【発明の詳細な説明】
遺伝子治療における可撓性プラスチック容器の使用
本発明は、遺伝子治療における可撓性プラスチック容器、例えば血液バッグの
使用に関する。
血液バッグは、少なくとも一つの投入口または排出口を含む、可撓性の密閉型
プラスチック容器からなる。様々な大きさのものが、異なる会社、例えば、バク
スター社（Baxter）、バイオトランス社（Biotrans）、コーブ社（Cobe）、フレ
セニウス社（Fresenius）、およびマコファーム社（Macopharm）から販売されて
おり、様々な適用分野のため、全血または骨髄の吸引のため、白血球搬出のため
、病院および血液銀行で使用されている。血液細胞は、保存し、凍結し、バッグ
に処理することが可能であり、洗浄および遠心分離などのための特別な装置が利
用可能であることが知られている。
遺伝子治療の分野では、ベクターおよび細胞のような各製品を、簡便に、取り
扱いが安全で容易な形態で、大量に調製することができる方法が切望されている
。従来は、研究実験室用の反応容器および装置が遺伝子治療法に使用されてきた
が、臨床的な適用にとっては、その取り扱いに相当の問題がある。
国際公開公報第87/06119号は、血液中の病原体の伝染を防止するのに適した、
血液を収集するための系に関する。この系には、血液を収集するための血液バッ
グ、および病原体中和剤を調節可能に導入するための第二の容器が含まれる。遺
伝子治療における血液バッグの適用とは全く関係がない。
国際公開公報第92/19285号は、試料中の細菌およびウイルスを破壊するため、
血液バッグに含まれる血液試料を消毒するための方法に関する。消毒薬は、陰イ
オン性界面活性剤、少なくとも一つの非陰イオン性界面活性剤、安定剤、2種の
塩および2種のリン酸塩を含む。遺伝子治療における血液バッグの適用とは全く
関連がない。
EP-A-0 471 947は、気体透過性の血液バッグにおける細胞の培養を開示してい
る。ハイブリドーマ細胞の培養が開示されている。遺伝子治療における血液バッ
グの使用とは全く関連がない。
JP-3 007 575は、回転式のピボットを有するベース上の血液バッグを含む装置
において、癌患者から収集されたリンパ球を培養するための装置に関する。遺伝
子治療における適用とは全く関連がない。
国際公開公報第96/00782号は、細胞に対する結合マトリックスでコーティング
された血液バッグにおける、固定化された幹細胞の培養に関する。幹細胞は患者
から収集され、培養後に再び返還される。インビトロでの幹細胞の遺伝子操作も
、培養中に行うこともできる。しかし、国際公開公報第96/00782号に開示された
方法は、幹細胞に限定されており、他の細胞型に単純に適合させることは不可能
である。
従って、本発明の目的は、より簡便に、より安全に細胞およびその他の物質を
取り扱うことができる、遺伝子治療における新規な手段および方法を提供するこ
とであった。
本発明に係るこの目的は、遺伝子治療における体外処理工程を実施するための
、可撓性プラスチック容器の使用によって達成される。本願は、懸濁細胞、特に
T細胞を用いた遺伝子治療に焦点を当てる。懸濁液中で増殖する細胞を、可撓性
プラスチック容器において、刺激し、形質転換し、培養し、標識することができ
る。
可撓性プラスチック容器を用いて実施できる遺伝子治療における処理工程には
、例えば、ドナー由来の細胞に遺伝物質を導入するために使用されるベクターを
充填する工程、細胞を感染または形質転換するためベクターをドナー細胞と接触
させる工程、懸濁細胞、特にT細胞を刺激または／および培養する工程、ならび
に細胞分離装置の充填または／および溶出の工程が含まれる。適当な連結部材、
例えば連結チューブのための少なくとも一つの開口部を有する、本発明に係る可
撓性プラスチック容器を使用することにより、ドナー由来の細胞の体外処理を、
部分的に、または完全に、閉鎖された系で実施することができる。
一般的に10〜5000ml、特に10〜2000mlの容量を有する可撓性プラスチック容器
は、好ましくは、接合チューブのための少なくとも一つの開口部、例えばアタッ
チメントを有する閉鎖されたプラスチック・バッグである。好ましくは密閉可能
なプラスチック素材からなる、これらの連結チューブは、閉鎖された系が常に維
持されるよう、テルモ社（Terumo Company）の無菌密閉装置などの適当な装置を
用いて、バッグを連結したり分離したりすることができる。結果として、細胞、
ウイルスなどの生物学的な物質を、夾雑物の混入のリスクを極めて低くして、取
り扱うことが可能であるため、無菌実験台すら使用する必要がない。
本発明に係る方法の第一の態様は、形質転換ベクター、例えばコタニ（Kotani
）ら（Human Gene Therapy 5(1994),19-28）により開示されたレトロウイルス・
ベクター、および遺伝子治療研究において使用されているレトロウイルス・ベク
ター（Anderson,Science 256(1992),808-813）の充填に関する。修飾型のヒトLN
GFR（低親和性神経成長因子受容体）（Malvilio et al.,Blood 82(1993),198
8-1997）の遺伝情報を含むレトロウイルス・ベクターが特に好ましい。現在のと
ころ、これらのベクターは、スクリューキャップを有する硬直なプロピレン容器
へと充填されており、開封された製品は無菌実験台で分注される。対照的に、本
発明に従い血液バッグを使用する場合には、ベクターを含む液体、例えば細胞培
養上清を、適当に調製された無菌チューブ連結を介して、0.22μmまたは0.45μm
のフィルターを通して、例えば容量20〜50mlの小さいバッグに直接的に充填する
ことが可能である。充填後、形質転換ベクターは好ましくは凍結乾燥または／お
よび凍結される。バッグを密閉した後は、以前と同様に−80℃で保存することが
可能である。驚くべきことに、レトロウイルス・ベクターは、プラスチック・バ
ッグ内に凍結または凍結乾燥された状態で、極めて長期間にわたり、例えば1年
半を越えて保存可能であることが見出された。その後、ベクターを含むバッグは
、病院で、形質転換を受ける細胞を含む他のバッグと連結されうる。この方法に
おいては、全ての工程が閉鎖された系で実施され、回収および充填の際の夾雑物
混入のリスクがほぼ完全に回避される。
本発明に係る方法の第二の態様は、細胞の形質転換である。形質転換のために
は、血液バッグに含まれる懸濁ドナー細胞、好ましくはT細胞もしくはその亜集
団、または白血球搬出により得られた末梢血リンパ球、または腫瘍細胞のような
抗原提示細胞を、形質転換ベクターを含むバッグとカップリングし、両方の容量
をこのようにして混合する。次に、この混合された容量で形質転換が起こる。即
ち、細胞がベクターにより遺伝学的な変化を受ける。細胞の洗浄および遠心分離
のような次の工程は、商業的に入手可能な装置の補助により行ってもよいし、バ
ッ
グ系を使用することも好ましい。
T細胞を形質転換するために可撓性プラスチック容器を使用するとき、プラス
チック容器を遠心分離することにより形質転換速度を改良することができる。驚
くべきことに、バッグを、通常のように底が下向きのスイングアウト・ローター
（swing-out rotor）に設置するのではなく、遠心分離中、最大の利用可能な表
面のうちの一面に細胞が分散できるように配置すると、形質転換効率が顕著に増
大することが見出された。この目的のために、バッグを、例えば、2つの側面の
うちの1つに設置することができる。ロータ-内で、いくつかのバッグを互いの上
に積み重ねることも可能である。この場合、バッグを互いの上に直接載せてもよ
いし、平行なプレートからなる特別なホルダーの中に設置してもよい。
本発明に係る方法の第三の態様は、懸濁細胞の増幅、特にT細胞または抗原提
示細胞の増幅に関する。このT細胞の増幅は、刺激または／および形質転換の後
に行われ、従来技術において知られている血小板製造用の気体透過性バッグにお
いて実施することができる。培養は、CO2インキュベーター内で行い、選択的に
振とう装置を使用してもよい。細胞増幅においては、必要に応じて、新鮮な培地
が充填されたバッグをカップリングすることにより、培養を拡大することができ
る。細胞チャンバー内の細胞数計数のための試料を採取するため、または培地の
成分を分析するため、小さなバッグを培養バッグに連結した後、無菌的に一部を
取り出すことができる。所望の細胞数に達した後、細胞をバッグ内で遠心分離し
、少量を取り出し、移植用に調製することができる。
本発明の第四の好ましい態様は、細胞分離装置、例えば細胞分離カラム（de W
ynter et al.,Stem Cells 13(1995),524-532）の充填または／および溶出のため
の、可撓性プラスチック容器の使用である。分離において、系を充填するために
も、分離された細胞を吸引するためにも、血液バッグを使用することができる。
全工程の完全に閉鎖された系を作製するためには、細胞の調製、例えば洗浄、遠
心分離、抗体の添加なども、好ましくはバッグ内で行う。特に好ましい細胞分離
装置は、オーディトア・ハーグリーブス（Auditore-Hargreaves）ら（Bioconjug
ate Chem.5(1994),287-300）により開示されたアビジン−ビオチン免疫吸着カラ
ムである。
本発明の第五の好ましい態様は、移植片対白血病法（graft-versus-leukaemia
methods）、養子免疫、ワクチン細胞系の調製、またはキラーT細胞の刺激のた
めの、懸濁細胞、特にT細胞の培養または／および刺激である。この場合にも、
血液バッグを使用することにより、細胞の開放的な取り扱いが回避でき、従って
、夾雑物混入のリスクが回避できる。
移植片対白血病法（graft-versus-leukaemia method）における使用には、健
康なドナーから収集されたT細胞を個別に刺激する必要がない。細胞を標識する
ため、好ましくは上記のようなレトロウイルス・ベクターを用いて、形質転換を
行う。
養子免疫治療においては、T細胞を、例えば、患者から収集された腫瘍細胞に
より刺激する。腫瘍細胞の単離は、腫瘍の型に依存し、おそらく増幅も腫瘍の型
に依存する。刺激のため、腫瘍細胞をドナーのT細胞を含むバッグに直接的に添
加する。その後、ベクターによる形質転換、T細胞の増幅、および細胞分離のよ
うな工程を全て、バッグ内で、即ち閉鎖された系で行うことができる。
好適なワクチン細胞系は、遺伝学的に修飾された腫瘍細胞系、例えばRCC-26細
胞系の誘導体（Schendel et al.,J.Immunol.151(1993),4209-4220）である。例
えばヒト腎癌由来の、これらの細胞系は、腫瘍を有する患者、例えば腎腫瘍を有
する患者に、転移性腎腫瘍細胞に対する免疫反応のため投与することができる。
この場合、ワクチン細胞系をバッグ内で増幅した後、患者に直接的に投与するこ
とができる。
不活化ヒトB細胞で刺激されたT細胞は、腫瘍細胞を攻撃することもできる。こ
の場合、不活化細胞を小さな血液バッグに充填し、患者のT細胞を含む血液バッ
グと直接的に連結させる。その後のさらなるT細胞の増幅は、上記のようにして
進行させる。刺激用細胞を、培養および不活化の後、クリオチューブ（cryotube
）内で凍結させていた従来の方法と比較して、この操作には、完全に閉鎖された
系で作業できるという利点がある。
さらに、コーティングされたプラスチック・バッグを、本発明に係る方法にお
いて使用することもできる。このコーティングは、例えば腫瘍細胞または腫瘍細
胞の一部、例えば細胞核を含まない細胞膜小胞を用いて達成することができる。
このように、T細胞を生存腫瘍細胞に接触させることなく、T細胞を刺激すること
が可能である。さらに、T細胞の刺激をさらに改良するため、プラスチック・バ
ッグの表面は、他の物質、例えばタンパク質でコーティングされていてもよい。
プラスチック表面は、例えば、欧州特許出願第96 108 288.0号に開示された方法
に従い、すなわち細胞または天然の細胞表面の一部を含む小胞を固定化すること
により、コーティングすることができる。細胞または小胞を、生物学的な結合対
の第一パートナーで修飾し、結合対の第二パートナーを用いて固相へと固定化す
ることができる。好適な結合対の例は、ビオチン／ストレプトアビジン、糖／レ
クチン、CD／抗CD抗体、MHC分子またはハプテン／抗ハプテン抗体などの高親和
性結合対である。
本発明のさらなる主題は、体外工程、即ち、T細胞の刺激、ベクターによる形
質転換、T細胞の増幅、および所望のT細胞を得るための分離を含む、養子免疫治
療のための方法である。この方法は、処理工程の少なくとも一つが、可撓性プラ
スチック・バッグを用いて実施されることを特徴とする。好ましくは、全ての工
程が閉鎖された系で行われる。
本発明のさらなる主題は、適当な緩衝液中に形質転換ベクター、好ましくはレ
トロウイルス・ベクターを含む、密閉可能な投入口または／および排出口を有す
るプラスチック・バッグ、特に血液バッグである。形質転換ベクターは、凍結ま
たは凍結乾燥された状態で驚異的に長い期間にわたり保存することが可能である
。別法として、または、さらに、プラスチック・バッグは、刺激T細胞または／
および抗原提示T細胞を含んでいてもよい。最後に、本発明は、適当な緩衝液中
の形質転換ベクターで遺伝学的に修飾されたT細胞を含むプラスチック・バッグ
にも関する。
図1は、エクスビボ（ex-vivo）遺伝子治療におけるプラスチック・バッグの使
用を示す図である。ドナーから収集されたT細胞を、刺激剤で処理することによ
り刺激する。その後、好ましくはウイルスベクターで形質転換を行う。次に培養
を行った後、細胞を抗体で標識し、分離カラムを用いて分離する。この後、培養
を行うことができる。最後に、T細胞を患者に移植する。
必要に応じて、個々の処理工程のうちいくつかを省略したり、新たな工程をい
くつか追加することが可能である。従って、分離後の培養は、必ずしも必要では
ない。その代わり、他の段階で培養工程を行うことが可能であるし、または急速
凍結させたバッグ内に細胞を保存することが必要な場合もある。
図は、特に移植片対白血病法（graft-versus-leukaemia method）または養子
免疫治療に関する作業工程図を示している。これらいずれの適用においても、バ
ッグ内に充填されたレトロウイルス・ベクターが使用される。
ワクチン細胞系を培養する場合には、細胞の充填のみが使用され、その後、細
胞は直接的に、例えばカニューレなどを介して患者に注入される。
エクスビボで刺激されたキラーT細胞を増幅する場合には、白血球搬出、刺激
、培養、および移植の処理工程が使用される。
図から明らかなように、可撓性プラスチック容器を使用することにより、全て
の処理工程を閉鎖された系で行うことが可能となり、そのことにより、取り扱い
が非常に簡略化され、夾雑物混入のリスクはほぼ完全に排除される。The present invention relates to the use of flexible plastic containers, such as blood bags, in gene therapy. The blood bag consists of a flexible, closed plastic container that includes at least one input or output port. Various sizes are available from different companies, such as Baxter, Biotrans, Cobe, Fresenius, and Macopharm. It is used in hospitals and blood banks, for a variety of applications, for aspiration of whole blood or bone marrow, for leukapheresis. Blood cells can be stored, frozen, processed into bags, and it is known that special equipment is available for washing and centrifugation and the like. In the field of gene therapy, there is an urgent need for a method capable of preparing large quantities of products such as vectors and cells in a simple, safe and easy-to-handle form. Traditionally, laboratory reaction vessels and devices have been used for gene therapy, but for clinical applications there are considerable problems in their handling. WO 87/06119 relates to a system for collecting blood, suitable for preventing the transmission of pathogens in blood. The system includes a blood bag for collecting blood and a second container for controllably introducing a pathogen neutralizing agent. It has nothing to do with the application of blood bags in gene therapy. WO 92/19285 relates to a method for disinfecting a blood sample contained in a blood bag to destroy bacteria and viruses in the sample. The disinfectant comprises an anionic surfactant, at least one non-anionic surfactant, a stabilizer, two salts and two phosphates. It has nothing to do with the application of blood bags in gene therapy. EP-A-0 471 947 discloses the cultivation of cells in a gas-permeable blood bag. A culture of hybridoma cells is disclosed. It has nothing to do with the use of blood bags in gene therapy. JP-3007 575 relates to a device for culturing lymphocytes collected from a cancer patient in a device comprising a blood bag on a base with a rotating pivot. It has nothing to do with application in gene therapy. WO 96/00782 relates to the culture of immobilized stem cells in a blood bag coated with a binding matrix for the cells. Stem cells are collected from the patient and returned after culture. Genetic manipulation of stem cells in vitro can also be performed during culture. However, the method disclosed in WO 96/00782 is limited to stem cells and cannot be simply adapted to other cell types. Therefore, an object of the present invention was to provide a novel means and method in gene therapy that can handle cells and other substances more easily and safely. This object according to the present invention is achieved by the use of a flexible plastic container for performing an extracorporeal treatment step in gene therapy. The present application focuses on gene therapy using suspension cells, especially T cells. Cells growing in suspension can be stimulated, transformed, cultured and labeled in a flexible plastic container. Processing steps in gene therapy that can be performed using a flexible plastic container include, for example, a step of filling a vector used to introduce genetic material into cells from a donor, a vector to infect or transform cells, Contacting with a donor cell, stimulating or / and culturing suspension cells, especially T cells, and filling or / and eluting a cell separation device. The use of a flexible plastic container according to the invention, having at least one opening for a suitable connecting member, for example a connecting tube, allows the extracorporeal treatment of the cells from the donor to be partially or completely completed. , Can be performed in a closed system. Flexible plastic containers having a volume of generally 10 to 5000 ml, in particular 10 to 2000 ml, are preferably closed plastic bags with at least one opening for the joining tube, for example an attachment. These connecting tubes, preferably made of a sealable plastic material, connect the bags using a suitable device, such as a sterile sealing device of the Terumo Company, so that a closed system is always maintained. And can be separated. As a result, biological substances such as cells and viruses can be handled with extremely low risk of contamination, and there is no need to use even a sterile laboratory bench. A first embodiment of the method according to the present invention is directed to transformation vectors, such as the retroviral vectors disclosed by Kotani et al. (Human Gene Therapy 5 (1994), 19-28), and for use in gene therapy studies. The retroviral vector (Anderson, Science 256 (1992), 808-813). Particularly preferred is a retroviral vector containing the genetic information of a modified human LNGFR (low affinity nerve growth factor receptor) (Malvilio et al., Blood 82 (1993), 198-1997). At present, these vectors are filled into rigid propylene containers with screw caps, and the opened product is dispensed on a sterile laboratory bench. In contrast, when a blood bag is used in accordance with the present invention, the liquid containing the vector, e.g., the cell culture supernatant, is passed through a 0.22 μm or 0.45 μm filter through a suitably prepared sterile tube connection, for example. It is possible to fill directly into small bags with a capacity of 20-50 ml. After filling, the transformation vector is preferably lyophilized or / and frozen. After the bag is sealed, it can be stored at -80 ° C as before. Surprisingly, it has been found that retroviral vectors can be stored in plastic bags, frozen or lyophilized, for very long periods of time, for example over a year and a half. The bag containing the vector can then be ligated at the hospital with another bag containing the cells to be transformed. In this way, all steps are performed in a closed system and the risk of contamination during recovery and filling is almost completely avoided. A second aspect of the method according to the invention is the transformation of cells. For transformation, suspension donor cells, preferably T cells or a subpopulation thereof, contained in a blood bag, or peripheral blood lymphocytes obtained by leukocyte export, or antigen presenting cells such as tumor cells, are transformed. Couple with the bag containing the conversion vector and mix both volumes in this way. Next, transformation occurs in this mixed volume. That is, the cell undergoes a genetic change with the vector. Subsequent steps, such as cell washing and centrifugation, may be performed with the aid of commercially available equipment, or it is preferable to use a bag system. When using a flexible plastic container to transform T cells, the rate of transformation can be improved by centrifuging the plastic container. Surprisingly, instead of placing the bag on a swing-out rotor with the bottom facing down as usual, cells have been placed on one of the largest available surfaces during centrifugation. It has been found that when placed in a dispersable manner, transformation efficiency is significantly increased. For this purpose, the bag can for example be installed on one of the two sides. It is also possible to stack several bags on top of each other in the rotor. In this case, the bags may be placed directly on top of each other or may be placed in special holders consisting of parallel plates. A third aspect of the method according to the invention relates to the expansion of suspension cells, in particular of T cells or antigen presenting cells. This T cell expansion is performed after stimulation or / and transformation, and can be performed in gas permeable bags for platelet production known in the prior art. The cultivation is performed in a CO 2 incubator, and a selective shaking device may be used. In cell expansion, the culture can be expanded by coupling a bag filled with fresh medium, if necessary. A small bag can be aseptically removed after the small bag is connected to the culture bag to collect a sample for counting the number of cells in the cell chamber or to analyze the components of the medium. After the desired number of cells has been reached, the cells can be centrifuged in a bag and a small amount removed and prepared for implantation. A fourth preferred embodiment of the present invention relates to a flexible cell separation device, such as a cell separation column (de Wynter et al., Stem Cells 13 (1995), 524-532) for packing or / and elution. The use of plastic containers. In separation, a blood bag can be used both to fill the system and to aspirate the separated cells. To prepare a completely closed system of all steps, the preparation of the cells, eg washing, centrifugation, addition of antibodies, etc., is also preferably performed in a bag. A particularly preferred cell separation device is the avidin-biotin immunosorbent column disclosed by Auditore-Hargreaves et al. (Bioconjugate Chem. 5 (1994), 287-300). A fifth preferred embodiment of the present invention relates to suspension cells, especially T cells, for graft-versus-leukaemia methods, adoptive immunization, preparation of vaccine cell lines or stimulation of killer T cells. Culture and / or stimulation. Also in this case, by using a blood bag, open handling of cells can be avoided, and therefore, the risk of contamination can be avoided. For use in the graft-versus-leukaemia method, there is no need to individually stimulate T cells collected from healthy donors. To label the cells, transformation is performed, preferably using a retroviral vector as described above. In adoptive immunotherapy, T cells are stimulated, for example, by tumor cells collected from a patient. The isolation of tumor cells depends on the type of tumor, and probably also on the type of tumor. For stimulation, tumor cells are added directly to the bag containing donor T cells. Thereafter, steps such as vector transformation, T cell expansion, and cell separation can all be performed in bags, ie, in a closed system. Suitable vaccine cell lines are genetically modified tumor cell lines, for example derivatives of the RCC-26 cell line (Schendel et al., J. Immunol. 151 (1993), 4209-4220). These cell lines, eg, from human renal carcinoma, can be administered to a patient with a tumor, eg, a patient with a renal tumor, for an immune response to metastatic renal tumor cells. In this case, the vaccine cell line can be administered directly to the patient after amplification in the bag. T cells stimulated with inactivated human B cells can also attack tumor cells. In this case, the inactivated cells are filled into a small blood bag and directly connected to the blood bag containing the patient's T cells. Subsequent amplification of further T cells proceeds as described above. Compared to the conventional method in which the stimulator cells are frozen in a cryotube after cultivation and inactivation, this operation has the advantage that it can work in a completely closed system. Furthermore, coated plastic bags can also be used in the method according to the invention. This coating can be achieved, for example, using cell membrane vesicles that do not contain tumor cells or parts of tumor cells, such as cell nuclei. Thus, it is possible to stimulate T cells without bringing the T cells into contact with living tumor cells. Furthermore, the surface of the plastic bag may be coated with other substances, for example proteins, to further improve the stimulation of T cells. Plastic surfaces can be coated, for example, according to the method disclosed in European Patent Application No. 96 108 288.0, ie by immobilizing cells or vesicles containing parts of the natural cell surface. The cell or vesicle can be modified with a first partner of a biological binding pair and immobilized on a solid phase using the second partner of the binding pair. Examples of suitable binding pairs are high affinity binding pairs such as biotin / streptavidin, sugar / lectin, CD / anti-CD antibodies, MHC molecules or hapten / anti-hapten antibodies. A further subject of the present invention is a method for adoptive immunotherapy, comprising an extracorporeal step, i.e. stimulation of T cells, transformation with a vector, expansion of T cells, and isolation to obtain the desired T cells. The method is characterized in that at least one of the processing steps is performed using a flexible plastic bag. Preferably, all steps are performed in a closed system. A further subject of the present invention is a plastic bag, especially a blood bag, having a sealable inlet or outlet and containing a transformation vector, preferably a retroviral vector, in a suitable buffer. Transformation vectors can be stored in a frozen or lyophilized state for a surprisingly long period of time. Alternatively, or in addition, the plastic bag may contain stimulated T cells or / and antigen presenting T cells. Finally, the invention also relates to a plastic bag containing T cells genetically modified with the transformation vector in a suitable buffer. FIG. 1 shows the use of plastic bags in ex-vivo gene therapy. T cells collected from the donor are stimulated by treatment with a stimulant. Thereafter, transformation is preferably performed with a viral vector. Next, after culturing, the cells are labeled with an antibody and separated using a separation column. Thereafter, culture can be performed. Finally, the T cells are transplanted into the patient. If necessary, some of the individual processing steps can be omitted or some new steps can be added. Therefore, culture after separation is not always necessary. Instead, it is possible to perform the culturing step at other stages, or it may be necessary to store the cells in quick-frozen bags. The figure shows a working process diagram, in particular for the graft-versus-leukaemia method or adoptive immunotherapy. In each of these applications, a retroviral vector packed into a bag is used. When culturing a vaccine cell line, only packing of cells is used, after which the cells are injected directly into the patient, for example via a cannula. When amplifying killer T cells stimulated ex vivo, the steps of leukocyte export, stimulation, culture, and transplantation are used. As is evident from the figure, the use of a flexible plastic container makes it possible to perform all processing steps in a closed system, which greatly simplifies handling and reduces contamination. Risk is almost completely eliminated.
【手続補正書】
【提出日】１９９９年２月１７日（１９９９．２．１７）
【補正内容】
（１）明細書第１頁２９行〜第２頁３行
「JP-3 007 575は、回転式のピボットを有するベース上の血液バッグ
を含む装置において、癌患者から収集されたリンパ球を培養するため
の装置に関する。遺伝子治療における適用とは全く関連がない。」を
「EP-A-0 725 134 は、治療的に関心のある細胞の体外培養を目的とす る可撓性バイオリアクターについて開示している。しかし、遺伝子治 療における細胞の処理工程において血液バッグを使用することとは全 く関連がない。」と訂正する。
（２）明細書第２頁９行〜１２行
「従って、本発明の目的は、より簡便に、より安全に細胞およびその
他の物質を取り扱うことができる、遺伝子治療における新規な手段お
よび方法を提供することであった。」を
「腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）がプラスチック・バッグ内で培養できる ことは記載されている。しかし、単なる培養を越えるプラスチック・ バッグ内でのTILの処理は開示されていない。
従って、本発明の目的は、より簡便に、より安全に細胞およびその他
の物質を取り扱うことができる、遺伝子治療における新規な手段およ
び方法を提供することであった。」と訂正する。
（３）請求の範囲 別紙の通り請求の範囲
1．遺伝子治療における体外処理工程を実施するために、形質転換ベクターを充
填するための、可撓性プラスチック容器の使用。
2．レトロウイルス・ベクターを充填するための請求項1記載の使用。
3．形質転換ベクターが充填後に凍結乾燥または／および凍結される、請求項1ま
たは2記載の使用。
4．遺伝子治療における懸濁細胞の体外形質転換のための可撓性プラスチック容
器の使用。
5．白血球もしくはその亜集団または抗原提示細胞の形質転換のための請求項4記
載の使用。
6．形質転換が遠心分離工程を含む請求項4または5記載の使用。
7．最大の利用可能な表面のうちの一面に細胞が分散できるように、プラスチッ
ク容器が配置されている、請求項6記載の使用。8 ．
遺伝子治療における細胞分離装置の体外充填または／および溶出のための可
撓性プラスチック容器の使用。9 ．
遺伝子治療における懸濁細胞の体外刺激および選択的に培養のための可撓性
プラスチック容器の使用。10 ．
移植片対白血病法（graft-versus-leukaemia processes）のためのT細胞の
刺激および選択的に培養のための請求項9記載の使用。11 ．
養子免疫治療のためのT細胞の刺激および選択的に培養のための請求項9記載
の使用。12 ．
ワクチン細胞の刺激および選択的に培養のための請求項9記載の使用。13 ．
キラーT細胞の刺激および選択的に培養のための請求項9記載の使用。14 ．
刺激が、コーティングされたプラスチック・バッグ内で実施される、請求項9 〜13
のいずれか一項記載の使用。15 ．
可撓性プラスチック容器が10〜5000mlの容量を有する、請求項1〜14のいず
れか一項記載の使用。16 ．
プラスチック容器が、密閉可能な連結のための少なくとも一つのアタッチメ
ントを含む閉鎖されたバッグである、請求項1〜15のいずれか一項記載の使用。17 ．
体外工程、すなわち、T細胞の刺激、ベクターによる形質転換、T細胞の増幅
、および分離を含む、養子免疫治療または移植片対白血病法（graft-versus-leu
kaemia methods）のための方法であって、処理工程、すなわち、T細胞の刺激、 ベクターによる形質転換、および分離のうち
の少なくとも一つが可撓性プラスチ
ック容器内で実施される方法。18 ．
全ての工程が閉鎖された系で実施される、請求項17記載の方法。19 ．
適当な緩衝液中の形質転換ベクターを含むプラスチック・バッグ。20 ．
レトロウイルス・ベクターを含む、請求項19記載のプラスチック・バッグ。21 ．
凍結または凍結乾燥された状態である、請求項19または20記載のプラスチッ
ク・バッグ。[Procedure for Amendment] [Date of Submission] February 17, 1999 (Feb. 17, 1999) [Content of Amendment] (1) Description, page 1, line 29 to page 2, line 3 "JP-3007 575 " EP-A- ", which relates to a device for culturing lymphocytes collected from cancer patients in a device comprising a blood bag on a base with a rotating pivot, which has nothing to do with application in gene therapy. 0 725 134 discloses a therapeutically flexible bioreactor shall be the purpose of in vitro culture of interest cells. However, the the use of blood bags in the process of cells in gene therapy is to correct the all Ku unrelated. ". (2) Specification, page 2, lines 9 to 12 "Accordingly, an object of the present invention is to provide novel means and methods in gene therapy that can handle cells and other substances more easily and safely. It has been described that " tumor infiltrating lymphocytes (TILs) can be cultured in plastic bags . However, treatment of TILs in plastic bags beyond mere culture has been described. Accordingly, it was an object of the present invention to provide new means and methods in gene therapy that could more easily and safely handle cells and other substances. " Correct. (3) the scope of the following claims Attachment of claims 1. Use of a flexible plastic container to fill a transformation vector to perform an extracorporeal processing step in gene therapy. 2． 2. Use according to claim 1 for filling a retroviral vector. 3． 3. Use according to claim 1 or 2, wherein the transformation vector is lyophilized and / or frozen after filling. Four. Use of flexible plastic containers for in vitro transformation of suspension cells in gene therapy. Five. 5. Use according to claim 4, for the transformation of leukocytes or subpopulations thereof or antigen presenting cells. 6． 6. Use according to claim 4 or 5, wherein the transformation comprises a centrifugation step. 7． 7. Use according to claim 6, wherein the plastic container is arranged so that the cells can be dispersed on one of the largest available surfaces. 8 ． Use of a flexible plastic container for extracorporeal filling and / or elution of a cell separation device in gene therapy. 9 ． Use of flexible plastic containers for extracorporeal stimulation and selective culture of suspended cells in gene therapy. 10 ． 10. Use according to claim 9 for the stimulation and selective culture of T cells for graft-versus-leukaemia processes. 11 ． 10. Use according to claim 9 for stimulation and selective culture of T cells for adoptive immunotherapy. 12 ． 10. Use according to claim 9 for stimulating and selectively culturing vaccine cells. 13 ． 10. The use according to claim 9 , for stimulating and selectively culturing killer T cells. 14 ． 14. Use according to any one of claims 9 to 13 , wherein the stimulus is performed in a coated plastic bag. 15 ． Flexible plastic container having a capacity of 10～5000Ml, use of any of claims 1-14. 16 ． 16. Use according to any one of the preceding claims, wherein the plastic container is a closed bag containing at least one attachment for a sealable connection. 17 ． A method for adoptive immunotherapy or graft-versus-leukaemia methods, including extracorporeal steps, i.e., stimulation of T cells, transformation with a vector, amplification of T cells, and isolation. The method wherein at least one of the processing steps , i.e., stimulation of T cells, transformation with a vector, and isolation is performed in a flexible plastic container. 18 ． 18. The method of claim 17 , wherein all steps are performed in a closed system. 19 . Plastic bag containing the transformation vector in a suitable buffer. 20 . 20. The plastic bag of claim 19 , comprising a retroviral vector. 21 . 21. The plastic bag according to claim 19 or 20 , which is in a frozen or freeze-dried state.
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ
，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ
，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，
ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ
Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ
，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，
ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ
Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ
，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，
ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ
(72)発明者 クビウス マンフレッド
ドイツ国 ペンツバーグ グラスワンドス
トラッセ ７シー────────────────────────────────────────────────── ───
Continuation of front page
(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE,
DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L
U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF)
, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE,
SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, S
D, SZ, UG, ZW), UA (AM, AZ, BY, KG)
, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT
, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA,
CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, F
I, GB, GE, GH, HU, IL, IS, JP, KE
, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS,
LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, M
X, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE
, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT,
UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW
(72) Inventor Kvyus Manfred
Germany Pentsburg Grass Wands
Trasse 7 Sea