JP2000502458A

JP2000502458A - Method and apparatus for processing by complexing liquid media

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Publication number: JP2000502458A
Application number: JP10517256A
Authority: JP
Inventors: ジノ，フレデリック
Original assignee: ベーイーオーメリュー
Priority date: 1996-10-04
Filing date: 1997-10-06
Publication date: 2000-02-29
Anticipated expiration: 2017-10-06
Also published as: US6218116B1; FR2754344A1; CA2239499A1; WO1998015832A1; FR2754344B1; EP0882233A1; EP0882233B1; JP3843134B2; CA2239499C; DE69719312D1; DE69719312T2; ATE233404T1

Abstract

(57)【要約】この発明は、一種または数種の構成物を含む液体媒体を複合化によりこの液体媒体中の複数の配位子の存在を決定する処理のための方法および装置に関するものであり、ａ）それぞれ異なる複数の対配位子が固定化されている複数の結合部位がその上に分布した多複合化用の支持体を用意し、ｂ）前記液体媒体を前記複合化支持体に接触させ、それにより前記配位子が前記対配位子と組み合わされることから成る。本発明は、各配位子／対配位子複合体の安定性が、参照パラメーターと呼ばれる前記支持体の条件を設定する少なくとも一つの外因性パラメーターに依存し、支持体上の結合部位がこのサイトでそれぞれ異なる値を持つ前記外因性パラメーターによって区別され、異なる配位子／対配位子複合体の安定性をそれぞれ決定する外因性参照パラメーターの予め定められた最適値によって、対配位子は異なる結合部位間に分布する。この発明は混成による核酸の順位付けに有用である。 (57) [Summary] The present invention relates to a method and an apparatus for a process for determining the presence of a plurality of ligands in a liquid medium by compounding a liquid medium containing one or several constituents, a) Providing a support for multi-complexation having a plurality of binding sites having a plurality of paired ligands immobilized thereon, b) contacting the liquid medium with the complexed support; The ligand is combined with the counter ligand. The present invention provides that the stability of each ligand / pair ligand complex depends on at least one extrinsic parameter that sets the conditions of the support, referred to as reference parameters, and that the binding site on the support The pre-determined optimal value of the extrinsic reference parameter, which is distinguished by the extrinsic parameters, each having a different value at the site and which respectively determines the stability of the different ligand / pair ligand complex, Are distributed between different binding sites. The invention is useful for ranking nucleic acids by hybridization.

Description

【発明の詳細な説明】液体媒体の複合化による処理のための方法および装置この発明は、一般に、一種または多種の成分を含む液体媒体の複合化により前記液体媒体中の遊離状態の複数または多様な種々の配位子の存在を決定する処理に関する。この説明及び特許請求範囲において、次の定義が採用される。「配位子」は、一つまたは複数の非共有結合によって「対配位子」と呼ばれる他の構成要素または分子に特異な様式で結合できる化学的、生化学的または生物学的性質のある構成要素または分子を意味すると定義する。この定義から特に含まれるものに、相互に及び相補的様式で複合体を形成できる異なる生物学的または生化学的構成要素、特にバイオポリマーがある。 -それらは、例えば、それらはポリペプチド、特にエピトープまたは抗原（対配位子）に特種な様式で結合できる抗体（配位子）といったポリペプチド、またはその反対の、ポリペプチドであり、 -またはそれらには、以下の説明に例示されるように、一重鎖形でオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに相補的様式で結合できるある核酸または核構成材が含まれる。配位子が対配位子と結合または一対化、即ち複合体の形成を行う化学的特質の反応または平衡を、以後「複合化」（complexing）用語で呼ぶことにする。この反応または平衡の生成物を、以後「複合体」（complex）の用語で呼ぶことにする。核構成材料またはマクロ分子の場合には、この複合体を以後「複式体」（duplex ）の用語で呼ぶことにする。「核構成材料」または「核酸」は、改質等が行われているヌクレオチドの少なくとも一つの非分枝で線形の鎖を含むあるマクロ分子を意味すると理解される。この定義に含まれるものに、明らかに、デオキシリボ核酸、その修正体、その他、及びリボ核酸、その修正体、その他が挙げられる。このようなマクロ分子は一重鎖または二重鎖でもよいし、他のある第二次または第三次の分子構造を有していてもよい。実際には以後の説明及び実例においては、この核構成材料は配位子を含有し、直接この処理を受けるものかまたはそこから液体媒体が得られるものであり、次にこの発明に従い処理される。「オリゴヌクレオチド」は、天然の核酸またはその構成成分、即ち糖、窒素質塩基または燐酸基の少なくとも一つが改質された核酸から成る少なくとも５個のモノマー、好ましくは少なくとも７個、例えば８個のモノマーを含有するポリヌクレオチドを意味する。「支持体」は、直接または間接に、共有結合的及び非共有結合的にその表面に対配位子が永久的に固定化または付着されたある基板を意味する。基板は、例えば不活性で透明の材質のシートのような自己支持性か、例えばガラススライド上のアクリルアミドの層のような剛性なベースでそれ自体が支持されている。「表面」は、固体基板であれ、見かけ表面より真の表面が大きい多孔性基板であれ、対配位子に接近可能の基板の表面を意味すると理解される。以後の説明及び実例では、オリゴヌクレオチドは上記定義の対配位子を構成している。一方の核構成材料または核酸と他方の相補的オリゴヌクレオチドとの間の複合化反応を、以後は「混成（hybiridization）」の用語で呼ぶ。文書、ＷＯ-９２／１０５５８及びＷＯ-９３２２６８０、並びにいわゆる「可逆的ドットブロット」生物検定様式によれば、一またはそれ以上の核酸成分を含む核酸試料の場合に液体媒体の複合化、即ち混成によりこの液体媒体中の遊離状態の複数の異なる核酸の断片、分節または連鎖（配位子）の存在を決定する処理方法とその装置が記載されている。この処理では。主に、文書（６）と（７）に開示された周知の原理と方法による混成による核酸試料の順序付けに適用される。この方法によれば、ａ）核酸フラグメントに相補的なヌクレオチド配列とそれぞれに複合化が可能であり、それぞれが異なる複数のオリゴヌクレオチド（対配位子）がその中に固定化され、相互に分離した複数の離散型カップリングサイトまたはゾーンがその表面に分布した多複合化用のバイオチップ型の支持体を用意する。ｂ）一つのカップリング位置から他の位置にかけて、等温条件下で、液体媒体、即ち核酸試料とこの複合化支持体とを接触させ、それにより遊離ヌクレオチド配列は固定されたオリゴヌクレオチドとそれぞれ一対となり、結果としてこの複数複合化の支持体に付着する。ｃ）元の液体媒体中の異なるヌクレオチド配列の存在及び／または量を表現する信号及び／または情報を発生するように、得られた異なる複合体即ち混成体の存在及び／または量を表現するパラメーターを多複合化支持体の異なるカップリングサイトで観察する。好ましくは、これら複合体は、核酸試料の成分の標識化、または形成し、支持体に付着した異なる混成体の標識化を利用して観察される。上記のように、このプロセスは完全に等温条件下で行われる。即ち、液体媒体を多複合化支持体に接触させる時及び／または混成の後のこの支持体を洗浄する時に一つのカップリングサイトから他のサイトにかけて同じ混成温度を設けて行う。文書、ＥＰ-０，５３５，２４２によれは、同様な方法が記載され、同じく等温条件下で操作することが提案されている。これによれば、各カップリングサイトにおけるこのサイトに特定のオリゴヌクレオチドの濃度は作用温度の関数として選択され、相補的なヌクレオチド配列により得られた対応する複合体の安定性を促進する。この文書によれば、この濃度は、その温度が変動する洗浄液体により実施され、熱勾配洗浄と不正確に称している洗浄段階の間に、各カップリングサイトで溶出した相補的なヌクレオチド配列のパーセンテージを観察することで選択される。上記の解決法は文書、ＷＯ-９２／１０５８８で確認された技術的困難を免れず、これはまだ解決していない。実際、先決した混成温度とオリゴヌクレオチド（対配位子）の配列の所定の長さでは、核酸プローブのそのターゲットの相補的配列との混成で得られる複合体の安定性はこの配列によって変動する。つまり、相互にヌクレオチドの一つのみ異なる、即ちある場合はＴで他の場合はＧ、二つのオリゴヌクレオチドは、同じ長さで類似配列であるのに、同じ安定性ではそれぞれの相補的核酸を混成を行わない。換言すれば、得られる複合体の安定性は温度に依存するので、形成が可能の複合体の最低の安定に充分な冷温度で、核酸試料は多複合化支持体に担持したオリゴヌクレオチドプローブと混成すべきであり、そうでないと混成後に虚偽のネガティブ、即ちオリゴヌクレオチドプローブがその相補的配列が試料中に存在するのに混成信号を発生しない、が得られることになる。しかし、この手法で工程を遂行することで、オリゴヌクレオチドプローブ完全には相補的でない配列と充分に安定な複合体を形成する場合がある。このような場合には、虚偽のポジティブ、即ちオリゴヌクレオチドプローブがその相補的配列が核酸試料中に存在しないのに混成信号を発生する、が得られることになる。その結果、これら虚偽のネガティブおよび虚偽のポジティブは核酸試料の分析、特に混成による配列化のための分析に誤差を導入するので、上記した技術的解決法を度々利用できなくする。従って、この発明の目的は上記のような複合化による処理、特に混成における信頼性を向上させることである。この発明の出発点は、各配位子／対配位子複合体の安定性または信頼性が、以後参照パラメーターと呼称し、多複合化支持体の条件を設定する少なくとも一つの外因性パラメーターに直接的または間接的に依存することの観察である。「外因性パラメーター」は、配位子及び／または対配位子に対して非本質的な、即ちそれらからは独立したパラメーターまたは条件を意味すると理解される。多複合化支持体を条件設定するかまたは条件設定ができるそのような外因性の参照パラメーターは例えば、 -温度のような支持体に応用できる物性パラメーターまたは条件、 -実質的に全ての対配位子と一対化が可能の抗-対配位子の表面積のような前記支持体の表面に存在するまたはその表面で利用可能な化学的、生化学的または生物学的パラメーターまたは条件、 -選択的には、液体媒体に対するその湿潤性または表面張力のような支持体の表面に確立した物理化学的パラメーター。更なる例として、核酸タイプの配位子及びオリゴヌクレオチドタイプの対配位子の場合における外因性パラメーターは、核酸及び／またはオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列には帰属せず、例えば基本的な窒素質核酸塩基のどれか一つにおいてそれぞれの存在頻度に差異があるパラメーターまたは特性を意味すると理解される。この発明は次に、以下の二つの特性を組み合わせることで特色が現れる。 -一方では、全ての支持体において、例えばその全表面で、結合部位は外因性参照パラメーターの関数として区別され、そのパラメーターは異なる結合部位においてはそれぞれ異なる値を有す。 -特に異なる配位子／対配位子複合体の安定性を決定する外因性参照パラメーターの先決した最適値の関数として、対配位子はぞれぞれ異なる結合部位の間に分布している。従ってこの発明によれば、対応する対配位子が固定化された多複合化の支持体上の各結合部位は、対応する配位子／対配位子複合体の安定性に関する外因性参照パラメーターの最適値で機能し、この最適値が少なくとも一つの直接に隣接する結合部位の最適値とは相違させることが可能である。この発明の利点により、複数複合化の特に信頼性が高く、正確であり、敏感である様式が達成され、これは解像度も優れている。「カップリング」は支持体の表面に対配位子を永久に固定化できる共有結合またはその他のいずれかの結合を意味する。この発明は、例えば直接複合化または競合複合化による異なる生物検定形式に従って実行される。この発明は、任意に「サンドイッチ」形式により実行される。この形式によれば配位子は固定された対配位子及び液体媒体中の遊離状態にある試料と一対化が可能である。好ましい実施例の方法によれば、三つの異なる実用性のある様式が選択される。 -第一の様式によれば、外因性参照パラメーターの同一の最小値を適用して液体媒体を複合化支持体に接触させる。この最小値は実質的には全ての配位子と対配位子を複合化するのに十分な値である。次に支持体を、異なる結合部位にそれぞれ異なり先決しておいた外因性参照パラメーター値を適用することで洗浄する。これをこの洗浄段階の間、適用する。 -第二の様式相によれば、支持体と液体媒体との同じ接触を、異なる結合部位にそれぞれ異なり先決しておいた第一の外因性参照パラメーター値を適用することで遂行する。次に支持体を、外因性参照パラメーターのそれぞれ異なる第二の先決した値に異なる結合部位に維持して洗浄する。第一の値は、それぞれ外因性参照パラメーターの第二の値と同一または異なる。 -第三の様式によれば、支持体を、異なる結合部位にそれぞれ異なり先決しておいた外因性参照パラメーター値を適用することで液体媒体と接触させる。これを単一複合化または混成の間に適用する。混成された支持体を次に比較的冷たい一定の温度で洗浄液体により洗浄する。いわゆる均質型検出様式では、当然のことながら洗浄は本質的なものではない。上記定義の第一の様式は、各結合部位において、対配位子の量または濃度は、一方では考慮する配位子に実際に相補的である全ての配位子と、他方では同時にまたは寄生的にこの対配位子と一対となり得る全ての配位子と複合体を形成するに十分であることを仮定している。好ましくは、特に平坦姿勢の多複合化支持体には、支持体の少なくとも一基準方向、例えば長方形支持体の場合のその幅に、外因性参照パラメーターの勾配のような空間階調が確立されている。次いでこの空間階調は、異なる結合部位間にそれぞれ対配位子を分布して、異なる結合部位の位置と配置を固定する。この発明の変形または付加項目として、多複合化支持体上の結合部位は、このカップリング位置において異なる値を持つ他の一つの外因性参照パラメーターの関数として区別され、加えて対配位子は、配位子／対配位子複合体の安定性もまたそれぞれ決定する他の外因性参照パラメーターの予め定められた最適値の関数としてこのカップリング位置間に分布される。好ましくは、異なる配位子／対配位子複合体類の安定性がそれに依存する他の一つの外因性パラメーターは、異なる配位子／対配位子複合体類の安定性にそれぞれ要求される前記の他のパラメーターの値の平均値に設定される。実例では、この他の外因性パラメーターは、多複合化支持体と接触される液体媒体のｐＨまたはイオン強度であり、このパラメーターは混成バッファーの組成で決まる。その異なる結合部位に関して、この発明により設計され条件設定される多複合化支持体は、配位子の検出及び／または定量化に好ましく使用される。この目的のために幾つかの様式が考えられる。 -異なる配位子／対配位子複合体類の存在及び／または量を表す変数を、特に異なる結合部位で走査することで観察し、元の液体媒体中の異なる配位子の存在及び／または量を表す信号及び／または情報を取得する。 -好ましくは、異なる配位子／対配位子複合体は、それ自体は周知である次の操作の少なくともいずれか一つを用いて観察する。即ち、液体媒体の成分の標識化及び支持体に付着した異なる配位子／対配位子複合体の標識化。一般的には、支持体に接触させる液体媒体は一種または複数種の異なる構成要素を含有し、生物学的試料または試材等の試料から得られ、分析されが、これは二つの様式に従う。 -試料を上記方法に従い、直接に処理、特に多複合化支持体と直接に接触させる。 -または試料が、それぞれ異なる構成要素に同一またはそれから直接誘導され、構成要素の代表物である、処理された液体媒体中の一種または多種の成分を得るために選択された少なくとも一つの予備的操作を受ける。更に一般的には、異なる配位子が付着する複合化支持体を任意に、この支持体から複合化されなかった成分または不安定な形態で対配位子と複合化した成分を分離するために及び／または異なる配位子を差動的にまたは他の方法で溶出または放出ために選択した洗浄等の少なくとも一つの継続操作を受ける。この発明の応用の好ましいが独占的ではない分野は、核酸生成物または化合物の処理と分析に関するもの。この場合、配位子は、特に一重鎖形にある遊離ターゲットヌクレオチド配列から成る核酸であり、この核酸は、対応する対配位子から成り、他の固定または付着された相補的プローブヌクレオチド配列と混成が容易である。更に好ましくは、核構成材料としての液体媒体は、それぞれ異なる数種の配位子、即ち混成用の数種の領域またはセグメントを含むかまたは表現する単一成分、即ち一つの核酸から成り、それによりこの同一成分は異なる対配位子、即ちオリゴヌクレオチドとそれぞれに一対化する。従ってこの場合は、少なくとも一つの核酸鎖のヌクレオチドの連続が、対配位子のプローブヌクレオチド配列に対してそれぞれ相補的であるターゲットヌクレオチド配列に従って、複数の混成領域、それ故に複数の配位子を決定する。ヌクレオチドまたは核酸の生成物並びに化合物に応用されるこの発明による処理は、例えば次の応用の少なくともいずれかの一つ、即ち液体媒体の核酸成分の混成による配列化、この核酸成分の再配列化、核構成材料のマッピング、核構成材料または試料の分析と同定、核構成材料の分類、核構成材料のスクリーニング、遺伝子分析（例えば、参考文献８を参照）、バクテリアまたはウイルス病原性剤の検出に使用される。この発明の応用の一つは、混成、特に核酸材料の重なり配列の決定による核酸材料の順序付けである。この順序付けの原理及びその様式は刊行物（６）と（７）に記載されており、この説明の必要の箇所にはその内容が参照として組み込まれている。核構成材料のヌクレオチド配列を再構築するためにこのようにして得られた情報の分析と処理については、刊行文献（９）と（１０）に記載されている。この発明の他の応用は、配列の強制的再構築を行わずに混成プロフィルを決定することで微生物または微生物に関連する遺伝子を同定することである。これらの全ての応用のために、液体媒体は一つの同じ核酸フラグメントまたは数種の異なる核酸フラグメントを含む核酸試料から得られる。この核酸試料に、次ぎの操作から選択した少なくとも一つの予備的操作を任意に実施してもよい。即ち、変性、溶解、フラグメンテーション、クローン化及び増幅。この発明による処理の二つの異なるケースを念頭に入れておくべきである。 -第一のケースでは、液体媒体それぞれ異なる配位子から成る数種の異なる成分を含む。そこでは、この異なる成分は付着し、相互に分離しており、言わば多複合化支持体上で分解される。この様式は次の応用の少なくとも一つで遂行される。即ち、この異なる成分の同定、定量化、分離及び分別。 -他方のケースでは、液体媒体は、それ自体がそれぞれ異なる配位子から成るまたは表現する単一成分を含む。そこで、この成分は異なる配位子類とそれぞれに一対となる。この発明による処理のための装置は以下から成る。 -その上に例えばマトリクス状に相互に分離した複数のカップリンサイトが配置または分布している多複合化支持体。カップリンサイトにはそれぞれ異なり、前記配位子とそれぞれ複合化が可能の複数の対配位子が固定化されている。 -前記配位子と前記対配位子とをそれぞれ一対とし、前記支持体にそれらを付着させるように設計された液体媒体を支持体に接触させる手段。この装置は、一方では外因性参照パラメーターの関数として、前記サイトにおいてぞれぞれ異なる前記パラメーターの値によっで支持体上のカップリンサイトを区別する手段を更に含み、他方では支持体上の対配位子が、外因性参照パラメーターの予め定められた最適値の関数として異なる配位子／対配位子複合体の安定性をそれぞれ決定する異なるカップリンサイトの間に分布していることを特徴にする。独占的ではないが好ましくは、選択される外因性参照パラメーターは温度であり、区別手段は少なくとも一つ基準方向に従って温度に温度勾配のような階調が生じるように設計されている。この場合好ましくは、装置は冷源と熱源を含み、その間を前記支持体が基準方向に伸びている。一例として、このような装置は、それぞれ支持体の異なるカップリン位置と連結し、各カップリンサイトでの配位子／対配位子複合体の存在及び／または量を表す少なくとも一つの観察された変数を検出し、一または複数の測定信号または対応する情報を伝達する一または複数のセンサーを含む。一例として、この装置は、例えばＣＤＤカメラのようなそれ自体多重の基本センサー類から成る単一センサー、または多複合化支持体の表面を走査する単一センサーを含む。例えば、核構成材料の分析または順序付けには、この同じ装置は、前に定めておいた数学的及び／または論理的操作に基ずいて、異なるセンサー類により伝達された信号を処理し、液体媒体中の成分を特定する情報を得るユニットを含むまたはそれに連結している。一例として、配位子／対配位子複合体の存在及び／または量を表す観察された変数は、発光または再発光（例えば、蛍光または冷光）の吸光度または強度、イオン化照射の強度、または光回折、核磁気共鳴、接触角変化、電気伝導率、ボルタンメトリー、電流測定、インピーダンス測定のような異なる配位子／対配位子複合体の他の物理的、光学的、電気的即ち誘電的または電気化学的の特性である。実施態様の例として、多複合化支持体は次の不活性材質の一つから成る。ガラス、ガラス質材料、多孔性の無機または非晶質材料及びプラスチック材。バイオチップが使用される時は、支持体と結合部位は伝統的の光リソグラフィ技術により得られる（刊行書Ｎｏ１１を参照）。実例としてこの発明を、以下に詳細に記す実験プロトコールに従いまた添付した図を参照して、核酸または核酸材料の処理に関して述べる。 -図の１ａから１ｄは、ｘ-軸上に簡略に記した同定されたオリゴヌクレオチド及び核酸フラグメントための、それぞれ４゜Ｃ、１０°Ｃ、２０°Ｃ及び２５゜Ｃにおける等温混成の結果を表す。観察された変数、即ち得られた異なる複合体の蛍光により再放射された光の相対値がｙ-軸にプロットされている。中実棒は完全な一対化を表し、オープン棒は外部不整合を表す。 -図２は、この発明による処理用の装置の断面を図示している。 -図３は図２に示した装置の上面図を図示している。 -図４は図２と３に示した装置の処理キャビティの拡大スケールの図を表す。 -図５は図２と３に示した装置の、手段としての処理及び測定キャビティに限定した上面図を図示している。 -図６は、この図の右に並べた記号説明で同定された異なる核酸フラグメント／オリゴヌクレオチド複合体の温度の関数とした観察した変数（蛍光）の変化を示す。 -図７は、図２と３による、更に特には図４に示した装置のキャビティに適合する多複合化支持板のための、選択したオリゴヌクレオチドの関数として、この板の幅または高さだけでなく長さに沿った結合部位の配置を表す。 -図の１ａから１ｄに類似した様式で、図８は、ｘ-軸上の同定された核酸フラグメントとオリゴヌクレオチド及びこの発明による多複合化支持体から得られた混成を、前記各図と同じ規則で、表したものである。実験プロトコール実験プロトコールは以下の計画による。Ｉ-この発明の基礎を成す問題点の論証１．１オリゴヌクレオチド（対配位子）の選択１．２オリゴヌクレオチドの合成１．３オリゴヌクレオチドをグラフト化する方法１．４混成と複合体の蛍光の視覚化１．５等温での混成の結果 II-熱勾配に基ずいてそのカップリング位置が区別された多複合化支持体の助力による問題点の解決２．１熱勾配の応用を可能とするこの発明による装置の説明２．２それらの予め定められた最適混成温度におけるオリゴヌクレオチドの位置決め２．３発明による熱勾配下の混成の結果２．４包括的なオリゴヌクレオチドへの「バイオチップ」の操作の外挿Ｉ-この発明の基礎を成す問題点の論証１．１オリゴヌクレオチド（対配位子）の選択固体支持体の表面に固定化したオリゴヌクレオチドによる核酸（配位子）の伝統的混成で遭遇する困難を示すために、このタイプの分析の代表であるオリゴヌクレオチドのモデルを選定した。選定したオリゴヌクレオチドの長さは８塩基であり、それは混成による順序付けが関与するタイプの応用には通常受容されている長さである（参照文献１と２）。Ｂ、Ｄ及びＪで示す３つの塩基を選択した。これらは、対応する二重鎖ＤＮＡｃの安定性の相違を特徴とする。ＡとＴのヌクレオチドがリッチである配列Ｂは、その相補的配列と相対的に不安定な複式体を形成しよう。一方、ＣとＧのヌクレオチドがリッチである配列Ｊは、その相補的配列と相対的に安定な複式体を形成しよう。ＣとＧのヌクレオチドと同じ数のＡとＴのヌクレオチドを含有する配列Ｄは、その相補的配列と中間の安定性の複式体を形成しよう。Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ等の最近接モデル（参照文献３参照）を用いて二重鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドの相対的安定性を粗くではあるが予測することが可能である。このモデルにより、ある温度における各複式体のためのその配列の関数とした自由結合エネルギィを計算することができる。これら三つ塩基配列（Ｂ、Ｄ及びＪで示す。以下を参照）から、Ｂ、Ｄ及びＪの配列の単変動に相当する他の七つの配列を決定した。固体の多複合化支持体に固定化したのはこれら１０のオリゴヌクレオチドである。これらは、その５’端部にこれらの固定化に必要なビオチン基を含有する（下の１．３を参照）。以下の表においては、三つの塩基配列を太字で記す。注欄の添え字”ｃ”は相補的配列を意味する。名称配列注ｂＡ５’ｂ-ＡＣＴＧＡＴＧＡ３’ Ｄｃに関し一重外部不整合ｂＢ５’ｂ-ＡＡＴＣＡＴＴＡ３’ ＡＴがリッチｂＣ５’ｂ-ＧＡＧＣＡＴＴＡ３’ Ｂｃに関し二重内部不整合ｂＤ５’ｂ-ＡＣＴＧＡＴＧＣ３’ ５０％ＡＴ、５０％ＧＣｂＥ５’ｂ-ＡＣＴＣＡＴＧＣ３’ Ｄｃに関し一重内部不整合ｂＦ５’ｂ-ＡＡＧＣＡＴＴＡ３’ Ｂｃに関し一重内部不整合ｂＧ５’ｂ-ＧＣＴＧＡＴＧＣ３’ Ｄｃに関し一重外部不整合またはＡｃに関し二重外部不整合ｂＨ５’ｂ-ＧＣＡＣＣＧＴＣ３’ Ｊｃに関し一重内部不整合ｂＩ５’ｂ-ＡＣＧＣＣＧＴＣ３’ Ｊｃに関し一重外部不整合ｂＪ５’ｂ-ＧＣＧＣＣＧＴＣ３’ ＧＣががリッチ６種の蛍光性オリゴヌクレオチド（標識化された配位子）をこれらの固定化したオリゴヌクレオチドにより混成した。これらは、この３つの塩基配列及び末端ヌクレオチドが異なるそれらの変形体に相補的なオリゴヌクレオチドである。これらはその５’端部にフルオレセインを含有する。名称配列注ｆＡｃ５’Ｆ-ＴＣＡＴＣＡＧＴ．３’ ｂＡに対して相補的ｆＢｃ５’Ｆ-ＴＡＡＴＧＡＴＴ３’ ｂＢに対して相補的ｆＤｃ５’Ｆ-ＧＣＡＴＣＡＧＴ３’ ｂＤに対して相補的ｆＧｃ５’Ｆ-ＧＣＡＴＣＡＧＣ３’ ｂＧに対して相補的ｆＩｃ５’Ｆ-ＧＡＣＧＧＣＧＴ３’ ｂＩに対して相補的ｆＪｃ５’Ｆ-ＧＡＣＧＧＣＧＣ３’ ｂＪに対して相補的１．２オリゴヌクレオチドの合成活性化ビオチン及びフルオレセイン誘導体を５’位にアーム-（ＣＨ₂）₆-ＮＨ₂ -を含有するアミンで機能化したオリゴヌクレオチド配列と結合して、ビオチンとフルオレセインで標識化したオリゴヌクレオチドを得た。１．２．１オリゴヌクレオチドの合成アミン含有オリゴヌクレオチド類を、製造者提供のプロトコールを用いたホスホアミダイト法に従い、ＡＢＩ３９４装置（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｒｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）で合成した。アミン含有アームのホスホアミダイト前駆体を含む全ての試剤はＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから提供された。支持体からの開裂と脱保護化の後、酢酸ソーダ溶液（３Ｍ）と冷エタノール（−２０°Ｃ）を添加してオリゴヌクレオチド配列が上記される（原文に誤り）。１．２．２オリゴヌクレオチド-５’ビオチン接合体の合成このアミン含有オリゴヌクレオチドを乾燥した後、０．１５ＭのＮａＣｌを含有する０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．８）に溶解した。次に、ＤＭＦ中のビオチン溶液（ビオチノイルアミドカプロン酸Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミドエステル、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）（５ｍｇ／ｌ）を添加する。３７゜Ｃで２時間加温放置した後、塩化アンモニウム溶液（１Ｍ）の１０ミクロリッターを添加して反応を停止する。次いで、ビオチン化したオリゴヌクレオチドを−８０゜Ｃでエタノールと酢酸ナトリウム（３Ｍ）中に沈降させ、純水に溶解し、逆相ＨＰＬＣにより精製する。その濃度を２６０ｎｍのＵＶ測定により求めた。１．２．３オリゴヌクレオチド-５’フルオレセイン接合体の合成アミン含有オリゴヌクレオチドを乾燥した後、０．１５ＭのＮａＣｌを含有する０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．８）に溶解する。次に、ＤＭＦ中のフルオレセインイソチオシアナート（Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液（１２．５ｍｇ／ｌ）を添加する。５５゜Ｃで２時間加温放置した後、塩化アンモニウム溶液（１Ｍ）の２５ミクロリッターを添加して反応を停止する。次いで、この蛍光性オリゴヌクレオチドを上記のように沈降させ、精製する。その濃度を２６０ｎｍのＵＶ測定により求めた。これら種々接合体の純度を逆相ＨＰＬＣにより調べる。１．３オリゴヌクレオチド（対配位子）をグラフト化（固定化）する方法実験用に選択した固体支持体は顕微鏡スライドである。これは、このタイプの分析には共通の支持体である。使用したスライドの寸法は７５×２５×１ｍｍである。使用するオリゴヌクレオチドを固定化する方法は、ガラス表面誘導化及び分子生物学で共通に使用する技術から構成される。第一のステップは、アミン基をシラン化の手法によりガラス表面にグラフト化することから成る。第二のステップにおいては、アミンと強力に反応するカップリング剤により表面を活性化する。第三のステップにおいては、アビジンを、そのアミノ酸の一級アミンとカップリング剤との反応により活性化した表面に共有結合的にグラフト化する。最後に、最終ステップにおいて、ビオチン化したオリゴヌクレオチドを、アビジンによるビオチンの強力結合により、この表面に固定化する。この方法は、オリゴヌクレオチドのそれらの５’端部でのガラス表面への付着を保証する。詳細なプロトコール１．ガラススライドを十分の一に希釈したスルホクロム酸（Ｐｒｏｌａｂｏ）で洗浄し、水洗し、８０°Ｃで１５分間乾燥する。２．３-アミノプロピルジメチルエトキシシラン（ＡＢＣＲ社）の１％を含有するトルエン溶液（ｖｏｌ／ｖｏｌ）にスライドを浸す。室温で２０分間静置させる。３．スライドをエタノールで二回洗い、８０°Ｃで１５分間乾燥する。４．スライドを、ピリジンの１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）と１，４-フェニレンジイソチオシアナート（Ａｌｄｒｉｃｈ）の０．２％（ｗ／ｖｏｌ）を含有するジメチルフォルムアミドに浸す。室温で１時間静置させる。５．スライドをメタノール、次いでアセトン中で洗い、８０°Ｃで１５分間乾燥する。６．溶液状のアビジンの液滴の２μｌを所望の箇所に置く。アビジン溶液はｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、アビジン１ｍｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）から成る。室温に２０から３０分間静置させる。７．ピペットでアビジンの液滴を吸い上げる。８．１ＭのＮａＣｌ溶液でアビジン沈積物を洗い、再度２μｌ液滴を沈積させ、ピペットでそれを吹い上げる。９．ビオチン化したオリゴヌクレオチド（５μＭ）の液滴２μｌを同じ箇所に沈積させる。室温で３０分間静置する。ピペットで液滴を除く。このオリゴヌクレオチドは、ｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＮａＣｌに希釈されている。１０．スライドを、１％水酸化アンモン（ｖｏｌ／ｖｏｌ）と１ＭのＮａＣｌを含有する溶液に浸す。これを室温で１０分間放置する。１１．スライドを水洗し、大気中で乾燥する。スライドは混成、即ち複合化に備える。カップリング位置を決定し、ガラススライド上に正確にオリゴヌクレオチドの位置を定めるため、６から９のステップはＧｉｌｓｏｎロボット、モデル２２２により自動化した。このロボットは、希釈器に連結した針を備えた直角座標ロボットアームから構成されている。このアセンブリーにより、正確で再現性ある様式で液滴の沈積と吸い上げが可能となる。１．４混成と複合体の蛍光の視覚化（複合体の存在及び／または量を特性化する変数）蛍光性オリゴヌクレオチドを、次ぎの緩衝液中の１０^-7の濃度で、固定化したオリゴヌクレオチドを担持する表面上で混成した。ｐＨ８の５０ｍＭのＴｒｉｓ -Ｃｌ；４．５ＭのＴＭＡＣｌ；２ｍＭのＥＤＴＡ；０．０１％のサルコシン。この緩衝液は参照文献４から得られる。混成容積は１５０μｌである。この容積は、２４×５０ｍｍのガラスのカバースリップを使用する時、約０．１ｍｍ厚さの液膜に相当する。混成の時間は１ｈである。等温混成を、所定の温度を提供するタンクまたは水浴内で、スライドとガラスのカバースリップの間で実施した。熱勾配（以下を参照）によるこの発明による混成のために、混成溶液（液体媒体）を傾斜して支持する金属のブロックに直接沈積させ、オリゴヌクレオチドを担持するスライドを、泡が形成しないように注意してその上に当てた。混成（複合化）の視覚化、即ち観察を、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ社（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）のＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ（蛍光画像）装置を用いた蛍光によって行った。この装置は、アルゴンレーザ光（４８８ｎｍで励起）によって箇所ごとに及び結合部位ごとに照射することで観察対象の表面を走査し、光学繊維の束によって再放射され観察され検出された光を集める。５１５ｎｍの高ｂａｕｔ（ｓｉｃ、原文の間違い）フィルターが、非交換様式でこの装置に内蔵されている。更にフィルターを加えて、集光、観察された光を波長に関してより良好に選択することが可能である。観察のために、５３０±３０ｎｍの干渉フィルターを付設し、装置内の光増幅器を９２０ボルトに設定した。生じた画像のピクセルのサイズは、２００×２００μｍ平方である。カップリング位置は、直径が約２ｍｍのディスクから成り、これは約１０ピクセルのオーダーの各サイトの最終画像を表らわしている。オリゴヌクレオチド（対配位子）の長さは短く、室温でもＤＮＡ複式体の迅速な解離が最低安定性を持つ配列（配列Ａ及びＢ）に起こる。従って、混成を高い信頼性で観察するために以下の方法を開発した。１．スライドを−２０°Ｃに冷却した混成緩衝液に迅速に浸す。撹き混ぜる。２．スライドを−９゜Ｃに冷却した２０ＸＳＳＣ（Ａｍｂｅｓｃｏ社，Ｓｏｌｏｎ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡの市販標準液）に迅速に浸す。撹き混ぜる。これらの二つのステップは最大１０ないし１５秒内に行うべきである。３．スライドを−２０°Ｃに冷却した混成緩衝液に迅速に浸す。この温度でこの緩衝液では複式体（複合体）の解離は生じない。この緩衝液は脱ガスする必要がある。４．ターゲット（配位子）のオリゴヌクレオチドを含む溶液からスライドを取り出す。前もって冷却したガラスのカバースリップを上に置く。スライドの底を迅速に拭う。５．直ちに、蛍光画像装置により視覚し観察する。混成の定量化は、この蛍光画像装置とＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ社が提供したＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（登録商標）ソフトウエアによって遂行した。上記プロトコールは、同じスライドで実施した繰り返しで、２５％の混成信号の変動係数を保証する。１．５等温での混成の結果１０のオリゴヌクレオチド（対配位子）、ｂＡ、ｂＢ、ｂＣ、ｂＤ、ｂＥ、ｂＦ、ｂＧ、ｂＨ、ｂＩ、ｂＪを担持するスライドを作製し、４゜Ｃで三種の蛍光オリゴヌクレオチド（配位子）、ｆＢｃ、ｆＤｃ及びｆＪｃの混合物により混成化を行った。それぞれの初期濃度は１０-7Ｍである。これら混成の定量的結果は表１にまとめた。これは、反復した実験の平均値であり、混成信号は複式体信号、ｂＪ：ＦＪｃの関数として表示した。表１の値から、強い混成信号と極めて弱いそれとの強度の差は約１５倍である。検出できない混成は、強い混成より少なくとも２０倍弱い。予測したように、オリゴヌクレオチド、ｂＢ、ｂＤ及びｂＪから得られた混成は、溶液中の遊離オリゴヌクレオチドはそれぞれの相補的鎖であったので強い。ｂＣ、ｂＥ、ｂＦ及びｂＨから得られた混成は極めて弱く検出が可能ではないが、このことは、内部不整合は完全な一対化と容易に区別されることを意味している。他方、外部不整合では同じことが真とは言えない。実際、ｂＡが相対的弱い混成信号を発生する一方で、完全な一対化の信号に匹敵する強い混成信号を発生するｂＧとｂＩでは、同じことが真ではない。従って、複式体ｂＡ：ｆＤｃにより形成する外部不整合は正確に区別されるが、複式体ｂＧ：ｆＤｃ及びｂＩ：ｆＪｃが形成する外部不整合はそうではない。この実験条件下では、それ故に未知の試料（液体媒体）を微細に分析することは可能ではない。未知の試料で上記混成を実施すると、オリゴヌクレオチド、ｂＢ、ｂＤ、ｂＧ、ｂＩ及びｂＪは試料との混成化として決定されようが、これは４０％の虚偽のポジティブレベルであることを示す。外部不整合の識別を改良するのに、混成温度をの上昇を考えることができる。これを解決法を開拓するために、六種のオリゴヌクレオチド、ｂＡ、ｂＢ、ｂＤ、ｂＧ、ｂＩ及びｂＪをスライド上に固定化し、異なる温度、４、１０、２０、２５、３０及び３７゜Ｃでオリゴヌクレオチド、ｆＢｃ、ｆＤｃ及びｆＪｃと混成を行った。図１は、４から２５゜Ｃの温度で得られた混成の結果を表す。これらは１６ないし４２の測定で得られた平均値である。結果は、その複式体が最も安定と見なされるので、混成、ｂＪ：ｆＪｃの相対的光強度で表現している。この複式体の混成信号の絶対強度は、もちろん温度が上昇すると減少している。図１は、１０°Ｃの混成のプロフィルが４゜Ｃの混成で得られたそれに類似することを示している。他方、２０及び２５゜Ｃではある変化が生じている。その外部不整合、ｂＧ-ｆＤｃは、完全一対化ｂＩ：ｆＪｃより著しく弱くなる。同様に、外部不整合、ｂＩ：ｆＪｃは、単一混成の間その差異が完全な識別にはやや低いが、完全な一対化、ｂＪ：ｆＪｃより顕著に弱くなっているる。しかし、完全な一対化、ｂＢ：ｆＢｃも強度を減少し、不整合の複式体、ｂＩ：ｆＪｃの信号より弱い信号を発生する。従って、完全に一対化した複式体を不整合の複式体から誤差なく分離する混成強度しきい値を選択するのは可能ではない。例えば、０．５のしきい値で２５゜Ｃで混成するように選択すると、オリゴヌクレオチド、ｂＢはネガティブ、オリゴヌクレオチド、ｂＩはポジティブと断定されよう。従って、最終結果は虚偽のポジティブと虚偽のネガティブから成ることになろう。次に、０．４のしきい値で２０°Ｃの混成が選択されれば、実験の変動により、オリゴヌクレオチド、ｂＢが実際にポジティブと断定るばかりでなく、オリゴヌクレオチド、ｂＩ、時にはオリゴヌクレオチド、ｂＧも同様に断定される。 II 熱勾配を与えた本発明による解決法２．１熱勾配の応用を可能とするアセンブリーの説明上に開示した外部不整合間の識別の問題を解決するために、固定化オリゴヌクレオチドを担持するガラススライドの表面に熱勾配を確立でき、多複合化支持体を構成できる処理装置を設計し、開発した。この装置は次の仕様に合致する。 -１ｃｍ長さの有用または作用ゾーン中での１０゜Ｃの温度勾配 -０．１゜Ｃ以内の全ての箇所でのスライド基板の温度の知見 -試験ごとのスライド基板の温度の再現性：０．１ｍｍ以内で０．１゜Ｃ。２０から２５゜Ｃの室温が自由に変えるられねばならない。 -オリゴヌクレオチドを担持するガラススライドの設置及び除去の容易さ。基板の表面に熱勾配を確立する最も簡単な方法は、この基板の各端部にそれぞれ冷源３と熱源４をそれぞれ連結する方法である。二つの源の間に熱勾配は確立される。基板が一定の厚さであるならば、温度勾配は一定、即ち温度は基板に沿った距離の関数として基板上を線形的に変化する。実用上の見地から、オリゴヌクレオチドをその上に固定化するガラススライド２は試験ごと容易に置き換え可能であり、異なる試験間で熱交換に差異がないことが必要である。これが、熱勾配がガラススライド内に直接には確立されず、表面に小さいキャビティ１ａが掘られた金属ブロック１内に確立された理由である。ガラススライド２はこのキャビティに置かれ、固定化したオリゴヌクレオチドを担持するその側面は下方に向いている。くさび１１により支持された金属ブロック１とガラススライド２の間に、混成溶液５（図４を参照）即ち液体媒体がくる。図４において、ガラススライド２の位置を設定するストップ６が示されている。実際はスライドはこれらのストップと接触して設置される。スライド上でオリゴヌクレオチドを固定化する間、熱勾配下のオリゴヌクレオチドの位置は、このようにストップと接触しているスライドの縁部２ａから決定される。金属ブロック１は、例えば熱伝導率が１０から５０Ｗ／ｍ．Ｋのステンレススチール３０４１から構成されている。これは、例えば０．０６Ｗ／ｍ．Ｋ以下の固有伝導率を有し、例えばポリウレタンから構成される覆い７により絶縁にされている。この装置の端部は、冷気及び熱源の循環ができ、製造所（cryothermostat min ister Huber，−２５／＋１２０°Ｃ）の推奨値によれば熱変動率は±０．０２゜Ｃで安定である水浴に連結している。装置の温度は、図５に記載されているクロメル−アルメル熱電対（タイプＫ）により制御された。混成溶液中では、熱電対ＴＣＩ（ｓｉｃ、原文に間違い）及びＴＣ４はスライド２のいずれかの側面に位置しており、一方、そのワイヤの全直径が０．０８ｍｍである熱電対ＴＣ２及びＴＣ３はガラススライドの下に位置している。これら熱電対は直接にこのスチールに電気的に溶接した。それらの位置（熱電対の二つワイヤの中央値）は、マイクロメーターテーブルｘ，ｙの上にかかる双眼鏡レンズによって０．０２ｍｍ以内に決められている。これらは、氷冷の純水浴に浸した冷接合点を備え、差動的に載置されている。その差動電圧は、高精度マルティメーター（Ｋｅｉｔｈｌｅｙ，モデル２０００、精度：０．１ μＶ）により測定され、これら熱電対用の標準表により温度に変換される。上記した処理装置の寸法は、図２に文字入りマークで示されており、ＡＡ：４０ｍｍ、ＢＢ：４０ｍｍ、ＣＣ：２０ｍｍ、ＤＤ：１５ｍｍ、ＪＪ：１２０ｍｍ、ＥＥ：１０ｍｍ、ＦＦ：１０ｍｍ、ＧＧ：２０ｍｍ、ＨＨ：４０ｍｍ、ＩＩ：１２ｍｍである。数値シミュレーションから予測される熱勾配の直線性を、このアセンブリの基礎となる熱電対によって実験的にチェックした。勾配は線形であり、スライド２の有用なゾーンのある箇所の温度は、熱電対ＴＣ２とＴＣ３が提供する温度から簡単に計算できる。熱及び冷源の数点の温度のために異なる時間で行った温度測定は、試験ごとの温度分布は０．１゜Ｃ以内まで再現性があることを示している。ここに報告する実験の多くでは、冷水浴を−９゜Ｃに、熱水浴を＋６１゜Ｃに調節した。冷源３の液体はグリコール含有水（２５％グリコール）であり、熱源２のそれは純水であった。確立された勾配は１．０８５゜Ｃ／ｍｍであった。２５ｍｍ離れたガラススライドの両縁部では、それぞれ１３．２及び４０．３゜Ｃであった。２．２それらの予め定められた最適混成温度におけるオリゴヌクレオチドの位置決め等温混成の結果は、各オリゴヌクレオチドの混成温度は、外部不整合間の正確な識別のためには十分に高いことが必要であることを示している。しかし、この温度は、混成信号を検出可能とするには同時に十分に低い温度にとどめるべきである。上記装置では、混成温度は混成信号温度が４゜Ｃで得られる混成信号の２５％に等しくなるように設定されたが、この温度は固定化したオリゴヌクレオチドの飽和度に相当する。ガラススライド２（平板支持体）の位置と分布は、このように粗く決められることになる。勾配下にあるオリゴヌクレオチドのそれぞれの位置を正確にするために、勾配の方向にオリゴヌクレオチドを担持する五個一組になったスライドを作製した。五個一組体の５つの結合部位は、それぞれスライド２の冷縁部２ａから５、８．８、１２．６、１６．４及び２０．２ｍｍである。次にこれらスライドを、相補的な蛍光性のオリゴヌクレオチドの各種組合せにより混成した。図６は、オリゴヌクレオチド、ｆＢｃ，ｆＤｃ及びｆＪｃによるそのような混成の結果である。この実験では、熱勾配用の水浴を−９と＋７０゜Ｃに設定した。この種の幾つかの実験の終了時に、異なるオリゴヌクレオチドの結合部位の位置をそれぞれ明らかにした。ｂＡ：２３．５゜Ｃ；ｂＢ：２３゜Ｃ；ｂＤ：２６．５゜Ｃ；ｂＧ：２７．５゜Ｃ；ｂＩ：２７．５゜Ｃ；ｂＪ：２９゜Ｃ２．３発明による熱勾配下の混成の結果この実験のために、オリゴヌクレオチド、ｂＡ、ｂＢ、ｂＤ、ｂＧ、ｂＩ及びｂＪを、スライド２の冷縁部２ａからそれぞれ９．５、９、１２．２、１３．２、１３．２及び１４．６ｍｍの各ガラススライド上に固定化した。冷気及び熱源の水浴は−９と＋６１゜Ｃに設定した。これらの位置は上記に明かにした温度に対応する。図７のダイアグラムに従って、オリゴヌクレオチドの沈着を重複行った。次に各スライド（２）を、等温熱混成で前に使用したｆＢｃ、ｆＤｃ及びｆＪｃの同じ混合物により熱勾配下に混成を実施した。得られた混成結果を図８に集約する。これらは５回測定の平均値である。この結果を、図１ａから１ｄに提示した結果と同様に、混成、ｂＪ：ｆＪｃの相対強度として表してある。三つの完全一対化が遜色ない強度の混成信号（０．８４から１）を発生するのが注目でき、それに対して外部不整合の信号は顕著により弱い。等温熱混成で得た結果と異なり、ここでは完全一対化を不整合から分離する強度しきい値を、例えば０．７のしきい値のように定めることが可能である。上記装置の正確な操作をチェックするために、同一のスライドを蛍光性オリゴヌクレオチド、ｆＡｃ、ｆＢｃ、ｆＤｃ、ｆＧｃ、ｆＩｃ及びｆＪｃの他の組合せにより混成化した。これらの組合せはオリゴヌクレオチド、ｆＢｃを体系的に含有する。加えて、これらはｆＩｃまたはｆＪｃ及びｆＡｃまたはｆＤｃ、またはｆＧｃを含む。この様式で、各組合せの三つの蛍光性オリゴヌクレオチドは、それらが同じ固定したオリゴヌクレオチドとは一対化しないので、それらの混成において干渉を生じなかった。ｆＡｃ、ｆＧｃ及びｆＩｃを含む組合せも使用した。実際に、配列ＡとＧの間の交差混成は極めて低い（下の結果を参照）。表２にこれら混成の結果を報告する。これらは、複式体、ｂＢ：ｆＢｃの混成信号の強度に相対して表した。更に、非整合用に、結果は対応する完全一対化の混成信号に相対して表した。これら結果は、全ての完全一対化は類似した強度信号を発生することを示している。しかし、一対化ｂＧ：ｆＧｃは、６回の測定の標準偏差が０．２２であり、０．７９の信号であるので僅かであるが弱い信号を発生する。実験の変動を除いた真の信号がＩより事実上小さい確率は、従って、約９７％と高い。それ故に、このことは熱勾配におけるＧの位置がこの実験では若干熱く、Ｇは冷源に向け再位置決めができることを示している。その上これら結果は、外部不整合は完全複式体ｂＢ：ｆＢｃまたはそれらの各完全類縁体よりもかなり弱い信号発生することも示している。組合せ、ｆＢｃ＋ｆＤｃ＋ｆＪｃによる混成の特異の場合におけるように、完全参照複式体に比較できる０．７のしきい値は、外部不整合から完全一対化を識別することを可能とする。次に、オリゴヌクレオチド、ｂＧを２６．８゜Ｃの位置に設定し、（スライド２の冷縁部２ａから１２．５ｍｍ）、他のオリゴヌクレオチドの位置を不変のままにしたスライドについて新規実験を実施した。これらスライドを、蛍光性オリゴヌクレオチドの組合せ、ｆＢｃ＋ｆＧｃ＋ｆＩｃ及びｆＢｃ＋ｆＧｃ＋ｆＪｃにより混成した。複式体、ｂＢ：ｆＢｃと比較した複式体、ｂＧ：ｆＧｃの混成信号の平均は、７回測定で１．０８で標準偏差は０．３２であった。次に、不整合ｂＧ：ｆＤｃとｂＧ：ｆＡｃの信号を、ｂＧ用の新しい温度まで、以前の値を採用し、それらに１．０８：０．７９＝１．３６７の比率を掛けることで外挿した。同様に、それらの対応する完全類縁体、ｂＧ：ｆＧｃと比較される不整合ｂＤ：ｆＧｃとｂＡ：ｆＧｃの信号を、先行値を１．３６７で割ることで先行値から推論した。全てのこれら結果と計算は表３に記されている。予想通りに、これらの新しい結果は先行結果を確認し、改良している。全ての完全一対化が１に近似する混成信号を発生する一方で、信号が僅かに０．５より多きいｂＩ：ｆＪｃを除外して、末端不整合は０．５以下の信号を発生する。０．７のしきい値は、外部不整合から完全一対化の明確な区別を可能とする。２．４一般的オリゴヌクレオチドバイオチップの操作への応用例えば全ての”６５５３６の可能性のあるオクタマー”を担持するオリゴヌクレオチドバイオチップを使用する間に、信号がポジティブかネガティブかを決定するために強度しきい値を単純に応用するのは極めて有効とは言えない。実際、最も安定な不整合の信号は完全一対化の信号の二倍の弱さにすぎず、実験上の変動によりある数の完全一対化をネガティブとして検出し、同様にある数の外部不整合をポジティブとして決定すこともある。例えば、表３に集約した全データについて言うと、報告した３９の内に０．７のしきい値以下の完全一対化の信号が２あり（５．１％）、０．７のしきい値以上である外部不整合は５６回の測定の内で２（３．６％）である。これは複式体ｂＪ：ｆＩｃの値であり、複式体ｂＪ：ｆＩｃの値である。これら二つの複式体は、遂行した実験の内、三種の最も安定な不整合の複式体の部分を形成する。処理のより有効な手法は、同じグループ中の末端ヌクレオチドのみ相違する全てのオリゴヌクレオチド（全ての可能性のあるオクトマーを担持するバイオチップ用には１６オクトマー）を結合し、各グループごとに最も強い信号を決定する手法である。その時は、ポジティブグループをネガティブグループから識別することは、これが完全一対化と内部不整合とを識別すすことを含むので、容易である。例えば、０．４のしきい値を最も強い信号に関して適用する。次に、オリゴヌクレオチドの各グループに対して、０．７のしきい値を最も強い信号に関して適用することが可能である。表３に報告した全ての実験についてこの様式で処理を実行すれば、完全一対化は全て実験の最も強い信号に関する０．４のしきい値を大きく越えるので、ネガティブであると決定される完全一対化はない。他方で、ポジティブであると誤って決定された二つの値は誤ってポジティブのままである。従ってこれらのデータを応用すれば、この様式で作用するオリゴヌクレオチドバイオチップは、虚偽のネガティブ割合が０％、内部不整合の虚偽のポジティブ割合が０％、そして実際上、３０から４０％の外部不整合に対し約１０％の虚偽のポジティブ割合に相当するｅｘｔｅｍｅｓ（原文に誤り）不整合の虚偽のポジティブ割合が３から４％を持つことになる。このような虚偽のポジティブと虚偽のネガティブの割合は、等温混成による従来処理の状態をかなり改善していることを表している。この割合は、混成による順序付けによって核酸試料の配列の再構築を可能にするのに十分な低い割合である。実際には、残存する混成誤差は、混成の冗長性を利用した適当なデータ処理ソフトウエアにより修正できる（５）。更に結果の質を改善するためには、試料ごとに一つではなく二つの混成を実行することが可能である。その時、虚偽のポジティブ割合は、外部不整合の３０から４０％に対し１％のオーダーになるはずである。表２熱勾配における混成の結果ｂＢ：ｆＢｃに対する完全一対化に相対する強度表２の続き外部不整合の識別（１）ｂＢ：ｆＢｃは２３°Ｃにある（２）比率（複式体／ｂＢ：ｆＢｃ）の平均（３）測定の数（４）比率（複式体／蛍光性オリゴヌクレオチドの完全複式体）の平均表３ｂＧを２６．８゜Ｃに設定した、熱勾配における混成の結果ｂＢ：ｆＢｃに対する完全一対化に相対する強度表３の続き外部不整合の識別（１）ｂＢ：ｆＢｃは２３゜Ｃである（２）比率（複式体／ｂＢ：ｆＢｃ）の平均（３）測定の数（４）比率（複式体／蛍光性オリゴヌクレオチドの完全複式体）の平均（５）表２の値に１．３６７を掛けて計算した平均値。ｎと標準偏差は不変である。（６）完全複式体の比率のために、表２の値を０．３６７で割って計算した平均値。ｎと標準偏差は不変である。この説明に含めた必要な参考文献（１）Ｋ．Ｒ．Ｋｈｒａｐｋｏ，Ｖ．Ｐ．Ｌｙｓｏｖ，Ａ．ＡＫｈｏｒｌｙｎ，Ｖ．ＶＳｈｉｃｋ，Ｖ．Ｌ．Ｆｌｏｒｅｎｔｉｅｖ，Ａ．Ｄ．Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ：ＤＮＡ順序付けへのオリゴヌクレオチド混成法；ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ；１９８９；２５６；１１８−１２２（２）Ｍ．Ｊ．Ｄｏｋｔｙｃｚ，Ｍ．Ｄ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｓ．Ｊ．Ｄｏｒｍａｄｙ，Ｋ．Ｌ．Ｂｅａｔｔｉｅ，Ｋ．Ｂ．Ｊａｃｏｂｓｏｎ：１２８オクタマーＤＮＡ複式体の光学的融解；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；１９９５；２７０；８４３９−８４４５（３）Ｋ．Ｊ．Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ，Ｒ．Ｆｒａｎｋ，Ｈ．Ｂｌｃｋｅｒ，Ｌ．Ａ．Ｍａｒｙ；塩基配列からＤＮＡ複式体ｓｔａｂｉｌｉｔ（原文間違い）の予測；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；１９９６；８３；３７４６−３７５０（４）Ｕ．Ｍａｓｋｏｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ；ガラス支持体上で合成したオリゴヌクレオチドの大きい配列を利用したオリゴヌクレオチド再会合の研究；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ；１９９３；２１；４６６３ −４６６９（５）Ｚ．Ｓｔｒｅｚｏｓｋａ，Ｔ．Ｐａｕｎｅｓｋｕ，Ｄ．Ｒａｄｏｓａｖｌｊｅｖｉｃ，Ｉ．Ｌａｂａｔ，Ｒ．Ｄｒｍａｎａｃ，Ｒ．Ｃｒｋｖｅｎｊａｋ− ｏｖ；混成によるＤＮＡ順序付け：非ゲルに基ずく方法により読まれた１００塩基；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；１９９１；８８；１００８９−１００９３（６）Ｅ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ等（１９９２）；オリゴヌクレオチドの配列に対する混成による核酸配列の分析と比較：実験モデルを用いた評価；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１３，１００８−１０１７（７）Ｒ．Ｄｒｍａｎａｃ等；ｈｙｂｒｉｉｚａｔｉｏｎ（原文に間違い）によるＤＮＡ配列決定：有効な大スケール順序付けの戦略；Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０；１６４９−１６５２（８）Ｃａｒｒａｎｏ等（１９８９）；ＤＮＡ指紋化用の高解像蛍光に基ずく半自動化法；Ｇｅｎｏｍｉｃ４；１２９−１３６（９）Ｌｙｓｏｖ，Ｙｕ等（１９８８）；Ｄｏｋｌａｄｙａｋａｄｅｍｉ，Ｎａｕｋ，ＳＳＲ３０３；１５０８−１５１１（１０）Ｄｒｍａｎａｃ．Ｒ等（１９８９）；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４；１１４−１２８；（１１）ＳｚｅＶＬＳＩＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ＭｃＧｒａｗＨｉｌｌ；１９８３DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Method and apparatus for processing by complexing liquid media The present invention generally precedes the complexation of a liquid medium containing one or more components. Process for determining the presence of multiple or diverse ligands in the free state in a liquid medium About. In this description and in the claims, the following definitions are employed. A "ligand" is called a "pair ligand" by one or more non-covalent bonds Chemical, biochemical or biological that can bind to other components or molecules in a specific manner It is defined to mean a component or molecule having a chemical property. This definition specifically includes those that can form complexes in a mutually and complementarily manner. There are different biological or biochemical components, especially biopolymers. -They include, for example, that they are polypeptides, especially epitopes or antigens (vs. Polypeptides such as antibodies (ligands) that can bind to Is the opposite, a polypeptide, -Or to oligonucleotides in single-stranded form, as exemplified in the description below. A nucleic acid or nucleophile capable of binding in a complementary manner to a leotide or polynucleotide; Includes lumber. The chemical nature of the ligand binding or pairing with the counter ligand, ie forming a complex The reaction or equilibrium will hereinafter be referred to as "complexing" terminology. this The products of a reaction or equilibrium are hereinafter referred to as the term "complex". You. In the case of core materials or macromolecules, this complex is hereafter referred to as a “duplex” ). The “nucleus constituent material” or “nucleic acid” refers to the small number of nucleotides that have been It is understood to mean at least one macromolecule comprising one unbranched, linear chain. Included in this definition are deoxyribonucleic acids, their variants, and other And ribonucleic acids, modified forms thereof, and the like. One such macromolecule is May be a heavy or double chain, or have some other secondary or tertiary molecular structure I You may. In fact, in the following description and examples, this core constituent material Containing and subject to this treatment directly or from which a liquid medium is obtained Yes, and then processed according to the invention. "Oligonucleotide" refers to a naturally occurring nucleic acid or a component thereof, i.e., a sugar, nitrogenous substance. At least five of the nucleic acids having at least one of the base or phosphate groups modified Polynucleates containing monomers, preferably at least 7, for example 8 monomers Means creotide. A "support" is directly or indirectly, covalently and non-covalently, attached to its surface. It refers to a substrate on which the counter ligand is permanently immobilized or attached. The substrate may be self-supporting, for example, a sheet of an inert, transparent material, Supported by a rigid base such as a layer of acrylamide on a glass slide Have been. "Surface" refers to a porous substrate with a true surface larger than the apparent surface, whether it is a solid substrate. That is understood to mean the surface of the substrate accessible to the counter ligand. Subsequent explanation And in the examples, the oligonucleotides constitute a paired ligand as defined above. Complex between one nuclear constituent material or nucleic acid and the other complementary oligonucleotide The reaction is hereinafter referred to as "hybiridization". Documents, WO-92 / 10558 and WO-9322680, and so-called "OK" According to the "reverse dot blot" bioassay format, one or more nucleic acid components may be included. In the case of nucleic acid samples, complexation of the liquid medium, that is, hybridization Process for determining the presence of multiple different nucleic acid fragments, segments or chains (ligands) A method and its apparatus are described. In this process. Mainly in documents (6) and (7) Applied to sequencing nucleic acid samples by hybridization according to well-known principles and methods disclosed . According to this method, a) Can be complexed with nucleotide sequence complementary to nucleic acid fragment And a plurality of oligonucleotides (pair ligands), each of which is different, Multiple discrete coupling sites or zones A biochip-type support for multi-composite distributed on the surface is prepared. b) From one coupling position to another, under isothermal conditions, a liquid medium I.e., contacting the nucleic acid sample with the complexed support and thereby free nucleotides The sequences are each paired with a fixed oligonucleotide, resulting in this Attaches to the complexed support. c) expressing the presence and / or amount of different nucleotide sequences in the original liquid medium Of different composites or hybrids obtained so as to generate different signals and / or information. The parameters representing the presence and / or quantity are differently coupled to the multicomplexed support. Observe at the sight. Preferably, these complexes are used to label components of a nucleic acid sample. Or formed using the labeling of different hybrids attached to the support . As mentioned above, this process is performed under completely isothermal conditions. That is, the liquid medium Washing the support when contacting it with the multicomposite support and / or after hybridization Sometimes the same hybrid temperature is set from one coupling site to another U. According to the document EP-0,535,242, a similar method is described. It has been proposed to operate under warm conditions. According to this, each coupling size The concentration of a particular oligonucleotide at this site in the Of the corresponding complex obtained by complementary nucleotide sequences selected To promote. According to this document, this concentration is carried out by a cleaning liquid whose temperature varies. Solution at each coupling site between the thermal gradient wash and the incorrectly named wash stage. Selected by observing the percentage of complementary nucleotide sequences generated . The above solution avoids the technical difficulties identified in the document, WO-92 / 10588 And this has not been resolved yet. In fact, the hybridization temperature and oligonucleotide For a given length of the (pair ligand) sequence, the complement of the target of the nucleic acid probe is The stability of the complex obtained by hybridization with the sequence varies depending on the sequence. That is, Only one of the nucleotides differs from each other, i.e. T in some cases, G in others, Oligonucleotides are of similar length and similar sequence, but with the same stability Do not hybridize each complementary nucleic acid. In other words, the stability of the resulting complex is Nucleic acid testing at a cold temperature sufficient for the lowest possible stability of the complex that can be formed. The material should be hybridized with the oligonucleotide probe supported on the multi-complexed support. Otherwise, after hybridization, false negatives, ie, oligonucleotide probes That the complementary sequence is present in the sample but does not generate a hybrid signal. become. However, by performing the process in this manner, the oligonucleotide probe May form sufficiently stable complexes with sequences that are not completely complementary. this In such cases, false positives, i.e., oligonucleotide probes, To generate a hybrid signal when the complementary sequence is not present in the nucleic acid sample. Become. As a result, these false negatives and false positives were The technical solution described above introduces errors into the analysis, especially for hybrid sequencing. Make the law often unavailable. Accordingly, an object of the present invention is to provide a treatment by complexation as described above, particularly in a hybrid. It is to improve reliability. The starting point of the present invention is that the stability or reliability of each ligand / pair ligand complex is At least one of which is referred to as a post-reference parameter and sets the conditions of the multi-composite support Is an observation of a direct or indirect dependence on the extrinsic parameter. “Extrinsic parameters” are non-essential for ligands and / or counter ligands. That is, parameters or conditions independent of them. Such an extrinsic that can condition or condition the multi-complexed support Reference parameters are, for example, -Physical parameters or conditions applicable to the support such as temperature, -Such as the surface area of the anti-pair ligand capable of pairing with substantially all of the ligands Chemical, biochemical or biochemical present on or available on the surface of the support Physical parameters or conditions, -Optionally, the support may be of a type such as its wettability or surface tension with respect to the liquid medium. Physicochemical parameters established on the surface. As a further example, ligand coordination of nucleic acid type and oligonucleotide type The extrinsic parameters in the case of offspring are nucleic acids and / or oligonucleotides Does not belong to the nucleotide sequence of, for example, one of the basic nitrogenous nucleobases Means parameters or characteristics that differ in their frequency of occurrence in Understood. Next, the present invention is characterized by combining the following two characteristics. -On the one hand, the binding sites are exogenous on all supports, for example on their entire surface Distinct as a function of the reference parameter, which parameter is assigned to a different binding site Have different values. -Extrinsic reference parameters that specifically determine the stability of different ligand / pair ligand complexes As a function of the predetermined optimal value of the Are distributed. Therefore, according to the present invention, a multi-complexed support on which the corresponding pair ligand is immobilized Each of the above binding sites is an exogenous reference for the stability of the corresponding ligand / pair ligand complex. Function at the optimal value of the illumination parameter, and this optimal value Can be different from the optimal value of the binding site. The advantages of this invention make multi-complexing particularly reliable, accurate and sensitive. A style is achieved, which also has better resolution. “Coupling” refers to a covalent bond that can permanently immobilize a pair ligand on the surface of a support. Or any other bond. The invention relates to different bioassay formats, for example by direct or competitive multiplexing. Therefore, it is executed. The invention is optionally implemented in a "sandwich" fashion. According to this format If the ligand is paired with the immobilized counter ligand and the free sample in the liquid medium It is possible. According to the method of the preferred embodiment, three different practical modes are selected. . -According to the first mode, applying the same minimum value of the exogenous reference parameter The body medium is contacted with the composite support. This minimum corresponds to virtually all ligands This is a value sufficient to complex the ligand. The support is then transferred to different binding sites. Wash by applying extrinsic reference parameter values that have been set differently . This applies during this washing step. -According to a second modality, the same contact between the support and the liquid medium is achieved with different binding sites Apply the first extrinsic reference parameter value Perform with. The support is then separated by a second, different, extrinsic reference parameter. Washing while maintaining different binding sites to predetermined values. The first values are each extrinsic Same or different from the second value of the reference parameter. -According to the third mode, the support may be differently attached to different binding sites. The exogenous reference parameter value is applied and brought into contact with the liquid medium. this Is applied during single complexing or hybridisation. The hybrid support is then relatively cold Wash with a washing liquid at a constant temperature. In a so-called homogeneous detection format, of course, washing is not essential . A first mode of the above definition is that at each binding site, the amount or concentration of the paired ligand is On the one hand all ligands that are actually complementary to the ligands considered, and on the other hand simultaneously Or form a complex with all ligands that can be paired with this pairing ligand parasitically Is assumed to be sufficient. Preferably, especially for a multi-composite support in a flat position, at least one reference Direction, for example its width in the case of a rectangular support, the slope of the extrinsic reference parameter Such spatial gradation is established. This spatial tone then appears between the different binding sites Each pair ligand is distributed to fix the position and arrangement of different binding sites. As a variant or additional item of the invention, the binding site on the multi-complexed support is Another extrinsic reference parameter with a different value at the coupling position As a function, and in addition, the paired ligand also improves the stability of the ligand / paired ligand complex. A function of a predetermined optimal value of each of the other extrinsic reference parameters to be determined Is distributed between the coupling positions. Preferably, the stability of the different ligand / pair ligand complexes depends on the other One extrinsic parameter is related to the stability of the different ligand / pair ligand complexes. Each is set to the average of the values of the other parameters required. In the example, Other extrinsic parameters include the pH of the liquid medium contacted with the multicomplexed support. Or ionic strength, this parameter being determined by the composition of the hybrid buffer. Multicomplexes designed and conditioned by this invention for its different binding sites The immobilized support is preferably used for ligand detection and / or quantification. Several modes are conceivable for this purpose. -Variables representing the presence and / or quantity of different ligand / pair ligand complexes, in particular Observed by scanning at different binding sites, the presence of different ligands in the original liquid medium And / or obtaining a signal and / or information representative of the quantity. -Preferably, the different ligand / pair ligand complexes are of the following well known per se: Observe using at least one of the operations. Ie, labeling of components of the liquid medium And labeling of different ligand / pair ligand complexes attached to the support. Generally, the liquid medium in contact with the support is one or more different components. Containing and analyzed from biological samples or samples Follow two styles. -Process the sample directly according to the method described above, especially in direct contact with the multi-complexed support You. -Or the sample is identical or directly derived from each different component Obtain one or more components in the treated liquid medium, Undergo at least one preliminary operation selected to perform the operation. More generally, a composite support to which different ligands are attached, optionally, From uncomplexed components or components that are complexed with the counter ligand in unstable form. To separate and / or differentially or otherwise elute or Undergoes at least one continuous operation, such as a wash selected for release. A preferred but not exclusive field of application of this invention is nucleic acid products or compounds Related to processing and analysis. In this case, the ligand is free, especially in a single-chain form. A nucleic acid consisting of a get nucleotide sequence, wherein the nucleic acid And hybridized with other fixed or attached complementary probe nucleotide sequences. It is easy. More preferably, the liquid medium as the core constituent material has several different types of coordination. Child, a single component that contains or represents several hybrid regions or segments , Ie, one nucleic acid, so that this same component is a different pairing ligand, Pair with each of the oligonucleotides. Therefore, in this case, at least one Sequence of nucleotides in the nucleic acid strand of hand A plurality of hybrid regions, each according to a target nucleotide sequence that is complementary; Therefore, multiple ligands are determined. The process according to the invention applied to nucleotide or nucleic acid products and compounds The principle is, for example, at least one of the following applications: Sequence by hybridization, rearrangement of this nucleic acid component, mapping of nuclear constituent materials, nuclear configuration Analysis and identification of materials or samples, classification of nuclear constituent materials, screening of nuclear constituent materials , Genetic analysis (see for example reference 8), bacterial or viral pathogenicity Used to detect agents. One application of this invention is to hybridize nucleic acids, particularly by determining the overlapping sequence of nucleic acid materials. Material ordering. The principles and style of this ordering are described in publications (6) and (7). ), And the content of this description is incorporated by reference where necessary. Have been. Obtained in this way to reconstruct the nucleotide sequence of the nuclear constituent materials The analysis and processing of the information provided is described in publications (9) and (10). You. Another application of this invention is to determine hybrid profiles without forcing sequence reassembly. To identify a microorganism or a gene associated with the microorganism. For all these applications, the liquid medium may be one identical nucleic acid fragment or Obtained from nucleic acid samples containing several different nucleic acid fragments. In this nucleic acid sample, At least one preliminary operation selected from the following operations may be optionally performed. That is, denaturation, lysis, fragmentation, cloning and amplification. Two different cases of processing according to the invention should be kept in mind. -In the first case, several different components consisting of different ligands in each liquid medium Including minutes. There, the different components adhere and separate from each other, so to speak Degraded on composite support. This style is performed in at least one of the following applications: You. That is, identification, quantification, separation and fractionation of the different components. -In the other case, the liquid medium is itself composed of different ligands Or containing a single component to represent. So, this component is different from the different ligands And a pair. An apparatus for processing according to the invention comprises: -A plurality of coupling sites separated from each other, for example, in a matrix Multi-complexed support placed or distributed. Couplin sites are different, A plurality of paired ligands each capable of being complexed with the ligand are immobilized. A pair of the ligand and the paired ligand, and attaching them to the support; Means for bringing a liquid medium designed to be applied into contact with a support. This device, on the one hand, is available at the site as a function of the extrinsic reference parameters. Depending on the values of the above parameters, the coupling sites on the support Further comprising means for distinguishing between the exogenous reference parameter and the counter ligand on the support. Of different ligand / pair ligand complexes as a function of the predetermined optimal value of the Characterized by being distributed between different coupling sites that determine qualitative properties To Preferably, but not exclusively, the exogenous reference parameter selected is temperature. In addition, the distinction means has a gradation such as a temperature gradient in the temperature according to at least one reference direction. Designed to occur. In this case, preferably, the device comprises a cold source and a heat source, In the meantime, the support extends in the reference direction. By way of example, such a device may each be associated with a different coupling position on the support. To determine the presence and / or amount of ligand / pair ligand complex at each coupling site. Detecting at least one observed variable representing one or more measurement signals or Includes one or more sensors that convey corresponding information. As an example, this device is itself a multiplexed basic cell, for example a CDD camera. Single sensor consisting of sensors or a single sensor scanning the surface of a multi-complexed support. Including the sensor. For example, for the analysis or sequencing of nuclear constituent materials, this same instrument may be used as previously defined. Transmitted by different sensors based on the mathematical and / or logical operations you put Including a unit that processes the signals obtained and obtains information identifying components in the liquid medium. Or linked to it. As an example, an observed observed representing the presence and / or amount of a ligand / pair ligand complex Variables are the absorbance or intensity of luminescence or re-emission (eg, fluorescence or cold light), On irradiation intensity or light diffraction, nuclear magnetic resonance, contact angle change, electrical conductivity, vol Different ligands / pair ligands, such as tammetry, amperometry and impedance measurement Other physical, optical, electrical or dielectric or electrochemical properties of the composite . As an example of an embodiment, the multi-composite support comprises one of the following inert materials: Gala Materials, glassy materials, porous inorganic or amorphous materials and plastic materials. When a biochip is used, the support and the binding site are Obtained by technology (see Publication No. 11). By way of illustration, the present invention is described and attached in accordance with the experimental protocols detailed below. The processing of nucleic acids or nucleic acid materials will be described with reference to the figures. 1a to 1d in the figures are the oligonucleotides identified on the x-axis which are indicated briefly And 4 ° C., 10 ° C., 20 ° C. and 25 ° C. for nucleic acid fragments, respectively. 3 shows the results of isothermal hybridization in C. Observed variable, ie different complex obtained Are plotted on the y-axis. Solid stick An open bar represents an external mismatch, representing perfect pairing. FIG. 2 shows a cross section of an apparatus for processing according to the invention. FIG. 3 shows a top view of the device shown in FIG. FIG. 4 represents an enlarged scale view of the processing cavity of the apparatus shown in FIGS. 2 and 3; -Fig. 5 shows only the processing and measuring cavities of the device shown in Figs. FIG. -Figure 6 shows the different nucleic acid fragments identified in the legend on the right of this figure. Of the observed variable (fluorescence) as a function of the temperature of the Show. FIG. 7 fits into the cavity of the device according to FIGS. 2 and 3, and more particularly in FIG. As a function of the selected oligonucleotide for a multicomplexed support plate Represents the arrangement of binding sites along the length as well as the width or height of the plate. FIG. 8 shows, in a manner similar to FIGS. 1a to 1d, the identified nucleic acid fragments on the x-axis. Fragments and oligonucleotides and multi-complexed supports according to the invention. The hybrid is represented by the same rules as in the above figures. Experimental protocol The experimental protocol is based on the following plan. I-Demonstration of the problem underlying the invention 1.1 Selection of oligonucleotide (pair ligand) 1.2 Synthesis of oligonucleotides 1.3 Method of grafting oligonucleotide 1.4 Visualization of Hybrid and Complex Fluorescence 1.5 Hybridization results at isothermal II-Assistance of multi-composite support whose coupling position is distinguished based on thermal gradient To solve problems 2.1 Description of the device according to the invention enabling the application of thermal gradients 2.2 Oligonucleotides at their predetermined optimal hybridization temperature Positioning 2.3 Hybridization results under thermal gradient according to the invention 2.4 Extrapolation of “biochip” operation to comprehensive oligonucleotides I-Demonstration of the problem underlying the invention 1.1 Selection of oligonucleotide (pair ligand) Propagation of nucleic acids (ligands) by oligonucleotides immobilized on the surface of a solid support Oligonus, representative of this type of analysis, are used to demonstrate the difficulties encountered in classical hybridization. A model of cleotide was selected. The length of the selected oligonucleotide is 8 bases, which is ordered by hybridization For applications of the type involving injuries (see references 1 and 2). ). Three bases designated B, D and J were selected. These are the corresponding double-stranded DNA c is characterized by a difference in stability. Sequence B, in which the nucleotides A and T are rich, , Form a relatively unstable complex with its complementary sequence. On the other hand, Nuku of C and G Sequence J, which is rich in leotide, forms a duplex which is relatively stable with its complementary sequence. Let's do it. A sequence containing the same number of A and T nucleotides as the C and G nucleotides Column D will form an intermediate stability complex with its complementary sequence. Breslaue r using a nearest neighbor model (see Reference Document 3). It is possible to predict, albeit coarse, the relative stability of leotide. This model Gives the free bond energy as a function of its alignment for each duplex at some temperature. Nergies can be calculated. From these three base sequences (shown by B, D and J; see below), B, D and J The other seven sequences corresponding to the monovariation of the sequence were determined. These 10 oligonucleotides were immobilized on a solid multicomplexed support. You. These contain at their 5 'end the biotin groups necessary for their immobilization ( See 1.3 below). In the following table, three base sequences are shown in bold. Note The suffix "c" means a complementary sequence. name Array note Single external mismatch with respect to bA 5'b-ACTGATGA3 'Dc bB 5'b-AATCATTA3 'AT is rich bC 5'b-GAGCATTA3 'Double internal mismatch with respect to Bc bD 5'b-ACTGATGC3 '50% AT, 50% GC Single internal mismatch for bE 5'b-ACTCATGC3 'Dc Single internal mismatch for bF 5'b-AAGCATTA3 'Bc bG 5'b-GCTGATGC3'Dc single external mismatch or Double external mismatch with respect to Ac Single internal mismatch for bH 5'b-GCACCGTC3 'Jc single external mismatch with respect to bI 5'b-ACGCCGTC3 'Jc bJ 5'b-GCGCCGTC3 'GC is rich Six fluorescent oligonucleotides (labeled ligands) were immobilized on these The oligonucleotide was hybridized. These are the three base sequences and the terminal Oligonucleotides complementary to those variants that differ in nucleotides. This They contain fluorescein at the 5 'end.name Array note fAc 5'F-TCATCAGT. Complementary to 3 'bA Complementary to fBc 5'F-TAATGATT3'bB Complementary to fDc 5'F-GCATCAGT3'bD Complementary to fGc 5'F-GCATCAGC3'bG Complementary to fIc 5'F-GACGGCGT3'bI Complementary to fJc 5'F-GACGGCGC3'bJ 1.2 Synthesis of oligonucleotides Activated biotin and a fluorescein derivative are attached at the 5'-position with an arm-(CH_Two)₆-NH_Two -Is linked to an oligonucleotide sequence functionalized with an amine containing biotin And an oligonucleotide labeled with fluorescein. 1.2.1 Synthesis of oligonucleotides The amine-containing oligonucleotides were transferred to a host using a protocol provided by the manufacturer. According to the hoamidite method, an ABI 394 apparatus (Applied Biosystem) ems, Forster City, CA). Amine containing arm All reagents, including suhoamidite precursors, were purchased from Applied Biosystem. provided by s. After cleavage and deprotection from the support, sodium acetate solution (3M) And cold ethanol (-20 ° C) are added to define the oligonucleotide sequence (Error in original text). 1.2.2 Synthesis of oligonucleotide-5'-biotin conjugate After drying the amine-containing oligonucleotide, it contains 0.15 M NaCl. And dissolved in a 0.2 M sodium carbonate buffer (pH 8.8). Next, DMF Biotin solution (biotinoylamidocaproic acid N-hydroxysuccinate (Doester, Boehringer) (5 mg / l) is added. 2 at 37 ゜ C After warming for 10 hours, add 10 microliters of ammonium chloride solution (1M). To stop the reaction. Then, the biotinylated oligonucleotide was placed at -80 °. C, precipitate in ethanol and sodium acetate (3M), dissolve in pure water, reverse phase H Purify by PLC. Its concentration was determined by UV measurement at 260 nm. 1.2.3 Synthesis of oligonucleotide-5 'fluorescein conjugate After drying the amine-containing oligonucleotide, it contains 0.15 M NaCl. In a 0.2 M sodium carbonate buffer (pH 8.8). Next, in DMF Fluorescein isothiocyanate (Aldrich) solution (12.5 mg / l) is added. After heating at 55 ° C for 2 hours, the ammonium chloride solution (1 The reaction is stopped by adding 25 microliters of M). Next, the fluorescent The gonucleotide is precipitated and purified as described above. The concentration is set to 260 nm U It was determined by V measurement. The purity of these various conjugates is checked by reverse phase HPLC. 1.3 Method of grafting (immobilizing) oligonucleotide (pair ligand) The solid support chosen for the experiment is a microscope slide. This is of this type It is a common support for analysis. The dimensions of the slide used were 75 x 25 x 1 mm is there. The method of immobilizing the oligonucleotide to be used includes glass surface derivation and Consists of technologies commonly used in molecular biology. The first step is to graft amine groups onto the glass surface by silanization. It consists of doing. In the second step, a cup that reacts strongly with the amine The surface is activated by a ring agent. In the third step, avidin is added Of activated amino acids by the reaction of primary amine with coupling agent Graft associatively. Finally, in the final step, the biotinylated Gonucleotides are immobilized on this surface by strong binding of biotin with avidin Become This method involves attaching oligonucleotides to the glass surface at their 5 'end. Guarantee. Detailed protocol 1. Glass slides were diluted to one-tenth with sulfochromic acid (Prolab). Wash with o), wash with water and dry at 80 ° C. for 15 minutes. 2. Contains 1% of 3-aminopropyldimethylethoxysilane (ABCR) The slide is immersed in a toluene solution (vol / vol). Leave at room temperature for 20 minutes Let it. 3. Wash slides twice with ethanol and dry at 80 ° C. for 15 minutes. 4. Slides were prepared with 10% pyridine (vol / vol) and 1,4-phenylene. 0.2% (w / vol) of diisothiocyanate (Aldrich) Dimethylformamide. Let stand for 1 hour at room temperature. 5. Wash slides in methanol, then acetone and at 80 ° C for 15 minutes dry. 6. Place 2 μl of a solution of avidin droplets at desired locations. Avidin solution 10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA, avidin 1 mg / m 1 (Sigma). Let stand at room temperature for 20 to 30 minutes. 7. Aspirate avidin droplets with a pipette. 8. Wash the avidin deposit with 1 M NaCl solution and deposit 2 μl droplet again. And blow it up with a pipette. 9. Drop 2 μl of biotinylated oligonucleotide (5 μM) at the same location To be deposited. Let stand at room temperature for 30 minutes. Remove the droplets with a pipette. This oligonu The nucleotides were 10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA, 1 m M NaCl. 10. Slides were made with 1% ammonium hydroxide (vol / vol) and 1M NaC d. This is left at room temperature for 10 minutes. 11. Wash slides and dry in air. The slides are ready for hybridisation, i. Determine the coupling position and place the oligonucleotides accurately on a glass slide Steps 6 to 9 are used to determine the position of the Gilson robot, model 22 Automated by 2. This robot is a Cartesian robot with a needle connected to a dilutor. It consists of a bot arm. Accurate and reproducible with this assembly Drops can be deposited and drawn up in a manner. 1.4 Hybridization and visualization of complex fluorescence (characterizing the presence and / or amount of complex Variable) Fluorescent oligonucleotide was added to the following buffer in 10^-7At a concentration of Hybridized on the surface carrying the oligonucleotide. 50 mM Tris pH 8 -Cl; 4.5M TMACl; 2mM EDTA; 0.01% sarcosine. This buffer is obtained from reference 4. The hybrid volume is 150 μl. This volume is a 24 x 50 mm glass cover When using a slip, this corresponds to a liquid film of about 0.1 mm thickness. Hybridization time is 1 h. Slides and glass in an isothermal hybrid in a tank or water bath to provide the required temperature Was performed between cover slips. For the hybrid according to the invention by means of a thermal gradient (see below), the hybrid solution (liquid medium) Is deposited directly on a metal block that is supported at an angle and the oligonucleotide The supporting slide was applied thereon, taking care not to form bubbles. The visualization of hybrids (complexation), that is, observation, Fluorim from s Company (Sunnyvale, California, USA) This was performed by fluorescence using an ager (fluorescence image) device. This device uses argon Irradiation by laser light (excitation at 488 nm) site by site and site by site By scanning the surface of the object to be observed, it is re-emitted by the bundle of optical fibers and observed and detected Collect the light. 515nm high bout (sic, original error) filter Are integrated in this device in a non-exchangeable manner. Add more filters to collect light It is possible to better select the observed light with respect to wavelength. For observation, an interference filter of 530 ± 30 nm is attached, and light amplification in the device is performed. The vessel was set to 920 volts. The size of the pixels in the resulting image is 200 × 20 0 μm square. The coupling position consists of a disc with a diameter of about 2 mm, This represents the final image of each site on the order of about 10 pixels. Oligonucleotides (pair ligands) are short in length, allowing rapid DNA complexing even at room temperature Great dissociation occurs in the sequences with the lowest stability (sequences A and B). Therefore, high hybrid The following method was developed to observe with reliability. 1. Immediately soak slides in hybrid buffer cooled to -20 ° C. Stir . 2. 20X SSC (Ambesco, S.) cooled slides to -9 ° C olon, Ohio, USA). Stir. These two steps should be performed within a maximum of 10 to 15 seconds. 3. Immediately soak slides in hybrid buffer cooled to -20 ° C. At this temperature This buffer does not cause dissociation of the complex. This buffer must be degassed. It is necessary. 4. Slides from a solution containing target (ligand) oligonucleotides Take out. Place a pre-chilled glass coverslip on top. Slide bottom Wipe quickly. 5. Immediately, observe and observe with a fluorescent imager. Hybridization quantification was performed using this fluorescence imager and Molecular Dynamics. Performed by ImageQuant® software provided by the company . The above protocol was repeated on the same slide, with 25% hybrid signal Guarantee the coefficient of variation of 1.5 Hybridization results at isothermal 10 oligonucleotides (pair ligand), bA, bB, bC, bD, bE, b A slide carrying F, bG, bH, bI, and bJ was prepared, and three kinds of fluorescence were prepared at 4 ° C. Hybridized with a mixture of oligonucleotides (ligands), fBc, fDc and fJc Was performed. The initial concentration of each is 10 @ -7 M. The quantitative results of these hybridizations are summarized in Table 1. This is the average of repeated experiments, the hybrid signal is a complex signal, bJ: FJc Displayed as a function of From the values in Table 1, the difference between the intensity of a strong hybrid signal and that of a very weak signal is about 15 times. . Undetectable hybridization is at least 20 times weaker than strong hybridization. As expected, the hybrids obtained from the oligonucleotides bB, bD and bJ Is strong because the free oligonucleotides in solution were the respective complementary strands. Hybrids obtained from bC, bE, bF and bH are extremely weak and cannot be detected However, this means that internal inconsistencies are easily distinguished from perfect pairings. I have. On the other hand, the same is not true for external mismatches. In fact, bA is relatively weak Generates a strong composite signal that is comparable to a perfectly paired signal while generating a composite signal. The same is not true for bG and bI. Thus, by the complex bA: fDc The external inconsistencies that form are accurately distinguished, but the complexes bG: fDc and bI: fJ The external mismatch created by c is not. Under these experimental conditions, therefore, the fine analysis of unknown samples (liquid medium) Is not possible. Performing the above hybridization on an unknown sample gives the oligonucleotide, b B, bD, bG, bI and bJ will be determined as hybridization with the sample, Indicates a false positive level of 40%. To improve the identification of external mismatches, one can consider increasing the hybrid temperature. To explore this solution, six oligonucleotides, bA, bB, bD , BG, bI and bJ are immobilized on slides, at different temperatures, 4, 10, 20, Mix with oligonucleotides, fBc, fDc and fJc at 25, 30 and 37 ° C Performed. FIG. 1 shows the hybrid results obtained at temperatures between 4 and 25 ° C. this Are the average values obtained from 16 to 42 measurements. The result is that the compound is the most Since it is considered to be stable, it is expressed by the relative light intensity of hybrid, bJ: fJc. This The absolute intensity of the hybrid signal of the complex of course decreases with increasing temperature. FIG. 1 shows that the hybrid profile at 10 ° C. is similar to that obtained at the hybrid at 4 ° C. Which indicates that. On the other hand, some changes occur at 20 and 25 ° C. That External mismatch, bG-fDc, is significantly weaker than perfectly paired bI: fJc. same Thus, external inconsistencies, bI: fJc, are not likely to be completely distinguished during a single hybrid. Although slightly lower, complete pairing is noticeably weaker than bJ: fJc. But, Perfect pairing, bB: fBc also reduces strength, mismatched duplexes, bI: fJc Generates a weaker signal than the signal. Therefore, a completely paired compound can be It is not possible to select a hybrid intensity threshold that separates without error from the body. For example , At a threshold of 0.5, selected to hybridize at 25 ° C. Do bB will be determined as negative, oligonucleotide, and bI as positive. Obedience Thus, the end result will consist of false positives and false negatives. Next, if a hybrid of 20 ° C. is selected with a threshold of 0.4, the variation of the experiment will Not only oligonucleotides and bBs are actually positive, Nucleotides, bI, and sometimes oligonucleotides, bG, are similarly determined. II Solution according to the invention with thermal gradient 2.1 Description of the assembly enabling the application of thermal gradients To solve the problem of discrimination between external mismatches disclosed above, immobilized oligonucleotides A thermal gradient can be established on the surface of a glass slide carrying leotide, and a multi-composite support We designed and developed a processing device that can be configured. This device meets the following specifications: 10 ° C temperature gradient in a useful or working zone of -1 cm length Knowledge of the temperature of the slide substrate at all points within -0.1 ° C -Reproducibility of slide substrate temperature for each test: 0.1 ° C within 0.1 mm. 2 Room temperature from 0 to 25 ° C must be freely changed. -Ease of installation and removal of glass slides carrying oligonucleotides. The easiest way to establish a thermal gradient on the surface of the board is to attach In this method, the cold source 3 and the heat source 4 are connected. Thermal gradient established between two sources Is done. If the substrate is of constant thickness, the temperature gradient is constant, i.e. the temperature is Linearly changes over the substrate as a function of the distance. From a practical standpoint, a glass slide on which oligonucleotides are immobilized 2 can be easily replaced for each test, and there is no difference in heat exchange between different tests. Is necessary. This is because the thermal gradient is not established directly in the glass slide, This is why a small cavity 1a in the surface was established in the dug metal block 1. . The glass slide 2 is placed in this cavity and the immobilized oligonucleotide Its side facing downwards. Metal blower supported by wedge 11 Between the rack 1 and the glass slide 2, a mixed solution 5 (see FIG. 4), ie, a liquid medium You. In FIG. 4, a stop 6 for setting the position of the glass slide 2 is shown. . In practice, slides are placed in contact with these stops. Oligo on slide During the immobilization of the nucleotides, the position of the oligonucleotide under the thermal gradient From the edge 2a of the slide in contact with the stop. Metal block 1 has, for example, a thermal conductivity of 10 to 50 W / m. K stainless steel 3041 It is composed of This is, for example, 0.06 W / m. Has intrinsic conductivity of K or less However, it is insulated by a cover 7 made of, for example, polyurethane. The end of this device allows for the circulation of cold and heat sources, According to the recommended value of ister Huber, -25 / + 120 ° C), the heat fluctuation rate is ± 0.02 Connected to a water bath that is stable at ゜ C. The temperature of the device was determined by the chromel-alumel thermocouple (type K) described in FIG. Controlled by In mixed solutions, thermocouple TCI (sic, incorrect in original text) and And TC4 are located on either side of slide 2 while the entire length of the wire is Thermocouples TC2 and TC3 with a diameter of 0.08 mm are located under the glass slide are doing. These thermocouples were directly electrically welded to the steel. Those places Position (median value of the two wires of the thermocouple) is placed on the micrometer table x, y. It is determined within 0.02 mm by such a binocular lens. These are ice It has a cold junction immersed in a cold pure water bath and is placed differentially. The differential voltage is , High-precision multimeter (Keithley, model 2000, accuracy: 0.1) μV) and is converted to temperature by the standard table for these thermocouples. The dimensions of the processing apparatus described above are indicated by marks with characters in FIG. 0 mm, BB: 40 mm, CC: 20 mm, DD: 15 mm, JJ: 120 mm , EE: 10 mm, FF: 10 mm, GG: 20 mm, HH: 40 mm, II: 12 mm. The linearity of the thermal gradient, predicted from numerical simulations, was It was checked experimentally with a thermocouple as the foundation. The slope is linear, slide 2 The temperature at some point in the useful zone is determined by the temperature provided by thermocouples TC2 and TC3. Easy to calculate. Temperature measurements made at different times for several temperatures of hot and cold sources are The temperature distribution shows that the reproducibility is within 0.1 ° C. In many of the experiments reported here, the cold water bath was at -9 ° C and the hot water bath was at + 61 ° C. Adjusted. The liquid of the cold source 3 is glycol-containing water (25% glycol), In 2 it was pure water. The established gradient was 1.085 ° C / mm. 2 At both edges of the glass slide 5 mm apart, 13.2 and 40.3 ° C. respectively Met. 2.2 Oligonucleotides at their predetermined optimal hybridization temperature Positioning Isothermal hybridization results indicate that the hybridization temperature of each oligonucleotide is accurate between external mismatches. It is necessary to be sufficiently high for proper identification. But this The temperature should be low enough at the same time to be able to detect hybrid signals. is there. In the above apparatus, the hybrid temperature is 2 of the hybrid signal obtained when the hybrid signal temperature is 4 ° C. The temperature was set to be equal to 5%, but this temperature was fixed to the immobilized oligonucleotide. The degree of saturation. The position and distribution of the glass slide 2 (plate support) It will be determined roughly. To accurately position each of the oligonucleotides under the gradient, Slides carrying oligonucleotides in the direction of were prepared. The five binding sites of the quintuple are connected to the cold edges 2a to 5, 8 . 8, 12.6, 16.4 and 20.2 mm. These slides are then It was hybridized with various combinations of complementary fluorescent oligonucleotides. FIG. Are the result of such hybridization by the oligonucleotides fBc, fDc and fJc. . In this experiment, the water bath for the thermal gradient was set at -9 and + 70 ° C. At the end of several such experiments, the position of the binding site on the different oligonucleotides Locations were clarified. bA: 23.5 ° C; bB: 23 ° C; bD: 26.5 ° C; bG: 2 7.5 ° C; bI: 27.5 ° C; bJ: 29 ° C 2.3 Hybridization results under thermal gradient according to the invention For this experiment, oligonucleotides, bA, bB, bD, bG, bI and bJ was moved from the cold edge 2a of the slide 2 to 9.5, 9, 12.2, 13.2, respectively. , Immobilized on 13.2 and 14.6 mm glass slides. Cold and heat source The water bath was set at -9 and + 61 ° C. These positions correspond to the temperatures identified above. Respond. According to the diagram in FIG. 7, the deposition of the oligonucleotide was performed in duplicate. . Each slide (2) was then subjected to the fBc, fDc and fJc previously used in the isothermal heat hybrid. Hybridization was performed under a thermal gradient with the same mixture of FIG. 8 summarizes the obtained hybrid results. These are average values of five measurements. this The results are similar to the results presented in FIGS. 1a to 1d, hybrid, bJ: fJc relative strength Expressed as degrees. The three perfect pairings produce a hybrid signal (0.84 to 1) of comparable strength , Whereas the externally mismatched signal is significantly weaker. Obtained by isothermal heat hybridization In contrast to the above results, here the intensity threshold that separates perfect pairing from For example, it can be determined as a threshold value of 0.7. To check the correct operation of the above instrument, use the same slide Other combinations of nucleotides, fAc, fBc, fDc, fGc, fIc and fJc And hybridized. These combinations systematically combine the oligonucleotide, fBc. contains. In addition, they are fIc or fJc and fAc or fDc, or Contains fGc. In this manner, the three fluorescent oligonucleotides of each combination are: Because they do not pair with the same fixed oligonucleotide, their hybridization Did not cause interference. Combinations containing fAc, fGc and fIc may also be used. Was. In fact, the cross hybridization between sequences A and G is very low (see results below). Table 2 reports the results of these hybrids. These are composites, hybrids of bB: fBc Expressed relative to signal strength. In addition, for non-matching, the result is Expressed relative to the hybrid signal. These results show that all perfect pairings produce similar intensity signals. I have. However, paired bG: fGc has a standard deviation of 0.22 for six measurements. , 0.79, a small but weak signal is generated. Exclude experiment variation The probability that the true signal is effectively smaller than I is therefore as high as about 97%. Therefore This means that the position of G in the thermal gradient is slightly hot in this experiment, This indicates that repositioning can be performed. Furthermore, these results indicate that the external mismatch is a perfect duplex bB: fBc or each of them. It also shows that the signal generation is much weaker than the full analog. Combination, fBc + Compare to fully-referenced duplex, as in the case of hybrid singularities with fDc + fJc A threshold of 0.7 that can identify perfect pairing from external mismatches I do. Next, the oligonucleotide and bG were set at the position of 26.8 ° C. 2 12.5 mm from the cold edge 2a), leaving the position of the other oligonucleotides unchanged. A new experiment was performed on the loose slides. Transfer these slides to a fluorescent Gonucleotide combinations, fBc + fGc + fIc and fBc + fGc + fJc By hybridization. Complex, bB: hybrid of bG: fGc compared to fBc The average of the signal was 1.08 with 7 measurements and the standard deviation was 0.32. Next, irregular Combine the bG: fDc and bG: fAc signals with the previous value up to the new temperature for bG. And extrapolate them by multiplying them by the ratio of 1.08: 0.79 = 1.367. Was. Similarly, the mismatch b compared to their corresponding full analogs, bG: fGc By dividing the signal of D: fGc and bA: fGc by the leading value by 1.367, Inferred from. All these results and calculations are listed in Table 3. As expected, these new results confirm and refine previous results. All of While perfect pairing produces a hybrid signal approaching unity, the signal is slightly less than 0.5 Excluding the large bI: fJc, end mismatch produces a signal of 0.5 or less. 0 . A threshold of 7 allows a clear distinction of perfect pairing from external mismatches. 2.4 General oligonucleotides Application to biochip operation For example, oligonucleotides carrying all “65536 possible octamers” While using a biochip, you can determine whether the signal is positive or negative. Simply applying the intensity threshold to determine it is not very effective. Real The most stable mismatched signal is only twice as weak as the perfectly paired signal, A certain number of perfect pairings are detected as negative due to fluctuations in Partial inconsistency may be determined as positive. For example, all data summarized in Table 3 In terms of data, out of the 39 reported, fully paired signals below a threshold of 0.7 External mismatches with 2 signals (5.1%) and above a threshold of 0.7 were measured 56 times. It is 2 (3.6%) within the limit. This is the value of compound bJ: fIc, bJ: value of fIc. These two complexes are the only three of the experiments performed. Also form a stable mismatched duplex part. A more efficient approach to treatment is to use all the residues that differ only in the terminal nucleotides in the same group. All oligonucleotides (biochips carrying all possible octomers) 16 octomers for each group and determine the strongest signal for each group Method. In that case, identify the positive group from the negative group This is easy because this involves identifying perfect pairings and internal inconsistencies. You. For example, a threshold of 0.4 is applied for the strongest signal. Next, for each group of oligonucleotides, a threshold of 0.7 was set to the strongest. It can be applied to signals that are too small. Performing this procedure for all experiments reported in Table 3 will result in complete pairing Greatly exceed the 0.4 threshold for the strongest signal in the experiment, No pairing is determined to be active. On the other hand, false positive The two values determined incorrectly remain positive. Therefore, applying these data, oligonucleotides that work in this manner The biochip has a false negative rate of 0% and an internal mismatch false positive 0% rate, and practically about 10% false to 30-40% external mismatch False positives of mismatches corresponding to positive percentage of The active ratio will have 3-4%. Such false positives and falsehoods Negative ratios have significantly improved the state of the conventional treatment with isothermal hybridization. And This ratio can be used to determine the sequence order of the nucleic acid sample by hybrid ordering. It is low enough to allow construction. In practice, the remaining hybrid error is Can be modified by appropriate data processing software utilizing hybrid redundancy (5) . Perform two hybrids instead of one for each sample to further improve the quality of results It is possible to At that time, the false positive rate was 30 due to external inconsistency. They should be on the order of 1% for 40%.Table 2 Hybrid results in thermal gradients. bB: strength relative to perfect pairing for fBc Continuation of Table 2 Identify external inconsistencies (1) bB: fBc is at 23 ° C. (2) Average of ratio (compound / bB: fBc) (3) Number of measurements (4) Average of ratio (Complex / Complete complex of fluorescent oligonucleotide) Table 3 Hybridization results in thermal gradient with bG set at 26.8 ° C bB: strength relative to perfect pairing for fBcContinuation of Table 3 Identify external inconsistencies(1) bB: fBc is 23 ° C. (2) Average of ratio (compound / bB: fBc) (3) Number of measurements (4) Average of ratio (Complex / Complete complex of fluorescent oligonucleotide) (5) Average value calculated by multiplying the value in Table 2 by 1.367. n and standard deviation are invariant You. (6) Average calculated by dividing the values in Table 2 by 0.367 for the ratio of complete duplexes value. n and standard deviation are unchanged. Necessary references included in this description (1) K. R. Khrapko, V .; P. Lysov, A .; A Khorlyn , V. et al. VShick, V .; L. Florentiev, A .; D. Mirzabe kov: Oligonucleotide hybridization to DNA sequencing; FEBS Lette rs; 1989; 256; 118-122. (2) M.P. J. Doktycz, M .; D. Morris, S.M. J. Dormad y, K. L. Beattie, K.M. B. Jacobson: 128 octamer D Optical melting of the NA complex; Biol. Chem. 1995; 270; 84 39-8445 (3) K. J. Breslauer, R .; Frank, H .; Blcker, L . A. Mary: DNA complex stabilit (error in original text) Prediction; Proc. Natl. Acad. Sci. 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(1989); Genomics 4: 114-1. 28; (11) Sze VLSI Technology; McGraw Hill; 1983

Claims

[Claims] 1. By combining a liquid medium containing one or more components, the liquid A process for determining the presence of a plurality of different ligands in a free state in a medium, comprising: a) separated from each other, each being heterogeneous therein, and each of said ligands Distribution of multiple binding sites where multiple pairing ligands that can be complexed are immobilized, A placed multi-composite support is prepared, b) contacting the liquid medium with the composite support, whereby the ligand In the method of being paired with the counter ligand and being attached to the support, The stability of each ligand / pair ligand complex is called the reference parameter and Direct or indirect to at least one extrinsic parameter that sets the condition of the body On the other hand, the exogenous reference having different values at the site. As a function of the illumination parameters, the binding sites on the support are distinguished, while Ligands determine the stability of each different ligand / pair ligand complex, respectively. Between different binding sites as a function of a predetermined optimal value of the illumination parameter. A processing method characterized by being clothed. 2. Contacting in accordance with (b) above means that virtually all ligands are paired with the ligand. The same minimum value of the exogenous reference parameter should be used for all binding sites sufficient for complexation. Done by applying, then differently predetermined for different binding sites The support is washed by applying the specified extrinsic reference parameter values. The method of claim 1, wherein: 3. The contact according to the above (b) is different from each other Performed by applying one extrinsic parameter value to different binding sites; In addition, different binding sites are defined by different second predetermined of exogenous reference parameters. Wash the support by holding at the specified value, except that the exogenous reference parameter Wherein the first value of the data is the same or different from the second value, respectively. 2. The method according to 1. 4. The support is attached to a different and predetermined exogenous reference The hybridized support is contacted with the liquid medium by applying the The cleaning method according to claim 1, wherein the cleaning is performed by a cleaning liquid at a relatively cool constant temperature. The method described. 5. The spatial slope of the extrinsic reference parameter, in particular the slope of said parameter Setting at least one reference direction of the support on the support, wherein the spatial inclination is Characterized by fixing the positions of various binding sites and the distribution of paired ligands between the binding sites The method of claim 1, wherein 6. The extrinsic reference parameter is -Any of the physical parameters or conditions, e.g. temperature -Or, for example, an anti-ligand surface that can be paired with virtually all paired ligands Chemical, biochemical or biological parameters on the surface of the support such as concentration Or conditions, -Alternatively, the support, for example, wettability to liquid media or surface tension The physico-chemical parameter at the surface. the method of. 7. The stability of the different ligand / pair ligand complex depends on at least one other Extrinsic parameters dictate the stability of different ligand / pair ligand complexes The average value between the values of the other parameters to be set. The method of claim 1. 8. On the one hand, the binding sites on the support have different values at said sites. Is distinguished as a function of one of the extrinsic reference parameters; Also determine the stability of different ligand / pair ligand complexes between different binding sites Distribution as a function of predetermined optimal values of other extrinsic reference parameters to be determined. Sa The method of claim 1, 2, 3, or 4, wherein 9. Signals representing the presence and / or amount of different ligands in the original liquid medium; And / or the presence of different ligand / pair ligand complexes and / or Or the variable representing the amount is observed at different binding sites on the support The method according to claim 1. 10. The different ligand / pair ligand complexes are operated in the following manner, namely to the components of the liquid medium. At least the label and the label on the different ligand / pair ligand complex attached to the support The method of claim 9, wherein the method is observed using any one of the methods. 11. Organism in which the liquid medium contains one or more different components to be analyzed Claims obtained from a sample, such as a biological sample or a biological material. 2. The method according to 1. 12. Equal to or directly derived from various components, representing components , Selected to obtain one or more components in the treated medium 12. The method according to claim 11, wherein at least one preliminary operation is applied to the sample. Law. 13. To separate unbound components from the support and / or Selected for elution or release, with or without discrimination Also, at least one of the following operations is appropriate for the complexed support to which the various ligands are attached. The method of claim 1, wherein the method is used. 14． The ligand is used as a complementary probe made by the corresponding pair ligand. The target nucleic acid is amenable to hybridization with the nucleotide sequence, especially in single-stranded form. The method according to claim 1, which is a nucleic acid containing a reotide sequence. 15. The liquid medium comprises several different components, each consisting of a different ligand; Thereby, the different components are attached and inter-connected on the composite support. The method of claim 1, wherein the method is separated into: 16. The following operations, i.e. identification, quantification, separation and fractionation of the different molecules 16. The method according to claim 15, wherein any one of the two is performed. 17． The liquid medium consists of several different ligands or different ligands Contains a single component in which the child is present, whereby the component is a different paired ligand and The method of claim 1, wherein each pair is a pair. 18. The only component is the nucleotide sequence that is the probe for the ligand. According to the target nucleotide sequence, each of which is complementary, at least one strand A nucleus in which a stretch of nucleotides defines multiple hybrid regions and therefore multiple ligands 18. The method according to claims 14 and 17, wherein the method is an acid. 19. The following operations, ie, the arrangement of nucleic acid components in a liquid medium by hybridization Analysis and / or identification of sequence, nucleic acid material or sample, classification of nucleic acid material 19. The method according to claim 18, wherein one is performed. 20. Consists of one identical fragment or several different nucleic acid fragments 15. The nucleic acid sample according to claim 11, wherein a liquid medium is obtained. the method of. 21. The following operations, i.e., selected from denaturation, cloning, and amplification, 21. The method according to claim 20, wherein at least one preliminary operation is applied to the nucleic acid sample. The method described. 22. By compounding a liquid medium containing one or more components, the liquid medium An apparatus for determining the presence of a plurality of different ligands in free form in the body, comprising: The device -Separated from each other, different inside each other, and possible to complex with each of the above ligands Multiple binding sites are immobilized on which multiple binding sites are distributed A support for multi-complexing, -Combining the ligand and the counter ligand, and attaching them to the support; Means for contacting the liquid medium, designed to be applied, with the support; Consisting of The stability of each ligand / pair ligand complex is called the reference parameter and Direct or indirect to at least one extrinsic parameter that sets the condition of the body While the device further comprises a function of the extrinsic reference parameter. The different values of the parameters at the site on the support Means for differentiating the binding sites, while the pairing ligands are each a different ligand / pairing ligand Pre-determining said exogenous reference parameter to determine the stability of the ligand complex respectively Distribution between different binding sites on the support as a function of the optimal value determined An apparatus characterized by the above. 23. The extrinsic reference parameter selected for conjugation is temperature, Another means is to ramp the temperature according to at least one reference direction, for example by a temperature gradient. 23. The device of claim 22, wherein the device is designed to be tilted. 24. The apparatus has a cold source and a heat source at both ends of the substrate (2) along the reference direction. The device according to claim 23, characterized in that: 25. Each is bound to a different binding site on the support, and each is A variable representing the presence and / or amount of ligand / pair ligand in the Including a sensor that supplies further measurement signals or corresponding information 23. The apparatus according to claim 22, wherein 26. Different sensors may be used to obtain information identifying components in the liquid medium. Based on predetermined mathematical and / or logical operations The apparatus according to claim 25, comprising a processing unit. 27. The observed variables are the following variables: absorbance, outgoing light or re-emission The intensity of the light and the physical, optical, electrical, and attractive properties of the various ligand / pair ligand complexes. 27. The method according to claim 26, wherein the material is selected from electrical or electrochemical properties. apparatus. 28. 23. The device according to claim 22, wherein the support is flat. 29. The support may be any of the following materials, glass, porous materials, vitreous, inorganic or non- Claims: At least one of a crystalline material and a plastic material. Item 23. The device according to Item 22.