JP2000504230A

JP2000504230A - Method for producing tumoricidal T lymphocytes

Info

Publication number: JP2000504230A
Application number: JP10520046A
Authority: JP
Inventors: ハルベルトユングフェル; ハインリヒバルチェット
Original assignee: ロシュディアゴノスティックゲーエムベーハー
Priority date: 1996-10-30
Filing date: 1997-10-29
Publication date: 2000-04-11
Also published as: CA2270117A1; EP0942961A1; AU6908898A; WO1998018907A1

Abstract

(57)【要約】抗CD43抗体の存在下におけるインキュベーションを含む、リンパ球にリソソームによる前処理を施すことからなる、殺腫瘍性Tリンパ球の製造を可能にする方法について開示する。 (57) [Summary] Disclosed is a method that enables the production of tumoricidal T lymphocytes, comprising pretreating lymphocytes with lysosomes, including incubation in the presence of an anti-CD43 antibody.

Description

【発明の詳細な説明】殺腫瘍性Tリンパ球の製造法本発明は、殺腫瘍性Tリンパ球（tumoricidal T lymphocyte）の活性化、生産および増殖のための方法、ならびに殺腫瘍性Tリンパ球の活性化、生産および増殖のための培地として適した組成物に関する。細胞性免疫による防御は、例えばウイルス感染細胞または腫瘍細胞などの病理学的に変化した内因性細胞の排除に重要な役割を果たしている。この場合には、細胞傷害性Tリンパ球が表面抗原を利用してこれらの変化した内因性細胞を認識する。これらの表面抗原は通常、細胞によって形成され、いわゆる主要組織適合性複合体（MHC）の表面受容体と結合して細胞表面に存在する蛋白質断片である（Zinkernagelら、Nature 248（1974）、701〜702およびBabbitら、Nature317（ 1985）、359〜361）。しかし、腫瘍細胞のこれらの表面抗原と健常細胞の対応抗原との差が極めてわずかである場合には、免疫系は腫瘍細胞を排除しうる殺腫瘍性Tリンパ球を形成しないと考えられる。このため、このような腫瘍細胞に対して細胞性免疫による防御を誘発させようとの試みもすでになされている。最初にカルメット-ゲラン菌（bacillus Calmette-Guerin）（BCG）、コリネバクテリウムパルブム（Corynebacterium parvum）または腫瘍細胞抽出物に由来するワクチンなどの非特異的免疫賦活因子による能動免疫を達成させる試みがなされた（Te rryおよびRosenberg編、ヒト癌の免疫療法（Imunotherapy of Human Cancer）（ 1982）、Elsevier North Holland）。いわゆる養子免疫療法の概念により、さらに優れた結果が得られた。この場合には、患者のリンパ球をインビトロで活性化し、次いで再移植する。ほとんどの場合には、リンパ球はインターロイキン2の添加によってインビトロで活性化されて乱交雑キラー細胞（promiscous killer cell）となる（D．Thieleら、Immunology Today 10（1989）、375〜381）。得られた細胞傷害性リンパ球は以来、リンホカイン活性化キラー細胞（LAK細胞）と呼ばれている（Rosenberg、Immunology Today 9（1988）58〜62）。細胞傷害性T リンパ球と異なり、LAK細胞およびそれらの腫瘍細胞に対する作用は腫瘍抗原の認識に関してMHC遺伝子が正確に発現されることに依存しない上、免疫系のナチュラルキラー細胞と異なり、LAK細胞は生じたばかりの腫瘍細胞にも効果がある。すでにLAK細胞を用いて初めての臨床的成果が達成されている。しかし、この形式の養子免疫療法には、長期にわたり比較的高い用量が必要とされるインターロイキン2による副作用という短所がある。これは特に、臓器機能不全をもたらす毛細血管の透過性上昇につながる（Rosenberg、Immunology Today 9（1988）、58〜62、Rosenst einら、Journal lmnunology 137（1986）、1735〜1742およびEttinghausenら、S urg.Forum37（1987）、388〜389）。さらに、健常な内因性細胞を指向するインターロイキン2による刺激時にもLAK細胞が得られる（B．Chenら、Cell．Immunol .118（1989）、458〜469）。養子免疫療法に対するさらに効果的な方法が探索される中で、活性化させようとするリンパ球を自家腫瘍細胞の存在下で培養することも行われた（リンパ球腫瘍混合培養、G.Fossatiら、International Journal of Cancer 42（1988）、239 〜245；G．Degiovanniら、Eur．J．Immunol．18（1988）、671〜676；Wolfelら、J．Exp．Med．170（1989）、797〜819；Darrowら、J．Immunnol．142（1989）、3329〜3335およびNotterら、Int．J．Cancer 45（1990）、834〜841）。さらに、腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）をインビトロで増殖させるための方法も記載されている（Yronら、J．Immunol．125（1980）、238〜245）。末梢血液細胞から入手しうるLAK細胞とは異なり、腫瘍浸潤性リンパ球を入手するためには患者から腫瘍組織を採取する必要がある。これにより、それらの治療的応用はかなり制限される。殺腫瘍性Tリンパ球およびそれらの製造方法は国際公開公報第94／23014号に記載されている。これによれば、殺腫瘍性Tリンパ球はリンパ球と特定の性質をもつ哺乳動物細胞系との共培養によって生産される。 Tリンパ球の増殖において細胞表面のシアロ糖蛋白質（後にCD43と命名された）が一定の役割を果たすことは、メンツァー（Mentzer）ら、J．Exp．Medicine 165（1987）1383〜1392によって知られている。しかし、メンツァーによって記載された抗体がTリンパ球を刺激するのは単球の存在下のみである。ヴァーガス-コルテス（Vargas-Cortes）らは、Scand．J．Immunol．27（1988 ）661〜671に、抗CD43抗体による末梢血リンパ球（PBL）の剌激に関して記している。記載された方法ではヒトPBLの自発的細胞傷害性が増強され、その効果は主にN K細胞を指向し、腫瘍細胞系K562に対する細胞の細胞傷害性は増大する。本発明の目的は、他のTリンパ球および特にNK細胞の刺激および増殖が回避されるような、特異的な殺腫瘍性Tリンパ球を特異的に生産するための改善および単純化された方法を提供することであった。この目的は、向リソソーム性前処理を受けた（lysosomotropically pretreate d）リンパ球を抗CD43抗体とともに培養して殺腫瘍性Tリンパ球を単離することによる、慢性骨髄性白血病細胞系（K-562、ATCC CTL 243）の細胞を細胞傷害的に破壊せず、それらの増殖を限られた期間にわたり抑制するのみである殺腫瘍性T リンパ球を特異的に生産するための方法によって達成される。驚くべきことに、国際公開公報第94／23014号に記載された通り、白血球（リンパ球）を哺乳動物細胞系と共培養する必要はなく、むしろ向リソソーム性前処理を受けたリンパ球を培養して抗CD43抗体とともにインキュベートした場合には驚くほど特異性の高い殺腫瘍性Tリンパ球を入手できることが明らかになった。本発明の意味する範囲内での殺腫瘍性Tリンパ球は、国際公開公報第94／23014 号に記載された通りの、抗原非特異的な様式で腫瘍細胞を認識してアポトーシス誘導および／または細胞溶解を介してそれらを死滅させるT細胞である。殺腫瘍性Tリンパ球は、 a）腫瘍細胞系M0LT-4、ジャーカット、THP-1、HL-60、ヒーラ、K-562、Malme3 Mおよび／またはY79に対する殺腫瘍性効果を有する、ならびに b）細胞系HB654またはHB617の存在下におけるこれらの細胞の増殖中に、これらの殺腫瘍性Tリンパ球の培養上清からはインターロイキン2を検出限界0.5IU／m lで検出しえない、という点を特徴とする。殺腫瘍性キラーT細胞はナチュラルキラー（NK）細胞ではない。腫瘍浸潤性リンパ球と比べて、それらは広範な殺腫瘍活性をもつため、治療的応用により適している。ナチュラルキラー細胞と異なり、本発明に係る方法によって生産される殺腫瘍性細胞はT細胞である。NK細胞と殺腫瘍性細胞とを区別するさらなる基準は、NK細胞は腫瘍細胞系K-562を認識して細胞傷害的に破壊するが、殺腫瘍性T細胞は細胞系K-562の増殖を限られた期間にわたり抑制するのみであるという点である。本発明の意味する範囲内での限られた期間にわたる抑制とは、細胞培養物中の細胞が死滅せずにそれらの増殖のみが抑制されること、好ましくはそれらの増殖が完全に抑制されることを意味する。増殖抑制は可逆的であり、殺腫瘍性Tリンパ球と細胞系K-562の細胞とを分離することによって消失する。この点に関して殺腫瘍効果とは、検討する腫瘍細胞系の死滅（特に溶解）のみでなく、増殖に対する抑制効果も意味する。この殺腫瘍効果は、例えば殺腫瘍性 Tリンパ球とともに長期間にわたり培養した際に殺腫瘍性Tリンパ球と形態的に区別しうる腫瘍細胞系が培養物から消失する、または少なくともそれらの増殖が遅延するとの事実により、例えば当業者が精通している細胞傷害試験によって検出することができる。殺腫瘍性Tリンパ球は好ましくはCD3陽性（CD3⁺）および／またはCD4陽性（CD4⁺）である。本発明の意味する範囲内でのリンパ球は、例えば全血から入手しうる白血球の調製物（preparation）であると理解される。このような方法は当業者に公知である。例えば、勾配遠心処理（フィコール勾配）によって血液リンパ球を含む単核細胞の画分（PBMNC）が入手できる。特異的な殺腫瘍性Tリンパ球を形成させるためには、この様式で入手したPBMNCを前処理する必要がある。細胞をL-ロイシル-ロイシンメチルエステルまたは類似のエステルなどの向リソソーム性物質によって前処理する。このような物質は、例えばP.L．Triozziら、Immunopharmaco logy 28（1994）39〜45；C.S.Rosenfeld、Stemcells、Dayt 12（1994）198〜204 ；N．Seo、Cancer lnmunol．Immunother．38（1994）277〜280に記載されている。向リソソーム性前処理により、殺腫瘍性Tリンパ球の前駆細胞を豊富に含む生存リンパ球の画分を得ることができる。抗CD43抗体とは、細胞表面分子CD43（DeSmet，W.ら、Schlossman，S.F.ら（編）白血球タイピングV（Leukocyte Typing V）、pp.1706〜1707、Oxford United Kingdom：Oxford University Press、1995中）に対する抗体であると理解される。CD43は造血系の細胞上に生じるシアロ糖蛋白質であり―樹状細胞およびBリンパ球のあるサブポピュレーションを除き―免疫系のすべての細胞上に発現される（Fukuda，M.、Glycobiology 1［1991］、347〜356）。このような抗体は、好ましくは、CD43のMHCクラスI分子との結合に関与するCD43分子の一部を指向する。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよく、免疫化、合成または組換え法によって生産可能である。完全な抗体または特徴的な結合を媒介する抗体誘導体のいずれを用いることもできる。しかし、完全なCD43抗体と同様な様式で細胞表面のCD43分子と架橋する能力をもつ抗体または抗体誘導体を用いることが好ましい。前駆細胞（CD3陽性であってロイシルロイシンメチルエステル耐性のリンパ球）の殺腫瘍性Tリンパ球への分化には、表面マーカーCD43（刺激細胞上のMHC-Iとの結合）およびCD2（刺激細胞上のCD58との結合）を介した同時刺激が関与することが示されている。リンパ球と共培養した際に殺腫瘍性Tリンパ球を生じるに至る国際公開公報第94／23014号に記載された哺乳動物細胞系は、明らかに前記の表面マーカーを介して前駆細胞の分化を引き起こすことが示された。驚くべきことに、抗CD43抗体単独でも類似した効果が得られることが判明した。一つの好ましい態様において、殺腫瘍性Tリンパ球、および好ましくはT細胞によって剌激された1対の抗CD2抗体（CD2上の2つの異なるエピトープを指向する）の収量を改善するために1つまたはいくつかの抗CD2抗体を添加する（Schwartz,M .ら、J．Immunol．154（1995）、5813〜5820；Moingeon，P.ら、Immunol．Rev.1 11（1989）、111〜140）。リンパ球を数日間（好ましくは5〜30日）にわたり従来の培地中で抗CD43抗体とともに培養するのが好都合である。培地は好ましくは無血清である。自家性の殺腫瘍性Tリンパ球を調製しようとする際には、自家血清を培養に用いるのが特に好ましい。この様式で入手した殺腫瘍性Tリンパ球は、選択的には精製後に、治療的薬剤として患者に投与することができる。驚くべきことに、抗CD43抗体との培養により、リンパ球からHLAに拘束されず広範な殺腫瘍活性をもつ特異的な殺腫瘍性Tリンパ球が得られることが明らかになった。この点に関して殺腫瘍活性とは、対応する腫瘍細胞に対する死滅作用、特にアポトーシス誘導性および／または溶解作用のほか、これらの腫瘍細胞の増殖に対する抑制作用であると理解される。リンパ球としては血液リンパ球を用いるのが好ましい。しかし、腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）のほか、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球を用いることも可能である。リンパ球調製物は好ましくは使用前に精製する。血液リンパ球を用いる場合には、赤血球を除去するのが好都合である。抗CD43抗体との培養の前に殺腫瘍性Tリンパ球の前駆細胞の画分を濃縮する。このために、好ましくはシーレ（T hiele）およびリプスキー（Lipsky）（The Journal of lmunology、Vol.136、No .3（1986）、p.1038〜1048）に従ったL-ロイシル-L-ロイシンメチルエステルとのインキュベーションによる向リソソーム性処理により、単球、マクロファージ、NK細胞、サプレッサーT細胞ならびに同種抗原反応性の細胞傷害性T細胞およびその前駆細胞を除去する。本発明に係る方法を実施するためには、フィコール密度勾配遠心処理など既知の方法によって、好ましくはドナーの血液または腫瘍からリンパ球をまず単離する。続いて、向リソソーム性処理後に残ったリンパ球を抗CD43抗体とともに従来のリンパ球培地中で培養する。培地中の抗体濃度は1ng／mlから100μg／mlの間、好ましくは10μg／mlである。培養は殺腫瘍性Tリンパ球の活性化が検出可能になるまで続ける。これには通常、約8日間の培養を要する。本発明に係る培養は、リンホカインもしくは特にインターロイキン2などの増殖因子または分化因子の添加を必要とせずに殺腫瘍性Tリンパ球を活性化する。このような因子は治療的応用において副作用を惹起する恐れがあるため、この点は得られた殺腫瘍性T リンパ球の治療的応用のためには特に有益である。本発明に係る方法を用いて、治療において副作用につながる恐れのある例えばリンホカインまたはインターロイキン2などの分化因子の添加を必要とせずに、上記のヒト殺腫瘍性Tリンパ球を入手することができる。このため、本発明のさらなる主題は、腫瘍療法に用いうる治療的薬剤を製造するために本発明に係る方法を用いることである。このような治療的用途のためには、本発明に従って生産された殺腫瘍性Tリンパ球を、当業者が精通している方法（例えば、遠心および生理食塩水へのペレットの再懸濁を数回、例えば3回繰り返すなど）によって洗い、選択的には単離して、投与のために適した媒質（例えば生理食塩水）中に溶解させる。このリンパ球の殺腫瘍性Tリンパ球へのエクスビボ活性化に加えて、殺腫瘍性T リンパ球に対して抗CD43抗体を適用することによってリンパ球をインビボで活性化することもできる。このような治療的応用のためには、抗体を生理的食塩水などの投与に適した媒質中に溶解させて投与する。この殺腫瘍性Tリンパ球を用いてエクスビボで細胞調製物中の腫瘍細胞を排除することもできる。これは好ましくは、殺腫瘍性Tリンパ球との培養により、幹細胞単離物（例えば骨髄幹細胞）から腫瘍細胞を排除（一掃）するために用いることができる。この様式で精製された幹細胞は、例えば放射線療法または化学療法後の患者に再移植することができる（自家骨髄移植）。ヒトCD43分子に対する抗体はDeSmet，W.ら（SchlossmanS.F.ら［編］、白血球タイピングV（Leukocyte Typing V）、pp.1706〜1707、Oxford United Kingdom ：Oxford University Press、1995中）によって記載されている。例えば「6F5」と命名された抗CD43抗体は、本発明に係る方法に適している。一つの好ましい態様において、抗CD43抗体とともに培養した後に得られる殺腫痛性Tリンパ球を増殖させる。この増殖は、好ましくは、国際出願PCT／EP97／01 924号に記載されている方法によって実施する。細胞系HB 654は、1993年3月24日に「（有限会社）ドイツ細胞培養・微生物保存機関（Deutsche Sammlung fur Zellkulturen und Mikroorganismen GmbH）」、Mascheroder Weg 1b、D-38124 Braunschweigに、DSM ACC第2122号として寄託されている。細胞系HB 617は、94年1月3日に「（有限会社）ドイツ細胞培養・微生物保存機関」、Mascheroder Weg 1b，D-38124 BraurlschweigにDSM ACC第2166号として寄託されている。本発明は、以下の実施例、刊行物および表によって明らかになるが、その保護される範囲は特許の請求の範囲に由来する。記載される方法は、たとえ改変がなされた後でも本発明の主題を記載する例として理解される必要がある。実施例において言及する抗体の特徴は、国際白血球タイピングワークショップ（international Leucocyte Typing Workshop）で明記されている。前記の抗体の代わりに、類似した結合特異性をもつ抗体を用いることも可能である。実施例1 リンパ球の抗CD43抗体との培養ヒトドナーの末梢血（PBMNC）から得た単核細胞を勾配遠心処理（リンパ球分離用培地、Boehringer Mannheim GmbH（BM））によって赤血球から分離し、リン酸緩衝生理食塩水（Boehringer Mannheim GmbH（BM））で2回洗い、シーレ（Thi ele）およびリプスキー（Lipsky）（The Journal of lmunology、Vol.136、No.3 （1986）、p.1038〜1048）に従い、250μMのロイシル-ロイシンメチルエステル（Boehringer Mannheim GmbH（BM））とともに、細胞約5×10⁶個／ml RPMI-1640 培地（Boehringer Mannheim GmbH（BM））の密度にて室温で20分間インキュベートする。RPMI-1640培地で2回洗った後、6F5抗CD43抗体を10μg／mlの濃度になるように添加したX-vivo-20培地（Bio-Whittacker）中に生存細胞を2×10⁶個／ml の密度とし、8％CO₂雰囲気下にて37℃で培養する。培養開始から5日目に培地の半分を補充し、最終濃度が10μg／mlとなるように新たな6F5抗CD43抗体を添加する。培養開始から10日目に、実施例3のために細胞を用いる。培養第10日の細胞の表現型判定では、細胞の＞95％がCD3陽性であることが示される。マーカーCD14およびCD16を有する細胞は認められない。実施例2 リンパ球の抗CD43抗体および抗CD2抗体との培養実施例1で記載した通りに、勾配遠心処理およびロイシル-ロイシンメチルエステル処理によってヒトドナーの血液からリンパ球を調製する。10％の熱失活（56 ℃／30分）自家血清を添加し、抗CD43抗体6F5ならびに抗CD2抗体TS2／18およびV IT13（Schwarz，M.ら、J．Immunol．154（1995）、5813〜5820）を各10μg／ml の濃度となるように添加したイスコーブ（Iscoves）改変DMDM（Gibco）中にリンパ球を1×10⁶個／mlの密度で懸濁した。第5日に抗体を含む培地の半分を補充した。培養開始から10日目の細胞数計測では、リンパ球の増殖が2.2倍になったことが示された。実施例3 殺腫瘍性Tリンパ球の効果実施例1によって得た殺腫瘍性Tリンパ球をヒト腫瘍系（表ＩおよびII参照）の培養物に添加する。これらの腫瘍細胞に対する殺腫瘍効果を顕微鏡で観測する。本発明に係る殺腫瘍性Tリンパ球により、これらの種々の腫瘍細胞系は死滅するか、それらの増殖が抑制される。 1）エフェクター細胞／腫瘍細胞の比 2）48時間後の顕微鏡による評価 3)培養14日後 4）増殖抑制 5）5×10⁴個のTHP-1細胞当たり約4コロニー 6）5×10⁴個のHL-60細胞当たり約15コロニー 7）2.5×10⁴個のヒーラ細胞当たり6コロニー 8）３日後に増殖抑制が消失 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION tumoricidal T lymphocytes The method of producing, tumoricidal T lymphocytes activation (tumoricidal T lymphocyte), a method for the production and proliferation, as well as tumoricidal T lymphocytes A composition suitable as a medium for the activation, production and growth of E. coli. Protection by cellular immunity plays an important role in the elimination of pathologically altered endogenous cells such as, for example, virus-infected cells or tumor cells. In this case, cytotoxic T lymphocytes utilize surface antigens to recognize these altered endogenous cells. These surface antigens are protein fragments that are usually formed by cells and are present on the cell surface by binding to the so-called major histocompatibility complex (MHC) surface receptor (Zinkernagel et al., Nature 248 (1974), 701). -702 and Babbit et al., Nature 317 (1985), 359-361). However, if the differences between these surface antigens on tumor cells and the corresponding antigens on healthy cells are very slight, the immune system is not likely to form tumoricidal T lymphocytes that can eliminate tumor cells. For this reason, attempts have already been made to induce protection against such tumor cells by cellular immunity. Attempts to achieve active immunity with non-specific immunostimulators, such as vaccines derived from Bacillus Calmette-Guerin (BCG), Corynebacterium parvum, or tumor cell extracts, were first made. (Terry and Rosenberg, eds., Immunotherapy of Human Cancer (1982), Elsevier North Holland). Even better results have been obtained with the concept of so-called adoptive immunotherapy. In this case, the patient's lymphocytes are activated in vitro and then reimplanted. In most cases, lymphocytes are activated in vitro by the addition of interleukin 2 to become promiscous killer cells (D. Thiele et al., Immunology Today 10 (1989), 375-381). The resulting cytotoxic lymphocytes have since been called lymphokine-activated killer cells (LAK cells) (Rosenberg, Immunology Today 9 (1988) 58-62). Unlike cytotoxic T lymphocytes, LAK cells and their effects on tumor cells do not depend on the correct expression of MHC genes for recognition of tumor antigens, and unlike natural killer cells of the immune system, LAK cells It is also effective on newly born tumor cells. The first clinical results have already been achieved with LAK cells. However, this form of adoptive immunotherapy has the disadvantage of interleukin-2 side effects, which require relatively high doses over time. This leads in particular to increased capillary permeability leading to organ dysfunction (Rosenberg, Immunology Today 9 (1988), 58-62, Rosenstein et al., Journal lmnunology 137 (1986), 1735-1742 and Ettinghausen et al., S. urg. Forum 37 (1987), 388-389). In addition, LAK cells are also obtained upon stimulation with interleukin-2, which points to healthy endogenous cells (B. Chen et al., Cell. Immunol. 118 (1989), 458-469). As more effective approaches to adoptive immunotherapy are being explored, lymphocytes to be activated have been cultured in the presence of autologous tumor cells (mixed lymphocyte tumor culture, G. Fossati et al.). G. Degiovanni et al., Eur. J. Immunol. 18 (1988), 671-676; Wolfel et al., J. Exp. Med. 170 (1989), 797-. 819; Darrow et al., J. Immunol. 142 (1989), 3329-3335 and Notter et al., Int. J. Cancer 45 (1990), 834-841). In addition, methods for expanding tumor infiltrating lymphocytes (TILs) in vitro have been described (Yron et al., J. Immunol. 125 (1980), 238-245). Unlike LAK cells, which are available from peripheral blood cells, obtaining tumor infiltrating lymphocytes requires removal of tumor tissue from the patient. This considerably limits their therapeutic application. Tumoricidal T lymphocytes and methods for their production are described in WO 94/23014. According to this, tumoricidal T lymphocytes are produced by co-culture of lymphocytes with a mammalian cell line with specific properties. The role of the cell surface sialoglycoprotein (later named CD43) in T lymphocyte proliferation has been described by Menzer et al. Exp. Medicine 165 (1987) 1383-1392. However, the antibodies described by Menzer stimulate T lymphocytes only in the presence of monocytes. Vargas-Cortes et al., Scand. J. Immunol. 27 (1988) 661-671, describes the stimulation of peripheral blood lymphocytes (PBL) by anti-CD43 antibodies. The described method enhances the spontaneous cytotoxicity of human PBL, its effect is mainly directed at NK cells and increases the cytotoxicity of the cells against the tumor cell line K562. It is an object of the present invention to provide an improved and simplified method for the specific production of specific tumoricidal T lymphocytes such that the stimulation and proliferation of other T lymphocytes and especially NK cells is avoided. Was to provide. The purpose of this is to cultivate lysosomotropically pretreated lymphocytes with an anti-CD43 antibody to isolate tumor-killing T lymphocytes, a chronic myeloid leukemia cell line (K-562). , ATCC CTL 243) are achieved by a method for specifically producing tumoricidal T lymphocytes that does not cytotoxically destroy cells but only inhibits their proliferation for a limited period of time. Surprisingly, as described in WO 94/23014, it is not necessary to co-cultivate leukocytes (lymphocytes) with mammalian cell lines, but rather to cultivate lymphocytes that have undergone lysosomal pretreatment. It was found that when incubated with anti-CD43 antibody, surprisingly highly specific tumoricidal T lymphocytes were obtained. Tumoricidal T lymphocytes within the meaning of the present invention recognize a tumor cell in an antigen-nonspecific manner and induce apoptosis and / or as described in WO 94/23014. T cells that kill them via cell lysis. The tumoricidal T lymphocytes have: a) a tumoricidal effect on the tumor cell lines M0LT-4, Jurkat, THP-1, HL-60, HeLa, K-562, Malme3 M and / or Y79, and b 2.) that during the growth of these cells in the presence of the cell lines HB654 or HB617, interleukin 2 cannot be detected from the culture supernatant of these tumoricidal T lymphocytes with a detection limit of 0.5 IU / ml. It is characterized by. Tumor-killing killer T cells are not natural killer (NK) cells. Compared to tumor-infiltrating lymphocytes, they have broader tumoricidal activity and are therefore more suitable for therapeutic applications. Unlike natural killer cells, the tumoricidal cells produced by the method according to the invention are T cells. A further criterion for distinguishing NK cells from tumorigenic cells is that NK cells recognize and destroy cytotoxically the tumor cell line K-562, whereas tumoricidal T cells inhibit the proliferation of the cell line K-562. It is only suppressed for a limited period. Inhibition for a limited period within the meaning of the present invention means that only proliferation of cells in a cell culture is suppressed without dying, preferably their proliferation is completely suppressed. Means that. Growth inhibition is reversible and is eliminated by separating tumorigenic T lymphocytes from cells of cell line K-562. In this regard, a tumoricidal effect means not only the killing (especially lysis) of the studied tumor cell line, but also its inhibitory effect on proliferation. This tumoricidal effect is, for example, that tumor cells lines that are morphologically distinct from tumoricidal T lymphocytes disappear from the culture when cultured with tumoricidal T lymphocytes for an extended period of time, or at least their proliferation is reduced. The fact that it is delayed can be detected, for example, by cytotoxicity tests familiar to those skilled in the art. The tumoricidal T lymphocytes are preferably CD3 positive (CD3 ⁺ ) and / or CD4 positive (CD4 ⁺ ). Lymphocytes within the meaning of the invention are understood to be, for example, the preparation of leukocytes obtainable from whole blood. Such methods are known to those skilled in the art. For example, a mononuclear cell fraction (PBMNC) containing blood lymphocytes can be obtained by gradient centrifugation (Ficoll gradient). In order to form specific tumorigenic T lymphocytes, it is necessary to pretreat PBMNC obtained in this manner. Cells are pretreated with a lysosomal substance such as L-leucyl-leucine methyl ester or a similar ester. Such substances are described, for example, in PL. Triozzi et al., Immunopharmacology 28 (1994) 39-45; CSRosenfeld, Stemcells, Dayt 12 (1994) 198-204; Seo, Cancer lnmunol. Immunother. 38 (1994) 277-280. Lysosomal pretreatment can yield a fraction of viable lymphocytes that are rich in tumoricidal T lymphocyte progenitor cells. The anti-CD43 antibody is a cell surface molecule CD43 (DeSmet, W. et al., Schlossman, SF et al. (Eds.) Leukocyte Typing V, pp. 1706-1707, Oxford United Kingdom: Oxford University Press, 1995) Is understood to be an antibody to CD43 is a sialoglycoprotein produced on cells of the hematopoietic system-except for certain subpopulations of dendritic cells and B lymphocytes-expressed on all cells of the immune system (Fukuda, M., Glycobiology 1 [ 1991], 347-356). Such antibodies are preferably directed against a portion of the CD43 molecule that is involved in binding CD43 to MHC class I molecules. Antibodies can be monoclonal or polyclonal and can be produced by immunization, synthetic or recombinant methods. Either intact antibodies or antibody derivatives that mediate characteristic binding can be used. However, it is preferred to use an antibody or antibody derivative which has the ability to crosslink cell surface CD43 molecules in a manner similar to a complete CD43 antibody. Differentiation of progenitor cells (CD3-positive, leucylleucine methyl ester-resistant lymphocytes) into tumoricidal T lymphocytes requires the surface markers CD43 (binding to MHC-I on stimulator cells) and CD2 (stimulatory cells). (Binding to CD58 on cells) has been shown to be involved. The mammalian cell line described in WO 94/23014, which leads to the generation of tumoricidal T lymphocytes when co-cultured with lymphocytes, clearly differentiates progenitor cells via the surface markers described above. It has been shown to cause. Surprisingly, it has been found that a similar effect can be obtained with the anti-CD43 antibody alone. In one preferred embodiment, one to improve the yield of tumoricidal T lymphocytes, and preferably a pair of anti-CD2 antibodies (directed to two different epitopes on CD2) stimulated by T cells. Or add some anti-CD2 antibodies (Schwartz, M. et al., J. Immunol. 154 (1995), 5813-5820; Moingeon, P. et al., Immunol. Rev. 111 (1989), 111-140). . Conveniently, the lymphocytes are cultured with anti-CD43 antibodies in conventional media for several days, preferably 5 to 30 days. The medium is preferably serum-free. When preparing autologous tumoricidal T lymphocytes, it is particularly preferable to use autologous serum for culture. Tumoricidal T lymphocytes obtained in this manner can be administered to patients as therapeutic agents, optionally after purification. Surprisingly, it has been shown that culture with anti-CD43 antibodies yields specific tumoricidal T lymphocytes from lymphocytes that are not restricted to HLA and have a broad spectrum of tumoricidal activity. In this regard, tumoricidal activity is understood to be a killing effect on the corresponding tumor cells, in particular an apoptosis-inducing and / or lysing effect, as well as an inhibitory effect on the growth of these tumor cells. It is preferable to use blood lymphocytes as the lymphocytes. However, it is also possible to use tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) as well as lymphocytes from the spleen or lymph nodes. The lymphocyte preparation is preferably purified before use. When blood lymphocytes are used, it is advantageous to remove red blood cells. Prior to culture with the anti-CD43 antibody, the fraction of progenitor cells of tumoricidal T lymphocytes is enriched. For this purpose, preferably L-leucyl-L-leucine methyl according to Thiele and Lipsky (The Journal of lmunology, Vol. 136, No. 3 (1986), p. 1038-1048). Lysosomal treatment by incubation with esters removes monocytes, macrophages, NK cells, suppressor T cells, and alloantigen-reactive cytotoxic T cells and their precursor cells. To carry out the method according to the invention, the lymphocytes are first preferably isolated from the blood or tumor of the donor, by known methods, such as Ficoll density gradient centrifugation. Subsequently, the lymphocytes remaining after lysosomal treatment are cultured in a conventional lymphocyte medium together with an anti-CD43 antibody. The antibody concentration in the medium is between 1 ng / ml and 100 μg / ml, preferably 10 μg / ml. Culture is continued until activation of the tumoricidal T lymphocytes is detectable. This usually requires about 8 days of culture. The culture according to the invention activates the tumoricidal T lymphocytes without the need for the addition of growth or differentiation factors such as lymphokines or especially interleukin 2. This is particularly beneficial for therapeutic applications of the resulting tumoricidal T lymphocytes, since such factors can cause side effects in therapeutic applications. Using the method according to the present invention, the above-mentioned human tumoricidal T lymphocytes can be obtained without the need for addition of a differentiation factor such as lymphokine or interleukin 2, which may lead to side effects in treatment. . Thus, a further subject of the invention is the use of the method according to the invention for producing a therapeutic agent which can be used for tumor therapy. For such therapeutic uses, the tumoricidal T lymphocytes produced in accordance with the present invention can be prepared by methods known to those of skill in the art, such as centrifugation and resuspension of the pellet in saline, for example. (Eg, 3 times), optionally isolated and dissolved in a medium (eg, saline) suitable for administration. In addition to ex vivo activation of the lymphocytes to tumoricidal T lymphocytes, lymphocytes can also be activated in vivo by applying anti-CD43 antibodies to the tumoricidal T lymphocytes. For such therapeutic applications, the antibodies are administered dissolved in a medium suitable for administration, such as saline. The tumoricidal T lymphocytes can also be used to exclude tumor cells in cell preparations ex vivo. It can preferably be used to eliminate (clear) tumor cells from stem cell isolates (eg, bone marrow stem cells) by culture with tumoricidal T lymphocytes. Stem cells purified in this manner can be re-transplanted into a patient after, for example, radiation or chemotherapy (autologous bone marrow transplant). Antibodies against the human CD43 molecule are described by DeSmet, W. et al. (Schlossman S.F. et al. [Ed.], Leukocyte Typing V, pp. 1706-1707, Oxford United Kingdom: Oxford University Press, 1995). ing. For example, the anti-CD43 antibody named "6F5" is suitable for the method according to the present invention. In one preferred embodiment, the tumoricidal T lymphocytes obtained after culturing with an anti-CD43 antibody are expanded. This propagation is preferably carried out by the method described in PCT / EP97 / 01924. The cell line HB 654 was established on March 24, 1993 in "(Deutsche Sammlung fur Zellkulturen und Mikroorganismen GmbH)", Maschereroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, DSM ACC No. 2122 No. has been deposited. The cell line HB 617 was deposited on January 3, 1994 with "(Germany) German Cell Culture and Microorganism Preservation Institute", Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braurlschweig as DSM ACC No. 2166. The invention will be apparent from the following examples, publications and tables, the scope of which is to be protected by the following claims. The method described should be understood as an example which describes the subject of the present invention even after modifications have been made. The characteristics of the antibodies referred to in the examples are specified in the International Leucocyte Typing Workshop. Instead of the above antibodies, it is also possible to use antibodies with similar binding specificities. Example 1 Culture of lymphocytes with anti-CD43 antibody Mononuclear cells obtained from human donor peripheral blood (PBMNC) were separated from erythrocytes by gradient centrifugation (lymphocyte separation medium, Boehringer Mannheim GmbH (BM)). Washed twice with acid buffered saline (Boehringer Mannheim GmbH (BM)), Thiele and Lipsky (The Journal of lmunology, Vol. 136, No. 3 (1986), p. 1038-1048). ), And incubated with 250 μM leucyl-leucine methyl ester (Boehringer Mannheim GmbH (BM)) at a density of about 5 × 10 ⁶ cells / ml RPMI-1640 medium (Boehringer Mannheim GmbH (BM)) for 20 minutes at room temperature I do. After washing twice with RPMI-1640 medium, 2 × 10 ⁶ viable cells / ml in X-vivo-20 medium (Bio-Whittacker) supplemented with 6F5 anti-CD43 antibody to a concentration of 10 μg / ml. And culture at 37 ° C. in an 8% CO ₂ atmosphere. On the fifth day from the start of the culture, half of the medium is supplemented, and a new 6F5 anti-CD43 antibody is added to a final concentration of 10 μg / ml. Cells are used for Example 3 on day 10 from the start of culture. Phenotyping of the cells on day 10 of culture shows that> 95% of the cells are CD3 positive. No cells with markers CD14 and CD16 are found. Example 2 Culture of Lymphocytes with Anti-CD43 and Anti-CD2 Antibodies Lymphocytes are prepared from human donor blood by gradient centrifugation and leucyl-leucine methyl ester treatment as described in Example 1. 10% heat-inactivated (56 ° C./30 min) autologous serum was added and the anti-CD43 antibody 6F5 and the anti-CD2 antibodies TS2 / 18 and VIT13 (Schwarz, M. et al., J. Immunol. 154 (1995), 5813) Lymphocytes were suspended at a density of 1 × 10 ⁶ cells / ml in Iscoves-modified DMDM (Gibco) supplemented with 585820) at a concentration of 10 μg / ml. On day 5, half of the medium containing the antibody was replenished. The cell count on day 10 from the start of culture indicated that lymphocyte proliferation was 2.2-fold. Example 3 Effect of tumoricidal T lymphocytes The tumoricidal T lymphocytes obtained according to Example 1 are added to a culture of a human tumor line (see Tables I and II). The tumoricidal effect on these tumor cells is observed microscopically. The tumoricidal T lymphocytes according to the invention kill these various tumor cell lines or inhibit their proliferation. 1) Ratio of effector cells / tumor cells 2) Evaluation by microscope after 48 hours 3) After 14 days of culture 4) Growth inhibition 5) About 4 colonies per 5 × 10 ⁴ THP-1 cells 6) 5 × 10 ⁴ About 15 colonies per HL-60 cell 7) 6 colonies per 2.5 × 10 ⁴ HeLa cells 8) Loss of growth inhibition after 3 days

【手続補正書】【提出日】１９９９年５月１０日（１９９９．５．１０）【補正内容】請求の範囲 1．向リソソーム性前処理を受けたリンパ球を抗CD43抗体とともに培養すること、および殺腫瘍性Tリンパ球を単離することにより、慢性骨髄性白血病細胞系K-5 62（ATCC CCL 243）を細胞傷害的に破壊せずにそれらの増殖を限られた期間にわたり抑制するのみである殺腫瘍性Tリンパ球を特異的に製造するための方法。[Procedure for Amendment] [Date of Submission] May 10, 1999 (May 10, 1999) [Details of Amendment] Claims 1. Chronic myelogenous leukemia cell line K-562 (ATCC CCL 243) was obtained by culturing lysosomal pretreated lymphocytes with anti-CD43 antibody and isolating tumorigenic T lymphocytes. A method for specifically producing tumoricidal T lymphocytes that only suppresses their proliferation for a limited period of time without damaging them.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, S D, SZ, UG, ZW), UA (AM, AZ, BY, KG) , KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT , AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, F I, GB, GE, GH, HU, ID, IL, IS, JP , KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, M W, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD , SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW

Claims

[Claims] 1． Culturing lymphocytes subjected to lysosomal pretreatment with anti-CD43 antibodies , And by isolating tumorigenic T lymphocytes, the chronic myeloid leukemia cell line K-5 62 (ATCC CCL 243) for a limited period of time without their cytotoxic destruction. A method for specifically producing a tumoricidal T lymphocyte that only suppresses or suppresses T lymphocytes. 2. The method of claim 1, wherein one or several anti-CD2 antibodies are added. 3． 2. The method of claim 1, wherein autologous serum is added to the culture. Four. L-leucyl-leucine methyl ester used for lysosomal pretreatment 4. The method of claims 1-3.