JP2000505457A

JP2000505457A - Crystal structure of Apopain and its use

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Publication number: JP2000505457A
Application number: JP9530285A
Authority: JP
Inventors: ニコルソン，ドナルド・ダブリユ; フアジル，キンバリー・エイ; ガラン，ミツシエル; ガロ，イブ; ラベル，マルク; ラスパー，デイータ・エム; ルール，リジアン; バイランコート，ジヨン・ピイ; ベツカー，ジヨージフ・ダブリユ; ロトンダ，ジエニフアー; ソーンベリイ，ナンシー・エイ; ピーターソン，エリン・ピー
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド; メルクフロストカナダアンドカンパニー
Priority date: 1996-02-23
Filing date: 1997-02-19
Publication date: 2000-05-09
Also published as: EP0885243A4; CA2247068A1; EP0885243A1; WO1997031018A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、結晶化アポペイン、該構造の、アポペイン相同体及びアポペインの他の結晶形態、突然変異体及びアポペインの共複合体の構造の解明のための使用、並びにアポペイン構造、その相同体、突然変異体及び共複合体の、アポペインモジュレーターの設計のための使用に関する。 (57) [Summary] The present invention relates to the use of crystallized apopain, the structure for elucidating the structure of apopain homologues and other crystalline forms of apopain, mutants and co-complexes of apopain, and the apopain structure, homologs thereof, The use of variants and co-complexes for the design of apopain modulators.

Description

【発明の詳細な説明】アポペインの結晶構造及びその使用発明の分野アポトーシス。発明の背景本発明は、結晶性アポペイン、Ｘ線結晶学により測定したアポペインの構造、前記構造の、アポペイン類似体及びアポペインの他の結晶形態、突然変異体及びアポペインの共複合体（ｃｏ−ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）の構造を解明するための使用、並びにアポペイン構造及びその同族体、突然変異体及び共複合体の、アポペインモジュレーターを設計するための使用に関する。本発明の１面は、Ｘ線回折法によりタンパク質の３次元（３次）構造を決定するのに十分な品質を有するアポペイン結晶を得ることにある。前記した結晶が得られることは、実際極めて予期せぬ結果である。本出願以前、タンパク質結晶学の分野においてアポペインの構造を決定するために十分な品質を有する結晶が得られていなかったことは公知である。そこで、本発明の１つの目的は、アポペインの３次元構造を高分離能（ｈｉｇｈｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）で決定するために十分な品質を有する結晶を提供することである。アポペイン結晶の価値は、アポペインそのものの構造を得ることができることに止まらない。アポペインに関して得た知識を利用して、関連タンパク質の３次構造のモデルを作ることができる。本発明の別の面は、タンパク質のアポペインファミリーの他のメンバーの構造を決定する際に使用するための出発材料を提供することである。タンパク質のアポペインファミリーの構造の知識から、該タンパク質の体内での作用メカニズムを調べる手段が提供される。例えば、上記タンパク質の各種受容体分子に対する結合を各種コンピュータモデルにより予測することができる。前記結合が実際に起こることが知見されたら、化学者らはタンパク質構造の知識に基づいてアポペインのその受容体への機能的結合によく似た小分子を設計し、その合成を試みることができる。これは、「合理的な」薬物設計の方法である。よって、本発明の別の面は、アポペインの作用によく似た薬物の合理的設計における出発材料である物質を提供することである。哺乳動物インターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）及び線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓでプログラムされた細胞死に必要とされる遺伝子の産物であるＣＥＤ−３に関連するシステインプロテアーゼが脊椎動物をアポトーシスさせる生化学的事象において重要な役割を果たすことは判明している^1-3。ＩＣＥ／ＣＥＤ−３様プロテアーゼファミリーの幾つかのヒトイソ型（これらは２つの別個の系統分類サブファミリーに分けられる）が現在同定されている。ＩＣＥに関連するイソ型はＩＣＥ_rel−II（ＴＸ、ＩＣＨ−２）及びＩＣＥ_rel−IIIを含み、ＣＥＤ−３により類似のイソ型はＩＣＨ−１（ｍＮｅｄｄ２）、ＣＰＰ３２（アポペイン、Ｙａｍａ）、Ｍｃｈ２及びＭｃｈ３（ＩＣＥ− ＬＡＰ３）を含む^4-14。本発明者らは、ＣＰＰ３２／アポペインと強力なテトラペプチド−アルデヒド阻害剤の複合体の３次元構造をＸ線回折分析により調べた。タンパク質は、３次及び４次構造の点で及び触媒活性に関連する特徴の点でＩＣＥと類似している。しかしながら、アポペインのＳ₄サブサイトは、サイズ及び化学組成の点でＩＣＥとは顕著に異なる。この違いから、これらの酵素の２つのサブファミリー間の特異性の違いを理解するための構造的基礎が与えられる。哺乳動物アポトーシスにおけるＩＣＥそれ自体の役割はまだ明確に確立されてはいないが^15,16、この重要な生理学的過程において少なくとも１つの同族体のアポペイン／ＣＰＰ３２が重要な役割を有することは明らかである。アポペインは、アポトーシスの開始時に（Ｐ₄）Ａｓｐ−Ｘ−Ｘ−Ａｓｐ（Ｐ₁）モチーフの必須機能ドメインを分離することにより、主要なホメオスタシス・修復酵素を無能にする。アポペインに対する公知の基質はポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ストレス細胞におけるゲノムサーべイランス及びＤＮＡ修復に関わる酵素）、Ｕ１−７０ｋＤａ核内低分子リボ核タンパク質（ｍＲＮＡスプライシングのために必要である。）、及びＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ二本鎖切断修復のために必要である）の４６０ｋＤａ触媒ユニットを含む^15,19,21-23。細胞自殺中のアポペイン及びアポペイン様プロテアーゼに対する別の可能性ある基質は構造タンパク質、例えばホドリン（非赤血球型スペクトリン）、核ラミン類及び増殖停止特異性タンパク質２（Ｇａｓ２）、並びにタンパク質キナーゼＣ∂及び幾つかのまだ同定されていないループス自己抗原を含む^22,24-27。これらのプロテアーゼは、ヘモスタシス・修復過程の無能化及び死にかけている細胞の系統的構造解体に寄与する開裂事象のカスケードに関わると考えられる。アポトーシスのバランスの崩れが、不十分なアポトーシス死、例えばガンや過剰もしくは未熟なアポトーシス、例えばアルツハイマー病の両方を含み得る多くのヒトの病気の病因の根底をなすと考えられる。従って、特異的生化学的アポトーシスモジュレーター、例えばアポペインを同定すれば、これらの病気の治療方法の可能性が開ける。ＩＣＥ／ＣＥＤ−３プロテアーゼはすべて、タンパク質分解プロセッシングされるとヘテロダイマーの触媒ドメインを形成するプロ酵素として合成されるようである。最近発表されたＩＣＥの結晶構造では、２つのヘテロダイマーは結合してテトラマーを形成しており、この知見からこの物質が酵素の触媒活性形態であることか示唆された^28,29。このファミリーの最も特徴的な触媒特性は、基質Ｐ₁ 位置のＡｓｐをほぼ絶対的に必要とすることである^4,5,28-30。前記した及び他の点で類似性があるが、ＩＣＥ及びアポペインの基質特異性は著しく異なる。ＩＣＥは重要な決定基であるＰ₄位置の疎水性残基を好むが、アポペインはこの位置のＡｓｐに対して特異的であると考えられる。従って、本発明者らは、上記した基質特異性の著しい違いを明らかにする決定基を同定するために、前記酵素の高特異性モジュレーターを設計するための基礎を与えるために、また最終的にはアポトーシス細胞死におけるアポペイン及び機能的に関連するファミリーメンバーの役割についての構造的基礎を理解するためにアポペインの３次元構造を決定しようと努めた。本発明者らは、ペプチド−アルデヒド阻害剤Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯとの複合体中のアポペインの３次元構造を２．５Åの公称分解能で解明した。アポペインの３次及び４次構造は、ＩＣＥと非常に類似している（図１）。アポペインのｐ１７サブユニット及びｐ１２サブユニットは折り畳まれて約４０×３５×２５Å のサイズのコンパクトなシリンダーとなり、折り畳みは、５つの平行鎖及び１つの逆平行鎖を有する中央６−鎖β−シートにより支配される。モジュレーター− 結合サイトの一部であるシリンダーの上部に小さな２鎖逆平行β−シート及び分子の正面に第２の２鎖逆平行β−シートが存在する（図１Ａ）。更に、ｐ１７サブユニットのＣ−末端及びｐ１２サブユニットのＮ−末端を含む非常に小さな２鎖β−構造が存在する（以下の４次構造の記載を参照されたい）。５つのヘリックスが存在し、そのうち３つは主β−シートの一面に、２つは他の面に存在する。ＩＣＥ（図１Ｂ）のｐ２０サブユニットのＮ−末端のヘリックスは、アポペイン結晶中に等価物を持たず、アポペインのアラインされたアミノ酸中のこのヘリックスに相当する残基は結晶構造中では明らかに無秩序である。ＩＣＥ構造の場合のように、ｐ１７−ｐ１２ヘテロダイマーの対は集合して、２回回転対称の結晶軸を横断して中央β−構造が延びることにより結晶格子において別のテトラマーとなる（図２）。阻害剤は延長したコンホメーションの形態にあり、その酵素に対する結合はＩＣＥに対するテトラペプチドアルデヒド阻害剤の場合と非常に類似している。阻害剤のＰ₁−Ｐ₃残基を含む結合モードは、ＩＣＥ構造で見られるモードと非常に類似しているか、Ｐ₄のＡｓｐ残基を含む相互作用は明らかに異なっており、この位置での２つの酵素の特異性の違いに一致している。アポペイン構造及びＩＣＥ構造が類似の二次構造またはコンホメーションを有する１９４残基上にアラインされると、同等α炭素原子間の平均差異は１．１１ Åである。２つの酵素の全構造における最も有意な違いは、ＩＣＥ中に存在する２つの小さな表面ループがアポペインにはなく、アポペインが他の酵素には存在しない１つのエキストラループを含んでいることである。アポペインは、ＩＣＥの残基１５６−１６０（図１Ｂの左下）及び残基２４８−２５８（図１Ｂの上部中央）に等価の基を持たない。アポペインはＩＣＥの残基３８１に等価の位置に１０−残基挿入物を含み（図１Ａの右上部）、このエキストラループは結合した阻害剤にわたり不規則な逆ターンを形成し、結合サイトの一部を形成する幾つかの残基を与える。このループの付加は２つの酵素により例示される２種のＩＣＥ関連プロテアーゼ間の最も有意な違いの１つである。例えば、ＩＣＥサブファミリーの全てのメンバー（ＩＣＥ、ＩＣＥ_rel−II、ＩＣＥ_rel−III)は一次配列アラインメントに基づくこのループを持たないと予想される。一方、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＣＥＤ−３それ自体を含めたＣＥＤ−３様サブファミリーの全てのメンバーは等価のループ（例えばＩＣＨ −１、Ｍｃｈ２、Ｍｃｈ３）を持つと予想される。従って、このループ構造の存在は、アポペインに対する構造及びたぶん機能関連性を示す分子特徴であると考えられる（以下参照）。２つの酵素の４次構造は、一般的な極めて類似している。各タンパク質において、２つの鎖により形成されるヘテロダイマーは構造的に同一のヘテロダイマーと密接に結合して、２回回転対称を有する４鎖集合体を形成する。両方のタンパク質において、中央のβ−シートは生じた界面を横断して延び、残基３８９及び３９２を含む逆平行β−構造型水素結合が２つのヘテロダイマーを連結する。生じたテトラマー集合体は、その中心に１２鎖−β−構造が通っている約５０×３５×２５ Åのサイズを有し、分子の広く離れた部分に２つの触媒サイトを含む（図２）。２つのテトラマーがアラインすると、等価の３８８α炭素が平均２．０１Åだけ異なる。ＩＣＥ及びアポペインが２つの異なる結晶格子において類似の４次構造を取るという知見から、この構造はこのファミリーの酵素の他のメンバーに共通であり得るという考えが裏付けられる。アポペインにおいて、ＩＣＥの場合のように、ヘテロダイマーのより大きなサブユニットのＣ−末端は同じヘテロダイマーのより小さなサブユニットのＮ−末端とかなり離れている（５２Å）。例えば、図２において暗色の左ｐ１７の残基２９５は明色の左ｐ１２の残基３１７とは５２Å離れている。この距離は、アポペイン前駆体中のこれらの残基を結合しているが結晶構造においては無秩序である９つの残基により補うにはあまりにも長い。このため、アポペインの折り畳み及びプロセッシングは、ＩＣＥのように、幾つかの独特の特徴を含む。両方のタンパク質に関して、２つのモデルが提案され得る^28,29。第１のモデルにおいて、暗色ｐ１７鎖（図２の左）は暗色ｐ１２鎖（図２の右）と同じ前駆体分子に由来する。これらの残基は１２Åだけ離れており、これらは９つの無秩序残基により大きな構造再配置なしに容易に結合され得る。しかしながら、このモデルにおいては、成熟タンパク質（図１）に見られる比較的コンパクトなヘテロダイマーは２つの別々に合成され折り畳まれたポリペプチド鎖に由来しなければならない。ＩＣＥ構造及びアポペイン構造の両方において、このモデルは新しい鎖端部の接近性により裏付けられる。ＩＣＥ構造において、このモデルは、図２（左）の暗色ｐ１７鎖に相当するサブユニットのＣ−末端と暗色ｐ１２鎖のＮ−末端の間に広い β−構造水素結合が存在するという事実によっても裏付けられる。これらの相互作用は、ｐ２０鎖の残基２９−２９７をｐ２０鎖の残基３１７−３２３に結合し、７つの水素結合を含む。しかしながら、アポペインにおいて、対応する相互作用はそれほど広範囲に及ばない。β−構造は、各鎖（Ｇｌｙ²⁹³、Ｉｌｅ²⁹⁴、Ｉｌｅ³²¹、Ｐｒｏ³²²）由来の２つの残基及び２つの水素結合を含むのみである。第２モデルにおいて、図２の左側の２つの鎖である暗色ｐ１７鎖及び明色ｐ１２鎖は、同じｐ３２前駆体から誘導される。このモデルは、図２の左側の比較的コンパクトなヘテロダイマーは１つの前駆体分子から誘導されるが、プロセッシング時に比較的大きなコンホメーション変化を必要とするという考えにより支持される。アポペイン構造において、前記した変化は局部的な効果しか持たず、タンパク質の全体構造に影響を持たない。アポペイン前駆体において、表面ループはレッド鎖のＮ−末端でブルーサブユニットのＣ−末端を結合する。前記ループは、残基２７８−２８３を含むβ−鎖（図２の左から４番目）の末端から残基３２７−３３１にわたる鎖（図２の左から５番目）の始めまで延びており、前駆体は小さいβ−構造が残基２９３−２９４及び３２１−３２２を含む点を除いて成熟型タンパク質と同じ３次及び４次構造を有する。このモデルの実現可能性は、セルピンファミリーのタンパク質分解の後により大きく且つよりラジカルなコンホメーション変化が起こることが知られているという事実により支持される^31,3 ² 。ＩＣＥ構造及びアポペイン構造それ自体は、いずれのモデルを厳密には除外しない。要するに、前駆体プロセッシングに関わるサブユニット及び特定の残基の配置は、ＩＣＥ及びアポペインの両方において非常に類似しているが、アポペイン及びＩＣＥの前駆体の構造の詳細及びそれらのプロセッシングについてはより完全な研究を必要とする。アポペインの活性サイト及びそのテトラペプチドアルデヒド阻害剤Ａｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨＯとの相互作用は、２つのタンパク質が全く異なるＳ４サブサイトを除いて、ＩＣＥ：Ａｃ−Ｔｒｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＣＨＯ複合体の同族特徴に類似している。両方のタンパク質において、阻害剤は酵素表面の溝中で結合する。Ｐ₁及びＰ₄の側鎖は、タンパク質と多くの相互作用をなす結合溝中の著しいくぼみに含まれるのに対して、Ｓ₂及びＳ₃側鎖はタンパク質の体部から離れている。両方の複合体には、阻害剤骨格と酵素の間に３つの逆平行β−構造様水素結合、すなわちＰ₁Ｏ−Ｓｅｒ³³⁹Ｎ、Ｐ₂Ｎ−Ａｒｇ³ ⁴¹ Ｏ及びＰ₂−Ｏ−Ａｒｇ³⁴¹Ｎが存在する（図３）。Ｓ₁サブサイトはＩＣＥ及びアポペイン複合体において非常に類似している。Ｐ₁のカルボニル炭素原子はＣｙｓ²⁸⁵のｓγに結合し、この残基の側鎖は複雑な一連のＡｒｇ¹⁷⁹、Ｇｌｎ²⁸ ³ 及びＡｒｇ³⁴¹の側鎖との極性相互作用に関わっている。触媒活性サイトでのアポペインとＩＣＥの３次元構造の高類似性から、これらのタンパク質の触媒メカニズムの詳細が保存されることが強く示唆される。触媒作用及びＳ₁において構造により関わる残基の全てがＩＣＥ／ＣＥＤ−３プロテアーゼファミリーのメンバー中で保存されるという事実から、これらの酵素は共通の触媒作用メカニズム及びＰ₁におけるＡｓｐをほぼ完全に要求することが示唆される。Ｓ₁中のアルギニル側鎖の２つの正電荷の局部的集中状態は、これらの酵素のモジュレーター及び基質の負に帯電したアスパルチル側鎖により安定化される。阻害されたアポペイン及びＩＣＥの３次元構造において認められるコンホメーションは非阻害酵素においては不安定であり、上記した安定化は存在しない。これらの所見から、遊離酵素はＳ₁中にアセテートのような対イオンまたは幾つかの水分子を含むか、モジュレーター及び基質の結合または放出に対して有意な局部的なコンホメーション変化があることが示唆される。Ｓ₂及びＳ₃でのアポペイン及びＩＣＥ複合体の間の違いは主に、アミノ酸配列の違いにより生ずる。アポペインにおいて、Ｐ₃グルタミル残基の側鎖はタンパク質の体部から離れているが、該側鎖により塩はＡｒｇ³⁴¹側鎖に連結している。このことは、このサイトでの酵素の特異性に一致している。Ａｒｇ³⁴¹側鎖はＰ₁アスパルチル側鎖とも相互に作用する（上記参照）。Ｐ₂バリンの側鎖は、Ｔｙｒ³³⁸側鎖上の中央にある溝の疎水性壁に寄りかかるようにある。Ｓ₁−Ｓ₃におけるアポペイン及びＩＣＥの類似性とは反対に、Ｓ₄サブサイトは全幾何学及び化学的種類の点で根本的に異なる。ＩＣＥのＳ₄サブサイトはチロシル側鎖を容易に収容する大きく且つ浅い疎水性くぼみであり、アポペインにおける対応するサイトはＰ₁ Ａｓｐ側鎖をぴったりと包囲する狭いソケットである。２つのサイトを比較すると、アポペインサイトがＴｒｐ³⁴⁸及びＰｈｅ³⁸⁰ ^A の側鎖の存在により圧縮されていることが最も明瞭な違いである（図４）。更に、ＩＣＥにおいてＡｒｇ³⁸³側鎖が占める容積には、Ｓｅｒ^381Aで始まる挿入ペプチドが充填されている。このペプチドは、Ｓ₄内のくぼみからタンパク質の表面を越えるくぼみまで延びている。アポペインのＳ₄サブサイトから、この位置での酵素の特異性が理解される。前記サイトの境界は、Ｔｒｐ³⁴⁰、Ａｒｇ³⁴¹、Ａｓｎ³⁴²、Ｔｒｐ³⁴⁸、Ｓｅｒ³⁸ ^1A 及びＰｈｅ^381Bにより定められる（図４Ａ）。阻害剤のカルボキシル基により、Ｐｈｅ^381Bのアミド窒素原子及びＡｓｎ³⁴²のＮ^δ1原子との特異的な極性相互作用が生ずる。この水素結合のネットワークは、Ａｓｎ³⁴²Ｎ^δ2原子とＬｙｓ³⁴⁴及びＡｓｐ³⁴⁵のアミド窒素原子との相互作用により延長する。前記サイトは、サイズ及び形の点でアスパルチル側鎖と相補的であり、カルボキシル基と相互作用する適切な幾何学でしっかりと位置づけられている２つの水素結合ドナーを含む。Ａｓｎ³⁴²の側鎖の配向は、水素原子アクセプターであるＯ^δ1と水素結合ドナーであるＬｙｓ³⁴⁴ 及びＡｓｐ³⁴⁵のアミド窒素原子との相互作用により固定される。アポペインのＳ₄サブサイトのサイズと形を規定する重要な役割を有する、３４８位置におけるＴｒｐ残基及び３８０位置における挿入された１０個のアミノ酸残基は、ＩＣＥ関連プロテアーゼの公知のＣＥＤサブファミリーに完全に保存され、このことからこれらの酵素はこのサブサイトにおいて類似の特異性を有することが示唆される。アポペインの３次元構造は、通常３次及び４次構造の点でＩＣＥと類似している。更に、これらの２つのタンパク質は、Ｓ₁−Ｓ₃サブサイトの場合と非常に類似の方法で同族のモジュレーターペプチドと相互作用する。しかしながら、これら２つの酵素間のアミノ酸配列の変化及び基質特異性の違いと一致する、Ｓ₄サブサイトのサイズ及び種類の点で大きな違いがある。これらの違いは、ＩＣＥ−特異的プロテアーゼの２つのサブファミリー間の構造及び機能の違いを理解する基礎を与える。また、上記した２つの構造の比較から、上記タンパク質に関連する病気及び生理学的機能の研究において重要な高特異性モジュレーターの設計のための構造的基礎が与えられる。発明の要旨本発明は、結晶性アポペイン、Ｘ線結晶学により測定したアポペインの構造、前記構造の、アポペイン同族体及びアポペインの他の結晶形態、突然変異体及びアポペインの共複合体の構造の解明のための使用、並びにアポペイン構造及びその同族体、突然変異体及び共複合体の、アポペインモジュレーターの設計のための使用に関する。本発明は、アポペインと称される単離・精製酵素の３次元構造及びその構造座標に関する。また、本発明は、アポペイン結晶の構造座標を、アポペインの活性サイト及び１つ以上の補助結合サイトの原子詳細を解明するために使用することである。更に、本発明は、アポペイン結晶の構造座標を、別のアポペイン結晶、またはアポペインの突然変異体、同族体もしくは共複合体の結晶の構造を解明するために使用することである。更に、本発明は、野生型アポペインとは異なる性質を１つ以上有するアポペイン突然変異体を提供することである。更に、本発明は、アポペイン、またはその突然変異体、同族体または共重合体の構造座標及び原子詳細を、アポペインの望ましくない物理的及び薬理的性質を予防及び処理するアポペインモジュレーターを設計し、コンピュータを用いて評価し、合成し、使用することである。前記モジュレーターは、免疫、増殖性疾患及び変性疾患の治療に有用な治療薬として使用され得、前記疾患の非限定例には、免疫不全症候群（例えばＡＩＤＳ）、自己免疫疾患、病原性感染、心血管及び神経損傷、脱毛症、老化、ガン、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、神経変性疾患及び脊髄損傷が含まれる。更に、本発明は、アポトーシスの分野並びにアポトーシスの低下が有用である疾患（その非限定例は上記した）の治療において研究道具とて有用な式Ｉ Ac-DEVD-CHO Ｉの化合物（Ｌ−７６１，１９１と称される）に関する。特に、本発明は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ、Ｕ１−７０ｋＤａの核内低分子リポ核タンパク質及びＤＮＡ依存性プロテインキナーゼの触媒サブユニットの正常な生物学的機能を不能にすることにより少なくとも部分的にアポトーシスを引き起こすチオールプロテイナーゼのプロアポトーシスタンパタ質分解活性のモジュレーターに関する。図面の簡単な説明図１（Ａ）は、結晶２回回転軸で観察したアポペイン：Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ構造の概略図である。β−構造のα−ヘリックス、コイルは矢印である。結合阻害剤を、図の上部に短い矢印で示す。アポペイン中のエキストラループ（残基１８０Ａ、１８１Ａ−Ｉ）を矢印で示す。ｐ１７鎖は暗色、ｐ１２鎖は明色である。図１（Ｂ）は、（Ａ）とのアラインメントを最大とすべく配向させたＩＣＥ：ＹＶＡＤ構造を示す。ＩＣＥ中の２つのエキストラループを、図の下部（残部１５６−１６０）及び左上部（残部２４８−２５３）に白い矢印で示す。ｐ２０鎖は暗色、ｐ１０鎖は明色である。図１（Ｃ）は、２つのタンパク質のアラインさせた３次元構造において類似の二次構造またはコンホメーションを有する残基をマッチさせることによりアラインさせたアポペイン及びＩＣＥのアミノ酸配列を示す。下部文字は、電子密度が明らかにない残基を示す。ＩＣＥとアポペインとの比較を容易にするために、アポペインのアミノ酸残基をこのアラインメイントにおけるＩＣＥの同族残基の配列ナンバーにより同定する。アポペイン中にＩＣＥ関連残基が存在しないときにはアポペイン配列ナンバーを省略し、アポペイン特異性挿入をＩＣＥ配列ナンバーに文字を加えることにより示す。アポペインの産生に使用される方法は、別々に大腸菌で発現させる成分ｐ１７及びｐ１２サブユニットからの活性酵素の折り畳みを含む。このセクションに記載する組換えエンジニアリングの目的のためのアミノ酸ナンバリングについては、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ１３７３８の読みとり枠から決定されるアポペインプロ酵素内のアミノ酸の位置を参照されたい（イニシエーターのメチオニンは残基１であり、ストップコドンの前の最終残基は残基４０２である）。各サブユニットの始めと終わりは、非−組換え精製ヒトアポペインのマススペクトル分析及びアミノ末端ミクロ配列決定により決定される¹⁹。アポペイン／ＣＥＰ３２ｐ１７サブユニット（Ｓｅｒ¹⁴¹−Ａｓｐ²⁹⁷）及びｐ１２サブユニット（Ｓｅｒ³¹⁰−Ｈｉｓ⁴⁰²）を、ＰＣＲ鋳型修飾によりそれぞれＭｅｔＳｅｒ¹⁴¹−Ａｓｐ²⁹⁷構築物及びＭｅｔＳｅｒ³¹⁰−Ｈｉｓ⁴²⁰構築物として発現させるために遺伝子操作した。ｐ１７サブユニットをコードするｃＤＮＡを、完全長ＣＰＰ３２β ｃＤＮＡ（３ｎｇ／μｌ）を鋳型として使用して、センス（前進）合成オリゴヌクレオチド５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＧＡＧＴＧＧＡＡＴＡＴＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＧＴＴＡＴＡＡＡＡＴＧＧ−３’（配列番号１）及びアンチセンス（逆）オリゴヌクレオチド５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＧＡＴＴＡＧＴＣＴＧＴＣＴＣＡＡＴＧＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＧＴＴＧＴＧ−３’（配列番号２）で増幅させた（Ｐｗｏポリメラーゼ（０．０２５Ｕ／μｌ）ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ；９４℃×１分、６０℃×１分及び７２℃×４５秒のサイクルを２５回）。ｐ１２サブユニットをコードするｃＤＮＡを同様に増幅させたが、ただし、センス（前進）オリゴヌクレオチドは５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＧＡＧＴＧＧＴＧＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＣＧＴＧＴＣ−３’（配列番号３）とし、アンチセンス（逆）オリゴヌクレオチドは５’ −ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＧＡＴＴＡＧＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＡＧＡＧＴＴＣＴＴＴＴＧＴＧＡＧＣ−３’（配列番号４）とした。生じたｐＣＲ断片を精製し、ＸｂａＩでトリムし、次いでｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＸｂａＩサイトに結合した。配列を確認した後、挿入断片をネストしたＢｓｐＨＩサイトから切り出し、ｐＥＴ−１１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｃｏＩサイトに結合した。次いで、適切に配向したクローンを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞に形質転換した。産生培養用の最適増殖条件は、組換えタンパク質の発現のために１ｍＭＩＰＴＧを用い、Ｍ９培地を３７℃で一晩誘導しながら使用した。（これらの条件下で、個々のサブユニットを約５０ｍｇ／ｌで発現させた。いずれの場合にも、タンパク質は、通常総タンパク質の９９％を越えるタンパク質が含まれる封入体分画に専ら局在化した。）大腸菌を集め、洗浄し、プロテアーゼ阻害剤の存在下で切断した。次いで、封入体を単離し、６Ｍグアニジン塩酸塩において可溶化した。活性組換えアポペインを生成するために、変性したｐ１７サブユニット及びｐ１２サブユニットを混合し、迅速に１００ｍＭＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１０％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、０．５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＤＴＴ中で１００μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。（いくつかのパイロット実験で、これらが最適の折り畳み条件であることが確立されている。）次いで、反応物を室温で６０分間インキュベートした。これら条件下で、サブユニットタンパク質の幾つかは沈殿した。１００，０００×ｇで６０分間超遠心して沈殿物を除去した。この方法を用い、折り畳み効率は約１０％（活性酵素のモル数／ｐ１７サブユニットのモル数×１００）であった。これは培養物１リッター当たり活性酵素約５ｍｇの総収量に相当する。続いて、活性酵素を、ＨｉＴｒａｐＱカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１ｍｌを用いるアニオン交換クロマトグラフィーにより正しく折り畳まれていないタンパク質から分離した。組換えアポペイン複合体のマススペクトル分析は、該複合体がＳｅｒ¹⁴¹−Ａｓｐ²⁹⁷にわたる完全なｐ１７鎖と、主としてＭｅｔＳｅｒ³¹⁰−Ｈｉｓ⁴⁰²からなり若干のＳｅｒ³¹⁰−Ｈｉｓ⁴⁰²を含むＰ１２鎖混合物とからなることを示す。得られた酵素は、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによる阻害に対するキネティックパラメータの点では天然酵素と区別できない。アポペイン：Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ複合体を、懸垂蒸気拡散法により結晶化した。タンパク質−阻害剤溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．５、１０ｍＭＤＴＴ、３ｍＭＮａＮ₃中８．７ｍｇ／ｍｌ）１．５μｌを等容量のリザーバー緩衝液（７％ＰＥＧ−６０００（ｗ／ｗ）、０．１０Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ５．０、１０ｍＭＤＴＴ、３ｍＭＮａＮ₃）と混合し、室温でインキュベートした。結晶は斜方晶空間群１２２２（ａ＝６９．８１、ｂ＝８４．６２、ｃ＝９６．７９Å）に属する。２．５Åの分解能に拡大した３次元回折データを、Ｓｉｅｍｅｎｓ面積検出計及び理学ＲＵ−２００回転アノードＸ線発生装置からのＣｕＫα放射を用いて室温で集めた。これらのデータをＳＡＩＮＴソフトウェアパッケージ３６を用いて処理した。８，９２９ユニーク反射の２０，８０１観測値を５．５５％のＲ−因子と統合した。構造を、Ｘ−ＰＬＯＲ³⁷及び阻害されたＩＣＥ²⁸の構造のＰＯＢ³⁸ エントリー１ＩＣＥをベースとするモデルを用い、分子置換により解明した。現在のモデルは、相互作用のモデル作成³⁹及びＸ−ＰＬＯＲを用いる細分³⁷により構築された。モデル建築の初期段階において、ＳＱＵＡＳＨ⁴⁰を用いる相細分は電子密度マップの質を大きく改良させた。現在のモデルは、１０％模擬アニーリングオミットマップ⁴¹に対して検査し、ｐ１７鎖の残基１４９−２９５、結合阻害剤のｐ１２鎖の残基３１７− ４０２及び２５秩序水分子を含む。ｐ１７鎖のＮ−末端の残基１４１−１４８、ｐ１７鎖のＣ−末端の２９６−２９７及びｐ−１２鎖のＮ−末端の３１０−３１６は、たぶん無秩序のために現在の電子密度マップでは可視化されない。細分されたモデルのＲ−因子は２６．２％（Ｒ_free＝３４．２％）⁴²であり、立体化学は合理的である（結合のｒ．ｍ．ｓ．分布=０．００６Å、角度＝１．３°）。二次構造をプログラムＳＴＲＩＤＥ⁴³を用いてアポペイン及びＩＣＥに帰属させた。Ｐ₁炭素原子でのＣｙｓ²⁸⁵Ｓγの求核攻撃により生ずる光学中心のキラリティーを確立するために、特別の注意を払った。細分が終わったら、この原子で考えられる配置のそれぞれに対して同等のモデルを作成し、２つのモデルを大きさは同じであるが手が反対のキラル制限で同時に細分した。次いで、この原子の８．０Å内のすべての原子をそれぞれのモデルから欠失させ、両方の切り捨てたモデルを３０００Ｋ模擬アニーリング細分にかけた。次いで、複合体のこの部分の電子密度マップを、両組の相から計算し、このサイトでの立体化学を決定するために検査した。アポペイン：Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ複合体の座標及び構造要素はＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ³⁸に寄託されるであろう。図２は、図１に示したように配向させたアポペインテトラマーの概略図である。この図の左側のヘテロダイマーは図１と同一である。左のヘテロダイマーにおいて、ｐ１７鎖は暗色、ｐ１２は明色である。右のヘテロダイマーでは色は逆である。結合した阻害剤分子は図の左側のダイマーの上部、また右側のダイマーの下部の短い矢印である。図３は、結合Ｎ−アセチルテトラペプチドアルデヒド阻害剤、（Ａ）ＩＣＥ及び（Ｂ）アポペイン間の水素結合及び他の極性相互作用を示す。図４（Ａ）は、アポペイン：Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ複合体のＳ₄サブサイトを示す。結合阻害剤のアセチル基及びＳ₄アスパルチル残基を、ボール−棒モデルで示す。タンパク質はロッドとして示す。水素結合はダッシュ付き白線で描く。図４（Ｂ）は、ＩＣＥ：ＹＶＡＤ複合体のＳ₄サブサイトを示す。（Ａ）及び（Ｂ）は２つのタンパク質の全体的アラインメントを最大にするために配向している。上記した参考文献は以下の通りである。１． Ellis,R.E.,Yuan,J.Y.& Horvitz,H.R.Annu 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Genetics23,566-579(1995).発明の詳細な説明本発明は、アポペインと称される単離・精製酵素の３次元構造及びその構造座標に関する。本発明はまた、アポペイン結晶の構造座標を、アポペインの活性サイト及び１つ以上の補助結合サイトの原子詳細を解明するために使用することである。更に、本発明は、アポペイン結晶の構造座標を、別のアポペイン結晶、またはアポペインの突然変異体、同族体もしくは共複合体の結晶の構造を解明するために使用することである。更に、本発明は、野生型アポペインとは異なる性質を１つ以上有することを特徴とするアポペイン突然変異体を提供することである。更に、本発明は、アポペイン、またはその突然変異体、同族体または共重合体の構造座標及び原子詳細を、アポペインの望ましくない物理的及び薬理的性質を予防及び治療するアポペインモジュレーターを設計し、コンピュータを用いて評価し、合成し、使用することである。前記モジュレーターは、免疫、増殖性疾患及び変性疾患の治療に有用な治療薬として使用され得、前記疾患の非限定例には、免疫不全症候群（例えばＡＩＤＳ）、自己免疫疾患、病原性感染、心血管及び神経損傷、脱毛症、ガン、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、神経変性疾患及び脊髄損傷が含まれる。更に、本発明は、アポトーシスの分野並びにアポトーシスの低下が有用である疾患（その非限定例は上記した）の治療において研究道具とて有用な式Ｉ Ac-DEVD-CHO Ｉの化合物（Ｌ−７６１，１９１と称される）に関する。特に、本発明は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの正常な生物学的機能を不能にすることにより少なくとも部分的にアポトーシスを引き起こすチオールプロテイナーゼのプロアポトーシスタンパク質分解活性のモジュレーターに関する。アポトーシスは、正常な形態形成、組織改造作用及び病原性感染または他の修復不可能な細胞損傷に対する応答の間の生体における細胞自殺の組織的手段を構成する。不適切なアポトーシスは、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、免疫不全、自己免疫疾患、虚血性心血管及び神経損傷、脱毛症、白血病、リンパ腫及び他のガンなどのヒトの病気の病因となり得るので、アポトーシスを管理することは治療に対する重要な潜在的標的となる。アポトーシス細胞死に関与する幾つかの生化学的事象が最近明らかとされた。例えば、線虫における遺伝的証拠が、アポトーシスの正及び負の調節物質を同定した。重要なプロアポトーシス遺伝子のｃｅｄ−３は想定システインプロテアーゼをコードする。前記システインプロテアーゼは、Ｓ１サブサイトにおいてアスパラギン酸に対してほぼ完全な特異性の特徴を有する新しいシステインプロテアーゼファミリーのうち最初に同定された酵素である哺乳動物インターロイキン− １β変換酵素（ＩＣＥ）⁶に関連する。ｃｅｄ−３遺伝子の欠失または突然変異は、各種宿主細胞にトランスフェクトしたとき、さもなければ死に至るすべての細胞のアポトーシス死並びにＣＥＤ−３及びＩＣＥによるアポトーシスを完全に予防した。更に、ＣＥＤ−３のプロアポトーシス効果は、線虫死抑制遺伝子ｃｅｄ−９を一緒にトランスフェクトすることにより、ある程度はその哺乳動物プロオンコジーンｂｃｌ−２により予防され得る。従って、真核細胞の死は、ＩＣＥ／ＣＥＤ−３様プロテアーゼの反対プロアポトーシス効果とＢｃｌ−２及び／またはその同族体を含む上流調節機構との間のバランスにあり得る。アポトーシスの間のＩＣＥ／ＣＥＤ−３様プロテアーゼに対する可能性ある基質の１つが、ＤＮＡ修復、ゲノムサーベイランス及び完全性における主要酵素であるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）である。ＰＡＲＰは、ＩＣＥの性質と類似の性質を有する未同定のプロテアーゼによりアポトーシスの開始時にタンパク質分解的に開裂される。ＰＡＲＰ（ＤＥＶＤ²¹⁶−Ｇ²¹⁷）内の開裂サイトは、ＩＣＥにより認識され、開裂されるプロＩＬ−１β（ＦＥＡＤ²⁷ −Ｇ²⁸）における２つのサイトのひとつに似ている。このサイトでＰＡＲＰがタンパク質分解的に開裂すると、自己修飾からＰＡＲＰのアミノ末端における２つの亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフ及びポリペプチドのカルボキシ末端に位置するポリ（ＡＤＰ−リボース）イレーテイング触媒ドメインが分離する。この開裂により、ＰＡＲＰの触媒ドメインがＤＮＡ損傷のサイトに補充されるのが妨げられ、その後の修復及びゲノム維持事象を調節するＰＡＲＰの能力が不能になるであろう。更に、アポトーシスの特徴であるヌクレオソーム内ＤＮＡ開裂に関わるＣａ²⁺／Ｍｇ²⁺−依存エンドヌクレアーゼは、ポリ（ＡＤＰ−リボース）イレーション^20-22により負に調節される。従って、正常なＰＡＲＰ機能が損失すると、このヌクレアーゼが死にかけている細胞において高度に活性化される。アポペインに対する他の基質は、（二本鎖ＤＮＡ切断修復及びＶ（Ｄ）Ｊ組換えのために必須である）ＤＮＡ依存タンパタ質キナーゼの４６０ｋＤａ触媒サブユニット及び（プレ−ｍＲＮＡスプライシングのために必要である）Ｕ１核内低分子リボ核タンパク質の７０ｋＤａタンパク質成分を含む。これら全ての基質における開裂サイトは、ＩＣＥに対する好ましい認識モチーフ（Ｔｙｒ−Ｘ−Ｘ−Ａｓｐ）とは明らかに異なるＡｓｐ−Ｘ−Ｘ−Ａｓｐモチーフにあり、いずれの場合にも標的ポリペプチド中の重要な機能ドメインが物理的に分離される。よって、重要なホメオスタシス過程の協同不能は、アポトーシス細胞死の基本原理及び細胞死中のアポペインの重要な役割にあると考えられる。ヒト起源とするシステインプロテアーゼのＩＣＥ／ＣＥＤ−３ファミリーとして、ＩＣＥ、ＩＣＥ_rel−II、ＩＣＥ_rel−III、ＩＣＨ−１、ＣＰＰ３２、Ｍｃｈ２及びＭｃｈ３の７種が公知である。それぞれ、宿主細胞にトランスフェクトされるとアポトーシス応答を開始し得る。しかしながら、プロテアーゼが過剰発現すると、非特異的に細胞死が引き起こされ得る。他のプロテアーゼ、例えばトリプシン、キモトリプシン、プロテイナーゼＫまたはグランジムＢの細胞質発現によってアポトーシスが引き起こされることも示されている^27,28。今回の研究で、本発明者らは、ＣＰＰ３２の活性形態であるアポペインが、アポトーシスの開始時に起こるＰＡＲＰの特異的タンパク質分解に関与する酵素であることを立証する。更に、本発明者らは、アポペイン仲介ＰＡＲＰ開裂を抑制するとインビトロでアポトーシスが減ずることから、このプロテアーゼが哺乳細胞のアポトーシスにおいて果たす中心的な役割であることを立証する。線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて、１つの遺伝子ｃｅｄ−３が欠失または突然変異するとアポトーシス死がなくなった。配列決定したところ、ｃｅｄ−３は、１つの公知の機能が不活性３１ｋＤａｐｒｏＩＬ−１βサイトカイン前駆体の活性１７ｋＤａ形態への開裂であるプロテアーゼをコードする哺乳動物インターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）の遺伝子と相同であることが判明した。哺乳動物細胞におけるＩＣＥ様プロテアーゼのアポトーシス機能の説明は、ＩＣＥのＩＬ−１β形成への参加及びアポートーシスが通常ＩＣＥ欠乏マウスにおいて生ずるという知見を考慮して、４つの他の哺乳動物ＩＣＥ／ＣＥＤ−３様プロテアーゼ（ＩＣＥ、ＩＣＥ_rel−II、ＩＣＥ_rel−III、ＩＣＨ−１、ＣＰＰ３２、Ｍｃｈ２及びＭｃｈ３）^23-26の発見並びにゲノム構造及び一体性の調整における重要な酵素であるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）はアポトーシスの開始時にプロテアーゼ類似ＩＣＥ（ｐｒＩＣＥ）により機能的に不活化されるという観察とともにより明白となる。本発明者らは、実際ｐｒＩＣＥはアポペイン／ＣＰＰ３２であり、アポペイン／ＣＰＰ３２は哺乳動物細胞においてアポトーシスの開始時にＰＡＲＰ及び他の基質を開裂する特異的なＩＣＥ／ＣＥＤ−３様システインプロテアーゼであることを立証した。哺乳動物細胞死においてアポペイン／ＣＰＰ３２が果たす中心的役割は、インビトロでアポトーシスが起こるのを防ぐ強力且つ選択的なモジュレーターにより更に立証される。これらの知見とアポペインプロ酵素、ＣＰＰ３２及びＣＥＤ−３間の配列の関係とから、ＣＰＰ３２とそのタンパク質分解的に活性な形態のアポペインはＣＥＤ−３のヒト等価物であり得ることが示唆される。従って、アポペイン活性の薬理学的調節は、不適切なアポトーシスが顕著な病的状態における治療方法のための適切なポイントであり得る。クローン化したアポペインｃＤＮＡを、適当なプロモーター及び他の適切な転写調節要素を含む発現ベクターに分子クローニングすることにより組換え的に発現し得、原核もしくは真核宿主細胞に移入すると、組換えアポペインが産生され得る。本明細書において、発現ベクターは、遺伝子のクローン化コピーの転写及びそのｍＲＮＡの適切な宿主での翻訳に必要なＤＮＡ配列と定義される。前記ベクターを使用して、細菌、酵母、ラン藻、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞のような各種宿主において真核遺伝子を発現させることができる。特別に設計されたベクターを使用すると、細菌−酵母または細菌−動物細胞のような宿主間でＤＮＡをシャトルすることができる。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞における自律複製のための複製起源、選択マーカー、特定数の有用な制限酵素サイト、高コピー数のためのポテンシャル及び活性プロモーターを含み得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合せしめ、ＲＮＡ合成を開始するＤＮＡ配列と定義される。ｍＲＮＡ合成を高頻度で開始させるプロモーターが強力なプロモーターである。発現ベクターには、非限定的に、クローニングベクター、修飾クローニングベクター、特別に設計されたプラスミドまたはウイルスが含まれ得る。各種の哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞において組換えアポペインを発現させることができる。組換えアポペインの発現に適した市販の哺乳動物発現ベクターには、非限定的に、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ＰＲＳＶｇＰｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐｓＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）及びＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）が含まれ得る。アポペインをコードするＤＮＡは、組換え宿主細胞に発現させるために発現ベクターにクローン化され得る。組換え宿主細胞は原核もしくは真核細胞であり得、これらの細胞には、非限定的に、細菌、酵母、哺乳動物細胞及び昆虫細胞が含まれる。適当であり、市販されている哺乳動物種を起源とする細胞系には、非限定的に、ＣＶ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）が含まれる。発現ベクターは任意の方法を用いて宿主細胞に導入され得るが、前記方法には、非限定的に、形質転換、トランスフェクション、感染、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーションが含まれる。発現ベクター含有細胞はクローン的に増殖し、個々のクローンがアポペインタンパク質を産生するかどうか調べるために分析にかけられる。アポペイン発現宿主細胞クローンは幾つかの手段により同定され得るが、前記手段には、非限定的に、抗 −アポペイン抗体との免疫学的反応性、宿主細胞結合アポペイン活性の存在が含まれる。アポペインｃＤＮＡの発現は、インビトロで産生される合成ｍＲＮＡを用いて実施され得る。合成ｍＲＮＡは、各種の無細胞系で効率的に翻訳され得るが、前記無細胞系には、非限定的に、コムギ胚芽抽出物及び網状赤血球抽出物が含まれる。或いは、合成ｍＲＮＡは、細胞を含む系で効率的に翻訳され、非限定的に、例えばカエル卵母細胞にミクロ注入される。最適レベルの酵素活性及び／またはアポペインタンパク質を生ずるアポペインｃＤＮＡ配列を決定するために、修飾アポペインｃＤＮＡ分子を構築する。宿主細胞をｃＤＮＡ分子を用いて形質転換し、アポペインＲＮＡおよびタンパク質のレベルを測定する。宿主細胞中のアポペインタンパク質のレベルを、イムノアフィニティー法及び／またはリガンドアフィニティー法のような各種方法を用いて定量化する。³⁵Ｓ−メチオニン標識もしくは非標識のアポペインタンパク質を単離するために、アポペイン特異的アフィニティービーズまたはアポペイン特異的抗体を使用する。標識アポペインタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。非標識アポペインタンパク質を、アポペイン特異的抗体を使用するウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡにより検出する。アポペインを組換え宿主細胞において発現させた後、アポペインタンパク質を回収して、活性形態のアポペインを得ることができる。幾つかのアポペイン精製方法が利用され得、使用に適している。組換えアポペインは、当業界で公知の分画またはクロマトグラフィーを各種組み合わせて、または個別に適用することにより細胞ライゼートまたは条件培地から精製され得る。更に、組換えアポペインは、完全長新生アポペインまたはアポペインのポリペプチド断片に対して特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて調製されるイムノアフィニティーカラムを用いて他の細胞タンパク質から分離され得る。組換えタンパク質は、抗体を作成するために使用され得る。本明細書において用語「抗体」は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、並びにその断片、例えば抗原またはハプテンに結合し得るＦｖ断片、Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ）２断片が含まれ得る。アポペインに対する単一特異性抗体は、アポペインに対して反応性の抗体を含有する哺乳動物抗血清から精製されるか、または標準的な方法を用いてアポペインと反応性のモノクローナル抗体として産生される。本明細書において単一特異性抗体は、単一の抗体種またはアポペインに対して均質な結合特性を有する複数の抗体種と定義される。本明細書において均質な結合は、上記したアポペインと結合するような特定の抗原またはエピトープに結合する抗体種の能力を指す。酵素特異的抗体は、動物、例えばマウス、ラット、モルモツト、家兎、ヤギ、ウマ等（家兎が好ましい）に対して、適切濃度のアポペインを適宜免疫アジュバントと一緒に用いて免疫感作することにより作成される。アポペインと反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、同系繁殖させたマウスをアポペインを用いて免疫感作するような慣用の方法により作成され得る。マウスに対して、許容され得るアジュバント（フロイント完全アジュバントが好ましい）を等容量加えた緩衝液または食塩液約０．５ｍｌ中アポペイン約０．１〜約１０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇで免疫感作する。０日目にマウスに対して最初の免疫感作を行い、約３〜約３０週間休ませる。免疫感作したマウスに、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）のような緩衝液中アポペイン約０．１〜約１０ｍｇによるブースター免疫感作を静脈注射（ＩＶ）経路により１回もしくはそれ以上施す。抗体陽性マウス由来のリンパ球を、免疫感作マウスから脾臓を当業界で公知の標準的な方法により取り出して得る。ハイブリドーマ細胞は、脾臓リンパ球を適切な融合パートナーと安定なハイブリドーマを形成し得る条件下で混合して産生される。融合ハイブリドーマ細胞を、当業界で公知の方法によりヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリン補充ダルベッコ変更イーグル培地（ＤＭＥＭ）において増殖させることにより選択する。上清流体を、約１４、１８及び２１日目に増殖陽性ウェルから集め、抗原としてアポペインを用いる固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）のようなイムノアッセイにより抗体産生についてスクリーニングする。培養液をオクタロニー沈降アッセイでテストして、ｍＡｂのアイソタイプを調べた。抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞を、Ｋｒｕｓｅ及びＰａｔｅｒｓｏｎ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ発行（１９７３）、ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＳｏｆｔＡｇａｒＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ中、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎの軟寒天法のような方法によりクローン化する。抗−アポペインのインビトロ産生は、約２％の胎仔ウシ血清を含むＤＭＥＭ中でハイブリドーマを増殖させることにより実施され、十分量の特異的ｍＡｂが得られる。このｍＡｂは当業界で公知の方法により精製される。腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体タイターを、各種血清学的または免疫学的アッセイにより測定するが、前記アッセイには、非限定的に、沈降、受身凝集反応、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法が含まれる。類似のアッセイが、体液または組織、及び細胞培養物中のアポペインの存在を検出するために使用される。上記したような方法は、単一特異性抗体を産生するために使用され得、またはアポペインポリペプチド断片または完全長新生アポペインポリペプチドに特異的な抗体を産生するために使用することができる。アポペイン抗体アフィニテイーカラムは、抗体がアガロースケルビーズ支持体と共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで前活性化させたケル支持体、例えばＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に抗体を添加することにより調製される。次いで、抗体をスペーサーアームを有するアミド結合を介してゲルに結合させた後、残りの活性化エステルをエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）を用いてクエンチする。カラムを水、０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で順次洗浄して、非結合抗体または無関係のタンパク質を除去する。次いで、カラムをリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．３）で平衡化し、カラムにアポペインまたはアポペイン分画を含有する細胞培養上清または細胞抽出物をゆっくりと流す。その後、カラムを洗浄し、タンパク質を溶離させる。次いで、精製アポペインタンパク質をリン酸緩衝食塩液に対して透析する。アポペインｃＤＮＡ、アポペインに対する抗体またはアポペインタンパク質を含有するキットを作成することができる。前記キットは、アポペインＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡを検出するために、またはサンプル中のアポペインタンパク質またはペプチド断片の存在を検出するために使用される。前記特徴は各種目的に有用であるが、この目的には、非限定的に、法的分析または疫学研究が含まれる。本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質及び抗体は、アポペインＤＮＡ、アポペインＲＮＡまたはアポペインタンパク質のレベルをスクリーニングし、測定するために使用され得る。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及び抗体は、アポペインを検出及びタイプ分けするのに適当なキットを作成するのに有用である。前記キットは、少なくとも１つの容器を閉じこめた状態で保持するのに適した区画化キャリアーを含む。更に、前記キャリアーはアポペインを検出するために適した組換えアポペインタンパク質または抗ーアポペイン抗体のような試薬を含む、キャリアーは、標識抗原または酵素基質等のような検出手段を含み得る。アポペインをコードするｃＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を、アンチセンス治療のために合成することができる。前記したアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ＤＮＡの安定誘導体（例えば、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネート）、ＲＮＡ、ＲＮＡの安定誘導体（例えば、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡ）、または他のアポペインアンチセンスオリゴヌクレオチド模造物であり得る。アポペインアンチセンス分子は、ミクロ注入、リポソームカプセル化、またはアンチセンス配列を有するベクターからの発現により細胞に導入され得る。アポペインアンチセンス治療は、アポペイン活性を減らすことが有効な病気の治療に対して特に有用である。アポペイン遺伝子治療は、標的臓器の細胞にアポペインを導入するために使用され得る。アポペイン遺伝子は、受容体宿主細胞の感染によりアポペインＤＮＡの移入を仲介するウイルスベクターに結合され得る。適当なウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、肝炎ウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス等が含まれる。或いは、アポペインＤＮＡは、リガンド−ＤＮＡ結合体またはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ結合体を用いる受容体仲介標的ＤＮＡ転移、リポフェクション膜融合または直接ミクロ注入を含めた非ウイルス方法により遺伝子治療用細胞に導入することができる。これらの方法及びその変法は、生体内及び生体外アポペイン遺伝子治療に適している。アポペイン遺伝子治療は、アポペイン活性を高めることが有効な疾患の治療のために特に有用であり得る。アポペインＤＮＡまたはアポペインタンパク質を含む医薬的に有用な組成物は、本明細書に記載されているようにして、または医薬的に許容され得る担体と混合するような公知の方法に従って調製され得る。前記担体及び調製方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。効果的に投与するために適した医薬的に許容され得る組成物を作成するために、前記組成物は、有効量のタンパク質またはＤＮＡを含む。本発明の治療または診断用組成物は、アポペイン関連疾患を治療または診断するのに十分な量個体に投与される。有効量は、個体の状態、体重、性別及び年齢のような各種因子により異なり得る。他の因子には、投与モードが含まれる。医薬組成物は、皮下、局所、経口及び筋肉内のような各種経路により個体に投与され得る。特定のアミノ酸をコードする各種コドン中に多量の重複部分が存在することは公知である。従って、本発明は、同一のアミノ酸の偶発的翻訳をコードする別のコドンを含むＤＮＡ配列にも関する。本明細書では、１つ以上の置換コドンを有する配列は縮重変異体と定義される。また、発現タンパク質の最終的物性を実質的に変更しない、ＤＮＡ配列または翻訳されたタンパク質の突然変異も本発明に包含される。例えば、ロイシンをバリンに、リシンをアルギニンに、またはグルタミンをアスパラギンに置換してもポリペプチドの機能性に変化は生じないことがあり得る。ペプチドをコードするＤＮＡ配列が、天然に存在するペプチドの性質とは異なる性質を有するペプチドをコードするために変更され得ることは公知である。ＤＮＡ配列を変更する方法には、非限定的に、位置指定突然変異誘発が含まれる。変更される性質の例には、非限定的に、基質に対する酵素のアフィニティーの変化が含まれる。本明細書において、アポペインの「機能的誘導体」は、アポペインの生物学的活性と実質的に類似の生物学的活性（機能的または構造的）を有する化合物である。用語「機能誘導体」は、アポペインの「断片」、「変異体」、「縮重変異体」、「アナログ」、「相同体」または「化学的誘導体」を含むと意図される。用語「断片」は、アポペインのポリペプチドサブセットを指す。用語「変異体」は、構造及び機能の点で全アポペイン分子またはその断片と実質的に類似している分子を指す。両方の分子が実質的に類似の構造または両方の分子が類似の生物学的活性を有しているならば、分子はアポペインに「実質的に類似」している。従って、２つの分子が実質的に類似の活性を有している場合、たとえ１方の分子の構造が他方の分子に見られなくとも、また２つのアミノ酸配列が同一でなくとも、両分子は変異体であると見做される。用語「アナログ」は、機能の点で全アポペイン分子またはその断片と実質的に類似している分子を指す。用語「化学的誘導体」は、通常基本分子の一部ではない化学的部分を追加的に含む分子を指す。前記部分により、基本分子の溶解性、半減期、吸収等が改善され得る。また、前記部分は、基本分子の望ましくない副作用を減らしたり、基本分子の毒性を減ずることができる。前記部分の例は、いろいろな本、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。本発明は、アポペインをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現またはアポペインタンパク質の機能をインビボで調節する化合物をスクリーニングする方法にも関する。これらの活性を調節する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、非タンパク質有機物質であり得る。化合物は、アポペインをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現或いはアポペインタンパク質の機能を上昇もしくは減少することにより調節し得る。アポペインをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現或いはアポペインタンパク質の機能を調節する化合物は、各種アッセイで検出し得る。前記アッセイは、発現または機能の変化があるかどうか調べるための単純な「イエス／ノー」アッセイであり得る。このアッセイは、試験サンプルの発現または機能を標準サンプル中の発現または機能のレベルと比較することにより定量的に行い得る。更に、本発明は、式Ｉの化合物（Ｌ−７６１，１９１）またはその医薬的に許容され得る塩を包含する。 Ac-DEVD-CHO Ｉ本発明の医薬組成物は、活性成分として式Ｉの化合物またはその医薬的に許容され得る塩を含み、医薬的に許容され得る担体及び任意に他の治療用成分を含み得る。用語「医薬的に許容され得る塩」は、無機及び有機塩基を含めた医薬的に許容され得る非毒性塩基から製造される塩を指す。無機塩基から誘導される塩には、アルミニウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、銅塩、第１鉄塩、第２鉄塩、リチウム塩、マグネシウム塩、第１マンガン塩、第２マンガン塩、カリウム塩、ナトリウム塩、亜鉛塩等が含まれる。特に好ましくは、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩及びナトリウム塩である。医薬的に許容され得る有機の非毒性塩基から誘導される塩には、第１級、第２級及び第３級アミン、天然に存在する置換アミンを含めた置換アミン、環状アミン、及び塩基性イオン交換樹脂（例えば、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチル−モルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミン等）の塩が含まれる。本発明の化合物が塩基性の場合には、塩は無機及び有機酸を含めた医薬的に許容され得る非毒性酸から製造される。前記酸には、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、ショウノウスルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が含まれる。特に好ましくは、クエン酸、臭化水素酸、塩酸、マレイン酸、リン酸、硫酸及び酒石酸である。以下の治療方法の記載において式Ｉの化合物を言及するとき、該化合物には医薬的に許容され得る塩も包含されるものと理解されたい。式Ｉの化合物のアポペインの作用を抑制する能力により、該化合物はアポトーシスの分野での有用な研究ツールとなる。前記化合物は、哺乳動物、特にヒトにおいて病気を治療、予防及び改善するために使用される。前記病気には、非限定的に、１．免疫不全症候群（ＡＩＤＥＳを含む）、２．Ｉ型糖尿病、３．病原性感染、４．心血管及び神経損傷、５．脱毛症、６．老化、７．パーキンソン病、８．アルツハイマー病が含まれる。用量範囲式Ｉの化合物の治療用量は、治療を受ける状態の重篤度、並びに式ＶＩの特定化合物及びその投与経路により変わり、臨床医の判断によっても変わる。また、治療用量は、各患者の年齢、体重及び反応によっても異なる。従って、活性成分の有効用量は、全ての基準を考慮し、患者の利益が最良になるように判断して臨床医によって決定され得る。許容され得る眼科用処方物中の式Ｉの化合物０．００１〜１重量％溶液または懸濁液からなる点眼用製剤を使用することができる。医薬組成物有効量の本発明の化合物を哺乳動物、特にヒトに投与するために、適当な投与経路が使用され得る。例えば、経口、非経口及び局所経路が使用され得る。投与形態には、錠剤、トローチ剤、分散剤、懸濁剤、溶液剤、カプセル剤、クリーム剤、軟膏、エアゾール等が含まれる。本発明の医薬組成物は、式Ｉの化合物またはその医薬的に許容され得る塩を活性成分として含み、医薬的に許容され得る担体及び任意に他の治療成分をも含み得る。用語「医薬的に許容され得る塩」は、無機の酸もしくは塩基及び有機の酸もしくは塩基を含めた医薬的に許容され得る非毒性の酸もしくは塩基から製造される塩を指す。本発明の組成物には、経口、非経口及び眼投与に適した組成物が含まれる。これらの組成物は、単位投与形態で提供され、薬剤業界で十分に公知の方法により製造されるのが好都合である。実際の使用において、活性成分としての式Ｉの化合物は、慣用の医薬コンパウンディング方法に従って均質混合物の形態で医薬用担体と混合される。担体は、所望される投与製剤の形態によって各種形態をとり得る。経口投与の形態の組成物を製造するには、通常の医薬媒体、例えば懸濁剤、エリキシールや溶液剤のような経口液体製剤の場合には例えば水、アルコール、油、芳香剤、保存剤、着色剤等；散剤、カプセル剤及び錠剤のように経口固体製剤の場合にはスターチ、糖、微晶質セルロース、希釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等の担体が使用され得る。固体の経口製剤が液体製剤に比べて好ましい。投与が容易であることから、散剤及びカプセル剤が医薬用担体を必ず使用する最も有利な単位経口投与形態である。所望ならば、錠剤に標準的な水性または非水性方法でコーティングを施してもよい。本発明の経口投与に適した医薬組成物は、各々が所定量の活性成分を含むカプセル剤、カシェ剤または錠剤のようなディスクリート単位として、散剤または顆粒剤として、或いは水性液体、非水性液体、水中油型乳濁液もしくは油中水型油乳液中の溶液剤または懸濁剤として提供され得る。前記組成物は、任意の調剤方法により製造され得るが、いずれの方法も活性成分を１つ以上の必要成分からなる担体と接触させるステップを含む。一般に、前記組成物は、活性成分を液体担体及び／または微細な固体担体と均一かつ均質に混合し、次いで所要により生成物を所望の形態に成形して製造される。例えば、錠剤は、任意に１つ以上の補助成分と共に圧縮または成形して製造され得る。圧縮錠剤は、適当な機械中で、粉末または顆粒のような自由流動性の形態の活性成分を場合により結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、表面活性剤または分散剤と混合してから圧縮して製造され得る。すりこみ錠剤は、適当な機械中で、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化化合物の混合物を成形して製造され得る。望ましくは、各錠剤は約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含み、各カシェ剤またはカプセル剤は約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含む。本発明の化合物は、当業界で公知の方法を用いて製造するのが好都合である。ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼのタンパク質分解開裂は次のようにして測定され得る。（ａ） ³⁵ Ｓ−放射性標識ＰＡＲＰの調製ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼをコードするｃＤＮＡ（クローンｐＣＤ−１２；ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｍ３２７２１；ＮＣＢＩｇｉ１９０２６６）をそのクローニングベクターからＸｈｏＩ制限酵素消化により切出し、次いでＸｈｏＩ−切断、ＣＩＰ−処理ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に結合させた。コンピテント大腸菌細胞に形質転換し、コロニー精製し、生じた形質転換細胞を液体培養物中で増殖させた後、プラスミドＤＮＡを精製し、ＰＡＲＰｃＤＮＡの配向を制限酵素分析により調べた。Ｔ７方向及びＴ３方向で配向させたクローンを得、そのプラスミドＤＮＡを使用して、［³⁵Ｓ］メチオニン（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）の存在下でＴｎＴ網状赤血球ライゼート（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いる共役インビトロ転写／翻訳により［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰを合成した。生じた［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰポリペプチドを、予め１０ｍＭＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＣＨＡＰＳ、５ｍＭジチオトレイトールで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５ＨＲ１０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉｅ）を用いるゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し、網状赤血球ライゼートの諸成分を取り除いた。（ｂ）ＰＡＲＰ開裂の測定インキュベーション混合物（最終容量２５μｌ）は１０ｍＭＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＣＨＡＰＳ、５ｍＭジチオトレイトールからなる緩衝液中で調製し、精製［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰ５μｌ、ＰＡＲＰ開裂活性（例えば、アポトーシス性骨肉腫、ＴＨＰ−１または他の細胞由来の分画、または精製アポペインまたは組換えアポペイン）０〜１０μｌ及び薬物（指示されている場合）またはベヒクルを含んでいた。混合物を３７℃で６０分間インキュベート後、５倍濃縮したＳＤＳ含有ＰＡＧＥサンプル緩衝液６．５μ ｌを添加して停止し、９５℃で５分間変性させた。サンプルを１０％ポリアクリルアミドゲルで分離し、エレクトロブロッティングによりポリ（ビニリデンジフルオライド）膜に移した後、［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰ開裂産物をオートラジオグラフィーにより可視化した。ＰＡＲＰ開裂を、１１３．１ｋＤａＰＡＲＰポリペプチドの２４．１ｋＤａ断片及び８９．１ｋＤａ断片への分解として調べた。ＰＡＲＰ開裂活性を、得られたオートラジオグラムをレーザーデンシトメトリーにより測定した２４．１ｋＤａ断片の容量−密度により定量化した。（ｃ）蛍光原基質の開裂によるＰＡＲＰ開裂の測定アポペインにより認識され、ＰＡＲＰ開裂サイトＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（ＡＭＣＮアミノ−４−メチルクマリン）のＰ１−Ｐ４アミノ酸に相当するテトラペプチドの蛍光原誘導体を、ｉ）Ｎ−Ａｃ−Ａｓｐ（ＯＢｎ）−Ｇｌｕ（ＯＢｎ） −Ｖａｌ−ＣＯ₂Ｈの合成、ii）Ａｓｐ（ｏＢｎ）−７−アミノ−４−メチルクマリンとのカップリング、iii）ベンジル基の除去により製造した。１００ｍＭＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１０％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭジチオトレイトール中にＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ及び精製または粗製ＰＡＲＰ開裂アポペイン／ＣＰＰ３２酵素を含む標準反応混合物（最終容量３００μｌ）を、２５℃でインキュベートした。反応を、分光蛍光計を用い、励起波長３８０ｎｍ、放射波長４６０ｎｍで連続的に追跡した。結晶の調製及びＸ線結晶学用語「構造座標」は、Ｘ線単色ビームの回折に対して結晶形のアポペイン分子の原子（散乱中心）により得られるパターンに関する数式から誘導される数学的座標を指す。回折データを使用して、結晶の繰返し単位の電子密度マップを算出した。分子密度マップを使用して、結晶の単位胞内の個々の原子の位置を確認した。用語「重原子誘導化」は、化学的に修飾した形態のアポペイン形態を製造する方法を指す。結晶中に拡散し、タンパク質の表面に結合し得る重金属原子塩または有機金属化合物を含有する溶液中に結晶を浸漬する。浸漬させた結晶をＸ線回折分析にかけて結合した重金属原子の位置を調べる。この情報を使用して、タンパク質の３次元構造を構築するために使用される相情報を得る。当業者が理解するように、Ｘ線結晶学により決定される構造座標は標準誤差を持たない。用語「単位胞（unit cell）」は、基本的な平行六面体ブロックを指す。前記ブロックを規則的に組み立てることにより結晶の全容積が構築され得る。用語「空間群」は、結晶の対称要素の配置を指す。用語「分子置換」は、その構造座標が公知の分子を配向させ、配置することによりその構造座標がわかっていないアポペイン結晶の予備モデルを作成することを含む方法を指す。次いで、このモデルから相を計算し、観測した振幅と合わせて、座標が公知の構造の近似フーリエ合成を得る。アポペインの構造座標を使用して、酵素に結合し、各種方法で物理的特性を変更する化合物を設計することができる。また、酵素の構造座標を使用して、酵素に結合する化合物の小分子データ基礎をコンピュータを用いてスクリーニングすることができる。アポペイン突然変異体の構造座標により、関連タンパク質または酵素の同定が容易となり得、よってアポペイン仲介状態の治療及び予防のための新規治療モードを導くことができる。以下の実施例により本発明を例示するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。実施例１アポペインの産生アポペインの産生方法は、大腸菌において別々に発現される成分ｐ１７サブユニット及びｐ１２サブユニットからの活性酵素の折り畳みを含む。アポペイン／ＣＰＰ３２ｐ１７サブユニット（Ｓｅｒ¹⁴¹−Ａｓｐ²⁹⁷）及びｐ１２サブユニット（Ｓｅｒ³¹⁰−Ｈｉｓ⁴⁰²）を、ＰＣＲ直接鋳型修飾によりそれぞれＭｅｔＳｅｒ¹⁴¹ −Ａｓｐ²⁹⁷構築物及びＭｅｔＳｅｒ³¹⁰−Ｈｉｓ⁴⁰²構築物として発現させるために遺伝子操作した。ｐ１７サブユニットをコードするｃＤＮＡを、完全長ＣＰＰ３２β ｃＤＮＡ（３ｎｇ／μｌ）を鋳型として用い、センス（前進）合成オリゴヌクレオチド５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＧＡＧＴＧＧＡＡＴＡＴＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＧＴＴＡＴＡＡＡＡＴＧＧ−３’（配列番号５）及びアンチセンス（逆）オリゴヌクレオチド５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＧＡＴＴＡＧＴＣＴＧＴＣＴＣＡＡＴＧＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＧＴＴＣＴＧ−３’（配列番号６）で増幅させた（Ｐｗｏポリメラーゼ（０．０２５Ｕ／μｌ）ＢｏｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ；９４℃×１分、６０℃×１分、７２℃×４５秒のサイクルを２５回）。ｐ１２サブユニットをコードするｃＤＮＡを同様にして増幅させた。ただし、センス（前進）オリゴヌクレオチドは５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＧＡＧＴＧＧＴＧＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＣＧＴＧＴＣ−３’（配列番号７)とし、アンチセンス（逆）オリゴヌクレオチドは５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＧＡＴＴＡＧＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＡＧＡＧＴＴＣＴＴＴＴＧＴＧＡＧＣ−３’（配列番号８）とした。生じたｐＣＲ断片を精製し、ＸｂａＩでトリムし、次いでｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＸｂａＩサイトに結合した。配列を確認した後、挿入断片をネストしたＢｓｐＨＩサイトから切り出し、ｐＥＴ−１１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｃｏＩサイトに結合した。次いで、適切に配向したクローンを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞に形質転換した。産生培養用の最適増殖条件は、組換えタンパク質の発現のために１ｍＭＩＰＴＧを用い、Ｍ９培地を３７℃で一晩誘導しながら使用した。（これらの条件下で、個々のサブユニットを約５０ｍｇ／ｌで発現させた。いずれの場合にも、タンパク質は、通常総タンパク質の９９％を越えるタンパク質が含まれる封入体分画に専ら局在化した。）大腸菌を集め、洗浄し、プロテアーゼ阻害剤の存在下で切断した。次いで、封入体を単離し、６Ｍグアニジン塩酸塩において可溶化した。活性組換えアポペインを生成するために、変性したｐ１７サブユニット及びｐ１２サブユニットを混合し、迅速に１００ｍＭＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１０％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、０．５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＤＴＴ中に１００μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。（いくつかのパイロット実験で、これらが最適の折り畳み条件であることが確立されている。）次いで、反応物を室温で６０分間インキュベートした。これら条件下で、サブユニットタンパク質の幾つかは沈降した。１００，０００×ｇで６０分間超遠心して沈殿物を除去した。この方法により、折り畳み効率は約１０％（活性酵素のモル数／ｐ１７サブユニットのモル数×１００）であった。これは培養物１リッター当たり活性酵素約５ｍｇの総収量に相当する。実施例２アポペインの精製続いて、活性酵素を、ＨｉＴｒａｐＱカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１ｍｌを用いるアニオン交換クロマトグラフィーにより正しく折り畳まれていないタンパク質から分離した。組換えアポペイン複合体のマススペクトル分析は、該複合体がＳｅｒ¹⁴¹−Ａｓｐ²⁹⁷にわたる完全なｐ１７鎖と、主としてＭｅｔＳｅｒ³¹ ⁰ −Ｈｉｓ⁴⁰²からなり若干のＳｅｒ³¹⁰−Ｈｉｓ⁴⁰²を含むＰ１２鎖混合物とからなることを示す。得られた酵素は、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによる阻害に対するキネティックパラメータの点では天然酵素と区別できない。実施例３アポペインの結晶化アポペイン：Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ複合体を、懸垂蒸気拡散法により結晶化した。タンパク質−阻害剤溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．５、１０ｍＭＤＴＴ、３ｍＭＮａＮ₃中８．７ｍｇ／ｍｌ）１．５μｌを等容量のリザーバ−緩衝液（７％ＰＥＧ−６０００（ｗ／ｗ）、０．１０Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ５．０、１０ｍＭＤＴＴ、３ｍＭＮａＮ₃）と混合し、室温でインキュベートした。結晶は斜方晶空間群Ｔ２２２（ａ＝６９．８１、ｂ＝８４．６２、ｃ＝９６．７９Å）に属する。実施例４構造解明及び細分２．５Åの分解能に拡大した３次元回折データを、Ｓｉｅｍｅｎｓ面積検出計及び理学ＲＵ−２００回転アノードＸ線発生装置からのＣｕＫα放射を用いて室温で集めた。これらのデータをＳＡＩＮＴソフトウェアパッケージ³⁶を用いて処理した。８，９２９ユニーク反射の２０，８０１観測値を５．５５％のＲ−因子と統合した。構造を、Ｘ−ＰＬＯＲ³⁷及び阻害されたＩＣＥ²⁸の構造のＰＤＢ³⁸ エントリー１ＩＣＥをベースとするモデルを用い、分子置換により解明した。現在のモデルは、相互作用のモデル作成³⁹及びＸ−ＰＬＯＲを用いる細分³⁷により構築された。モデル作成の初期段階において、ＳＱＵＡＳＨ⁴⁰を用いる相細分は電子密度マップの質を大きく改良させた。現在のモデルは、１０％模擬アニーリングオミットマップ⁴¹に対して検査し、ｐ１７鎖の残基１４９−２９５、結合阻害剤のｐ１２鎖の残基３１７−４０２及び２５秩序水分子を含む。ｐ１７鎖のＮ−末端の残基１４１−１４８、ｐ１７鎖のＣ−末端の２９６−２９７及びｐ−１２鎖のＮ−末端の３１０−３１６は、たぶん無秩序のために現在の電子密度マップでは可視化されない。細分されたモデルのＲ−因子は２６．２％（Ｒ_free＝３４．２％）⁴²であり、立体化学は合理的である（結合のｒ．ｍ．ｓ．分布=０．００６Å、角度＝１．３°）。二次構造をプログラムＳＴＲＩＤＥ⁴³ を用いてアポペイン及びＩＣＥに帰属させた。Ｐ₁炭素原子でのＣｙｓ²⁸⁵Ｓγの求核攻撃により生ずる光学中心のキラリティーを確立するためにに特別の注意を払った。細分が終わったら、この原子で考えられる配置のそれぞれに対して同等のモデルを作成し、２つのモデルを大きさは同じであるが手が反対のキラル制限で同時に細分した。次いで、この原子の８．０Å内のすべての原子をそれぞれのモデルについて欠失させ、両方の切り捨てたモデルを３０００Ｋ模擬アニーリング細分にかけた。次いで、複合体のこの部分の電子密度マップを、両組の相から計算し、そのサイトでの立体化学を決定するために検査した。アポペイン：Ａｃ −ＤＥＶＤ−ＣＨＯ複合体の座標及び構造要素はＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ³⁸に寄託されるであろう。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Crystal structure of Apopain and its use Field of the invention Apoptosis.Background of the Invention The present invention relates to crystalline apopain, the structure of apopain measured by X-ray crystallography, Apopain analogs and other crystalline forms, mutants, and Use for elucidating the structure of apopain co-complexes Apoppe for apopain structures and homologues, mutants and co-complexes thereof For use in designing inmodulators. One aspect of the present invention determines the three-dimensional (tertiary) structure of a protein by X-ray diffraction. The present invention is to obtain an apopain crystal having a sufficient quality to be used. The above crystals are obtained What is actually done is a very unexpected result. Prior to this application, protein crystallography Crystals of sufficient quality to determine the structure of apopain in the field It is known that it has not been done. Therefore, one object of the present invention is to High resolution (high) provide crystals of sufficient quality to be determined by resolution. And The value of Apopain crystals is that they can obtain the structure of Apopain itself. It doesn't stop there. Use the knowledge gained about Apopain to help A model of quality tertiary structure can be created. Another aspect of the invention is the use of protein Starting material for use in determining the structure of other members of the Popein family Is to provide a fee. From the knowledge of the structure of the Apopain family of proteins Means for examining the mechanism of action of the protein in the body are provided. For example, Binding of the above proteins to various receptor molecules using various computer models Can be predicted. Once the binding is found to actually occur, chemists Is based on functional binding of apopain to its receptor based on knowledge of the protein structure. You can design similar small molecules and try to synthesize them. This is "reasonable" It is a method of drug design. Thus, another aspect of the invention is very similar to the action of Apopain. To provide a starting material in the rational design of drugs. Mammalian interleukin-1β converting enzyme (ICE) and nematodes C. elega required for cell death programmed in ns Cysteine protease related to CED-3, a product of a gene To play an important role in biochemical events that apoptosis Is^1-3. Some human isoforms of the ICE / CED-3-like protease family (Which are divided into two distinct phylogenetic subfamilies) are now identified ing. The isoform related to ICE is ICE_rel-II (TX, ICH-2) and I CE_relAn isoform that is more similar to CED-3, including ICH-1 (mNedd 2), CPP32 (Apopaine, Yamaha), Mch2 and Mch3 (ICE- LAP3)^4-14. We believe that CPP32 / apopane and strong tetra The three-dimensional structure of the peptide-aldehyde inhibitor complex was investigated by X-ray diffraction analysis . Proteins may have I-type tertiary and quaternary structures and in terms of features related to catalytic activity. Similar to CE. However, Apopain's S_FourSubsites are And ICE in terms of chemical composition. Because of this difference, two of these enzymes Provides a structural basis for understanding the differences in specificity between subfamilies of The role of ICE itself in mammalian apoptosis is still clearly established Not^15,16This important physiological At least one homologue, Apopain / CPP32, plays an important role in the process It is clear that. At the onset of apoptosis, apopain (P_Four) As p-XX-Asp (P₁) By separating the essential functional domains of the motif Disables key homeostasis and repair enzymes. Known groups for Apopaine The quality is poly (ADP-ribose) polymerase (genomic server in stressed cells). Enzymes involved in veillance and DNA repair), U1-70 kDa small nuclear ribonuclei Protein (required for mRNA splicing), and DNA dependent 460k of an inactive protein kinase (required for DNA double-strand break repair) Including Da catalyst unit^15,19,21-23. Apopain and Apopain during cell suicide Potential substrates for like-like proteases are structural proteins such as fodrin (Non-erythroid spectrin), nuclear lamins and growth arrest specific protein 2 (G as2), and protein kinase C キナーゼ and some unidentified Contains self-antigens^22,24-27. These proteases are responsible for hemostasis and repair Disruption events that contribute to the disabling of the process and the systematic disassembly of dying cells It is thought to be related to cade. Apoptosis balance Collapse, poor apoptotic death, such as cancer or excess or immature apoptosis Underlying the etiology of many human diseases, which can include both Alzheimer's disease It is thought to do. Thus, specific biochemical apoptosis modulators, such as Identifying apopain, for example, opens up potential treatments for these diseases. All ICE / CED-3 proteases are proteolytically processed. Is synthesized as a proenzyme that forms the catalytic domain of the heterodimer It is. In the recently published ICE crystal structure, the two heterodimers combine From this finding, this finding indicates that this substance is a catalytically active form of the enzyme. Was suggested^28,29. The most characteristic catalytic property of this family is the substrate P₁ Is that the position Asp is almost absolutely necessary^4,5,28-30. Mentioned above and others However, the substrate specificities of ICE and Apopain differ significantly. I CE is an important determinant of P_FourPrefers a hydrophobic residue at the position, but Apopa Is considered specific for Asp. Accordingly, the present inventors have In order to identify determinants that reveal significant differences in substrate specificity, To provide a basis for designing high specificity modulators And, ultimately, functionally related to apopain in apoptotic cell death To understand the structural basis for the role of family members Tried to determine the three-dimensional structure of. We have developed a conjugate with the peptide-aldehyde inhibitor Ac-DEVD-CHO. The three-dimensional structure of apopain in the body was elucidated with a nominal resolution of 2.5 °. Apopaine Are very similar to ICE (FIG. 1). Apopain's p The 17 subunit and the p12 subunit are folded to about 40 x 35 x 25 cm Size compact cylinder with 5 parallel chains and 1 fold Dominated by a central 6-chain β-sheet with antiparallel chains of Modulator- At the top of the cylinder that is part of the binding site, a small two-chain antiparallel β-sheet and There is a second two-strand antiparallel β-sheet in front of the offspring (FIG. 1A). In addition, p17 Very small 2 containing the C-terminus of the punit subunit and the N-terminus of the p12 subunit. There is a chain β-structure (see description of the quaternary structure below). Five helicopters And three of them exist on one side of the main β-sheet and two on the other side . At the N-terminal end of the p20 subunit of ICE (FIG. 1B). The helix has no equivalent in the Apopaine crystal and is Residues corresponding to this helix in broken amino acids are apparently disordered in the crystal structure It is. As in the case of the ICE structure, the p17-p12 heterodimer pair The central β-structure extends across the twice rotationally symmetric crystal axis It becomes another tetramer in the offspring (FIG. 2). Inhibitors have an extended conformation And its binding to the enzyme is a tetrapeptide aldehyde to ICE. Is very similar to the case of the inhibitor. Inhibitor P₁−P_ThreeBinding mode with residues Is very similar to the mode found in the ICE structure,_FourThe Asp residue of The interactions involved are clearly different, and the differences in specificity of the two enzymes at this position Matches. Apopain structure and ICE structure have similar secondary structure or conformation When aligned on 194 residues, the average difference between equivalent α carbon atoms is 1.11 Å. The most significant difference in the overall structure of the two enzymes is present in ICE Two small surface loops are absent in Apopain, ApoPain is present in other enzymes Not including one extra loop. Apo Pain is ICE Residues 156-160 (left of FIG. 1B) Bottom) and residues 248-258 (top middle of FIG. 1B) have no equivalent groups. Apo The pane contains a 10-residue insert at a position equivalent to residue 381 of the ICE (FIG. 1A). (Top right), this extra loop has an irregular reverse turn over the bound inhibitor To give some residues that form part of the binding site. Add this loop Is the most significant difference between the two ICE-related proteases exemplified by the two enzymes. One of them. For example, all members of the ICE subfamily (ICE, I CE_rel-II, ICE_rel-III) describes this loop based on primary sequence alignment. Not expected to have. On the other hand, C.I. elegans including CED-3 itself All members of the CED-3-like subfamily have equivalent loops (eg, ICH -1, Mch2, Mch3). Therefore, the existence of this loop structure Is considered to be a molecular feature that indicates structural and possibly functional relevance to Apopain. (See below). The quaternary structures of the two enzymes are generally very similar. Each protein smell The heterodimer formed by the two chains is a structurally identical heterodimer. And form a four-chain aggregate with twofold rotational symmetry. Both tampa Quality And the central β-sheet extends across the resulting interface, adding residues 389 and 392. An anti-parallel β-structured hydrogen bond comprising links the two heterodimers. The resulting Tet The lamer aggregate is about 50 × 35 × 25 with a 12-chain-β-structure passing through its center. It has a size of Å and contains two catalytic sites in widely separated parts of the molecule (FIG. 2). When the two tetramers are aligned, the equivalent 388α carbon is only 2.01% on average different. ICE and Apopain have similar quaternary structures in two different crystal lattices This structure is common to other members of this family of enzymes Is supported. At Apopaine, as in the case of ICE, the larger The N-terminal of the smaller subunit of the same heterodimer Very far from the edge (52 °). For example, in FIG. 295 is 52 ° away from residue 317 on the left p12, which is lighter. This distance is These residues in the Payne precursor are linked but are disordered in the crystal structure. Too long to be complemented by nine residues. Because of this, the folding of Apopain And processing includes some unique features, such as ICE. Both Impact Two models can be proposed for quality^28,29. In the first model, dark The p17 chain (left in FIG. 2) is derived from the same precursor molecule as the dark p12 chain (right in FIG. 2) . These residues are separated by 12 ° and they are larger due to nine disordered residues. It can be easily combined without complicated structural rearrangement. However, in this model , Two relatively compact heterodimers found in the mature protein (Figure 1) Must be derived from a separately synthesized and folded polypeptide chain. IC In both the E- and apopain structures, this model shows the accessibility of the new chain ends. Backed by In the ICE structure, this model corresponds to the dark p in FIG. 2 (left). Wide between the C-terminus of the subunit corresponding to 17 chains and the N-terminus of the dark p12 chain This is supported by the fact that β-structured hydrogen bonds exist. These mutual The effect is to bind residues 29-297 of the p20 chain to residues 317-323 of the p20 chain. , Containing seven hydrogen bonds. However, the corresponding interaction Use is not very extensive. The β-structure consists of each chain (Gly²⁹³, Ile²⁹⁴, I le³²¹, Pro³²²)) And only contains two hydrogen bonds and two hydrogen bonds. In the second model, the dark p17 chain and the light p1 which are the two chains on the left side of FIG. The two chains are derived from the same p32 precursor. This model is shown on the left side of FIG. Compact heterodimers are derived from a single precursor molecule, Supported by the idea that relatively large conformational changes are required during Is done. In the Apopain structure, the changes described above have only a local effect, Has no effect on the overall structure of the protein. Surface loops in Apopain precursor Binds the C-terminus of the blue subunit at the N-terminus of the red chain. The loop Is the residue 3 from the end of the β-chain containing residues 278-283 (fourth from the left in FIG. 2). It extends to the beginning of the chain spanning 27-331 (fifth from the left in FIG. 2) and contains the precursor Is formed except that the small β-structure contains residues 293-294 and 321-322. It has the same tertiary and quaternary structures as the mature protein. The feasibility of this model is Larger and more radical cons after proteolysis of the serpin family Supported by the fact that homeotic changes are known to occur^31,3 ^Two . The ICE structure and the Apopain structure themselves strictly exclude any model do not do. In short, the subunits involved in precursor processing And the arrangement of specific residues is very similar in both ICE and apopain. But the structural details of the precursors of Apopain and ICE and their processing Need more thorough research. Active site of apopaine and its tetrapeptide aldehyde inhibitor Ac-As Interaction with p-Glu-Val-Asp-CHO indicates that the two proteins are ICE: Ac-Try-Val-Ala-As, except for the different S4 subsites Similar to the homologous features of the p-CHO complex. Inhibited by both proteins The agent binds in the groove on the enzyme surface. P₁And P_FourSide chains are associated with many proteins In contrast to the marked depressions in the acting coupling groove,_TwoAnd S_ThreeThe side chain is Away from proteinaceous body. Both complexes have 3 between the inhibitor backbone and the enzyme. Antiparallel β-structure-like hydrogen bonds, ie, P₁O-Ser³³⁹N, P_TwoN-Arg^Three ⁴¹ O and P_Two-O-Arg³⁴¹N is present (FIG. 3). S₁Subsites are ICE and And the apopain complex. P₁The carbonyl carbon atom of Cys²⁸⁵And the side chain of this residue is a complex series of Arg¹⁷⁹, Gln²⁸ ^Three And Arg³⁴¹The Polar Interaction with the Side Chain I have. Due to the high similarity of the three-dimensional structures of Apopain and ICE at the catalytically active site, It is strongly suggested that the details of the catalytic mechanism of these proteins are preserved. Catalysis and S₁All of the structurally related residues in ICE / CED-3 Due to the fact that they are conserved among members of the Rotase family, these enzymes Is a common catalytic mechanism and P₁Almost completely demanding Asp in Is suggested. S₁The local concentration of the two positive charges on the arginyl side chain in It is stabilized by the modulator and the negatively charged aspartyl side chain of the substrate. Conformations observed in the three-dimensional structure of inhibited apopain and ICE Are unstable in non-inhibitory enzymes and do not have the stabilization described above. this From their findings, the free enzyme is S₁Some counter ions like acetate or some Contains water molecules or has significant locality for modulator or substrate binding or release It is suggested that there is a typical conformational change. S_TwoAnd S_ThreeThe difference between the Apopaine and the ICE complex in E. coli is mainly due to the amino acid sequence It is caused by the difference. In Apopain, P_ThreeGlutamyl residue side chain is tamper Away from the body However, due to the side chain, the salt is Arg³⁴¹Linked to the side chain. This means that this site In accordance with the specificity of the enzyme at Arg³⁴¹The side chain is P₁Compatible with aspartyl side chain Interact (see above). P_TwoThe side chain of valine is Tyr³³⁸In the middle on the side chain As if leaning against the hydrophobic wall of the groove. S₁-S_ThreeContrary to the similarity of Apopaine and ICE in_FourSub site Are fundamentally different in terms of overall geometry and chemical type. ICE S_FourThe subsite is Large and shallow hydrophobic recess that easily accommodates rosyl side chains, The corresponding site is P₁ With a narrow socket that exactly surrounds the Asp side chain is there. Comparing the two sites, the Apo Pain site is Trp³⁴⁸And Phe³⁸⁰ ^A The most obvious difference is the compression due to the presence of the side chain (FIG. 4). Change In the ICE, Arg³⁸³The volume occupied by the side chains includes Ser^381AInserts starting with Peptide is packed. This peptide is_FourOf protein from the cavity inside It extends to the depression beyond the surface. Apopain's S_FourFrom the subsites, the specificity of the enzyme at this position is understood. The site boundary is Trp³⁴⁰, Arg³⁴¹, Asn³⁴², Trp³⁴⁸, Ser³⁸ ^1A And Phe^381BBy (FIG. 4A). Due to the carboxyl group of the inhibitor, Phe^381BAmide of Nitrogen atom and Asn³⁴²N^δ1Specific polar interactions with the atoms occur. This water The elementary connection network is Asn³⁴²N^δ2Atoms and Lys³⁴⁴And Asp³⁴⁵Ami Is extended by interaction with the nitrogen atom. The site is accessible in size and shape. Complementary to the Spartyl side chain and with the appropriate geometry to interact with the carboxyl group Includes two well-positioned hydrogen bond donors. Asn³⁴²Side chain of Is oriented by the hydrogen atom acceptor O 2^δ1And hydrogen bond donor Lys³⁴⁴ And Asp³⁴⁵Is fixed by interaction with the amide nitrogen atom. Apopain's S_FourAt 348 positions, which have an important role in defining the size and shape of the subsite Trp residues and the inserted 10 amino acid residues at position 380 are Fully conserved in the known CED subfamily of E-related proteases, Suggest that these enzymes have similar specificities at this subsite It is. The three-dimensional structure of Apopain is usually similar to ICE in terms of tertiary and quaternary structures. You. Furthermore, these two proteins are₁-S_ThreeVery similar to the case of subsites Momo in a similar way in a similar way Interacts with the regulator peptide. However, the amino acid between these two enzymes In agreement with the changes in the amino acid sequence and differences in substrate specificity, S_FourSubsite size and There are significant differences in type. These differences indicate that the ICE-specific protease It provides a basis for understanding the structural and functional differences between the two subfamilies. Also, From the comparison of the above two structures, the disease and physiological mechanism Provides structural basis for the design of high specificity modulators important in the study of available.Summary of the Invention The present invention relates to crystalline apopain, the structure of apopain measured by X-ray crystallography, Apopain homologues and other crystalline forms, mutants, and Uses for elucidation of the structure of apopain co-complexes, as well as Homologues, mutants and co-complexes for the design of apopain modulators Regarding the use of The present invention relates to a three-dimensional structure of an isolated / purified enzyme called apopain and its structural locus. About the mark. In addition, the present invention relates to the method of Used to elucidate the atomic details of a site and one or more auxiliary binding sites It is. Further, the present invention provides a method for converting the structural coordinates of an apopain crystal to another To elucidate the crystal structure of a mutant, homolog or co-complex of Popein Is to use. Furthermore, the present invention has one property that differs from wild-type apopain. An object of the present invention is to provide an apopain mutant having the above. Furthermore, the present invention Structural coordinates and atomic details of Paine or its mutants, homologues or copolymers For preventing and treating undesirable physical and pharmacological properties of Apopaine Design, use a computer to evaluate, synthesize and use inmodulators That is. The modulators are useful in treating immune, proliferative and degenerative diseases. Non-limiting examples of the diseases include immunodeficiency syndrome (eg, AIDS), autoimmune diseases, pathogenic infections, cardiovascular and nerve damage, alopecia, aging , Cancer, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, neurodegenerative diseases and And spinal cord injury. Furthermore, the present invention is useful in the field of apoptosis as well as in reducing apoptosis. Formula I useful as a research tool in the treatment of diseases (non-limiting examples of which are described above) Ac-DEVD-CHO I (Designated L-761, 191). In particular, the present invention relates to poly ( ADP-ribose) polymerase, U1-70 kDa nuclear small liponucleoprotein Normal Biology of the Catalytic Subunit of Protein and DNA-Dependent Protein Kinases Thios causing at least partial apoptosis by disabling function A modulator of pro-apoptotic proteolytic activity of proteinase Related.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 (A) shows an apopain: Ac-DEVD-CH observed on the twice rotation axis of the crystal. It is the schematic of an O structure. α-helix of β-structure, coils are arrows. Join Inhibitors are indicated by short arrows at the top of the figure. Extra loop in apopaine (residue 180A, 181A-I) are indicated by arrows. The p17 chain is dark and the p12 chain is light You. FIG. 1 (B) shows ICE oriented to maximize alignment with (A). : Indicates a YVAD structure. The two extra loops in the ICE are shown at the bottom 156-160) and the upper left (remainder 248-253) with white arrows. p20 The chains are dark and the p10 chains are light. FIG. 1 (C) shows a three-dimensional structure in which two proteins are aligned. Match residues with similar secondary structure or conformation 1 shows the amino acid sequences of Apopain and ICE that have been aligned. Lower sentence Letters indicate residues with apparently no electron density. Easy comparison between ICE and ApoPain In order to make the amino acid residue of Identified by the sequence number of the cognate residue of E. ICE-related residues in Apopain If it does not exist, omit the Apopain sequence number and Indicated by adding characters to the ICE sequence number. The method used for the production of apopain consists of the component p17, which is expressed separately in E. coli. And folding of the active enzyme from the p12 subunit. This section describes Amino acid numbering for recombinant engineering purposes , Apopei determined from reading frame of GenBank accession number U13738 Refer to the position of the amino acid in the protein enzyme (the methionine in the initiator is Residue 1 and the last residue before the stop codon is residue 402). Each sub unit The beginning and end of the knit are based on mass spectral analysis of non-recombinant purified human apopain. And determined by amino-terminal microsequencing¹⁹. Apopei / CEP32 p17 subunit (Ser¹⁴¹-Asp²⁹⁷) And p12 sub Unit (Ser³¹⁰-His⁴⁰²) Is modified by PCR template modification to MetS er¹⁴¹-Asp²⁹⁷Constructs and MetSer³¹⁰-His⁴²⁰Expressed as a construct Was genetically engineered to The cDNA encoding the p17 subunit was Using the long CPP32β cDNA (3 ng / μl) as a template, Hex) Synthetic oligonucleotide 5'-GCT CTA GAC TCG AGT CAT GAG TGG AAT ATC CCT GGA CAA CAG TTA TAA AAT GG-3 '(SEQ ID NO: 1) and antisense (reverse) Rigo nucleotide 5'-GCT CTA GAC TCG AGT CAT G AT TAG TCT GTC TCA ATG CCA CAG TCC A Amplified with GT TGT G-3 '(SEQ ID NO: 2) (Pwo polymerase (0 . 025U / μl) Boehringer Mannheim; 94 ° C. × 1 minute, 25 cycles of 60 ° C. × 1 minute and 72 ° C. × 45 seconds). p12 subunit The encoding cDNA was amplified similarly, except that the sense (forward) oligonucleotide Leotide is 5'-GCT CTA GAC TCG AGT CAT GAG TGG TGT TGA TGA TGA CAT GGC GTG TC-3 '(SEQ ID NO: 3), and the antisense (reverse) oligonucleotide was 5' -GCT CTA GAC TCG AGT CAT GAT TAG TGA TAA AAA TAG AGT TCT TTT GTG AGC-3 '( SEQ ID NO: 4) The resulting pCR fragment was purified, trimmed with XbaI, and then Xba of pBluescript II SK (+) (Stratagene) Bound to the I site. After confirming the sequence, the insert was nested with Bsp HI Cut out from the site and place it on the Nco I site of pET-11d (Novagen) Joined. Then, the appropriately oriented clone was cloned into E. coli BL21 (DE3) pLy. Transformed into sS cells. Optimal growth conditions for production culture are based on recombinant protein development. M9 medium was used at 37 ° C. overnight with induction using 1 mM IPTG for development. Was. (Under these conditions, the individual subunits were expressed at about 50 mg / l. In each case, the protein is usually greater than 99% of the total protein. Localized exclusively to inclusion body fractions containing quality. ) Collect E. coli, wash, protea Cleavage in the presence of a protease inhibitor. The inclusion bodies were then isolated and Solubilized in gin hydrochloride. Denature to generate active recombinant apopain The p17 and p12 subunits were mixed and immediately mixed with 100 mM HEPES / KOH (pH 7.5), 10% (w / v) sucrose, 0.1% ( w / v) 100 μg / CHAPS, 0.5 M NaCl, 10 mM DTT Diluted to a concentration of ml. (Some pilot experiments show that these Conditions are established. ) The reaction was then incubated at room temperature for 60 minutes. Was added. Under these conditions, some of the subunit proteins precipitated. The precipitate was removed by ultracentrifugation at 100,000 × g for 60 minutes. Using this method, The folding efficiency is about 10% (moles of active enzyme / moles of p17 subunit × 1). 00). This corresponds to a total yield of about 5 mg of active enzyme per liter of culture. Hit. Subsequently, the active enzyme was applied to a HiTrap Q column (Pharmacia). Improper folding by anion exchange chromatography using 1 ml From the protein. Mass spectral analysis of the recombinant apopain complex The complex is Ser¹⁴¹-Asp²⁹⁷Complete p17 chain and mainly MetS er³¹⁰-His⁴⁰²Consists of a little Ser³¹⁰-His⁴⁰²including And a P12 chain mixture. The resulting enzyme was Ac-DEVD-CH Indistinguishable from native enzyme in terms of kinetic parameters for inhibition by O . Apopain: Crystallization of Ac-DEVD-CHO complex by suspended vapor diffusion method did. Protein-inhibitor solution (10 mM Tris-HCl pH 8.5, 10 mM DTT, 3 mM NaN_Three8.7 mg / ml) 1.5 μl in an equal volume Buffer solution (7% PEG-6000 (w / w), 0.10 M sodium citrate) PH 5.0, 10 mM DTT, 3 mM NaN_Three) And mix at room temperature Incubated. The crystals are orthorhombic space group 1222 (a = 69.81, b = 84 . 62, c = 96.79 °). The three-dimensional diffraction data enlarged to a resolution of 2.5 mm is converted to a Siemens area detector. And room using CuKα radiation from a RU-200 rotating anode X-ray generator Collected warm. These data are obtained using the SAINT software package 36. Processed. 20,801 observations of 8,929 unique reflections with 5.55% R-factor Integrated with child. The structure is X-PLOR³⁷And inhibited ICE²⁸POB with structure³⁸ Based on entry 1 ICE Was elucidated by molecular replacement using a model that The current model is an interaction model Create³⁹And subdivision using X-PLOR³⁷Built by Early model construction At the stage, SQUASH⁴⁰Phase subdivision greatly improves the quality of electron density maps. I made it good. The current model is a 10% simulated annealing omit map⁴¹Against Inspection, residues 149-295 of the p17 chain, residues 317- of the p12 chain of the binding inhibitor It contains 402 and 25 ordered water molecules. residues 141-148 at the N-terminus of the p17 chain, 296-297 at the C-terminus of the p17 chain and 310-31 at the N-terminus of the p-12 chain. 6 is not visible in the current electron density map, probably due to disorder. Subdivision The R-factor of the model obtained was 26.2% (R_free= 34.2%)⁴²And stereochemistry Is reasonable (rms distribution of bonds = 0.006 °, angle = 1.3 °). Program the secondary structure STRIDE⁴³To ApoPain and ICE using Was. P₁Cys at carbon atom²⁸⁵Optical center chirality caused by Sγ nucleophilic attack Special care was taken to establish After the subdivision, consider this atom. Create an equivalent model for each of the possible configurations and scale the two models Are subdivided simultaneously with the same but opposite chiral restrictions. Then all atoms within 8.0% of this atom were deleted from the respective model. , Both truncated models were subjected to a 3000K simulated annealing subdivision. Then Calculate the electron density map for this part of the complex from both sets of phases and calculate Examined to determine stereochemistry. Apopaine: Ac-DEVD-CHO composite Body coordinates and structural elements are in the Protein Data Bank³⁸Will be deposited in There will be. FIG. 2 is a schematic diagram of an apopain tetramer oriented as shown in FIG. . The heterodimer on the left side of this figure is the same as in FIG. To the left heterodimer P17 chain is dark and p12 is light. The color is reversed in the right heterodimer is there. Bound inhibitor molecules are shown at the top of the dimer on the left side of the figure and on the right side of the dimer. It is a short arrow at the bottom. FIG. 3 shows bound N-acetyltetrapeptide aldehyde inhibitors, (A) ICE and (B) shows hydrogen bonding and other polar interactions between apopains. FIG. 4 (A) shows the S of the Apopain: Ac-DEVD-CHO complex._FourSub site Is shown. Acetyl group and S of the binding inhibitor_FourThe aspartyl residue is replaced with a ball-stick model. Shown in Protein is ro Shown as a pad. Hydrogen bonds are drawn with dashed white lines. FIG. 4B shows ICE: S of YVAD complex_FourIndicates a subsite. (A) and (B) are two proteins Are oriented to maximize the overall alignment of The references mentioned above are as follows. 1. Ellis, R.E., Yuan, J.Y. & Horvitz, H.R.Annu Rev Cell Biol7, 663-98 (1991). 2. Miura, M., Zhu, H., Rotello, R., Hartwieg, E.A. & Yuan, J.Y. Cell 75, 653-660 (1993). 3. Yuan, J.Y., Shaham, S., Ledoux, S., Ellis, H.M. & Horvitz, H.R. Cell 75, 641-652 (1993). 4. Thornberry, N.A., et al. Nature 356, 768-74 (1992). 5. Cerretti, D.P., et al. Science 256, 97-100 (1992). 6. Munday, N.A., et al. Journal Of Biological Chemistry270, 15870-15876 (1995). 7. Faucheu, C., et al. Embo Journal 14, 1914-1922 (1995). 8. Kamens, J., et al. Journal of Biological Chemistry270,15250- 15256 (1995). 9. Kumar, S., Kinoshita, M., Noda, M., Copeland, N.G. & Jenkins, N.A.Genes & Development 8,1613-1626 (1994). Ten. 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The present invention also provides a method for determining the structural coordinates of an Apopain crystal. Used to elucidate the atomic details of the site and one or more auxiliary binding sites is there. In addition, the present invention provides a method for converting the structural coordinates of an apopain crystal to another apopain crystal. Elucidate the crystal structure of mutants, homologs or co-complexes Is to use for. Furthermore, the present invention has properties different from wild-type apopain. Has one or more To provide an Apopain mutant. Furthermore, the present invention , Apopain, or its mutants, homologues or copolymers Child details to prevent and treat the unwanted physical and pharmacological properties of Apopaine Design, evaluate, synthesize, and use ApoPain modulators using a computer. It is to use. The modulator may be used to treat immune, proliferative and degenerative diseases. Non-limiting examples of the diseases include immunodeficiency syndrome (Eg AIDS), autoimmune diseases, pathogenic infections, cardiovascular and nerve damage, alopecia , Cancer, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, neurodegenerative diseases and And spinal cord injury. Furthermore, the present invention is useful in the field of apoptosis as well as in reducing apoptosis. Formula I useful as a research tool in the treatment of diseases (non-limiting examples of which are described above) Ac-DEVD-CHO I (Designated L-761, 191). In particular, the present invention relates to poly ( By disabling the normal biological function of ADP-ribose) polymerase Apot at least partially Pro-apoptotic proteolysis of thiol proteinase causing lysis For modulators of activity. Apoptosis is responsible for normal morphogenesis, tissue remodeling and pathogenic infection or other repairs. Configure systematic means of cell suicide in vivo during response to irreversible cell damage To achieve. Inappropriate apoptosis occurs in Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Hunch Tonton's disease, immunodeficiency, autoimmune disease, ischemic cardiovascular and nerve damage, alopecia, leukemia Apoptosis, as it can cause human diseases such as disease, lymphoma and other cancers Managing health is an important potential target for treatment. Several biochemical events involved in apoptotic cell death have recently been identified. For example, genetic evidence in C. elegans identifies positive and negative regulators of apoptosis did. An important pro-apoptotic gene, ced-3, is a putative cysteine protein Code Ze. The cysteine protease is associative at the S1 subsite. A new cysteine protea with nearly complete specificity for paraginate. Mammalian interleukin, the first enzyme identified in the 1β converting enzyme (ICE)⁶is connected with. ced-3 gene deletion or sudden Mutations should not be fatal when transfected into various host cells. Apoptotic death of all cells and apoptosis by CED-3 and ICE Totally prevented. Furthermore, the pro-apoptotic effect of CED-3 is due to the nematode death suppressing gene. By transfecting ced-9 together, the mammal, to some extent, It can be prevented by the prooncogene bcl-2. Thus, the death of a eukaryotic cell is I Opposing pro-apoptotic effects of CE / CED-3-like proteases and Bcl-2 and And / or a balance between upstream regulatory mechanisms, including homologs thereof. Potential group for ICE / CED-3-like protease during apoptosis One of the qualities is a key enzyme in DNA repair, genomic surveillance and integrity Certain poly (ADP-ribose) polymerases (PARP). PARP is Apoptosis is caused by an unidentified protease with properties similar to those of ICE. Proteolytic cleavage at initiation. PARP (DEVD²¹⁶-G²¹⁷)Inside The cleavage site is the pro-IL-1β (FEAD) that is recognized and cleaved by ICE.²⁷ -G²⁸) Is similar to one of the two sites. PARP on this site When cleaved proteolytically, self-modification leads to Two zinc finger DNA binding motifs at the amino terminus and the polypeptide Poly (ADP-ribose) erasing catalyst domain located at the carboxy terminus Are separated. This cleavage causes the catalytic domain of PARP to become a site of DNA damage. PARs are prevented from recruiting and regulate subsequent repair and genome maintenance events P's ability will be disabled. In addition, Nucleoso, a characteristic of apoptosis Ca involved in intracellular DNA cleavage²⁺/ Mg²⁺The dependent endonuclease is poly (A DP-ribose) ylation^20-22Is adjusted to be negative. Therefore, the normal P Loss of ARP function causes this nuclease to become highly reactive in dying cells. Is activated. Other substrates for apopain include (double-stranded DNA break repair and 460 of DNA-dependent protein kinase (essential for V (D) J recombination) kDa catalytic subunit and (necessary for pre-mRNA splicing) C) the 70 kDa protein component of the U1 nuclear small ribonucleoprotein. this The cleavage site in all of these substrates is a preferred recognition motif for ICE (T yr-XX-Asp). Yes, in each case, important functional domains in the target polypeptide. Mains are physically separated. Therefore, the inability to cooperate in important homeostasis processes Plays a key role in apoptotic cell death and apopin in cell death it is conceivable that. ICE / CED-3 family of cysteine proteases of human origin ICE, ICE_rel-II, ICE_rel-III, ICH-1, CPP32, Mc Seven types of h2 and Mch3 are known. Each transfected into host cells Can initiate an apoptotic response. However, excessive protease When manifested, cell death can be caused non-specifically. Other proteases, such as Cytoplasmic expression of lipsin, chymotrypsin, proteinase K or glandme B Has also been shown to cause apoptosis^27,28. In this study, we found that Apopain, the active form of CPP32, An enzyme involved in the specific proteolysis of PARP that occurs at the onset of potosis Prove that there is. In addition, we inhibit apopain-mediated PARP cleavage. This protease reduces apoptosis in vitro, so this protease is Demonstrates its central role in vesicle apoptosis. C. elegans elegans, one gene ced-3 is deleted or suddenly Mutation eliminated apoptotic death. When sequenced, ced-3 was: One known function is that of the inactive 31 kDa proIL-1β cytokine precursor. Mammalian internucleotide encoding a protease that is cleaved to an active 17 kDa form It was found to be homologous to the gene for leukin-1β converting enzyme (ICE). Feeding A description of the apoptotic function of ICE-like proteases in animal cells Participation in IL-1β formation and apoptosis usually occur in ICE-deficient mice In view of the knowledge of cheating, four other mammalian ICE / CED-3-like proteases (ICE, ICE_rel-II, ICE_rel-III, ICH-1, CPP32, M ch2 and Mch3)^23-26Discovery and coordination of genome structure and integrity An important enzyme, poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), is Functional inactivation by protease-like ICE (prICE) at the onset of lysis Will become more apparent with the observation that The inventors have in fact found that prICE is Popein / CPP32, which is a mammalian cell in mammalian cells Specific cleavage of PARP and other substrates at the onset of apoptosis ICE / CED-3-like cysteine protease. Mammal The central role played by Apopaine / CPP32 in cell death is in vitro Further proven by powerful and selective modulators that prevent potosis from occurring It is. These findings and the sequence between the apopain proenzyme, CPP32 and CED-3 From the relationship, CPP32 and its proteolytically active form of Apopain It is suggested that it may be the human equivalent of CED-3. Therefore, Apopain activity Pharmacological regulation of therapeutics in pathological conditions marked by inappropriate apoptosis May be a suitable point for. The cloned Apopain cDNA is then transferred to a suitable promoter and other suitable Recombinantly generated by molecular cloning into an expression vector containing transcriptional regulatory elements When introduced into prokaryotic or eukaryotic host cells, recombinant apopains are produced. obtain. As used herein, an expression vector refers to the transcription and transcription of a cloned copy of a gene. Is defined as the DNA sequence required for translation of the mRNA of the appropriate host. The vector Using bacteria, yeast, cyanobacteria, plant cells, insect cells and animal cells Eukaryotic genes can be expressed in various hosts. With specially designed vectors, bacterial-yeast or bacterial-animal cell DNA can be shuttled between such hosts. Properly constructed expression vector Is the origin of replication for autonomous replication in the host cell, a selectable marker, Useful restriction enzyme sites, potential and active promoters for high copy numbers May be included. The promoter causes RNA polymerase to bind to DNA, A Defined as the DNA sequence that initiates synthesis. Initiate mRNA synthesis frequently The promoter is a strong promoter. Expression vectors include, but are not limited to, Roning vectors, modified cloning vectors, and specially designed plasmids Or a virus may be included. Using a variety of mammalian expression vectors, recombinant apope in mammalian cells Can be expressed. Commercially available mammals suitable for expression of recombinant apopain Product expression vectors include, but are not limited to, pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EB O-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1 (8-2) (A TCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), PRSVgPt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 371) 98), psV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATC C 37460) and IZD35 (ATCC 37565). The DNA encoding apopain is expressed in an expression vector for expression in recombinant host cells. Can be cloned into a vector. Recombinant host cells can be prokaryotic or eukaryotic These cells include, but are not limited to, bacteria, yeast, mammalian cells and insect cells. I will. Suitable and commercially available cell lines of mammalian species include, but are not limited to, CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 70) 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (AT CC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH / 3T3 ( ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127 I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) And MRC-5 (ATCC CCL 171). An expression vector can be introduced into a host cell using any method. , But not limited to, transformation, transfection And infection, protoplast fusion and electroporation. Expression Vector-containing cells grow clonally, and individual clones Analyze to see if it produces quality. Apopain-expressing host cells Clones can be identified by several means, including but not limited to anti- -Immunological reactivity with apopain antibodies, including the presence of host cell-bound apopain activity I will. Expression of apopain cDNA is performed using in vitro produced synthetic mRNA. Can be implemented. Synthetic mRNA can be efficiently translated in various cell-free systems, The cell-free system includes, but is not limited to, wheat germ extract and reticulocyte extract. You. Alternatively, synthetic mRNA is efficiently translated in a system including cells, including but not limited to: For example, microinjected into frog oocytes. Apopain producing optimal levels of enzyme activity and / or apopain protein To determine the cDNA sequence, a modified apopain cDNA molecule is constructed. Host Cells are transformed with the cDNA molecule, and apopin RNA and protein Measure the level. The level of apopein protein in host cells Using various methods such as the affinity method and / or the ligand affinity method Quantify.³⁵S-methionine-labeled or unlabeled apopain protein Apopain-specific affinity beads or apopain-specific Use antibodies. The labeled apopin protein is analyzed by SDS-PAGE. You. Unlabeled Apopain protein can be transferred to Wester using Apopain-specific antibodies Detection by immunoblotting, ELISA or RIA. After expression of apopain in recombinant host cells, the Upon recovery, the active form of Apopain can be obtained. Some apopain purification Methods can be utilized and are suitable for use. Recombinant apopain is available from known sources in the art. Application of different fractions or chromatography in various combinations or individually It can be more purified from cell lysates or conditioned media. In addition, recombinant apopain can be a full-length newborn apopain or an apopain polypeptide. Using monoclonal or polyclonal antibodies specific for peptide fragments Separated from other cellular proteins using the prepared immunoaffinity column Can be Recombinant proteins can be used to make antibodies. As used herein, the term "antibody" includes polyclonal and monoclonal antibodies, as well as And fragments thereof, such as Fv fragments, Fab fragments and And F (ab) 2 fragments. Monospecific antibodies to Apopain include antibodies reactive to Apopain. Purified from mammalian antisera having It is produced as a monoclonal antibody reactive with the protein. Monospecific herein Antibody is a single antibody species or multiple antibodies with homogeneous binding Antibody type. As used herein, a homogeneous bond is defined as Refers to the ability of an antibody species to bind to a particular antigen or epitope as it binds. Yeast Element-specific antibodies include animals such as mice, rats, guinea pigs, rabbits, goats, horses, etc. Etc. (preferably rabbits) and an appropriate concentration of apopaine as appropriate immunoadjuvant It is created by immunization using with. Monoclonal antibodies (mAbs) reactive with apopain are Can be prepared by a conventional method, such as immunization of the cells with Apopain. Ma For mice, an acceptable adjuvant (complete Freund's adjuvant is preferred) New) About 0.1 to about 10 m of apopain in about 0.5 ml of buffer or saline added to an equal volume g, preferably about 1 mg. First immunization of mice on day 0 Perform the crop and rest for about 3 to about 30 weeks. Immunized mice receive phosphate buffer ( Booster immunization with about 0.1 to about 10 mg of Apopain in a buffer such as PBS) Epidemics are given one or more times by the intravenous (IV) route. Antibody positive mouse Spleen from immunized mice by standard methods known in the art. Get out more. Hybridoma cells are used to transfer spleen lymphocytes to the appropriate fusion It is produced by mixing under conditions capable of forming a stable hybridoma with the yeast. Fusion c The hybridoma cells may be prepared using methods known in the art for hypoxanthine, thymidine and Grown in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with aminopterin By choosing Supernatant fluid was added on days 14, 18, and 21 to Solid-phase immunoradioassay (SPI) Screen for antibody production by immunoassay such as RA). Culture The nutrient solution was tested in the Ouchterlony sedimentation assay to determine the mAb isotype. . Hybridoma cells from antibody positive wells were Edited by Paterson, published by Academic Press (1973), Tis Sue Culture Methods and Applications MacPherson in Soft Agar Technologies Clone by a method such as the heavenly method. In vitro production of anti-apopane was performed in DMEM containing approximately 2% fetal calf serum. By growing the hybridomas to obtain sufficient specific mAbs. Can be This mAb is purified by methods known in the art. Antibody titers from ascites fluid or hybridoma cultures were tested for serologic or immunological Assays include, but are not limited to, sedimentation, Collection reaction, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and radioimmunoassay (RIA) ) Law. Similar assays are performed in body fluids or tissues, and in apoptosis in cell culture. Used to detect the presence of a pane. Methods such as those described above can be used to produce monospecific antibodies, or Specific for apopain polypeptide fragments or full-length nascent apopain polypeptides Can be used to produce suitable antibodies. Apopain antibody affinity columns use an agarose skeleton beads support With N-hydroxysuccinimide ester to form a covalent bond with Antibody is added to a Kel support, for example, Affigel-10 (Biorad) It is prepared by Next, the antibody was conjugated to an amide having a spacer arm. After binding to the gel via coalescence, the remaining activated ester is replaced with ethanolamine HC Quench with 1 (pH 8). The column was washed with water, 0.23 M glycine HCl (PH 2.6) to remove unbound antibodies or extraneous proteins You. The column was then equilibrated with phosphate buffered saline (pH 7.3) and Remove cell culture supernatant or cell extract containing popain or apopain fractions. Flow away. Thereafter, the column is washed and the protein is eluted. Then purification Dialyze Apopain protein against phosphate buffered saline. ApoPain cDNA, antibodies to ApoPain or ApoPain protein Kits containing the same can be made. The kit contains For detecting hybridizing DNA or in a sample of apopaintin Used to detect the presence of protein or peptide fragments. The above features Signs are useful for a variety of purposes, including but not limited to legal analysis or epidemiology. Research included. The DNA molecules, RNA molecules, recombinant proteins and antibodies of the present invention Screening DNA, Apopain RNA or Apopain protein levels And can be used to measure. Recombinant protein, DNA molecule, RNA content The offspring and antibodies make up an appropriate kit for detecting and typing apopain. Useful for The kit contains at least one container closed. Includes a compartmentalized carrier suitable for carrying. Further, the carrier is Apopain. Recombinant apopain protein or anti-apopain antibody suitable for detecting The carrier containing the reagents such as Steps may be included. A nucleotide sequence complementary to the cDNA sequence encoding It can be synthesized for sense therapy. The antisense molecule described above is DN A, A stable derivative of DNA (eg, phosphorothioate or methylphosphonate) G), RNA, stable derivatives of RNA (eg, 2'-O-alkyl RNA), Or other Apopain antisense oligonucleotide mimics Can be Apopain antisense molecules are microinjected, liposome capsules Or introduced into cells by expression from a vector having an antisense sequence. obtain. Apopain antisense treatment is effective for reducing apopain activity Especially useful for the treatment of qi. Apopaine gene therapy is used to introduce apopain into cells of the target organ Can be done. The apopain gene is transformed into apopain DNA by infection of the recipient host cell. Can be ligated to a viral vector that mediates the transfer of E. coli. Suitable virus vector Are retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, hepatitis viruses, Xinia virus, poliovirus and the like. Alternatively, Apopain DNA Using a ligand-DNA conjugate or an adenovirus-ligand-DNA conjugate Receptor-mediated target DNA transfer, lipofection membrane fusion or direct microinjection Can be introduced into cells for gene therapy by non-viral methods including this These methods and variants thereof are suitable for in vivo and in vitro apophine gene therapy . Apopaine gene therapy is a treatment for diseases in which increasing apopain activity is effective. May be particularly useful for Pharmaceutically useful compositions comprising apopain DNA or apopain protein are Mixed with a pharmaceutically acceptable carrier as described herein or It can be prepared according to known methods such as combining. Examples of the carrier and the preparation method, To Remington's Pharmaceutical Sciences Has been described. Pharmaceutically acceptable compositions suitable for effective administration To make, the composition comprises an effective amount of protein or DNA. The therapeutic or diagnostic composition of the present invention is used for treating or diagnosing an apopain-related disease. Administered to the individual in an amount sufficient to The effective amount depends on the condition, weight, sex and age of the individual. May vary depending on various factors. Other factors include the mode of administration. Pharmaceutical compositions can be administered to an individual by various routes, such as subcutaneous, topical, oral and intramuscular. Can be given. The presence of large amounts of overlap in the various codons encoding a particular amino acid It is known. Thus, the present invention provides another alternative that encodes an accidental translation of the same amino acid. It also relates to DNA sequences containing codons. As used herein, one or more substituted codons Are defined as degenerate variants. Also, the final product of the expressed protein Mutations in the DNA sequence or translated protein that do not substantially alter sex Included in the present invention. For example, leucine to valine, lysine to arginine, or Or substitution of glutamine for asparagine causes a change in polypeptide functionality It is not possible. The DNA sequence encoding the peptide differs from the nature of the naturally occurring peptide. It is known that it can be modified to encode a peptide having certain properties. D Methods for altering NA sequences include, but are not limited to, site-directed mutagenesis. Examples of altered properties include, but are not limited to, altering the affinity of an enzyme for a substrate. Includes As used herein, a “functional derivative” of Apopaine is a biological derivative of Apopain. A compound having a biological activity (functional or structural) substantially similar to the activity You. The term "functional derivative" refers to the "fragment", "variant", "degenerate variant" "," Analog "," homolog "or" chemical derivative ". for The term "fragment" refers to a subset of the polypeptides of Apopain. The term "variant" Substantially similar to all apopain molecules or fragments thereof in structure and function Refers to a molecule. Both Molecules have substantially similar structures or both molecules have similar biological activities If so, the molecule is "substantially similar" to Apopain. Therefore, two molecules If they have substantially similar activities, the structure of one molecule will If not found, and even if the two amino acid sequences are not identical, both molecules are variants Considered to be. The term “analog” is substantially identical to the entire apopain molecule or a fragment thereof in function. Refers to molecules that are similar. The term “chemical derivative” additionally includes a chemical moiety that is not normally part of the base molecule. Refers to molecules that contain. The part improves the solubility, half-life, absorption, etc. of the base molecule. Can be In addition, the moieties may reduce unwanted side effects of the base molecule, The toxicity of the molecule can be reduced. Examples of such parts are found in various books, for example, Re. Described in mington's Pharmaceutical Sciences Have been. The present invention relates to the expression of DNA or RNA encoding To screen for compounds that modulate protein function in vivo Related. Compounds that regulate these activities include DNA, RNA, peptides, and proteins. Quality, non It can be a protein organic substance. The compound may be a DNA encoding apopain or Is to increase or decrease the expression of RNA or the function of apopain protein Can be adjusted by Expression or DNA expression of DNA or RNA encoding Compounds that modulate the function of the Popein protein can be detected in various assays. Previous The assay described above is a simple “yes” to determine if there is a change in expression or function. / No "assay. This assay is based on the expression or Quantitatively by comparing performance to the level of expression or function in a standard sample. Can be. Furthermore, the present invention relates to a compound of the formula I (L-761,191) or a pharmaceutically acceptable compound thereof. And salts that can be tolerated. Ac-DEVD-CHO I The pharmaceutical compositions of the present invention comprise a compound of Formula I as an active ingredient or a pharmaceutically acceptable compound thereof. Including pharmaceutically acceptable carriers and optionally other therapeutic ingredients. obtain. The term "pharmaceutically acceptable salt" refers to pharmaceutically acceptable salts, including inorganic and organic bases. Refers to salts produced from acceptable non-toxic bases. For salts derived from inorganic bases Are aluminum salts, ammonium salts, calcium salts, copper salts, ferrous salts, ferric Salt, lithium salt, magnesium salt, manganese salt, manganese salt, potassium Salts, sodium salts, zinc salts and the like. Particularly preferably, calcium salt, mug Nesium, potassium and sodium salts. Pharmaceutically acceptable Salts derived from organic non-toxic bases which may be used include primary, secondary and tertiary alcohols. Amines, substituted amines, including naturally occurring substituted amines, cyclic amines, and basic Ion exchange resins (eg, arginine, betaine, caffeine, choline, N, N '-Dibenzylethylenediamine, diethylamine, 2-diethylaminoethano , 2-dimethylaminoethanol, ethanolamine, ethylenediamine, N-ethyl-morpholine, N-ethylpiperidine, glucamine, glucosamine, Histidine, hydravamin, isopropylamine, lysine, methylglucamine, Morpholine, piperazine, piperidine, polyamine resin, procaine, purine, Theobromine, triethylamine, trimethylamine, tripropylamine, Lomethamine, etc.). When the compound of the present invention is basic, salts are pharmaceutically acceptable, including inorganic and organic acids. Produced from non-toxic acids that can be tolerated. The acid includes acetic acid, benzenesulfonic acid, Benzoic acid, camphorsulfonic acid, citric acid, ethanesulfonic acid, fumaric acid, Luconic acid, glutamic acid, hydrobromic acid, hydrochloric acid, isethionic acid, lactic acid, maleic acid , Malic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, mucus acid, Nitric acid, pamoic acid, pantothenic acid, phosphoric acid, succinic acid, sulfuric acid, tartaric acid, p-toluene Sulfonic acid and the like. Particularly preferred are citric acid, hydrobromic acid, hydrochloric acid and maleic acid. Inic, phosphoric, sulfuric and tartaric acids. When reference is made to a compound of formula I in the following description of methods of treatment, the compound may include It is to be understood that pharmaceutically acceptable salts are also included. Due to the ability of the compounds of formula I to inhibit the action of apopain, It is a useful research tool in the field of cis. The compound is useful in mammals, especially humans It is used for treating, preventing and ameliorating diseases. Not limited to the disease Typically, 1. 1. immunodeficiency syndrome (including AIDES); 2. Type I diabetes; Pathogenicity Infection, 4. 4. cardiovascular and nerve damage; 5. Alopecia, Aging, 7. Parkinson's disease, 8. Includes Alzheimer's disease.Dose range The therapeutic dose of a compound of Formula I will vary with the severity of the condition being treated, as well as the specificity of Formula VI. It depends on the compound and its route of administration, and also on the judgment of the clinician. Also, Therapeutic doses will also depend on the age, weight and response of each patient. Therefore, the active ingredient Effective dose of The clinician considers all criteria, decides to best benefit the patient, and Can be determined. A 0.001 to 1% by weight solution of a compound of Formula I in an acceptable ophthalmic formulation or An ophthalmic formulation consisting of a suspension can be used.Pharmaceutical composition Suitable administration for administering an effective amount of a compound of the present invention to a mammal, especially a human. Routes can be used. For example, oral, parenteral, and topical routes may be used. Administration Forms include tablets, troches, dispersions, suspensions, solutions, capsules, creams Agents, ointments, aerosols and the like. The pharmaceutical compositions of the present invention utilize a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Pharmaceutically acceptable carrier and optionally other therapeutic ingredients. obtain. The term "pharmaceutically acceptable salts" refers to inorganic acids or bases and organic acids. Or made from pharmaceutically acceptable non-toxic acids or bases, including bases. Salt. The compositions of the present invention include compositions suitable for oral, parenteral and ophthalmic administration. This These compositions are provided in unit dosage form, Conveniently, they are prepared by methods well known in the pharmaceutical arts. In practical use, the compounds of the formula I as active ingredients are prepared in a conventional pharmaceutical composition. It is mixed with a pharmaceutical carrier in the form of a homogeneous mixture according to the binding method. The carrier is It may take various forms depending on the form of the desired dosage formulation. Composition in oral dosage form To manufacture the product, the usual pharmaceutical media such as suspensions, elixirs and solutions In the case of oral liquid preparations such as water, alcohol, oils, fragrances, preservatives, coloring Preparations; starch, sugar in the case of oral solid preparations such as powders, capsules and tablets Carriers such as microcrystalline cellulose, diluents, granulating agents, lubricants, binders and disintegrants Can be used. Solid oral formulations are preferred over liquid formulations. Easy to administer Thus, powders and capsules are the most advantageous unit oral dosage in which pharmaceutical carriers are indispensable. It is a given form. If desired, coat tablets with standard aqueous or non-aqueous methods. May be applied. Pharmaceutical compositions suitable for oral administration of the present invention include capsules each containing a predetermined amount of the active ingredient. Powder or condyle as a discrete unit such as a cell, cachet or tablet As granules or aqueous liquid Solutions or suspensions in the body, non-aqueous liquids, oil-in-water emulsions or water-in-oil emulsions It can be provided as an agent. The composition can be manufactured by any dispensing method, Either method involves contacting the active ingredient with a carrier comprising one or more necessary ingredients. Including Generally, the compositions comprise an active ingredient in a liquid carrier and / or in a finely divided solid. Mix homogeneously and homogeneously with the carrier, then if necessary mold the product into the desired form Manufactured. For example, a tablet may be compressed or molded, optionally with one or more accessory ingredients. It can be manufactured. Compressed tablets are free in a suitable machine such as powder or granules Flowable active ingredients optionally with binders, lubricants, inert diluents, surface active It can be manufactured by mixing with an agent or dispersant and then compressing. Reinjected tablets are suitable Manufactured in a machine by molding a mixture of powdered compounds moistened with an inert liquid diluent. Can be Desirably, each tablet contains from about 1 mg to about 500 mg of the active ingredient, Chews or capsules contain from about 1 mg to about 500 mg of the active ingredient. The compounds of the present invention are conveniently prepared using methods known in the art.Proteolytic cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase is as follows. Can be measured. (A) ³⁵ Preparation of S-radiolabeled PARP CDNA encoding human poly (ADP-ribose) polymerase (clone pCD-12; GeneBank accession number M32721; NCBI gi 19 [0266] was excised from the cloning vector by digestion with Xho I restriction enzyme. Followed by Xho I-cleavage, CIP-treated pBluescript II SK + (Stratagene). Transform competent E. coli cells After colony purification and the resulting transformed cells are grown in liquid culture, The plasmid DNA was purified and the orientation of PARP cDNA was examined by restriction enzyme analysis. . Obtain clones oriented in the T7 and T3 directions and use the plasmid DNA. Using³⁵S] Methionine (New England Nuclear) In vitro using TnT reticulocyte lysate (Promega) in the presence By transcription / translation³⁵[S] PARP was synthesized. occured[³⁵S] PARP Polype The peptide was previously prepared with 10 mM Hepes / KOH (pH 7.4), 2 mM EDT. A, 0.1% CHAPS, Superdex-75 HR 10 equilibrated with 5 mM dithiothreitol By gel filtration chromatography using a 30/30 column (Pharmacia). Then, the components of the reticulocyte lysate were removed. (B)Measurement of PARP cleavage Incubation mixture (final volume 25 μl) contains 10 mM Hepes / K OH (pH 7.4), 2 mM EDTA, 0.1% CHAPS, 5 mM dithio Prepared in a buffer consisting of threitol and purified [³⁵S] PARP 5 μl, PA RP cleavage activity (e.g., from apoptotic osteosarcoma, THP-1 or other cells) Fraction, or purified or recombinant apopaine) 0-10 μl and drug (If indicated) or vehicle. Mixture at 37 ° C for 60 minutes After incubation for 5 hours, PAGE sample buffer containing SDS with 5 fold concentration was 6.5 μl. Stopped by addition of 1 and denatured at 95 ° C. for 5 minutes. 10% polyacrylic sample Separation on a ruamide gel and electroblotting of poly (vinylidene dif (Fluoride) film,³⁵S] Autoradiography of PARP cleavage products -Visualized. The PARP cleavage was performed on the 113.1 kDa PARP Degradation of the polypeptide into 24.1 kDa and 89.1 kDa fragments was examined. . PARP cleavage activity was determined by laser densitometry. Quantified by the volume-density of the 24.1 kDa fragment measured by the (C)Measurement of PARP cleavage by cleavage of fluorogenic substrates The PARP cleavage site Ac-DEVD-AMC (A MCN amino-4-methyl coumarin) The fluorogenic derivative of the peptide was converted to i) N-Ac-Asp (OBn) -Glu (OBn) -Val-CO_TwoH, ii) Asp (oBn) -7-amino-4-methylc Coupling with marine, iii) prepared by removal of benzyl group. 100 mM Hepes / KOH (pH 7.5), 10% (w / v) sucrose 0.1% (w / v) CHAPS, 10 mM Ac-DEVD-AMC and purified or crude PARP cleavage in thiothreitol A standard reaction mixture containing Apopain / CPP32 enzyme (final volume 300 μl) Incubated at 25 ° C. The reaction was performed using a spectrofluorometer at an excitation wavelength of 380 nm. , Continuously tracked at an emission wavelength of 460 nm.Crystal preparation and X-ray crystallography The term “structural coordinates” refers to the crystalline form of an apopein molecule for diffraction of an X-ray monochromatic beam Mathematical formula derived from the mathematical formula for the pattern obtained by the atoms (scattering centers) Refers to coordinates. Use diffraction data to calculate electron density maps of crystal repeat units did. Use molecular density maps to locate individual atoms within a unit cell of the crystal. Was. The term "heavy atom derivatization" produces a chemically modified form of the apopain form Point the way. Heavy metal atoms or salts that can diffuse into the crystal and bind to the protein surface Immerses crystals in a solution containing an organometallic compound. X-ray rotation of immersed crystal Investigate the position of the bound heavy metal atom by fold analysis. Use this information to Obtain the phase information used to construct the three-dimensional structure of the protein. As those skilled in the art will appreciate, the structural coordinates determined by X-ray crystallography have a standard error of do not have. The term "unit cell" refers to a basic parallelepiped block. Said By assembling the blocks regularly, the entire volume of the crystal can be built. The term "space group" refers to the arrangement of symmetric elements of a crystal. The term “molecular replacement” refers to the orientation and arrangement of molecules whose structural coordinates are known. To make a preliminary model of apopain crystal whose structure coordinates are not known better Refers to methods that include The phase is then calculated from this model and combined with the observed amplitude. To obtain an approximate Fourier composition of a structure whose coordinates are known. Using the ApoPain structural coordinates, it binds to the enzyme and modifies its physical properties in various ways. Further compounds can be designed. Also, using the enzyme's structural coordinates, Computer-based screening of small molecule data bases for compounds that bind to Can be Depending on the structural coordinates of the Apopain mutant, Can facilitate the identification of enzymes, and thus for the treatment and prevention of apopain-mediated conditions New therapeutic modes can be derived. The following examples illustrate the invention, but these examples It does not limit the invention. Example 1 Apopain production The method for producing apopain is based on the component p17 subunit expressed separately in E. coli. And folding of the active enzyme from the p12 and p12 subunits. Apopaine / C PP32p17 subunit (Ser¹⁴¹-Asp²⁹⁷) And p12 subunit (Ser³¹⁰-His⁴⁰²) Is converted to MetSer by PCR direct template modification.¹⁴¹ -Asp²⁹⁷Constructs and MetSer³¹⁰-His⁴⁰²Express as a construct Genetically engineered for The cDNA encoding the p17 subunit was converted to full-length C Sense (forward) synthesis using PP32β cDNA (3 ng / μl) as template Oligonucleotide 5'-GCT CTA GAC TCG AGT CAT GAG TGG AAT ATC CCT GGA CAA CAG TTA TAA AAT GG-3 '(SEQ ID NO: 5) and antisense (reverse) oligonucleotide Reotide 5'-GCT CTA GAC TCG AGT CAT GATT AG TCT GTC TCA ATG CCA CAG TCC AGT T CT G-3 '(sequence number No. 6) (Pwo polymerase (0.025 U / μl) Bohrin ger Mannheim; 94 ° C. × 1 minute, 60 ° C. × 1 minute, 72 ° C. × 45 seconds 25 cycles). Amplify cDNA encoding p12 subunit in the same manner I let it. However, the sense (forward) oligonucleotide is 5'-GCTCTAG AC TCG AGT CAT GAG TGG TGT TGA TGA T GA CAT GGC GTG TC-3 '(SEQ ID NO: 7) (Reverse) oligonucleotide is 5'-GCT CTA GAC TCG AGT CAT GAT TAG TGA TAA AAA TAG AGT TCT TTT GTG AGC-3 '(SEQ ID NO: 8). Purify the resulting pCR fragment And trimmed with Xba I, then pBluescript II SK (+) ( (Stratagene) at the Xba I site. After confirming the sequence, insert The incoming fragment was excised from the nested Bsp HI site and pET-11d (Nov agen) at the Nco I site. The properly oriented clones are then E. coli BL21 (DE3) pLysS cells were transformed. Optimal expansion for production culture Culture conditions were as follows: 1 mM IPTG was used for expression of the recombinant protein, and M9 medium was used. Was used at 37 ° C. with induction overnight. (Under these conditions, individual subunits Was expressed at about 50 mg / l. In each case, the protein is usually It localized exclusively in the inclusion body fraction, which contained more than 99% of the protein. 2.) E. coli was collected, washed and cut in the presence of protease inhibitors. Then seal The input was isolated and solubilized in 6M guanidine hydrochloride. Active recombinant Apopei The modified p17 and p12 subunits are mixed to produce And rapidly added to 100 mM HEPES / KOH (pH 7.5), 10% (w / v). ) Sucrose, 0.1% (w / v) CHAPS, 0.5 M NaCl, 10 mM Diluted in DTT to a concentration of 100 μg / ml. (Some pilot experiments It has been established that these are optimal folding conditions. ) Then the reaction The material was incubated at room temperature for 60 minutes. Under these conditions, the subunit tampering Some of the sediment settled. Ultracentrifuge at 100,000 xg for 60 minutes to remove precipitate I left. By this method, the folding efficiency is about 10% (moles of active enzyme / p17 (Moles of subunit × 100). This is active per liter of culture This corresponds to a total yield of about 5 mg of enzyme.Example 2 Apopain purification Subsequently, 1 ml of HiTrap Q column (Pharmacia) was added to the active enzyme. Improperly folded tan by anion exchange chromatography Separated from Parkin. Mass spectral analysis of the recombinant apopain complex Body is Ser¹⁴¹-Asp²⁹⁷Complete p17 chain and mainly MetSer³¹ ⁰ -His⁴⁰²Consists of a little Ser³¹⁰-His⁴⁰²And a P12 chain mixture containing Indicates that The resulting enzyme is resistant to inhibition by Ac-DEVD-CHO. Indistinguishable from natural enzymes in terms of kinetic parameters. Example 3 Apopain crystallization Apopain: Crystallization of Ac-DEVD-CHO complex by suspended vapor diffusion method did. Protein-inhibitor solution (10 mM Tris-HCl pH 8.5, 10 mM DTT, 3 mM NaN_Three8.7 mg / ml) in an equal volume Server buffer (7% PEG-6000 (w / w), 0.10 M sodium citrate PH 5.0, 10 mM DTT, 3 mM NaN_Three) And incubated at room temperature. The crystals are orthorhombic space group T222 (A = 69.81, b = 84.62, c = 96.79 °). Example 4 Structure elucidation and subdivision The three-dimensional diffraction data enlarged to a resolution of 2.5 mm is converted to a Siemens area detector. And room using CuKα radiation from a RU-200 rotating anode X-ray generator Collected warm. These data are stored in the SAINT software package³⁶Using I understood. 20,801 observations of 8,929 unique reflections with 5.55% R-factor And integrated. The structure is X-PLOR³⁷And inhibited ICE²⁸PDB with structure³⁸ Elucidated by molecular replacement using a model based on Entry 1 ICE. Present Existing models create interaction models³⁹And subdivision using X-PLOR³⁷By It was constructed. In the early stages of model creation, SQUASH⁴⁰The subdivision using Significantly improved the quality of the electron density map. The current model is 10% simulated Nguomit map⁴¹And residues 149-295 of p17 chain, binding inhibition Includes residues 317-402 of the p12 chain of the harmful agent and 25 ordered water molecules. p Residues 141-148 at the N-terminus of the 17 chain, 296-297 at the C-terminus of the p17 chain And 310-316 at the N-terminus of the p-12 chain may be due to current disorder, possibly due to disorder. It is not visualized in the child density map. The R-factor of the refined model is 26.2% ( R_free= 34.2%)⁴²And the stereochemistry is reasonable (the rms of the bond is Distribution = 0.006 °, angle = 1.3 °). Program the secondary structure STRIDE⁴³ Was assigned to Apopain and ICE. P₁Cys at carbon atom²⁸⁵Sγ Special care has been taken to establish the chirality of the optical center caused by nucleophilic attacks paid. After subdivision, equivalent for each possible configuration of this atom And create two models of the same size but opposite hands. At the same time. Then all atoms within 8.0% of this atom are The model was deleted and both truncated models were replaced with a 3000K mock Crushed. Then an electron density map of this part of the complex was obtained from both sets of phases. Calculated and examined to determine stereochemistry at that site. Apopaine: Ac -The coordinates and structural elements of the DEVD-CHO complex are described in Protein Data B ank³⁸Will be deposited with

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者ニコルソン，ドナルド・ダブリユカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス・カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者フアジル，キンバリー・エイカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス・カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者ガラン，ミツシエルカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス・カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者ガロ，イブカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス・カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者ラベル，マルクカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス・カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者ラスパー，デイータ・エムカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス・カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者ルール，リジアンカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス・カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者バイランコート，ジヨン・ピイカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス・カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者ベツカー，ジヨージフ・ダブリユアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065―0907、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ロトンダ，ジエニフアーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065―0907、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ソーンベリイ，ナンシー・エイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065―0907、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ピーターソン，エリン・ピーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065―0907、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) (81) Designated country EP (AT, BE, CH) , DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), CA, JP, US (72) Inventor Nicholson, Donald d'Abrieu Quebec, Canada・ Ashiyu 9 ・ Ashiyu 3 ・ El ・ 1, Kirkland, Trans Canada Highway 16711 (72) Inventor Huazil, Kimberly Ai, Quebec Ashiu ・ 9 ・ Ayuyu ・ 3 ・ El 1, Kirkland, Trans Canada Highway 16711 (72) Inventor Galant, Mitsiel Canada Quebec Ashyu 9 Ashyu 3 El 1, Kirkland, Trans Canada Highway 16711 (72) Inventor Gallo, Eve Canada, Quebec Ashyu 9 Ashyu 3 El 1 , Kirkland, Trans Canada Highway 16711 (72) Inventor Label, Marc Canada, Quebec Ashyu 9, Ashyu 3 El, Kirkland, Trans Canada Highway 16711 (72) Inventor Laspar, Data Em Canada Quebec Ashyu 9 Ashyu 3 El 1, Kirkland, Trans Canada Highway 16711 (72) Inventor Ruhr, Lizian Canada Quebec Ashyu, 9 Ashyu 3 El 1, Kirkland, Trans Canada Highway 16711 (72) Inventor Bailan Court, Jillon Piy Quebec, Canada・ Acy 9 ・ Acy 3 ・ 3 ・ 1, Kirkland, Trans Canada Highway 16711 (72) Inventor Betska, Jyozhoff-Doubled, United States, New Jersey 07065-0907, Lowway, East Lincoln Avenue 126 (72) Inventor Rotonda, Jennifer United States, New Jersey 07065-0907, Lowway, East Lincoln Avenille 126 (72) Inventor Thornbury, Nancy A United States of America, New Jersey 07065- 0907, Lowway, East Rinkan Avenue 126 (72) Inventor Peterson, Erin P. United States, New Jersey 07065-0907, Lowway, East Rinkan Avenue 126

Claims

[Claims] 1. An apopain crystal having an orthorhombic space group symmetry 1222. 2. It consists of a plurality of rectangular unit cells, each unit cell being 69.81 × 84.62 × 96. . The crystal of claim 1, having a dimension of 79 °. 3. A sudden change of the apopain of the structural coordinates of the crystal according to claim 1 or a part thereof. Elucidation of the crystal form of a variant, homolog or co-complex by difference Fourier or molecular replacement Use for. 4. An active ingredient of Apopaine according to the structural coordinates of the crystal or a part thereof according to claim 1. A chemical entity to bind to the site or auxiliary binding site Use to evaluate using. 5. A composition comprising the crystals of claim 1.