JP2000505667A

JP2000505667A - Calcification resistant biomaterial

Info

Publication number: JP2000505667A
Application number: JP9527827A
Authority: JP
Inventors: シュローダー，リチャード，エフ．; オウグル，マシュー，エフ．
Original assignee: セントジュードメディカル，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-02-05
Filing date: 1997-02-05
Publication date: 2000-05-16
Also published as: BR9707269A; EP0885021A1; WO1997027886A1; AU1848997A

Abstract

(57)【要約】本発明は、少なくとも１つの結合外因性貯蔵構造を有し、貯蔵構造がそれに遊離可能に結合している多量の石灰化抑制剤を有している生体適合性材料を含む生物プロテーゼを特徴とする。貯蔵構造はタンパク質又は合成高分子であり得る。石灰化抑制剤には、一般的には、金属イオン及びホスファターゼ抑制剤が含まれる。二官能金属キレート剤は、外因性タンパク質に結合されて金属イオン類を送達することができる。 (57) [Summary] The present invention features a bioprosthesis comprising a biocompatible material having at least one associated exogenous storage structure, wherein the storage structure has a high amount of a calcification inhibitor releasably bound thereto. . The storage structure can be a protein or a synthetic macromolecule. Calcification inhibitors generally include metal ions and phosphatase inhibitors. Bifunctional metal chelators can bind to exogenous proteins to deliver metal ions.

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称石灰化抵抗性生体材料発明の背景本発明は、石灰化を低減させるための処理が施されているプロテーゼ用材料に関する。より詳細には、本発明は緩徐に遊離される石灰化抑制剤類が結合されているプロテーゼ用材料に関する。生物プロテーゼ類、即ち生物プロテーゼ用具類は、ヒト及び動物の損傷又は罹患した臓器、組織及びその他の器官を修復又は置換するために使用される。生物プロテーゼ類は一般に、代表的には長期間に渡って埋殖されるので生体適合性でなければならない。詳細には、生物プロテーゼ類には哺乳動物類組織その他から構成される人工心臓、人工心臓弁、靭帯修復材料、血管修復材料、外科用パッチ類を含むことができる。生物プロテーゼ類は天然又は合成材料の組み合わせから構成することもできる。石灰化、つまりカルシウム塩、特にリン酸カルシウム（ヒドロキシアパタイト）の沈積は移植可能な生物プロテーゼ類の製造に使用される一部の材料の内部及び表面に発生する。これは、特に長期間に渡って、これらの医用生体材料類から構成される医療用具の性能及び構造的完全性に影響を及ぼす。例えば、石灰化はブタ大動脈弁又はウシ心膜から作られた生体心臓弁の臨床的不全の主要原因である。石灰化はさらに又、ポリウレタンのような合成材料から構成された生物プロテーゼ類の性能にも重大な影響を及ぼす。動物由来生体プロテーゼ心臓弁は損傷したヒトの心臓弁の置換物として極めて重要であることから、これらの異種移植片の石灰化の影響には相当に大きな注目が集まっている。天然材料から作られる生体プロテーゼ心臓弁は1960年代初期に導入され、代表的にはブタ大動脈弁に由来するか、又はウシ心膜のような他の生物学的材料から製造される。異種心臓弁は、代表的には免疫学的拒絶反応が発生する可能性を低減させるために、移植前にグルタールアルデヒドを用いて固定される。グルタールアルデヒドはタンパク質中の遊離アミノ基と反応して共有結合を形成し、それによって近くにあるタンパク質を化学的に架橋結合する。一般に、生体プロテーゼ心臓弁は移植から約７年後には衰弱し始め、20年後においても機能を保持している生体弁はほとんどない。劣化しつつある人工弁の置換は、特に高齢者及び緊急置換術の状況においては、手術によるより一層のリスクを患者に負わせる。生物プロテーゼ類の不全は全年齢群の患者にとって問題であるが、特に若年患者において顕著である。15歳以下の患者の場合は、置換された生体プロテーゼ弁の50％以上が、石灰化のために５年以内に機能不全になる。同様に、人工心臓におけるポリウレタン製嚢及びポリウレタン製弁における弁尖（小葉）の石灰化も、臨床的に重大となる可能性がある。その他の天然及び／又は合成材料から作られた生物プロテーゼ類は臨床的に重大な石灰化を示す。その結果として、埋殖された医用生体材料類、特に人工弁上のカルシウムの沈積を防止することには相当に大きな関心が集まっている。石灰化の防止に関する研究は、埋殖前の医用生体材料の前処理に相当に大きな重点が置かれてきた。そこで、カルシウム核形成を減少させることによって石灰化を低減させることを意図して、組織を前処理するために洗浄剤や界面活性剤（例、ドデシル硫酸ナトリウム）、トルイジンブルー又はジホスフォネート類が使用されてきた。だがこれらの物質は生物プロテーゼ用材料から埋殖物の周囲の体液内に比較的急速に洗い流されてしまう傾向があるので、それらの有効性は限定されている。石灰化を低減させるためのもう１つのアプローチは、化学的プロセスにより、組織から反応性グルタールアルデヒド部分の少なくとも一部を除去することであった。さらにまた別のアプローチには代替固定法の開発が含まれていたが、それは、この固定プロセス自体が石灰化及びこれに伴なう機械的劣化の原因となるかも知れないという証拠が示されたからであった。さらに、移植された組織内に存在する生育不能な細胞がカルシウム沈積の部位となっているので、移植前に組織のコラーゲン−エラスチン基質から細胞物質を取り除くための様々なプロセスが開発されてきた。生物プロテーゼ類の石灰化を低減させるための重要な進展は、Ａｌ⁺³陽イオン及びその他の多価陽イオンが石灰化を阻止するという事実の確定であった。生物プロテーゼ用材料は、埋殖前にＡｌＣｌ₃の酸性水溶液を用いて処理された。処理溶液から取り出された後で一部のＡｌ⁺³陽イオンは洗い流されてしまうが、相当に多量の陽イオンは長期間に渡って処理された材料と結合したままに止まる。これはおそらく、陽イオンと生物プロテーゼ用材料のある種の会合によるものであろう。生物プロテーゼ用材料内へのイオンの負荷（loading）は限界値に達すると思われる。会合したＡｌ⁺³陽イオンはカルシウム沈積の大幅な抑制に寄与することが明らかになっている。さらにその上、この作用は若年動物においては相当に長期間、少なくとも数ヶ月間持続した。Ｆｅ⁺³塩を用いた処理も石灰化の低減の面で類似の有効性を産み出すことが観察されている。生物プロテーゼ類の石灰化にはアルカリホスファターゼが関与していると言われてきた。石灰化は、細胞破壊及びこれに対応する、細胞からのＣａ⁺²のポンプアウトに起因する低い細胞内カルシウム濃度を維持する、細胞カルシウム調節の中断に関連していると思われる。細胞損傷は、機械的損傷、極端なｐＨ濃度、極端なイオン濃度及び／又はグルタールアルデヒド処理のような化学的固定の結果として生じる。細胞損傷は、生育不能な細胞内へのカルシウムの抑制されない流入をもたらす。生理学的には正常な骨格及び歯牙組織の石灰化と、生物プロテーゼ類の石灰化のような病理学的石灰化とは、リン灰石ミネラルの初期沈積を含む重要な類似性をもっている。これらのミネラル沈積物はカルシウムとリン酸塩類を含んでおり、ミネラル成長は初期沈積物によって産生した核で発生する。骨発達における核形成は、高濃度のカルシウム結合リン脂質及び高活性のホスファターゼ類、特にアルカリホスファターゼを有する構造(structure)で発生する。アルカリホスファターゼ活性は特に小児において高く、これが若年患者に埋殖された生物プロテーゼ類に対する深刻な石灰化問題の原因である可能性がある。ホスファターゼ活性は、ＡｌＣｌ₃及びＦｅＣｌ₃と一緒に培養することによって抑制されることが明らかになっている。この結果は、石灰化を低減させることにおけるＡｌ⁺³及びＦｅ⁺³陽イオンの作用がホスファターゼ活性の抑制に起因することを示唆している。その代わりに、又はこれに加えて、これらのイオン類はヒドロキシアパタイト結晶格子内への置換によって作用し、結晶を不安定化させることによって成長を防止できる可能性もある。発明の要約一般に、本発明は少なくとも１つの結合外因性貯蔵構造を有し、前記貯蔵構造がそれに遊離可能に結合した大量の石灰化抑制剤を有している生体適合性材料を含む生物プロテーゼである事を特徴としている。生体適合性材料は天然組織を含むことができる。天然組織はブタの心臓弁、大動脈根、壁、及び／又は弁尖；及びウシの心膜組織、硬（脳）膜のような結合組織、同種移植組織、バイパスグラフト、鍵、靭帯、皮膚パッチ、血管、ヒトの請帯組織及び骨から構成される群から選択することができる。その代わりに、又はこれに加えて、生体適合性材料は重合体を含むことができる。貯蔵構造は、フェリチンのようなタンパク質であってよい。貯蔵構造はまた合成高分子であってよい。貯蔵構造と会合させられる石灰化抑制剤は金属陽イオンを含んでいる。金属陽イオンは、好ましくはＡｌ⁺³、Ｆｅ⁺³、及びＭｇ⁺²から構成される群から選択される。石灰化抑制剤はさらに、二リン酸塩類及びホスファターゼ抑制剤類を含んでいる。ホスファターゼ抑制剤は、好ましくはリン酸塩イオン類、Ｇａ⁺³、Ｌａ⁺³、ホウ酸塩イオン類、シュウ酸塩イオン類、シアン化物イオン類、Ｌ−フェニルアラニン、尿素、過剰Ｚｎ⁺²、グリシン、プロピルアミン、ラバミソール及びヒ酸塩イオン類から構成される群から選択される。生物プロテーゼにおいては、生体適合性材料への貯蔵構造の結合は好ましくは主として共有結合である。その代わりに、生物プロテーゼは好ましくは多数の非共有的相互作用を特徴とする生体適合性材料への貯蔵構造の結合をもっている。外因性貯蔵構造は、好ましくはさらに標的（targeting）分子を含有している。関連する観点においては、本発明は生体適合性材料の調製方法を特徴とするが、この方法は生体適合性材料へ複数の外因性巨大分子貯蔵構造を結合させることを含んでおり、前記巨大分子貯蔵構造はそれに遊離可能に結合している多量の石灰化抑制剤を有している。好ましい方法では、前記の結合は前記生体適合性材料へ前記巨大分子貯蔵構造を化学的に架橋結合させることによって実施される。他の好ましい実施態様では、前記結合は粘着分子を使用した標的によって実施される。別の好ましい方法では、本方法はさらに生体適合性材料を金属イオンと接触させるステップを含んでいる。別の関連する観点では、生物プロテーゼは、それに遊離可能に結合している多量の金属陽イオンを有している、結合二官能（二元機能型）キレート剤を有している生体適合性材料を含有している。本発明の利点は、生体適合性材料の選択した部分へ石灰化抑制剤を指向させる能力である。本発明のもう１つの利点は、材料内での石灰化抑制剤の負荷を増加させる可能性である。さらに本発明のもう１つの利点は、石灰化抑制剤のための遊離時間を所望値に選択する能力である。さらにもう１つの利点は、適当な生理学的条件下で、生体適合性材料を加工処理する能力である。本発明は、生体適合性材料の微小環境内への遊離を、調整された期間中許容しながら、広範囲の抗石灰化剤の使用を許容する。さらにもう１つの本発明の利点は、石灰化抑制剤と直接に接触させた生体適合性材料の配置と外因性貯蔵構造との組み合わせ使用である。別の観点では、本発明は、少なくとも１つの結合外因性貯蔵構造を有している生体適合性材料を含んでいる生物プロテーゼを含有しており、前記貯蔵構造は生体適合性材料１ｇ当たり約０．５ｍｇ以上の、それに遊離可能に結合している金属陽イオンを集合的に有している。より好ましくは、貯蔵構造は生体適合性材料１ｇ当たり約１０．０ｍｇ以上の金属陽イオンを集合的に有している。さらにより好ましくは、貯蔵構造は生体適合性材料１ｇ当たり約１５．０ｍｇ以上の金属陽イオンを集合的に有している。別の観点では、本発明は少なくとも１つの結合外因性貯蔵構造を有する天然組織を含んでいる生物プロテーゼを含んでいる。そして、前記貯蔵構造はそれに遊離可能に結合している多量の石灰化抑制剤を有しており、天然組織は哺乳動物類内への皮下移植の約２ヶ月後に結合外因性貯蔵構造を含有しない等価天然組織に比較して、カルシウム沈積を９５％以上低減させた。別の観点では、本発明はフェリチンを天然組織へ結合させるステップを含む、生物プロテーゼを製造する方法を含んでおり、このときフェリチンには、天然組織１ｇ当たり少なくとも０．５ｍｇの金属陽イオンが存在するように、石灰化抑制性金属陽イオンが負荷される。別の観点では、本発明は、約６．０から８．５の間のｐＨで、生物プロテーゼ用材料に石灰化抑制剤を化学的に結合させるステップを含む、生物プロテーゼを製造する方法を含んでいる。本発明の他の利点及び特徴は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲から明白になるであろう。発明の詳細な説明本発明の生物プロテーゼは、石灰化抑制剤を貯蔵する結合構造を有する生体適合性材料から構成される。これらの物質の貯蔵構造からの経時的な緩徐な遊離は、生体適合性材料上へのカルシウム塩、特にリン酸カルシウムの沈積を抑制する。石灰化抑制剤を含有している結合貯蔵構造の使用は、特定の貯蔵構造及び結合石灰化抑制剤の選択を通して相当に大きな多様性を提供する。石灰化と生物プロテーゼの劣化の間に明白な関連がある場合は、どんな程度であっても、カルシウム沈積の抑制は有用である。好ましい度合いの抑制は、処理されない生物プロテーゼに比較して、２ヶ月の間少なくとも約５０から７５％までカルシウム沈積を低減させる。より好ましい度合いの抑制は、カルシウム沈積を少なくとも９０％まで、さらにより好ましくは埋殖約２ヶ月後には少なくとも９５％まで低減させる。貯蔵構造を備えた生体適合性材料を調製する方法においては、生理的条件に近似する条件を使用することができる。貯蔵構造の選択及び生体適合性材料への貯蔵構造の付着に依存して、生物プロテーゼ基質における石灰化抑制剤の量を相当多量にすることができる。金属陽イオン類については、好ましい負荷は乾燥組織１ｇ当たり約０．５ｍｇ以上のイオン類、より好ましくは乾燥組織１ｇ当たり約１０ｍｇ以上のイオン類、さらにより好ましくは乾燥組織１ｇ当たり約１５ｍｇ以上のイオン類を有している。石灰化抑制剤は、一般的にはカルシウム形成を抑制するように選択することができ、詳細には、アルカリホスファターゼのようなヒドロキシアパタイト形成に対する酵素性前駆物質の作用を抑制するように選択することができる。１又は２種以上の石灰化抑制剤を保持する多種の様々な貯蔵構造を単一生物プロテーゼにおいて使用することができる。Ａ．生体適合性材料本出願の生物プロテーゼ（生物プロテーゼ製品）は、宿主のヒト又は動物の身体内に埋殖（移植）される器具である。生物プロテーゼは１又は２種以上の生体適合性材料から作られており、宿主内に長期間埋殖されるのに適合している。宿主に免疫抑制剤療法を施すことが有用な場合があるが、この療法が必要とされないことも多い。これらの生体適合性材料の少なくとも１つは結合貯蔵構造をもつことができる。貯蔵構造は多量の石灰化抑制剤（１種又は２種以上）を貯蔵している。生体適合性材料は好ましくは生物学的材料又は高分子材料を含んでいる。一部のプロテーゼ類は完全に金属成分から構成できるが、これらのプロテーゼ類は一般には本発明には関連しない。本発明に含まれる生物プロテーゼは、生物学的材料及び／又は合成ポリマーの部分を有する金属部分のような、材料の混合物から構成される可能性がある。適切な生物プロテーゼ類は、制限無しに、人工心臓、人工心臓弁、靭帯修復材料、バイパスグラフト、哺乳類組織から構成された外科用パッチ、その他を含んでいる。本発明で使用するための生物学的材料は、比較的無傷の組織並びに脱細胞化組織を含んでいる。これらの組織は、例えば心臓弁、大動脈根、壁、及び弁尖のような心臓弁の部分、及び心膜パッチのような心膜組織、硬膜のような結合組織、同種移植組織、バイパスグラフト、鍵、靭帯、皮膚パッチ、血管、軟骨、ヒト臍帯組織その他から入手することができる。一般に、これらの組織は種々の動物種、代表的にはヒト、ウシ、ブタ、アザラシ及びカンガルーのような哺乳類に由来するコラーゲン含有材料及び組織工学処理材料を含んでいる。組織工学処理材料は、再形成（repopulate）された吸収性基質を含んでおり、これは合成組織の形を取っている。しかし一般的には、生物学的組織は必ずしも軟組織である必要はない。組織サンプルは、代表的には、組織を架橋結合させて固定され、組織の酵素性劣化を防止することによって機械的安定化を生じさせているが、サンプルの固定は必要ではない。細胞を固定させるためには代表的にはグルタールアルデヒドが使用されるが、エポキシド類及びその他の二官能アルデヒド類のような他の固定剤を使用することもできる。コラーゲン及びエラスチン構造基質のような細胞材料が取り除かれた構造基質から主として構成される脱細胞化組織を製造することができる。脱細胞化プロセスには、酵素類、その他の化学薬品及び物理的処理の適用を含めることができる。例えば、その全体が参照によってここに組み込まれる同時係属出願の米国特許出願第０８／４２４，２１８号が参照される。本発明の生物プロテーゼ類において使用するための生体適合性重合体材料は、合成高分子並びに精製されて織成された生物学的重合体類を含んでいる。合成高分子類には、ポリアミド類（ナイロン）、ポリエステル類、ポリスチレン、ポリアクリレート類、ビニルポリマー類（例、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン及びポリ塩化ビニル）、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリジメチルシロキサン、酢酸セルロース、ポリメチルメタクリレート、酢酸ビニルエチレン、ポリスルホン、ニトロセルロース及び類似の共重合体類が含まれる。これらの合成高分子材料は、基質すなわちマトリックスを形成するためにメッシュ状に織ることができる。その代わりに、合成高分子材料は選択された形に成形若しくは鋳造することもできる。基質に適切に成形できる精製された生物学的重合体には、多糖類（例、セルロース及びデンプン）、ポリアミノ酸、コラーゲン、ゼラチン及び腸線縫合糸が含まれる。Ｂ．石灰化抑制剤生物学的材料及び重合体材料は、材料の組成及び構造に依存して様々な度合いで、石灰化に対する感受性を示す。石灰化の機序は完全には解明されていないが、骨形成に関連するカルシウム沈積との類似性を示している。ホスファターゼ類、特にアルカリホスファターゼは病理学的石灰化プロセスにおいて重要な役割を果たすと推定されてきた（R.J.Levyらの論文：25J.Biomedical Materials Resea rch 905-935頁（1991）を参照）。本発明は、特定の生物プロテーゼの内側及び周囲の細胞レベルでの、調節された方法による抗石灰化剤の導入または送達（delivery）を含んでいる。石灰化を低減すなわち抑制するための有効性を保ちながら、少ない総量の活性剤を送達することことができる。量は少なくてよく、このためレシピエント（被移植者）に対しては非毒性でありながら、反面、それらは活性組成を含有している生物プロテーゼの局所環境に比較して相当に高い負荷を表すことができる。石灰化抑制剤には、石灰化の核形成を抑制する化合物類並びにアルカリホスファターゼ抑制剤類が含まれる（Levyらの米国特許第５，３６８，６０８号を参照）。抗石灰化剤は、生物プロテーゼの有効寿命を有意に延長させるために長期間に渡って遊離されるのが好ましい。背景濃度を超える抗石灰化剤の遊離は好ましくは数ヶ月間、より好ましくは数年間にわたるであろう。Ａｌ⁺³、Ｍｇ⁺²及びＦｅ⁺³イオンは石灰化抑制剤であることが証明されており、時間制御された遊離方法で送達されると、生物プロテーゼ類の石灰化を低減させるのに有効である。Ｇａ⁺³、Ｌａ⁺³その他のような多価陽イオンも又、アルカリホスファターゼのような酵素性前駆物質のヒドロキシアパタイト形成機能を抑制することが知られている。本発明は、生体適合性材料内での多価陽イオンを含む石灰化抑制剤の調節された会合及び緩徐な遊離を含んでいる。ベリリウムは相当な毒性を持つが、Ｂｅ⁺²イオンも又ホスファターゼを抑制することが知られている。その他のホスファターゼ抑制剤類としてはリン酸塩イオン類、Ｇａ⁺³、Ｌａ⁺³、ホウ酸塩イオン類、シュウ酸塩イオン類、シアン化物イオン類、Ｌ−フェニルアラニン、尿素、過剰Ｚｎ⁺²、グリシン、プロピルアミン、ラバミソール及びヒ酸塩イオン類が含まれる。アルカリホスファターゼの機能は又Ｍｇ／Ｚｎイオン比率によっても影響を受ける。その他の石灰化抑制剤には二リン酸塩類が含まれる。Ｃ．外因性貯蔵構造貯蔵構造は、石灰化抑制剤の貯蔵及び緩徐な遊離のために使用される。好ましい貯蔵構造は、天然若しくは合成タンパク質又は適当な合成高分子類のような顕微鏡的巨大分子組成であろう。しかし、好ましい組成の集合が顕微鏡的である必要はないことが理解されなければならない。外因性貯蔵構造によって貯蔵される石灰化抑制剤は、一般には、多価金属陽イオンのようなあらゆる石灰化抑制剤であってよい。「タンパク質」の用語は、ペプチド結合によって連結されているアミノ酸だけではなく、炭水化物、核酸及び／又は脂質と共にアミノ酸を含有している共役タンパク質をも意味すると解されるべきである。溶液中の有意な濃度のＡｌ⁺³陽イオンを用いて処理された生物学的材料は、Ａｌ⁺³陽イオンと会合している。観察されたＡｌ⁺³陽イオンと天然生物学的基質との会合は、おそらく天然に発生するフェリチンとの結合によるものと考えられる。フェリチンは、タンパク質１分子当たり鉄イオン数千個という、相当に多量の鉄イオンを貯蔵できる鉄貯蔵タンパク質である。フェリチンも又これに類似するが、より少ない量のＡｌ⁺³及び他の非鉄イオンしか貯蔵することができない。天然に発生するフェリチンは、おそらく固定中に、タンパク質又は他の生物学的若しくは合成基質へ架橋されるか、さもなければ結合される可能性がある。天然のフェリチンは、Ａｌ⁺³、Ｆｅ⁺³、Ｍｇ⁺²その他のような陽イオンを極めて緩徐に局所環境内へ遊離するであろう。本発明の貯蔵構造は、生体適合性材料（外因性フェリチン）の内部に既に存在するフェリチンのようなあらゆる天然発生構造に追加されるか、又はその代替物として使用される。この方法で、本処理の有効性は、外部源（外因性フェリチンのような外因性貯蔵構造）から供給される貯蔵構造の使用を通して強化することができる。本発明の範囲内の適当なタンパク質貯蔵構造類は、フェリチン、トランスフェリン、ヘモグロビン、メタロチエン、ミオグロビン、セルロプラスミン及びヘモシアニンのような金属結合タンパク質類、並びに金属結合能力を発生させるために二官能キレート剤が添加された改変（修飾）タンパク質を含んでいる。フェリチンは、大きな貯蔵能力を備えているために好ましい金属結合タンパク質である。アポフェリチン（結合金属を含まないフェリチンタンパク質）は分子量が約４５０，０００の２４本のサブニットからなるタンパク質である。もっとも、この分子量はフェリチンが単離された種に依存して変動する。相違する数のサブユニットを備えた関連タンパク質であるイソフェリチン類も又本発明の範囲内にある。フェリチンの核は約２，０００から約４，５００の間の鉄イオンを貯蔵することができる。例えば、ウマ脾フェリチンは、ヒト・フェリチン中の約２，５００個の鉄イオンに比較して、約４，５００個の鉄イオンを結合することができる。鉄は、酸化第二鉄又はヒドロキシリン酸第二鉄として核内に貯蔵される。フェリチンは又、Ａｌ、Ｍｇ、Ｂｅ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｖ、Ｔｂ、Ｃｄなどの金属のイオンを含む他の金属イオンを大量に結合することができる。これらの非鉄イオンの結合は、中等度の量の鉄イオンの同時の結合によって増強される。鉄イオン又は非鉄金属イオンの結合はイン・ビトロ（試験管内）及びイン・ビボ（生体内）の両方において発生する。一般に、貯蔵構造類はイン・ビトロで予備負荷されたか、又は血液供給からの鉄イオンのようなイン・ビボの陽イオンで負荷された組織へ結合させることができる。特定貯蔵構造は、その貯蔵能力及び貯蔵された石灰化抑制剤の遊離速度に基づいて選択することができる。例えば、フェリチン又は他の金属結合タンパク質は一般に、本発明において有用であるとして関心を持たれる金属イオン内で飽和される必要はない。フェリチンは、相当に濃縮されたＡｌＣｌ₃溶液で精製フェリチンを培養することによって、例えばＡｌ⁺³を充填されることができる。タンパク質への結合は加熱及びｐＨ調整によって加速することができる。十分に長時間の培養の後、溶液をイオン交換樹脂の上を通過させるか、又はサイズ排除膜を通すことによって、遊離金属は取り除くことができる。天然に発生する金属貯蔵タンパク質を使用する代わりに、金属結合能力を作り出すために他のタンパク質を改変することができる。好ましいタンパク質は、免役グロブリン類のように高分子量を有するものである。タンパク質に金属単離化合物を共有結合させることができる。ポリアミノカルボキシレート又はポリアミノホスフォネートのような二官能キレート剤を、金属単離化合物としてのタンパク質へ結合させることによって、有意な金属結合能力を作り出すことができる。好ましい二官能キレート剤は、ブロモアセトアミド、マレイミド、イニドエステル、チオフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミルエステル、ピリジルジスルフィド、アジ化フィニル、ｏ−アシルイソウレア、ジアゾニウムヒドラジン、カルボニルヒドラジン、アミノヒドラジン、アシルヒドラジン、ジアゾニウムセミカルバジド、カルボニルセミカルバジド、アミノセミカルバジド、アシルセミカルバジド、チオセミカルバジド、及び１２から１６の原子環を有する環状ポリアミノカルボキシレート類及び環状ポリアミノホスフォネート類のような求電子性及び求核性部分を含んでいる。特定のキレート剤を選択することにより、結合金属イオンの所望の遊離速度を得ることができる。二官能キレート剤は、一般には従来方法によって、タンパク質に共有結合させることができる。代表的には、共有結合はタンパク質の選択されたアミノ酸残基とキレート剤に含まれる特定の官能基との間で形成されるであろう。タンパク質に結合するキレート剤の数は構造及び反応条件に依存するであろう。好ましいのは、各タンパク質へ少なくとも１種の二官能キレート剤を結合させることであり、より好ましいのは、各タンパク質へ複数の二官能キレート剤を結合させることである。金属イオンは、タンパク質へのキレート剤の共有結合前、結合時、又は結合後のいずれかの時点にキレート剤へ結合させることができる。反応条件はプロセスの選択順序に影響を及ぼす可能性がある。金属貯蔵タンパク質の使用の代替策は、金属陽イオンを貯蔵するための合成有機金属重合体の使用である。例えば、クエン酸第二鉄のアルカリ溶液は核を包囲しているクエン酸塩とともに水酸化第二鉄の核を有する重合体を形成することができる（T.G.Spiroらの論文：89 J.Amer.Chem.Soc．5555-5559頁（1967）を参照）。有機金属重合体のもう１つの例はビニルフェロセンであるが、これは炭素鎖に沿った芳香族環の間に多数のＦｅ⁺²イオンを含有している。ポリエステル類、ポリアミド類、ポリ尿素類及びポリウレタン類を含有しているセレニウムも又よく知られており、これも本発明に好適である。一般的に、これらの有機金属重合体の大多数は特性が明らかにされており、所望の金属イオン及び遊離速度に基づいて選択することができる。適当な外因性貯蔵構造は、金属イオン類の貯蔵に適した構造には限定されない。抗石灰化、特にホスファターゼ抑制剤には非金属化合物が含まれる。有機物質の貯蔵のための好ましい巨大分子貯蔵構造は合成高分子である。所望の石灰化抑制化合物は重合体鎖内の単量体であるか、又は重合体の側基に結合されることができる。所望の化合物が重合体に共有的又は非共有的のいずれの態様で結合していても、重合体は、選択された速度で分解して所望の化合物を産生するように設計されることができる。この分解は加熱プロセスによって、又は生体内の化学的及び生化学的環境との相互作用を通して発生させることができる。Ｄ．外因性貯蔵構造の結合生体適合性材料への外因性貯蔵構造の結合は、その材料内の特定の構造を標的とする特異的結合相互作用を含むことができる。その代わりに、結合は、例えば一般的な架橋剤との反応に起因する非特異的結合を含むことができる。一般的架橋剤の使用は、普通は、生物プロテーゼ用材料内の特定の場所で、外因性貯蔵構造が濃縮されることを妨害する。外因性貯蔵構造の結合は好ましくはほぼ生理学的ｐＨで、好ましくは約ｐＨ６からｐＨ８．５の間で、さらにより好ましくはｐＨ７．０からｐＨ８．０の間で発生する。非特異的結合のための方法の代表的な例ではグルタールアルデヒドを利用するが、グルタールアルデヒドはそれに含まれる２群のアルデヒド（基）によってタンパク質を架橋する。外因性構造を生物プロテーゼ用材料へ結合させる非特異的架橋結合は、組織の固定と同時に実施することができる。その代わりに、外因性貯蔵構造を結合させるための非特異的架橋結合は、固定プロセスの実施前又は完了後に、個別のステップとして実施することもできる。石灰化は特定の位置で開始する傾向があることが観察されているので、特定の位置を標的にすることは有用である。適切な標的の例には、核膜、細胞質の位置、血漿膜及び細胞外部位が含まれる。標的にされる結合の特徴は共有的であることもでき、あるいは、例えば抗体− 抗原、特異的結合−タンパク質受容体及び酵素−基質会合を特徴とする水素結合、ファンデルワールス相互作用及び分子転位のような、多数の非共有的相互作用を含むこともできる。特定の位置を標的にする好ましい方法は、貯蔵構造へのリンカー（linker）の共有結合及び多数の非共有結合的相互作用による生物プロテーゼ用材料とリンカーとの会合を含んでいる。ある特定の特異的受容体を有する細胞内又は細胞外部位を標的にするために、多種多様な、市販で入手可能な抗体及びその他の特異的結合試薬をリンカー、つまり標的分子として使用してもよい。その代わりに、生物学的材料の好ましい位置にある細胞又は細胞外コンポーネント（cellular component）を従来型技術によって単離することもできる。例えば、核膜あるいは、抗原又は抗原の群形成に対応する核膜の特異的部分を単離することができる。単離された材料はその後、ポリクローナル（poly clonal）又はモノクローナル（mono clonal ）抗体を従来型技術によって産生させるために使用される。その結果として生じた抗体は、生物プロテーゼ用材料に結合するように調製するために、外因性貯蔵構造に共有結合させられる。付加された抗体又は匹敵する標的分子を有する貯蔵構造は、本発明の目的に適した「貯蔵構造」であると見なされる。抗体への化合物の結合は、特に該化合物がタンパク質である場合は、技術的に明瞭に確立されている。鉄含量が高いために、一般にフェリチンが抗体に結合させられて組織学分野における電子顕微鏡プローブとして役立たせられている。好ましい実施態様では、グルタールアルデヒドが反応性タンパク質、即ちフェリチン及び免役グロブリンを架橋させるために使用される。本発明の発明者らは、石灰化がしばしば核膜に近い場所で開始されることを証明した。このため、好ましいアプローチには、核膜又は核膜の一部へ直接に指向される抗体の使用を含んでいる。この方法では、貯蔵構造はカルシウム沈積の早期事象に対して特に感受性の高い細胞構造を標的とされることができる。Ｅ．結合処理本発明の外因性貯蔵構造の結合は、金属塩溶液を用いる直接処理のプロセスと組み合わせることができる。塩溶液の金属塩濃度は一般的には０．００００１から０．１モルの間、より好ましくは０．００１から０．１モルの間である。生体適合性材料を金属塩溶液に接触させるのは、貯蔵構造の生体適合性材料への結合の前、後又はその間に行うことができる。生体内負荷のためには、鉄のような必要なイオン類の供給は宿主の血液供給によって生じさせることができるであろう。適切な塩には、何らの制約なしに、塩化アルミニウム、塩素酸アルミニウム、乳酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、硝酸アルミニウム、塩化第二鉄、硝酸第二鉄、臭化第二鉄、エデト酸ナトリウム第二鉄、硫酸第二鉄及びギ酸第二鉄が含まれる。金属塩はさらに又、生物プロテーゼに使用される重合体基質内に組み入れることもできる。金属塩は、それらが重合体基質内に組み入れられるように、好ましくは重合ステップ中に添加される。この方法では、石灰化抑制剤はより長期間に渡って、調節された速度で遊離される。その後、外因性貯蔵構造が重合体基質に結合させられる。好ましくは約０．００００１Ｍから約０．１Ｍの間の濃度のカルシウムイオン・キレート剤を、処理前に金属塩溶液に添加することができる。例えば、クエン酸塩類及びクエン酸はＡｌ⁺³及びＦｅ⁺³イオンの石灰化抑制作用を相乗作用的に増強することが明らかになった。同様に、エタンヒドロキシジホスフォネート（ＥＨＤＰ又はエチドロネート）及びアミノプロパンヒドロキシジホスフォネートを無制限に含むジホスフォネート塩類のような、その他のカルシウムイオンキレート剤も又、Ａｌ⁺³及びＦｅ⁺³イオンの抗石灰化作用における相乗作用的改善を生じさせる。特定の用途においては、これより高いか、又は低い濃度で使用することができる。外因性貯蔵構造の選択は、金属塩溶液のと組み合わせ処理によって影響を受けることがある。例えば、石灰化抑制剤の遊離速度を、より効果的な抑制又はより長期間にわたる抑制を生じさせるように、組み合わせ処理において選択することができる。Ｆ．陽イオン送達のための外因性タンパク質の使用金属結合能力を作り出すように外因性タンパク質を改変できるのと同様の方法で、外因性タンパク質を同様に改変することができる。例えば、生体適合性材料は、金属イオンを貯蔵するように、二官能キレート剤に結合させることができる。好ましい二官能キレート剤には、ブロモアセトアミド、マレイミド、イニドエステル、チオフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミルエステル、ピリジルジスルフィド、アジ化フィニル、ｏ−アシルイソウレア、ジアゾニウムヒドラジン、カルボニルヒドラジン、アミノヒドラジン、アシルヒドラジン、ジアゾニウムセミカルバジド、カルボニルセミカルバジド、アミノセミアルバジド、アシルセミカルバジド、チオセミカルバジド類及び１２から１６個の原子環を有する環状ポリアミノカルボキシレート類及び環状ポリアミノホスフォネート類のような求電子性及び求核性部分が含まれる。特異的キレート剤は、結合金属イオンの所望の遊離速度を生じさせるように選択することができる。二官能キレート剤は、上記の項Ｃにおいて記載したような、外因性タンパク質にそれらを結合させるのと同様の方法で、内因性タンパク質に共有結合させることができる。生体適合性材料に結合させられる二官能キレート剤の量は、材料中への石灰化抑制剤の所望の負荷を達成するように選択することができる。実験例本実験例は、塩化アルミニウムが負荷されている架橋結合フェリチンの生物プロテーゼ用材料に対する石灰化抑制効果を示すものである。ウマ脾フェリチン（ＨＳフェリチン）は、ミズーリ州セントルイスの（Saint Louis）シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Company）から入手した。ＨＳフェリチンの１００ｍｇ／ｍｌ溶液中の０．２５ｍｌ量が、０．０２５ｇのＫＨ₂ ＰＯ₄をも含有している０．１Ｍ塩化アルミニウム六水化物溶液１ｍｌと一緒に試験管に添加された。試験管はホイルで被覆され、インキュベーター内で１５０ＲＰＭの速度で攪拌しながら６８．２℃で２３時間に渡って培養された。計５４本の試験管が調製された。２３時間の攪拌後、フェリチンは１０，０００ダルトンの孔サイズの透析膜（スペクトラ・ポア［Spectra Pour］）を使用して、ＨＥＰＥＳ緩衝液に対して透析された。透析は、原子発光分析法を使用して、アルミニウム濃度がベースライン値であると見なされるまで継続された。フェリチン分子１個当たり約２５０個のアルミニウムイオンが結合させられたが、これはフェリチンがＡｌ⁺³イオンで飽和していないことを示していた。その後、使用準備が整うまで、透析管は０．０５０Ｍリン酸塩緩衝液中に置かれた。ブタ大動脈心臓弁は、動物を屠殺するためのＵＳＤＡガイドラインに従っている標準的供給業者から入手された。弁が剥離され、組織サンプルは弁尖部全体及び無作為８ｍｍ大動脈根バイオプシ．用パンチから調製された。弁尖は約１０ｍｇの乾量を有し、大動脈根組織は約２０mgの乾量を有していた。各組織サンプルはアルミニウム負荷フェリチンを含有する個別の透析バッグに入れられた。組織サンプルを含有する透析バッグは、その後約１週間に渡り、室温で０．０５０ＭのＨＥＰＥＳ生物学的緩衝液（ｐＨ７．４）（シグマ・ケミカル社製、ロット番号７５Ｈ５７１６）を用いて緩衝された０．５％グルタールアルデヒド溶液中に入れられた。これに類似する組織サンプルが、アルミニウム負荷フェリチンを含まないＨＳフェリチンを用いて調製された。試験管内での陽イオンの送達を測定するために、フェリチン処理大動脈根及び弁尖組織サンプルは、室温で約４０６時間に渡りＨＥＰＥＳ中に置かれた。その結果として生じた溶液は、ＩＣＰ−ＡＥＳ（高周波誘導結合プラズマー原子発光分光分析）を使用してアルミニウム及び鉄陽イオンについて分析された。両方の陽イオンの微量（約０．０１から０．３５ｐｐｍ）が溶液中で検出された。処理された組織サンプルの石灰化に抵抗する能力を測定するために、生体内試験が実施された。本試験では、フェリチン処理及びアルミニウム負荷フェリチン処理の両方で処理された弁尖及び大動脈根組織サンプルが使用された。４種の各々について各９例、つまり計３６例の処理サンプルが使用された。さらに、１８例の対照（control）組織サンプルも使用されたが、それらのうちの９例はブタ大動脈弁尖組織で、残り９例はブタ大動脈根組織であった。対照サンプルは、生体内試験の前にＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて緩衝された０．５％のグルタールアルデヒド溶液を用いて架橋結合させられた。サンプルは、汚染を防止するために、無菌法を用いて取り扱われた。３６例の処理サンプル及び１８例の対照サンプルは、カラーコード縫合糸を用いて、若年雄性ラットの背部の皮下に埋殖された。各タイプ９例ずつの２重サンプル中、３例は埋殖から２１日後に切除され、残り６例は埋殖から６３日後に切除された。除去後、サンプルは分析前に０．９％生理食塩水（Ｈ₂ＯにＮａＣｌを溶解させたもの）中に入れられた。各組織サンプルは生理食塩水から取り出され、半分に切片化された。組織サンプルの半分の片方部分は宿主（即ち、ラット）組織を取り除かれ、元素分析のために使用された。組織サンプルのもう一方の半分は１０％ホルマリン液中に入れられ、組織学検査のために保管された。回収された組織の元素分析は、まず最初に組織を乾燥させることによって実施された。乾燥した組織は濃硝酸中に溶解させられた。その結果として生じた溶液はＩＣＰ−ＡＥＳを受けた。元素分析測定で得られた数値は下記の表にまとめられている。これらの数値は３回（２１日間）又は６回（６３日間）の測定の平均値である。これらの結果は、アルミニウム負荷フェリチンを用いて処理した後の弁尖及び大動脈根組織の各々について、２１日間の埋殖後には、石灰化が約２．０％及び１．８％に低減したことを示している。一方フェリチン処理の場合は、カルシウム濃度（level）は弁尖及び大動脈根組織の各々について１１．６％及び１７．８％に低減された。埋殖から６３日（約２ヶ月）後には、アルミニウム負荷フェリチン処理の場合は、４．６％及び１．６％への石灰化の低減が弁尖及び大動脈根組織各々について観察された。カルシウム濃度は、６３日間の埋殖後には、弁尖及び大動脈根組織各々について２９．８％及び４６．２％に低減した。従って、天然（部分的に鉄負荷された）フェリチン、及び特にアルミニウム負荷フェリチンを原因とする石灰化の顕著な低減が明らかにされた。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Title of invention Calcification resistant biomaterial Background of the Invention The present invention relates to a prosthetic material that has been treated to reduce calcification. Related. More specifically, the present invention provides for the release of slowly released calcification inhibitors Materials for prostheses. Biological prostheses, or bioprosthetic devices, are intended to damage or affect humans and animals. It is used to repair or replace affected organs, tissues and other organs. Creature Prostheses are generally biocompatible because they are typically buried for long periods of time. There must be. In particular, biological prostheses include mammalian tissues and others. Composed artificial heart, artificial heart valve, ligament repair material, vascular repair material, surgical patch Can be included. Biological prostheses are made from combinations of natural or synthetic materials It can also be configured. Calcification, ie calcium salts, especially calcium phosphate (hydroxyapatite ) Is deposited inside and outside of some materials used in the manufacture of implantable bioprostheses. And on the surface. This is especially true over long periods of time from these biomaterials. Affects the performance and structural integrity of the medical device being constructed. For example, calcification A major cause of clinical failure of porcine aortic valves or living heart valves made from bovine pericardium You. Calcification is also composed of synthetic materials such as polyurethane. It also has a significant effect on the performance of selected bioprostheses. Animal-derived bioprosthetic heart valves are extremely replacements for damaged human heart valves Significant attention to the impact of calcification on these xenografts due to their importance Are gathering. Bioprosthetic heart valves made from natural materials in the early 1960s Introduced, typically from porcine aortic valves or other sources such as bovine pericardium Manufactured from physical materials. Heterologous heart valves typically develop immunological rejection Fixed with glutaraldehyde prior to transplantation to reduce the likelihood of It is. Glutaraldehyde reacts with free amino groups in proteins to form a covalent bond And thereby chemically crosslink nearby proteins. In general, bioprosthetic heart valves begin to weaken about seven years after implantation and 20 years later However, there are few biological valves that retain their functions. Placement of deteriorating artificial valve Replacement is an additional risk of surgery, especially in the elderly and emergency replacement situations. To the patient. Bioprosthesis failure is a problem for patients of all ages Yes, but especially in younger patients. If the patient is under 15 years old, More than 50% of living prosthetic valves fail within 5 years due to calcification. Similarly, polyurethane capsules in artificial hearts and valves in polyurethane valves Apical (lobular) calcification can also be clinically significant. Other natural and / or Or biological prostheses made from synthetic materials Mussels show clinically significant calcification. As a result, implanted biomaterials, especially calcium deposits on prosthetic valves, There is considerable interest in preventing accumulation. About prevention of calcification Research has given considerable weight to the pretreatment of biomedical materials prior to implantation. So Here, it is intended to reduce calcification by reducing calcium nucleation. As illustrated, use detergents or detergents (eg, sodium dodecyl sulfate) to pre-treat tissue. Um), toluidine blue or diphosphonates. But this These substances are relatively quickly washed from the bioprosthetic material into the body fluid around the implant. Their effectiveness is limited because they tend to be washed away. Another approach to reducing calcification is through chemical processes The removal of at least a portion of the reactive glutaraldehyde moiety from the tissue Was. Yet another approach involved the development of alternative fixation methods, Does this fixation process itself cause calcification and consequent mechanical degradation? Evidence was given. In addition, there is no Non-viable cells are the site of calcium deposition, so tissue Various processes for removing cellular material from collagen-elastin matrix Has been developed. Significant progress in reducing the calcification of bioprostheses is due to Al⁺³Cation And other multivalent cations prevent calcification That fact was confirmed. The material for bioprostheses is AlCl prior to implantation._ThreeAcidic Treated with aqueous solution. Some Al after being removed from the processing solution⁺³Positivity Cations are washed away, but a significant amount of cations are treated over a long period of time. Stays bonded to the material. This is probably cation and bioprosthesis material It may be due to some kind of meeting with a fee. Negative ions in bioprosthetic materials Loading is likely to reach a limit. Al associated⁺³Cations apparently contribute to significant suppression of calcium deposition I'm crazy. Furthermore, the effect is quite long in young animals. It lasted for at least several months. Fe⁺³Treatment with salt is similar in reducing calcification Has been observed to produce efficacy. Alkaline phosphatase is involved in calcification of biological prostheses I have been. Calcification causes cell destruction and, correspondingly, Ca from cells.⁺²Pump Out of cellular calcium regulation, maintaining low intracellular calcium concentration Seems to be related to the interruption. Cell damage can include mechanical damage, extreme pH levels, extreme Excellent ion concentration and / or results of chemical fixation such as glutaraldehyde treatment Occurs as Cell damage is the uncontrolled flow of calcium into nonviable cells. Bring in. Calcification of physiologically normal skeletal and dental tissues and bioprostheses Pathological calcification such as the first of apatite minerals It has important similarities, including early deposition. These mineral deposits are calcium Mineral growth occurs in nuclei produced by the initial deposits Live. Nucleation in bone development depends on high concentrations of calcium-binding phospholipids and high activity Phosphatases, especially structures with alkaline phosphatase appear. Alkaline phosphatase activity is particularly high in children, May be responsible for serious calcification problems for bioprostheses buried in the elderly There is. The phosphatase activity is_ThreeAnd FeCl_ThreeBy culturing with Has been shown to be suppressed. The consequence of this is to reduce calcification Al in⁺³And Fe⁺³Cation action results from suppression of phosphatase activity Suggests that Alternatively or additionally, these ions It acts by substitution into the hydroxyapatite crystal lattice, destabilizing the crystal. Growth can be prevented by doing so. Summary of the Invention In general, the invention comprises at least one associated exogenous storage structure, wherein said storage structure Biocompatible material with a large amount of calcification inhibitor releasably bound to it It is characterized by being a biological prosthesis. Biocompatible materials include natural tissue Can be taken. The natural tissue is the porcine heart valve, aortic root, wall, and / or leaflets; Bovine pericardial tissue, connective tissue such as hard (brain) membrane, allograft, bypass graft A group consisting of feet, keys, ligaments, skin patches, blood vessels, human contracting tissues and bone You can choose from. Alternatively or additionally, the biocompatible material A polymer can be included. The storage structure may be a protein such as ferritin. The storage structure also matches It may be a synthetic polymer. Calcification inhibitors associated with storage structures are metal cations Contains. The metal cation is preferably Al⁺³, Fe⁺³, And Mg⁺²From Selected from the group formed. Calcification inhibitors are furthermore diphosphates and phosphoric acids. Contains Tase inhibitors. The phosphatase inhibitor is preferably a phosphate Ons, Ga⁺³, La⁺³, Borate ions, oxalate ions, cyanide Ions, L-phenylalanine, urea, excess Zn⁺², Glycine, propylamid , Lavamisole and arsenate ions. In bioprostheses, the attachment of the storage structure to the biocompatible material is preferably It is mainly a covalent bond. Instead, the bioprosthesis preferably has a large number of non- It has a storage structure binding to a biocompatible material characterized by covalent interactions. The exogenous storage structure preferably further contains a targeting molecule. In a related aspect, the invention features a method of preparing a biocompatible material. This method combines multiple exogenous macromolecular storage structures into a biocompatible material Wherein the macromolecular storage structure comprises a large amount of stones releasably bound thereto. Has an ashing inhibitor. In a preferred method, said binding comprises attaching said macromolecular storage structure to said biocompatible material. It is performed by chemically cross-linking. In another preferred embodiment, The conjugation is performed by a target using an adhesion molecule. In another preferred method, the method further comprises contacting the biocompatible material with metal ions. Step. In another related aspect, the bioprosthesis has multiple cells releasably associated with it. With a bound bifunctional (bifunctional) chelating agent having an amount of metal cation Contains biocompatible materials. An advantage of the present invention is that it directs calcification inhibitors to selected portions of the biocompatible material. Ability. Another advantage of the present invention is that it increases the loading of calcification inhibitors in the material. It is possible to make it. Yet another advantage of the present invention is that a calcification inhibitor Ability to select release time to desired value. Yet another advantage is proper physiology The ability to process biocompatible materials under biological conditions. The present invention permits release of biocompatible materials into the microenvironment for a controlled period of time. While allowing the use of a wide range of anticalcification agents. Yet another advantage of the present invention Describes the location of the biocompatible material in direct contact with the calcification inhibitor and the extrinsic storage structure. Is used in combination. In another aspect, the invention has at least one associated exogenous storage structure A bioprosthesis comprising a biocompatible material, wherein the storage structure is a bioprosthesis; About 0.5mg or less per 1g of body compatible material Above, collectively having a metal cation releasably bound thereto. Than Preferably, the storage structure comprises at least about 10.0 mg of metal oxide per gram of biocompatible material. It has ions collectively. Even more preferably, the storage structure is a biocompatible material About 15.0 mg or more of metal cations per gram of the material. In another aspect, the invention relates to a natural set having at least one associated exogenous storage structure. Contains a bioprosthesis that includes a weave. And the storage structure has It has a large amount of releasably bound calcification inhibitors and its natural tissues are mammalian Approximately two months after subcutaneous implantation into an equivalent natural tissue that does not contain a bound exogenous storage structure In comparison, calcium deposition was reduced by more than 95%. In another aspect, the invention comprises binding ferritin to natural tissue. Includes a method for producing a biological prosthesis, wherein ferritin contains Calcification inhibition such that there is at least 0.5 mg of metal cations per gram of tissue. Antistatic metal cations are loaded. In another aspect, the invention is directed to a bioprosthesis at a pH between about 6.0 and 8.5. Bioprosthesis, comprising chemically binding a calcification inhibitor to the application material. Includes manufacturing method. Other advantages and features of the invention will be apparent from the following detailed description, and from the claims. Will be. Detailed description of the invention The bioprosthesis of the present invention is a bioprosthesis having a binding structure for storing a calcification inhibitor. It is composed of a compatible material. The slow release of these substances from storage structures over time Inhibits the deposition of calcium salts, especially calcium phosphate, on biocompatible materials . The use of combined storage structures containing calcification inhibitors may be It offers considerable diversity through the choice of calcification inhibitors. If there is a clear link between calcification and bioprosthesis degradation, to what extent Even so, suppression of calcium deposition is useful. The suppression of the desired degree At least about 50 to 75% for two months compared to non- Reduces calcium deposition. A more favorable degree of suppression is calcium deposition At least 90%, even more preferably at least about 2 months after breeding Reduce to 95%. Methods for preparing a biocompatible material with a storage structure require near physiological conditions. Similar conditions can be used. Selection of storage structure and storage in biocompatible material Depending on the attachment of the storage structure, the amount of calcification inhibitor in the bioprosthesis substrate is considerable It can be large. For metal cations, the preferred loading is dry tissue About 0.5 mg or more ions / g, more preferably about 0.5 mg / g of dry tissue 10 mg or more ions, even more preferably about 15 mg / g of dry tissue It has the above ions. Calcification inhibitors generally inhibit calcium formation. You can choose to control Include enzymes for hydroxyapatite formation such as alkaline phosphatase Can be selected to suppress the action of the sexual precursor. One or more stones Use of many different storage structures holding ashing inhibitors in a single bioprosthesis can do. A.Biocompatible materials The bioprosthesis (bioprosthesis product) of the present application may be a human or animal host. It is a device that is buried (transplanted) in the body. Biological prostheses are one or more living organisms Made from compatible materials and adapted for long-term implantation in a host. Inn It may be useful to give mainly immunosuppressant therapy, but this therapy is not needed. There are many things. At least one of these biocompatible materials has a bonded storage structure be able to. The storage structure stores a large amount of calcification inhibitor (one or more) I have. The biocompatible material preferably comprises a biological or polymeric material. part Although some prostheses can be composed entirely of metallic components, these prostheses Generally not relevant to the present invention. The biological prosthesis included in the present invention may be a biological material. Material and / or a mixture of materials, such as metal parts having synthetic polymer parts May be configured. Suitable bioprostheses include, without limitation, artificial hearts, Surgery composed of artificial heart valves, ligament repair materials, bypass grafts, and mammalian tissue Includes patches, etc. Biological material for use in the present invention is a relatively intact tissue or tissue. Contains decellularized tissue. These tissues include, for example, heart valves, aortic roots, walls, And parts of the heart valve, such as leaflets, and pericardial tissue, such as pericardial patches, like dura Connective tissues, allografts, bypass grafts, keys, ligaments, skin patches, blood vessels, It can be obtained from cartilage, human umbilical cord tissue and others. Generally, these organizations Various animal species, typically such as humans, cows, pigs, seals and kangaroos Includes collagen-containing and tissue-engineered materials derived from mammals. Organization The engineered material contains a repopulated absorbent substrate, which is It is in the form of a synthetic tissue. However, in general, biological tissue is not necessarily soft tissue Need not be. Tissue samples are typically fixed by crosslinking the tissue. And provides mechanical stabilization by preventing enzymatic degradation of tissue. No fixation of the sample is necessary. Gluta is typically used to fix cells. Aldehydes are used, but epoxides and other bifunctional aldehydes Other fixatives such as can also be used. Structural substrates from which cellular material has been removed, such as collagen and elastin structural substrates Can be used to produce a decellularized tissue mainly composed of Decellularization process Can include the application of enzymes, other chemicals and physical treatments . For example, U.S. Patents in co-pending applications, which are hereby incorporated by reference in their entirety. Reference is made to application Ser. No. 08 / 424,218. Biocompatible polymeric materials for use in the bioprostheses of the present invention include: It includes synthetic polymers as well as purified and woven biological polymers. Composite height Molecules include polyamides (nylon), polyesters, polystyrene, poly Acrylates, vinyl polymers (eg, polyethylene, polytetrafluoroe (Tylene, polypropylene and polyvinyl chloride), polycarbonate, polyurethane , Polydimethylsiloxane, cellulose acetate, polymethyl methacrylate, vinegar Includes vinyl ethylene acid, polysulfone, nitrocellulose and similar copolymers. I will. These synthetic polymeric materials form a matrix, Can be woven into a mesh. Instead, synthetic polymer materials were chosen It can also be formed or cast into a shape. Purified raw material that can be properly molded into a substrate Physical polymers include polysaccharides (eg, cellulose and starch), polyamino acids, Includes lagen, gelatin and intestinal sutures. B.Calcification inhibitor Biological and polymeric materials can vary to varying degrees depending on the composition and structure of the material. Indicates sensitivity to calcification. The mechanism of calcification is not completely understood, Shows similarity to calcium deposition associated with bone formation. Phosphatases In particular, alkaline phosphatase plays an important role in the pathological calcification process (R.J.Levy et al .: 25J. Biomedical Materials Resea rch 905-935 (1991)). The present invention provides for the regulation of cells at the cellular level inside and around a particular biological prosthesis. The introduction or delivery of the anti-calcification agent by any method. Calcification Deliver a low total amount of active agent while retaining effectiveness for reduction or suppression Can be The amount may be small, so the recipient (the recipient) Although non-toxic to them, they do not Significantly higher loads can be represented compared to the local environment of the thesis. Calcification inhibitors include compounds that inhibit nucleation of calcification and alkali phosphines. Vatase inhibitors (see US Pat. No. 5,368,608 to Levy et al.). ). Anticalcification agents can be used for extended periods to significantly extend the useful life of a bioprosthesis. Is preferably released over a period of time. Release of anticalcification agents above background concentration is preferred Or for months, more preferably for years. Al⁺³, Mg⁺²And Fe⁺³Ions have been proven to be calcification inhibitors Reduces calcification of bioprostheses when delivered in a time-controlled release manner It is effective to make it. Ga⁺³, La⁺³Other polyvalent cations, such as Suppresses hydroxyapatite-forming function of enzymatic precursors such as phosphatase It is known to control. The present invention includes multivalent cations in biocompatible materials. Includes controlled association and slow release of calcification inhibitors. Beryllium has considerable toxicity, but Be⁺²Ions also suppress phosphatases It is known that Other phosphatase suppression Agents include phosphate ions, Ga⁺³, La⁺³, Borate ions, oxalic acid Salt ions, cyanide ions, L-phenylalanine, urea, excess Zn⁺², Glycine, propylamine, labamisol and arsenate ions are included. Al Kaliphosphatase function is also affected by the Mg / Zn ion ratio. Other calcification inhibitors include diphosphates. C.Extrinsic storage structure The storage structure is used for storage and slow release of the calcification inhibitor. Preferred Storage structures can be naturally occurring, such as natural or synthetic proteins or suitable synthetic macromolecules. It may be a microscopic macromolecular composition. However, the preferred set of compositions must be microscopic. It must be understood that there is no need. Stored by an extrinsic storage structure Calcification inhibitors are generally any calcification inhibitors such as polyvalent metal cations. May be. The term “protein” refers to an entity linked by peptide bonds. Not only amino acids but also amino acids with carbohydrates, nucleic acids and / or lipids It should be understood that it also means a conjugated protein. Significant concentration of Al in solution⁺³Biological material treated with cations is A l⁺³Associated with cations. Al observed⁺³Cations and natural biological substrates Association is probably due to binding to naturally occurring ferritin . Ferritin has a considerable amount of iron, thousands of iron ions per protein molecule. Stores iron ions It is an iron storage protein that can be stored. Ferritin is also similar, but less Large amount of Al⁺³And only other non-ferrous ions can be stored. Naturally occurring Ferritin is probably a protein or other biological or synthetic group during fixation. It may be cross-linked or otherwise bound to the quality. Natural ferritin is Al⁺³, Fe⁺³, Mg⁺²Cations like the others Will slowly release into the local environment. The storage structure of the present invention is a biocompatible material (Exogenous ferritin) any naturally occurring like ferritin already present inside Added to or used as a substitute for the raw structure. In this way, Efficacy is provided by an external source (exogenous storage structures such as exogenous ferritin) Can be strengthened through the use of storage structures. Suitable protein storage structures within the scope of the present invention include ferritin, transfer Phosphorus, hemoglobin, metallothiene, myoglobin, ceruloplasmin and hemo Metal-binding proteins such as cyanine, as well as to generate metal-binding ability And a modified (modified) protein to which a bifunctional chelating agent is added. Ferries Chin is a preferred metal binding protein due to its large storage capacity . Apoferritin (ferritin protein without binding metal) has a molecular weight of about 4 It is a protein consisting of 50,000 24 subunits. However, this The molecular weight will vary depending on the species from which ferritin was isolated. Different numbers of subunits Related proteins with kits Are also within the scope of the present invention. Ferritin nuclei can store between about 2,000 and about 4,500 iron ions. Can be. For example, horse spleen ferritin is approximately 2,500 in human ferritin. About 4,500 iron ions can be bound as compared to one iron ion. Iron is stored in the nucleus as ferric oxide or ferric hydroxyphosphate. Ferries Tin is also a metal ion such as Al, Mg, Be, Cu, Zn, V, Tb, and Cd. And other metal ions can be bound in large amounts. The binding of these non-ferrous ions Is enhanced by the simultaneous binding of moderate amounts of iron ions. Iron ion or non The binding of iron metal ions can occur both in vitro (in vitro) and in vivo (in vivo). Occur on the side. Generally, storage structures are preloaded in vitro, Or to tissues loaded with in vivo cations, such as iron ions from the blood supply Can be combined. The specific storage structure is based on its storage capacity and the rate of release of stored calcification inhibitors. You can choose. For example, ferritin or other metal binding proteins Generally, the saturation within the metal ions of interest as being useful in the present invention. Need not be. Ferritin is substantially enriched in AlCl_ThreePurified ferri solution in solution By culturing tin, for example, Al⁺³Can be filled. Tampa Binding to the matrix can be accelerated by heating and pH adjustment. Long enough After incubation, pass the solution over the ion exchange resin or Alternatively, free metals can be removed by passing through a size exclusion membrane. Instead of using naturally occurring metal storage proteins, create metal binding capacity Other proteins can be modified for delivery. Preferred proteins are It has a high molecular weight like a working globulin. Metal isolation for proteins The compound can be covalently linked. Bifunctional keys such as polyaminocarboxylates or polyaminophosphonates Conjugates to proteins as metal-isolated compounds. It is possible to create a unique metal binding ability. Preferred bifunctional chelating agents are Moacetamide, maleimide, inide ester, thiophthalimide, N-hydro Xysuccinimil ester, pyridyl disulfide, finyl azide, o-acy Luisourea, diazonium hydrazine, carbonyl hydrazine, aminohydra Gin, acylhydrazine, diazonium semicarbazide, carbonyl semicarba Zide, aminosemicarbazide, acylsemicarbazide, thiosemicarbazide, and Polyaminocarboxylates having 12 to 16 atomic rings and cyclic polyaminocarboxylates It contains electrophilic and nucleophilic moieties such as laminophosphonates. specific The desired rate of release of bound metal ions can be obtained by selecting a suitable chelating agent. Can be. Bifunctional chelators are generally added to proteins by conventional methods. They can be covalently bonded. Typically, a covalent bond is selected for the protein Will form between amino acid residues and specific functional groups contained in the chelating agent . The number of chelating agents that bind to a protein will depend on structure and reaction conditions . Preferably, at least one bifunctional chelator is attached to each protein. More preferably, multiple bifunctional chelators are attached to each protein. It is to match. Before the covalent attachment of the chelating agent to the protein, The chelator can be attached at the time of conjugation or at any time after conjugation. Reaction conditions can affect the order of process selection. Alternatives to the use of metal storage proteins are synthetic alternatives for storing metal cations. The use of metal polymers. For example, an alkaline solution of ferric citrate surrounds the nucleus Forming a polymer having a ferric hydroxide nucleus with the citrate (See T.G. Spiro et al., 89 J. Amer. Chem. Soc., Pp. 5555-5559 (1967)). ). Another example of an organometallic polymer is vinyl ferrocene, which has a carbon chain Fe between the aromatic rings along⁺²Contains ions. Polyesters, Selenium containing polyamides, polyureas and polyurethanes is also It is well known and is also suitable for the present invention. Generally, these organometallic polymers The majority of the body is characterized and based on the desired metal ion and release rate. You can choose. Suitable extrinsic storage structures are not limited to structures suitable for storing metal ions . Anti-calcification, especially phosphatase inhibitors, include non-metallic compounds. Organic substances Preferred macromolecule storage structures for storage of proteins are synthetic macromolecules. The desired calcification inhibiting compound is a monomer in the polymer chain or Can be combined. Whether the desired compound is covalent or non-covalent to the polymer The polymer is decomposed at the selected rate to form the desired compound. It can be designed to produce. This decomposition is due to the heating process or Can be generated through interactions with the chemical and biochemical environment in living organisms. You. D.Connecting extrinsic storage structures Binding of an extrinsic storage structure to a biocompatible material targets specific structures within that material Specific binding interaction. Instead, the join is, for example, Non-specific binding due to reaction with common crosslinking agents can be included. General frame The use of a bridging agent is usually at a specific location within the bioprosthesis material at an Prevents the structure from being concentrated. Binding of the extrinsic storage structure is preferably nearly physiological At a typical pH, preferably between about pH 6 and pH 8.5, even more preferably p Occurs between H7.0 and pH 8.0. A typical example of a method for non-specific binding utilizes glutaraldehyde However, glutaraldehyde contains two groups of a The protein is cross-linked by aldehyde (group). Exogenous structures for biological prostheses Non-specific cross-linking to the material can be performed simultaneously with tissue fixation. You. Instead, non-specific cross-links to attach exogenous storage structures are fixed. Can be performed as a separate step before or after the completion of the fixed process . It has been observed that calcification tends to start at certain locations, It is useful to target a location. Examples of suitable targets include nuclear envelope, cytoplasmic location , Plasma membrane and extracellular sites. The characteristics of the targeted binding can be covalent or, for example, antibody- Hydrogen bonding characterized by antigen, specific binding-protein receptor and enzyme-substrate association Many non-covalent interactions, such as van der Waals interactions and molecular rearrangements Can also be included. A preferred method of targeting a specific location is to access the storage structure. Biological proteins through the covalent bonding of linkers and numerous non-covalent interactions Includes the association of the enzyme material with the linker. To target intracellular or extracellular sites with certain specific receptors, A variety of commercially available antibodies and other specific binding reagents It may be used as a target molecule. Instead, the preferred position of biological material Cell or extracellular component in a conventional technology Therefore, it can be isolated. For example, in the nuclear membrane or in the formation of antigens or antigens The specific part of the corresponding nuclear membrane can be isolated. Isolated wood After that, the material is either polyclonal or monoclonal. 2.) Used to raise antibodies by conventional techniques. Consequently Antibodies can be stored in exogenous storage to prepare them for binding to bioprosthetic materials. Covalently attached to the structure. Storage structures with added antibodies or comparable target molecules are suitable for the purposes of the present invention. Is considered a “storage structure”. The binding of a compound to an antibody may be Where is a protein, it is clearly established in the art. Due to high iron content In general, ferritin is bound to an antibody and used in electron microscopy in the field of histology. Used as a robe. In a preferred embodiment, glutaraldehyde To crosslink reactive proteins, ferritin and immunoglobulin used. The inventors of the present invention have demonstrated that calcification is often initiated near the nuclear envelope. Revealed. For this reason, a preferred approach is to direct the nuclear envelope or part of the nuclear envelope directly Includes the use of antibodies. In this way, the storage structure has a rapid calcium deposition Cell structures that are particularly sensitive to phasic events can be targeted. E. FIG.Join processing The connection of the extrinsic storage structure of the present invention is a direct treatment process using a metal salt solution. Can be combined. The metal salt concentration of the salt solution is generally 0.00001 Between 0.1 and 0.1 mole, more preferably between 0.001 and 0.1 mole. Living body Compatible material dissolved in metal salt Contact with the liquid may occur before, after or during the coupling of the storage structure to the biocompatible material. It can be carried out. For in vivo load, supply of necessary ions such as iron It could be produced by the host's blood supply. Any suitable salt Aluminum chloride, aluminum chlorate, aluminum lactate, sulfur Potassium aluminum salt, aluminum nitrate, ferric chloride, ferric nitrate, bromide Includes ferric, sodium ferric edetate, ferric sulfate and ferric formate. Metal salts can also be incorporated into polymeric substrates used in bioprostheses. Can also be. Metal salts are preferred so that they are incorporated into the polymer matrix. Or during the polymerization step. In this way, the calcification inhibitor can be Over time, it is released at a controlled rate. Later, the extrinsic storage structure becomes a polymer matrix. Combined. Calcium ions, preferably at a concentration between about 0.00001 M and about 0.1 M A chelating agent can be added to the metal salt solution before processing; For example, Acid salts and citric acid are Al⁺³And Fe⁺³Synergistic effect of ion calcification suppression It was found to be enhanced. Similarly, ethane hydroxy diphosphonate ( EHDP or etidronate) and aminopropane hydroxydiphosphonate Other calcium ions such as diphosphonate salts containing unlimited The coating agent is also Al⁺³And Fe⁺³Anticalcification of ions Causes a synergistic improvement in Higher for certain applications Or lower concentrations. The choice of the extrinsic storage structure is affected by the combined treatment with the metal salt solution Sometimes. For example, the rate of release of the calcification inhibitor can be reduced more effectively or Choose in combination processing to produce long-term suppression Can be. F.Use of exogenous proteins for cation delivery Similar methods that can modify exogenous proteins to create metal binding capacity Thus, the exogenous protein can be similarly modified. For example, biocompatible materials Can be conjugated to a bifunctional chelator to store metal ions . Preferred bifunctional chelators include bromoacetamide, maleimide, inidee Stele, thiophthalimide, N-hydroxysuccinimil ester, pyridyldi Sulfide, finyl azide, o-acylisourea, diazonium hydrazine , Carbonylhydrazine, aminohydrazine, acylhydrazine, diazonium Semicarbazide, carbonyl semicarbazide, aminosemialbazide, acylse Micarbazide, thiosemicarbazide and cyclic having 12 to 16 atomic rings Such as polyaminocarboxylates and cyclic polyaminophosphonates; Electronic and nucleophilic moieties are included. Specific chelators may be used to bind bound metal ions Can be selected to produce a release rate of Bifunctional chelators may be exogenous as described in Section C above. Share with endogenous proteins in a manner similar to attaching them to endogenous proteins Can be combined. Bifunctional chelating agents bound to biocompatible materials The amount can be selected to achieve the desired loading of the calcification inhibitor into the material. Wear. Experimental example This experimental example demonstrates the bioplating of cross-linked ferritin loaded with aluminum chloride. Fig. 3 shows a calcification inhibitory effect on a material for a rotation. Horse spleen ferritin (HS ferritin) was purchased from Saint Louis, Missouri. Louis) obtained from Sigma Chemical Company. HS 0.25 ml volume of a 100 mg / ml solution of eritin is_Two PO_FourWith 1 ml of a 0.1 M aluminum chloride hexahydrate solution also containing Added to test tube. The test tubes are coated with foil and placed in an incubator for 150 The culture was incubated at 68.2 ° C. for 23 hours with stirring at the speed of RPM. 54 in total Test tubes were prepared. After stirring for 23 hours, ferritin was converted to a dialysis membrane with a pore size of 10,000 daltons ( Use Spectra Pour) to transmit to HEPES buffer. Was analyzed. Dialysis uses atomic emission spectrometry to determine the baseline aluminum concentration. Continued until it was considered About 250 per ferritin molecule Aluminum ions were bound, which was⁺³at Ion It was not saturated. Thereafter, the dialysis tubing is kept at 0. 1 until ready for use. Placed in 050M phosphate buffer. Porcine aortic heart valves comply with USDA guidelines for sacrifice animals Obtained from standard suppliers. The valve was detached and the tissue sample was spread over the entire leaflet. And random 8 mm aortic root biopsy. Prepared from punches. The leaflet is about 10m g dry weight and the aortic root tissue had about 20 mg dry weight. Each tissue sample Were placed in separate dialysis bags containing aluminum loaded ferritin. Organization The dialysis bag containing the sample is then stored at room temperature at 0.050M for approximately one week. HEPES biological buffer (pH 7.4) (manufactured by Sigma Chemical Co., Lot No. No. 75H5716) in a 0.5% glutaraldehyde solution buffered with Was put in. A similar tissue sample contains aluminum-loaded ferritin. It was prepared using fresh HS ferritin. To measure cation delivery in vitro, ferritin-treated aortic roots and The leaflet tissue samples were placed in HEPES for approximately 406 hours at room temperature. That The resulting solution was ICP-AES (high frequency inductively coupled plasma-atomic emission Spectroscopy) were analyzed for aluminum and iron cations. Both Trace amounts of cations (about 0.01 to 0.35 ppm) were detected in the solution. In vivo tests were performed to determine the ability of treated tissue samples to resist calcification. The experiment was performed. In this study, ferritin treatment and Valve leaflet and aortic root tissue sumps treated with both luminium-loaded ferritin treatment Was used. Nine cases for each of the four types, ie, a total of 36 processed samples Was used. In addition, 18 control tissue samples were also used, Nine of them were porcine aortic leaflet tissue and nine were porcine aortic root tissue. Was. Control samples were buffered with HEPES buffer prior to in vivo testing Crosslinked using a 0.5% glutaraldehyde solution. sample Handled using aseptic methods to prevent contamination. 36 treated samples and 18 control samples used color coded sutures. And implanted subcutaneously on the back of young male rats. Double sun with 9 cases of each type Of the pulls, 3 were resected 21 days after implantation and the remaining 6 were resected 63 days after implantation. Removed. After removal, the samples were washed with 0.9% saline (H_TwoNaCl for O Was dissolved). Each tissue sample was removed from saline and sectioned in half. Tissue sun One half of the pull had host (ie, rat) tissue removed and analyzed for elemental analysis. Used for Place the other half of the tissue sample in 10% formalin solution And stored for histological examination. Elemental analysis of the recovered tissue is performed by first drying the tissue. Was done. The dried tissue was dissolved in concentrated nitric acid. The resulting solution Received ICP-AES. The values obtained by elemental analysis are summarized in the table below. These numbers are The average of three (21 days) or six (63 days) measurements. These results show that the leaflets and leaflets after treatment with aluminum loaded ferritin For each of the aortic root tissues, after 21 days of implantation, calcification was about 2.0% and It shows that it was reduced to 1.8%. On the other hand, in the case of ferritin treatment, Levels were 11.6% and 17.2 for leaflet and aortic root tissue, respectively. Reduced to 8%. 63 days (about 2 months) after breeding, In the case of lithin treatment, the reduction of calcification to 4.6% and 1.6% is due to the leaflets and aorta. Observed for each root tissue. Calcium concentration is 63 days After implantation between 29.8% and 46.2% for leaflet and aortic root tissue respectively Reduced to Therefore, natural (partially iron-loaded) ferritin, and especially A marked reduction in calcification due to minium-loaded ferritin was revealed.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者オウグル，マシュー，エフ. アメリカ合衆国 55105 ミネソタ州、セントポール、ジュリエットアベニュー 2053────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, S Z, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD , RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ , BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, G E, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR , KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, P L, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK , TJ, TM, TR, TT, UA, UG, UZ, VN (72) Inventors Ogle, Matthew, F. United States 55105 Minnesota, Minnesota Paul and Juliet Avenue 2053

Claims

[Claims] 1. A bioprosthesis comprising a biocompatible material having at least one associated exogenous storage structure, said storage structure having a high amount of a calcification inhibitor releasably bound thereto. 2. 2. The bioprosthesis according to claim 1, wherein said biocompatible material comprises natural tissue. 3. The natural tissues are porcine heart valves, aortic roots, walls, leaflets and bovine pericardial tissues, connective tissues such as dura, allografts, bypass grafts, keys, ligaments, skin patches, blood vessels, human 3. The bioprosthetic material according to claim 2, wherein the material is selected from the group consisting of band tissue and bone. 4. The bioprosthesis according to claim 1, wherein the biocompatible material comprises a polymer. 5. 2. The biological prosthesis according to claim 1, wherein said storage structure comprises a protein. 6. The bioprosthesis of claim 5, wherein said protein comprises ferritin. 7. The bioprosthesis according to claim 1, wherein the storage structure comprises a synthetic polymer. 8. 2. The bioprosthesis according to claim 1, wherein the calcification inhibitor comprises a metal cation. 9. 9. The ^{bioprosthesis according} to claim 8, wherein the metal cation is selected from the group consisting of Al ^{+ 3} , Fe ^{+ 3,} and Mg ^{+ 2} . 10. The bioprosthesis according to claim 1, wherein the calcification inhibitor comprises a diphosphate. 11. 2. The bioprosthesis according to claim 1, wherein the calcification inhibitor comprises a phosphatase inhibitor. 12. The phosphatase inhibitor is phosphate ions, Ga ⁺³ , La ⁺³ , borate ions, oxalate ions, cyanide ions, L-phenylalanine, urea, excess Zn ⁺² , glycine, propyl 12. The bioprosthesis according to claim 11, wherein the bioprosthesis is selected from the group consisting of amines, lavamisole and arsenate ions. 13. 2. The bioprosthesis of claim 1, wherein the nature of the bond of the storage structure to the biocompatible material is predominantly covalent. 14． 2. The bioprosthesis according to claim 1, wherein the binding of the storage structure to the biocompatible material is characterized by a number of non-covalent interactions. 15. 2. The bioprosthesis of claim 1, wherein said exogenous storage structure further comprises a target molecule. 16. A method of preparing a biocompatible material, said method comprising the step of coupling a number of exogenous macromolecular storage structures to said biocompatible material, wherein said macromolecular storage structures are releasably bound thereto. Having a large amount of calcification inhibitors. 17． 17. The method of claim 16, wherein the conjugation is performed by chemically cross-linking the macromolecular storage structure to the biocompatible material. 18. 17. The method of claim 16, further comprising contacting the biocompatible material with a metal ion. 19. A bioprosthesis comprising a biocompatible material having a bound bifunctional chelator having a large amount of metal cation releasably bound. 20. A biocompatible material having at least one associated exogenous storage structure, wherein said storage structure is releasably bound to said biocompatible material at about 0.5 g / g of biocompatible material. A biological prosthesis having collectively 5 mg or more of metal cations. 21. 21. The bioprosthesis of claim 20, wherein the storage structure has collectively more than about 10.0 mg of metal cations per gram of biocompatible material. 22. 21. The bioprosthesis of claim 20, wherein the storage structure collectively has more than about 15.0 mg of metal cations per gram of biocompatible material. 23. A natural tissue having at least one associated exogenous storage structure, said storage structure having a large amount of a calcification inhibitor releasably bound thereto, and wherein said natural tissue is subcutaneously in a mammal. A bioprosthesis that has reduced calcium deposition by more than 95% compared to an equivalent native tissue that does not contain the bound exogenous storage structure about two months after being buried. 24. A method for producing a biological prosthesis, comprising the step of binding ferritin to natural tissue, wherein the ferritin has at least 0.5 mg of metal cation per gram of the natural tissue. A method for producing a biological prosthesis. 25. A process for producing a bioprosthesis, comprising covalently or non-covalently attaching a calcification inhibitor to a bioprosthesis material at a pH between about 6.0 and about 8.5.