JP2000506380A

JP2000506380A - Human cancer antigens of tyrosinase-related proteins 1 and 2, and genes encoding the same

Info

Publication number: JP2000506380A
Application number: JP9528747A
Authority: JP
Inventors: ワン，ロン―フー; ローゼンバーグ，スティーブン・エイ
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1996-02-09
Filing date: 1997-02-06
Publication date: 2000-05-30
Anticipated expiration: 2017-02-06
Also published as: DE69725428D1; CA2733866C; DK1411124T3; DE69725428T2; EP0882130A2; US6087110A; DK0882130T5; PT1411124E; DK0882130T3; DE69738630T2; US6132980A; CA2733866A1; CA2245702A1; WO1997029195A3; EP1092770A2; WO1997029195A2; EP1092770A3; ES2206685T3; PT882130E; AU1957297A

Abstract

(57)【要約】本発明は、正常なメラノーマ形成性遺伝子であるｇｐ７５遺伝子が、Ｔリンパ球によって認識される抗原性癌ペプチドにプロセスされる、ＯＲＦ３の２４アミノ酸ペプチドである遺伝子産物をコードすることを開示する。ＯＲＦ３から誘導される本発明の癌ペプチドは、腫瘍拒絶抗原として癌抗原特異的Ｔリンパ球によって認識される。本発明は、ＴＩＬ５８６細胞株から由来するＨＬＡ−Ａ３１制限ＣＴＬクローンによって認識される第２の腫瘍抗原の同定に関する。ＴＲＰ−２タンパク質腫瘍抗原から由来するこの抗原およびそのペプチドは、１ｎＭのペプチド濃度でＣＴＬクローンによる溶解のために標的細胞を感作することができる。修飾されたペプチドもＣＴＬクローンによって認識された。これらの遺伝子の産物は、癌を有する患者の治療および診断のための免疫治療戦略の有望な候補である。 (57) [Summary] The present invention discloses that the gp75 gene, a normal melanoma forming gene, encodes a gene product that is a 24-amino acid peptide of ORF3 that is processed into an antigenic cancer peptide recognized by T lymphocytes. The cancer peptide of the present invention derived from ORF3 is recognized as a tumor rejection antigen by cancer antigen-specific T lymphocytes. The present invention relates to the identification of a second tumor antigen recognized by an HLA-A31 restricted CTL clone derived from the TIL586 cell line. This antigen and its peptides, derived from the TRP-2 protein tumor antigen, can sensitize target cells for lysis by the CTL clone at a peptide concentration of 1 nM. The modified peptide was also recognized by the CTL clone. The products of these genes are promising candidates for immunotherapy strategies for the treatment and diagnosis of patients with cancer.

Description

【発明の詳細な説明】チロシナーゼ関連タンパク質１及び２のヒト癌抗原並びにこれをコードする遺伝子発明の分野本発明は、癌ワクチンを含む癌の診断薬および治療薬の領域に関する。より具体的には、本発明は、新規な癌ペプチド並びにその癌ペプチドをコードする代替（alternative）オープンリーディングフレームＤＮＡ配列の単離と精製に関する。本発明はさらに、癌を治療および防止する際の道具として作用し得る新規な腫瘍抗原並びにその癌抗原をコードするＤＮＡの単離と精製に関する。本発明はさらに、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ１）遺伝子内に由来する代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列によってコードされる新規な癌ペプチドに関する。本発明はまた、ＴＲＰ２遺伝子内に由来する新規な癌ペプチドに関する。本発明はさらに、個人における癌と前癌を検出および診断および治療するための方法に関する。発明の背景腫瘍浸透リンパ球（ＴＩＬ）の養子免疫伝達は、転移性メラノーマを伴う患者で腫瘍の退行を仲介することができ、Ｔ細胞によって認識される腫瘍拒絶抗原がこれらの腫瘍細胞上に存在することが示唆される。そのようなＴ細胞が入手可能なことにより、ヒトメラノーマ抗原をコードする遺伝子をクローン化し配列決定することが可能になっている。ヒトメラノーマからこれまでに同定された抗原は、その発現パターンに基づいて２つのクラスに分類することができる。第１のクラスの抗原は、腫瘍および精巣でのみ発現し、他の正常ヒト組織で発現しない遺伝子によってコードされる。ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＧＡＧＥおよびＢＡＧＥはこのクラスの例である。第２のクラスの抗原は、メラノサイト、メラノーマおよび正常網膜でのみ発現する遺伝子によってコードされる分化抗原を表す。ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００およびチロシンはこのクラスの例である。これらの抗原は全て未変異自己タンパク質である。しかしながら、ＣＤＫ４、Ｂ −カテニンおよびＭｕｍ−１を含む幾つかの変異抗原もまた、Ｔ細胞によって認識されることが同定された。対応する遺伝子産物に由来するＴ細胞によって認識される抗原性エピトープの同定は、自己抗原に対する免疫応答の機構を理解するためのみならず、癌を伴う患者の治療のためのこれらの抗原または合成ペプチドによる新規で有効な免疫治療戦略を開発するためにも、重要である。以前の研究により、メラノーマを伴う自己由来患者内にＴＩＬ５８６＋ＩＬ− ２を注入すると転移の客観的な退行が生じることが示された。より最近に、ＨＬＡ−Ａ３１と関連してＴＩＬ５８６によって認識される腫瘍抗原をコードする遺伝子、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１またはｇｐ７５）がクローン化された。興味深いことに、遺伝子産物ｇｐ７５は、転移性メラノーマを伴う患者からの血清中のＩｇＧ抗体によって認識される抗原として最初に同定された。その遺伝子は、メラノーマ、正常メラノサイト細胞株および網膜でのみ発現し、試験した他の正常組織では発現しないことが判明した。従って、この遺伝子は、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００およびチロシナーゼを含む第２のクラスの抗原の一員である。本分野では、癌の発達から個人を保護するための免疫原またはワクチンとして有用である癌細胞上のエピトープを同定することは困難であった。本発明は、Ｔ細胞によって特異的に認識されるＴＲＰ−１遺伝子内の代替オープンリーディングフレーム配列からコードされるペプチド内の癌ペプチドおよび抗原性癌エピトープの同定である。本発明は、ＴＲＰ−２遺伝子によってコードされる癌ペプチドを包含する。本発明の癌ペプチドは咄乳類で癌を阻害または防止するための免疫原およびワクチンとして有用である。発明の要旨本発明の一つの目的は、Ｔリンパ球によって癌抗原として認識される新規なペプチドおよびその一部を提供することである。本発明の癌ペプチドおよびその癌ペプチドの抗原性癌エピトープ部分は、同一の遺伝子由来の正常のタンパク質またはペプチドをコードするために使用されるオープンリーディングフレームＤＮＡ配列以外の遺伝子の代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列によってコードされる。この範囲内に入る遺伝子はＴＲＰ−１遺伝子である。本発明の別の側面は、同一の遺伝子由来の正常のタンパク質またはペプチドをコードするオープンリーディングフレームＤＮＡ配列以外の遺伝子の代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列によってコードされる腫瘍抗原である。この範囲内に入る遺伝子はＴＲＰ−１遺伝子である。本発明の別の目的は、癌ペプチドとして作用する、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２およびその変異体のペプチドフラグメントである。本発明の腫瘍抗原およびその腫瘍抗原の抗原性癌ペプチドは、ＴＲＰ−２遺伝子（配列番号４６）の全部または一部によってコードされる。ＴＲＰ−２は、チロシナーゼ関連遺伝子ファミリーの一員である。ＴＲＰ−２はＴ細胞に免疫応答を引き出させることができる新規で潜在的な腫瘍抗原として現在同定されている。本発明の一つの側面は、癌の発達から被験者を保護できる癌ワクチンとして有用である、ＴＲＰ−１遺伝子、ＴＲＰ−２遺伝子またはその変異体によってコードされる癌ペプチドである。本発明はまた、癌を防止するのに有効な量の癌ワクチンを投与する方法に関する。本発明の別の側面は、癌ペプチドまたはその抗原性癌エピトープを単独または１以上の免疫刺激分子と組み合わせて含む医薬組成物である。本発明の別の側面は、ＴＲＰ−１癌抗原を単独、ＴＲＰ−２腫瘍抗原を単独、または１以上の同時免疫刺激分子と組み合わせて含む医薬組成物である。本発明の別の目的は、Ｔ細胞を刺激して腫瘍および癌に対して免疫原性応答を引き出す、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２ペプチドまたはその組み合わせを含む、医薬組成物である。癌ペプチドまたはその抗原性癌エピトープは、癌の防止または治療のための免疫原としてまたはワクチンとして提供することができる。医薬組成物は、哺乳類において癌を治療または防止する方法で有用である。治療方法では、医薬組成物は、哺乳類における癌を防止または阻害するのに有効な量で哺乳類に投与される。本発明の別の目的は、同一の遺伝子由来の正常のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームＤＮＡ配列以外の遺伝子由来の代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列の翻訳によって癌ペプチドおよびそのペプチド内の抗原性癌エピトープを生成する方法である。本発明のさらに別の目的は、正常のタンパク質またはペプチドをコードするオープンリーディングフレームＤＮＡ配から翻訳される遺伝子産物以外の遺伝子由来の代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列から翻訳される癌ペプチド遺伝子産物またはその一部を検出および同定する方法である。本発明のさらに別の側面は、癌ペプチドまたはその一部をコードする代替オープンリーディングフレームＤＮＡまたはＲＮＡ配列、並びに癌ペプチドまたはその一部を産生する方法におけるそのＤＮＡまたはＲＮＡ配列の使用である。本発明はさらに、プローブまたはプライマーとして使用するための代替オープンリーディングフレームＤＮＡまたはＲＮＡ配列のオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のさらに別の目的は、細胞で発現させた場合に腫瘍抗原を産生する、ＴＲＰ−２またはそのフラグメントをコードする核酸配列である。本発明はさらに、癌ペプチドまたはその一部をコードする代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列を単独または少なくとも１つの免疫刺激分子をコードする第２のＤＮＡ配列と組み合わせて含むベクターを提供する。代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列は、ＴＲＰ−１遺伝子またはその変異体からのものでもよい。本発明はまた、癌ペプチドまたはその一部をコードする代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列を単独または少なくとも１つの免疫刺激分子をコードする第２のＤＮＡ配列と組み合わせて含むベクターでトランスフェクトまたは形質導入した宿主細胞を提供する。本発明はさらに、腫瘍抗原をコードするＴＲＰ−２遺伝子またはその一部を単独または少なくとも１つの同時免疫刺激分子をコードする第２のＤＮＡ配列と組み合わせて含むベクターを提供する。ベクターおよび宿主細胞はワクチンとして作用することができ、腫瘍抗原または癌ペプチドの発現は、ワクチンで免疫化した哺乳類における腫瘍抗原特異的Ｔリンパ球の刺激を生じさせる。本発明はまた、ＴＲＰ−２腫瘍抗原またはその変異体をコードするＤＮＡを単独または少なくとも１つの同時免疫刺激分子をコードする第２のＤＮＡ配列と組み合わせて含むベクターでトランスフェクトまたは形質導入した宿主細胞を提供する。ベクターおよび宿主細胞はワクチンとして作用することができ、ＴＲＰ−２腫瘍抗原の発現は、ワクチンで免疫化した哺乳類における抗原特異的Ｔリンパ球の刺激を生じさせる。ベクターおよび宿主細胞はワクチンとして作用することができ、癌ペプチドまたはその一部の発現は、ワクチンで免疫化した哺乳類における癌ペプチド特異的Ｔリンパ球の刺激を生じさせる。本発明のさらに別の目的は、ヒトの前新生物性および新生物性の細胞および組織を診断する方法を提供することである。本発明は、同一の遺伝子由来の正常のタンパク質をコードするために使用されるオープンリーディングフレーム核酸配列以外の遺伝子の代替リーディングフレーム核酸配列によってコードされる癌ペプチドまたはその一部を検出することによって哺乳類における癌または前癌を診断する方法であって、その癌ペプチドまたはその一部がＴリンパ球によって認識される方法を提供する。代替リーディングフレーム核酸配列は、ＴＲＰ−１遺伝子またはその変異体からのものでもよい。本発明のさらに別の目的は、ヒトの前新生物性および新生物性の細胞および組織を診断する方法を提供することである。本発明によれば、その方法は、ヒトから細胞、組織またはその抽出物を単離し、癌ペプチドをコードする代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列またはその一部を検出するか、代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列によって発現される癌ペプチドまたはその一部を検出することを含み、代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列または発現産物の検出またはその増加は、前新生物または新生物の指標である。本発明は、ＴＲＰ−２腫瘍抗原の検出による哺乳類の癌または前癌の診断方法であって、腫瘍抗原、癌ペプチドまたはその変異体がＴリンパ球によって認識される方法を提供する。本発明は、ＴＲＰ−２遺伝子またはそのフラグメントによってコードされる腫瘍抗原の検出による哺乳類の癌または前癌の診断方法であって、腫瘍抗原がＴリンパ球によって認識される方法を提供する。本発明のさらに別の目的は、癌ペプチドまたはその一部をコードする代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列の１以上のコピーをそのゲノム中に取り込んでいるトランスジェニック動物を提供することである。代替リーディングフレーム核酸配列はＴＲＰ−１遺伝子またはその変異体からのものでもよい。代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列の取り込みにより、多重型または変異型の癌ペプチドの過剰発現または発現が生じる。そのようなトランスジェニック動物は癌の治療に有用な治療剤のスクリーニングのために有用である。本発明のさらに別の目的は、本発明の腫瘍抗原の１以上のコピーをそのゲノム中に取り込んでいるトランスジェニック動物を提供することである。ＴＲＰ−２ＤＮＡ配列またはそのフラグメントの取り込みにより腫瘍抗原の過剰発現または発現が生じる。そのようなトランスジェニック動物は、癌の治療に有用な治療剤のスクリーニングのために有用である。本発明はまた、代替オープンリーディングフレーム核酸配列またはＴＲＰ−２腫瘍抗原核酸配列に特異的にターゲッティングして結合し、同一の遺伝子に由来する正常タンパク質の発現に悪影響を及ぼすことなく癌ペプチドまたは腫瘍抗原の発現を阻害する、アンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。本発明のさらに別の側面は、診断および検出アッセイで使用するためのＴＲＰ −１癌ペプチドおよびＴＲＰ−２脛瘍抗原を含む癌ペプチドおよびその抗原性癌エピトープと反応性を有するモノクローナルおよびポリクローナル抗体である。モノクローナルおよびポリクローナル抗体は、単独または診断および検出アッセイで通常使用される他の試薬と一緒のキットの形態で提供することができる。図面の簡単な説明本発明のこれら及び他の目的、特徴、および随伴する利点の多くは、添付する図面を一緒に考慮して、以下の詳細な説明を読むことでより良く理解されるであろう。図面中、図１Ａおよび１Ｂは、ＴＩＬ５８６によって認識される抗原性ペプチドをコードするｇｐ７５ヌクレオチド配列の位置を示す。図１Ａは、ｇｐ７５の１５８４ｂｐのオープンリーディングフレームを含む全長ｃＤＮＡを示す。ヌクレオチドは、リーダー配列と成熟ｇｐ７５から成るタンパク質へと翻訳される開始コドンから番号付けされている。ｐｃＤＮＡ７７６は最初の２４６ヌクレオチドコード領域を欠くｇｐ７５の部分ｃＤＮＡであり、ＨＬＡ−Ａ３１遺伝子と一緒にＣＯＳ−７をコトランスフェクションした際に、ＴＩＬ５８６によるＧＭ−ＣＳＦ分泌を刺激する能力に基づくアッセイを使用してｃＤＮＡライブラリーから単離された。一連の欠失構築物およびＰＣＲＤＮＡフラグメントを作製した。ｐＤ７７６ＡはＡｐａＩ制限酵素での消化後のｐｃＤＮＡ７７６の誘導体である。図１Ｂは、ＴＩＬ５８６によるＧＭ−ＣＳＦの放出を示す。ＴＩＬ５８６によるＧＭ−ＣＳＦ分泌は、図１Ａに示すＤＮＡフラグメントとＨＬＡ−Ａ３１遺伝子でコトランスフェクションしたＣＯＳ−７で同時培養した後に測定した。対照刺激物質細胞は、５８６ｍｅｌ、３９７ｍｅｌ／Ａ３１⁺ 、ＣＯＳ−７単独、およびＨＬＡ−Ａ３１またはｐｃＤＮＡ７７６ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳ−７を含む。図２は、ｇｐ７５遺伝子のヌクレオチド、アミノ酸配列およびオープンリーディングフレームを示す。最初の１５７アミノ酸の部分ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、ＯＲＦ１（ｇｐ７５）の翻訳の開始コドンから示した。ＴＩＬ５８６からのＧＭ−ＣＳＦ放出を刺激する能力を付与したＤＮＡフラグメントを下線で示す。２個の推定開始コドン、ＡＴＧ（２５４−２５６）およびＡＴＧ（２９４ −２９６）を太字で示し、各々ＯＲＦ２およびＯＲＦ３の翻訳を生じさせることができる。ＯＲＦ３からＴＩＬ５８６によって認識されるペプチド配列は太字と下線で示す。図３Ａと３Ｂは、抗原性ペプチドと代替オープンリーディングフレームの翻訳を示す。図３Ａは、ＰＣＲによって増幅されたＰＣＲフラグメントの位置と長さを示す。ＤＮＡフラグメントはＰＣＲ増幅によって得られ、ｐＣＲ３発現ベクター中にクローン化された。位置２９４−２９６のＡＴＧのＡＴＣによる置換は、材料および方法に記載される通りに行った。図３Ｂは、ＴＩＬ５８６からのサイトカイン放出を刺激するＤＮＡフラグメントおよび変異構築物の試験を示す。ＧＭ−ＣＳＦ放出アッセイは図１の場合と同様に行った。図４Ａ−４Ｃは、ＴＩＬ５８６によって認識される抗原性ペプチドの特徴を示す。図４Ａは、種々の刺激物質とともに同時インキュベートした場合の、ＨＬＡ− Ａ３１制限ＴＩＬ５８６によるＧＭ−ＣＳＦの放出を示す。トランスフェクションおよびサイトカインアッセイは図１ＡおよびＢと同様に行った。５８６ｍｅｌおよび３９７ｍｅｌをＴＩＬ５８６の反応性に関して陽性および陰性対照として含めた。ＯＲＦ３Ｐペプチドを１μｇ／ｍｌの濃度で９０分間５８６ＥＢＶ（Ａ３１＋）およびＴ２（非−Ａ３１）細胞とともにインキュベートした。ＴＩＬ５８６によるＧＭ−ＣＳＦ分泌の剌激は、ペプチドＯＲＦ３Ｐでパルスした自己由来５８６ＥＢＶおよび異質遺伝子型の１５１０ＥＢＶ（Ａ３１＋）細胞で同時インキュベートした場合は有意に増加したが、５８６ＥＢＶ単独またはＯＲＦ３Ｐペプチドで充填したＴ２（非−Ａ３１）細胞で同時インキュベートした場合は増加しなかった。図４Ｂは、ＴＩＬ５８６による標的細胞の細胞毒性溶解を示す。５８６ｍｅｌ（−■−）および３９７ｍｅｌ（−□−）を各々陽性および陰性対照として使用した。５８６ＥＢＶＢ細胞を、マークした通り、ＯＲＦ３Ｐ（ｐｅｐ）と（− ▲−）、無関係なペプチドと（ｉｐｅｐ）（−●−）、ペプチドなしに（−△− ）インキュベートし、そしてＴ２細胞をＯＲＦ３Ｐでパルスした（−○−）。インキュベーション後、ＴＩＬ５８６を添加し標的細胞と混合した。ＴＩＬ５８６の細胞溶解活性を４時間のクロム放出アッセイで測定した。図４Ｃは、ＴＩＬ５８６による溶解のために標的細胞を感作するためのペプチド濃度の滴定を示す。５８６ＥＢＶ細胞を、ＯＲＦ３Ｐ（ｐｅｐ）（−▲−）または無関係なペプチド（ｉｐｅｐ）（−●−）の連続希釈で、そしてＴ２細胞をＯＲＦ３Ｐペプチドで（−○−）９０分間別々にインキュベートした。ＴＩＬ５８６の細胞溶解活性は、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比率４０：１で４時間の⁵¹Ｃｒ放出アッセイで評価した。図５Ａおよび図５Ｂは、ＯＲＦ３Ｐペプチドでロードした未標識５８６ＥＢＶ細胞による⁵¹Ｃｒ標識した標的細胞の溶解の阻害を示す。図５Ａは、５８６ｍｅｌ細胞をクロムで９０分間「ホット」標的として標識したことを示す。ＯＲＦ３Ｐ（−▲−）、無関係なペプチド（−△−）でパルスした５８６ＥＢＶ細胞並びにＯＲＦ３ＰペプチドでロードしたＴ２細胞（−□−）を「コールド」標的細胞として使用した。洗浄後、「ホット」および「コールド」標的細胞を再度計数し、１：１、５：１、１０：１および２０：１の「コールド」／「ホット」比で混合した。ＴＩＬ５８６をエフェクター：「ホット」標的（Ｅ：Ｔ）比率２０：１で添加した。クロムの放出を４時間のインキュベーション後に測定した。図５Ｂは、ｇｐ１００を認識したＴＩＬ１２００による⁵¹Ｃｒ標識した６２４ｍｅｌ（「ホット」標識）の溶解が、無関係なペプチド（−△−）でパルスした５８６ＥＢＶ細胞と比較して、ＯＲＦ３Ｐ（−▲−）でパルスした５８６ＥＢＶ細胞によって阻害されなかったことを示す。「コールド」および「ホット」標的細胞を示した比率で混合した。ＴＩＬ１２００をエフェクター：ホット標的（Ｅ：Ｔ）比率３０：１で添加した。ＴＩＬ１２００の細胞溶解活性を４時間の⁵¹Ｃｒ放出活性で評価した。図６Ａ−６Ｄは、ＴＩＬ５８６細胞株からの抗原性ペプチドＴ細胞クローンの認識を示す。Ｔ細胞クローンをＴＩＬ５８６細胞株から生成した。５８６ＥＢＶＢ細胞をＯＲＦ３Ｐペプチドまたは無関係なペプチドでパルスした。Ｔ細胞クローンまたはＴＩＬ５８６細胞を添加して同時インキュベートした。５８６ｍｅｌ、３９７ｍｅｌ／Ａ３１⁺ 腫瘍およびメラノサイトＮＨＥＭ６８０細胞について、１×１０⁵ 細胞／ウエルを、各々Ｔ細胞クローン、ＴＩＬ５８６−Ｃ１（図６Ａ）、ＴＩＬ５８６−Ｃ４（図６Ｂ）およびＴＩＬ５８６−Ｃ６（図６Ｃ）またはＴＩＬ５８６（図６Ｄ）に１８〜２４時間１×１０⁵ 細胞でインキュベートした。ＧＭ−ＣＳＦアッセイを図１Ｂに記載した通り行った。図７．ＴＩＬ５８６に由来するＣＴＬクローンによる種々の標的細胞および抗原性ペプチドの認識。Ｔ細胞クローンをＴＩＬ５８６細胞株由来の限界希釈（１細胞／ウエル）によって生成し、６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含むＡＩＭ− Ｖ培地中でさらに膨張させた。ＣＴＬクローン５８６ＴＩＬ−Ｃ１およびクローン４によるＧＭ−ＣＳＦ分泌を、正常メラノサイト細胞株（ＨＬＡ−Ａ３１＋）、ＯＲＦ３Ｐペプチドまたは無関係なペプチドでパルスした５８６ＥＢＶＢ細胞、３９７ｍｅｌまたは５８６ｍｅｌ細胞と同時培養した後に測定した。図８．ＣＴＬクローン４により認識された新規な腫瘍抗原としてのＴＲＰ−２の同定。ＣＴＬクローン４によるＧＭ−ＣＳＦ放出を、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ７５／ＴＲＰ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ｐ１５およびＴＲＰ−２をコードする遺伝子と一緒にＨＬＡ−Ａ３１ｃＤＮＡでコトランスフェクションしたＣＯＳ −７と同時培養後に測定した。対照剌激物質細胞には、５８６ｍｅｌ、３９７ｍｅｌ、ＣＯＳ−７単独、およびＨＬＡ−Ａ３１ｃＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ−７が含まれた。図９．ＴＲＰ−２遺伝子の欠失およびサブクローンの構築およびＴ細胞認識。１５５７ｂｐオープンリーディングフレームを含むＴＲＰ−２の全長ｃＤＮＡを示す。ヌクレオチドをＴＲＰ−２ｃＤＮＡの５’未翻訳領域からｆ〜ｒｓｔヌクレオチドから番号を付けた。一連の欠失構築体およびＤＮＡフラグメントのスブクローニングを作製した。各構築物のＴ細胞認識を、上記したＤＮＡフラグメントおよびＨＬＡ−Ａ３１遺伝子でコトランスフェクションしたＣＯＳ−７でＣＴＬクローン４を同時培養した後に測定した。図１０．ＴＲＰ−２の抗原性ペプチドおよび部分コード配列．ＴＲＰ−２遺伝子の部分ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。ｐＴＤ４、ｐＴＡ、ｐＴＤ３およびｐＴＫ中のＤＮＡフラグメントの長さおよび３’末端を矢印で示し、ＡｐａＩ、ＰｓｔＩおよびＫｐｎＩの制限部位に印を付ける。ＣＴＬクローン４で認識される抗原性ペプチド配列を太字および下線で示す。図１１Ａから図１１Ｃ．ＣＴＬクローン４で認識される抗原性ペプチドの特徴。図１１（Ａ）．異なるペプチド濃度でのT細胞によるＧＭ−ＣＳＦ放出。５８６ＥＢＶ（Ａ３１＋）を、ＴＲＰ_197-205ペプチド（−−▲−−）でパルスし、Ｔ２（非−Ａ３１）細胞をＴＲＰ_197-205ペプチド（−−●−−）で異なるペプチド濃度で９０分間パルスした。対照ペプチドとしてのＯＲＦ３Ｐを、５８６ＥＢＶＢ細胞（−−△−−）上にパルスした。ＣＴＬクローン４によるＧＭ−ＣＳＦ放出を、ＴＲＰ_197-205およびＯＲＦ３Ｐでパルスした５８６ＥＢＶＢ細胞、そしてＴＲＰ_197-205でパルスしたＴ２細胞と同時インキュベートした後に測定した。図１１（Ｂ）．異なるペプチド濃度でのＣＴＬクローン４による溶解のための標的細胞の感作。５８６ＥＢＶＢ細胞を、ＴＲＰ_197-205（−−▲−−）、無関係なペプチドＯＲＦ３Ｐ（−−△−−）とインキュベートし、そしてＴ２細胞を種々のペプチド濃度でＴＲＰ_197-205でパルスした（−−●−−）。ペプチドインキュベーション後に、標的細胞を３０分間標識した。洗浄後、Ｅ：Ｔ比率４０：１でのＣＴＬクローン４の細胞溶解活性をＴ細胞と標的細胞との４時間のインキュベーション後に測定した。図１１（Ｃ）．異なるＥ：Ｔ比率でのＣＴＬクローン４による標的細胞の溶解。標的５８６ＥＢＶ細胞を、ＴＲＰ_197-205（−− ▲−−）または無関係なペプチドＯＲＦ３Ｐ（−−△−−）と別々にインキュベートし、標的Ｔ２細胞をＴＲＰ_197-205ペプチド（−−●−−）と９０分間インキュベートした。５８６ｍｅｌ（−−□−−）および３９７ｍｅｌ（−−■−− ）を各々陽性および陰性対照として使用した。発明の詳細な説明本発明は、免疫系のＴリンパ球によって免疫学的に認識される、癌ペプチド、腫瘍抗原並びにそれらの一部、誘導体または変異体を包含する。本発明はさらに、癌ペプチドまたは腫瘍抗原中に含まれる抗原性癌エピトープを包含する。抗原性癌エピトープは免疫系のＴ細胞との相互作用により細胞仲介免疫応答を特異的に生じさせる。抗原性癌エピトープとＴ細胞との相互作用により、Ｔ細胞はヒトを含む哺乳類中の癌に対して反応し、それを防止、排除または減少させる。一つの態様において、本発明の癌ペプチドの中に含まれる癌ペプチドおよび抗原性癌エピトープは、癌ペプチドが遺伝予内の正常のタンパク質またはペプチドをコードするオープンリーディングフレーム以外の遺伝子の代替オープンリーディングフレームによってコードされるという点で、正常のタンパク質またはペプチドと区別される。癌ペプチドおよびその一部は、特徴的なことに、正常な細胞では不在であるか非常に低いレベルで存在し、前癌および癌細胞では高いレベルで存在する。高いレベルでの癌ペプチドの発現は、正常細胞から前癌または癌細胞への形質転換と相関している。本発明の癌ペプチドは、原発性または転移性のメラノーマ、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホドキンの（non−Hodgkin' s）リンパ腫、ホドキンのリンパ腫、白血病、子宮癌、頸部癌、膀胱癌、腎臓癌、およびアデノカルチノーマ、例えば乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌等を含むがこれらに限定されない癌の一部を形成するか、それらから誘導される。メラノーマという用語には、メラノーマ類、転移性メラノーマ、メラノサイトまたはメラノサイト関連母斑細胞の何れか由来のメラノーマ、黒色癌、黒色上皮腫、黒色肉腫、in situメラノーマ、表在拡散性メラノーマ、結節性メラノーマ、ほくろ悪性メラノーマ、末端性ほくろ性メラノーマ、侵食性メラノーマまたは家族性非定型性母斑及びメラノーマ（ＦＡＭ−Ｍ）症候群が含まれるが、これらに限定されない。特に興味深いのは、癌、特にメラノーマを有する患者中の自己由来ＣＴＬによって認識される癌ペプチド、そのフラグメントまたは誘導体である。さらに興味深いのは、ＭＨＣ制限ＣＴＬ、特にＭＨＣクラスＩ制限ＣＴＬによって認識される癌ペプチド、そのフラグメントまたは誘導体である。本発明の「腫瘍抗原」は、哺乳類での抗腫瘍応答を引き出すことができる癌または腫瘍タンパク質およびその癌または腫瘍タンパク質の任意の部分を包含する。一つの態様では、腫瘍抗原には、全長ＴＲＰ−２タンパク質が含まれる。「癌ペプチド」という用語は本明細書で使用する場合、腫瘍抗原として作用する、癌または腫瘍タンパク質の任意のエピトープまたはフラグメントを包含する。「フラグメント」という用語は本明細書で使用する場合、タンパク質フラグメントの場合で少なくとも５または６アミノ酸そして遺伝子の場合で少なくとも１５から１８ヌクレオチドを有するタンパク質または遺伝子の任意のセグメントを意味する。一つの態様では、本発明の癌ペプチドは、正常遺伝子由来の代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列の発現から生じる。正常の遺伝子産物が発現されるよりむしろ、ＭＨＣ制限様式でＴリンパ球によって免疫学的に認識されることができる癌ペプチドが発現する。ＭＨＣ制限Ｔリンパ球は癌または前癌に関連する代替オープンリーディングフレーム遺伝子産物を同定するのに有用である。特に興味深いのは、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）；マウス腫瘍サプレッサーＩＮＫ４ａ遺伝子の代替リーディングフレームから生じるタンパク質ｐ１９^ARF（Quell e,D.E.他、Cell Vol.83，pp993-1000，1995）；抗原性オクタペプチドＳＶＶＥＦＳＳＬ、即ち、ＪＡＬ８、ｂｍ１抗Ｂ６同種異系反応性ｂｍ１ＢＺ１９．４Ｔ細胞によって認識される異質遺伝子型ペプチド（Malarkannan，S他、J.Exp.Med ．Vol.182，pp.1739-1750，1995）など：に関連する癌ペプチドである。一つの態様では、本発明の癌ペプチド、そのフラグメントまたは誘導体は、哺乳類の癌腫瘍由来の腫瘍浸透性リンパ球（ＴＩＬ）によって免疫学的に認識される抗原性癌エピトープを含む。特に興味深いのは、癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞によって認識される抗原性癌エピトープである（ＣＤ８⁺）。本発明の一つの態様では、癌ペプチドは約２４アミノ酸を含み、図２に記載したチロシナーゼ関連タンパク質１をコードする同一の遺伝子由来またはそれらのホモログまたは変異体由来の代替オープンリーディングフレーム３ＤＮＡ配列によって発現される。一つの態様では、本発明の癌ペプチドはアミノ酸配列：ＭＸａａＬＱＲＱＦＬＲＴＱＬＷＤＶＰＳＷＬＥＲＳＣＬ（配列番号７）およびそのフラグメントまたは誘導体を含む（式中、ＸａａはＳｅｒまたはＡｌａである）。配列番号６と部分的配列相同性を共有する癌ペプチドまたはその一部も本発明の範囲内に含まれる。部分的アミノ酸配列相同性とは、配列番号６と少なくとも８５％の配列相同性、好ましくは少なくとも９５％の配列相同性またはそれ以上を有するペプチドを意味し、癌抗原特異的Ｔリンパ球を刺激する生物学的作用を有する。本発明の一つの態様では、癌ペプチドは式：ＭｅｔＸａａＬｅｕＧｌｎＡｒｇＧｌｎＰｈｅＬｅｕＡｒｇ（配列番号８）およびそのフラグメントおよび誘導体によって表すことができる（式Ｘａａ＝ＳｅｒまたはＡｌａ）。本発明の癌ペプチドの別の態様では、アミノ酸配列：ＭＳＬＱＲＱＦＬＲ（配列番号９）およぴそのフラグメントおよび誘導体を含む。別の態様では、本発明の腫瘍抗原の中に含まれる癌ペプチドおよび抗原性癌エピトープは、メラノーマ、正常メラノサイト細胞株および網膜で主として発現するＴＲＰ−２タンパク質に由来する。本発明の腫瘍抗原は、前癌および癌細胞で見られる上昇したレベルよりも大部分の正常細胞では有意に低いレベルで存在する。腫瘍抗原の上昇した発現は正常細胞の前癌または癌細胞への形質転換と相関する。ＴＲＰ−２はヒト染色体１３に位置し、チロシナーゼ関連遺伝子ファミリーの一員であることが示され、チロシナーゼおよびｇｐ７５／ＴＲＰ−１に対して４０−４５％のアミノ酸配列同一性を共有する（Yokoyama他(1994); Bouchard 他(1994)）。ＴＲＰ−２は５１９アミノ酸を有するタンパク質をコードし、メラニン合成に関与するＤＯＰＡクロム互変異性化酵素（tautomerase）活性を有することが実証されている（Bouchard他(1994)）。特に興味深いのは、癌、特にメラノーマを有する患者における自己由来ＣＴＬによって認識されるＴＲＰ−２の癌ペプチドまたはその変異体である。さらに興味深いのは、ＭＨＣ制限ＣＴＬ、特にＭＨＣクラスＩ制限ＣＴＬによって認識される癌ペプチド、そのフラグメントまたは誘導体である。癌ペプチドによって認識される好ましいＨＬＡサブタイプはＨＬＡ−Ａ３１サブタイプである。本発明は、ＨＬＡ−Ａ３１制限Ｔ細胞によって認識される潜在的な腫瘍抗原としての、ＴＲＰ−２、チロシナーゼタンパク質ファミリーのメラノーマ／メラノサイト分化抗原の同定に関する。ＴＲＰ−２遺伝子産物はＴＩＬ５８６から単離されたＣＴＬクローンによって認識される第２の腫瘍抗原である。本発明の別の態様では、腫瘍抗原は約９アミノ酸を含む癌ペプチドであり、チロシナーゼ関連タンパク質−２（配列番号４６）をコードする遺伝子または図１０に示すそのホモログまたは変異体から発現される。さらに別の態様では、ＴＲＰ−２タンパク質のフラグメントまたはその機能的に均等な変異体は癌ペプチドとして使用される。好ましくは、本発明の腫瘍抗原はアミノ酸１９７−２０５の少なくとも一部分を含むＴＲＰ−２タンパク質のフラグメントを含む。最も好ましくは、本発明の癌ペプチドはアミノ酸配列：ＬＬＧＰＧＲＰＹＲおよびそのフラグメントまたは誘導体を含む。アミノ酸１９７− ２０５を含むＴＲＰ−２の領域と部分的配列相同性を共有する癌ペプチドまたはその一部も本発明の範囲内に含まれる。部分的アミノ酸配列相同性とは、ＬＬＧＰＧＲＰＹＲと少なくとも８５％の配列相同性、好ましくは少なくとも９５％の配列相同性またはそれ以上を有するペプチドを意味し、癌抗原特異的Ｔリンパ球を刺激する生物学的作用を有する。本発明の別の態様は、癌ペプチドとして有効に作用するのに十分な相同性をＬＬＧＰＧＲＰＹＲに対して有する癌ペプチドを包含する。そのようなペプチドは１以上の位置で保存的アミノ酸変化を有していてもよい。保存的アミノ酸変化とは、特定の位置での本来存在するのと同一の型のアミノ酸変化を意味し、即ち、疎水性アミノ酸が疎水性アミノ酸に変化し、塩基性アミノ酸が塩基性アミノ酸に変化すること等である。そのようなアミノ酸変化はペプチドの全体の荷電および配置を有意には変更せず、従ってそのような変異体は癌ペプチドの抗癌活性を維持する。そのような保存的変化の例は当業者に周知であり、本発明の範囲内である。本発明のさらに別の態様は、ＬＬＧＰＧＲＰＹＲペプチドに由来するが、１以上の位置で非保存的アミノ酸変化を含む数種の癌ペプチドに関する。そのようなペプチドが本発明で同定され、ＬＳＧＰＧＲＰＹＲ、ＫＬＧＰＧＲＰＹＲ、ＬＬＧＰＧＦＰＹＲおよびそのフラグメントおよび誘導体を含むが、これらに限定されない。本発明はＴＲＰ−１またはＴＲＰ−２癌ペプチドの機能的に均等な変異体に関する。「機能的に均等な変異体」には、部分的配列相同性を有するペプチド、１以上の特定の保存的および／または非保存的アミノ酸変化を有するペプチド、ペプチド結合体、キメラタンパク質、融合タンパク質およびペプチド核酸が含まれる。癌ペプチド、腫瘍抗原およびそれらの抗原性癌エピトープは、一次臨床単離物、細胞株などからなどのように天然源から精製および単離することができる。癌ペプチドおよびその一部は少なくとも９０％の純度、好ましくは少なくとも９５％の純度、そして１００％の純度である。癌ペプチドおよびそれらの抗原性エピトープはまた、化学合成によってまたは当分野で公知の組み換えＤＮＡ技術によって得ることもできる。化学合成の技術はJ.M．StewardおよびJ.D.Young，”Solid Phase Peptide Synthesis”，W.H．Freeman & Co.，San Francisco，1969; M． Bodansky他”Peptide Synthesis”，John Wiley & Sons，第２編、１９７６、およびJ.Meienhofer，”Hormonal Proteins and Peptidea”，Vol.2，p.46，Acade mic Press，New York，1983およびE.SchroderおよびK.Kubke”The Peptides” Vol.1，Academic Press，New York，1965に記載されている。癌ペプチドおよびそれらの抗原性癌エピトープは、当分野で公知の方法によって薬学的に許容可能な担体とともに医薬組成物に調剤化することができる。本組成物は癌を防止または治療するためのワクチンとして有用である。本組成物はさらに少なくとも１つの免疫刺激分子を含む。抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するために癌ペプチドまたはその一部分と組み合わせて使用するための免疫刺激分子には、１以上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子、例えばクラスＩおよびクラスＩＩ分子、好ましくはクラスＩ分子が含まれるが、これらに限定されない。本組成物はさらに、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ− １、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２等を含む他の刺激剤分子、並びに、ＩＬ−１からＩＬ −１５、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＦＮ α、ＣＴＡＰＩＩＩ、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯ、Ｉ−３０９、ＰＦ−４、ＩＰ−１０、ＬＤ−７８、ＭＧＳＡ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βを含むがこれらに限定されないサイトカイン類、またはそれらの組み合わせ等を、免疫強化のために含んでもよい。刺激分子は物理的に別個の形態として提供してもよいし、Ｂ細胞、マクロファージまたは樹枝状細胞などの抗原提示細胞の膜中に、リポソームの膜中に提供してもよいし、形質導入またはトランスフェクションした細胞の表面上に発現してもよい。ＭＨＣ免疫刺激分子のＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋ等から入手可能である。癌ペプチド、腫瘍抗原およびそれらの抗原性癌エピトープは、癌を防止または治療するための方法で有用であり、ヒトを含む哺乳類中の癌または前癌を検出するための診断アッセイで有用である。癌ペプチドまたはその一部は、放射標識、ビオチン、フルオレセインなどの他の構成成分がそれに付着している、誘導体の形態でもよい。特定の器官、腫瘍または細胞型への特異的ターゲッティングを可能にするターゲッティング物質もまた腫瘍抗原、癌ペプチドまたはその一部に付着させてもよい。そのようなターゲッティング物質は、ホルモン、サイトカイン、細胞受容体などでもよい。癌ペプチド、腫瘍抗原およびそれらの一部は、単独または他の試薬と組み合わせてキットの形態で用意することができる。本発明の別の側面は、癌に対する腫瘍特異的細胞仲介免疫性を誘導するのに有用なワクチンである。癌の免疫療法に対するアプローチは能動または受動のカテゴリーに分類することができる。能動免疫療法には、腫瘍に対する免疫応答を増進するための試みにおいて癌抗原を有する癌患者を直接免疫感作することが含まれる。受動免疫治療は、抗腫瘍応答を直接的に仲介することを目標にして、抗腫瘍反応性を有する免疫細胞または抗体などの免疫試薬を投与することを言う。能動免疫療法の最初の試みは、無傷な癌細胞または癌細胞抽出物のいずれかを、これらの物質が免疫応答を刺激できる量および形態で腫瘍抗原を含んでいるという期待をもって、利用した。しかしながら、癌抗原の分子の同定により、ヒト癌の治療のための免疫療法を開発する新たな可能性が開けた。これらの試みの幾つかの要約を表１に示す。表１癌抗原の分子同定に基づく癌治療１．以下のものによる能動免疫治療：ａ．免疫優性ペプチド１）単独２）アジュバンドとの組み合わせ３）ヘルパーペプチド、脂質またはリポソームに結合４）抗原提示細胞上にパルスｂ．ＭＨＣ分子への結合を増大させるアミノ酸置換による免疫優性ペプチドｃ．単独またはアジュバンドと組み合わせたタンパク質ｄ．癌抗原をコードする「裸の」ＤＮＡ１）皮膚内注入のための「遺伝子銃」２）筋肉内注入３）脂質に結合ｅ．次をコードするワクシニア、鶏痘又はアデノウイルス等の組み換えウイルス１）癌抗原単独２）癌抗原＋サイトカインをコードする遺伝子、同時刺激分子、または免疫疫応答を増強する他の遺伝子ｆ．単独または免疫刺激分子と組み合わせて癌抗原をコードするＢＣＧ、サルモネラまたはリステリア等の組み換え細菌２．免疫刺激サイトカインの投与を伴う（上記の）能動免疫治療１．ＩＬ−２２．ＩＬ−６３．ＩＬ−１０４．ＩＬ−１２５．ＩＬ−１５など３．TIL又はPBLの次へのインビトロ感作で生じた抗腫瘍リンパ球による受動免疫治療１．抗原提示細胞上にパルスした免疫優性ペプチド（ＣＤ８細胞を生じる）２．抗原提示細胞と同時インキュベートした抗原性タンパク質（ＣＤ４細胞を生じる外生抗原提示経路）Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母またはバキュロウイルスなどの高効率発現系への癌抗原をコードする遺伝子の挿入は、免疫化で使用するための大量の精製された腫瘍抗原を得る機会を提供する。あるいは、これらの腫瘍抗原からの免疫優性ペプチドはインビトロで容易に合成でき、単独にあるいはアジュバンド、脂質／リポソームまたはヘルパーペプチドへの結合との組み合わせなどのそれらの免疫原性を改善することを意図した形態で免疫化のために大量に精製することができ、または抗原提示細胞上へパルスすることができる。ＭＨＣ抗原への結合効率を改善するための免疫優性ペプチドの個々のアミノ酸の修飾により、天然のペプチドと比較して免疫原性を潜在的に増加させることができる。筋肉中または皮膚中に直接注入した「裸の」ＤＮＡを使用する最近の技術は、コードされた抗原に対する細胞性とホルモン性の両方の免疫応答を高めることを示した（Cooney，E.L.，A.C．Collier，P.D．Greenberg，R.W．Coombs，J.Zarli ng，D.E．Arditti，M.C．Hoffman，S.L．HuおよびL．Correy，1991，Lancet337: 567;Wolff，J.A.，R.W．Malone，P.Williams，W．Chong，G．Acsadi，A．Jani, およびP.L.Felgner，1990，Science 247:1465;Davis，H.L.，R.G．Whalen,およびB.A.Demeniex，1993，Hum．Gene Ther.4:151; Yang，N.S.，J.Burkholder，B ．Roberts，B Martinelli,およびD．McCabe，1990，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 8 7:9568;Williams，R.S.，S.A．Johnston，M.Riedy，M.J．Devlt，S.G．McElligo tt,およびJ.C．Sanford，1991，Proc.Natl.Acad.Sci．USA88:2726;Fynan，E.R. ，Webster,D.H．Fuller，J.R．Haynes，J.C．Santoro,およびH.L.Robinson，199 5，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 90:11478;Eisembraum，M.D.，D.H.Fuller,およびJ .R.Haynes，1993，DNA and CellBio．12:791; Fuller，D.H.およびJ.R．Haynes ，1994，AIDS Res．Hum．Retrovir．10(11):1433;Acsadi，G.，G．Dickson，D.R .Love，A.Jani，F.S．Walsh，A．Gurusinghe，J.A．Wolff，およびK.E．Davies ，1991，Nature 352:815）。生活力のないＤＮＡベクターを使用する技術は準備の容易性と投与の安全性の利点を有している。本発明の代替核酸配列は癌に対する免疫原としてまたはＤＮＡワクチンとして有用である。ＴＲＰ−１の本発明の代替オープンリーディングフレーム核酸配列あるいは本発明のＴＲＰ−２タンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列は、癌細胞に対する細胞応答を引き出す量で遺伝子銃を使用して投与することができる。ナノグラムの量がそのような目的にとって有用である。免疫化の有効な形態は、ＢＣＧ、サルモネラまたはリステリア等の組み換え細菌中にあるいはワクシニア、鶏痘またはアデノウイルス等の組み換えウイルス等中に免疫原性分子をコードする遺伝子を取り込むことを含む。癌抗原をコードする遺伝子は、単独で、あるいは免疫刺激分子をコードする遺伝子または感染後に免疫応答を増大させることができる他の遺伝子と一緒に発現させることができる。マウスモデル中のモデル腫瘍抗原による研究は、インターロイキン−２（ＩＬ −２）またはＢ７．１の遺伝子の取り込みによりモデル腫瘍抗原の免疫原性を増大することができ、これらの抗原を有する確立した肺転移巣の減退を仲介さえでき、そしてこれらの抗原を有する確立した肺転移巣の減退を仲介さえできることを示した。ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２またはＩＬ−１５等の免疫刺激サイトカインの外来投与を伴う能動免疫治療を使用して免疫応答を改善することもできる。ヒト腫瘍抗原を認識できる遺伝的に改変した免疫細胞（通常は養子免疫治療と称される）による受動免疫は転移性メラノーマを有する選択患者における癌の退行を仲介するのに有効である。ヒトリンパ球が抗原提示細胞上に提示された腫瘍抗原免疫優性ペプチドにインビトロで感作されるインビトロ技術が開発されている。反復したインビトロ刺激によって、ヒト腫瘍抗原をコードする遺伝子をクローン化するために使用したＴＩＬよりもはるかに大きなヒト腫瘍抗原を認識する能力を有する細胞を誘導することができる。即ち、癌ペプチドによる反復したインビトロ感作によって、ＴＩＬの５０〜１００倍以上の効力を有するリンパ球を誘導することができた。これらの細胞の養子移入は、通常通り生育したＴＩＬよりもインビトロでの腫瘍退行を仲介するのにより有効であるかもしれない。癌を防止または阻害する方法において、癌ペプチドまたはその一部を、静脈内、筋肉内、皮下、皮膚内、腹腔内、くも膜内、胸膜内、子宮内、直腸、膣、局所、腫瘍内などを含むがこれらに限定されない複数の経路の一つを通じて投与することができる。投与は、粘膜通過または皮膚通過手段で行うことができる。粘膜通過または皮膚通過投与のためには、透過すべき障壁に適した浸透剤を調剤中に使用する。そのような浸透剤は当分野で一般的に既知であり、例えば、粘膜通過投与のためには胆汁塩およびフシジン酸（fusidic acid）誘導体が含まれる。さらに、洗浄剤を使用して浸透を容易化することができる。粘膜通過投与は、例えば、鼻腔スプレー、または座薬によるものでもよい。経口投与のためには、癌ペプチド、腫瘍抗原、その一部または変異体は、カプセル剤、錠剤および毒物（toxics）などの通常の経口投与形態に調剤化される。一般に、被験者の体重１Ｋｇ当たり少なくとも約１ｐｇ、好ましくは体重１Ｋｇ当たり少なくとも約１ｎｇ、より好ましくは体重１Ｋｇ当たり少なくとも約１ μｇ以上の投与量の癌ペプチドまたはその一部を被験者に供給することが望ましい。体重１Ｋｇ当たり約１ｎｇから体重１Ｋｇ当たり約１００ｍｇの範囲が好ましいが、より低い投与量またはより高い投与量を投与することもできる。投与により、癌抗原特異的Ｔリンパ球、好ましくは細胞毒性Ｔリンパ球のクローン性膨張を開始、刺激および／または生じさせるのに有効であり、これらは次いで被験者中で癌を防止または阻害することができる。投薬量は少なくとも１回投与され、巨丸薬（bolus）としてまたは連続投与として供給してもよい。数週間から数カ月間にわたる投薬量の多数回投与が好ましいかもしれない。次の投与は指示された通りに投与することができる。治療方法においては、癌ペプチドまたはその一部を含むワクチンを有効量で哺乳類に投与し、哺乳類における癌を防止する。特に興味深いのは、メラノーマの防止のためのＴＲＰ−１遺伝子のＯＲＦ３によってコードされる癌ペプチドまたはその一部を含むワクチンである。また特に興味深いのはメラノーマの防止のためのＴＲＰ−２遺伝子のフラグメントによってコードされる１以上のペプチドを含むワクチンである。腫瘍を有する動物における腫瘍の負荷を減少する方法においては、当該方法は腫瘍の負荷の部位に有効量の抗原性癌エピトープを投与することを含み、その量はその部位の腫瘍の大きさを減少するのに有効である。治療の別の方法では、自己由来の細胞毒性リンパ球または腫瘍浸透リンパ球を癌を有する患者から得ることができる。リンパ球を培養液中で生育させ、特異的癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープの単独での、またはサイトカインを有する少なくとも１つの免疫剌激分子と一緒での存在下において培養することによって癌抗原特異的リンパ球を膨張させる。抗原特異的リンパ球を次いで、患者の腫瘍を減少または排除するのに有効な量で患者中に注入して戻す。免疫化の後に、ワクチンの効率を、特異的溶解活性、特異的サイトカイン産生、腫瘍退行またはこれらの組み合わせによって評価される通り、癌抗原を認識する免疫細胞の産生によって評価することができる。免疫化すべき哺乳類が癌または転移性癌に既に罹患している場合には、ワクチンを、免疫調節剤、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、インターフェロン、腫瘍壊死因子などの他の治療処置、シスプラチナムなどの化学治療剤、ガンシクロビルなどの抗ウイルス剤、アムホテリシンＢ、抗生物質などと組み合わせて投与することができる。本発明の別の側面は、正常のタンパク質またはペプチドをコードするオープンリーディングフレームＤＮＡ配列以外の遺伝子の代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列であって、代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列が免疫系のＴ細胞によって免疫学的に認識される癌ペプチドおよびその一部をコードする、上記ＤＮＡ配列である。代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列は、ＴＲＰ−１遺伝子、ＴＲＰ −２遺伝予、ＩＮＫ４ａ遺伝子などからのＤＮＡ配列を含むが、これらに限定されない。興味深いのは、メラノーマ形成遺伝子由来の代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列である。メラノーマ形成遺伝子は、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ｇｐ７５（ＴＲＰ−１）、ＴＲＰ−２（Helahan，R 他、1993 J．Invest．Dermatol．100(Suppl.): 176S-185S）などをコードする遺伝子を含むが、これらに限定されない。本発明の一つの態様は、チロシナーゼ関連タンパク質をコードする遺伝子配列内からの癌ペプチドをコードする代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列またはその一部である。ＴＲＰ−１の遺伝子配列は、Vijayasaradhi，S．他(199 0，J．Exp.Med.171:1375-80)に記載されている通り、アクセッション番号Ｘ５１４５５により、そしてCohen，T．他1990 Nucleic Acids Research，VOL.18:2807 に記載されている通り、ＥＭＢＬアクセッション番号Ｘ５１４２０により、ＥＭＢＬデータバンクに開示されている。一つの態様において、代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列は、腫瘍浸透リンパ球を含む癌抗原特異的Ｔリンパ球によって認識される癌ペプチドまたはその一部をコードする、配列番号５を有する図２に記載のＯＲＦ３、その一部および機能的に均等なその配列変異体を含む。図２に記載したＯＲＦ３に相補的並びに抗相補的な核酸配列も本発明に含まれる。別の態様において、代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列は、ＡＴＧＴＣＡＣＴＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＴＴＴＣＴＣＡＧＧ（配列番号１０）を含む。本発明の一つの態様は１以上の癌ペプチドをコードするＴＲＰ−２の一部である。ＴＲＰ−２の遺伝子配列は、Yokoyama他（1994）に記載されている通りアクセッション番号Ｄ１７５４７そしてBouchard他（1994）に記載されている通りジーンバンクアクッション番号Ｓ６９２３１によりジーンバンクに開示されている。一つの態様において、ＴＲＰ−２遺伝子フラグメントは、ＬＬＧＰＧＲＰＹＲおよび、腫瘍浸透リンパ球を含む癌抗原特異的Ｔリンパ球によって認識される癌ペプチドについての機能的に均等なその配列変異体をコードする。ＬＬＧＰＧＲＰＹＲをコードする配列およびその均等な配列変異体に相補的並びに抗相補的な核酸配列も本発明に含まれる。別の態様において、ＴＲＰ−２タンパク質をコードするＤＮＡ配列は全てまたはその一部以上を発現する。ＴＲＰ−２遣伝子の好ましいフラグメントは、ヌクレオチド位置９４７のＰｓｔＩ部位とヌクレオチド位置１０８０のＫｐｎＩ部位の間の領域を含む。ＴＲＰ−２遺伝子の別の好ましいフラグメントは、ＴＴＡＴＴＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＣＧＣＣＣＣＴＡＣＡＧＧを含む。遺伝コードの縮重のため、ＤＮＡ配列の変形が均等な癌ペプチドの翻訳を生じるであろう。その結果、置換が癌抗原ＭＨＣ制限Ｔ細胞によって認識される癌ペプチドの発現を生じる限り、そのような置換も本発明の範囲内に含まれる。本発明に包含される一つの置換は、ＳｅｒをコードするＴＣＡのＡｌａをコードするＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡまたはＧＣＧの代わりの置換である。他の咄乳類種からのホモログが本発明の範囲内に含まれる。ＴＲＰ−１遺伝子などからのような代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列の全部または一部をプローブとして使用して他の咄乳類種の癌ペプチドのホモログを同定および単離することができる。同様に、ＴＲＰ−２遺伝子の全部または一部をプローブとして使用して他の哺乳類種の癌ペプチドのホモログを同定および単離することができる。一つの態様においては、マウスｃＤＮＡ配列を使用してヒトホモログ核酸配列の哺乳類ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。陽性クローンを選択して配列決定する。ｃＤＮＡライブラリーを合成できる組織種類の例としては、真皮、表皮、固体腫瘍、メラノーマ、メラノサイトなどが含まれるがこれらに限定されない。当業者ならばホモログを検出するために使用する好適なハイブリダイゼーション条件を理解するであろう。核酸ハイブリダイゼーション、ライブラリーの構築およびクローニング技術の慣用的方法はSamb rook他（eds）（1989）「Molecular Cloning．A Laboratory Manual」 Cold Spr ing Harbor Press，Plainview，New YorkおよびAusubel他（eds）「Current Pro tocols in Molecular Biology」（1987）、John WileyおよびSons，New York，N ew Yorkに記載されている。本発明の別の側面は、癌を有する哺乳類から単離された生物試料中のＴＲＰ− １、ＴＲＰ−２癌ペプチドなどのような癌ペプチドを転写するＲＮＡの検出および定量のための核酸プローブである。対照ＲＮＡ試料に対するＲＮＡのレベルの変化は哺乳類の疾患の診断および予後において有用である。一つの態様において、ｍＲＮＡを癌または前癌を有することが疑われる患者の組織から誘導し、健常な対照被験者由来のｍＲＮＡと比較する。対照と比較して、患者中の癌ペプチドをコードする代替オープンリーディングフレームｍＲＮＡの定量的および／または定性的増加は患者中の癌または前癌の指標である。ｍＲＮＡはｍＲＮＡにハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプローブを使用して検出できる。一つの態様において、プローブはＴＲＰ−１のＯＲＦ３の転写産物とハイブリダイズできる。本発明の別の側面は、癌を有する哺乳類から単離された生物試料中のＴＲＰ− ２腫瘍抗原を転写するＲＮＡの検出および定量のための核酸プローブである。対照ＲＮＡ試料に対するＲＮＡのレベルの変化は咄乳類の疾患の診断および予後において有用である。一つの態様において、ＴＲＰ−２ｍＲＮＡを癌または前癌を有することが疑われる患者の組織から誘導し、健常な対照被験者由来のＴＲＰ−２ｍＲＮＡと比較する。対照と比較して、患者中のＴＲＰ−２ｍＲＮＡの定量的および／または定性的増加は患者中の癌または前癌の指標である。ｍＲＮＡはオリゴヌクレオチドプローブを使用して検出できる。癌ペプチドまたはその一部をコードする配列に基づくオリゴヌクレオチド対の組み合わせをＰＣＲプライマーとして使用して、選択されたＲＮＡ配列を増幅するための逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法を使用して生物試料中のｍＲＮＡを検出することができる。本発明はまた癌ペプチドまたはその一部をコードするＤＮＡおよびＲＮＡの検出のためのｉｎｓｉｔｕＰＣＲおよびｉｎｓｉｔｕＲＴ−ＰＣＲをも包含する。その技術は、標的核酸のコピー数が非常に低い場合、または異なる型の核酸を区別しなければならない場合に好ましい。その方法は正常細胞由来の前癌および癌を検出および識別する際に特に有用である。本発明は、遺伝子由来の核酸欠失フラグメントの生成を含む抗原特異的Ｔ細胞と反応性を有する抗原性癌エピトープを同定する方法を含む。欠失フラグメントを好適なベクター中に置き、これを次いで核酸産物の発現のために宿主細胞中にトランスフェクトまたは形質導入する。場合により、宿主細胞は免疫刺激分子をも発現する場合もある。癌抗原特異的Ｔ細胞応答は欠失産物を発現する宿主細胞の存在下で測定される。宿主細胞が欠失産物のみを発現する場合、免疫刺激分子を、Ｂ細胞、マクロファージ、樹枝状細胞などの抗原提示細胞によってあるいは刺激分子でトランスフェクションした細胞によって供給することができる。一つの態様において、免疫刺激分子はＭＨＣクラスＩ分子である。このアプローチを使用するマッピングによって、癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープをコードする代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列を決定する。癌抗原および抗原性癌エピトープを同定する代替法は、合成ペプチドを作製し、その合成ペプチドで抗原提示細胞をパルスし、そしてペプチドでパルスした抗原提示細胞を抗原特異的Ｔ細胞と一緒に添加し、そしてペプチドでパルスした抗原提示細胞の存在下でＴ細胞の抗原特異的応答を測定することによる。抗原特異的Ｔ細胞応答を生じる合成ペプチドは本発明の抗原性癌エピトープを含む。本発明はまた、癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープをコードする代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列を含むベクターを包含する。場合により、ベクターは少なくとも１つの免疫剌激分子をコードするＤＮＡ配列をも含むことができる。一つの態様において、ベクターはＴＲＰ−１遺伝子のＯＲＦ−３を含む。本発明はまた、本発明の腫瘍抗原をコードするＴＲＰ−２遺伝子およびそのフラグメントを含むベクターを包含する。場合により、ベクターは少なくとも１つの同時免疫刺激分子をコードするＤＮＡ配列をも含むことができる。真核発現ベクターには、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、鶏痘ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヒトパピローマウイルスベクター、馬脳炎ベクター、インフルエンザウイルスベクターなどが含まれるがこれらに限定されない。本発明は、同一の遺伝子からの正常のタンパク質またはペプチドをコードするために使用されるオープンリーディングフレーム核酸配列以外の遺伝子の代替オープンリーディングフレーム核酸配列によってコードされる癌ペプチドまたはその一部を発現する新規な組み換えウイルスを包含する。別の態様において、本発明は、ＴＲＰ−２遺伝子またはそのフラグメントまたは変異体の核酸配列によってコードされるＴＲＰ−２腫瘍抗原を発現する新規な組み換えウイルスを包含する。組み換えウイルスは少なくとも１つの免疫刺激分子を発現してもよい。組み換えウイルスは、哺乳類、特にヒトの癌を防止または治療する目的のために、哺乳類において細胞仲介免疫応答を引き出すかアップ調節することができる。組み換えウイルスは、単独または免疫刺激分予をコードする１以上の遺伝子と一緒に、癌ペプチド、その一部、または抗原性癌エピトープをコードする核酸配列をそのゲノムまたはその一部中に取り込んでいる。一つの態様において、組み換えウイルスは、ＴＲＰ−１癌ペプチドまたはその一部をコードする核酸配列をそのゲノム中に取り込んでいる。別の態様において、組み換えウイルスは、単独または同時免疫刺激分子をコードする１以上の遺伝子と一緒に、ＴＲＰ−２腫瘍抗原またはその変異体をコードする核酸配列をそのゲノムまたはその一部中に取り込んでいる。組み換えウイルスで感染した宿主細胞は、癌ペプチド、その一部、または抗原性癌エピトープを単独または少なくとも１つの免疫刺激分子と一緒に発現する。組み換えワクシニアウイルスベクターからの外来遺伝子産物を構築および発現させる方法は、Perkus他Science 229:981-984，1985、Kaufman他Int.J.Cancer 4 8:900-907，1991、Moss Science 252:1662，1991、SmithおよびMoss BioTechniq ues Nov/Dec，p.306-312,1984、および米国特許４，７３８，８４６号に開示されている。SutterおよびMoss(Proc.Natl.Acad.Scl.U.S.A.89:10847-10851，1992 )およびSutter他（Virology 1994）は、本発明でウイルスベクターとして使用できる非複製性組み換えアンカラウイルス（ＭＶＡ、改変したワクシニアアンカラ）のベクターとしての構築および使用を開示している。BaxbyおよびPaoletti（V accine 10:8-9，1992）は、本発明でウイルスベクターとして使用するための、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルスおよび他の鳥類種を含む非複製性プロキシウイルス（proxvirus）のベクターとしての構築および使用を開示する。本発明のベクターは、癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープの発現のために好適な宿主細胞中に置くことができる。真核宿主細胞株には、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、昆虫細胞、樹枝状細胞などの抗原提示細胞などが含まれるがこれらに限定されない。場合により、宿主細胞は刺激分子を発現することもできる。宿主細胞が癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープを少なくとも１つのＭＨＣ分子と一緒に両方発現する場合、真核発現系を使用して適当なグリコシル化を行うことが好ましい。宿主細胞による癌抗原および免疫刺激分子の両方の発現により、特異的Ｔ細胞に対して必要なＭＨＣ制限ペプチドとＴ細胞に対する好適なシグナルが供給され、抗原認識と増殖が助けられ、または抗原特異的Ｔ細胞のクローン性膨張が助けられる。全体的な結果は免疫系のアップ調節である。免疫応答のアップ調節は、癌または前癌の増殖を殺傷または阻害することができる癌抗原特異的細胞毒性リンパ球の増加によって明白である。ＤＮＡは、当分野で既知の方法によってトランスフェクション、形質導入、リポソームなどによって宿主細胞中に挿入される（Sambrook他、1989、「Molecular Cloning A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor press，Plainview，New York）。リポソームのためには、例えば、ポリカチオン性脂質である、中性リン脂質ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）と複合化したジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）などのカチオン性脂質が好ましく、Nabel，E.G．他,1992，Hum.Gen e.Ther．3:367-275;Nabel，G.J.他，1992,Hum.Gene Ther.3:649-656;Stewart,M. J．他，1992 Hum.Gene Ther.3:399-410;Nabel，G.J．他1993 Proc.Natl.Acad.Sc i．USA 90:11307-11311;およびHarrison，G.S.他1995 BioTechniques 19:816-82 3に開示されている通りである。宿主細胞によって発現された組み換え癌タンパク質、腫瘍抗原または抗原性癌エピトープは、当分野で既知の標準的タンパク質精製法によって細胞ライセートまたは細胞上清から精製することができる。これらには、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点フォーカシング、ゲル電気泳動、アフィニティ−クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣなどが含まれるがこれらに限定されない（Ausubel他、1987，Current Protocols in Molecular Biology，John WileyおよびSons，New York，NY）。免疫アフィニティ−クロマトグラフィーを、免疫アフィニティ−試薬として、本明細書に記載した抗癌タンパク質抗体またはその抗原結合フラグメントを使用して精製のために使用することもできる。組み換えウイルスは治療剤またはワクチンとしても使用できる。そのような使用では、被験者に約１０⁵から約１０¹⁰プラーク形成単位／哺乳類ｍｇの範囲内の組み換えウイルスの投与量を供給することが望ましいが、より低いまたはより高い投与量を投与することもできる。組み換えウイルスベクターは、メラノーマなどの癌の証拠の前に、またはメラノーマなどの癌に罹患した哺乳類の疾患の退行を仲介するために、哺乳類に導入することができる。ウイルスベクターを哺乳類に投与するための方法の例としては、ｅｘｖｉｖｏで組み換えウイルスに細胞を露出すること、あるいは罹患した組織中の組み換えウイルスの注入または静脈内、皮下、皮膚内、筋肉内などのウイルス投与が挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、組み換えウイルスベクターまたは組み換えウイルスベクターの組み合わせを好適な薬学的に許容可能な担体中で癌性損傷への直接注入または局所投与によって局所的に投与することができる。問題の核酸配列を有する組み換えウイルスベクターの量はウイルス粒子の力価に基づく。免疫化の好ましい範囲は、哺乳類１頭、好ましくはヒト１人当たり約１０⁵から１０¹⁰ウイルス粒子である。腫瘍拒絶に関与する本発明の癌抗原エピトープは本明細書に具体的に開示されたものに限定されない。本発明で開示した方法を使用して、代替オープンリーディングフレーム産物に含まれる他の癌抗原エピトープを他の腫瘍関連抗原から同定することができ（Van der Bruggen，P．他1991 Science 254:1643-47; Gaugle r，B他1994 J.Exp.Med．179:921-30;Boel，P．他19951 Immunity．2:167-75;Bri chard，V 他1993，J.Exp.Med．178:489-95; Robbins，P.F．他、1994、Cancer R esearch 54; 3124-26;Kawakami，Y.他1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．91:351 5-19;Coulie，P.G.他1994 J.Exp.Med．180:35-42;Bakker，A.他1994，J．Exp.Me d.179:1005-09）、例えばＭＡＲＴ−１／ＭeｌａｎＡ（Kawakami，他J．Exp.Med .180:347-352，1994）、ＭＡＧＥ−３（Gaugler他、J．Exp.Med.179:921-930，1 994）、ｇｐ１００（Kawakami，他Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A．91:6458-6462， 1994）、チロシナーゼ（Brichard他J．Exp.Med.178:489，1993）、ＴＲＰ−２、ＣＥＡ、ＣＡ−１９−Ａ、Ａ−１２５、ＰＳＡ、ｅｒｂ−２（Boon他、Ann.Rev. Immunol．12:337，1994）などから同定することができる。腫瘍保有患者由来の腫瘍浸透リンパ球（ＴＩＬｓ）は主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子によって提示される腫瘍関連抗原を認識する。インターロイキン−２（ＩＬ−２）と一緒にＴＩＬ５８６を転移性メラノーマを有する自己由来患者に注入すると、主要の客観的退行が生じた。ＴＩＬ５８６によって認識された腫瘍抗原をコードする遺伝子は最近単離され、ｇｐ７５をコードすることが示された。本発明は、正常のｇｐ７５タンパク質に由来しない、ＴＩＬ５８６によって認識された、抗原ペプチド、ＭＳＬＱＲＱＦＬＲ（配列番号９）の同定と単離である。代わりに、この９量体ペプチドが同一遺伝子の代替オープンリーディングフレームの翻訳から生じた。即ち、ｇｐ７５遺伝子は２種の完全に異なるポリペプチド、即ち、癌を有する患者からの血清中のＩｇＧ抗体によって認識される抗原としてのｇｐ７５と、Ｔ細胞によって認識される腫瘍拒絶抗原としての２４アミノ酸産物とをコードする。これは、ヒト腫瘍拒絶抗原が正常のタンパク質をコードするために使用されるもの以外のオープンリーディングフレームを使用して正常の細胞遺伝子から生成できることの最初の実証を意味する。これらの知見は、癌に対する腫瘍特異的細胞仲介免疫を誘導するためのワクチンとして有用である、腫瘍抗原を生成するための新規な機構を明らかにした。ＥｘｏＩＩＩ／Ｓ１欠失分析の方法は癌エピトープをｇｐ７５遺伝子の小さいＤＮＡフラグメントに位置付けた。癌エピトープは正常のｇｐ７５タンパク質に不在であった。ＴＩＬ５８６によって認識された本発明の癌ペプチドは、正常のｇｐ７５タンパク質をコードする同一の遺伝子の代替オープンリーディングフレームから翻訳された遺伝子産物から誘導された。ヌクレオチド２９４−２９６のＡＴＧをＡＴＣで置換するとＴＩＬ５８６からのサイトカイン放出を刺激する能力の完全な損失が生じた。コールド標的阻害実験は、同定された癌エピトープが腫瘍細胞上に存在する天然でプロセスされたペプチドによってＴ細胞認識を競合できることを示した。ＴＩＬ５８６細胞株から作製した６個のＴ細胞クローンは、５８６ｍｅｌ腫瘍細胞、このペプチドでパルスした５８６ＥＢＶＢ細胞、および正常メラノサイトをＨＬＡ−Ａ３１制限様式で認識することができ、また代替オープンリーディングフレームによってコードされた遺伝子産物が腫瘍細胞並びに正常メラノサイト中に存在するかもしれないことも示唆される。本発明はまた、ＴＩＬ５８６によって認識される腫瘍抗原をコードしＴＲＰ− ２をコードすることを示した遺伝子に関する。本発明はまた、ＴＲＰ−２に由来し、癌ワクチンとして活性である抗原性ペプチドＬＬＧＰＧＲＰＹＲの同定および単離に関する。本発明は、癌ペプチドまたはその一部をコードする代替オープンリーディングフレームＤＮＡ配列の１以上のコピーをそのゲノム中に取り込んでいるトランスジェニック動物を提供する。本発明はまた、ＴＲＰ−２腫瘍抗原またはその一部をコードするＤＮＡ配列の１以上のコピーをそのゲノム中に取り込んでいるトランスジェニック動物を提供する。トランスジェニック動物の一般的な作製方法は、Krimpenf ort他、米国特許5,175,384、Leder他、米国特許5,175,383、Wagner他、米国特許 5,175,385、Evans他、米国特許4,870,009およびBerns米国特許5,174,986に記載されている。遺伝子の取り込みは、癌ペプチドの多重形態または変異体の過剰発現、変化した発現または発現を生じる。得られたトランスジェニック動物は本発明の癌または腫瘍抗原の発達の研究で有用である。動物モデルは癌治療のためのワクチンおよび化学療法剤のスクリーニングで有用である。トランスジェニック動物はまた癌の発達の研究でも有用である。本発明はさらに、本発明の癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープの免疫化によって引き出された抗体またはその抗原結合部分を含む。癌ペプチドまたは抗原性癌工ピトープが数個のアミノ酸のみから成る場合、癌ペプチドまたは抗原性癌エピトープは、抗体反応を引き出すために担体タンパク質と結合させることができる。ＫＬＨまたは破傷風毒素などの担体タンパク質および結合の方法は当分野で公知である。抗体は本発明の癌ペプチドおよび抗原性癌エピトープに対する特異性を有し、それと反応または結合する。例示的な抗体分子は、完全な免疫グロブリン分子、実質的に完全な免疫グロブリン分子または抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子のこれらの一部分であり、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）₂ 、ヒト化キメラ抗体、およびＦ（ｖ）として当分野で公知の免疫グロブリン分子の一部が含まれる。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は当分野で既知の方法によって作製できる（Kohl erおよびMilstein（1975）Nature 256，495-497; Campbell 「Monoclonal Anti body Technology，the Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas」 in Burdon他(eds.)(1985)、「Laboratory Techniques in Bioch emistry and Molecular Biology」第１３巻、Elsevier Science Publishers，アムステルダム）。抗体または抗原結合フラグメントは遺伝子工学によって作製することもできる。重鎖および軽鎖の両方の発現のための技術はＰＣＴ特許出願、公開番号ＷＯ９０１４４３、ＷＯ９０１４４２４、Huse他(1989)Science 246:12 75-1281、及び米国特許４，９４６，７７８の主題である。一つの態様において、本発明の抗体を免疫分析で使用して、生物試料中のＴＲＰ−１ペプチドおよびＴＲＰ−２腫瘍抗原またはその一部を含む癌ペプチドを検出する。抗体またはその抗原結合フラグメントを使用して癌に罹患した哺乳類からの組織バイオプシー試料中の癌ペプチドを検出できる。疾患組織中の癌抗原の評価を使用して哺乳類における疾患の進行を予測したり、治療の効果を診断できる場合がある。免疫分析は放射免疫分析、ウエスタンブロット分析、免疫蛍光分析、酵素免疫分析、ケミルミネッセント分析、免疫組織化学分析などが可能であり、インビトロ、インビボまたはｉｎｓｉｔｕで行うことができる。ＥＬＩＳＡに関する当分野で公知の標準技術は、「Methods in Immunodiagnosis」第２版、 RoseおよびBigazzi eds．John Wiley & Sons，1980;Campbell他「Methods and I mmunology」、W.A．Benjamin,社、1964;およびOellerich，M.1984，J.Clin.Chem .Clin.Biochem.22:895-904に記載されている。免疫組織化学のための慣用法はHa rlowおよびLane(eds)(1988)、「Antibodies A Laboratory Manual」Cold Spri ng Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York;Ausbel他（eds）1987「Curre nt Protocols in Molecular Biology」、John WileyおよびSons（New York，NY ）に記載されている。そのような検出分析のために適当な生物試料は、細胞、組織バイオプシー、全血、血漿、血清、たん、脳髄液、胸膜液、尿などが含まれるがこれらに限定されない。本発明の抗体および抗原結合フラグメントは免疫治療でも使用できる。抗体またはその抗原結合フラグメントは、癌の症状の度合い、範囲または持続期間を防止、減少または減衰させるのに十分な量で哺乳類に提供される。引用された全ての文献および特許は引用により本明細書中に取り込まれる。本発明を一定の特定の態様に関して上記で説明してきたが、多くの変形が可能であること、並びに代替の物質および試薬を本発明から離れることなく使用できることが理解される。ある場合には、そのような変形および置き換えは若干の実験を必要とするかもしれないが、通常の試験を含むだけである。特定の態様の上記の記載は本発明の一般的性質を十分に明らかにし、他者は、現在の知識を適用することによって、一般的概念から離れることなくそのような特定の態様を各種の応用のために容易に改良および／または採択でき、従ってそのような採択および改良は開示した態様の意味および均等の範囲の中に含まれることが意図される。実施例１材料と方法化学薬品と試薬下記化学薬品と試薬は表示供給源から購入した：ＲＰＭＩ１６４０，ＡＩＭ −V培地，Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ，Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）；真核細胞発現ベクターｐＣＲ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）；抗−ＨＬＡ−Ａ３１モノクローナル抗体（Ｏｎｅｌａｍｄａ，ＣａｎｏｇａＰａｒｋ，ＣＡ）；フルオレセインイソチオシアネートとコンジュゲートした抗−免疫グロブリンＭ抗体（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒlｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と細胞系統ＴＩＬ５８６を、転移性メラノーマを有する患者の腫瘍標本から単離し、ＩＬ −２（６００ＯＩＵ／ｍｌ）（Ｃｈｉｒｏｎ）を含有する培地中で３２〜６０日間、既述されたように増殖させた（Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．，Ｄ．Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｆ．Ｐ．Ａｖｉｓ，Ａ．Ｅ．Ｃｈａｎｇ，Ｄ．Ｌ．Ｆｒｅｅｋｓｅｎ，Ｗ．Ｍ．Ｌｉｎｅｈａｎ，Ｍ．Ｔ．ｌｏｔｚｅ，Ｃ．Ｎ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｃ．Ａ．Ｓｅｉｐｐ，Ｐ．Ｓｉｍｏｎ，Ｃ．Ｇ．Ｓｉｍｐｓｏｎ及びＳ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，１９８８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．６：８３９〜５３）。ＴＩＬ５８６は主としてＣＤ８⁺Ｔ細胞であった。ＴＩＬ１２００はＴＩＬ５８６に関して述べた条件と同じ条件下で増殖させた。Ｔ細胞クローンはＴＩＬ５８６細胞系統から限界希釈法によって得て、次に、６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含有するＡＩＭ−Ｖ培地中で膨張させた(expanded)。メラノーマ細胞系統３９７ｍｅｌ，３９７ｍｅｌ／Ａ３１，５８６ｍｅｌ，６２４ｍｅｌ及びＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系統５８６ＥＢＶと１５１０ＥＢＶをこの実験室で確立して、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。幼児包皮(infant foreskin)に由来する正常培養メラノサイト（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，ＣＡから購入したＮＨＥＭ６８０）はメラノサイト増殖培地（ＭＧＭ；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，ＣＡ）中で培養した。ＣＯＳ７細胞系統はＷ．Ｌｅｏｎａｒｄ博士（ＮＩＨ）から提供された。ＧＭ−ＣＳＦ分泌アッセイＤＮＡトランスフェクションとＧＭ−ＣＳＦ分析は既述されたようにおこなった（Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｆ．，Ｐ．Ｆ．Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｙ．Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｘ．Ｑ．Ｋａｎｇ及びＳ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，１９９５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：７９９〜８０４）。簡単には、異なるフラグメントを含有するＤＮＡ２００μｇとＨＬＡ−Ａ３１ＤＮＡ５０ｎｇとを１００μｌのＤＭＥＭ中の２００μｌのリポフェクタミンと１５〜４５分間混合した。ＤＮＡ／リポフェクタミン混合物を次にＣＯＳ−７（５ｘ１０⁴）細胞に加えて、一晩インキュベートした。翌日、細胞をＤＭＥＭ培地によって２回洗浄した。ＴＩＬ５８６を１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含有するＡＩＭ−Ｖ培地中に１ｘ１０⁵細胞／穴の濃度で加えた。１８〜２４時間のインキュベーション後に、１００μｌの上澄み液を回収し、ＧＭ−ＣＳＦを標準ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＋ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で測定した。ペプチドに関しては、５８６ＥＢＶ、１５１０ＥＢＶ及びＴ２細胞を３７℃においてペプチドと共に９０分間インキュベートしてから、１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含有するＡＩＭ−Ｖ培地によって３回洗浄した。ＴＩＬ５８６を加え、さらに１８〜２４時間インキュベートし、１００μｌの上澄み液をＧＭ−ＣＳＦアッセイのために回収した。ＥｘｏＩＩＩ／ＳＩ欠失構築とＰＣＲフラグメント一連の欠失を作製するために、ｐｏＤＮＡ７７６プラスミドＤＮＡをＸｂａＩによって消化させ、α−ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド三リン酸によって充填し、ＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼ消化をブロックした。ｐｃＤＮＡ７７６プラスミドは２．４ｋｂＤＮＡフラグメントと、転写を導くためのＣＭＶプロモーターとを含有するｐｃＤＮＡ３ベクターの誘導体である。直鎖状(linea rized)ＤＮＡを第２の制限酵素Ｘｈｏｌ消化にさらして、ＥｘｏＩＩＩに感受性の１末端を形成した。ＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼ／ＭｕｎｇＢｅａｎヌクレアーゼ欠失は製造者の指示（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）に従っておこなった。詳細なプロトコールは次の通りである：１．１０μｇのＤＮＡをＸｂａＩによって消化させて、αホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチドによって充填した。２．ＤＮＡを第２酵素ＸｈｏＩによって消化させた後に、フェノール抽出及びエタノール沈降をおこなった。３．ＤＮＡペレットを乾燥させ、１２５μｌの２ＸＥｘｏ緩衝剤、２５μｌの１００ｍＭ β−メルカプトエタノール、１００μｌの水中に懸濁させた。４．全てのアリコートが取り出されて、ドライアイス上に置かれた時点で、チューブを６８℃で１５分間加熱してから、氷上に置いた。５．１５ＵのＭｕｎｇＢｅａｎヌクレアーゼを各時点のチューブに（１ＸＭｕｎｇＢｅａｎ希釈緩衝剤によって予め希釈して）加えて、３０℃において３０分間インキュベートした。６．下記を加えた：４μｌの２０％ＳＤＳ１０μｌの１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．５２０μｌの８ＭＬｉＣｌ２５０μｌの緩衝剤平衡化フェノール：クロロホルム７．サンプルをボルテックスし、マイクロフュージ中で１分間回転させ、上部水層を取り出して、クロロホルムで抽出して、ＭｕｎｇＢｅａｎタンパク質をＤＮＡから抽出した。８．２５μｌの３ＭＮａＯＡｃ（ｐＨ７．０）を水相に加えた。１０ｎｇ／ μｌの最終濃度までのｔＲＮＡを沈降のためのキャリヤーとして用いた。９．６５０μｌの冷エタノールを加えた。サンプルをドライアイス上で１０分間急冷して、マイクロフュージ中で２０分間回転させた。１０．上澄み液を排出して、ペレットを８０％エタノールによって洗浄した。１１．ペレットを乾燥させた。１２．ＤＮＡペレットを１５μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭＥＤＴＡ中に再溶解した。Ｂ．ライゲーション１３．ＤＮＡ欠失を下記条件を用いてライゲートした。１．０μｌのＥｘｏ／Ｍｕｎｇ処理ＤＮＡ２．０μｌの１０Ｘライゲーション緩衝剤５００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ７．５７０ｍＭＭｇＣｌ₂ １０ｍＭＤＴＴ２．０μｌの５ｍＭＡＴＰ，ｐＨ７．０〜７．５２．０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｃａｔ＃６０００１１；キットとして提供）１３．０μｌのＨ₂Ｏ２０．０μｌの総反応容量室温においてインキュベートインサートをベクターにライゲートするためのＤＮＡライゲーションキット（Ｃａｔ＃２０３００３）をＳｔｒａｔａｇｅｎｅが提供。１４．残留する１４．０μｌのＥｘｏ／Ｍｕｎｇ処理ＤＮＡのうちの７μｌをゲル電気泳動分析に用いた。１５．１μｌのライゲーション反応を用いて、１０μｌのＥｐｉｃｕｒｉａｎｃｏｌｉＲｅｃＡ−ＪＭ１０９又はＸＬＩ−Ｂｌｕｅ細胞を形質転換させ、ＬＢ／ＡＭＰプレート上にプレートした。Ｃ．低融点アガロース方法欠失体のスクリーニングを最少にするために、欠失の一部を低融点アガロース中で泳動し、問題のバンドを切り取り、ライゲーションを続けた。ライゲーション反応において、アガロース濃度は０．５％未満に維持した。ＰＣＲ反応を９４℃において２分間おこなった後に、９４℃で１分間、５５℃ で４５秒間そして７２℃で１分間の２５サイクルを続けた。プライマーｇｐＮ（５’ＡＧＡＡＴＧＡＧＴＧＣＴＣＣＴＡＡＡＣＴＣＣＴＣＴＣＴＣＴＧＧＧ）（配列番号：４２）とｇｐ１１Ｂ（５’ＣＡＴＧＴＧＡＧＡＡＡＡＧＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡ）（配列番号：４３）とを用いて、ＤＮＡフラグメント（１〜６６７）を生成し、次にｐＣＲ３発現ベクター中にクローン化して、ｐＰＣＲ１１０を作製した。プラスミドｐＰＣＲ２１０とｐＰＣＲ２２０とは、それぞれ、プライマーｇｐ−１（５’ＴＧＧＡＴＡＴＧＧＣＡＡＡＧＣＧＣＡＣＡＡＣＴＣ）（配列番号：４４）とｇｐ１１Ｂ，ｇｐ−１及びｇｐ２２（５’ＴＡＡＡＴＧＧＡＡＡＴＧＴＴＣＴＣＡＡＡＴＴＧＴＧＧＣＧＴＧ）（配列番号：４５）とを用いて増幅させたＤＮＡ挿入フラグメントを含有するｐＣＲ３ベクターであった。細胞傷害性溶菌アッセイ溶菌アッセイを既述されたようにおこなった（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ等，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：６４５８〜６２）。簡単には、ターゲット細胞をクロムによって９０分間標識した。３回洗浄した後に、細胞を１μｇ／ｍｌの濃度のペプチドと共に９０分間インキュベートした。細胞を再び洗浄し、カウントし、次にＴＩＬ５８６とエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）の指定比率で混合した。４時間のインキュベーション後に、クロム放出を測定した。ペプチドはペプチドシンセサイザー（ＭｏｄｅｌＡＭＳ４２２，ＧｉｌｓｏｎＣｏ．社，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，ＯＨ）を用いて固相法によって合成した。一部のペプチドはＨＰＬＣによって精製され、９８％を越える純度を有した。ＴＩＬ５８６によって認識されるＯＲＦ３Ｐペプチドの滴定のために、５８６ＥＢＶＢ細胞を種々な濃度の精製ＯＲＦ３Ｐペプチドと共にインキュベートした。特異的溶菌(specific lysis)の％を式：（Ａ−Ｂ）／（Ｃ −Ｂ）ｘ１００［式中、Ａはペプチドの存在下でのＴＩＬ５８６による５８６ＥＢＶＢ細胞の溶菌であり、Ｂは同じペプチドの存在下、但し、エフェクター細胞の不存在下での５８６ＥＢＶＢ細胞からの自然放出(spontaneous release) であり、Ｃは最大クロム放出である］から算出した。細胞溶解のコールドターゲット阻害は“ホット”ターゲットとして⁵¹Ｃｒ標識５８６ｍｅｌ又は６２４ｍｅｌを、“コールド”ターゲットとして、ペプチドをパルスされた(pulsed)５８６ＥＢＶＢ及びＴ２細胞を用いておこなった。部位特異的突然変異誘発部位特異的突然変異を構築するために、変異したプライマーＧＰＭＵＴＩ、（５’ＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＴＣＧＧＧＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＣＴＴＧＣＧＣＴＴＣＴＴＣＡＡＴＡＧＧＡＣＡＴＣＴＣＡＣＴＧＣＡＡＣ）（配列番号：１１）とＧＰＡ１とを用いて、ヌクレオチド２９６に変異（ＧからＣへ）を含有するＰＣＲフラグメントを生成した。野生型ＤＮＡフラグメントをプライマーＧＰＦ１（５’ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＴＣＧＧＧＡＧＧＴＣＴＧ）（配列番号：１２）、ＧＰＥ１（５’ＧＡＡＴＴＣＧＴＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＧＡＡＡＴＴＧＣＣＧＴＴＧ）（配列番号：１３）、ＧＰＥ２（５’ＧＡＡＴＴＣＧＡＣＴＡＴＧＡＧＡＡＣＣＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＡＧＧＣ）（配列番号：１４）及びＧＰＡ１（５’ＡＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＧＧＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＴＣＴＴＴＴＣ）（配列番号：１５）を図３Ａにおける矢印頭によって指示されるように用いることによって増幅させた。精製ＰＣＲ生成物を次にｐＣＲ３発現ベクター中にクローン化した。ＰＣＲフラグメントを含有する全てのプラスミドを配列決定して、方向とヌクレオチド配列とを確認した。実施例２ＴＩＬ５８６によって認識される抗原ペプチドの局在化ｇｐ７５から抗原性エピトープを同定するために、ＥｘｏＩＩＩ／Ｓ１ヌクレアーゼを用いて３’末端からｇｐ７５遺伝子の一連のネストされた欠失(nested deletions)を生成し、さらに、ＰＣＲ増幅によってｇｐ７５から付加的なＤＮＡフラグメントを生成した（図１Ａ）。欠失研究のための出発物質としてｐｃＤＮＡ７７６を選択した理由は、このクローンが最初にライブラリースクリーニングによって同定され、ＴＩＬ５８６からのサイトカイン放出を刺激する能力を与えたからである。プラスミドｐｃＤＮＡ７７６はＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）にＢｕｄａｐｅｓｔＴｒｅａｔｙに従って１９９６年１月１９日に寄託され、受託番号ＡＴＣＣ９７４２３を与えられた。この研究の目的はＴＩＬ５８６によって認識されるエピトープを同定することであるので、比較的小さいＤＮＡフラグメント中のエピトープを迅速に局在化することができるように、できるかぎり短いフラグメント（全長ｃＤＮＡの代わりの、切頭型のｇｐ７５）が用いられた。次に、これらの欠失構築体をＨＬＡ−Ａ３１遺伝子を含有するｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドと共にＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクトした(transfected)（Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｆ．等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：７９９〜８０４）。２４時間後に、トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞を検査して、どの構築体がＴＩＬ５８６によるサイトカイン放出を刺激することができるのかを判定した。正常ｇｐ７５開始コドンを欠いた、ヌクレオチド２４７から７７１までの範囲の小さい切頭ＤＮＡフラグメントはＴＩＬ５８６によるＧＭ−ＣＳＦ放出を刺激する能力を有し、このことはＴＩＬ５８６によって認識されるエピトープが２４７から７７１までのヌクレオチドを含有するＤＮＡフラグメント中に位置付けされることを示唆する。ヌクレオチド４４５〜４４７に位置付けされたＫｏｚａｋ配列（ＧＡＴＡＴＧＧ）（配列番号：１６）に比較的良好に関係して、ｇｐ７５オープンリーディングフレームと同じフレーム内にＡＴＧ開始コドンが存在するので、ＴＩＬ５８６によって認識されるエピトープがヌクレオチド４４５から７７１までの範囲内に位置付けされると推理された。それ故、ｐＰＣＲ２１０とｐＰＣＲ２２０とを構築したが、これらはｐＣＲ３発現ベクターの誘導体であり、切頭正常ｇｐ７５タンパク質の翻訳のための開始コドンとして４４５ｂｐに位置付けされたｇｐ７５（ＧＡＴＡＴＧＧ）（配列番号：１６）を有するフレーム中に内部ＡＴＧコドンを含有した。しかし、ｐＰＣＲ２１０又はｐＰＣＲ２２０のいずれも、ＨＬＡ−Ａ３１遺伝子とのＣＯＳ−７の同時トランスフェクション後に（図１Ｂ）ＴＩＬ５８６からのサイトカイン分泌を刺激する能力を与えず、このことはこのエピトープがこれらのフラグメントの上流に局在することを示唆した。それ故、さらに別のプラスミドｐＤ７７６Ａを構築したが、これは２４７から４４２までのヌクレオチド配列を含有し、ｇｐ７５と同じフレーム中にＡＴＧコドンを有さなかったが、ｇｐ７５とは異なるオープンリーディングフレーム中に２個のＡＴＧコドンを含有した。このプラスミドは、Ａ３１ｃＤＮＡと共にＣＯＳ−７細胞中に同時トランスフェクトしたときにＴＩＬ５８６からのサイトカイン放出を強度に刺激した。ｇｐ７５の真正の開始コドンを含有するプラスミドｐＰＣＲ１１０は、ＨＬＡ−Ａ３１遺伝子と共に同時トランスフェクトしたときに（図１Ｂ）、ｐＤｅｌ５又はｐＤ７７６Ａよりも数倍低いサイトカイン放出を刺激した。これらの結果は、ＴＩＬ５８６によって認識されるエピトープ（単数又は複数）がヌクレオチド２４７〜４４２の領域に位置付けされることを示唆した。この領域（ヌクレオチド２４７〜４４２）は正常ｇｐ７５オープンリーディングフレーム中にＡＴＧ開始コドンを有さなかったが、例えばＡＣＧ、ＣＴＧ及びＧＴＧのような非ＡＴＧコドンからの翻訳開始が幾つかの場合に報告されている（Ｈａｎｎ，Ｓ．Ｒ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ７６：８８０〜８６；Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒ，Ｓ．等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９４，６８：１７０〜７６）。この領域のエピトープを同定するために、ＨＬＡ−Ａ３１のペプチド結合モチーフ(binding motif)（位置２における疎水性残基とＣ末端における正に荷電した残基）に基づいて合成ペプチドを作製した（図２）（Ｆａｌｋ，Ｋ等，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ１９９４，４０：２３８〜４１）。この研究のために選択されたペプチドの大部分はノナマー(nonamer)であったが、一部は１０マー及び１１マーであった。これらのペプチドを５８６ＥＢＶＢ細胞上にパルスさせて、ＴＩＬ５８６によるサイトカイン放出を刺激するこれらの細胞の能力を調べた（表１）。１つのペプチド、ＡＡＣＤＱＲＶＬＩＶＲＲ（配列番号：２５）はＴＩＬ５８６からのＧＭ−ＣＳＦ放出を非常に弱く誘導した。しかし、このペプチドはＴＩＬ５８６による溶菌に関してペプチド負荷５８６ＥＢＶＢを感作させることができなかった（表１）。表１表１．ＴＩＬ５８６に対する反応性による合成ペプチドのスクリーニング５８６ＥＢＶ細胞は１μｇ／ｍｌの濃度の個々のペプチドと共に９０分間インキュベートした。ＧＭ−ＣＳＦ放出はＴＩＬ５８６とのペプチド負荷５８６ＥＢＶ細胞の同時インキュベーション後に測定した。剌激物質なしのＴＩＬ５８６のみによるＧＭ−ＣＳＦ分泌を控除した。５８６ＥＢＶはＨＬＡ−Ａ−３１を発現するＥＢＶ形質転換済みＢ細胞系統であった。ＴＩＬ５８６による、ペプチドパルスされた５８６ＥＢＶの細胞傷害性溶菌を４時間クロム放出アッセイにおいておこなった。このペプチドは、高濃度（＞１μｇ／ｍｌ）で５８６ＥＢＶＢ細胞をインキュベートしたときにのみＴＩＬ５８６からのサイトカイン放出を弱く刺激し、１０μｇ／ｍｌのペプチド濃度においてもターゲット細胞をＴＩＬ５８６による溶菌に関して感作しなかった（データ示さず）ので、このペプチドはＴＩＬ５８６によって認識される主要なＴ細胞エピトープに相当する可能性はなかった。この主要なＴ細胞エピトープを含有する領域をさらに定義するために、それぞれ、プライマーＧＰＦ１と、ＧＰＥ１及びＧＰＥ２とによって増幅されたＰＣＲフラグメントを含有する、さらに２種類のプラスミドを構築した（図３Ａ）。図３Ｂに示すように、小さいＰＣＲフラグメントの始点にＡＴＧ開始コドンを含有する両プラスミドは、ＨＬＡ−Ａ３１に関連したＴＩＬ５８６によるサイトカイン放出を刺激する能力を与え、このことはＴ細胞によって認識されるエピトープがｇｐ７５ｃＤＮＡの塩基２４７から３２９までの８２ヌクレオチド配列内でコードされることを示唆した。ＯＲＦ１中の２８のオーバーラップペプチド(overl apping peptides)（９マー又は１０マー）をこの領域中のｇｐ７５のアミノ酸配列に基づいて合成したが、いずれもＧＭ−ＣＳＦ放出を刺激しないか、又は５８６ＥＢＶＢ細胞をＴＩＬ５８６による溶菌に関して感作しないことが判明した（データ示さず）。実施例３ｇｐ７５遺伝子の代替オープンリーディングフレームの翻訳から生じる抗原性ペプチドこの小領域においてＴＩＬ５８６によって認識されるエピトープを同定できないことは、代替オープンリーディングフレームが翻訳されうることを示唆した。比較的良好に関連した２種類のＡＴＧコドンが、ｇｐ７５オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）とは異なるオープンリーディングフレーム中のこの領域（ヌクレオチド２４７〜４４２）に存在した（図２）。最初のＡＴＧ（２５１ＧＡＧＡＴＧＡ２５７）（配列番号：２９）からの翻訳は４５アミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ２）を生じたが、ヌクレオチド２９４〜２９６間に位置付けられたＡＴＧ（ＧＡＣＡＴＧＴ）（配列番号：３０）から出発した翻訳は２４アミノ酸遺伝子産物（ＯＲＦ３）を生成した（図２）。ＯＲＦ２に由来する３ペプチドとＯＲＦ３に由来する２ペプチドを選択して、ＨＬＡ −Ａ３１結合モチーフに基づいて合成した（表２と図２）。意外にも、ＯＲＦ３に由来する１つのペプチドＭＳＬＱＲＱＦＬＲ（配列番号：９）（ＯＲＦ３Ｐと表示）は、５８６ＥＢＶＢ細胞にパルスされたときに、ＴＩＬ５８６によって強度に認識された（表２）。ＴＩＬ５８６によるＯＲＦ３ペプチド（ＭＳＬＱＲＱＦＬＲ）（配列番号：９）の認識は、このペプチドが自己由来５８６ＥＢＶＢ細胞及び１５１０ＥＢＶＢ（Ａ３１＋）細胞上にパルスされたときにのみ観察されたが、ペプチドがＴ２（非ＨＬＡ−Ａ３１）細胞上に負荷したときには観察されず、このことはＴＩＬ５８６によるこのペプチドの認識がＨＬＡ−Ａ３１制限されることを示唆した。ＯＲＦ３Ｐのペプチド質量(peptide mass)は質量分光測定分析によって確認された。図４Ｂに示すように、ＴＩＬ５８６はＯＲＦ３Ｐペプチドをパルスされた５８６ＥＢＶＢ細胞を溶菌したが、ＨＬＡ−Ａ３１のペプチド結合モチーフの基準を満たすがＴＩＬ５８６によって認識されない関連のないペプチドをパルスされた５８６ＥＢＶＢ細胞、又はＯＲＦ３ＰペプチドをパルスされたＴ２細胞を溶菌することができなかった。ペプチドによる溶菌に関する感作は１００ｎＭにおいて最大効果を示したが、１ｎＭのペプチド濃度においても溶菌活性は検出された（図４Ｃ）。ＴＩＬ５８６はペプチドＭＳＬＱＲＱＦＬＲＴ（配列番号：３３）若しくはＳＬＱＲＱＦＬＲＴ（配列番号：３４）のいずれも認識せず、ＭＳＬＱＲＱＦＬＲ（配列番号：９）に由来する修飾ペプチド（位置２、６及び９におけるアンカー残基の置換）ＭＬＬＱＲＱＦＬＲ（配列番号:３６）、ＭＲＬＱＲＱＦＬＲ（配列番号：３７）、ＭＳＬＱＲＬＦＬＲ（配列番号：３８）、ＭＳＬＱＲＱＦＬＥ（配列番号：３９）、ＭＳＬＱＲＱＦＬＫ（配列番号：４０）も認識しなかった（表２）。ＴＩＬ５８６は、ペプチドＭＳＬＱＲＱＦＬＲ（配列番号：９）に比べて位置２におけるＡｌａによるＳｅｒ置換を有するペプチドＭＡＬＱＲＱＦＬＲ（配列番号：３５）のみを認識した（表２）。表２．ＴＩＬ５８６に対する反応性による抗原性ぺプチドの同定５８６ＥＢＶＢ細胞によるペプチドインキュベーションとＧＭ−ＣＳＦ放出アッセイとの条件は、表１に述べた条件と同じであった。刺激物質なしのＴＩＬ５８６のみによるＧＭ−ＣＳＦ分泌を控除した。修飾ペプチドはＭＳＬＱＲＱＦＬＲ（配列番号：９）に対する位置２、６及び９におけるアミノ酸置換によって作製した。ＴＩＬ５８６による、ペプチドパルスされた５８６ＥＢＶの細胞傷害性溶菌を４時間クロム放出アッセイにおいておこなった。実施例３自然プロセス抗原性ペプチド生成のために翻訳が必要であるＯＲＦ３のＡＴＧ開始コドン（２９４〜２９６）の上流の６ヌクレオチド中に位置付けられた停止コドンＴＡＧ（２８８〜２９６）が存在した（図２）ので、ＯＲＦ３Ｐペプチドがフレームシフト(frameshift)から生じたとは思われなかった。ＤＮＡ配列分析も、この上流領域に欠失又は挿入が存在しないことを確認した。ヌクレオチド２９４〜２９６に位置付けられたＡＴＧが２４アミノ酸産物の翻訳に重要な役割りを果たすかどうかを調べるために、ＡＴＧＴ（２９４〜２９７）からＡＴＣＴへ変異させて（２９４〜２９７）、ＯＲＦ１（ｇｐ７５）におけるＣｙｓ（ＵＧＵ）からＳｅｒ（ＵＣＵ）への変化を生じると考えられる、ＯＲＦ３の翻訳を排除した（図３Ａ）。変異した遺伝子を含有するプラスミド（ｐＧＦＭＵＴ１）を、ＣＯＳ−７中にＨＬＡ−Ａ３１ｃＤＮＡと共に同時トランスフェクトしたときにＴＩＬ５８６による認識を生じるその能力に関して試験した。図３Ｂは、変異した遺伝子が、野生型遺伝子を含有する構築体に比べて、ＴＩＬ５８６によるＧＭ−ＣＳＦ放出を刺激する能力を完全に失ったことを実証した。この観察は、ヌクレオチド位置２９４〜２９６におけるＯＲＦ３中のＡＴＧが２４アミノ酸産物の翻訳のために必要であるので、ＴＩＬ５８６によって認識されるＴ細胞エピトープの生成のために重要であることを意味した。Ｍｅｔ（ＡＴＧ）はぺプチドエピトープの位置１に存在し、ヌクレオチド２９４〜２９６におけるＡＴＧからＡＴＣへの変異はペプチドの位置１におけるＭｅｔからＩｌｅへの変化を生じたので、ＴＩＬ５８６が変異した遺伝子を認識しないことは変異したぺプチドがＭＨＣクラスＩ分子に結合する能力を失ったことによると考えられる可能性を研究した。変異した遺伝子によってコードされる配列と同じアミノ酸配列を有する合成ぺプチド（ＩＳＬＱＲＱＦＬＲ）（配列番号：４１）を作製して、ＴＩＬ５８６による認識に関して検査した。合成変異ぺプチドが野生型ぺプチドに匹敵する濃度においてＴＩＬ５８６によってまだ認識されることが判明した。さらに、同じ変異を全長ｃＤＮＡ中に導入した場合には、ＴＩＬ５８６に対する反応性が観察されなかったが、野生型ｃＤＮＡはｐＰＣＲ１１０と同様なレベルにおいてＴＩＬ５８６からのサイトカイン放出を刺激することができた。このことは欠失データと一致し、ＴＩＬ５８６が遺伝子の他の領域におけるぺプチド（単数又は複数）を認識しなかったことを意味した。これらの結果は、Ｔ細胞が変異遺伝子（ヌクレオチド２９４〜２９６におけるＡＴＧからＡＴＣへ）を認識しないことはＯＲＦ３の翻訳開始の不活化によるものであると示唆した。実施例４腫瘍細胞並びにメラノサイト上の抗原性ぺプチドの認識腫瘍細胞上のＯＲＦ３Ｐぺプチドと同様な又は同じである自然プロセス(natur ally processed)ぺプチドをＴＩＬ５８６が認識するかどうかという問題に対処するために、ＯＲＦ３Ｐぺプチドをパルスされた５８６ＥＢＶＢ細胞がコールドターゲット阻害アッセイにおいて⁵¹Ｃｒ標識５８６ｍｅｌの溶菌を阻害する能力を検査した。⁵¹Ｃｒ標識５８６ｍｅｌの溶菌の顕著な阻害が、ＯＲＦ３Ｐペプチドをパルスされた５８６ＥＢＶＢ細胞によって観察されたが、関連のないペプチドをパルスされた５８６ＥＢＶＢ細胞又はＯＲＦ３ＰペプチドをパルスされたＴ２細胞によっては観察されず（図５Ａ）、このことは、このペプチドエピトープがＴ細胞認識に関して腫瘍細胞上の自然プロセスペプチドと競合しうることを意味した。予想されたように、ＯＲＦ３Ｐ負荷５８６ＥＢＶＢ細胞はＴＩＬ１２００によるターゲット６２４ｍｅｌの溶菌を阻害せず、ＴＩＬ１２００は、５８６ＥＢＶＢ単独に比べて、ＨＬＡ−Ａ２に関連してｇｐ１００抗原を認識する（図５Ｂ）。Ｔ細胞クローンがＯＲＦ３Ｐペプチドをパルスされた５８６ＥＢＶＢ細胞と腫瘍細胞系統の両方を認識することができるかどうかをさらに試験するために、Ｔ細胞クローンを限界希釈（９６穴丸底マイクロプレートにおいて１細胞／穴）によってＴＩＬ５８６細胞系統から生成し、培養においてさらに膨張させた。Ｔ細胞クローンは限界希釈（１細胞／穴）によってＴＩＬ５８６細胞系統から生成した。Ｔ細胞クローンを６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含有するＡＩＭ−Ｖ培地においてさらに膨張させた。培養においてさらに膨張させた。５８６ＥＢＶＢ細胞をＯＲＦ３Ｐペプチド又は関連のないペプチドによって３７℃において９０分間パルスした。３回洗浄した後に、Ｔ細胞クローン又はＴＩＬ５８６細胞を加えて、さらに１８〜２４時間同時インキュベートした。５８６ｍｅｌと、３９７ｍｅｌ／Ａ３１⁺腫瘍と、メラノサイトＮＨＥＭ６８０細胞とに関しては、１ｘ１０⁵細胞／穴を、それぞれ、Ｔ細胞クローン、ＴＩＬ５８６ −Ｃ１（図６Ａ）、ＴＩＬ５８６−Ｃ４（図６Ｂ）及びＴＩＬ５８６−Ｃ６（図６Ｃ）又はＴＩＬ５８６（図６Ｄ）に対して１ｘ１０⁵細胞で１８〜２４時間インキュベートした。ＧＭ−ＣＳＦアッセイを図１Ｂに示すようにおこなった。６種類のＴ細胞クローンは５８６ｍｅｌ腫瘍細胞と、ＯＲＦ３Ｐペプチドをパルスされた５８６ＥＢＶＢ細胞と、ＨＬＡ−Ａ３１陽性(positive)メラノサイトとを認識することができたが、３９７ｍｅｌ／Ａ３１又は５８６ＥＢＶＢ細胞単独を認識することができなかった。典型的なデータを図６Ａ〜６Ｄに示す。これらの結果は、Ｔ細胞クローンが恐らく腫瘍細胞及び正常メラノサイト上のＯＲＦ３Ｐペプチドと同様な又は同じの自然プロセスペプチドを認識することを示唆した。チロシナーゼ、ｇｐ１００及びＴＲＰ−２に対するｇｐ７５の４０〜４５％アミノ酸配列同一性が存在するので、Ｔ細胞クローンによって認識されるペプチドがｇｐ７５に由来するのではなく、これらの他のタンパク質のいずれかに由来する可能性を試験した。ＣＯＳ−７細胞をＨＬＡ−Ａ３１に加えたチロシナーゼ、ｇｐ１００又はＴＲＰ−２ｃＤＮＡｓによって、それぞれトランスフェクトして、いずれも６種類のＴクローンによって認識されることができないが、ＨＬＡ− Ａ３１とｇｐ７５ｃＤＮＡとによってトランスフェクトされたＣＯＳ−７は、これらのクローンからのＧＭ−ＣＳＦ放出を刺激することを発見した（データ示さず）。コンピューターのデータベースサーチも、データベース中のチロシナーゼ、ｇｐ１００及びＴＲＰ−２を含めた既知タンパク質がＨＬＡ−Ａ３１のペプチド結合モチーフを有するアミノ酸配列と、ＴＩＬ５８６によって認識されるペプチドエピトープとの顕著な類似性とを含有しないことを示した。実施例５Ｉｎｖｉｖｏ保護アッセイｉｎｖｉｖｏ保護試験のために、ＭＨＬ−Ａ３１⁺トランスジェニックマウスを、１０⁴Ｔｒｐ−１⁺Ｂ１６マウスメラノーマ細胞による皮下チャレンジ又は５ｘ１０⁵Ｔｒｐ−２⁺Ｂ１６マウスメラノーマ細胞による静脈内チャレンジの前に、０日目と１４日目に０、１Ｐｇ、１ｎｇ、１μｇ、１ｍｇ又は１００ｍｇの癌ペプチド（配列番号：９）によって静脈内で免疫感作させる。腫瘍細胞を皮下に受容したマウスを腫瘍発生に関して週２回観察して、サイズを測定する。腫瘍細胞を静脈内に受容したマウスを１２日目に安楽死させ、肺転移の数をＨｏｕｇｈｔｏｎ，Ａ．Ｎ．１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：１〜４０によって述べられているように測定する。実施例６Ｉｎｖｉｖｏ処置アッセイｉｎｖｉｖｏ処置に関しては、肺転移を確立するために、ＭＨＬ−Ａ３１⁺ トランスジェニックマウスを、１ｘ１０⁵又は５ｘ１０⁵Ｔｒｐ−１⁺Ｂ１６マウスメラノーマ細胞によって静脈内チャレンジする。続いて、マウスに１０⁵ＰＦＵ／ｍｇ体重で癌ペプチド（配列番号：９）を発現する組換えウイルスを予防接種する。マウスを１２日目に安楽死させ、予防接種したマウス対非予防接種マウスの肺転移の数を測定する。実施例７癌抗原特異的Ｔリンパ球免疫療法メラノーマ抗原に対して予感作されたＴリンパ球は、メラノーマに罹患した哺乳動物の治療処置に有効であると考えられる。Ｔリンパ球を末梢血又はメラノーマ懸濁液から単離して、ｉｎｖｉｔｒｏ培養した（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．等，１９８８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：２１８３〜２１９１）。Ｔリンパ球を癌ペプチド（配列番号：９）に１μｇ／ｍｌの濃度において単独で又はＩＬ−２の存在下で暴露させ、再感作させ、培養で膨張させる。癌ペプチドに暴露させたＴリンパ球を哺乳動物に約１０⁹〜１０¹²リンパ球／動物で投与する。これらのリンパ球は静脈内、腹腔内又は病巣内に投与する。この処置は例えばサイトカイン、メラノーマの手術切除及び化学治療薬のような、他の治療処置と同時に投与することができる。実施例８転移性メラノーマを有する患者の処置このプロトコールでは、進行したメラノーマを有する患者を抗原性癌エピトープによって免疫感作させる。このトライアルに適した患者は、標準的な有効療法を失敗した、測定可能な又は評価可能な転移性メラノーマの徴候を有さなければならない。患者は、腫瘍細胞ＲＮＡのＰＣＲ又はノーザンブロット分析によって実証されるような、ＴＰＩ −１抗原を発現する腫瘍を有さなければならない。患者は１ｎｇ、１μｇ、１ｍｇ又は５００ｍｇ／ｋｇ体重の癌ペプチド（配列番号：６）を０日目、７日目及び１４日目に単独で又はＩＬ−２及び／又は免疫刺激性分子と組合せて受容する。患者を毒性、免疫学的効果及び治療効力に関して評価する。処置した患者から採取したリンパ球をアミノ酸配列ＭＳＬＱＲＱＦＬＲ（配列番号：６）を含む癌抗原に対する特異的反応に関して検査する。完全な反応は、少なくとも４週間持続する、疾患のあらゆる臨床徴候の完全な消失として定義される。部分的反応(partial response)は、新たな病巣の出現がないか又は病巣の増大のない、全ての測定可能な病巣の垂直直径の積(product) の全体として、少なくとも４週間にわたる５０％以上の減少である。軽度反応は、新たな病巣の出現がない又は病巣の増大のない、全ての測定可能な病巣の垂直直径の積の全体として２５〜４９％の減少として定義される。部分的反応未満を有する患者は不反応者と見なされる。部分的反応又は完全反応後の、新しい病巣の出現又は先行病巣の垂直直径の積の２５％を越える増加は再発と見なされる。実施例９ＴＲＰ−２のための材料と方法化学薬品と試薬下記化学薬品と試薬は指定供給源から購入した：ＲＰＭＩ１６４０，ＡＩＭ −Ｖ培地，Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ，Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）；真核細胞発現ベクターｐＣＲ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）；抗−ＨＬＡ−Ａ３１モノクローナル抗体（Ｏｎｅｌａｍｄａ，ＣａｎｏｇａＰａｒｋ，ＣＡ）；フルオレセインイソチオシアネートとコンジュゲートした抗−免疫グロブリンＭ抗体（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）。Ｔ細胞クローンと系統Ｔ細胞クローンは、ＴＩＬ５８６細胞系統から限界希釈法（１細胞／穴）によって、１０％ヒトＡＢ血清と５００ＩＵＩＬ−２とを含有するＲＰＭＩ１６４０中で支持細胞として同種ＰＢＬ（１ｘ１０³細胞／穴）を用いて生成させた。１２日間後に、Ｔ細胞クローンを６０００ＩＵ／ｍｌＩＬ−２を含有するＡＩＭ−Ｖ培地中で膨張させた。最適な膨張(expansion)を得るために、Ｓ．Ｒｉｄｄｅｌｌ（Ｗａｌｔｅｒ等，１９９５，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３３：１０３８〜１０４４）が述べているＯＫＴ３膨張方法を用いた。簡単には、０日目に５ｘ１０⁴〜５ｘ１０⁵Ｔ細胞をＨＬＡ−Ａ３１ＰＢＬ（５００：１、ＰＢＬ：Ｔ細胞比率）及び５８６ＥＢＶＢ細胞（１００：１、ＥＢＶ：Ｔ細胞比率）と共に、１１％ヒト血清と３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体と抗生物質とを含有するＲＰＭＩ１６４０（２５ｍｌ）中で同時培養した。１日目に、ＩＬ−２を１８０ＩＵ／ｍｌの最終濃度で加えた。５日目に、この培地を、１１％ヒト血清と、ＩＬ−２１８０ＩＵ／ｍｌとを含有する新しい培地と交換した。次に、培地を３日間毎に交換した。１２〜１４日目に、Ｔ細胞を回収して、計数し、冷凍保存した。ＴＩＬ５８６を転移性メラノーマを有する患者の標本から単離し、ＩＬ−２（６０００ＩＵ／ｍｌ）（Ｃｈｉｒｏｎ）を含有する培地中で既述されたように３２〜６０日間増殖させた（Ｔｏｐａｌｉａｎ等，１９８８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．６：８３９〜８５３）。ＴＩＬ５８６は主としてＣＤ８⁺Ｔ細胞であった。メラノーマ細胞系統３９７ｍｅ１、３９７ｍｅｌ／Ａ３１、５８６ｍｅｌ、６２４ｍｅｌ、６２４ｍｅｌ／Ａ３１、及びＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系統、５８６ＥＢＶと１５１０ＥＢＶを我々の実験室で確立して、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。幼児包皮に由来する正常培養メラノサイト（ＮＨＥＭ６８０、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、ＣＡから購入）をメラノサイト増殖培地（ＭＯＭ；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、ＣＡ）中で培養した。ＣＯＳ− ７細胞系統はＤｒ．Ｗ．Ｌｅｏｎａｒｄ（ＮＩＨ）によって提供された。ＧＭ−ＣＳＦ分泌アッセイＤＮＡトランスフェクションとＧＭ−ＣＳＦアッセイとは既述されたようにおこなった（Ｗａｎｇ等，１９９５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：７９９〜８０４）。簡単には、抗原をコードするＤＮＡ２００ｎｇと、ＨＬＡ−Ａ３１ＤＮＡ５０ｎｇとを、１００ｍｌのＤＭＥＭ中の２μｌのリポフェクタミンと１５〜４５分間混合した。ＤＮＡ／リポフェクタミン混合物を次にＣＯＳ−７（５ｘ１０⁴）細胞に加えて、一晩インキュベートした。翌日、細胞をＤＭＥＭ培地によって２回洗浄した。ＴＩＬ５８６を１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含有するＡＩＭ−Ｖ培地中で１ｘ１０⁵細胞／穴の濃度で加えた。Ｔ細胞クローンに関しては、１〜２ｘ１０⁴細胞／穴のみを加えた。１８〜２４時間インキュベートした後に、１００μｌの上澄み液を回収し、ＧＭ−ＣＳＦを標準ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＋ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で測定した。ペプチド認識を試験するために、５８６ＥＢＶ又はＴ２細胞を３７℃においてペプチドと共に９０分間インキュベートしてから、１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含有するＡＩＭ−Ｖ培地によって３回洗浄した。Ｔ細胞を加え、さらに１８〜２４時間インキュベートし、１００μｌの上澄み液をＧＭ−ＣＳＦアッセイのために回収した。ＥｘｏＩＩＩ／ＳＩ欠失構築とサブクローニングＴＲＰ−２ｃＤＮＡはＤｒ．Ｓｈｉｂａｈａｒａの贈り物（Ｙｏｋｏｙａｍａ等，１９９４，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２１７：３１７〜３２１）であり、これを発現のためのＣＭＶプロモーターと共にｐＣＲ３ベクター中にサブクローニングした。一連の欠失を作製するために、ＴＲＰ−２ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＣＲ３をＸｂａＩによって消化させ、α−ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド三リン酸によって充填し、ＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼ消化をブロックした。直鎖状ＤＮＡを第２の制限酵素消化にさらして、ＥｘｏＩＩＩに感受性の１端部を生成した。ＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼ／ＭｕｎｇＢｅａｎヌクレアーゼ欠失は製造者の指示（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）に従っておこなった。全ての欠失構築体を配列決定して、取り出されるＤＮＡ配列の位置を決定した。ｐＴＡプラスミドは、ＴＲＰ−２遺伝子の３’末端からＡｐａＩＤＮＡフラグメントが欠失した、ｐＣＲ３−ＴＲＰ−２の誘導体であった。ＴＲＰ−２遺伝子の３’末端からＫｐｎＩＤＮＡフラグメントを除去した後に、ｐＴＫが作製された。ｐＴＰは内部ＰｓｔＩフラグメントの欠失と再ライゲーションとによって生成された。ノーザンブロット分析グアニジンイソチオシアネート／塩化セシウム遠心分離法によって、総ＲＮＡを単離した。ヒト正常組織からの総ＲＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈ、ＣＡから購入した。２０μｇの総ＲＮＡに１．２％アガロースホルムアルデヒドゲル中での電気泳動をおこなって、これをナイロン膜上に移した。ＴＲＰ−２遺伝子の２．０ｋｂＤＮＡフラグメントをランダムプライミング法によって³²Ｐ−α−ＣＴＰで標識した。プレハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションとをＱｕｉｃｋＨｙｂプロトコール（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従っておこなった。膜を室温での１５分間の２ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳによって２回、６０℃での３０分間の０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳによって２回洗浄した。オートラジオグラフィーを−７０℃においておこなった。細胞傷害性アッセイ溶菌をＣａｌｃｅｉｎＡＭ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いておこなった。簡単には、Ｔ２細胞又は５８６ＥＢＶＢ細胞をＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＣＳ中でペプチドで９０分間パルスした。腫瘍細胞と、ペプチドパルスされたＥＢＶＢ細胞とをＣａｌｃｅｉｎＡＭ（１ｘ１０⁶細胞毎に１５μｌの１ｍｇ／ｍｌＣａｌｃｅｉｎＡＭ）によって３７℃ において３０分間標識した。インキュベーション後に、細胞をＡＩＭＶ／１２０ＩＵＩＬ−２によって３回洗浄した。１ｘ１０³ターゲット細胞にＴ細胞を種々なＥ：Ｔ比率で混合した。３７℃における４時間のインキュベーション後に、５μｌの臭化エチジウム含有ウシヘモグロビンクエンチ溶液(bovine hemoglob in quench solution)を加えた。プレートをＬａｍｂｄａスキャンによって読み取った。溶菌の％は下記式：［１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）］ｘ１００［式中、ＡはＴ細胞の存在下での非溶菌細胞の読取り値であり、Ｂはバックグラウンドシグナル値であり、Ｃはターゲット細胞からの最大シグナル値である］から算出した。ペプチドはペプチドシンセサイザー（ＭｏｄｅｌＡＭＳ４２２，ＧｉｌｓｏｎＣｏ．社，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，ＯＨ）を用いて固相法によって合成した。数種類のペプチドをＨＰＬＣによって精製し、これらは９８％を越える純度を有した。数種類のペプチドのペプチド質量を質量分光測定分析によって確認した。実施例１０ＣＴＬクローンによる腫瘍細胞上の新しい抗原の認識以前の研究において、我々は限界希釈法によってＴＩＬ５８６細胞系統から多くのＴ細胞クローンを単離している（Ｗａｎｇ等，１９９６ｂ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１１３１〜１１４０）。これらの中で、６種類のクローンが、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５遺伝子の代替オープンリーディングから翻訳された遺伝子産物に由来するＯＲＦ３Ｐペプチドをパルスされた５８６ＥＢＶＢ細胞と、自己由来５８６ｍｅｌ腫瘍細胞とを認識したが、関連のないペプチドをパルスされた５８６ＥＢＶＢ細胞を認識しなかった。図７に示すような、これらのＴ細胞クローンの１つの代表としてＴＩＬ５８６−Ｃ１を選択した。しかし、同じＴＩＬ５８６細胞系統から単離された幾つかのＴ細胞クローンは、ＴＲＰ−１ペプチドＯＲＦ３Ｐをパルスされた５８６ＥＢＶＢ細胞も、ＴＲＰ−１とＨＬＡ−Ａ３１ｃＤＮＡとによってトランスフェクトされたＣＯＳ細胞も認識しなかったが、５８６ｍｅｌ並びにＨＬＡ−Ａ３１＋メラノサイトを認識することができた（図７）。これらの結果は、これらのＴ細胞クローンが５８６ｍｅｌ腫瘍細胞上の付加的な腫瘍抗原を認識することを示唆した。次に、これらのＴ細胞クローンを膨張させて、材料と方法の項（実施例９）に述べた方法による認識に関して、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために又は他のｃＤＮＡを試験するために充分な細胞を得た。１種類のクローン、ＣＴＬクローン４を以下に述べるような他の研究のために上首尾に膨張させて、用いた。実施例１１Ｔ細胞クローンによって認識される腫瘍抗原をコードするｃＤＮＡの同定ＣＴＬクローン４に抗原を提示する役割を担うＨＬＡ分子を決定するために、例えば３９７ｍｅｌ及び６２４ｍｅｌのようなＡ３１陰性腫瘍系統中にＨＬＡ− Ａ３１ｃＤＮＡをトランスフェクトして、ＣＴＬクローンによる認識に関して試験した。ＨＬＡ−Ａ３１を発現する３９７ｍｅｌ及び６２４ｍｅｌのトランスフェクション体(transfectant)はＣＴＬクローン４によって顕著に認識された（表３）。さらに、これらのＴ細胞はＨＬＡ−Ａ３１陽性同種腫瘍系統１３５３ｍｅｌをも認識することができ、このことは、ＣＴＬクローン４による腫瘍抗原の認識がＨＬＡ−Ａ３１制限される(HLA-A31 restricted)ことを意味した。表３．ＣＴＬクローン４によるＧＭ−ＣＳＦの特異的分泌はＨＬＡ−Ａ３１制限される２ｘ１０⁴ＣＴＬクローン４細胞をメラノーマ細胞系統又は、ＨＬＡ−Ａ３１ｃＤＮＡによってトランスフェクトされたＣＯＳ−７と共に２４時間インキュベーションした後に、上澄み液中のＧＭ−ＣＳＦを測定した。限られた数のＴ細胞のみが利用可能であったので、これらのＴ細胞が予め同定された腫瘍抗原又はメラノサイト系統分化タンパク質(melanocyte-lineage diff erentiation protein)を認識するか否かを最初に試験した。ＨＬＡ−Ａ３１ｃＤＮＡと、ＭＡＲＴ−１（Ｋａｗａｋａｍｉ等，１９９４ａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３５１５〜３５１９）、ｇｐ７５（Ｗａｎｇ等，１９９５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：７９９〜８０４）、ｇｐ１００（Ｋａｗａｋａｍｉ等，１９９４ｂ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：６４５８〜６４６２）、チロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄ等，１９９３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９〜４９５）、ｐ１Ｓ（Ｒｏｂｂｉｎｓ等，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５９４４〜５９５０）及びＴＲＰ−２（Ｙｏｋｏｙａｍａ等，１９９４，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２１７：３１７〜３２１；Ｂｏｕｃｈａｒｄ等，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：１２７〜１３４）を包含する、既知腫瘍抗原又は推定される抗原をコードする遺伝子とによってトランスフェクトされたＣＯＳ −７細胞の、ＣＴＬクローン４による認識を試験した。ＨＬＡ−Ａ３１のみ又はＴＲＰ−２のみによってトランスフェクトされたＣＯＳ細胞はＴ細胞クローンによる認識を生じなかった。しかし、ＨＬＡ−Ａ３１とＴＲＰ−２ｃＤＮＡとによってトランスフェクトされたＣＯＳ細胞はＴ細胞からのＧＭ−ＣＳＦ放出を刺激したが、ＨＬＡ−Ａ３１と他の遺伝子とによってトランスフェクトされたＣＯＳ細胞は刺激せず、このことは、Ｔ細胞クローン４がＨＬＡ−Ａ３１制限様式でＴＲＰ−２を腫瘍抗原として認識したことを示す。ＨＬＡ−Ａ３、Ａ１１、Ａ３１、Ａ３３及びＡ６８とそれらのペプチド結合モチーフとにおける構造類似性の分析は、Ａ３様スーパーモチーフ(A3-like super motif)の存在を示唆している（Ｓｉｄｎｅｙ等，１９９６，ＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｌ．４５：７９〜９３）。単一エピトープペプチドは、総集団(general population)の約４０〜５０％に累積的に発現されるＨＬＡ−Ａ３、Ａ１１、Ａ３１、Ａ３３及びＡ６８分子と交差反応することができた。Ｂ型肝炎ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質に由来する同じペプチドエピトープがＨＬＡ−Ａ３１と−Ａ６８分子によって提示され、対応するＨＬＡ−Ａ３１又は−Ａ６８制限ＣＴＲによって認識されることが報告されている（Ｍｉｓｓａｌｅ等，１９９３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：７５１〜７６２）。ＨＬＡ−Ａ３１制限Ｔ細胞が、ＨＬＡ−Ａ３陽性ＥＢＶＢ細胞上にパルスされた場合のＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２エピトープを認識するかどうかを試験した。興味深いことには、Ｔ細胞からのＧＭ−ＣＳＦ放出に基づいて弱い認識が検出された。しかし、ＨＬＡ−Ａ３陽性腫瘍細胞の認識は検出されなかった。実施例１２ＴＲＰ−２遺伝子の発現種々な組織におけるＴＲＰ−２の発現パターンを評価するためのプローブとしてＴＲＰ−２ｃＤＮＡを用いて、ノーザンブロット分析をおこなった。正常な網膜組織は試験した正常なヒト組織のうちでＴＲＰ−２発現において唯一の陽性であることが判明した。メラノーマ細胞系統と他の細胞系統とにおけるＴＲＰ−２の発現パターンを以下の表４に列挙する。３０のメラノーマ細胞系統のうちの２５の細胞系統がＴＲＰ−２を発現することが判明した。ＢｕｒｋｉｔｔのＢ細胞系統Ｄａｕｄｉと胸部癌細胞系統ＭＤＡ２３１とは、以前の結果と一致して、陰性であった（Ｂｏｕｃｈａｒｄ等，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：１２７〜１３４）。したがって、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ｇｐ１００及びＭＡＲＴ−１と同様に、この遺伝子の発現パターンはメラノーマ、正常メラノサイト細胞系統及び網膜に限定されるように思われる。表４：種々な細胞系統と試験したヒト組織におけるＴＲＰ−２の発現ＴＲＰ−２の発現をノーザンブロット分析によって１０−２０〜ｇの総ＲＮＡを用いて試験して、ＴＲＰ−２ｃＤＮＡフラグメントによってプローブした。ＤａｕｄｉはＢｅｒｋｉｔｔのＢ細胞系統であり、ＭＤＡ２３１は乳癌細胞系統である。実施例１３Ｔ細胞によって認識されるペプチドエピトープＴＲＰ−２からの抗原性エピトープを判定するために、ＥｘｏＩＩＩ／Ｓ１ヌクレアーゼと、ＴＲＰ−２の切頭形をコードするＤＮＡフラグメントとを用いて３’末端からＴＲＰ−２遺伝子の一連の組重ね欠失体を生成した。これらの欠失体とサブクローン化構築体とを、ＨＬＡ−Ａ３１ｃＤＮＡを含有するｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドと共に、ＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクトされたＣＯＳ細胞の認識をＣＴＬクローンによって、ＣＴＬクローンからのＧＭ−ＣＳＦサイトカイン放出を測定することによって試験した。図９は、ｐＴＤ１、２及び３構築体がＣＴＬクローン４からのサイトカイン放出を刺激する能力を保有するが、ｐＴＤ４とｐＴＤ５はＣＴＬクローン４に対する刺激活性を失ったことを示し、このことはＣＴＬクローン４によって認識されるエピトープ（単数又は複数）がヌクレオチド８３６〜１０４５の領域に位置付けられたことを意味した。このことはサブクローニング実験によって得られた結果と一致した。ｐＴＡとｐＴＰとはＣＴＬクローン４からのサイトカイン放出を刺激する能力を失ったが、ｐＴＫはサイトカイン放出アッセイにおいてまだ陽性のままである。それ故、これらのエピトープは、図１０に示すように、第１のＰｓｔＩとＫｐｎＩ部位によって隣接されたＤＮＡフラグメント中に存在した。この小さいＤＮＡフラグメントのコーディング領域からエピトープを同定するために、５種類の合成ペプチドはＨＬＡ−Ａ３１の合成ペプチド結合モチーフ（位置２における疎水性残基と位置９における正に荷電した残基）に基づくものであった（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ等，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１：１７８〜２２８）。これらのペプチドを５８６ＥＢＶＢ細胞上にパルスし、ＣＴＬクローン４によるサイトカイン放出を刺激するそれらの能力に関して試験した。表５に示すように、ペプチドＴＲＰ₁₉₇ _〜205は、５８６ＥＢＶＢ細胞上にパルスされたときに、ＣＴＬクローン４によって強度に認識された。ＣＴＬクローン４によるこのペプチドの認識は、このペプチドを、例えば５８６ＥＢＶと１５１０ＥＢＶのような、ＨＬＡ−Ａ３１＋ＥＢＶＢ細胞上にパルスしたときにのみ観察され、ＨＬＡ−Ａ３１陰性Ｔ２細胞上にパルスしたときには観察されなかった。ＣＴＬクローン４はＴＲＰ−１遺伝子の代替オープンリーディングフレームに由来するＯＲＦ３Ｐペプチドを認識しなかった。これらの結果は、ＴＩＬ５８６−ＣｌがＴＲＰ−１由来ＯＲＦ３Ｐペプチドを特異的に認識し、ＣＴＬクローン４がＴＲＰ２由来ペプチドを特異的に認識することを実証した。ＯＲＦ３ＰとＴＲＰ２−ｐ１９７の両方がＨＬＡ−Ａ３１分子によってＴ細胞に提示されたときに、交差反応性は観察されなかった。表５．Ｔ細胞クローンに対する反応性を有する合成ぺプチドの同定５８６ＥＢＶ細胞を１〜ｇ／ｍｌの濃度の個々のペプチドと共に９０分間インキュベートした。ペプチド負荷５８６ＥＢＶ細胞を、ＴＲＰ−１又はＴＲＰ−２のいずれかを認識するＴ細胞クローンと共に同時インキュベーションした後にＧＭ−ＣＳＦ放出を測定した。刺激因子なしのＴ細胞のみによるＧＭ−ＣＳＦ分泌を控除した。５８６ＥＢＶと１５１０ＥＢＶはＨＬＡ−Ａ３１を発現するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系統であった。実施例１４ＴＲＰ_197-205ペプチドの特徴付け滴定実験は、１ｎＭのペプチドがＴ細胞クローン４からのＧＭ−ＣＳＦ放出を刺激するために充分であり、この刺激が５００ｎＭにおいてプラトーに達したことをことを実証した（図１０Ａ）。ＴＲＰ_197-205をパルスされた５８６ＥＢＶＢ細胞のＣＴＬクローン４による溶菌も種々なペプチド濃度において測定し（図１０Ｂ）、サイトカイン放出アッセイと同様に、ＣＴＬクローン４によるターゲット細胞の溶菌は１ｎＭペプチド濃度において検出された。最大溶菌は１００ｎＭのペプチド濃度において見られた。ＣＴＬクローン４はＴＲＰ２−ｐ１９７をパルスされた５８６ＥＢＶと５８６ｍｅｌ腫瘍細胞とを低いＥ：Ｔ比率においても溶菌することができたが、単独若しくは対照ペプチドＯＲＦ３Ｐをパルスされた５８６ＥＢＶＢ細胞も、ＨＬＡ−Ａ３１陰性３９７ｍｅｌ系統も溶菌することができなかった（図１０）。現在までに同定されたヒトメラノーマ抗原の大部分は非変異自己抗原であり、対応するＭＨＣ分子に対するこれらの自己ペプチドのＴ細胞認識及び結合アフィニティは、幾つかの場合に、アンカー残基におけるアミノ酸の置換によって改良されている。８マー又は１０マーを包含する多くの合成ペプチドと、表６に表示する修飾ペプチドとを作製し、５８６ＥＢＶＢ細胞にパルスされた場合のＣＴＬクローン４による認識に関して試験した。ＴＲＰ_197-205のＮ末端において１アミノ酸が伸長された、１０マーＴＬＬＧＰＧＲＰＹＲは、５８６ＥＢＶＢ細胞にパルスされた場合に、ＣＴＬクローン４によってまだ認識されたが、反応性は重複９マーＬＬＧＰＧＲＰＹＲの約６０％であった。ＨＬＡ−Ａ３１の結合モチーフに基づいて、アンカー残基位置２と９並びに他の位置におけるアミノ酸置換によって若干の修飾ペプチドを生成した。Ｃ末端の位置９におけるＡｒｇ残基は、Ｌｙｓ残基によって置換されることができ、この修飾ペプチドは親ペプチドの活性の少なくとも６０％を保有した。位置２におけるＬｅｕ残基の、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ又はＶａｌ残基による置換は、同じ活性を維持したか、又は親ペプチドの６０％に活性を低下させたが、この位置におけるＡｌａ又はＰｈｅによる置換はＴ細胞からのサイトカイン放出を刺激する能力を低下させた（表６）。他の修飾はＴ細胞認識における可変な癌ペプチド活性を生じた。表６．修飾ペプチドのＴ細胞反応性の比較５８６ＥＢＶ細胞を０．５〜ｇ／ｍｌの濃度の個々のペプチドと共に９０分間インキュベートした。ペプチド負荷５８６ＥＢＶ細胞を、ＣＴＬクローン４細胞と共に同時インキュベーションした後にＧＭ−ＣＳＦ放出を測定した。刺激因子なしのＴ細胞のみによるＧＭ−ＣＳＦ分泌を控除した。５８６ＥＢＶはＨＬＡ− Ａ３１を発現するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系統であった。ＴＲＰ−２タンパク質は２つの推定の銅結合部位と、システイン富化領域と、膜通過ドメインとを含有する。ヒトＴＲＰ−２は染色体１３にマッピングされており、マウスの対応物は染色体１４のコートカラー変異(coat color mutation) 、スレーティ(slaty)の領域にマッピングされている。ＴＲＰ−２とチロシナーゼ又はＴＲＰ−１／ｇｐ７５との間には約４０％のアミノ酸配列同一性が存在するが、チロシナーゼタンパク質ファミリー間の共通ペプチドエピトープを認識するＣＴＬ系統又はクローンは現在までに見つかっていない。ＣＴＬクローン４によって認識された９マーＴＲＰ_197-205ペプチドはＴＲＰ −２のコーディング領域における銅結合部位の１つに位置付けられる。このペプチドは、この研究で試験した修飾ペプチドを含めた他のペプチドに比べて、Ｔ細胞からのサイトカイン放出を最も効果的に刺激した。このことは、位置２におけるＬｅｕと位置９におけるＡｒｇとが好ましい残基であることを示す、予測されたＨＬＡ−Ａ３１結合モチーフと一致した。位置２におけるＬｅｕと位置９におけるＡｒｇとはそれぞれ位置２におけるＩｌｅとＳｅｒ及び位置９におけるＬｙｓと、Ｔ細胞認識に対する反応性の損失が殆ど無く若しくは微々たる損失で、置換されることができるが、位置１、３又は６におけるアミノ酸置換は反応性の若干の損失を生じた。実施例１５Ｉｎｖｉｖｏ処置アッセイｉｎｖｉｖｏ処置に関しては、肺転移を確立するために、ＭＨＬ−Ａ３１⁺ トランスジェニックマウスを、１ｘ１０⁵又は５ｘ１０⁵Ｔｒｐ−１⁺Ｂ１６マウスメラノーマ細胞によって静脈内チャレンジする。続いて、マウスに１０⁵ＰＦＵ／ｍｇ体重で癌ペプチド、ＬＬＧＰＧＲＰＹＲを発現する組換えウイルスを予防接種する。マウスを１２日目に安楽死させ、予防接種したマウス対非予防接種マウスの肺転移の数を測定する。実施例１６癌抗原特異的Ｔリンパ球免疫療法メラノーマ抗原に対して予感作されたＴリンパ球は、メラノーマに罹患した哺乳動物の治療処置に有効であると考えられる。Ｔリンパ球を末梢血又はメラノーマ懸濁液から単離して、ｉｎｖｉｔｒｏ培養する（Ｋａｗａｋａｍｉ，等，１９８８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：２１８３〜２１９１）。Ｔリンパ球を癌ペプチド、ＬＬＧＰＧＲＰＹＲに１μｇ／ｍｌの濃度において単独で又はＩＬ−２の存在下で暴露させ、再感作させ、培養で膨張させる。癌ペプチドに暴露させたＴリンパ球を哺乳動物に約１０⁹〜１０¹²リンパ球／哺乳動物で投与する。これらのリンパ球は静脈内、腹腔内又は病巣内に投与する。この処置は例えばサイトカイン、メラノーマ損傷の手術切除及び化学治療薬のような、他の治療処置と同時に投与することができる。実施例１７転移性メラノーマを有する患者の処置このプロトコールでは、進行したメラノーマを有する患者を抗原癌エピトープによって免疫感作させる。このトライアルに適した患者は、標準の有効療法に失敗した、測定可能な又は評価可能な転移性黒色腫の徴候を有さなければならない。患者は、腫瘍細胞ＲＮＡのＰＣＲ又はノーザンブロット分析によって実証されるようなＴＰＩ−２抗原を発現する腫瘍を有さなければならない。患者は１ｎｇ、１μｇ、１ｍｇ又は５００ｍｇ／ｋｇ体重の癌ペプチド、ＬＬＧＰＧＲＰＹＲを０日目、７日目及び１４日目に単独で又はＩＬ−２及び／又は同時免疫刺激性分子(co-immunostimulatory molecule)と組合せて静脈内で受容する。患者を毒性、免疫学的効果及び治療効力に関して評価する。処置した患者から採取したリンパ球をアミノ酸配列、ＬＬＧＰＧＲＰＹＲを含む癌抗原に対する特異的反応に関して検査する。完全な反応は、少なくとも４週間持続する、疾患のあらゆる臨床徴候の消失として定義される。部分的反応は、新たな病巣の出現がないか又は病巣の増大のない、全ての測定可能な病巣の垂直直径の積の全体として、少なくとも４週間にわたる５０％以上の減少である。軽度反応は、新たな病巣の出現がないか又は病巣の増大のない、全ての測定可能な病巣の垂直直径の積の全体として２５〜４９％の減少として定義される。部分的反応未満を有する患者は不反応者と見なされる。部分的反応又は完全反応後の、新しい病巣の出現又は先行病巣の垂直直径の積の２５％を越える増加は再発と見なされる。考察例えばチロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ及びｇｐ１００のような対応する非変異性共有(non-mutated shared)メラノーマ抗原の正常オープンリーディングフレームに由来する幾つかの抗原性Ｔ細胞エピトープが同定されている。この研究では、ＴＩＬ５８６によって認識される抗原性ペプチドがｇｐ７５遺伝子の第２遺伝子産物に由来することを実証した。我々の知るかぎりでは、これは、Ｔ細胞が同じ遺伝子の重複オープンリーディングフレームの翻訳から生じる抗原性ペプチドを認識する最初の例であり、かつ２種類の完全に異なるタンパク質及び／又はペプチドが単一細胞遺伝子の重複オープンリーディングフレームから翻訳されることができるという真核細胞における唯一つの例である。ｇｐ７５遺伝子のＯＲＦ３は２４アミノ酸の短いタンパク質をコードする。ＴＩＬ５８６によって認識される抗原性ペプチドは、代替オープンリーディングフレームのＡＴＧ（２９４〜２９６）開始コドンの直後に位置付けられた配列によってコードされる。ｇｐ７５はチロシナーゼ、ｇｐ１００及びＴＲＰ−２に対して４０〜４５％の配列相同性を有するが、ＣＯＳ−７細胞中へのＨＬＡ−Ａ３１とチロシナーゼ、ｇｐ１００又はＴＲＰ−２ｃＤＮＡ、それぞれとの同時トランスフェクションはＴＩＬ５８６由来Ｔ細胞クローンからのＧＭ−ＣＳＦ放出を刺激することができなかった。データベースサーチは、ＨＬＡ−Ａ３１ペプチド結合モチーフと、ＴＩＬ５８６とそれに由来するＴ細胞クローンによって認識されるペプチドエピトープに対して顕著な配列相同性とを有するタンパク質を明らかにしなかった。さらに、以前の研究は、メラノーマトランスフェクション体（ｇｐ７５⁺ ／Ａ３１⁺）がＴＩＬ５８６からのＧＭ−ＣＳＦ放出を刺激する能力を与えたが、ｇｐ７５メラノーマトランスフェクション体（ｇｐ７５^-／Ａ３１⁺）は与えなかったことを示した（Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｆ．等，１９９５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：７９９〜８０４）。他のメラノーマ細胞系統（ｇｐ７５^-／Ａ３１⁺）によっても同様な結果が得られた。ＯＲＦ３Ｐペプチドはｇｐ７５遺伝子から同定された唯一のエピトープであり、ＴＩＬ５８６由来の６種類のＴ細胞クローンによって認識されたので、このペプチドは腫瘍細胞又はメラノサイト上の自然プロセスペプチドと同じ又は類似すると考えられる。このことは、このペプチドは腫瘍細胞上の自然ペプチドとＴ細胞認識に関して競合することができたので、コールドターゲット阻害実験によってさらに支持された。結腸癌における変異した腺腫症結腸ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子のフレームシフトに由来するＴ細胞エピトープペプチドが予防接種したＢＡＬＢ／ｃマウスから得られたＣＴＬによって認識されることが報告された（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ａ．等，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ，３７１：６６２）。図３の結果は、ヌクレオチド２９４〜２９６におけるＡＴＧが２４アミノ酸産物の翻訳のために必要であり、２４アミノ酸産物は次にＴＩＬ５８６によって認識される抗原性ペプチドにプロセシングされることを示した。ＴＩＬ５８６は５８６ＥＢＶＢ細胞にパルスされた変異合成ペプチドをも認識したが、ＣＯＳ−７細胞中にＨＬＡ−Ａ３１ｃＤＮＡと共に同時トランスフェクトされた場合は、変異遺伝子を認識せず、このことは、ＴＩＬ５８６による変異（ＡＴＧからＡＴＣへ）遺伝子の認識喪失がＯＲＦ３産物の翻訳の無いことに起因することを示した。ＤＮＡ配列分析に加えてこれらの結果は、ＴＩＬ５８６によって認識される抗原性ペプチドがｇｐ７５のフレームシフト産物に由来するという可能性を除外した。それ故、多重のペプチド又はタンパク質がしばしば単一真核遺伝子の重複オープンリーディングフレームから翻訳されるが、これらの代替産物を検出するための手段が利用可能でなかったことが考えられる。自然プロセスペプチドを検出するためのＴ細胞の鋭敏な感受性は、この現象の多くの他の例を明らかにすることができる。重複オープンリーディングフレーム３（ＯＲＦ３）がｉｎｖｉｖｏで翻訳される機構は、現在不明である。１つより多いＡＵＧコドンにおいて開始し、幾つかの稀な場合にはＡＵＧコドンと、例えばＣＵＧのような非ＡＵＧコドンの両方において開始してＮ−末端伸長した同じ配列を形成する細胞ｍＲＮＡの幾つかの例が報告されているが、単一真核細胞ｍＲＮＡからの重複オープンリーディングフレーム（即ち、２種類の全く異なるペプチドを翻訳する）の利用は、我々の知る限りまだ述べられていない。単−ｍＲＮＡからの重複リーディングフレームの翻訳の幾つかの例は述べられているが、ウイルス遺伝子に排他的に限定されている。ウイルス遺伝子における重複オープンリーディングフレームの産物の検出は、ウイルス感染宿主の血清中の反応性抗体の存在のために可能であった。本発明では、Ｔ細胞アッセイを用いて、Ｔ細胞によって認識されるエピトープペプチドを同定した。このアプローチは慣用的なウェスタンブロット又は免疫沈降分析とは全く異なり、これらの分析よりも高感度である。真正開始コドンと、ＯＲＦ３の開始コドンとの間には５個のＡＴＧコドンが存在するが、ＯＲＦ１（ｇｐ７５）のＮ末端部分と、完全なＯＲＦ２及びＯＲＦ３をカバーする構築体ｐＰＣＲ１１Ｏ（ヌクレオチド１〜６６７）はＴＩＬ５８６からのサイトカイン放出を刺激する能力をまだ保有する。しかし、刺激のレベルはｇｐ７５の５’切頭形（最初の２４６ヌクレオチドが欠失）による刺激レベルよりも数倍低く（図１Ａと１Ｂ）、このことは上流のＡＴＧコドンがＯＲＦ３発現を部分的に阻害したと考えられることを示唆した。幾つかのファクターがこの系におけるＯＲＦ３産物の発現を検出することを可能にしている。第一に、ＯＲＦ３のＡＴＧ開始コドンに先行する上流のＡＴＧコドンは最適に関係しないように思われ、このことがリーキースキャンニングモデル(leaky scanning model)による開始コドンとしての下流ＡＴＧの使用を可能にすると考えられる。第二に、ＣＯＳ−７細胞中のトランスフェクトされた遺伝子の比較的高い発現と、極度に敏感な手段としてのＴ細胞アッセイの有効性とが非常に低レベルの翻訳産物の検出を可能にすると考えられる。興味深いことには、ＯＲＦ３産物は腫瘍細胞中並びに正常メラノサイト中でＴ細胞によって検出され（図６Ａ〜６Ｄ）、このことはＯＲＦ３タンパク質が腫瘍細胞における遺伝的変化(genetic alteration)に起因する遺伝子産物でないことを強く示唆した。以前の研究では、ＴＩＬ５８６が試験された多重の腫瘍細胞系統（ｇｐ７５⁺／Ａ３１⁺）を認識したことが示され、これは、ＴＩＬ５８６が非変異共有腫瘍抗原を認識することを示唆した（ＷａｎｇＲ．Ｆ．等上記文献）。ｇｐ７５遺伝子はノーザンブロットとＰＣＲ分析とに基づくとメラノーマ中に高度に発現され（ＷａｎｇＲ．Ｆ．等上記文献）、その遺伝子産物ｇｐ７５タンパク質はメラノーマ細胞とメラノサイトに発現された最も豊富な細胞内糖タンパク質であるので（Ｔａｉ，Ｔ．，Ｅｉｓｉｎｇｅｒ，Ｍ．，Ｏｇａｔａ，Ｓ．及びＬｌｏｙｄ，Ｋ．Ｏ．，１９８３，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４３：２７７３〜２７７９；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｔ．Ｎ．，Ｍａｔｔｅｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｏｌｄ，Ｌ．Ｊ．及びＬｌｏｙｅｄ，Ｋ．Ｏ．１９８５，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔ．８５：１６９〜１７４；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｔ．Ｎ．，ｒｅａｌ，Ｆ．Ｘ．，Ｍｕｔａｋａｍｉ，Ｓ．，Ｃｏｒｄｏｎ−ｃａｒｄｏ，Ｃ．，Ｏｌｄ，Ｌ．Ｊ．及びＨｏｕｇｈｔｏｎ，Ａ．Ｎ．１９８８，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔ．９０，４５９〜４６６），Ｔ細胞クローンが５８６ＥＢＶＢ細胞（Ａ３１⁺），メラノーマ（ｇｐ７５⁺／Ａ３１⁺）並びにＡ３１⁺ラノサイト上にパルスされた場合のＯＲＦ３Ｐペプチドを認識したが、ｇｐ７５⁺／Ａ３１⁺メラノーマ細胞上にパルスされた場合、又は非Ａ３１Ｔ２細胞にパルスされたＯＲＦ３Ｐを認識しなかったことは意外ではない。腫瘍細胞とメラノサイトとにおけるペプチド発現を説明する他の可能性は、ＯＲＦ３がｇｐ７５ｍＲＮＡ又は異なるプロモーターの選択的スプライシング(alternative splicing)によって生成された別のｍＲＮＡ転写体(transcript)（単数又は複数）から翻訳されうることである。我々の知る限りでは、選択的スプライシングによって生成されたｍＲＮＡ転写体は、同じオープンリーディングフレームを用いてアイソフォームタンパク質に翻訳される。しかし、本発明の場合には、別の転写体が生成されて、翻訳の鋳型として用いられたとしても、ｇｐ７５とは全く異なるオープンリーディングフレームがＯＲＦ３産物の翻訳に用いられた。ｉｎｖｉｖｏでのＯＲＦ３タンパク質の翻訳の機構を解明するには、さらなる実験が必要である。それにも拘わらず、上述したこれらの可能性は相互に排他的ではない。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Human cancer antigens of tyrosinase-related proteins 1 and 2, and genes encoding the same ChildField of the invention The present invention relates to the field of cancer diagnostics and therapeutics, including cancer vaccines. More In general, the present invention relates to novel cancer peptides and alternatives encoding the same. (Alternative) Regarding isolation and purification of open reading frame DNA sequences You. The present invention further provides novel novel compounds that can act as tools in treating and preventing cancer. The present invention relates to the isolation and purification of tumor antigens and DNA encoding the cancer antigens. The present invention In addition, alternative auxiliaries derived from within the tyrosinase-related protein 1 (TRP1) gene Novel cancer peptide encoded by open reading frame DNA sequence About. The present invention also relates to a novel cancer peptide derived from the TRP2 gene. You. The present invention is further directed to detecting and diagnosing and treating cancer and precancers in an individual. About the method.Background of the Invention Adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) in patients with metastatic melanoma Can mediate tumor regression, and tumor rejection antigens recognized by T cells Suggested to be present on these tumor cells. Such T cells are available In particular, the gene encoding human melanoma antigen was cloned and sequenced. It is possible to do. The antigens identified so far from human melanoma , Based on their expression patterns. The first qu Las antigen is expressed only in tumors and testes, but not in other normal human tissues. Coded by gene. MAGE1, MAGE3, GAGE and BAGE Is an example of this class. The second class of antigens is melanocytes, melanoma and And differentiation antigens encoded by genes expressed only in normal retina. MA RT-1 / Melan-A, gp100 and tyrosine are examples of this class . These antigens are all unmutated self proteins. However, CDK4, B -Several mutant antigens, including catenin and Mum-1, are also recognized by T cells. Was identified. Recognized by T cells derived from the corresponding gene product Of antigenic epitopes to be understood understands the mechanism of the immune response to self-antigens These antigens or synthetic peptides not only for the treatment of patients with cancer It is also important to develop new and effective immunotherapy strategies. Previous studies have shown that TIL586 + IL- in autologous patients with melanoma It was shown that injection of 2 resulted in objective regression of metastases. More recently, HL Residue encoding a tumor antigen recognized by TIL586 in association with A-A31 Gene, tyrosinase-related protein 1 (TRP-1 or gp75) cloned Was Interestingly, the gene product gp75 is associated with metastatic melanoma. First identified as an antigen recognized by IgG antibodies in serum from humans. The gene is expressed only in melanoma, normal melanocyte cell lines and retina, It was found not to be expressed in other normal tissues tested. Therefore, this gene A second crop containing MART-1 / Melan-A, gp100 and tyrosinase He is a member of Russ's antigen. In the field, as an immunogen or vaccine to protect individuals from cancer development It has been difficult to identify epitopes on cancer cells that are useful. The present invention uses T Alternative open readings in the TRP-1 gene specifically recognized by cells Cancer peptides and antigenic cancer epithelia within peptides encoded from gframe sequences Identification of the loop. The present invention relates to a cancer pepti encoded by the TRP-2 gene. Inclusive. The cancer peptide of the present invention is useful for inhibiting or preventing cancer in mammals. Useful as epidemiology and vaccine.Summary of the Invention One object of the present invention is to provide a novel marker recognized by T lymphocytes as a cancer antigen. To provide peptides and parts thereof. The cancer peptide of the present invention and the antigenic cancer epitope portion of the cancer peptide are the same. Used to encode a normal protein or peptide derived from the gene Alternative open reading of genes other than open reading frame DNA sequence Coding DNA sequence. Genes falling within this range are TR It is the P-1 gene. Another aspect of the present invention relates to normal proteins or peptides from the same gene. Alternative open for genes other than the encoding open reading frame DNA sequence Tumor antigen encoded by the reading frame DNA sequence. this Genes falling within the range are TRP-1 genes. Another object of the present invention is to provide TRP-1, TRP-2 and TRP-2 acting as cancer peptides. And its mutant peptide fragments. The tumor antigen and the antigenic cancer peptide of the tumor antigen of the present invention are Encoded by all or part of the child (SEQ ID NO: 46). TRP-2 It is a member of the rosinase-related gene family. TRP-2 is an immune response to T cells Currently identified as a novel and potential tumor antigen that can elicit . One aspect of the present invention is useful as a cancer vaccine that can protect a subject from developing cancer. The TRP-1 gene, the TRP-2 gene or a mutant thereof. Cancer peptide. The present invention also provides a cancer vaccine in an amount effective to prevent cancer. A method of administering tin. Another aspect of the invention relates to the use of a cancer peptide or its antigenic cancer epitope alone or A pharmaceutical composition comprising a combination with one or more immunostimulatory molecules. Another aspect of the invention Means TRP-1 cancer antigen alone, TRP-2 tumor antigen alone, or one or more A pharmaceutical composition comprising a combination with an immunostimulatory molecule. Another object of the present invention is to provide a T-cell. TRP-1, TR stimulating vesicles to elicit an immunogenic response against tumors and cancer A pharmaceutical composition comprising a P-2 peptide or a combination thereof. Cancer peptide Or its antigenic cancer epitopes also serve as immunogens for the prevention or treatment of cancer. Can be provided as a vaccine. Pharmaceutical compositions cure cancer in mammals Useful in treating or preventing. In the method of treatment, the pharmaceutical composition is administered to a mammal. Administered to a mammal in an amount effective to prevent or inhibit cancer in a mammal. Another object of the present invention is to provide an autologous gene encoding a normal protein from the same gene. Alternative open readies derived from genes other than punreading frame DNA sequences Peptide and antigens within the peptide by translation of the in-frame DNA sequence A method for generating a sex cancer epitope. Still another object of the present invention is to provide a protein encoding a normal protein or peptide. Genes other than gene products translated from open reading frame DNA Cancer peptide residues translated from an alternative open reading frame DNA sequence A method for detecting and identifying a gene product or a part thereof. Yet another aspect of the present invention is an alternative alternative encoding a cancer peptide or a portion thereof. Open reading frame DNA or RNA sequences, as well as cancer peptides or The use of that DNA or RNA sequence in a method of producing a portion of the DNA. Departure Ming also provides an alternative open source for use as a probe or primer. An oligonucleotide of the coding frame DNA or RNA sequence is provided. Yet another object of the present invention is to provide a T cell that produces a tumor antigen when expressed in cells. Nucleic acid sequence encoding RP-2 or a fragment thereof. The present invention further provides an alternative open readout encoding a cancer peptide or a portion thereof. Coding frame DNA sequence alone or encoding at least one immunostimulatory molecule Provided in combination with a second DNA sequence. Alternative open library The reading frame DNA sequence is derived from the TRP-1 gene or a variant thereof. It may be. The present invention also provides an alternative open ready encoding a cancer peptide or a portion thereof. Coding frame DNA sequence alone or encoding at least one immunostimulatory molecule Transfected or characterized by a vector comprising in combination with a second DNA sequence An introduced host cell is provided. The present invention further provides a TRP-2 gene encoding a tumor antigen or a portion thereof. Paired with a second DNA sequence encoding a German or at least one co-immunostimulatory molecule Provide a vector containing the combination. Vectors and host cells as vaccines Can act, the expression of tumor antigens or cancer peptides is immunized with the vaccine Causes stimulation of tumor antigen-specific T lymphocytes in mammals. The present invention also relates to DNA encoding the TRP-2 tumor antigen or a variant thereof. Paired with a second DNA sequence encoding a German or at least one co-immunostimulatory molecule Provide host cells transfected or transduced with the vector I do. Vectors and host cells can act as vaccines, Tumor antigen expression is determined by antigen-specific T lymphocyte expression in mammals immunized with the vaccine. Causes irritation. Vectors and host cells can act as vaccines, including cancer peptides and Or some of its expression is specific for cancer peptide in vaccine-immunized mammals. Causes T lymphocyte stimulation. Yet another object of the present invention is to provide human pre-neoplastic and neoplastic cells and compositions. It is to provide a method for diagnosing the weave. The present invention is used to encode normal proteins from the same gene. Alternative reading frame for genes other than the open reading frame nucleic acid sequence Detecting a cancer peptide encoded by a nucleic acid sequence or a part thereof Therefore, it is a method for diagnosing cancer or precancerous cancer in a mammal, including the cancer peptide or Or a method wherein a part thereof is recognized by T lymphocytes. Alternative reading The gframe nucleic acid sequence may be from the TRP-1 gene or a variant thereof. . Yet another object of the present invention is to provide human pre-neoplastic and neoplastic cells and compositions. It is to provide a method for diagnosing the weave. According to the present invention, the method comprises Cells, tissues or extracts thereof and an alternative open encoding cancer peptide Detect reading frame DNA sequences, RNA sequences or parts thereof, Expressed by an alternate open reading frame DNA or RNA sequence Alternative open reading, including detecting a cancer peptide or a portion thereof Detection or increase of the frame DNA sequence, RNA sequence or expression product is An indicator of an organism or neoplasm. The present invention relates to a method for diagnosing mammalian cancer or precancerous cancer by detecting a TRP-2 tumor antigen. Wherein the tumor antigen, cancer peptide or variant thereof is recognized by T lymphocytes Provide a way to be. The present invention relates to tumors encoded by the TRP-2 gene or a fragment thereof. A method for diagnosing cancer or precancerous cancer in a mammal by detecting a tumor antigen, wherein the tumor antigen is a T cell. Provide a method that is recognized by the sphere. Yet another object of the present invention is to provide an alternative audio encoding a cancer peptide or part thereof. Incorporates one or more copies of the pruning reading frame DNA sequence into its genome To provide transgenic animals. Alternative reading free The nucleic acid sequence may be from the TRP-1 gene or a variant thereof. Alternative Multiplex or mutant, depending on the incorporation of open reading frame DNA sequences Overexpression or expression of the cancer peptide. Such transgenic movement The products are useful for screening for therapeutic agents useful for treating cancer. It is a further object of the present invention to provide one or more copies of a tumor antigen of the present invention in its genome. The purpose is to provide the transgenic animals that have taken up. TRP-2 Overexpression of tumor antigens or incorporation of DNA sequences or fragments thereof Expression occurs. Such transgenic animals can be used as therapeutic agents useful for treating cancer. Useful for screening. The present invention also provides an alternative open reading frame nucleic acid sequence or TRP-2. Specific targeting and binding to tumor antigen nucleic acid sequence, derived from the same gene Cancer peptides or tumor antigens without adversely affecting the expression of normal proteins Antisense oligonucleotides that inhibit the expression of Yet another aspect of the invention is a TRP for use in diagnostic and detection assays. Peptide containing -1 cancer peptide and TRP-2 tibia antigen and antigenic cancer thereof Monoclonal and polyclonal antibodies reactive with the epitope. Monoclonal and polyclonal antibodies can be used alone or in diagnostic and detection assays. It can be provided in the form of a kit together with other reagents commonly used in (a).BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES Many of these and other objects, features, and attendant advantages of the present invention are set forth in the appended claims. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The drawings will be better understood from reading the following detailed description, taken together with the drawings. Would. In the drawing, FIGS. 1A and 1B show the antigenic peptides recognized by TIL586. Gp75 nucleotide sequence. FIG. 1A shows the entire gp75 containing the 1584 bp open reading frame. 1 shows a long cDNA. The nucleotide is a tandem consisting of the leader sequence and mature gp75. It is numbered from the start codon which is translated into protein. pcDNA776 is Gp75 partial cDNA lacking the first 246 nucleotide coding region; When COS-7 was co-transfected with the LA-A31 gene, T Using an assay based on the ability to stimulate GM-CSF secretion by IL586 Isolated from a cDNA library. A series of deletion constructs and PCR DNA Fragments were made. pD776A is pcD after digestion with ApaI restriction enzyme. It is a derivative of NA776. FIG. 1B shows the release of GM-CSF by TIL586. According to TIL586 GM-CSF secretion was determined by the DNA fragment shown in FIG. 1A and the HLA-A31 gene. Measured after co-culture with COS-7 co-transfected with offspring. Contrast The stimulator cells were 586 mel, 397 mel / A31⁺ , COS-7 alone, And HLA-A31 or pcDNA776 cDNA Includes COS-7. FIG. 2 shows the nucleotide, amino acid sequence and open reading of the gp75 gene. 3 shows a switching frame. Partial nucleotide and amino of the first 157 amino acids The acid sequence is shown from the translation start codon of ORF1 (gp75). TIL586 DNA fragments conferring the ability to stimulate GM-CSF release from Show. Two putative start codons, ATG (254-256) and ATG (294) -296) in bold, causing translation of ORF2 and ORF3, respectively Can be. The peptide sequence recognized by ORF3 by TIL586 is in bold Shown by underline. Figures 3A and 3B show translation of antigenic peptides and alternative open reading frames. Is shown. FIG. 3A shows the position and length of a PCR fragment amplified by PCR. . The DNA fragment was obtained by PCR amplification and contained in the pCR3 expression vector. Cloned. Replacement of the ATG at positions 294-296 with ATC can be accomplished by And as described in Methods. FIG. 3B shows a DNA fragment that stimulates cytokine release from TIL586. 2 shows the testing of the mutant and mutant constructs. The GM-CSF release assay was the same as in FIG. I went. 4A-4C show the characteristics of the antigenic peptide recognized by TIL586. You. FIG. 4A shows HLA- when co-incubated with various stimuli. Figure 4 shows the release of GM-CSF by A31 restricted TIL586. Transfection And cytokine assays were performed as in FIGS. 1A and B. 586 mel And 397mel as positive and negative controls for TIL586 reactivity included. The ORF3P peptide was 586 EBV (A 31+) and T2 (non-A31) cells. TIL5 Stimulation of GM-CSF secretion by 86 was self-pulsed with peptide ORF3P. 586 EBV and allogeneic 1510 EBV (A31 +) cells Incubation significantly increased, but 586 EBV alone or ORF3P Increased when co-incubated with peptide-loaded T2 (non-A31) cells Did not add. FIG. 4B shows cytotoxic lysis of target cells by TIL586. 586 mel (-■-) and 397mel (-□-) used as positive and negative controls, respectively did. 586 EBV B cells were ORF3P (pep) and (−) as marked. ▲-), irrelevant peptide (ipep) (-●-), without peptide (-△- ) Incubate and T2 cells were pulsed with ORF3P (-O-). I After incubation, TIL586 was added and mixed with target cells. TIL586 Was measured in a 4 hour chromium release assay. FIG. 4C shows a peptide for sensitizing target cells for lysis by TIL586. 4 shows the titration of the metal concentration. 586 EBV cells were transformed into ORF3P (pep) (-▲-) Or serial dilutions of an irrelevant peptide (-ep-) and The ORF3P peptides were separately incubated for (-O-) for 90 minutes. TIL5 The cytolytic activity of 86 was obtained at an effector: target (E: T) ratio of 40: 1 for 4 hours. of⁵¹Evaluated in a Cr release assay. FIGS. 5A and 5B show unlabeled 586 EBV loaded with ORF3P peptide. By cell⁵¹4 shows inhibition of lysis of Cr-labeled target cells. FIG. 5A labeled 586 mel cells with chromium as a “hot” target for 90 minutes. Indicates that ORF3P (-▲-), irrelevant peptide (-△-) 586 EBV cells and T2 cells loaded with ORF3P peptide (-□-) Was used as a "cold" target cell. After cleaning, "hot" and "cold" The target cells were counted again and the 1: 1, 5: 1, 10: 1 and 20: 1 “calls” C. "/" Hot "ratio. Effector TIL586: "Hot" Target (E: T) added at a ratio of 20: 1. 4 hours incubation of chromium release After the measurement. FIG. 5B shows by TIL1200 that recognized gp100.⁵¹Cr labeled 624 Lysis of mel ("hot" label) was pulsed with an irrelevant peptide (-△-) 586 EBV pulsed with ORF3P (-▲-) compared to 586 EBV cells Indicates not inhibited by cells. "Cold" and "hot" targets Cells were mixed at the indicated ratios. Effector TIL1200: Hot Target (E : T) at a ratio of 30: 1. The cytolytic activity of TIL1200 was⁵¹C It was evaluated by the r-release activity. Figures 6A-6D show antigenic peptide T cell clones from the TIL586 cell line. Indicates recognition. T cell clones were generated from the TIL586 cell line. 586 EBV B cells were pulsed with ORF3P peptide or an irrelevant peptide. T cell cell Lawn or TIL586 cells were added and co-incubated. 586me 1, 397mel / A31⁺ Tumor and melanocyte NHEM680 cells And 1 × 10^Five Cells / wells were each cloned from a T cell clone, TIL586-C1. (FIG. 6A), TIL586-C4 (FIG. 6B) and TIL586-C6 (FIG. 6C). ) Or TIL586 (FIG. 6D) for 18-24 hours 1 × 10^Five Incubate with cells I was vate. The GM-CSF assay was performed as described in FIG. 1B. FIG. Various target cells and anti-cells by CTL clones derived from TIL586 Recognition of native peptides. T cell clones were subjected to limiting dilution from TIL586 cell line (1 Cells / well) and containing 6000 IU / ml IL-2 The cells were further expanded in V medium. CTL clone 586TIL-C1 and Claw GM-CSF secretion by melamine 4 was performed in a normal melanocyte cell line (HLA-A31 +). , 586 EBV B cells pulsed with ORF3P peptide or an irrelevant peptide Vesicles were measured after co-culture with 397 mel or 586 mel cells. FIG. TRP-2 as a novel tumor antigen recognized by CTL clone 4 Identification. GM-CSF release by CTL clone 4 was measured by MART-1, gp75. / Encodes TRP-1, gp100, tyrosinase, p15 and TRP-2 COS cotransfected with HLA-A31 cDNA together with the gene It was measured after co-culture with -7. Control stimulator cells included 586 mel and 397 m el, COS-7 alone and transfected with HLA-A31 cDNA COS-7 was included. FIG. TRP-2 gene deletion and subclone construction and T cell recognition. A full-length TRP-2 cDNA containing a 1557 bp open reading frame Show. Nucleotides from the 5 'untranslated region of the TRP-2 cDNA Numbered from Leotide. Subsequent deletion constructs and DNA fragments Cloning was made. The T cell recognition of each construct was determined by DNA fragmentation as described above. CT and COS-7 cotransfected with HLA-A31 gene It was measured after co-culture of L clone 4. FIG. TRP-2 antigenic peptides and partial coding sequences. TRP-2 inheritance The nucleotide and amino acid sequences of the offspring are shown. pTD4, pTA, pTD3 The length and 3 'end of the DNA fragment in pTK and pTK are indicated by arrows, and Ap Mark the restriction sites for aI, PstI and KpnI. Approved by CTL clone 4 The recognized antigenic peptide sequences are shown in bold and underlined. 11A to 11C. Characteristics of antigenic peptides recognized by CTL clone 4 Sign. FIG. GM-CSF release by T cells at different peptide concentrations. 586 EBV (A31 +)_197-205Pulse with peptide (----) and T 2 (non-A31) cells were transferred to TRP_197-205Peptides different for peptides (----) Pulse for 90 minutes. ORF3P as a control peptide was added to 586 EB Pulsed on VB cells (-△-). GM-CS by CTL clone 4 F release, TRP_197-205EBV B cells pulsed with and ORF3P And TRP_197-205After co-incubation with T2 cells pulsed at Specified. FIG. 11 (B). Markers for lysis by CTL clone 4 at different peptide concentrations Cell sensitization. 586 EBV B cells were transformed with TRP_197-205(−− ▲ −−), unrelated Incubate with the relevant peptide ORF3P (-△-) and T2 cells TRP at various peptide concentrations_197-205(−− ● −−). Pepti After incubation, target cells were labeled for 30 minutes. After washing, E: T ratio 40 : The cytolytic activity of CTL clone 4 at 1: 1 was determined for 4 hours between T cells and target cells. It was measured after the incubation. FIG. 11 (C). CTL black at different E: T ratios Lysis of target cells by Target 586 EBV cells are_197-205(−− ▲ -−) or unrelated peptide ORF3P (−−−−−) The target T2 cells to TRP_197-20590 minutes in with peptide (----) Cubbed. 586 mel (----) and 397 mel (-----) ) Were used as positive and negative controls, respectively.Detailed description of the invention The present invention relates to a cancer peptide, which is immunologically recognized by T lymphocytes of the immune system, Includes tumor antigens and parts, derivatives or variants thereof. The invention further provides , Cancer peptides or antigenic cancer epitopes contained in tumor antigens. antigen Sexual Cancer Epitope Specificizes Cell-Mediated Immune Response by Interacting with Immune System T Cells Is caused. Due to the interaction between antigenic cancer epitopes and T cells, T cells Reacts with and prevents, eliminates or reduces cancer in mammals, including. In one embodiment, a cancer peptide contained in a cancer peptide of the present invention and an anti-cancer peptide A primary cancer epitope is a normal protein or peptide whose cancer peptide is within Open reading of genes other than the open reading frame encoding Normal protein or peptide in that it is encoded by the It is distinguished from Pide. Cancer peptides and parts thereof are characteristically found in normal cells. Is absent or present at very low levels and high levels in precancerous and cancerous cells Exists in. High levels of expression of the cancer peptide are indicative of precancerous or cancerous cells from normal cells. Correlation with transformation into vesicles. The cancer peptide of the present invention may be used for primary or metastatic melanoma, thymoma, lymphoma. , Sarcoma, lung cancer, liver cancer, non-Hodgkin's lymphoma, Hodkin Lymphoma, leukemia, uterine cancer, cervical cancer, bladder cancer, kidney cancer, and adenocarcinoma Including, but not limited to, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, etc. Form part of or are derived from cancer. The term melanoma includes melanomas, metastatic melanoma, melanocytes Or melanoma, melanoma or melanoma derived from any of the melanocyte-related nevus cells Tumor, melanosarcoma, in situ melanoma, superficial diffuse melanoma, nodular melanoma , Mole malignant melanoma, terminal mole melanoma, erosive melanoma or These include familial atypical nevus and melanoma (FAM-M) syndrome It is not limited to. Of particular interest are autologous CTLs in patients with cancer, especially melanoma. Or a fragment or derivative thereof. Further interest Deep is recognized by MHC restricted CTL, especially MHC class I restricted CTL Cancer peptide, a fragment or derivative thereof. The "tumor antigen" of the present invention is a cancer or cancer capable of eliciting an antitumor response in mammals. Or an oncoprotein and any part of the cancer or oncoprotein . In one embodiment, the tumor antigen comprises the full length TRP-2 protein. The term "cancer peptide", as used herein, acts as a tumor antigen. Encompass any epitope or fragment of a cancer or oncoprotein . The term "fragment," as used herein, refers to a protein fragment. At least 5 or 6 amino acids for the gene and at least 1 amino acid for the gene Any segment of a protein or gene having from 5 to 18 nucleotides means. In one embodiment, the cancer peptide of the present invention comprises an alternative open library derived from a normal gene. Arising from the expression of the coding frame DNA sequence. Normal gene product is expressed Rather, it is recognized immunologically by T lymphocytes in an MHC restricted manner. The resulting cancer peptide is expressed. MHC restricted T lymphocytes are associated with cancer or precancerous Useful for identifying alternative open reading frame gene products. Of particular interest is TRP-1 (gp75); a mouse tumor suppressor INK. Protein p19 arising from the alternative reading frame of the 4a gene^ARF(Quell e, D.E. et al., Cell Vol. 83, pp993-1000, 1995); antigenic octapeptide SVVE FSSL, ie, JAL8, bm1 anti-B6 alloreactive bm1BZ19.4T Allogeneic peptides recognized by cells (Malarkannan, S et al., J. Exp. Med . Vol.182, pp.1739-1750, 1995) and the like. In one embodiment, the cancer peptide of the present invention, a fragment or derivative thereof, comprises Immunologically recognized by tumor penetrating lymphocytes (TILs) from breast cancer tumors Antigenic cancer epitopes. Of particular interest are cancer antigen-specific cytotoxic T cells. Antigenic cancer epitope (CD8⁺). In one embodiment of the invention, the cancer peptide comprises about 24 amino acids and is described in FIG. Derived from the same gene encoding tyrosinase-related protein 1 or Alternate open reading frame 3 DNA sequence from homologue or mutant Therefore, it is expressed. In one embodiment, the cancer peptide of the invention has the amino acid sequence: MXaaLQRQFLRTQLWDVPSWLERSCL (SEQ ID NO: 7) and (Where Xaa is Ser or Ala) ). A cancer peptide or a part thereof sharing partial sequence homology with SEQ ID NO: 6 Included within the scope of the invention. The partial amino acid sequence homology is as few as SEQ ID NO: 6. At least 85% sequence homology, preferably at least 95% sequence homology or Biological peptide that stimulates cancer antigen-specific T lymphocytes Having In one embodiment of the invention, the cancer peptide has the formula: MetXaaLeuGlnArgGlnPheLeuArg (SEQ ID NO: 8) and And its fragments and derivatives (Formula Xaa = Ser Or Ala). In another embodiment of the cancer peptide of the invention, the amino acid sequence: Including MSLQRQFLR (SEQ ID NO: 9) and fragments and derivatives thereof . In another aspect, the present invention relates to a cancer peptide contained in the tumor antigen of the present invention and an antigenic cancer antigen. Pitopes are mainly expressed in melanoma, normal melanocyte cell lines and retina Derived from the TRP-2 protein. The tumor antigens of the present invention are useful in pre-cancerous and cancer cells. Present at significantly lower levels in most normal cells than the elevated levels seen You. Elevated expression of tumor antigens correlates with transformation of normal cells into precancerous or cancerous cells I do. TRP-2 is located on human chromosome 13 and is a tyrosinase-related gene family. -Tyrosinase and gp75 / TRP-1 Share 40-45% amino acid sequence identity (Yokoyama et al. (1994); Bouchard Et al. (1994)). TRP-2 encodes a protein having 519 amino acids, Has DOPA chrome tautomerase activity involved in nin synthesis (Bouchard et al. (1994)). Of particular interest is autologous CTL in patients with cancer, especially melanoma. Is a cancer peptide of TRP-2 or a variant thereof. Further interest Tasty is recognized by MHC restricted CTL, especially MHC class I restricted CTL. Cancer peptide, a fragment or derivative thereof. Recognized by cancer peptide The preferred HLA subtype recognized is the HLA-A31 subtype. The present invention Is a potential tumor antigen recognized by HLA-A31 restricted T cells. TRP-2, melanoma / melanocyte component of tyrosinase protein family The identification of antigens. The TRP-2 gene product was obtained from CIL isolated from TIL586. It is the second tumor antigen recognized by the TL clone. In another aspect of the invention, the tumor antigen is a cancer peptide comprising about 9 amino acids, Gene encoding rosinase-related protein-2 (SEQ ID NO: 46) or FIG. 0 is expressed from its homologue or variant. In yet another aspect, a fragment of the TRP-2 protein or a functional Equivalent variants are used as cancer peptides. Preferably, the tumor antigen of the present invention Is a fragment of a TRP-2 protein comprising at least a portion of amino acids 197-205. Including ragments. Most preferably, the cancer peptide of the invention has the amino acid sequence: LL GPGRPYR and fragments or derivatives thereof. Amino acid 197- A cancer peptide sharing partial sequence homology with the region of TRP-2 containing Some of them are also included in the scope of the present invention. Partial amino acid sequence homology refers to LLG At least 85% sequence homology with PGRPYR, preferably at least 95% A peptide having sequence homology or higher, which means a cancer antigen-specific T lymphocyte Has a biological effect that stimulates Another aspect of the invention is that the homology of L is sufficient to effectively act as a cancer peptide. Includes cancer peptides having against LGPGRPYR. Such a peptide It may have conservative amino acid changes at one or more positions. Conservative amino acid changes Refers to the same type of amino acid change that exists naturally at a particular position, i.e., Hydrophobic amino acids change to hydrophobic amino acids, basic amino acids change to basic amino acids Change. Such amino acid changes can affect the overall charge of the peptide and It does not change the configuration significantly, and thus such variants maintain the anticancer activity of the cancer peptide. Carry. Examples of such conservative changes are well known to those skilled in the art and are within the scope of the present invention. You. Yet another aspect of the invention is derived from the LLGPGRPYR peptide, wherein It relates to several cancer peptides containing non-conservative amino acid changes at the above positions. like that Peptides have been identified in the present invention, LSGPGRPYR, KLGPGRPYR, LL Including but not limited to GPGFPYR and fragments and derivatives thereof. Not. The present invention relates to functionally equivalent variants of the TRP-1 or TRP-2 cancer peptide. I do. “Functionally equivalent variants” include peptides with partial sequence homology, 1 Peptides having specific conservative and / or non-conservative amino acid changes, Includes peptide conjugates, chimeric proteins, fusion proteins and peptide nucleic acids You. Cancer peptides, tumor antigens and their antigenic cancer epitopes are Can be purified and isolated from natural sources, such as from cell lines and the like. cancer The peptide and its parts are at least 90% pure, preferably at least 95% % Purity, and 100% purity. Cancer peptides and their antigenic epi Topes can also be produced by chemical synthesis or by recombinant DNA technology known in the art. Tsu Can also be obtained. J. Chemical synthesis technology M. Steward and J. D. Young, “Solid Phase Peptide Synthesis ”, W. H. Freeman & Co. , San Francisco, 1969; Bodansky et al., "Peptide Synthesis", John Wiley & Sons, 2nd ed., 1976. And J. Meienhofer, “Hormonal Proteins and Peptidea”, Vol. 2, p. 46, Acade mic Press, New York, 1983 and E. Schroder and K. Kubke “The Peptides” Vol. 1, Academic Press, New York, 1965. Cancer peptides and their antigenic cancer epitopes can be obtained by methods known in the art. And a pharmaceutical composition together with a pharmaceutically acceptable carrier. Main group The composition is useful as a vaccine to prevent or treat cancer. The composition is And at least one immunostimulatory molecule. Stimulates antigen-specific T cell responses Immunostimulatory molecules for use in combination with cancer peptides or portions thereof Are one or more major histocompatibility complex (MHC) molecules, such as class I and Including, but not limited to, class II molecules, preferably class I molecules. Book The composition further comprises B7. 1, B7. 2, ICAM-1, ICAM-2, LFA- 1, other stimulant molecules including LFA-3, CD72, etc., and IL-1 to IL -15, TNFα, IFNγ, RANTES, G-CSF, M-CSF, IFN α, CTAPIII, ENA-78, GRO, I-309, PF-4, IP-1 0, LD-78, MGSA, MIP-1α, MIP-1β, but not limited to these Cytokines, or combinations thereof, are not included for immune enhancement. It may be. The stimulatory molecules may be provided in physically separate forms, In the membrane of an antigen presenting cell, such as a page or dendritic cell, or in the membrane of a liposome. Or expressed on the surface of transduced or transfected cells. Is also good. DNA sequences of MHC immunostimulatory molecules are available from GenBank and others. You. Cancer peptides, tumor antigens and their antigenic cancer epitopes prevent cancer or Useful in methods for treating and detecting cancer or pre-cancer in mammals, including humans Useful in diagnostic assays for The cancer peptide or a part thereof is radiolabeled, Derivatives with other components attached to it, such as biotin, fluorescein, etc. It may be in a form. Allows specific targeting to specific organs, tumors or cell types The targeting substance that activates also attaches to the tumor antigen, cancer peptide, or part thereof. May be worn. Such targeting substances include hormones, cytokines Or a cell receptor. Cancer peptides, tumor antigens and some of them alone Alternatively, it can be prepared in the form of a kit in combination with other reagents. Another aspect of the invention is useful for inducing tumor-specific cell-mediated immunity to cancer. Vaccine. Approaches to cancer immunotherapy can be categorized as active or passive. Can be. Active immunotherapy involves attempts to enhance the immune response to tumors Directly immunizing cancer patients with cancer antigens. Passive immunotherapy Have anti-tumor responsiveness with the goal of directly mediating the anti-tumor response. Administering an immunological reagent such as an epidemic cell or an antibody. The first attempt at active immunotherapy involves either intact cancer cells or cancer cell extracts. That these substances contain tumor antigens in amounts and forms that can stimulate an immune response We used with expectation. However, the identification of cancer antigen molecules has New possibilities open up for developing immunotherapy for the treatment of cancer. The number of these attempts Some summaries are shown in Table 1. Table 1 Cancer treatment based on molecular identification of cancer antigens 1. Active immunotherapy with: a. Immunodominant peptide 1) alone 2) Combination with adjuvant 3) Binding to helper peptides, lipids or liposomes 4) Pulse on antigen presenting cells b. Immunodominant peptides by amino acid substitutions that increase binding to MHC molecules c. Protein alone or in combination with adjuvant d. "Naked" DNA encoding a cancer antigen 1) "Gene gun" for intradermal injection 2) Intramuscular injection 3) Binding to lipid e. Recombinant virus such as vaccinia, fowlpox or adenovirus that encodes 1) Cancer antigen alone 2) Gene encoding cancer antigen + cytokine, costimulatory molecule, or immunity Other genes that enhance the epidemiological response f. BCG, Salmo encoding cancer antigens alone or in combination with immunostimulatory molecules Recombinant bacteria such as Nera or Listeria 2. Active immunotherapy (as described above) with administration of immunostimulatory cytokines 1. IL-2 2. IL-6 3. IL-10 4. IL-12 5. IL-15, etc. 3. Passive immunotherapy with antitumor lymphocytes generated by in vitro sensitization following TIL or PBL 1. Immunodominant peptide pulsed on antigen presenting cells (producing CD8 cells) 2. Antigenic protein (CD4 cells co-incubated with antigen presenting cells) Exogenous antigen presentation pathway that produces E. FIG. E. coli, yeast, or baculovirus Insertion of the encoding gene translates into large amounts of purified tumor antigens for use in immunization Provide the opportunity to get Alternatively, immunodominant peptides from these tumor antigens Can be easily synthesized in vitro, alone or in adjuvant, lipid / liposome Or improve their immunogenicity, such as in combination with binding to helper peptides Can be purified in large quantities for immunization in a form intended to It can be pulsed onto the original presentation cells. To improve the binding efficiency to MHC antigens Modification of individual amino acids in immunodominant peptides for comparison with natural peptides Can potentially increase immunogenicity. Recent techniques using "naked" DNA injected directly into muscle or skin are: Enhancing both cellular and hormonal immune responses to encoded antigens (Cooney, E. L. , A. C. Collier, P. D. Greenberg, R. W. Coombs, J. Zarli ng, D. E. Arditti, M. C. Hoffman, S. L. Hu and L. Correy, 1991, Lancet 337: 567; Wolff, J. A. , R. W. Malone, P. Williams, W.S. Chong, G. Acsadi, A .; Jani, And P. L. Felgner, 1990, Science 247: 1465; Davis, H. L. , R. G. Whalen, and B. A. Demeniex, 1993, Hum. Gene Ther. 4: 151; Yang, N. S. , J. Burkholder, B . Roberts, B Martinelli, and D.M. McCabe, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 7: 9568; Williams, R. S. , S. A. Johnston, M. Riedy, M. J. Devlt, S. G. McElligo tt, and J. C. Sanford, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2726; Fynan, E. R. , Webster, D. H. Fuller, J. R. Haynes, J. C. Santoro, and H. L. Robinson, 199 5, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11478; Eisembraum, M. D. , D. H. Fuller, and J . R. Haynes, 1993, DNA and CellBio. 12: 791; Fuller, D. H. And J. R. Haynes , 1994, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 (11): 1433; Acsadi, G. , G. Dickson, D. R . Love, A. Jani, F. S. Walsh, A .; Gurusinghe, J. A. Wolff, and K. E. Davies 1991, Nature 352: 815). Ready to use non-viable DNA vectors It has the advantages of ease of administration and safety of administration. Alternative nucleic acid sequences of the invention are directed against cancer Useful as an immunogen or as a DNA vaccine. TRP-1 of the present invention Alternative open reading frame nucleic acid sequence or TRP-2 protein of the invention DNA sequences encoding proteins or peptides trigger cellular responses to cancer cells. The amount of gene gun Can be used for administration. Nanogram quantities are useful for such purposes It is. Effective forms of immunization include recombinant cells such as BCG, Salmonella or Listeria. Recombinant virus such as vaccinia, fowlpox or adenovirus in bacteria And incorporating a gene encoding an immunogenic molecule therein. Encodes a cancer antigen Genes, either alone or after encoding an immunostimulatory molecule, or Can be co-expressed with other genes that can enhance the immune response . Studies with a model tumor antigen in a mouse model have been performed with interleukin-2 (IL -2) or B7. Increased immunogenicity of model tumor antigens by incorporation of one gene Can even mediate the decline of established pulmonary metastases with these antigens And can even mediate the decline of established pulmonary metastases with these antigens showed that. Such as IL-2, IL-6, IL-10, IL-12 or IL-15 Improving the immune response using active immunotherapy with outpatient administration of immunostimulatory cytokines You can also. Genetically modified immune cells that can recognize human tumor antigens (usually Immunization with cancer regression in selected patients with metastatic melanoma Useful for mediating lines. Tumor with human lymphocytes presented on antigen presenting cells In vitro techniques have been developed to sensitize antigen immunodominant peptides in vitro. You. The gene encoding human tumor antigen is cloned by repeated in vitro stimulation. Recognizes human tumor antigens much larger than the TIL used to clone Capable cells can be induced. That is, repeated a In vitro sensitization, lymphocytes that are 50 to 100 times more potent than TIL Could be guided. Adoptive transfer of these cells is more likely than normal growth of TILs. May be more effective at mediating tumor regression in vitro. In a method of preventing or inhibiting cancer, a cancer peptide or a portion thereof is administered intravenously. , Intramuscular, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, intrathecal, intrapleural, intrauterine, rectal, vaginal, topical Administered through one of a number of routes, including but not limited to intratumoral be able to. Administration can be by transmucosal or transdermal means. Mucosal passage or skin For transdermal administration, penetrants appropriate to the barrier to be permeated are used in the formulation. So No Such penetrants are generally known in the art, and include, for example, biliary administration for transmucosal administration. Juice salts and fusidic acid derivatives are included. In addition, use cleaning agents. To facilitate penetration. For transmucosal administration, for example, nasal spray Or by suppository. For oral administration, cancer peptides, tumor antigens , Some or variants of which are usually found in capsules, tablets and toxics Is formulated into an oral dosage form. Generally, at least about 1 pg per kg of body weight of the subject, preferably at least about 1 ng / g, more preferably at least about 1 / kg body weight It is desirable to supply a dose of at least μg of the cancer peptide or a part thereof to the subject. No. A range of about 1 ng / kg to about 100 mg / kg body weight is preferred. However, lower or higher doses can be administered. For administration More clonal expansion of cancer antigen-specific T lymphocytes, preferably cytotoxic T lymphocytes Effective in initiating, stimulating and / or causing tonicity, which are then Cancer can be prevented or inhibited in a subject. The dosage may be administered at least once, as a bolus or as a continuous dose. May be supplied. Multiple doses over weeks to months are preferred Maybe. Subsequent administrations can be administered as indicated. In the method of treatment, a vaccine containing a cancer peptide or a part thereof is administered in an effective amount. Administered to mammals to prevent cancer in mammals. Of particular interest is the melanoma Cancer peptide encoded by ORF3 of TRP-1 gene for prevention Is a vaccine containing a part of it. Of particular interest is the prevention of melanoma. One or more peptides encoded by fragments of the TRP-2 gene for Vaccine. In a method of reducing tumor burden in an animal having a tumor, the method comprises: Administering an effective amount of an antigenic cancer epitope to the site of tumor burden, the amount of Is effective in reducing the size of the tumor at that site. Another method of treatment involves autologous cytotoxic lymphocytes or tumor-penetrating lymphocytes. It can be obtained from a patient with cancer. Lymphocytes are grown in culture and specific Cancer peptide or antigenic cancer epitope alone or with cytokine Less Cancer antigen by culturing in the presence together with one immunostimulatory molecule Inflate specific lymphocytes. Antigen-specific lymphocytes then reduce the patient's tumor Or injected back into the patient in an amount effective to eliminate. After immunization, the efficacy of the vaccine is determined by the specific lytic activity, specific cytokine production Recognizes cancer antigens as assessed by tumor regression or a combination of these Can be evaluated by the production of immune cells. If the mammal to be immunized has cancer or If already afflicted with metastatic cancer, the vaccine may be immunized with an immunomodulator such as I L-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-15, interferon, Other therapeutic treatments such as tumor necrosis factor, chemotherapeutic agents such as cisplatinum, cancer Rovir and other antivirals, amphotericin B, antibiotics, etc. Can be given. Another aspect of the invention relates to an open protein encoding a normal protein or peptide. Alternative open reading frame for genes other than the reading frame DNA sequence Wherein the alternative open reading frame DNA sequence is Encoding a cancer peptide and a part thereof immunologically recognized by T cells of the system The above DNA sequence. The alternative open reading frame DNA sequence is the TRP-1 gene, TRP -2, including, but not limited to, DNA sequences from the INK4a gene, etc. Not. Interestingly, alternative open reading frames from melanoma forming genes The DNA sequence. The melanoma forming genes are MART-1 / MelanA, Tyrosinase, gp100, gp75 (TRP-1), TRP-2 (Helahan, R 1993 J. et al. Invest. Dermatol. 100 (Suppl. ): 176S-185S) etc. Including but not limited to genes. One embodiment of the present invention provides a gene sequence encoding a tyrosinase-related protein. Alternative open reading frame DNA sequence encoding a cancer peptide from within Or part of it. The gene sequence of TRP-1 is described in Vijayasaradhi, S .; Other (199 0, J. Exp. Med. 171: 1375-80), accession number X51 455, and Cohen, T .; 1990 Nucleic Acids Research, VOL. 18: 2807 Described in EMBL accession number X51420, as Data banks. In one embodiment, the alternative open reading frame DNA sequence is A cancer peptide recognized by a cancer antigen-specific T lymphocyte, including an infiltrating lymphocyte, or Is the ORF3 of FIG. 2 having SEQ ID NO: 5, encoding a portion thereof, a portion thereof And functionally equivalent sequence variants thereof. Complementary to ORF3 described in FIG. As well as anti-complementary nucleic acid sequences are included in the present invention. In another embodiment, the alternative open reading frame DNA sequence is ATGTCACTGCAACGGCAATTTCTCAG (SEQ ID NO: 10) Including. One aspect of the invention is a portion of TRP-2 encoding one or more cancer peptides. You. The gene sequence of TRP-2 was obtained as described in Yokoyama et al. (1994). Session number D17547 and as described in Bouchard et al. (1994). Disclosed to GeneBank under the umbrella cushion number S69231. . In one embodiment, the TRP-2 gene fragment is LLGPGRPYR And cancer recognized by cancer antigen-specific T lymphocytes including tumor-infiltrating lymphocytes It encodes a functionally equivalent sequence variant for the peptide. LLGPGR Complementary and anti-complementary to the sequence encoding PYR and its equivalent sequence variants Nucleic acid sequences are also included in the present invention. In another embodiment, the DNA sequences encoding the TRP-2 protein are all Expresses at least a part thereof. Preferred fragments of the TRP-2 gene are PstI site at leotide position 947 and KpnI site at nucleotide position 1080 Including the area between. Another preferred fragment of the TRP-2 gene is TTATTAGGACCAGGACGCCCCTACCAGG including. Due to the degeneracy of the genetic code, deformation of the DNA sequence results in equivalent translation of the cancer peptide Will be. As a result, cancer cells whose replacement is recognized by cancer antigen MHC restricted T cells Such substitutions are included within the scope of the invention, as long as they result in the expression of the peptide. Departure Wrapped in light One substitution involved was GCT encoding Ala of TCA encoding Ser. , GCC, GCA or GCG. Homo from other nursing species Logs are included within the scope of the present invention. Alternative open reading frame DNA such as from TRP-1 gene etc. All or part of the sequence can be used as a probe to target cancer peptides of other mammalian species. Mologs can be identified and isolated. Similarly, the entire TRP-2 gene Or use as a probe to identify homologues of cancer peptides from other mammalian species And can be isolated. In one embodiment, a mouse cDNA sequence is used. To screen a mammalian cDNA library for human homologous nucleic acid sequences You. Positive clones are selected and sequenced. Can synthesize cDNA library Examples of tissue types include dermis, epidermis, solid tumor, melanoma, melanocytes, etc. But are not limited to these. One skilled in the art can use You will understand the suitable hybridization conditions to use. Nucleic acid hybridizer The conventional method of construction, library construction and cloning techniques is Samb rook et al. (eds) (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual '' Cold Spr ing Harbor Press, Plainview, New York and Ausubel et al. (eds) "Current Pro tocols in Molecular Biology "(1987), John Wiley and Sons, New York, N ew York. Another aspect of the present invention is directed to TRP- in a biological sample isolated from a mammal having cancer. 1. Detection and detection of RNA that transcribes cancer peptides such as TRP-2 cancer peptide And nucleic acid probes for quantification. RNA levels relative to control RNA samples The changes are useful in the diagnosis and prognosis of mammalian diseases. In one embodiment, the mRNA is administered to a patient suspected of having cancer or precancerous. It is derived from tissue and compared to mRNA from healthy control subjects. Compared to the control , An alternative open reading frame mRNA encoding a cancer peptide in a patient A quantitative and / or qualitative increase in is an indicator of cancer or precancerous in the patient. mR NA is measured using an oligonucleotide probe that can hybridize to mRNA. Can be detected. In one embodiment, the probe is a transcript of ORF3 of TRP-1 And hybridize. Another aspect of the present invention is directed to TRP- in a biological sample isolated from a mammal having cancer. 2 Nucleic acid probe for detection and quantification of RNA that transcribes tumor antigens. versus Changes in RNA Levels for Controlled RNA Samples Are Diagnosed and Prognosed for Neonatal Diseases It is useful in In one embodiment, the TRP-2 mRNA is suspected of having cancer or precancerous. Compared to TRP-2 mRNA from healthy control subjects, derived from the patient's tissue I do. Quantitative and / or quantitative determination of TRP-2 mRNA in a patient as compared to a control Sexual gain is an indicator of cancer or precancerous in the patient. mRNA is an oligonucleotide It can be detected using a probe. Oligonucleotide pairs based on the sequence encoding the cancer peptide or part thereof Use the combination as a PCR primer to amplify a selected RNA sequence Biological test using reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) MRNA in the sample can be detected. The present invention also relates to a cancer peptide or one thereof. Situ PCR for the detection of DNA and RNA encoding It also includes in situ RT-PCR. The technology uses a copy number of the target nucleic acid. Very low or preferred when different types of nucleic acids must be distinguished No. The method is particularly useful for detecting and distinguishing precancerous and cancerous cells from normal cells It is. The present invention relates to an antigen-specific T cell comprising the generation of a nucleic acid-deleted fragment derived from a gene. And a method for identifying an antigenic cancer epitope reactive with the antigen. Deletion fragment In a suitable vector, which is then placed into a host cell for expression of the nucleic acid product. Transfect or transduce. In some cases, the host cell may supply an immunostimulatory molecule. May also be expressed. Cancer antigen-specific T cell responses are host cells expressing deletion products It is measured in the presence of If the host cell expresses only the deletion product, the immunostimulatory molecule may be replaced with B cells, macrophages. Transfer by antigen-presenting cells such as phages, dendritic cells, or with stimulatory molecules Can be supplied by the injected cells. In one embodiment, the immune The stimulatory molecule is an MHC class I molecule. Mapping using this approach allows for the identification of cancer peptides or antigenic cancer Determining an alternative open reading frame DNA sequence encoding a pitope . An alternative method of identifying cancer antigens and antigenic cancer epitopes is to generate synthetic peptides. Pulsing antigen presenting cells with the synthetic peptide, and the peptide Protopresenter cells were added together with antigen-specific T cells and peptide-pulsed anti- By measuring the antigen-specific response of T cells in the presence of primitive presenting cells. Antigen specific Synthetic peptides that produce a specific T cell response include the antigenic cancer epitopes of the invention. The present invention also provides an alternative open encoding a cancer peptide or antigenic cancer epitope. And vectors containing the reading frame DNA sequence. In some cases, The vector may also comprise a DNA sequence encoding at least one immune stimulating molecule. it can. In one embodiment, the vector comprises ORF-3 of the TRP-1 gene . The present invention also relates to the TRP-2 gene encoding the tumor antigen of the present invention and its FRP gene. Vector containing the fragment. Optionally, at least one vector And DNA sequences encoding the co-immunostimulatory molecules. Eukaryotic expression vectors include retrovirus vectors, vaccinia virus vectors -, Adenovirus vector, herpes virus vector, fowlpox virus vector -, Baculovirus vector, human papillomavirus vector, equine encephalitis vector Virus, influenza virus vectors, etc. . The present invention encodes a normal protein or peptide from the same gene Alternatives to genes other than the open reading frame nucleic acid sequence used for Cancer peptide encoded by the open reading frame nucleic acid sequence or its And a novel recombinant virus that expresses a portion of E. coli. In another aspect, the invention This depends on the nucleic acid sequence of the TRP-2 gene or a fragment or variant thereof. Novel recombinant virus expressing TRP-2 tumor antigen encoded by You. The recombinant virus may express at least one immunostimulatory molecule. Braid Recombinant viruses are used to prevent or treat cancer in mammals, especially humans. A cell-mediated immune response can be elicited or up-regulated in mammals. The recombinant virus may be alone or with one or more genes encoding immunostimulatory components. Together, nucleic acid sequences encoding a cancer peptide, a portion thereof, or an antigenic cancer epitope The sequence is incorporated into the genome or a part thereof. In one embodiment, the combination The recombinant virus has a nucleic acid sequence encoding a TRP-1 oncopeptide or a portion thereof. That geno In the system. In another embodiment, the recombinant virus is alone or in combination. Together with one or more genes encoding immunostimulatory molecules, a TRP-2 tumor antigen or Integrates the nucleic acid sequence encoding the variant into its genome or a portion thereof I have. A host cell infected with the recombinant virus may contain a cancer peptide, a portion thereof, or Expresses an antigenic cancer epitope alone or together with at least one immunostimulatory molecule You. Construction and expression of foreign gene products from recombinant vaccinia virus vectors The method for this is described in Perkus et al., Science 229: 981-984, 1985, Kaufman et al., Int. J. Cancer 4 8: 900-907, 1991, Moss Science 252: 1662, 1991, Smith and Moss BioTechniq ues Nov / Dec, p. 306-312,1984, and U.S. Pat. No. 4,738,846. Have been. Sutter and Moss (Proc. Natl. Acad. Scl. U. S. A. 89: 10847-10851, 1992 ) And Sutter et al. (Virology 1994) find use in the present invention as viral vectors. Non-replicating recombinant ankara virus (MVA, modified vaccinia ankara) ) Are disclosed for construction and use as vectors. Baxby and Paoletti (V accine 10: 8-9, 1992) for use as a viral vector in the present invention. Non-replicating proxies including canary pox virus, fowlpox virus and other bird species Disclosed is the construction and use of proxvirus as a vector. The vectors of the present invention are suitable for expressing cancer peptides or antigenic cancer epitopes. It can be placed in a suitable host cell. Eukaryotic host cell lines include COS cells, CHO Cells, HeLa cells, NIH / 3T3 cells, insect cells, dendritic cells, etc. Including, but not limited to, indicator cells. In some cases, the host cell Offspring can also be expressed. The host cell has a cancer peptide or antigenic cancer epitope When expressed together with at least one MHC molecule, a eukaryotic expression system may be used. Preferably, appropriate glycosylation is performed. Cancer antigens and immune stings by host cells The expression of both macromolecules allows the MHC restriction peptide required for specific T cells to A suitable signal to T cells is provided to aid antigen recognition and proliferation, or The clonal expansion of antigen-specific T cells is aided. The overall result is an improvement in the immune system. Adjustment. Up-regulation of the immune response kills or inhibits cancer or precancerous growth It is evident by the increase in cancer antigen-specific cytotoxic lymphocytes that can be performed. DNA can be transfected, transduced, and resected by methods known in the art. Po (Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning A Laboratory Manual ", Cold Spring Harbor press, Plainview, New York). For liposomes, for example, neutral phosphorus, which is a polycationic lipid Complexed with lipid dioleoylphosphatidyl-ethanolamine (DOPE) Dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethylammonium ( Cationic lipids such as DMRIE) are preferred; G. Et al., 1992, Hum. Gen e. Ther. 3: 367-275; Nabel, G. J. Et al., 1992, Hum. Gene Ther. 3: 649-656; Stewart, M. J. Et al., 1992 Hum. Gene Ther. 3: 399-410; Nabel, G. J. 1993 Proc. Natl. Acad. Sc i. USA 90: 11307-11311; and Harrison, G. S. 1995 BioTechniques 19: 816-82 3 as disclosed. Recombinant oncoprotein, tumor antigen or antigenic cancer expressed by host cells Epitopes can be lysed by standard protein purification methods known in the art. Alternatively, it can be purified from the cell supernatant. These include molecular sieves Chromatography, ion exchange chromatography, isoelectric focusing, Electrophoresis, affinity chromatography, HPLC, reverse phase HPLC, etc. Including, but not limited to, Ausubel et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, NY). Immune affinity Chromatography was described herein as an immunoaffinity reagent. For purification using anti-cancer protein antibodies or antigen-binding fragments thereof Can also be used. Recombinant viruses can also be used as therapeutics or vaccines. Such use About 10 subjects^FiveFrom about 10^TenPlaque-forming unit / mammalian mg It is desirable to supply a dose of recombinant virus, but lower or more Higher doses can be administered. Recombinant viral vectors can be used either prior to evidence of cancer, such as melanoma, or Introduced into mammals to mediate regression of disease in mammals with cancer such as norma can do. As an example of a method for administering a viral vector to a mammal Are exposing cells to the recombinant virus ex vivo, or Injection of recombinant virus into a living tissue or intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, etc. Virus throw But not limited thereto. Alternatively, a recombinant viral vector Or a combination of recombinant virus vectors in a suitable pharmaceutically acceptable carrier Can be administered locally by direct injection or local administration to cancerous lesions in You. The amount of recombinant viral vector with the nucleic acid sequence in question depends on the power of the virion. Based on value. The preferred range of immunization is per mammal, preferably per human About 10^FiveFrom 10^TenVirus particles. The cancer antigen epitopes of the present invention that are involved in tumor rejection are specifically disclosed herein. It is not limited to that. Using the method disclosed in the present invention, an alternative open read Other cancer antigen epitopes contained in the (Van der Bruggen, P. et al. 1991 Science 254: 1643-47; Gaugle r, B et al. 1994 J. Exp. Med. 179: 921-30; Boel, P.R. Et al. 19951 Immunity. 2: 167-75; Bri chard, V et al. 1993, J. Exp. Med. 178: 489-95; Robbins, P.F. Et al., 1994, Cancer R esearch 54; 3124-26; Kawakami, Y. et al. 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 351 5-19; Coulie, P.G. et al. 1994 J. Exp. Med. 180: 35-42; Bakker, A. et al. Exp.Me d.179: 1005-09), for example, MART-1 / MelanA (Kawakami, et al., J. Exp. Med. .180: 347-352, 1994), MAGE-3 (Gaugler et al., J. Exp. Med. 179: 921-930, 1). 994), gp100 (Kawakami, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 6458-6462, 1994), tyrosinase (Brichard et al., J. Exp. Med. 178: 489, 1993), TRP-2, CEA, CA-19-A, A-125, PSA, erb-2 (Boon et al., Ann. Rev. Immunol. 12: 337, 1994). Tumor penetrating lymphocytes (TILs) from tumor-bearing patients are MHC) recognizes tumor-associated antigens presented by class I molecules. Interlo TIL586 together with Ikin-2 (IL-2) self with metastatic melanoma When injected into the patient of origin, a major objective regression occurred. Recognized by TIL586 The gene encoding the isolated tumor antigen has recently been isolated and encodes gp75 It has been shown. The present invention relates to TIL586, which is not derived from the normal gp75 protein. Of an antigenic peptide, MSLQRQFLR (SEQ ID NO: 9), recognized by And isolation. Instead, this 9-mer peptide is an alternative open source of the same gene Ding frame translation. That is, the gp75 gene has two completely different Polypeptide, ie, Gp as antigen recognized by IgG antibodies in serum from patients with cancer 75 and the 24 amino acid product as a tumor rejection antigen recognized by T cells Code. This is because human tumor rejection antigen encodes a normal protein Normal cellular inheritance using open reading frames other than those used It represents the first demonstration of what can be generated from a child. These findings suggest that tumors Tumor antigens useful as vaccines to induce tumor-specific cell-mediated immunity A new mechanism for generation has been revealed. The method of ExoIII / S1 deletion analysis shows that the cancer epitope is small in the gp75 gene. Localized to DNA fragment. Cancer epitope on normal gp75 protein I was absent. The cancer peptide of the present invention recognized by TIL586 has a normal Alternative open reading frame for the same gene encoding gp75 protein Derived from the gene product translated from the gene. For nucleotides 294-296 Ability to replace ATG with ATC to stimulate cytokine release from TIL586 A complete loss of force has occurred. Cold-target inhibition experiments show that identified cancer epitopes Compete for T cell recognition by naturally processed peptides present on tumor cells It shows that you can do it. Six T cell clones generated from the TIL586 cell line 586 mel tumor cells, 586 EBV B cells pulsed with this peptide, And normal melanocytes can be recognized in an HLA-A31 restricted manner, and Gene product encoded by the alternative open reading frame It is also suggested that they may be present in normal melanocytes. The present invention also provides a TRP-encoding tumor antigen recognized by TIL586. 2 which has been shown to encode 2. The present invention also relates to TRP-2. And identification and identification of the antigenic peptide LLGPGRPYR that is active as a cancer vaccine. And isolation. The present invention provides an alternative open reading encoding a cancer peptide or a portion thereof. A transgene that incorporates one or more copies of the frame DNA sequence into its genome. Provide genic animals. The present invention also provides a TRP-2 tumor antigen or a portion thereof. A chromosome that incorporates one or more copies of a DNA sequence encoding Provide transgenic animals. Common methods for producing transgenic animals , Krimpenf ort et al., U.S. Patent 5,175,384, Leder et al., U.S. Patent 5,175,383, Wagner et al., U.S. Patent 5,175,385; described in Evans et al., U.S. Patent 4,870,009 and Berns U.S. Patent 5,174,986 Have been. Gene incorporation can lead to overexpression of multiple forms or variants of the cancer peptide This results in altered expression or expression. The transgenic animal obtained Useful in studying the development of light cancer or tumor antigens. Animal models for cancer treatment Useful in screening vaccines and chemotherapeutics. Transgenic Animals are also useful in cancer development studies. The present invention further provides for the immunization of a cancer peptide or antigenic cancer epitope of the present invention. Antibodies or antigen-binding portions thereof. Cancer peptide or antigenicity If the carcinoma pitope consists of only a few amino acids, the cancer peptide or antigenic cancer Pitopes can be conjugated to a carrier protein to elicit an antibody response You. Carrier proteins such as KLH or tetanus toxin and methods of conjugation are known in the art. It is known. Antibodies specific for the cancer peptides and antigenic cancer epitopes of the invention Reacts or binds with it. Exemplary antibody molecules are intact immunoglobulin molecules, substantially intact immunoglobulins. A phosphorus molecule or a portion thereof of an immunoglobulin molecule containing an antigen binding site , F (ab), F (ab '), F (ab')_Two , A humanized chimeric antibody, and F (V) includes some of the immunoglobulin molecules known in the art. Polyclaw Null or monoclonal antibodies can be made by methods known in the art (Kohl er and Milstein (1975) Nature 256, 495-497; Campbell "Monoclonal Anti body Technology, the Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas '' in Burdon et al. (Eds.) (1985), `` Laboratory Techniques in Bioch emistry and Molecular Biology, Vol. 13, Elsevier Science Publishers, Musterdam). Antibodies or antigen-binding fragments are produced by genetic engineering. You can also. Techniques for expression of both heavy and light chains are described in PCT Patent Application, Publication numbers WO901443, WO901444, Huse et al. (1989) Science 246: 12 75-1281, and U.S. Pat. No. 4,946,778. In one embodiment, the antibodies of the invention are used in immunoassays to determine TR Detection of cancer peptide containing P-1 peptide and TRP-2 tumor antigen or a part thereof Out I do. From mammals with cancer using antibodies or antigen-binding fragments thereof Can be detected in a tissue biopsy sample. Evaluation of cancer antigens in diseased tissues Can be used to predict disease progression in mammals or to diagnose the effects of treatment There are cases. Immunoassays include radioimmunoassay, western blot analysis, and immunofluorescence analysis , Enzyme immunoassay, chemiluminescent analysis, immunohistochemical analysis, etc. In vitro, in vivo or in situ. ELISA Standard techniques known in the art for "Methods in Immunodiagnosis", 2nd edition, Rose and Bigazzi eds. John Wiley & Sons, 1980; Campbell et al. "Methods and I mmunology ", W.A. Benjamin, Inc., 1964; and Oellerich, M. 1984, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22: 895-904. Ha is the conventional method for immunohistochemistry rlow and Lane (eds) (1988), Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spri ng Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; Ausbel et al. (eds) 1987 "Curre nt Protocols in Molecular Biology, ”John Wiley and Sons (New York, NY )It is described in. Biological samples suitable for such detection assays include cells, tissues and cells. Woven biopsy, including whole blood, plasma, serum, sputum, cerebrospinal fluid, pleural fluid, urine, etc. Are not limited to these. The antibodies and antigen-binding fragments of the invention can also be used in immunotherapy. Antibody Or its antigen-binding fragment prevents the degree, extent or duration of cancer symptoms. Provided to the mammal in an amount sufficient to stop, reduce or attenuate. All references and patents cited are incorporated herein by reference. Although the invention has been described above with respect to certain specific embodiments, many variations are possible. And that alternative materials and reagents can be used without departing from the invention. It is understood that In some cases, such transformations and replacements may May require testing, but only includes regular testing. The above description of certain embodiments fully illuminates the general nature of the invention, and others disclose: By applying current knowledge, such departures can be made without departing from general concepts. Certain aspects can be easily modified and / or adopted for various applications, and Adoption and improvement such as are included within the meaning and equivalent scope of the disclosed embodiment. Is intended.Example 1 Materials and methods Chemicals and reagents The following chemicals and reagents were purchased from the indicated sources: RPMI 1640, AIM -V medium, Lipofectamine, G418 (GIBCO BRL, Ga itersberg, MD); eukaryotic cell expression vector pCR3 (Invitr Ogen, San Diego, CA); anti-HLA-A31 monoclonal anti- Body (One lamda, Canada Park, CA); Anti-immunoglobulin M antibody conjugated with sothiocyanate (Vect or Laboratories, Inc. , Burlingame, CA). Cytotoxic T lymphocytes (CTL) and cell lineages TIL586 was isolated from tumor specimens of patients with metastatic melanoma and IL 32-60 days in medium containing -2 (600 OIU / ml) (Chiron) While grown as previously described (Topalian, S., D. Solomo). n, F. P. Avis, A .; E. FIG. Chang, D.C. L. Freesen, W.C. M. Linehan, M .; T. lotze, C.I. N. Robertson, C.I. A. See Seipp, P .; Simon, C .; G. FIG. Simpson and S.M. A. Ros enberg, 1988,J. Clin. Oncol. 6: 839-53). T IL586 is mainly CD8⁺T cells. TIL1200 is TIL586 Were grown under the same conditions as described for T cell clone is TIL586 Obtained by limiting dilution from cell lines, then 6000 IU / ml IL-2 Expanded in the containing AIM-V medium. Melanoma cell line 397mel, 397mel / A31,586mel, 6 The 24mel and EBV transformed B cell lines 586 EBV and 1510 EBV were Established in the laboratory, RPMI 164 containing 10% fetal calf serum (FCS) 0 medium. Normal cultured melanosa derived from infant foreskin (NHEM680 purchased from Clonetics, CA) is a melanocyte Cultured in growth medium (MGM; Clonetics, CA). COS7 cell line Toshi W. Courtesy of Dr. Leonard (NIH). GM-CSF secretion assay DNA transfection and GM-CSF analysis were performed as described above. (Wang, RF, PF Robbins, Y. Kawakami, X . Q. Kang and S.M. A. Rosenberg, 1995,J. Exp. Me d . 181: 799-804). Briefly, DNs containing different fragments A200 μg and 50 ng of HLA-A31 DNA in 100 μl of DMEM Of lipofectamine for 15-45 minutes. DNA / Lipofe The ctamine mixture was then added to COS-7 (5 x 10^Four) Incubate with cells overnight I did it. The next day, cells were washed twice with DMEM medium. TIL586 to 1 1x10 in AIM-V medium containing 20 IU / ml IL-2^FiveCells / hole Was added. After 18-24 hours of incubation, 100 μl of supernatant The GM-CSF was collected in a standard ELISA assay (R + D System). s, Minneapolis, MN). For the peptide, 586 EBV, 1510 EBV and T2 cells at 37 ° C. with peptide for 90 minutes After incubation, AIM-V containing 120 IU / ml IL-2 Washed three times with medium. Add TIL586 and ink for another 18-24 hours And 100 μl of the supernatant was collected for the GM-CSF assay. ExoIII / SI deletion construction and PCR fragment To make a series of deletions, the poDNA776 plasmid DNA was replaced with XbaI. Digested with α-phosphorothioate deoxyribonucleotide triphosphate And blocked ExoIII nuclease digestion. pcDNA7 76 plasmid contains a 2.4 kb DNA fragment and CMV to direct transcription. It is a derivative of pcDNA3 vector containing a promoter. Linear exposing the DNA to Xhol digestion with a second restriction enzyme, At one end. ExoIII nuclease / Mung Bean nuclease The deletion was performed according to the manufacturer's instructions (Stratagene, CA). The detailed protocol is as follows: 1. Digest 10 μg of DNA with XbaI and add α-phosphorothioate Filled with deoxyribonucleotides. 2. After digesting the DNA with the second enzyme XhoI, phenol extraction and Ethanol precipitation was performed. 3. The DNA pellet was dried and 125 μl of 2 × Exo buffer, 25 μl Of 100 mM β-mercaptoethanol in 100 μl of water Was. 4. Once all aliquots have been removed and placed on dry ice, The tube was heated at 68 ° C. for 15 minutes and then placed on ice. 5. Add 15 U of Mung Bean nuclease to tubes at each time point (1 × Mung Bean dilution buffer) and add to 30 ° C. And incubated for 30 minutes. 6. Added the following: 4 μl of 20% SDS 10 μl of 1 M Tris-HCl, pH 9.5 20 μl of 8M LiCl 250 μl buffer equilibrated phenol: chloroform 7. Vortex sample, spin in microfuge for 1 minute, Remove the upper aqueous layer, extract with chloroform, and remove the Mung Bean Protein was extracted from the DNA. 8.25 μl of 3M NaOAc (pH 7.0) was added to the aqueous phase. 10 ng / tRNA to a final concentration of μl was used as carrier for precipitation. 9.650 μl of cold ethanol was added. Sample on dry ice for 10 minutes Cooled quickly and spun in a microfuge for 20 minutes. 10. The supernatant was drained and the pellet was washed with 80% ethanol. 11. The pellet was dried. 12. 15 μl of 10 mM Tris-Cl (pH 7.5) Redissolved in 0.1 mM EDTA. B. Ligation 13. The DNA deletion was ligated using the following conditions. 1.0 μl Exo / Mung treated DNA 2.0 μl of 10 × ligation buffer 500 mM Tris-Cl, pH 7.5 70 mM MgCl_Two 10 mM DTT 2.0 μl of 5 mM ATP, pH 7.0-7.5 2.0 μl of T4 DNA ligase (Cat # 60011; kit and And provided) 13.0 μl of H_TwoO 20.0 μl total reaction volume Incubate at room temperature DNA ligation key to ligate insert to vector (Cat # 203003) provided by Stratagene. 14． 7 μl of the remaining 14.0 μl Exo / Mung treated DNA Used for gel electrophoresis analysis. 15. Using 1 μl of the ligation reaction, 10 μl of Epicuria transforming E. coli RecA-JM109 or XLI-Blue cells Converted and plated on LB / AMP plate. C. Low melting point agarose method To minimize screening for deletions, select some of the deletions using low-melting-point agarose. And excised the band in question and continued ligation. Ligation In the reaction, the agarose concentration was kept below 0.5%. After performing the PCR reaction at 94 ° C for 2 minutes, the reaction was performed at 94 ° C for 1 minute at 55 ° C. For 45 seconds and 1 minute at 72 ° C. Primer gpN ( 5'AGAATGAGTGCTCTCAAACTCCTCTCTCTGGG) ( SEQ ID NO: 42) and gp11B (5′CATGTGAGAAAAGCTGGTC) CCTCA) (SEQ ID NO: 43) and the DNA fragment (1-667). ) And then cloned into a pCR3 expression vector to create pPCR110 Produced. Plasmids pPCR210 and pPCR220 are Mar gp-1 (5'TGGATATGGCAAGCGC ACAACTC) (SEQ ID NO: 44) and gp11B, gp-1 and gp22 (5'TAAATGG AA ATGTTCTCAAATTGT GGCGTG) (SEQ ID NO: 45) PCR3 vector containing the DNA insert fragment amplified by Was. Cytotoxic lysis assay Lysis assays were performed as previously described (Kawakami, Y et al., 19 94, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6458-62. ). Briefly, target cells were labeled with chromium for 90 minutes. Wash three times After incubation, the cells were incubated with the peptide at a concentration of 1 μg / ml for 90 minutes. Was. The cells are washed again, counted, and then TIL586 and the effector: target (E: T) at the specified ratio. After 4 hours of incubation, System release was measured. The peptide was synthesized using a peptide synthesizer (Model AMS4). 22, Gilson Co. Solid phase using Worthington, OH) It was synthesized by the method. Some peptides were purified by HPLC and exceeded 98% It had a high purity. Titration of ORF3P peptide recognized by TIL586 For example, 586 EBV B cells were purified with various concentrations of purified ORF3P peptide. Incubated. The percentage of specific lysis is given by the formula: (AB) / (C -B) x100 where A is 586E by TIL586 in the presence of the peptide BV B cell lysis, B in the presence of the same peptide, but with the effector cells Spontaneous release from 586 EBV B cells in the absence of vesicles And C is the maximum chromium release]. Cold target for cell lysis Inhibition as a “hot” target⁵¹Cr label 586mel or 624me l as a "cold" target and 586 pulsed peptide This was performed using EBV B and T2 cells. Site-directed mutagenesis To construct a site-specific mutation, the mutated primer GPMUTI, ( 5'GCCATGGGCAGATATGATCGGGAGGTCTGGCCCT TGCGCTTCTTCAATAGGACATCTCACTGCAAC) (sequence No. 11) and GPA1 were used to mutate to nucleotide 296 (from G to C) A PCR fragment containing was generated. Prime the wild-type DNA fragment Mer GPF1 (5'GAAGATCTGCCATGGGCAGAGATGATC GGGAGTCTCG) (SEQ ID NO: 12), GPE1 (5'GAATTCG) TTG TGT CCTGAGAAATTGCCGTTG) (SEQ ID NO: 13) , GPE2 (5 'GA ATTCGACTATGAGAACCCTCTGGTC ACAGGC) (SEQ ID NO: 14) and GPA1 (5 'AAGATCTGGGC CCGGACAAAGTGGTTCTTTTTC) (SEQ ID NO: 15) is shown in FIG. 3A. Amplified by using as indicated by the arrowhead in the arrow. Purified P The CR product was then cloned into the pCR3 expression vector. PCR fragment All plasmids containing plasmids are sequenced to confirm orientation and nucleotide sequence. I accepted. Example 2 Localization of antigenic peptides recognized by TIL586 To identify an antigenic epitope from gp75, ExoIII / S1 A series of nested deletions of the gp75 gene from the 3 'end using deletions), and additional DNA from gp75 by PCR amplification. A fragment was generated (FIG. 1A). PcDN as starting material for deletion studies A776 was selected because this clone was first used for library screening. Conferred the ability to stimulate cytokine release from TIL586 This is because the. Plasmid pcDNA776 is from American Type C ultra Collection (12301 Parklawn Dri ve, Rockville, MD) according to Budapest Treaty Deposited January 19, 1996 and given accession number ATCC 97423. The purpose of this study was to identify epitopes recognized by TIL586 Rapid localization of epitopes in relatively small DNA fragments So that the shortest possible fragment (instead of the full-length cDNA) Truncated gp75) was used. Next, these deletion constructs were converted to HLA-A3 Transfected into COS-7 cells with the pBK-CMV plasmid containing Transfected (Wang, RF, et al., J. Exp. Med.) . 1 81: 799-804). After 24 hours, the transfected COS-7 cells The cells are examined to determine which constructs stimulate cytokine release by TIL586. It was determined whether it was possible. Nucleotide 2 lacking the normal gp75 start codon Small truncated DNA fragments ranging from 47 to 771 are due to TIL586. Have the ability to stimulate GM-CSF release, which is recognized by TIL586. DNA epitope containing 247 to 771 nucleotides Suggests that it is positioned in the fragment. At nucleotides 445-447 Relatively to the positioned Kozak sequence (GATATGG) (SEQ ID NO: 16) Well related, A was found in the same frame as the gp75 open reading frame. Due to the presence of the TG start codon, the epitope recognized by TIL586 It was deduced to be located in the range from nucleotides 445 to 771. So Therefore, pPCR210 and pPCR220 were constructed, but these were pCR3 expression Initiation code for translation of truncated normal gp75 protein, which is a derivative of the vector Gp75 (GATATGG) (SEQ ID NO: An internal ATG codon was contained in the frame with 16). However, pPCR2 10 or pPCR220, both of COS-7 and HLA-A31 gene When transfection (FIG. 1B), cytokine secretion from TIL586 Does not provide the ability to stimulate, which means that this epitope Suggested to be localized in the stream. Therefore, another plasmid pD776A was constructed. Which contains the nucleotide sequence from 247 to 442 and has a gp75 Did not have an ATG codon in the same frame as It contained two ATG codons in the reading frame. This plasmid is , When co-transfected into COS-7 cells with A31 cDNA, Cytokine release from IL586 was strongly stimulated. genuine starter of gp75 The plasmid pPCR110 containing the Hdon-don was co-simultaneously with the HLA-A31 gene. When transfected (FIG. 1B), the number was higher than pDel5 or pD776A. Stimulated a fold lower cytokine release. These results were confirmed by TIL586. Identified epitope (s) is located in the region of nucleotides 247-442 Suggested to be installed. This region (nucleotides 247-442) is normal gp75 open reading Did not have an ATG start codon in the G frame, eg, ACG, CTG and Translation initiation from non-ATG codons such as GTG has been reported in some cases (Hann, SR, 1994, Biochimie 76: 880-86; Muralidhar, S.M. J. et al. Virol. 1994, 68: 170-7. 6). To identify epitopes in this region, peptide binding of HLA-A31 Binding motif (a hydrophobic residue at position 2 and a positive charge at the C-terminus) (FIG. 2) (Falk, K et al., I. Immunogenetics 1994, 40: 238-41). This research Most of the peptides selected for were nonamers, but some were 10 And 11-mers. These peptides were transferred to 586 EBV B cells Ability of these cells to stimulate cytokine release by TIL586 (Table 1). One peptide, AACDQRVLIVRR (SEQ ID NO: 2 5) induced GM-CSF release from TIL586 very weakly. But this Of the peptides have a peptide loading of 586 EBV B for lysis by TIL586. No sensitization was possible (Table 1).Table 1 Table 1. Screening of synthetic peptides by reactivity to TIL586 586 EBV cells were incubated with individual peptides at a concentration of 1 μg / ml for 90 minutes. Cubbed. GM-CSF release is peptide loaded 586EB with TIL586 Measured after co-incubation of V cells. TIL586 without stimulants GM-CSF secretion was subtracted. 586EBV expresses HLA-A-31 EBV transformed B cell line. Peptide protein by TIL586 Rused 586 EBV cytotoxic lysates in a 4 hour chromium release assay I did it. This peptide inks 586 EBV B cells at high concentrations (> 1 μg / ml). Only weakly stimulate cytokine release from TIL586 The target cells were lysed with TIL586 even at a peptide concentration of 0 μg / ml. This peptide was not sensitized for fungi (data not shown), so this peptide was TIL586. Was not likely to correspond to the major T cell epitope recognized by. To further define the region containing this major T cell epitope, PCR amplified by primer GPF1 and GPE1 and GPE2 Two more plasmids containing the fragment were constructed (FIG. 3A). Figure Contains the ATG start codon at the start of the small PCR fragment, as shown in 3B The two plasmids that carry HLA-A31-associated TIL586 The ability to stimulate the release of antigens, which is an epitope recognized by T cells. Is within the 82 nucleotide sequence from bases 247 to 329 of the gp75 cDNA. Suggested to be loaded. 28 overlapping peptides in ORF1 (overl apping peptides) (9-mer or 10-mer) is replaced with the amino acid sequence of gp75 in this region. Synthesized on a column basis, none of which stimulated GM-CSF release, or 58 6EBV B cells were found not to be sensitized for lysis by TIL586 (Data not shown). Example 3 arising from translation of the alternative open reading frame of the gp75 gene Antigenic peptide The epitope recognized by TIL586 in this small region could not be identified. This suggested that alternative open reading frames could be translated. Two ATG codons that are relatively well related are the gp75 open reading This region in an open reading frame different from the frame (ORF1) ( Nucleotides 247-442) (FIG. 2). First ATG (251GA GATGA257) (SEQ ID NO: 29) encodes 45 amino acids An open reading frame (ORF2) was generated, but with nucleotides 294- ATG (GAC located between 296ATGT) (SEQ ID NO: 30) The issued translation produced a 24 amino acid gene product (ORF3) (FIG. 2). OR HLA was selected by selecting 3 peptides derived from F2 and 2 peptides derived from ORF3. Synthesized based on -A31 binding motif (Table 2 and Figure 2). Surprisingly, ORF3 One peptide MSLQRQFLR (SEQ ID NO: 9) derived from ORF3P (Shown) by TIL586 when pulsed into 586 EBV B cells. Strongly recognized (Table 2). ORF3 peptide by TIL586 (MSLQR QFLR) (SEQ ID NO: 9) was confirmed by the fact that this peptide was autologous 586 EBVB Observed only when pulsed on cells and 1510EBV B (A31 +) cells But observed when the peptide was loaded on T2 (non-HLA-A31) cells However, this means that recognition of this peptide by TIL586 is HLA-A31 restricted. Suggested to be limited. ORF3P peptide mass is mass spectroscopy Confirmed by measurement analysis. As shown in FIG. 4B, TIL586 is ORF3P 586 EBV B cells pulsed with peptide were lysed, but HLA-A31 Associations that meet the criteria for peptide binding motifs but are not recognized by TIL586 EBV B cells pulsed with no peptide, or ORF3P peptide Failed to lyse T2 cells pulsed with. Peptide lysis Sensitization showed the greatest effect at 100 nM, but at 1 nM peptide concentration. In this case, lytic activity was detected (FIG. 4C). TIL586 is the peptide MSLQR QFLRT(SEQ ID NO: 33) or SLQRQFLRT (SEQ ID NO: 34) And a modified peptide derived from MSLQRQFLR (SEQ ID NO: 9) Tide (substitution of anchor residues at positions 2, 6 and 9) MLLQRQFLR (distribution (Column number: 36), MRLQRQFLR (SEQ ID NO: 37), MSLQRLFLR (SEQ ID NO: 38), MSLQRQFLE(SEQ ID NO: 39), MSLQRQF LK(SEQ ID NO: 40) was not recognized (Table 2). TIL586 is a peptide Se by Ala at position 2 compared to MSLQRQFLR (SEQ ID NO: 9) Peptide M with r-substitutionAOnly LQRQFLR (SEQ ID NO: 35) was recognized (Table 2). Table 2. Identification of antigenic peptides by reactivity to TIL586 Peptide incubation and GM-CSF release by 586 EBV B cells The conditions for the assay were the same as those described in Table 1. TIL without stimulants GM-CSF secretion by 586 alone was subtracted. The modified peptide is MSLQRQF By amino acid substitution at positions 2, 6 and 9 for LR (SEQ ID NO: 9) Produced. Cytotoxicity of peptide-pulsed 586 EBV by TIL586 Lytic lysis was performed in a 4 hour chromium release assay. Example 3 Translation is required for production of natural process antigenic peptides In the 6 nucleotides upstream of the ATG start codon of ORF3 (294-296) Since the located stop codon TAG (288-296) was present (FIG. 2), ORF3P peptide does not appear to have resulted from a frameshift Was. DNA sequence analysis also confirmed that there were no deletions or insertions in this upstream region. Was. The ATG located at nucleotides 294-296 is a 24 amino acid product To find out if it plays an important role in translation, ATGT (294-29 7) From ATCT (294-297) and ORF1 (gp75) Is considered to cause a change from Cys (UGU) to Ser (UCU) Translation of RF3 was eliminated (FIG. 3A). Plasmid containing the mutated gene (p GFMUT1) was cotransfected with HLA-A31 cDNA into COS-7. Tested for its ability to produce recognition by TIL586 when infected . FIG. 3B shows that the mutated gene has a TI as compared to the construct containing the wild-type gene. Demonstrated complete loss of ability to stimulate GM-CSF release by L586 . This observation indicates that the ATG in ORF3 at nucleotide positions 294-296 was Recognized by TIL586 as required for translation of the 24 amino acid product It is important for the generation of T cell epitopes. Met (ATG) is located at position 1 of the peptide epitope and has nucleotide 29 The ATG to ATC mutation at 4-296 is due to the Me at position 1 of the peptide. TIL586 does not recognize the mutated gene since a change from t to Ile has occurred. The fact is that the mutated peptide has lost the ability to bind to MHC class I molecules. I studied the possibilities that could be considered. Sequence encoded by the mutated gene Synthetic peptide (ISLQRQFLR) having the same amino acid sequence as (SEQ ID NO: 41) was made and tested for recognition by TIL586. Synthetic Mutant Petit Is still recognized by TIL586 at concentrations comparable to wild-type peptide Turned out to be. Furthermore, when the same mutation was introduced into the full-length cDNA, T No reactivity to IL586 was observed, but wild-type cDNA was pPCR1 To stimulate cytokine release from TIL586 at levels similar to 10. I was able to. This is consistent with the deletion data, indicating that TIL586 is not Did not recognize the peptide (s). these The results indicate that the T cells were mutated (from ATG at nucleotides 294-296). Not recognizing ATC) is due to inactivation of ORF3 translation initiation. Suggested. Example 4 Recognition of antigenic peptides on tumor cells and melanocytes A natural process that is similar or identical to the ORF3P peptide on tumor cells ally processed) Dealing with the problem of whether or not the peptide is recognized by TIL586 586 EBV B cells pulsed with ORF3P peptide Target inhibition assays⁵¹Ability to inhibit lysis of Cr-labeled 586mel Inspect the force.⁵¹Significant inhibition of lysis of Cr-labeled 586 mel was due to ORF3P peptide. Unrelated markers observed with 586 EBV B cells pulsed with 586 EBV B cells or ORF3P peptide pulsed with peptide Was not observed by the isolated T2 cells (FIG. 5A), indicating that Can topps compete with natural process peptides on tumor cells for T cell recognition? And meant. As expected, ORF3P-loaded 586 EBV B cells had TI TIL1200 does not inhibit lysis of target 624mel by L1200. Gp100 antigen associated with HLA-A2 compared to 586 EBV B alone (Fig. 5B). 586 T cell clone pulsed with ORF3P peptide To determine whether it can recognize both EBV B cells and tumor cell lines To test, T cell clones were diluted by limiting dilution (in a 96-well round bottom microplate). (1 cell / well) from the TIL586 cell line and further in culture. Inflated. T cell clones were made to TIL586 by limiting dilution (1 cell / well). Produced from a cell line. T cell clone containing 6000 IU / ml IL-2 You Were further expanded in AIM-V medium. It was further expanded in culture. 586 EBV B cells were isolated by ORF3P peptide or an unrelated peptide. Pulsed at 7 ° C. for 90 minutes. After three washes, the T cell clone or TI L586 cells were added and co-incubated for an additional 18-24 hours. 586 mel and 397mel / A31⁺Tumor and melanocyte NHEM680 cells About 1x10^FiveCells / wells are designated T cell clone, TIL586, respectively. -C1 (FIG. 6A), TIL586-C4 (FIG. 6B) and TIL586-C6 (FIG. 6C) or 1 × 10 for TIL586 (FIG. 6D)^Five18-24 hours with cells Incubated. The GM-CSF assay was performed as shown in FIG. 1B. 6 T cell clones pulsed with 586 mel tumor cells and ORF3P peptide 586 EBV B cells and HLA-A31 positive melanocytes Could be recognized, but 397mel / A31 or 586EBV B cell single I could not recognize Germany. Typical data is shown in FIGS. this The results show that the T cell clones were probably ORFs on tumor cells and normal melanocytes. Suggests recognizing a natural process peptide similar or identical to the 3P peptide Was. 40-45% of gp75 against tyrosinase, gp100 and TRP-2 Peptides recognized by T cell clones due to the presence of amino acid sequence identity Is not derived from gp75 but from any of these other proteins Was tested. Tyrosinase obtained by adding COS-7 cells to HLA-A31; transfected with gp100 or TRP-2 cDNAs respectively Cannot be recognized by the six types of T clones, but HLA- COS-7 transfected with A31 and gp75 cDNA was Found to stimulate GM-CSF release from these clones (data shown). Zu). Computer database search, tyrosinase in the database Known proteins, including gp100 and TRP-2, are HLA-A31 peptides Amino acid sequence having a peptide binding motif and a peptide recognized by TIL586 And no significant similarity to the tide epitope.Example 5 In vivo protection assay For in vivo protection studies, MHL-A31⁺Transgenic mau 10^FourTrp-1⁺Subcutaneous challenge with B16 mouse melanoma cells or 5x10^FiveTrp-2⁺Before intravenous challenge with B16 mouse melanoma cells On days 0 and 14, 0, 1 Pg, 1 ng, 1 μg, 1 mg or 100 mg It is immunized intravenously with a cancer peptide (SEQ ID NO: 9). Subcutaneous tumor cells The mice that have received the tumor are observed twice weekly for tumor development and their size is measured. tumor Mice receiving cells intravenously were euthanized on day 12 and the number of lung metastases was determined by Houg. hton, A .; N. 1994,J. Exp. Med. 180: 1 to 40 Measure as stated. Example 6 In vivo treatment assays For in vivo treatment, MHL-A31 was used to establish lung metastases.⁺ 1 x 10 transgenic mice^FiveOr 5x10^FiveTrp-1⁺B16 Mau Intravenous challenge with melanoma cells. Then, add 10^FivePF U / mg body weight of recombinant virus expressing cancer peptide (SEQ ID NO: 9) To seed. Mice were euthanized on day 12 and vaccinated versus unvaccinated mice. The number of lung metastases is determined. Example 7 Cancer antigen-specific T lymphocytes Immunotherapy T lymphocytes pre-sensitized to melanoma antigens are It is believed to be effective in therapeutic treatment of dairy animals. T lymphocytes from peripheral blood or melanosis And isolated in vitro and cultured in vitro (Kawakami, Y. et al.). , 1988,J. Exp. Med. 168: 2183-2191). T lymphocytes alone with cancer peptide (SEQ ID NO: 9) at a concentration of 1 μg / ml Or in the presence of IL-2, resensitized and expanded in culture. Cancer pepti T lymphocytes exposed to⁹-10¹²Lymphocyte / animal administration I do. These lymphocytes are administered intravenously, intraperitoneally or intralesionally. This action is an example Other treatments such as cytokines, surgical resection of melanoma and chemotherapeutics Can be administered at the same time. Example 8 Treatment of patients with metastatic melanoma In this protocol, patients with advanced melanoma are Immunize with Patients who are eligible for this trial will have failed standard effective therapies, Must have evaluable signs of metastatic melanoma. Patient has tumor TPI, as demonstrated by PCR or Northern blot analysis of vesicle RNA Must have a tumor that expresses the -1 antigen. Patients received 1 ng, 1 μg, 1 mg or 500 mg / kg body weight of the cancer peptide (sequence No .: 6) alone or IL-2 and / or immunization on days 0, 7 and 14 Accept in combination with stimulatory molecules. Patients with regard to toxicity, immunological effects and therapeutic efficacy To evaluate. Lymphocytes collected from treated patients were analyzed for amino acid sequence MSLQRQFLR (sequence Test for specific response to cancer antigens, including No. 6). A complete response is complete for all clinical signs of the disease, lasting at least 4 weeks. Defined as vanishing. Partial response is when new lesions appear The product of the vertical diameters of all measurable lesions without or with no lesion growth Overall is a 50% or greater reduction over at least 4 weeks. Mild reactions Vertical of all measurable lesions, with no new lesions appearing or no lesions growing Defined as a 25-49% reduction in overall diameter product. Less than partial response Patients who have are considered unresponsive. New lesions after partial or complete response An over 25% increase in the product of the vertical diameter of the preceding lesion or of the preceding lesion is considered a recurrence. Example 9 Materials and methods for TRP-2 Chemicals and reagents The following chemicals and reagents were purchased from designated sources: RPMI 1640, AIM -V medium, Lipofectamine, G418 (GIBCO BRL, Ga itersberg, MD); eukaryotic cell expression vector pCR3 (Invitr Ogen, San Diego, CA); anti-HLA-A31 monoclonal anti- Body (One lamda, Canada Park, CA); Anti-immunoglobulin M antibody conjugated with sothiocyanate (Vect or Laboratories, Inc. , Burlingame, CA) . T cell clones and lineages T cell clones were obtained from the TIL586 cell line by limiting dilution (1 cell / well). Thus, RPMI 16 containing 10% human AB serum and 500 IU IL-2 Allogeneic PBL (1 x 10^ThreeCells / well) . After 12 days, T cell clones were cloned into A containing 6000 IU / ml IL-2. Swelled in IM-V medium. To obtain optimal expansion, S.D. Ri ddell (Walter et al., 1995,N. Engl. J. Med. 333: 1038 to 1044) described above. Easy, 0 days 5x10 in the eye^Four~ 5x10^FiveT cells were converted to HLA-A31 PBL (500: 1, PB L: T cell ratio) and 586 EBV B cells (100: 1, EBV: T cell ratio) ) Together with 11% human serum, 30 ng / ml OKT3 antibody and antibiotics Co-cultured in RPMI 1640 (25 ml). On the first day, IL-2 Added at a final concentration of 180 IU / ml. On day 5, the medium was replaced with 11% human serum. And a fresh medium containing 180 IU / ml of IL-2. Next, The land was changed every three days. On days 12-14, T cells are harvested, counted and frozen. saved. TIL586 was isolated from a sample of a patient with metastatic melanoma and As previously described in a medium containing L-2 (6000 IU / ml) (Chiron). Were grown for 32-60 days (Topalian et al., 1988,J. Cli n. Oncol . 6: 839-853). TIL586 is primarily CD8⁺T thin Vesicles. Melanoma cell line 397me1, 397mel / A31, 586mel, 6 24mel, 624mel / A31, and EBV transformed B cell lines, 586E BV and 1510EBV have been established in our laboratory and 10% fetal calf serum (FCS ) And cultured in RPMI 1640 medium containing Normal culture derived from infant foreskin Melanosite (purchased from NHEM680, Clonetics, CA) Cultured in cyto growth medium (MOM; Clonetics, CA). COS- The 7 cell line is Dr. W. Provided by Leonard (NIH). GM-CSF secretion assay DNA transfection and GM-CSF assay are as described above. (Wang et al., 1995,J. Exp. Med. 181: 799-80 4). Briefly, 200 ng of DNA encoding the antigen and HLA-A31D 50 ng of NA is combined with 2 μl of Lipofectamine in 100 ml of DMEM and 1 Mix for 5-45 minutes. The DNA / Lipofectamine mixture was then added to COS-7 (5 x10^Four) Added to cells and incubated overnight. The next day, cells were transferred to DMEM medium Was washed twice. TIL586 contains 120 IU / ml IL-2 1x10 in AIM-V medium^FiveAdded at a cell / well concentration. T cell clone Then 1-2x10^FourOnly cells / wells were added. Incubate for 18-24 hours After that, 100 μl of the supernatant was recovered, and GM-CSF was added to the standard ELISA. Measurements were made on R (D + D Systems, Minneapolis, MN). To test for peptide recognition, 586 EBV or T2 cells were incubated at 37 ° C. Incubate with peptide for 90 minutes, then 120 IU / ml IL-2 Was washed three times with AIM-V medium containing Add T cells and add 18- After incubating for 24 hours, 100 μl of the supernatant was subjected to GM-CSF assay. Collected for ExoIII / SI deletion construction and subcloning TRP-2 cDNA is available from Dr. Shibahara's Gift (Yokoyama Et al., 1994,Biochim. Biophys. Acta, 1217: 317 321), which is pCR3 vector together with the CMV promoter for expression. Subcloned in the To create a series of deletions, TRP-2cD The plasmid pCR3 containing NA was digested with XbaI and α-phosphor Filled with thioate deoxyribonucleotide triphosphate, ExoIII Clease digestion was blocked. Subjecting the linear DNA to a second restriction digestion , One end sensitive to ExoIII was generated. ExoIII nuclease / Mun gBean nuclease deletion was performed according to the manufacturer's instructions (Stratagene, CA). It was performed according to. All deletion constructs were sequenced and the DNA sequence removed. Determined the position of the column. The pTA plasmid contains A from the 3 'end of the TRP-2 gene. A derivative of pCR3-TRP-2, wherein the paI DNA fragment has been deleted. Was. Remove the KpnI DNA fragment from the 3 'end of the TRP-2 gene After that, pTK was made. pTP was deleted and relaunched with the internal PstI fragment. Generated by irrigation. Northern blot analysis Total RNA by guanidine isothiocyanate / cesium chloride centrifugation Was isolated. Total RNA from human normal tissues was purchased from Clontech, CA. Was. Electricity in 20% of total RNA in 1.2% agarose formaldehyde gel After electrophoresis, this was transferred onto a nylon membrane. 2.0k of TRP-2 gene b DNA fragments are prepared by random priming³²With P-α-CTP Labeled. Pre-hybridization and hybridization Performed according to the kHyb protocol (Stratagene). At room temperature Twice with 2 × SSC / 0.1% SDS for 15 minutes at 60 ° C. for 30 minutes Was washed twice with 0.1X SSC / 0.1% SDS. Autoradiograph At -70 ° C. Cytotoxicity assay Lysis was performed using Calcein AM (Molecular Probes, Euge). ne, OR). Briefly, T2 cells or 586 EBV B cells Cells were pulsed with the peptide in RPMI 1640/5% FCS for 90 minutes. Tumor Vesicles and peptide-pulsed EBV B cells were converted to Calcein AM (1 × 1 0⁶37 ° C. with 15 μl of 1 mg / ml Calcein AM per cell) For 30 minutes. After the incubation, the cells were washed with AIM V / 12 Washed 3 times with 0IU IL-2. 1x10^ThreeT cells as target cells Mixed in various E: T ratios. After 4 hours incubation at 37 ° C , Bovine hemoglobin quenching solution containing 5 μl ethidium bromide in quench solution). Read plate by Lambda scan I took it. The percentage of lysis is calculated by the following formula: [1- (AB) / (CB)] × 100 [where A is the reading of non-lysed cells in the presence of T cells and B is the background count. And C is the maximum signal value from the target cell]. Was. The peptide was synthesized using a peptide synthesizer (Model AMS 422, Gils). on Co. on. By solid-phase method using Worthington, OH) did. Several peptides were purified by HPLC, which were more than 98% pure. Had a degree. Confirm peptide mass of several peptides by mass spectrometry analysis did. Example 10 Recognition of new antigens on tumor cells by CTL clone In a previous study, we determined from the TIL586 cell line by limiting dilution. Many T cell clones have been isolated (Wang et al., 1996b, J. Exp. M). ed. 183: 1131-1140). Among these, six types of clones Gene production translated from alternative open readings of the RP-1 / gp75 gene 586 EBV B cells pulsed with ORF3P peptide from Recognized 586 mel tumor cells of origin but pulsed with an unrelated peptide 586 EBV B cells were not recognized. As shown in FIG. TIL586-C1 was selected as one representative of the loan. But the same TIL Some T cell clones isolated from the 586 cell line have the TRP-1 peptide 586 EBV B cells pulsed with ORF3P also produced TRP-1 and HLA-A3 COS cells transfected with 1 cDNA also did not recognize, 586 mel and HLA-A31 + melanocytes could be recognized (Fig. 7). These results indicate that these T cell clones were not attached to 586 mel tumor cells. It suggested that it would recognize additional tumor antigens. Next, these T cell clones were expanded. With respect to recognition by the method described in the Materials and Methods section (Example 9), the cD To screen NA libraries or to test other cDNAs Enough cells were obtained. One type of clone, CTL clone 4, is described below. It was successfully inflated and used for other studies. Example 11 Identification of cDNA encoding tumor antigen recognized by T cell clone To determine the HLA molecule responsible for presenting the antigen to CTL clone 4, For example, HLA- in A31 negative tumor lines such as 397mel and 624mel. Transfect A31 cDNA and test for recognition by CTL clone Tested. Transfection of 397 mel and 624 mel expressing HLA-A31 The transfectant was significantly recognized by CTL clone 4. 3). Furthermore, these T cells are HLA-A31 positive allogeneic tumor line 1353me l can be recognized, indicating that tumor antigen is recognized by CTL clone 4. HLA-A31 restricted. Table 3. Specific secretion of GM-CSF by CTL clone 4 HLA-A31 restricted2x10^FourCTL clone 4 cells were transformed into melanoma cell line or HLA-A31c 24 h incubation with COS-7 transfected with DNA After the GM-CSF, the GM-CSF in the supernatant was measured. Since only a limited number of T cells were available, these T cells were identified in advance. Tumor antigen or melanocyte lineage differentiation protein (melanocyte-lineage diff erentiation protein). HLA-A31cD NA and MART-1 (Kawakami et al., 1994a,Proc. Natl . Acad. Sci. USA , 91: 3515-3519), gp75 (Wan g et al., 1995,J. Exp. Med. 181: 799-804), gp100 (Kawakami et al., 1994b,Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 91: 6458-6462), tyrosinase (Brichard et al., 1). 993J. Exp. Med. 178: 489-495), p1S (Robbi) ns et al., 1995,J. Immunol. 154: 5944-5950) and T RP-2 (Yokoyama et al., 1994,Biochim. Biophys. Acta , 1217: 317-321; Bouchard et al., 1994,Eur . J. Biochem. 219: 127-134), known tumor antigens or Is the COS transfected with the gene encoding the putative antigen -7 cells were tested for recognition by CTL clone 4. HLA-A31 only or COS cells transfected with TRP-2 alone become T cell clones Did not cause any recognition. However, both HLA-A31 and TRP-2 cDNA Transfected COS cells stimulate GM-CSF release from T cells However, COS transfected with HLA-A31 and other genes The cells did not stimulate, indicating that T cell clone 4 had T cells in an HLA-A31 restricted fashion. This shows that RP-2 was recognized as a tumor antigen. HLA-A3, A11, A31, A33 and A68 and their peptide binding modules Analysis of the structural similarity with the chief revealed the A3-like supermotif (A3-like supermotif). motif) (Sidney et al., 1996,Human Im munol . 45: 79-93). A single epitope peptide is available in the general population (general HLA-A3, A11, A expressed cumulatively in about 40 to 50% of It could cross react with 31, A33 and A68 molecules. Hepatitis B virus The same peptide epitope derived from the nucleocapsid protein is HLA-A 31 and the corresponding HLA-A31 or -A68 Limit Has been reported to be recognized by CTR (Missal et al., 1993). ,J. Exp. Med. 177: 751-762). HLA-A31 restricted T cells Is TRP-1 and T when pulsed on HLA-A3 positive EBV B cells It was tested whether it recognizes the RP-2 epitope. Interestingly, T cells Weak recognition was detected based on GM-CSF release from. However, HLA-A No recognition of 3 positive tumor cells was detected. Example 12 Expression of TRP-2 gene A probe for evaluating the expression pattern of TRP-2 in various tissues Northern blot analysis was performed using TRP-2 cDNA. Normal net The membrane tissue was the only positive for TRP-2 expression among the normal human tissues tested. It turned out to be. TRP-2 in melanoma cell lines and other cell lines Are listed in Table 4 below. 2 of 30 melanoma cell lines Five cell lines were found to express TRP-2. Burkitt B cells The lineage Daudi and the breast cancer cell line MDA231 are consistent with previous results. Was negative (Bouchard et al., 1994,Eur. J. Biochem . 219: 127-134). Therefore, tyrosinase, TRP-1, gp1 00 and MART-1, the expression pattern of this gene was melanoma, normal It appears to be restricted to melanocyte cell lines and retina.Table 4: Expression of TRP-2 in various cell lines and human tissues tested Expression of TRP-2 was determined by Northern blot analysis from 10-20 g total RNA. And probed with a TRP-2 cDNA fragment. D Audi is a Berkitt B cell line, and MDA231 is a breast cancer cell line. is there. Example 13 Peptide epitope recognized by T cells To determine the antigenic epitope from TRP-2, ExoIII / S1 Using creatase and a DNA fragment encoding the truncated form of TRP-2 A series of stacked deletions of the TRP-2 gene was generated from the 3 'end. These deletions The body and the subcloned construct were constructed using pBK-C containing the HLA-A31 cDNA. It was transfected into COS-7 cells with the MV plasmid. Troff Of the detected COS cells by the CTL clone Was tested by measuring GM-CSF cytokine release. FIG. TD1, 2 and 3 constructs stimulate cytokine release from CTL clone 4 PTD4 and pTD5 have stimulatory activity against CTL clone 4 Lost, which is an epitope recognized by CTL clone 4. (S) located in the region of nucleotides 836 to 1045 Meant. This was consistent with the results obtained from subcloning experiments . pTA and pTP are capable of stimulating cytokine release from CTL clone 4 But pTK still positive in cytokine release assay . Therefore, these epitopes, as shown in FIG. Present in DNA fragments flanked by nI sites. Identify the epitope from the coding region of this small DNA fragment Therefore, five types of synthetic peptides are synthesized peptide binding motifs of HLA-A31 ( (A hydrophobic residue at position 2 and a positively charged residue at position 9). (Rammensee et al., 1995,Immunogenetics, 4 1: 178-228). These peptides were pulsed onto 586 EBV B cells. Tested for their ability to stimulate cytokine release by CTL clone 4. Tested. As shown in Table 5, the peptide TRP₁₉₇ _{~ 205}Is a 586 EBV B cell When pulsed up, it was strongly recognized by CTL clone 4. CTL Recognition of this peptide by clone 4 allows the peptide to be identified as, for example, 586 EBV. And pulsed on HLA-A31 + EBV B cells, such as 1510 EBV And only when pulsed on HLA-A31 negative T2 cells. Was not. CTL clone 4 is an alternative open reading of the TRP-1 gene The ORF3P peptide derived from the frame was not recognized. These results show that T IL586-Cl specifically recognizes the ORF3P peptide derived from TRP-1, It was demonstrated that TL clone 4 specifically recognizes a TRP2-derived peptide. O Both RF3P and TRP2-p197 are presented to T cells by the HLA-A31 molecule. When indicated, no cross-reactivity was observed. Table 5. Identification of synthetic peptides reactive to T cell clones 586 EBV cells were incubated with individual peptides at concentrations of 1-g / ml for 90 minutes. Cubbed. Peptide-loaded 586 EBV cells were isolated from TRP-1 or TRP-2. After co-incubation with a T cell clone that recognizes M-CSF release was measured. GM-CSF secretion by only T cells without stimulator Was deducted. 586 EBV and 1510 EBV are EBVs expressing HLA-A31 It was a transformed B cell line. Example 14 TRP_197-205Peptide characterization Titration experiments showed that 1 nM peptide released GM-CSF from T cell clone 4. Is sufficient to stimulate, and this stimulus has reached a plateau at 500 nM. (FIG. 10A). TRP_197-205586 EBV pulsed Lysis of B cells by CTL clone 4 was also measured at various peptide concentrations (Fig. 10B) Targeted by CTL clone 4 as in cytokine release assay Lysis of cut cells was detected at 1 nM peptide concentration. Maximum lysis is 100n M was found at a peptide concentration of M. CTL clone 4 contains TRP2-p197 Pulsed 586 EBV and 586 mel tumor cells at low E: T ratio Also lysed, but were pulsed alone or with the control peptide ORF3P. 586 EBV B cells as well as HLA-A31 negative 397 mel line (Fig. 10). Most of the human melanoma antigens identified to date are non-mutated autoantigens, T cell recognition and binding affinity of these self-peptides to the corresponding MHC molecules Nity is improved in some cases by substitution of amino acids at anchor residues Have been. Many synthetic peptides, including 8-mers or 10-mers, and are listed in Table 6 And CT when pulsed into 586 EBV B cells Tested for recognition by L clone 4. TRP_197-2051 at the N-terminus of A 10-mer TLLGPGRPYR with extended amino acids is 586 EBV B When pulsed into cells, still recognized by CTL clone 4, but not reactive Was about 60% of the overlapping 9-mer LLGPGRPYR. HLA-A31 binding mode Based on the chief, amino acid positions at anchor residue positions 2 and 9 and other positions The exchange produced some modified peptides. Arg residue at position 9 at the C-terminus Can be replaced by a Lys residue, the modified peptide being the parent peptide Retained at least 60% of its activity. Ser of the Leu residue at position 2, Substitution by an Ile or Val residue maintained the same activity, or Although the activity was reduced to 60%, substitution at this position by Ala or Phe The ability to stimulate cytokine release from T cells was reduced (Table 6). Other qualifications Resulted in variable cancer peptide activity in T cell recognition. Table 6. Comparison of T cell reactivity of modified peptides 586 EBV cells for 90 minutes with individual peptides at concentrations of 0.5-g / ml Incubated. Peptide-loaded 586 EBV cells were converted to CTL clone 4 cells. GM-CSF release was measured after co-incubation with Stimulator GM-CSF secretion by T cells alone without was subtracted. 586 EBV is HLA- EBV-transformed B cell line expressing A31. The TRP-2 protein has two putative copper binding sites, a cysteine-rich region, And a transmembrane domain. Human TRP-2 maps to chromosome 13 The mouse counterpart is the coat color mutation on chromosome 14. , Slaty area. TRP-2 and Tyrosiner There is about 40% amino acid sequence identity between the enzyme and TRP-1 / gp75. Recognizes common peptide epitopes between the tyrosinase protein families No CTL line or clone has been found to date. 9-mer TRP recognized by CTL clone 4_197-205Peptide is TRP -2 is located at one of the copper binding sites in the coding region. This pep Tide was compared to other peptides, including the modified peptides tested in this study, by T-cells. Cytokine release from vesicles was most effectively stimulated. This means that in position 2 Predicted that Leu and Arg at position 9 are preferred residues. HLA-A31 binding motif. Leu at position 2 and position 9 Are the Ile and Ser at position 2 and the Ly at position 9, respectively. with little or no loss of reactivity to T cell recognition. The amino acid substitution at position 1, 3 or 6 can be Dried losses occurred. Example 15 In vivo treatment assays For in vivo treatment, MHL-A31 was used to establish lung metastases.⁺ 1 x 10 transgenic mice^FiveOr 5x10^FiveTrp-1⁺B16 Mau Intravenous challenge with melanoma cells. Then, add 10^FivePF U / mg body weight of recombinant virus expressing oncopeptide LLPGGRPYR Immunize. Mice were euthanized on day 12 and vaccinated vs. non-vaccinated The number of lung metastases in the mice is determined. Example 16 Cancer antigen-specific T lymphocytes Immunotherapy T lymphocytes pre-sensitized to melanoma antigens are It is believed to be effective in therapeutic treatment of dairy animals. T lymphocytes from peripheral blood or melanosis Isolated from the suspension and cultured in vitro (Kawakami, et al., 1). 988,J. Exp. Med. 168: 2183-2191). T lymphocytes were added to the cancer peptide, LLGPGRPYR, at a concentration of 1 μg / ml. Exposure alone or in the presence of IL-2, resensitize, and expand in culture. Cancer Approximately 10 T lymphocytes exposed to the peptide⁹-10¹²Lymphocytes / feeding Administration. These lymphocytes are administered intravenously, intraperitoneally or intralesionally. this Treatments include, for example, cytokines, surgical resection of melanoma injuries, and chemotherapeutic agents. Can be administered simultaneously with other therapeutic treatments. Example 17 Treatment of patients with metastatic melanoma In this protocol, patients with advanced melanoma are identified as antigenic cancer epitopes. For immunization. Patients who are eligible for this trial will have failed standard effective therapy, be measurable or Must have evaluable signs of metastatic melanoma. The patient has tumor cells RN TPI-2 antigen as demonstrated by PCR or Northern blot analysis of A Must have a tumor that expresses Patients received 1 ng, 1 μg, 1 mg or 500 mg / kg body weight of cancer peptide, LL GPGRPYR alone or on day 0, 7 and 14 or IL-2 and / or Intravenous reception in combination with co-immunostimulatory molecules I do. Patients are evaluated for toxicity, immunological effects and therapeutic efficacy. Lymphocytes collected from treated patients were analyzed for amino acid sequence, LLGPGRPYR. Test for specific response to cancer antigens. A complete response is associated with the disappearance of any clinical signs of the disease, lasting at least 4 weeks. Is defined as A partial response is the absence of new lesions or no increase in lesions. The total product of the vertical diameters of all measurable lesions over a period of at least 4 weeks. That is a reduction of more than 50%. Mild response indicates no new lesions or no lesions 25-49% of the total product of the vertical diameters of all measurable lesions without any increase Is defined as the decrease of Patients with less than a partial response are considered unresponsive . Appearance of a new lesion or product of the vertical diameter of the preceding lesion after a partial or complete response Over 25% is considered a relapse. Consideration Such as tyrosinase, MART-1 / Melan-A and gp100 Normal open reading of the corresponding non-mutated shared melanoma antigen Several Antigenic T Cell Epitopes Derived from the Reading Frame have been Identified . In this study, the antigenic peptide recognized by TIL586 was identified as gp75. It was demonstrated that it was derived from the second gene product of the gene. As far as we know, this Results from the translation of overlapping open reading frames of the same gene by T cells The first example of recognizing an antigenic peptide and two completely different proteins Whether the quality and / or peptide is an overlapping open reading frame of a single cell gene It is the only example in eukaryotic cells that can be translated from. gp75 ORF3 of the gene encodes a short protein of 24 amino acids. TIL586 The antigenic peptide recognized by the alternative open reading frame A Coded by a sequence positioned immediately after the TG (294-296) start codon Is done. gp75 is 40- to tyrosinase, gp100 and TRP-2. Although having 45% sequence homology, HLA-A31 and tyrosin in COS-7 cells Co-transfection with Nase, gp100 or TRP-2 cDNA, respectively Stimulates GM-CSF release from TIL586-derived T cell clones. And couldn't. Database search was performed for HLA-A31 peptide binding motivation. And a peptide recognized by TIL586 and a T cell clone derived therefrom. Identify proteins with significant sequence homology to epitopes Was. In addition, previous studies have shown that melanoma transfectants (gp75⁺ / A3 1⁺) Gave the ability to stimulate GM-CSF release from TIL586, but gp 75 melanoma transfectants (gp75^-/ A31⁺Did not give (Wang, RF, et al., 1995,J. Exp. Med. 181 : 799-804). Other melanoma cell lines (gp75^-/ A31⁺By) Also obtained similar results. ORF3P peptide was identified from the gp75 gene It is the only epitope and is identified by six T cell clones derived from TIL586. Recognized, this peptide can be used in natural processes on tumor cells or melanocytes. It is considered to be the same or similar to the peptide. This means that this peptide Since the natural peptide above could compete with T cell recognition, This was further supported by target inhibition experiments. Mutated adenomatous polyposis coli (APC) gene frame in colon cancer BALB / c mice vaccinated with T cell epitope peptide derived from shift Is recognized by the CTL obtained from (Townsend, A. Et al., 1994, Nature, 371: 662). The results in FIG. ATG at Tides 294-296 Required for Translation of 24 Amino Acid Product The 24 amino acid product is then converted to an antigenic peptide recognized by TIL586. Processing. TIL586 pallets 586 EBV B cells HLA-A31 in COS-7 cells When co-transfected with cDNA, the mutant gene is not recognized This means that the loss of recognition of the mutated (ATG to ATC) gene by TIL586 This was due to lack of translation of the ORF3 product. In addition to DNA sequence analysis These results indicate that the antigenic peptide recognized by TIL586 is gp75 From the frameshift product. Therefore, multiple pep Tides or proteins are often duplicated open reading frames of a single eukaryotic gene. Translations, but no means are available to detect these alternative products. It is thought that it was difficult. Sensitivity of T cells to detect natural process peptides Sensitivity can reveal many other examples of this phenomenon. Duplicate open reading frame 3 (ORF3) translated in vivo The mechanism involved is currently unknown. Starting at more than one AUG codon, In rare cases, both AUG codons and non-AUG codons such as CUG Some of the cellular mRNAs that form the same sequence N-terminally extended starting at Examples have been reported, overlapping open readings from single eukaryotic mRNA The use of frames (ie, translating two completely different peptides) has been As far as has not been said. Of overlapping reading frames from single-mRNA Some examples of translation are described, but are exclusively restricted to viral genes. You. Detection of products of overlapping open reading frames in viral genes This was possible due to the presence of reactive antibodies in the sera of virus-infected hosts. The present invention Now, an epitope peptide recognized by T cells using a T cell assay Was identified. This approach combines conventional Western blot or immunoprecipitation analysis. Are quite different and more sensitive than these analyses. Authentic start codon and ORF3 There are 5 ATG codons between the start codon and ORF1 (gp75 ) And the construct pPCR1 covering the complete ORF2 and ORF3 10 (nucleotides 1 to 667) stimulates cytokine release from TIL586 Still have the ability to However, the level of stimulus is 5 'truncated of gp75 (first Several times lower than the level of stimulation due to the deletion of 246 nucleotides (Figs. This suggests that the upstream ATG codon partially inhibited ORF3 expression. Suggested that Several factors affect the expression of the ORF3 product in this system It is possible to detect. First, preceding the ATG start codon of ORF3 Upstream ATG codons do not appear to be optimally related, Downstream A as start codon by a leaky scanning model It is believed that it allows the use of TGs. Second, transfection in COS-7 cells Relatively high expression of the targeted gene and T cell uptake as an extremely sensitive means. It is believed that the effectiveness of the sey permits the detection of very low levels of translation product. Interestingly, the ORF3 product was expressed in tumor cells as well as in normal melanocytes. The cells were detected by the cells (FIGS. 6A-6D), indicating that ORF3 protein was Not a gene product due to genetic alteration in the cell Strongly suggested. In previous studies, TIL586 was tested on multiple tumor cell lines. To (gp75⁺/ A31⁺) Was recognized, indicating that TIL586 was non- Recognition of a mutation-sharing tumor antigen was suggested (Wang RF, et al., Supra). . The gp75 gene is found in melanoma based on Northern blot and PCR analysis. It is highly expressed (Wang RF et al., Supra) and its gene product gp75 Protein is the most abundant intracellular glycoprotein expressed on melanoma cells and melanocytes (Tai, T., Eisinger, M., Ogata, S. et al.) And Lloyd, K .; O. 1983, Cancer Res. 43: 2773 -2779; Thomson, T .; N. Mattes, J .; M. , Roux, L. , Old, L .; J. And Lloyed, K .; O. 1985, J. Am. Inves t. Dermat. 85: 169-174; Thomson, T .; N. , Rea 1, F. X. , Mutakami, S .; , Cordon-cardo, C .; , O ld, L .; J. And Houghton, A .; N. 1988, J.A. Invest. Dermat. 90, 459-466), and T cell clones were 586 EBV B cells. Vesicle (A31⁺), Melanoma (gp75⁺/ A31⁺) And A31⁺On Lanocite Recognized ORF3P peptide when pulsed to⁺/ A31⁺Me O when pulsed on ranoma cells or on non-A31 T2 cells It is not surprising that they did not recognize RF3P. Between tumor cells and melanocytes Another possibility to explain peptide expression in GFP75 is that Generated by alternative splicing of different promoters Can be translated from another mRNA transcript or transcripts It is. To our knowledge, the mRNs generated by alternative splicing The A transcript is an isoform protein using the same open reading frame. Translated into quality. However, in the case of the present invention, another transcript is generated and translated. Open readin completely different from gp75 even when used as a template for Frame was used for translation of the ORF3 product. ORF3 in vivo Further experiments are needed to elucidate the mechanism of protein translation. But also Nevertheless, the possibilities described above are not mutually exclusive.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 45/08 Ａ６１Ｋ 45/08 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 7/00 7/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/531 ＡＧ０１Ｎ 33/531 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ローゼンバーグ，スティーブン・エイアメリカ合衆国メリーランド州20854，ポトマック，アイロン・ゲイト・ロード 10104──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61K 45/08 A61K 45/08 48/00 48/00 C07K 14/47 C07K 14/47 16/18 16 / 18 C12N 5/10 C12N 7/00 7/00 C12P 21/02 C C12P 21/02 C12Q 1/68 A C12Q 1/68 G01N 33/531 A G01N 33/531 C12N 5/00 B // (C12P 21 / 02 C12R 1:91) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), UA (AM, AZ, BY, G, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES , FI, GB, GE, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, UZ, VN, YU (72) Inventor Rosenberg, Stephen A. Iron Gate Road, Potomac, 20854, Maryland, USA 10104

Claims

[Claims] 1. A cancer peptide, part or derivative thereof, encoded by an alternative open reading frame nucleic acid sequence from a gene other than the open reading frame sequence encoding a normal protein or peptide from the same gene. 2. The cancer peptide according to claim 1, wherein the cancer peptide is immunologically recognized by MHC-restricted T lymphocytes, a part or derivative thereof. 3. The cancer peptide according to claim 1, wherein the T lymphocyte is MHC class I restricted, a part or derivative thereof. 4. If the cancer peptide is non-Hodkin's lymphoma, leukemia, Hodkin's lymphoma, lung cancer, liver cancer, metastatic cancer, melanoma, adenocarcinoma, thymoma, colon cancer, uterine cancer, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, cervical cancer, The cancer peptide according to claim 1, which is derived from a cancer selected from the group consisting of bladder cancer, kidney cancer, pancreatic cancer and sarcoma, a part or derivative thereof. 5. The cancer peptide, part or derivative thereof according to claim 1, wherein the alternative open reading frame nucleic acid sequence is from the TRP-1 gene. 6. The cancer peptide according to claim 1, wherein the cancer peptide is derived from a tumor-associated antigen, a part or derivative thereof. 7. The tumor-associated antigen is fetal neoplastic antigen, MART-1, Mage-1, Mag-3, gp100, tyrosinase, CEA, PSA, CA-171A, CA-19A, CA-125, erb-2, P-15 The cancer peptide according to claim 1, which is selected from the group consisting of and β-galactosidase, a part or derivative thereof. 8. The cancer peptide, part or derivative thereof according to claim 1, wherein the nucleic acid sequence comprises ORF3 described in FIG. 2 as SEQ ID NO: 5, a part or a variant thereof. 9. The cancer peptide, part or derivative thereof according to claim 1, wherein the alternative open reading frame nucleic acid sequence comprises ATGTCACTGCAACGGCAATTTCTCAG (SEQ ID NO: 10) or a part or variant thereof. 10. The cancer peptide according to claim 1, wherein the cancer peptide comprises the amino acid sequence: MXaaLQRQFLRTQLWDVPPSWLERSCL (SEQ ID NO: 7), and a fragment or derivative thereof (where Xaa = Ser or Ala). 11. The cancer peptide according to claim 1, wherein the cancer peptide comprises the amino acid sequence: MSLQRQFLR (SEQ ID NO: 9), a fragment or a derivative thereof, or a part or derivative thereof. 12. An isolated tumor antigen having an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 47, or a fragment or variant thereof. 13. An isolated tumor antigen encoded by a nucleic acid sequence comprising at least a fragment of SEQ ID NO: 46, or a variant thereof. 14． The tumor antigen according to claim 12, wherein the tumor antigen is a cancer peptide that is immunologically recognized by MHC-restricted T lymphocytes. 15. 15. The tumor antigen of claim 14, wherein the T lymphocytes are HLA-A31 restricted. 16. If the tumor antigen is non-Hodkin's lymphoma, leukemia, Hodkin's lymphoma, lung cancer, liver cancer, metastatic cancer, melanoma, adenocarcinoma, thymoma, colon cancer, uterine cancer, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, cervical cancer, 13. The tumor antigen according to claim 12, which is derived from a cancer selected from the group consisting of bladder cancer, kidney cancer, pancreatic cancer and sarcoma. 17． 13. The tumor antigen according to claim 12, wherein the tumor antigen is a cancer peptide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 49 to SEQ ID NO: 59. 18. 14. The tumor antigen of claim 13, further comprising a nucleic acid sequence: TTATTAGGACCAGGACGCCCCTACAG G or a part or variant thereof. 19. 13. The method according to claim 12, wherein the tumor antigen is a cancer peptide comprising the amino acid sequence: X ¹ LLGPGRPYRX ² and a variant thereof (wherein X ¹ and X ² are the same or different and each is one or more amino acids). The described tumor antigen. 20. The tumor antigen according to claim 12, wherein the tumor antigen is a cancer peptide comprising the amino acid sequence: LLGPGRPYR or a variant thereof. 21. A pharmaceutical composition comprising the cancer peptide according to any one of claims 1 to 19 or 20, a tumor antigen, a part or derivative thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier. 22. An immunogen comprising the cancer peptide, tumor antigen, part or derivative thereof according to claims 1 to 19 or 20, alone or together with at least one immunostimulatory molecule. 23. 23. The immunogen according to claim 22, wherein the immunostimulatory molecule is an MHC molecule. 24. An isolated nucleic acid sequence comprising an alternative open reading frame nucleic acid sequence encoding a cancer peptide from a gene other than the open reading frame sequence encoding a normal protein or peptide from the same gene, part or derivative thereof. 25. If the cancer peptide is non-Hodkin's lymphoma, leukemia, Hodkin's lymphoma, lung cancer, liver cancer, metastatic cancer, melanoma, adenocarcinoma, thymoma, colon cancer, uterine cancer, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, cervical cancer, 25. The isolated nucleic acid sequence of claim 24, wherein the nucleic acid sequence is derived from a cancer selected from the group consisting of bladder cancer, kidney cancer, pancreatic cancer and sarcoma. 26. 25. The isolated nucleic acid sequence according to claim 24, wherein the gene is a TRP-1 gene. 27. 25. The isolated nucleic acid sequence of claim 24, wherein the nucleic acid sequence comprises ORF3 set forth in FIG. 2 as SEQ ID NO: 5, a portion or a variant thereof. 28. 28. The isolated nucleic acid sequence of claim 27, wherein the nucleic acid sequence comprises ATGTCACTGCAACGGCAATTTCTCAG (SEQ ID NO: 10) or a portion or variant thereof. 29. 25. The isolated nucleic acid sequence of claim 24, wherein the sequence encodes the amino acid sequence: MXaaLQRQFLRTQLWDVPSWLERSCL (SEQ ID NO: 7), and a fragment or derivative thereof, wherein Xaa = Ser or Ala. 30. 30. The isolated nucleic acid sequence of claim 29, wherein the sequence encodes the amino acid sequence: MSLQRQFLR (SEQ ID NO: 9), a fragment or derivative thereof. 31. An isolated nucleic acid sequence comprising SEQ ID NO: 46 or a fragment thereof encoding a tumor antigen. 32. The nucleic acid sequence is non-Hodkin's lymphoma, leukemia, Hodkin's lymphoma, lung cancer, liver cancer, metastatic cancer, melanoma, adenocarcinoma, thymoma, colon cancer, uterine cancer, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, cervical cancer, 32. The isolated nucleic acid sequence of claim 31, wherein the nucleic acid sequence is derived from a cancer selected from the group consisting of bladder, kidney, pancreas and sarcoma. 33. 32. The isolated nucleic acid sequence of claim 31, wherein the nucleic acid sequence comprises TTATTAGGACCAGGACGCCCCTACA GG or a variant thereof. 34. 33. The isolated nucleic acid sequence of claim 32, wherein the sequence encodes the amino acid sequence: LLGPGRPYR or a variant thereof. 35. A recombinant expression vector comprising the nucleic acid sequence according to any one of claims 24 to 33 or 34. 36. A host organism transformed or transfected with the recombinant expression vector according to claim 35. 37. 35. An oligonucleotide comprising a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence according to claims 24 to 33 or 34. 38. A recombinant virus comprising a recombinant virus having the nucleic acid sequence according to claims 24 to 33 or 34 incorporated into a viral genome or a part thereof. 39. 39. The recombinant virus according to claim 38, further comprising at least one gene encoding an immunostimulatory molecule. 40. 39. The recombinant virus of claim 38, wherein the virus is selected from the group consisting of retrovirus, baculovirus, ankara virus, fowlpox virus, adenovirus, and vaccinia virus. 41. 39. The recombinant virus according to claim 38, wherein the cancer peptide is derived from melanocytes. 42. 40. The recombinant virus according to claim 39, wherein the immunostimulatory molecule is an MHC class I molecule. 43. 39. The recombinant virus according to claim 38, wherein the nucleic acid sequence comprises: ATGTCACTGCAACGGCAATTTCTCAG (SEQ ID NO: 10) or a variant thereof. 44. 39. The recombinant virus of claim 38, wherein the nucleic acid sequence encodes a cancer peptide comprising the amino acid sequence: MXaaLQRQFLRTQLWDVPSWLERSCL (SEQ ID NO: 7), and a fragment or derivative thereof (where Xaa = Ser or Ala). 45. 39. The recombinant virus of claim 38, wherein the nucleic acid sequence comprises TTATTAGGACCAGGACGCCCCTACA GG. 46. 39. The method according to claim 38, wherein the nucleic acid sequence encodes a tumor antigen comprising the amino acid sequence: X ¹ LLGPGRPYRX ² and a variant thereof, wherein X ¹ and X ² are the same or different and each is one or more amino acids. 3. The recombinant virus according to item 1. 47. An isolated antibody that binds to a cancer peptide encoded by ORF3 of the TRP-1 gene, or a portion thereof. 48. 21. An isolated antibody that binds to the cancer peptide, tumor antigen, or part or variant thereof according to claims 1 to 19 or 20. 49. An isolated antibody that binds to a tumor antigen encoded by SEQ ID NO: 46 or a fragment thereof. 50. An isolated antibody that binds to a tumor antigen comprising SEQ ID NO: 47 or a fragment thereof. 51. 20. An isolated antibody that binds to the tumor antigen or a variant thereof according to claim 19. 52. A method for producing a recombinant cancer peptide or part thereof, comprising: a. Inserting the nucleotide sequence of ORF3 set forth in FIG. 2 as SEQ ID NO: 5, or a portion or variant thereof, into an expression vector; b. Introducing the expression vector into a host cell; c. Culturing the host cell under conditions suitable for expression of the cancer peptide or a portion thereof; and d. Recovering the recombinant cancer peptide or a part thereof. 53. 53. The method of claim 52, wherein step (a) further comprises inserting a nucleotide sequence encoding an MHC class I molecule or a portion thereof into an expression vector. 54. A method for producing a recombinant TRP-2 tumor antigen, comprising: a. Inserting a nucleotide sequence comprising at least a portion of SEQ ID NO: 46, or a variant thereof, into an expression vector; b. Introducing the expression vector into a host cell; culturing the host cell under conditions suitable for expressing the tumor antigen; and c. Recovering the recombinant tumor antigen. 55. 55. The method of claim 54, wherein in step (a), the method further comprises inserting a nucleotide sequence encoding an MHC class I molecule or a portion thereof into an expression vector. 56. A method for detecting the presence of a cancer or precancerous in a mammal, comprising: a. The nucleic acid sequence of ORF3 shown in FIG. 2 as SEQ ID NO: 5, or a part thereof or a variant thereof, is prepared by combining a mRNA test biological sample collected from a mammal with a complex between the sequence and the mRNA. B. Detecting the complex; c. A method comprising comparing the amount of mRNA in a test sample with the amount of mRNA in a known normal biological sample, wherein the increased amount of mRNA from the test sample is indicative of cancer or precancerous. 57. 57. The method according to claim 56, wherein the cancer or precancerous is melanoma. 58. A method for detecting the presence of a cancer or pre-cancer in a mammal, comprising: combining a nucleic acid sequence comprising at least a portion of SEQ ID NO: 46 or a variant thereof with a test biological sample of mRNA collected from the mammal; Contacting under conditions that allow for the formation of a complex therebetween; and detecting the complex, wherein the presence of the complex is indicative of the presence of a cancer or precancerous. 59. 59. The method according to claim 58, wherein the cancer or precancerous is melanoma. 60. A method for detecting an ORF3 genomic nucleic acid sequence in a biological sample, comprising: a. Contacting a genomic nucleic acid sequence with ORF3, or a portion or variant thereof, set forth in FIG. 2 as SEQ ID NO: 5, under conditions that cause a complex to form between said genomic nucleic acid sequence and ORF3; and b. Detecting the complex. 61. 21. A method for detecting a cancer peptide, a tumor or an antigen or a part or variant thereof according to claim 1 to claim 19 in a biological sample; Contacting a sample with an antibody specific for said cancer peptide under conditions that allow the formation of an immune complex; and b. Detecting the presence of the immune complex. 62. 21. A method for preventing or inhibiting cancer in a mammal, comprising administering an effective amount of a cancer peptide, tumor antigen or a part thereof according to claims 1 to 19 or 20 alone or together with an MHC molecule. Administering to a mammal, wherein the amount is effective to prevent or inhibit cancer in the mammal. 63. A method of inhibiting melanoma in a mammal, comprising: a. A T-lymphocyte can be used in vitro to bind to a cancer peptide, a tumor antigen or a part thereof according to claims 1 to 19 or 20 alone or together with an MHC molecule. Expose for a time sufficient to pull out the sphere; b. Administering a cancer peptide-specific T lymphocyte to the mammal in an amount sufficient to inhibit melanoma. 64. 21. A method for preventing or inhibiting cancer in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of a cancer peptide or tumor antigen according to claims 1 to 19 or 20 alone or together with MHC molecules. Wherein the amount is effective to prevent or inhibit cancer in a mammal. 65. 47. A method of preventing or inhibiting cancer in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of the recombinant virus of claims 38-45 or 46, alone or with an exogenous immunostimulatory molecule. And wherein the amount is effective to prevent or inhibit cancer. 66. Claims 38 to 45 or 46 comprising the recombinant virus alone or together with an exogenous immunostimulatory molecule, a chemotherapeutic agent, an antibiotic, an antibacterial agent, an antiviral agent or a combination thereof, And a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier. 67. A method for identifying an antigenic cancer epitope of a cancer antigen reactive with antigen-specific T lymphocytes, comprising: a. Generating a nucleic acid deletion fragment from a gene encoding a cancer antigen; b. Placing the deleted fragment in an expression vector; c. Transfecting or transducing a host cell with the vector; d. Measuring a cancer antigen-specific T lymphocyte response in the presence of a host expressing the deletion product. 68. The method according to claim 67, wherein the gene encoding a cancer antigen is TRP-1 or TRP-2. 69. A method for identifying an antigenic cancer epitope on a cancer antigen, comprising: a. Making a number of synthetic peptides; b. Pulsing the cancer antigen presenting cells with the synthetic peptide; c. Adding the cells pulsed with the peptide to cancer antigen-specific T lymphocytes; and d. Measuring a cancer antigen-specific T lymphocyte response. 70. 70. The method according to claim 69, wherein the cancer antigen is a melanoma antigen. 71. A transgenic animal having a gene encoding a tumor antigen comprising at least the fragment of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 47. 72. A transgenic animal expressing the tumor antigen according to claim 71.