリンで ある、請求項１０記載の方法。 １２．（ａ）ＲＮＡ試料を変性する工程； （ｂ）該ＲＮＡ試料を固相に結合する工程； （ｃ）固相に結合した該ＲＮＡを第１のアミノ酸とは異なる第２のアミノ酸の溶 液と接触させて、該第２のアミノ酸に対する低いアフィニティーを有するＲＮＡ を溶出する工程； （ｄ）固相に結合した該ＲＮＡを加熱する工程； （ｅ）固相に結合した該ＲＮＡを第２のアミノ酸の該溶液と２回めの接触をさせ 、該第２のアミノ酸に対して高いアフィニティー結合を有するＲＮＡを溶出する 工程； （ｆ）固相に結合した残存ＲＮＡを該第１のアミノ酸の溶液と接触させ、該第１ のアミノ酸に対する低いアフィニティーを有するＲＮＡを溶出する工程； （ｇ）固相に結合した残存ＲＮＡを加熱する工程；ならびに （ｈ）固相に結合した該残存ＲＮＡを該第１のアミノ酸の溶液と２回めの接触を させ、該アミノ酸に対する高いアフィニティーを有するＲＮＡを溶出する工程を 順に含む、第１のアミノ酸に対して少なくとも約１００ｎＭのアフィニティーを 有するＲＮＡ分子の精製方法。 １３．固定化した該第１のアミノ酸を有する固相に該ＲＮＡ試料を結合する工程 を含む、請求項１２記載の方法。 １４．工程（ｈ）で生成した溶出物から該ＲＮＡを単離する工程をさらに含む、 請求項１２記載の方法。 １５．工程（ｄ）および（ｅ）が少なくとも１回繰り返される、請求項１２〜１ ４記載の方法。 １６．該固相に結合したＲＮＡを少なくとも１つの追加のアミノ酸の溶液と少な くとも１回接触させ、該アミノ酸に対するアフィニティーを有するＲＮＡを溶出 する工程をさらに含む、請求項１２〜１５記載の方法。 １７．配列番号：３〜２０に示されるヌクレオチド配列を含有してなる、請求項 １記載の単離されたＲＮＡ分子。