JP2000505293A - Diagnosis of trinucleotide repeat disease and genes involved in this disease - Google Patents

Diagnosis of trinucleotide repeat disease and genes involved in this disease

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JP2000505293A
JP2000505293A JP9529061A JP52906197A JP2000505293A JP 2000505293 A JP2000505293 A JP 2000505293A JP 9529061 A JP9529061 A JP 9529061A JP 52906197 A JP52906197 A JP 52906197A JP 2000505293 A JP2000505293 A JP 2000505293A
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cag
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カン，オワール・エム
コーエン，ダニエル
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フォンダシオン・ジャン・ドセ―セフ
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Abstract

(57)【要約】 表の配列ＡないしＩに対応するCAGまたはCTG反復コドンを高レベルで保有する転写DNA配列とそれらのアレレおよび相補的配列が開示されている。これらの配列は特にトリヌクレオチド反復病の診断に有用である。   (57) [Summary] Disclosed are transcribed DNA sequences carrying high levels of CAG or CTG repeat codons corresponding to sequences A to I in the table, and their alleles and complementary sequences. These sequences are particularly useful for diagnosing trinucleotide repeat disease.

Description

【発明の詳細な説明】 トリヌクレオチド反復病の診断とこの病気に関係する遺伝子 本発明は、反復するCAGまたはCTGトリプレット配列を持つヒト遺伝子の証明、 ならびにある種の遺伝性神経病の診断および場合により治療におけるこれらの遺 伝子の使用に関する。 高度に多形で不安定な反復CAGまたはCTGトリプレット配列の伸長は、少なくと も６つのヒト遺伝性神経病（「トリプレット反復病」と呼ばれる）、特に脊髄延 髄性筋萎縮症(SBMA)、筋強直性ジストロフィー(MD)、脳脊髄性運動失調(SCA)１ と３、デンタトルブロパリドルイシアン(dentato-rubro-pallydoluysian)萎縮症 (DRPLA)およびハンチントン病(HD)に関係する突然変異となる(1)。 これらの病気の各々でのCAG/CTGの伸長（動的突然変異<dynamic mutation>と も呼ばれる）は表現促進(anticipation)現象を伴い、反復のサイズは発症の年齢 および／または徴候の重篤度としばしば逆に相関する。 CAG/CTG反復の伸長は、転写物の非コーディング(MD)またはコーディング（例 えばSBMAおよびHD）領域に現れることができる。これらの転写物は脳以外の組織 中に発現される場合もあり、それらが翻訳されると、異常に伸長したポリグルタ ミンドメインを持つより大きな遺伝子産物になる(2〜4)。 患者のゲノムDNAにおけるCAG/CTG伸長および／または危険性をもつ家族におけ る表現性促進の証明は、SCA2，SCA4およびSCA5、常染色体優性大脳性運動失調（ ２型のADCA）ならびに家族性形態の双極性情動障害(BPAD)もしくは精神分裂病に 動的突然変異が関係することを示唆した。発症の年齢や症状の重篤度に変動性（ ばらつき）を示す自閉症および家族性痴呆も動的突然変異により引き起こされう る。 下記のようなかなり多くの病気がやはり動的突然変異を起点とするか、これを 含んでいるかもしれない： −パーキンソン病、 −痙性対麻痺、 −上に列挙しなかった脳脊髄性運動失調、 −層間白内障、 −制御不能な震え、 −家族性アミロイド神経障害（ニューロパシー）、 −家族性肉芽種性関節炎（ブラウ<Blau>病）、 −片側顔面小体症、 −ある種の貧血および緑内障、 −強迫障害。 以上は、トリプレット反復病のかなりの重要性とその診断および治療の重要性 を示している。 本発明は、CAG/CTG反復（以下では"[CAG]n"と表示する、ｎはこのトリプレッ トの反復数である）の系統的研究に基づくものである。この研究はヒトcDNAバン クを用いて実施し、まずこれを最初の一般的なスクリーニングにかけ、次にスク リーニングで残った配列を、含まれる配列が新規なヒト遺伝子に属する可能性が あり、トリプレット反復病に関係する可能性が高いことを確実にするある数の基 準に基づいて選択した。最後に、選択された配列が、それらの位置決定(localiz ation)を可能にするためのより完全な研究の主題となった。 本発明に関連して、ヒトの脳に由来する２群のcDNAを、高密度膜上でのオリゴ ヌクレオチドのハイブリダイゼーションを用いて、CAG反復の存在について試験 するために検討した。２つのライブラリーはオリゴ−dTプライマーを用いてmRNA から得たものであり、これらのライブラリーの一方は胎児の脳(FB)のcDNAクロー ンからなり、他方のライブラリーは新生児の脳(NIB)の基準化cDNAクローンから なる。 また、データベース中のヒトESTを分析して、脳以外のヒトの組織のcDNA中で 反復トリプレットの存在を検出した。 一般的に言って、本発明は、正常な集団中で多形によりなり易い、９より大の ある数の[CAG］配列を含んでいるcDNAの選択を可能にするハイブリダイゼーショ ン条件下で得られたトリプレット反復病に関係しがちなある配列の証明に基づい ている。 これらの異なる配列の完全な分析および選択条件については以下では詳述しな い。特に後述するPCRプライマーのために、これらの配列の位置決定と再分離を 可能にする要素だけが供給されよう。 より具体的には、本発明は下記の表の配列Ａ〜Ｉに対応するCAGまたはCTG反復 トリプレットに富む転写DNA配列、ならびにそれらの正常および変異アレレおよ び相補的配列に関する。 「正常アレレ」とは、正常な個体の検体から分離されたか、または分離するこ とができるようなアレレを意味するものであり、「変異アレレ」とは、異常に反 復する［CAG]n配列を持つ遺伝子のアレレである。 これらの配列のあるものは、全体的または部分的に公知であるが、含まれてい る配列が動的突然変異を持つことができる遺伝子の一部であると同定されたのは 初めてであり、この遺伝子もまたこれまでに発表されたことのないものであるこ とに注目するのは重要である。 こうして規定された配列、特にそのうちの７つは、ヘテロ接合性の割合（％、 HTZ率）が、トリプレット反復病に非常に直接的に関係するのに十分な著しい値 をとる。配列ＥおよびＩはヘテロ接合の割合が非常に低く（HTZ＝0.05）、この 病気に関係する可能性がより小さい。 もちろん、上に既に述べたように、これらの配列は下記の表で同定されていて 、必要なら、下記のプライマーを用いて再分離することもできよう：配列番号１ 〜18のプライマー１〜18は、２つづつの対で上記の配列Ａ〜Ｉに対応する。 こうして規定された配列は、まず第一に、診断関係、より正確には予後（病気 の経過予測）関係に使用できる。実際は、遺伝的裏付けのある非常に多くの病気 と同様に、多くの異常な[CAG]nトリプレット反復を持つ配列の存在の証明は、そ れだけでその病気の発症を確実にするものではなく、非常に早期の診断、あるい は場合により特定のサーベイランス、（特に危険性のある家族における）、を可 能にするために他の情報との組の１機能として理解しなければならない。 この診断は、患者の本発明に従ったDNA配列を正常な配列と比較して、余分な トリヌクレオチド反復を検出することにより行うことができる。 より具体的には、本発明は、患者のトリヌクレオチド反復病の発症の危険性を 証明する方法であって、この患者の請求の範囲第１項に記載のDNA配列を正常な 配列と比較して、余分なトリヌクレオチド反復を検出することを特徴とする方法 に関する。 もちろん、正常配列に対して過剰のトリプレットを証明することができる多く の方法が存在し、例えば、ゲルおよびRFLP法を用いて分子量の差を証明すること ができる。しかし、たとえ他の方法が使用できるとしても、最も効率的な方法は 、差を証明する前に、適当な方法、特に"PC"と呼ばれる方法により増幅操作を行 うことからなる。 ここでPCR法について詳細に説明する必要はないが、この方法は、「プライマ ー」と呼ばれる２つの配列の間の特定の配列をかなり増幅することができる。 本発明に係る操作に関係して使用できるプライマーとしては、配列番号１ない し18のプライマーを挙げなければならない。これらは、２つずつで、本発明の主 題となる配列のそれぞれに対するプライマー対を構成する。 上述したプライマーを用いて本発明に係る配列を増幅し、これを正常な検体お よび／または標準検体と比較することにより、過剰なトリプレットの存在、従っ てこの種の動的突然変異に関係する病気の発症の可能性を証明することが可能と なる。 これらの動的突然変異疾患は、トリプレット反復数が多いほどますますより重 篤になり、またより早期に発症することが知られていることも興味深い。このよ うな状況では、本発明の診断方法により、その病気の発症に関する良好な予後（ 経過予測）が可能となるだけでなく、この病気の発症時期および／または起こり うる重篤度の事前評価も可能となる。 本発明はまた、これらの配列を少なくとも部分的に持っている遺伝子およびそ れらのアレレにも関する。この遺伝子はもちろんトリプレット反復病の発症に直 接関係する。 対応する遺伝子は、対応するタンパク質を産生するために既知の手段によって 細胞内で発現させることができよう。 このタンパク質も、例えば、ある種の診断キットへの使用を図ることも可能で ある。 一般に、これらのタンパク質も病気に関係し、それらの発現を遺伝子もしくは 調節要素のレベルで適当な方法によりブロックするか、または、例えばおとりの 役割を果たす受容体タンパク質を用いて、それらを固定もしくは不活性化するこ とにより、その量を低減させることが望まれよう。これらの受容体または不活性 化タンパク質もまた、対応するDNA配列の発現によりその場で生成させることが できよう。 これらのタンパク質のブロッキングを所望に応じて図るために、該タンパク質 に対応するモノクローナル抗体の製造を予想することもまた可能である。これら の操作の全体を、例えば、遺伝子治療法の使用、特に該遺伝子の発現配列を有す るベクターの使用により、in vivoで直接行うこともできる。 異常に伸びたポリグルタミンドメインを持つタンパク質が、他のタンパク質と の凝集性と同じような互い同士の異常な凝集性を持つことが証明された(7,8)。 こうして生成した凝集体が恐らくトリプレット反復病の発生に関与していよう。 これが、上述したように分子をブロッキングするか、または他のタンパク質との 連結を防ぐために分子に固定することにより、治療剤が凝集の防止に適している 治療法を予想することもまた可能であるという理由である。 この治療に関係して、これらのタンパク質の完全または欠失した変異型（これ は[CAG]nドメインに関して正常でも異常でもよい）の使用を見越すことも可能で ある。 本発明に係る配列は、表に示した情報とそこに列挙した参考文献の情報の結果 として、添付の配列表に記載したプライマー配列を用いて得ることができる。 使用したライブラリーは次の２つである： − 第１のライブラリー(5)は、ヒト胎児脳の60,000の非標準化cDNA（FBクロー ン）を含み（ハンス・レーラッハ博士の研究室、マックスプランク分子遺伝学研 究所、ベルリン、ドイツ）、p-SP0RT-1ベクター（ライフ・テクノロジーズ・イ ンコーポレイテッド、ゲイザーズバーグ、メリーランド、米国）中にサブクロー ニングされている。 − 第２のライブラリーは、新生児の脳の40,128の標準化cDNA（NIBクローン） を含み、lafmidベクター(6)中にサブクローニングされている。これは、IM AGE協会(consortium)（ローレンス・リバモア研究所、リバモア、カリフォルニ ア）およびESTメルクWUプログラム（ワシントン大学、セントルイス、ミズーリ 、米国）の資産の一部である。 一方、いくらかの量の他の情報は、遺伝子バンク・データベース(NCBI、ベセ スダ、メリーランド、米国）を用いて集めた。 採用した選択および分析方法それ自体は、本発明の一部を構成しない。本発明 は、こうして得られた配列とその使用、特に診断方法または治療方法での使用に 本質的に関係するものであるからである。 この分析において、完全な多形[CAG]n配列だけでなく、複合[CAG]n配列、即ち 、トリプレットの挿入によって中断された配列も保持されていた。実際、この挿 入トリプレットの存在は、SBMA、MDおよびHDの場合には見られないが、特にSCA1 の場合に見られる。 本発明の研究は、[CAG]n配列が９コピーより多い（ｎ＞９）CAGを含んでいる 場合に[CAG]n多形性が現れることを示した。これは、実施した選択において、緊 縮性状態がかなり高く、これがｎが９より大という大きな数の[CAG]n配列をすぐ に選択することを可能にしたためである。また、本発明に従って試験することが できたｎが10より小さい[CAG]n配列は、ゼロの多形性を示した。 一方、[CAG]n配列の長さと多形性の程度との間の直接的な相関関係は見つける ことができない。 さらに、NIBライブラリーから選択された新規クローンは、FB群から選択した ものと異なっている。これは、ヒトの脳が異なる発達段階で多数の別個の遺伝子 を発現することと一致する。 最後に、９より多い[CAG]n配列は、mRNAの3'領域を表すヒトcDNAにおいて稀で ある（1/2200〜1/3000）ことが本発明の検討から出てくる。 本発明の現状では、本発明の主題をなす配列は家族性神経症状と直接的に関係 していないが、異常CAG伸長の存在は、神経病、特に家族性要素がある場合の神 経病の発症の危険性と関係しうる。 3p14染色体上に位置し、ADCA IIに関係しうる2.116クローンを除いて、残りの 上に説明した高度に多形性の[CAG]n配列は、家族性神経病に対するどの既知の 遺伝子座とも対応しない。この2.116クローンは、ノーザンブロット分析によっ て骨格筋内で高度に発現し、脳内では弱く発現する2227塩基対の転写物に対応す ることが判明した。多形性CAG配列の反復は、mRNAの非翻訳3'領域のレベルに位 置する。2.116クローンに対応するmRNAは、遺伝子バンクの既知タンパク質と全 く相同性を持たない137アミノ酸の推定タンパク質(nt127から538)に対してコー ドする。 2.116クローンの転写物の完全な配列は配列番号19に示されている。 それでもなお、現在まだ位置決定がなされていない神経病がかなり多くあり、 本発明に係る配列と関係することが判明する可能性がある。 残った配列の適切さを研究するために考慮に入れた別の要素として、[CAG]n配 列がポリグルタミン伸長をコードするオープンリーディングフレーム(ORF)の存 在の可能性が挙げられる。 最後に、本発明の研究では、[CAG]n多形性の頻度が、mRNAの3'領域を表すヒト cDNAにおける稀な事象であることを示唆している。 参考文献 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Diagnosis of Trinucleotide Repeat Disease and Genes Associated With This Disease The present invention provides for the identification of human genes with repetitive CAG or CTG triplet sequences, and for the diagnosis and diagnosis of certain hereditary neuropathies. The use of these genes in therapy. Extension of highly polymorphic and unstable repetitive CAG or CTG triplet sequences is associated with at least six human hereditary neuropathies (referred to as "triplet repeat diseases"), particularly spinal medulla oblongata (SBMA), myotonia Mutations associated with dystrophy (MD), cerebrospinal ataxia (SCA) 1 and 3, dentato-rubro-pallydoluysian atrophy (DRPLA) and Huntington's disease (HD) ( 1). CAG / CTG elongation (also called dynamic mutation) in each of these diseases is associated with the phenomenon of anticipation, and the size of the repeats depends on the age of onset and / or the severity of the symptoms. Often they are inversely correlated. Extensions of CAG / CTG repeats can appear in non-coding (MD) or coding (eg, SBMA and HD) regions of the transcript. These transcripts may be expressed in tissues other than the brain, and when translated, result in larger gene products with abnormally elongated polyglutamine domains (2-4). Demonstration of CAG / CTG elongation in the patient's genomic DNA and / or enhanced expression in at-risk families includes SCA2, SCA4 and SCA5, autosomal dominant cerebral ataxia (type 2 ADCA), and a bipolar form of familial form This suggests that dynamic mutation is involved in sexual affective disorder (BPAD) or schizophrenia. Autism and familial dementia, which vary in age and severity of symptoms, can also be caused by dynamic mutations. Quite a number of diseases may also originate or contain dynamic mutations, such as:-Parkinson's disease,-spastic paraplegia,-cerebrospinal ataxia not listed above -Interlamellar cataract,-Uncontrolled tremor,-Familial amyloid neuropathy (neuropathy),-Familial granulomatous arthritis (Blau <Blau> disease),-Hemifacial body disease,-Certain anemia and glaucoma -Obsessive-compulsive disorder. The above illustrates the considerable importance of triplet recurrent disease and its diagnostic and therapeutic importance. The present invention is based on a systematic study of CAG / CTG repeats (hereafter denoted as [[CAG] n), where n is the number of repeats of this triplet). The study was performed using a human cDNA bank, which was first subjected to the first general screening, and then the remaining sequences were screened for possible triplet disease, with the potential for inclusion of a novel human gene. Was selected based on a number of criteria that ensure that it is likely to be relevant to Finally, the selected sequences have been the subject of a more complete study to enable their localization. In the context of the present invention, two groups of cDNAs from human brain were examined to test for the presence of CAG repeats using oligonucleotide hybridization on a dense membrane. Two libraries were obtained from mRNA using oligo-dT primers, one of these libraries consisting of fetal brain (FB) cDNA clones and the other library of neonatal brain (NIB) Consists of normalized cDNA clones. In addition, human ESTs in the database were analyzed to detect the presence of repetitive triplets in cDNA of human tissues other than brain. Generally speaking, the present invention has been obtained under hybridization conditions which allow for the selection of cDNAs containing a number of [CAG] sequences greater than 9 which are susceptible to polymorphism in the normal population. Based on a sequence that is likely to be associated with triplet repeat disease. The complete analysis and selection conditions for these different sequences are not detailed below. Only elements that allow the localization and re-separation of these sequences will be provided, especially for the PCR primers described below. More specifically, the present invention relates to transcribed DNA sequences rich in CAG or CTG repeat triplets corresponding to sequences AI in the table below, as well as their normal and mutant alleles and complementary sequences. "Normal allele" refers to an allele that has been isolated or can be separated from a normal individual specimen, and "mutant allele" refers to an abnormally repeated [CAG] n sequence. It is the allele of the gene that has. Some of these sequences are known in whole or in part, but it is the first time that the contained sequences have been identified as being part of a gene that can have dynamic mutations, It is important to note that this gene has never been published before. The sequences thus defined, especially seven of them, have a heterozygosity percentage (%, HTZ rate) that is significant enough to be very directly related to triplet repeat disease. Sequences E and I have a very low percentage of heterozygotes (HTZ = 0.05) and are less likely to be associated with this disease. Of course, as already mentioned above, these sequences are identified in the table below and, if necessary, could be re-isolated using the following primers: primers 1-18 of SEQ ID NOs: 1-18 Correspond to sequences AI above in pairs. The sequences defined in this way can be used, first of all, in diagnostic relationships, more precisely in prognostic (prediction of disease course) relationships. In fact, as with so many diseases with genetic backing, evidence of the existence of many unusual [CAG] n triplet repeats does not, by itself, assure the onset of the disease. It must be understood as a function of a set with other information to enable early diagnosis, or possibly specific surveillance, especially in at-risk families. This diagnosis can be made by comparing the patient's DNA sequence according to the invention with the normal sequence and detecting extra trinucleotide repeats. More specifically, the present invention is a method of demonstrating the risk of developing a trinucleotide recurrent disease in a patient, comprising comparing the DNA sequence of claim 1 of the patient with a normal sequence. And detecting extra trinucleotide repeats. Of course, there are many ways by which excess triplets can be demonstrated relative to the normal sequence, for example, gel and RFLP methods can be used to demonstrate differences in molecular weight. However, even if other methods can be used, the most efficient one consists of performing the amplification operation by a suitable method, especially one called "PC", before proving the difference. It is not necessary to elaborate on the PCR method here, but it can amplify a certain sequence between two sequences called "primers" considerably. Primers that can be used in connection with the procedure according to the present invention must include the primers of SEQ ID NOS: 1-18. These together make up a primer pair for each of the sequences which are the subject of the present invention. By amplifying the sequence according to the invention using the above-mentioned primers and comparing it with normal and / or standard samples, the presence of an excess of triplets, and thus the disease associated with this kind of dynamic mutation, It is possible to prove the possibility of onset. It is also interesting that these dynamic mutations are known to become more and more severe as the number of triplet repeats is increased and to develop earlier. In such situations, the diagnostic method of the present invention not only allows for a good prognosis (prognosis prediction) for the onset of the disease, but also provides a pre-evaluation of the onset time and / or possible severity of the disease. It becomes possible. The invention also relates to genes having these sequences at least in part and to their alleles. This gene is, of course, directly involved in the development of triplet disease. The corresponding gene could be expressed in the cell by known means to produce the corresponding protein. This protein can also be used, for example, in certain diagnostic kits. In general, these proteins are also involved in the disease and their expression can be blocked in a suitable manner at the level of the gene or of the regulatory element, or they can be fixed or immobilized, for example by means of a receptor protein acting as a decoy. It would be desirable to reduce the amount by activation. These receptors or inactivating proteins could also be generated in situ by expression of the corresponding DNA sequence. In order to achieve blocking of these proteins as desired, it is also possible to anticipate the production of monoclonal antibodies corresponding to the proteins. The whole of these operations can also be performed directly in vivo, for example, by using gene therapy, in particular by using a vector having an expression sequence of the gene. Proteins with unusually extended polyglutamine domains have been shown to have abnormal aggregating properties with each other, similar to that of other proteins (7,8). The aggregates thus formed are probably involved in the development of the triplet disease. This could also envisage therapeutics in which the therapeutic agent is suitable for preventing aggregation, by blocking the molecule as described above or immobilizing it on the molecule to prevent ligation with other proteins. That is the reason. In connection with this treatment, it is also possible to foresee the use of complete or deleted variants of these proteins, which may be normal or abnormal with respect to the [CAG] n domain. The sequences according to the invention can be obtained using the primer sequences described in the attached sequence listing as a result of the information shown in the table and the information of the references listed therein. Two libraries were used:-The first library (5) contains 60,000 non-standardized cDNAs (FB clones) of human fetal brain (Dr. Hans Loerlach's lab, Max Planck Molecule It has been subcloned into the p-SP0RT-1 vector (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland, USA), Institute for Genetics, Berlin, Germany. The second library contains 40,128 standardized cDNAs of the neonatal brain (NIB clone) and has been subcloned into the lafmid vector (6). It is part of the assets of the IMAGE consortium (Lawrence Livermore Laboratory, Livermore, CA) and the EST Merck WU program (Washington University, St. Louis, MO, USA). On the other hand, some amount of other information was gathered using the Genebank database (NCBI, Bethesda, Maryland, USA). The selection and analysis methods employed per se do not form part of the present invention. The present invention relates essentially to the sequences thus obtained and their use, especially in diagnostic or therapeutic methods. In this analysis, not only the complete polymorphic [CAG] n sequence, but also the complex [CAG] n sequence, ie, the sequence interrupted by triplet insertion, was retained. In fact, the presence of this inserted triplet is not seen in SBMA, MD and HD, but especially in SCA1. Studies of the present invention have shown that [CAG] n polymorphisms appear when the [CAG] n sequence contains more than 9 copies of CAG (n> 9). This is because in the selections made, the stringency state was quite high, which made it possible to quickly select a large number of [CAG] n sequences with n> 9. Also, [CAG] n sequences where n was less than 10 that could be tested in accordance with the present invention exhibited zero polymorphism. On the other hand, no direct correlation between the length of the [CAG] n sequence and the degree of polymorphism can be found. Furthermore, the new clones selected from the NIB library are different from those selected from the FB group. This is consistent with the human brain expressing many distinct genes at different stages of development. Finally, it emerges from a study of the present invention that more than 9 [CAG] n sequences are rare (1 / 2200-1 / 3000) in human cDNAs representing the 3 'region of mRNA. In the present context of the present invention, the sequences that are the subject of the present invention are not directly related to familial neurological symptoms, but the presence of abnormal CAG elongation is associated with the onset of neuropathies, especially in the presence of familial factors. Risk. Except for the 2.116 clone, which is located on chromosome 3p14 and may be involved in ADCA II, the remaining highly polymorphic [CAG] n sequence described above corresponds to any known locus for familial neuropathy do not do. This 2.116 clone was shown by Northern blot analysis to correspond to a 2227 base pair transcript that was highly expressed in skeletal muscle and weakly expressed in brain. Repeats of the polymorphic CAG sequence are located at the level of the untranslated 3 'region of the mRNA. The mRNA corresponding to the 2.116 clone encodes for a putative protein of 137 amino acids (nt127 to 538) that has no homology to known proteins in the gene bank. The complete sequence of the transcript of the 2.116 clone is shown in SEQ ID NO: 19. Nevertheless, there are quite a number of neuropathies that have not yet been localized and may prove to be relevant for the sequences according to the invention. Another factor that was taken into account to study the suitability of the remaining sequence was the possible presence of an open reading frame (ORF) in which the [CAG] n sequence encodes a polyglutamine extension. Finally, studies of the present invention suggest that the frequency of [CAG] n polymorphism is a rare event in human cDNA that represents the 3 'region of mRNA. References

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９８年４月６日（１９９８．４．６） 【補正内容】 請求の範囲 １）前掲の表に記載の配列ＡないしＩに対応するCAGまたはCTG反復トリプレット に富む転写DNA配列ならびにそれらの正常および変異アレレおよび相補的配列。 ２）請求の範囲第１項に記載の配列の全部または一部を含むことを特徴とする、 ヒト遺伝子およびそのアレレ。 ３）患者のトリヌクレオチド反復病の発症の危険性を証明する方法であって、そ の患者の請求の範囲第１項に記載のDNA配列を正常な配列と比較して余分なトリ ヌクレオチド反復の存在を検出することを特徴とする方法。 ４）請求の範囲第１項記載の配列の全部または一部の増幅を行い、その増幅産物 中で余分なトリヌクレオチド反復の存在を証明することを特徴とする、請求の範 囲第３項記載の方法。 ５）配列の増幅を、それぞれ配列ＡないしＩに対応する配列表に記載の配列番号 １ないし18のプライマーを用いて行うことを特徴とする、請求の範囲第４項記載 の方法。 ６）請求の範囲第２項記載の遺伝子の全部または一部を発現する形質転換細胞。 ７）請求の範囲第６項記載の形質転換細胞から得られたタンパク質。 ８）請求の範囲第７項記載のタンパク質と相互作用するタンパク質。 ９）請求の範囲第７項または第８項のいずれかに記載のタンパク質に対応するモ ノクローナル抗体。 10）請求の範囲第７項または第８項のいずれかに記載のタンパク質を発現するベ クター。 11）請求の範囲第７項もしくは第８項のいずれかに記載のタンパク質、請求の範 囲第９項記載の抗体、または請求の範囲第10項記載のベクターを用いた薬剤の製 造。[Procedural Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Date of Submission] April 6, 1998 (1998.4.6) [Contents of Amendment] Claims 1) Sequences A to C described in the above table Transcript DNA sequences rich in CAG or CTG repeat triplets corresponding to I and their normal and mutant alleles and complementary sequences. 2) A human gene and an allele thereof, comprising all or a part of the sequence according to claim 1. 3) A method for proving the risk of developing a trinucleotide repeat disease in a patient, wherein the DNA sequence according to claim 1 of the patient is compared with a normal sequence to determine the presence of extra trinucleotide repeats. A method characterized by detecting 4) The method according to claim 3, wherein all or a part of the sequence according to claim 1 is amplified, and the presence of an extra trinucleotide repeat in the amplification product is proved. Method. 5) The method according to claim 4, wherein the amplification of the sequence is performed using primers of SEQ ID Nos. 1 to 18 described in the sequence listing corresponding to the sequences A to I, respectively. 6) A transformed cell that expresses all or a part of the gene according to claim 2. 7) A protein obtained from the transformed cell according to claim 6. 8) A protein that interacts with the protein according to claim 7. 9) A monoclonal antibody corresponding to the protein according to any one of claims 7 and 8. 10) A vector that expresses the protein according to any one of claims 7 and 8. 11) Production of a drug using the protein according to any one of claims 7 or 8, the antibody according to claim 9, or the vector according to claim 10.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 27/06 Ａ６１Ｋ 31/00 ６２７Ｃ Ａ６１Ｋ 38/00 39/395 Ｄ 39/395 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 27/06 A61K 31/00 627C A61K 38/00 39/395 D 39/395 48/00 48/00 C07K 14/47 C07K 14/47 16/18 16/18 C12P 21/08 C12P 21/08 C12Q 1/68 A C12Q 1/68 A61K 37/02

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １）前掲の表に記載の配列ＡないしＩに対応するCAGまたはCTG反復トリプレット に富む転写DNA配列ならびにそれらの正常および変異アレレおよび相補的配列。 ２）請求の範囲第１項に記載の配列を少なくとも部分的に保有することを特徴と する、ヒト遺伝子およびそのアレレ。 ３）患者のトリヌクレオチド反復病の発症の危険性を証明する方法であって、そ の患者の請求の範囲第１項に記載のDNA配列を正常な配列と比較して余分なトリ ヌクレオチド反復の存在を検出することを特徴とする方法。 ４）請求の範囲第１項記載の配列の全部または一部の増幅を行い、その増幅産物 中で余分なトリヌクレオチド反復の存在を証明することを特徴とする、請求の範 囲第３項記載の方法。 ５）配列の増幅を、それぞれ配列ＡないしＩに対応する配列表に記載の配列番号 １ないし18のプライマーを用いて行う、請求の範囲第４項記載の方法。 ６）請求の範囲第２項記載の遺伝子の全部または一部を発現する形質転換細胞。 ７）請求の範囲第６項記載の形質転換細胞から得られたタンパク質。 ８）請求の範囲第７項記載のタンパク質と相互作用するタンパク質。 ９）請求の範囲第７項または第８項のいずれかに記載のタンパク質に対応するモ ノクローナル抗体。 10）請求の範囲第７項または第８項のいずれかに記載のタンパク質を発現するベ クター。 11）請求の範囲第７項または第８項のいずれかに記載のタンパク質、請求の範囲 第９項記載の抗体、または請求の範囲第10項記載のベクターの治療への使用。[Claims] 1) CAG or CTG repeat triplets corresponding to sequences A to I listed in the table above -Rich transcribed DNA sequences and their normal and mutant alleles and complementary sequences. 2) characterized by having at least a part of the sequence according to claim 1. The human gene and its allele. 3) A method of demonstrating the risk of developing trinucleotide repeat disease in a patient, Comparing the DNA sequence according to claim 1 to a normal sequence for extra birds A method comprising detecting the presence of a nucleotide repeat. 4) Amplifying all or a part of the sequence according to claim 1 and the amplified product Claims characterized by proving the presence of extra trinucleotide repeats in the 4. The method according to paragraph 3. 5) Amplification of the sequence was performed according to the sequence numbers in the sequence listing corresponding to sequences A to I, The method according to claim 4, wherein the method is carried out using 1 to 18 primers. 6) A transformed cell that expresses all or a part of the gene according to claim 2. 7) A protein obtained from the transformed cell according to claim 6. 8) A protein that interacts with the protein according to claim 7. 9) A model corresponding to the protein according to any one of claims 7 and 8. Noclonal antibodies. 10) A vector that expresses the protein according to claim 7 or 8. Doctor. 11) The protein according to any one of claims 7 and 8, Use of the antibody according to claim 9 or the vector according to claim 10 for therapy.
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