【発明の詳細な説明】
電気泳動ゲル、ファイバースペーサーを有するゲルホルダーおよびその製造方
法
発明の背景
ＤＮＡ配列決定は、実験室レベルで設計された自動化システムを用いて行うこ
とができる。ＤＮＡ配列決定のための方法および装置は、米国特許第4,811,218
号明細書；同第4,823,007号明細書；同第5,062,942号明細書；同第5,091,652号
明細書；同第5,119,316号明細書および同第5,122,345号明細書に記載され、これ
らをここに参照として引用する。
これらのシステムに使用される一般的な方法は、制限エンドヌクレアーゼを用
いてサンプルＤＮＡを分断し；対象となる制限フラグメントを増幅し（例えばＰ
ＣＲを用いる）；増幅されたＤＮＡと配列決定プライマー（これは増幅プライマ
ーと同じまたは異なっていてもよい）を組み合わせ；通常のヌクレオチド（Ａ、
Ｃ、ＧおよびＴ）および導入されたときにプライマーのさらなる伸長を抑制する
デオキシヌクレオチドのような鎖停止ヌクレオチドの存在下、配列決定プライマ
ーを伸長させ；得られた伸長したフラグメントの長さに応じて生成物を分析する
ことを包含する。フラグメントの分析は、例えばポリアクリルアミドゲルを用い
た電気泳動により行われる。
ゲルを用いて核酸配列の分析を行うにあたり、ゲルのサイズや厚さのようなゲ
ルの特徴は、分析を行うのに必要な時間およびコストに影響を及ぼす。診断用の
製品として配列決定の利用性を改善するために、配列決定の分析の時間およびコ
ストを減少させるのが望ましいので、短時間でオリゴヌクレオチドフラグメント
の極少量を分析できるゲルを提供するのが有利である。また、ゲルが満たされた
ときにこれらの所望される特性を提供する、大規模に製造され得る一回限りで使
い捨てのゲルホルダーが有利である。
分析時間が短く、配列分析に求められる高い生産性を達成するために、顕著に
薄いゲルを製造することが試みられてきた。とくに多く見られるのは、ゲルを囲
む基体間に極めて均一な空間を形成しかつ維持する組み立て技術を展開し、ゲル
自身に均一な厚さをもたせるというものである。米国特許第4,929,329号明細書
および同第5,164,066号明細書には、例えば前面および後面プレート間のスペー
サーとして、マイラーまたはナイロンモノフィラメントからなる薄いフィルム（
約０．１０〜０．０２インチ厚）を用いる電気泳動ゲルの形成が開示され、ここ
に参照として引用する。スペーサーはプレートに接着されるのではなく、単に２
つのプレート間におかれ、２つのプレート間のスペースがゲル形成溶液で満たさ
れるときに、クランプを用いて正確な場所に固定される。重合後、重合したゲル
は、正確な場所に配置された２つのプレートに保持される。
これらの特許に開示された電気泳動ゲルの製造方法は、幾つかの欠点を有する
。第１に、ゲル充填操作のときにスペーサーを正確な位置におき、これを保持す
る必要があり、得られるゲルは大規模生産に適合しない。また、ゲルは一旦製造
されると保存期間が短く、またゲルはプレートおよびスペーサに保持されるので
、使用する時点で装置の組み立てを行わなければならない。このことは、多くの
ゲルの製造において、あるいは使い捨ての一回限りの使用のゲルホルダーの製造
において、上記特許に開示されているようなスペーサの使用を困難にしている。
本発明の目的は、容易に製造することのできる、均一な厚さの非常に薄いゲル
チャンバーを有する使い捨ての一回限りの使用のゲルホルダーを提供することに
ある。
さらに本発明の目的は、容易に製造することのできる、均一な厚さの非常に薄
いゲルチャンバーを有する使い捨ての一回限りの使用のゲルホルダーの製造方法
を提供することにある。
さらにまた本発明の目的は、容易に製造することのできる、均一な厚さの非常
に薄いゲルチャンバーを有する使い捨ての一回限りの使用のゲルホルダーにおい
て形成された電気泳動ゲルを提供することにある。
発明の要旨
本発明の上記の目的およびその他の目的は、接着剤を用いてゲルホルダーを形
成する基体に固定されたファイバー、とくにグラスファイバーを用いる電気泳動
ゲルのためのゲルホルダーを形成することにより達成される。したがって、本発
明の一つの見地は、次に示す方法である：
（ａ）平面の第1基体および平面の第2基体間に接着剤をコーティングした複数
のファイバーを配置し；
（ｂ）前記ファイバーが前記第1基体および第2基体に接着するように基体の外
側に圧力を施し、これにより前記第1基体および第2基体間にゲルチャンバーを形
成し、前記ゲルチャンバーはファイバーの内部コアにより決定された厚さを有す
るものである。
これとは別に、コーティングしていないファイバーを2つ1組にしておき、この
1組の各ファイバー間のラインに接着剤を施すこともできる。接着剤が硬化した
とき、これはスペーサーとして正確な場所にファイバーを接着し、また互いに第
1および第2基体が固定される。同時に、ファイバーはゲルコンパートメントから
接着剤を分離する。このようにして、ゲルチャンバー内のゲルの重合を接着剤が
干渉することが防がれる。
このような方法により形成されたゲルホルダーは、ポリアクリルアミドのよう
なゲル形成溶液で、迅速に満たされるか、あるいは無期限に貯蔵し、必要なとき
に使用することができる。
本発明のさらなる見地は、ゲルホルダーおよび電気泳動ゲル製品であり、次の
要素を含む：
（ａ） 平面の第1基体；
（ｂ） 平面の第2基体；および
（ｃ） 前記第1基体および第2基体間に1つとして、あるいは対として配置さ
れた複数のファイバーを含む。ファイバーは、接着剤を用いて基体に接着され、
ファイバー、第1および第2基体は、共同して、ファイバーの直径により定められ
た厚さを有するゲルチャンバーを形成する。最終的な電気泳動ゲルにおいて、こ
のチャンバーはポリアクリルアミドゲルのような重合性ゲルで満たされる。
図面の簡単な説明
図１Ａおよび１Ｂは、本発明のゲルホルダーの第１の態様を示すものである。
図２Ａおよび２Ｂは、本発明のゲルホルダーの2つの態様を示すものである。
図３は、本発明に有用な接着剤でコーティングされたファイバーを示すもので
ある。
図４は、検出照射線および検出システムがゲルの同じ側方面に対してなされる
装置に有用な本発明の態様を示すものである。
図５は、本発明の電気泳動ゲルを示すものである。
図６Ａおよび図６Ｂは、本発明のゲルホルダーの薄い領域の使用を示す図であ
る。
図７Ａおよび図７Ｂは、薄い領域を有する別の構造を示すものである。
発明の詳細な説明
図１は、本発明のゲルホルダーの第１の態様を示すものである。ゲルホルダー
は、上部の基体１０、底部の基体１１および複数のファイバー1２から形成され
る。ファイバーの断面は、図示したような円形や、卵型や矩形であることができ
る。ファイバー１２は、互いに平行にかつ基体１０、１１の対向端部に平行に配
置され、基体の一つの末端から互いに伸びている。底部の基体１１は、電気泳動
のサンプルの充填を容易にするために、示したようにゲルホルダーの末端で、上
部基体１０を超えて伸び、電気泳動のサンブルの充填を容易にしている。このよ
うに、上部の基体と末端を同じくするか、あるいは図１Ａに示したように、底部
の基体が広がって伸びている。これとは別に、開口部１３が、この目的のために
上部の基体のひとつの末端付近に設けられている（図１Ｂ）。
図２Ａは、図１に示す４つのファイバーではなく、２つのファイバーを有する
ゲルホルダーを詳細に示している。ファイバー１２は、上部の基体１０および底
部の基体１１と接触し、接着剤２１により基体に接着している。ファイバー１２
、上部の基体１０および底部の基体１１は、電気泳動ゲルで満たされるチャンバ
ー２０を共に形成している。
図２Ｂは、本発明の別の態様を示している。この場合、ファイバー１２は、対
をなして基体間におかれ、2つのファイバー間の空間を満たすように接着剤が線
上におかれている。この空間は、隣接する対をなすファイバー間と比較して非常
に小さく、好ましくは図2Bに示したように、2つのファイバーが互いにほぼ接触
するように並んでおかれたときに生じる空間である。
接着剤は、基体およびファイバーの材料を結合できるものであれば特に制限さ
れない。好適な態様において、これはガラス−ガラス結合であるが、幾つかの用
途によってはガラス−プラスチック結合であることもできる。好適な接着剤は、
紫外線硬化性アクリレート接着剤、例えばM36,427タイプ６８（Edmund Scientif
ic）または熱硬化性アクリル接着剤、例えばEPO-TEK 353 ND（Epoxy Technology
Inc．）等が挙げられる。多の適切な接着剤は、Deco Cementまたは5-minute Ep
oxy(Thorlabs)である。
もし接着剤が、図2に示した態様のように、ゲルがチャンバーを満たしたとき
にこれと接触するかもしれないならば、幾つかの接着剤が、ゲルの重合に悪影響
を及ぼすことに注意するべきである。すなわち、紫外線硬化性のゲルのためのホ
ルダーにおける紫外線硬化性接着剤の使用は、接着剤およびゲルの硬化への干渉
により、理想的ではない。この問題は、接着剤が、ファイバーの対によりゲルチ
ャンバーから分離している図2Bの態様では生じない。
本発明のゲルホルダーは、図3に示したように、接着剤でコーティングされた
ファイバーを用いることにより製造される。このようなファイバーは、基体間の
空間を有効に定めることのできる材料から製造した内部コア３１を有する。好適
な材料はガラスであり、また実質上圧縮されない重合性材料、例えばナイロンで
ある。ファイバーは、接着剤の層３２でコーティングされる。この層は、基体へ
のファイバーの接着を確実にし、しかし接着剤がゲルチャンバーの多くの部分を
ブロックするほど多くない程度に、十分な接着剤を提供する厚さを有するべきで
ある。好適な厚さは、５〜２０μｍである。ファイバー材料および接着剤は、チ
ャンバーの内部でのゲルの重合に悪影響を及ぼさず、また電気泳動の最中または
後の分離した材料の検出に使用される波長で強く蛍光を発しないようなものを選
択するべきである。
本発明のゲルホルダーを形成するために使用される基体は、電気泳動ゲルおよ
び使用される検出方法と調和する、平らな、平面の任意の材料であることができ
る。幾つかの場合において、電気泳動ゲルの重合または電気泳動ゲル上の分離し
たフラグメントの観察に干渉しないプラスチック材料を使用することができる。
しかしながら、好ましくは、基体はガラス製であるのがよく、最適には、蛍光を
あまり発しないガラスから形成されるのがよい。紫外線透過性の高い、１mmのボ
ロシリケートガラスが他の好適な材料である。
本発明のゲルホルダーを形成するために使用される基体の少なくとも１つは、
電気泳動ゲル内の材料の観察が可能な材料で形成されていなければならない。し
かしながら、幾つかの装置において、検出光線源、例えばゲル４３中の蛍光分子
を励起するための光線４２を生成するレーザー４１および発した光線４５を検出
するための検出器４４が、図４に示したように、電気泳動ゲルの同じ側面におか
れることがある。この場合、底部の基体１１は、サンプルの観察を可能する機能
よりも、むしろ背面からの照射が最小になるように選択される。例えば、蛍光検
出システムを備えた配列決定装置に使用するためのゲルホルダーの場合、底部の
基体１１は、そこに到達する励起光をすべて吸収する、すなわち実質上非蛍光性
の着色ガラスから製造することができる。背面の蛍光は、基体の蛍光性不純物か
らそのほとんどが発せられるので、これによって背面の蛍光の量を顕著に減少さ
せ、観察の感度を改善することができる。
背面の蛍光を減少する別の方法は、透明の薄い基体を用いることである。例え
ば、図５に示すように、一方の基体５０を厚い（かつ好ましくは吸収性で非蛍光
性の）材料から形成し、他方の基体５１を非常に薄い（すなわち０．１mm以下）
透明の低蛍光性材料から製造する。好適な薄い材料は、“カバースリップ”ガラ
スを含む。また、薄い領域６１は、図６Ａに示すようにファイバーに対して鉛直
方向か、図６Ｂに示すようにゲルの一つの端部を覆うように励起／検出領域に配
置され得る。このような基体は、所望の形状になるように連続的な基体を成形す
ることにより（図７Ａ）、あるいは連続的な薄い基体７２上に厚い材料のブロッ
ク７１を固定することにより形成することができる。後者の場合、厚い材料のブ
ロック７１は、吸収する、非蛍光性の材料から形成し、背面の蛍光を減少させる
ことができる。
ゲルホルダーを形成するために、ファイバーは基体の１つの表面上にまずおか
れる。基体は、互いに平行にかつ基体の２つの対向する端部と平行にするべきで
ある。ファイバーは、互いに平行にこれらを維持するフレームにおかれ、また互
いに一定の距離のあるように配置され得る。もし２つのファイバーを使用するな
らば、これらは基体の端部付近に置くのが有利であり、内部に１つの大きなゲル
チャンバーを形成することができる。ゲルチャンバーが複数の部分に分割される
ように、２つ以上のファイバーを使用することがきる。この場合、ファイバーは
チャンバーの各部が４つのサンプルを受け入れるのに十分に大きい（すなわち配
列決定プロセスに使用される各鎖末端オリゴヌクレオチド混合物毎に１つのサン
プルレーン）ように、一定の間隔でおかれるのが好ましい。このように、１６レ
ーン（４つの完全配列）を有するゲルにおいて、合計５つのファイバーが使用さ
れる。２つを超えるファイバーの使用は、幅広いゲルにとくに好適である。なぜ
ならば、内部ファイバーは、ゲルチャンバーの中央部の基体の沈下の防止に役立
つからであり、このようにして一層調和した幅のゲルチャンバーを形成すること
ができる。
本発明の方法の１つの態様において、次のステップはファイバーが２つの基体
間に配置されるサンドイッチ構造を形成するように、ファイバー上に第２基体を
おくことである。基体は、ファイバーの並びのどちらの側にも接触する。十分な
圧力を施して、ファイバーがサンドイッチ構造において基体に固定される。次に
サンドイッチ構造は、用いる接着剤に応じた方法で硬化する。例えば、もし使用
した接着剤がEPO-TEK NDであるならば、硬化は８０℃で15分、あるいは100℃で5
分で達成される。硬化プロセスが完了した後は、基体の端部を越えて伸びるファ
イバーの部分をはさみまたは他の手段で切断する。
本発明の方法の第2の態様において、ファイバーを第１基体に接着させ、その
上に第２基体がおかれる。例えば、紫外線により活性化する接着剤を、ファイバ
ーの上部に第２基体がおかれる前に硬化させることができる。次に第２基体が部
分的に溶融したファイバーの上部におかれ、基体は互いにプレスされ、接着剤が
硬化する。
図２Ｂで示される形態のようなゲルホルダーを形成するために、ファイバーの
対が所望の整列状態でおかれ、外部のフレームにより空気中に吊り下げられる。
ファイバーは、０．５〜２．５mmの狭い間隙をなして対になっている。この間隙
は、基体同士を固定するのに必要な接着剤の幅により定められる。整列したファ
イバーは、一方の基体上におかれる。ファイバーが適切な位置にあるとき、ファ
イバー間の空間は、例えばEPO-TEK 353 NDのようなエポキシ接着剤で満たされる
。第２基体は、整列したファイバー上におかれ、サンドイッチ構造を形成する。
次にサンドイッチ構造は、必要に応じて圧力下硬化し、基体を越えて伸びるファ
イバーはすべて取り除かれる。
本発明のゲルホルダーにおけるゲルチャンバーのサイズは、ファイバーの内部
コアの厚さにより決定される。核酸を迅速に配列決定するためには、これらのフ
ァイバーは２５０μm以下、最適には５０〜１００μmの直径を有するのが好まし
い。しかしながら、さらに薄い一定のコア直径を得るために、また非常に小さい
間隙に気泡を形成することなく、ゲル形成溶液を均一に導入するために、これよ
りも小さいものであることもできる。実際、本発明は、間隙のサイズにかかわり
なく、基体間の非常に小さい空間を達成するための容易な方法を提供するもので
ある。同様に、本発明の方法は、大きい間隙を有するゲルホルダーを形成するた
めに適用される。このようなゲルホルダーは、核酸フラグメントの高速分析器に
は適していない。
ゲルホルダーが上記の方法のいずれかにより形成されると、次のステップはチ
ャンバーにゲル形成溶液を満たし、溶液を重合してゲルを形成することである。
このプロセスは、当業者に自明の数多くの任意の方法によりなされる。好ましく
はゲルホルダーは、１９９４年１１月１日に出願された米国特許出願０８／３３
２，８９２号明細書に記載されたタイプ、１９９５年１０月３１日に出願され、
ＷＯ９６／１３７１５号として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／１３
９５４に記載されたタイプの装置を用いて充填される。これらはここに参照とし
て引用する。
本発明のさらなる態様において、ゲルは、ファイバー上に第２基体が設けられ
る前にチャンバーにおかれる。この態様において、ファイバーは、光吸収性かつ
非蛍光性である第１基体上に１つとして、あるいは対をなしておかれ、基体に接
着される。次にゲル形成溶液がファイバーとほとんど同じ深さまで基体に注がれ
、重合する。仮のガラス繊維が両側に取り付けられ、ゲルが外部に移行するのを
防いでいる。これとは別に、重合の前や重合の最中に底部の基体がおかれる端部
を緊密にシールするフレームを使用することができる。ゲルの上部表面は空いて
いるため、この方法は、ゲルを非常に均一にする。ゲルが重合した後に、非常に
薄い（すなわち１〜１０μｍ）、柔軟性のある透明なフィルムをゲルの上部にお
き、接着剤または機械的手段により固定される。カバーフィルムとして使用する
ための好適な材料は、溶解性ポリマー、とくにスプレー可能なものを含む。この
ポリマーフィルムは、ゲルの重合に悪影響を及ぼさないであろう。なぜならば、
重合プロセスは、フィルムが取り付けられる前に完了するからである。
本発明のゲルホルダーおよび電気泳動ゲルは、従来技術を超える幾つかの有利
な点を提供する。第１に、これらは製造が容易であり、使い捨て可能であり、電
気泳動ゲルを後に満たすことができる。第２に、これらは基体間の空間が高度に
均一である。さらに、溶融して流れる材料が熱により一定の形状に成形されるの
で、ゲルの重合や蛍光性に強く影響を及ぼさないガラスのような材料を用いて、
互いにゲルホルダーを接着することができる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Electrophoresis gel, gel holder having fiber spacer and method for producing the same
Law
Background of the Invention
DNA sequencing can be performed using automated systems designed at the laboratory level.
Can be. Methods and apparatus for DNA sequencing are described in U.S. Pat. No. 4,811,218.
No. 4,823,007; No. 5,062,942; No. 5,091,652
The description is described in the specification of US Pat. No. 5,119,316 and the specification of US Pat. No. 5,122,345.
They are incorporated herein by reference.
A common method used in these systems uses restriction endonucleases.
To amplify the restriction fragment of interest (eg, P
CR); amplified DNA and sequencing primers (this is the amplification primer
-May be the same or different from the same; a normal nucleotide (A,
C, G and T) and inhibits further extension of the primer when introduced
Sequencing primer in the presence of a chain terminating nucleotide such as a deoxynucleotide
And analyze the product according to the length of the obtained extended fragment.
It is included. For fragment analysis, for example, using polyacrylamide gel
Electrophoresis.
When analyzing nucleic acid sequences using gels, gels such as gel size and thickness
The characteristics of the file affect the time and cost required to perform the analysis. Diagnostic
To improve sequencing availability as a product, the time and cost of sequencing analysis
It is desirable to reduce the cost of oligonucleotide fragments in a short time.
It is advantageous to provide a gel that can analyze very small amounts of Also the gel was filled
One-time use that can be manufactured on a large scale, sometimes providing these desired properties
A discarded gel holder is advantageous.
In order to achieve the high productivity required for sequence analysis due to the short analysis time,
Attempts have been made to produce thin gels. The most common case is surrounding the gel.
Developing assembly technology to form and maintain a very uniform space between substrates
It is to give itself a uniform thickness. U.S. Pat.No. 4,929,329
And US Pat. No. 5,164,066, for example, describe the spacing between the front and rear plates.
A thin film made of mylar or nylon monofilament (
The formation of an electrophoretic gel using about 0.10 to 0.02 inches thick) is disclosed,
Cited as a reference. The spacer is not glued to the plate,
Put between two plates and fill the space between the two plates with gel-forming solution
When it is fixed in place using a clamp. After polymerization, polymerized gel
Are held on two plates located at the correct locations.
The methods of making electrophoretic gels disclosed in these patents have several disadvantages.
. First, place the spacer in the correct position during the gel filling operation and hold it.
And the resulting gel is not compatible with large-scale production. Also, once the gel is manufactured
Storage time is short and the gel is retained on the plates and spacers.
The device must be assembled at the point of use. This means that many
Manufacture of gel holders for use in gel production or for one-time use
Makes it difficult to use spacers as disclosed in the above patents.
It is an object of the present invention to provide a very thin gel of uniform thickness that can be easily manufactured.
To provide a disposable one-time use gel holder with a chamber
is there.
It is a further object of the present invention to provide a very thin, uniform thickness that can be easily manufactured.
Of producing a disposable one-time use gel holder having a small gel chamber
Is to provide.
Furthermore, an object of the present invention is to provide a uniform thickness very easy to manufacture.
Disposable one-time use gel holder with thin gel chamber
To provide an electrophoresis gel formed by the above method.
Summary of the Invention
The above and other objects of the present invention are to form a gel holder using an adhesive.
Electrophoresis using fibers fixed to the substrate to be formed, especially glass fibers
This is achieved by forming a gel holder for the gel. Therefore,
One aspect of Ming is the following method:
(A) A plurality of substrates having an adhesive coated between a first planar substrate and a second planar substrate
Place the fiber;
(B) outside the substrate such that the fibers adhere to the first and second substrates.
Pressure on the side, thereby forming a gel chamber between the first substrate and the second substrate.
Wherein the gel chamber has a thickness determined by the inner core of the fiber
Things.
Separately, keep a pair of uncoated fibers,
Adhesive can also be applied to the line between each pair of fibers. The adhesive has cured
Sometimes this glues the fibers in the correct place as spacers and
The first and second substrates are fixed. At the same time, the fiber comes out of the gel compartment
Separate the adhesive. In this way, the adhesive polymerizes the gel in the gel chamber.
Interference is prevented.
The gel holder formed by such a method is similar to polyacrylamide.
Fill quickly or store indefinitely with a unique gel-forming solution and use it when needed
Can be used for
A further aspect of the invention is a gel holder and an electrophoresis gel product, comprising:
Including elements:
(A) a planar first substrate;
(B) a planar second substrate; and
(C) disposed as one or a pair between the first substrate and the second substrate.
Contain multiple fibers. The fibers are bonded to the substrate using an adhesive,
The fiber, first and second substrates are jointly defined by the diameter of the fiber.
To form a gel chamber having a predetermined thickness. In the final electrophoresis gel,
Chambers are filled with a polymerizable gel such as a polyacrylamide gel.
BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
1A and 1B show a first embodiment of the gel holder of the present invention.
2A and 2B show two embodiments of the gel holder of the present invention.
FIG. 3 shows a fiber coated with an adhesive useful in the present invention.
is there.
FIG. 4 shows that the detection radiation and the detection system are made on the same lateral side of the gel
2 illustrates an embodiment of the invention useful for the device.
FIG. 5 shows an electrophoresis gel of the present invention.
6A and 6B show the use of a thin area of the gel holder of the present invention.
You.
7A and 7B show another structure having a thin region.
Detailed description of the invention
FIG. 1 shows a first embodiment of the gel holder of the present invention. Gel holder
Is formed from a top substrate 10, a bottom substrate 11 and a plurality of fibers 12.
You. The cross section of the fiber can be circular as shown, oval or rectangular
You. The fibers 12 are arranged parallel to each other and to the opposite ends of the substrates 10,11.
And extend from one end of the substrate to one another. Bottom substrate 11 is electrophoresis
At the end of the gel holder, as shown, to facilitate sample loading
It extends beyond the base 10 to facilitate filling of the electrophoretic samble. This
As shown in FIG. 1A, the end of the upper substrate is the same as that of the upper substrate.
The substrate has spread and stretched. Separately, the opening 13 is provided for this purpose.
It is provided near one end of the upper substrate (FIG. 1B).
FIG. 2A has two fibers instead of the four fibers shown in FIG.
Figure 3 shows the gel holder in detail. The fiber 12 comprises a top substrate 10 and a bottom
And is adhered to the substrate by an adhesive 21. Fiber 12
, Top substrate 10 and bottom substrate 11 are filled with an electrophoresis gel
-20 are formed together.
FIG. 2B illustrates another aspect of the present invention. In this case, the fiber 12 is
The adhesive is placed between the substrates and the adhesive is lined to fill the space between the two fibers.
Is on top. This space is very unlikely between adjacent pairs of fibers.
2 fibers, preferably in close contact with each other, as shown in Figure 2B
It is a space that is created when they are placed side by side.
The adhesive is not particularly limited as long as it can bond the substrate and the fiber material.
Not. In a preferred embodiment, this is a glass-glass bond, but for some applications
In some cases, it can be a glass-plastic bond. A suitable adhesive is
UV curable acrylate adhesives such as M36,427 type 68 (Edmund Scientif
ic) or a thermosetting acrylic adhesive such as EPO-TEK 353 ND (Epoxy Technology
Inc. ) And the like. Many suitable adhesives are Deco Cement or 5-minute Ep
oxy (Thorlabs).
If the glue fills the chamber, as in the embodiment shown in FIG.
Some adhesives may adversely affect gel polymerization if they come into contact with
It should be noted that In other words, the UV curing gel
The use of UV-curable adhesives in ruders can interfere with the curing of adhesives and gels
Not so ideal. The problem is that the glue is
This does not occur in the embodiment of FIG. 2B which is separated from the chamber.
The gel holder of the present invention was coated with an adhesive as shown in FIG.
Manufactured by using fibers. Such fibers are
It has an inner core 31 made of a material capable of effectively defining a space. Suitable
A common material is glass, and a substantially incompressible polymerizable material, such as nylon.
is there. The fiber is coated with a layer 32 of adhesive. This layer is applied to the substrate
Ensures that the fibers adhere to each other, but the adhesive covers many parts of the gel chamber
Should be thick enough to provide enough glue, not too much to block
is there. The preferred thickness is between 5 and 20 μm. Fiber material and adhesive
It does not adversely affect the polymerization of the gel inside the chamber, and during electrophoresis or
Select one that does not fluoresce strongly at the wavelength used to detect the separated material later.
Should be chosen.
Substrates used to form the gel holder of the present invention include electrophoretic gels and
Can be any material, flat, planar, consistent with the detection method used
You. In some cases, electrophoresis gel polymerization or separation on electrophoresis gel
Plastic materials that do not interfere with the observation of the fragment can be used.
However, preferably, the substrate is made of glass, and optimally, is fluorescent.
It is good to be formed from glass which does not emit much. 1mm box with high UV transmittance
Losilicate glass is another suitable material.
At least one of the substrates used to form the gel holder of the present invention comprises:
It must be formed of a material that allows observation of the material in the electrophoresis gel. I
However, in some devices, the detection light source, for example, the fluorescent molecules in the gel 43
Detects a laser 41 that generates a light beam 42 for exciting light and a light beam 45 that is emitted
As shown in FIG. 4, the detector 44 is mounted on the same side of the electrophoresis gel.
May be In this case, the base 11 at the bottom is a function that allows observation of the sample.
Rather, it is chosen to minimize backside illumination. For example, fluorescence
Gel holder for use in a sequencing device with a
The substrate 11 absorbs all of the excitation light that reaches it, ie, is substantially non-fluorescent.
From colored glass. Fluorescence on the back is a fluorescent impurity on the substrate
This significantly reduces the amount of fluorescence on the back, since most of them are emitted.
And the sensitivity of observation can be improved.
Another way to reduce backside fluorescence is to use a transparent thin substrate. example
If one substrate 50 is thick (and preferably absorptive and non-fluorescent) as shown in FIG.
And the other substrate 51 is very thin (ie, less than 0.1 mm).
Manufactured from a transparent, low fluorescent material. A suitable thin material is a "coverslip" glass
Including Also, the thin region 61 is perpendicular to the fiber as shown in FIG. 6A.
Direction or in the excitation / detection area so as to cover one end of the gel as shown in FIG. 6B.
Can be placed. Such a substrate is formed by molding a continuous substrate into a desired shape.
(FIG. 7A) or a block of thick material on a continuous thin substrate 72.
It can be formed by fixing the hook 71. In the latter case, a thicker material
Lock 71 is formed from an absorbing, non-fluorescent material to reduce backside fluorescence
be able to.
The fibers are first placed on one surface of the substrate to form a gel holder.
It is. The substrates should be parallel to each other and to the two opposing ends of the substrate.
is there. The fibers are placed in a frame that keeps them parallel to each other and
Can be arranged at a certain distance. If you don't use two fibers
These are advantageously placed near the edge of the substrate, with one large gel inside.
A chamber can be formed. Gel chamber is divided into multiple parts
As such, more than one fiber can be used. In this case, the fiber
Each part of the chamber is large enough (ie, the arrangement) to accept four samples.
One sample for each strand-end oligonucleotide mixture used in the sequencing process
(Pull lane), preferably at regular intervals. In this way, 16
A total of five fibers were used in gels with
It is. The use of more than two fibers is particularly suitable for a wide range of gels. why
If so, the internal fibers help prevent sinking of the substrate in the center of the gel chamber
To form a gel chamber of a more harmonious width in this way.
Can be.
In one aspect of the method of the present invention, the next step is that the fiber comprises two substrates.
A second substrate is placed on the fiber to form a sandwich structure disposed therebetween.
It is to put. The substrate contacts either side of the fiber array. enough
Pressure is applied to fix the fibers to the substrate in a sandwich configuration. next
The sandwich structure cures in a manner that depends on the adhesive used. For example, if you use
If the applied adhesive is EPO-TEK ND, cure will be at 80 ° C for 15 minutes or at 100 ° C for 5 minutes.
Achieved in minutes. After the curing process is complete, the fan extends beyond the edge of the substrate.
The part of the iver is cut with scissors or other means.
In a second embodiment of the method of the present invention, the fibers are adhered to a first substrate, and
A second substrate is placed on top. For example, an adhesive activated by ultraviolet light
It can be cured before the second substrate is placed on top of the substrate. Next, the second base is
On top of the partially melted fiber, the substrates are pressed together and the adhesive is
To cure.
To form a gel holder like the configuration shown in FIG.
The pairs are placed in the desired alignment and suspended in air by an external frame.
The fibers are paired with a narrow gap of 0.5-2.5 mm. This gap
Is determined by the width of the adhesive necessary for fixing the substrates. Aligned files
The iva is placed on one of the substrates. When the fiber is in the proper position,
The space between the bars is filled with an epoxy glue such as EPO-TEK 353 ND
. The second substrate is placed on the aligned fibers to form a sandwich structure.
The sandwich structure is then cured under pressure, if necessary, and extends over the substrate.
All Eva are removed.
The size of the gel chamber in the gel holder of the present invention depends on the inside of the fiber.
It is determined by the thickness of the core. For rapid sequencing of nucleic acids, these
The fiber preferably has a diameter of less than 250 μm, optimally 50-100 μm.
No. However, to obtain a thinner constant core diameter, and also very small
In order to uniformly introduce the gel-forming solution without forming bubbles in the gap,
Can be smaller. In fact, the present invention relates to the size of the gap
Rather, it provides an easy way to achieve very small spaces between substrates
is there. Similarly, the method of the present invention can be used to form gel holders with large gaps.
Applied to Such a gel holder can be used as a high-speed analyzer for nucleic acid fragments.
Is not suitable.
Once the gel holder has been formed by any of the above methods, the next step is
Filling the chamber with a gel-forming solution and polymerizing the solution to form a gel.
This process can be done in any number of ways obvious to one skilled in the art. Preferably
No. 08/33, filed Nov. 1, 1994.
No. 2,892, filed Oct. 31, 1995,
International Patent Application PCT / US95 / 13 published as WO 96/13715
Filling using a device of the type described in 954. These are here for reference
Quote.
In a further aspect of the invention, the gel is provided with a second substrate on the fiber.
Before placing it in the chamber. In this embodiment, the fiber is light absorbing and
A single or paired on a first substrate that is non-fluorescent and contacts the substrate.
Be worn. The gel-forming solution is then poured onto the substrate to approximately the same depth as the fibers.
Polymerizes. Temporary glass fiber is attached to both sides to prevent the gel from migrating to the outside.
I'm preventing. Separately, the end where the bottom substrate is placed before or during the polymerization
A tightly sealing frame can be used. The top surface of the gel is empty
Therefore, this method makes the gel very homogeneous. After the gel polymerizes, very
A thin (ie, 1-10 μm), flexible, transparent film is placed on top of the gel.
And secured by adhesive or mechanical means. Use as cover film
Suitable materials for include soluble polymers, especially those that are sprayable. this
The polymer film will not adversely affect the polymerization of the gel. because,
This is because the polymerization process is completed before the film is attached.
The gel holder and electrophoresis gel of the present invention have several advantages over the prior art.
Provide a point. First, they are easy to manufacture, disposable,
The electrophoresis gel can be filled later. Second, they have a high degree of space between the substrates.
It is uniform. Furthermore, the material that melts and flows is formed into a certain shape by heat.
In, using a material such as glass that does not strongly affect the polymerization and fluorescence of the gel,
The gel holders can be glued together.
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項
【提出日】１９９７年１２月１０日（１９９７．１２．１０）
【補正内容】
たフラグメントの観察に干渉しないプラスチック材料を使用することができる。
しかしながら、好ましくは、基体はガラス製であるのがよく、最適には、蛍光を
あまり発しないガラスから形成されるのがよい。紫外線透過性の高い、１mmのボ
ロシリケートガラスが他の好適な材料である。
本発明のゲルホルダーを形成するために使用される基体の少なくとも１つは、
電気泳動ゲル内の材料の観察が可能な材料で形成されていなければならない。し
かしながら、幾つかの装置において、検出光線源、例えばゲル４３中の蛍光分子
を励起するための光線４２を生成するレーザー４１および発した光線４５を検出
するための検出器４４が、図４に示したように、電気泳動ゲルの同じ側面におか
れることがある。この場合、底部の基体１１は、サンプルの観察を可能する機能
よりも、むしろ背面からの照射が最小になるように選択される。例えば、蛍光検
出システムを備えた配列決定装置に使用するためのゲルホルダーの場合、底部の
基体１１は、そこに到達する励起光をすべて吸収する、すなわち実質上非蛍光性
の着色ガラスから製造することができる。背面の蛍光は、基体の蛍光性不純物か
らそのほとんどが発せられるので、これによって背面の蛍光の量を顕著に減少さ
せ、観察の感度を改善することができる。
背面の蛍光を減少する別の方法は、透明の薄い基体を用いることである。例え
ば、図５に示すように、一方の基体５０を厚い（かつ好ましくは吸収性で非蛍光
性の）材料から形成し、他方の基体５１を非常に薄い（すなわち０．１mm以下）
透明の低蛍光性材料から製造する。好適な薄い材料は、“カバースリップ”ガラ
スを含む。また、薄い領域６１は、図６Ａに示すようにファイバーに対して鉛直
方向か、図６Ｂに示すようにゲルの一つの端部を覆うように励起／検出領域に配
置され得る。このような基体は、所望の形状になるように連続的な基体を成形す
ることにより（図７Ａ）、あるいは連続的な薄い基体７２上に厚い材料のブロッ
ク７１を固定することにより形成することができる。後者の場合、厚い材料のブ
ロック７１は、吸収する、非蛍光性の材料から形成し、背面の蛍光を減少させる
ことができる。
ゲルホルダーを形成するために、ファイバーは基体の１つの表面上にまずおか
れる。ファイバーは、互いに平行にかつ基体の２つの対向する端部と平行にする
べきである。ファイバーは、互いに平行にこれらを維持するフレームにおかれ、
また互いに一定の距離のあるように配置され得る。もし２つのファイバーを使用
するならば、これらは基体の端部付近に置くのが有利であり、内部に１つの大き
なゲルチャンバーを形成することができる。ゲルチャンバーが複数の部分に分割
されるように、２つ以上のファイバーを使用することがきる。この場合、ファイ
バーはチャンバーの各部が４つのサンプルを受け入れるのに十分に大きい（すな
わち配列決定プロセスに使用される各鎖末端オリゴヌクレオチド混合物毎に１つ
のサンプルレーン）ように、一定の間隔でおかれるのが好ましい。このように、
１６レーン（４つの完全配列）を有するゲルにおいて、合計５つのファイバーが
使用される。２つを超えるファイバーの使用は、幅広いゲルにとくに好適である
。なぜならば、内部ファイバーは、ゲルチャンバーの中央部の基体の沈下の防止
に役立つからであり、このようにして一層調和した幅のゲルチャンバーを形成す
ることができる。
本発明の方法の１つの態様において、次のステップはファイバーが２つの基体
間に配置されるサンドイッチ構造を形成するように、ファイバー上に第２基体を
おくことである。基体は、ファイバーの並びのどちらの側にも接触する。十分な
圧力を施して、ファイバーがサンドイッチ構造において基体に固定される。次に
サンドイッチ構造は、用いる接着剤に応じた方法で硬化する。例えば、もし使用
した接着剤がEPO-TEK NDであるならば、硬化は８０℃で15分、あるいは100℃で5
分で達成される。硬化プロセスが完了した後は、基体の端部を越えて伸びるファ
イバーの部分をはさみまたは他の手段で切断する。
本発明の方法の第2の態様において、ファイバーを第１基体に接着させ、その
上に第２基体がおかれる。例えば、紫外線により活性化する接着剤を、ファイバ
ーの上部に第２基体がおかれる前に硬化させることができる。次に第２基体が部
分的に溶融したファイバーの上部におかれ、基体は互いにプレスされ、接着剤が
硬化する。
図２Ｂで示される形態のようなゲルホルダーを形成するために、ファイバーの
対が所望の整列状態でおかれ、外部のフレームにより空気中に吊り下げられる。
ファイバーは、０．５〜２．５mmの狭い間隙をなして対になっている。この間隙
は、基体同士を固定するのに必要な接着剤の幅により定められる。整列したファ
イバーは、一方の基体上におかれる。ファイバーが適切な位置にあるとき、ファ
イバー間の空間は、例えばEPO-TEK 353NDのようなエポキシ接着剤で満たされる
。第２基体は、整列したファイバー上におかれ、サンドイッチ構造を形成する。
次にサンドイッチ構造は、必要に応じて圧力下硬化し、基体を越えて伸びるファ
イバーはすべて取り除かれる。
本発明のゲルホルダーにおけるゲルチャンバーのサイズは、ファイバーの内部
コアの厚さにより決定される。核酸を迅速に配列決定するためには、これらのフ
ァイバーは２５０μm以下、最適には５０〜１００μmの直径を有するのが好まし
い。しかしながら、さらに薄い一定のコア直径を得るために、また非常に小さい
間隙に気泡を形成することなく、ゲル形成溶液を均一に導入するために、これよ
りも小さいものであることもできる。実際、本発明は、間隙のサイズにかかわり
なく、基体間の非常に小さい空間を達成するための容易な方法を提供するもので
ある。同様に、本発明の方法は、大きい間隙を有するゲルホルダーを形成するた
めに適用される。このようなゲルホルダーは、核酸フラグメントの高速分析器に
は適していない。
ゲルホルダーが上記の方法のいずれかにより形成されると、次のステップはチ
ャンバーにゲル形成溶液を満たし、溶液を重合してゲルを形成することである。
このプロセスは、当業者に自明の数多くの任意の方法によりなされる。好ましく
はゲルホルダーは、１９９４年１１月１日に出願された米国特許出願０８／３３
２，８９２号明細書に記載されたタイプ、１９９５年１０月３１日に出願され、
ＷＯ９６／１３７１５号として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／１３
９５に記載されたタイプの装置を用いて充填される。これらはここに参照として
引用する。
本発明のさらなる態様において、ゲルは、ファイバー上に第２基体が設けられ
る前にチャンバーにおかれる。この態様において、ファイバーは、光吸収性かつ
非蛍光性である第１基体上に１つとして、あるいは対をなしておかれ、基体に接
着される。次にゲル形成溶液がファイバーとほとんど同じ深さまで基体に注がれ
、重合する。仮のガラス繊維が両側に取り付けられ、ゲルが外部に移行するのを
請求の範囲
１．（ａ）平面の第1基体および平面の第2基体間に複数のファイバーを配置し
；
（ｂ）接着剤により前記基体に前記ファイバーを永久的に接着し、これにより
、第１基体および第２基体間にゲルチャンバーを形成させ、前記ゲルチャンバー
は、ファイバー決定された厚さを有するものであることを特徴とする、使い捨て
可能な1回限りで使用される電気泳動ゲルのためのゲルホルダーの形成方法。
２．ファイバーがガラス製である請求の範囲第1項に記載の方法。
３．ファイバーが２５０μｍ以下の直径を有する請求の範囲第1項または第２
項に記載の方法。
４．ファイバーが、基体間におかれる前に接着剤でコーティングされる請求の
範囲第1項ないし第3項のいずれか1項に記載の方法。
５．接着剤でコーティングされたファイバーが平面の第1基体の表面におかれ
、平面の第2基体がファイバーの上部におかれ、ファイバーが前記第1基体および
第2基体間に配置されるサンドイッチ構造を形成し；圧力が基体に施されて基体
にファイバーの接着が行われる請求の範囲4項に記載の方法。
６．接着剤でコーティングされたファイバーが、第１基体の表面上におかれ、
接着剤を活性化する光線に暴露され；第２基体が活性化した接着剤でコーティン
グされたファイバー上におかれ、ファイバーが第１基体および第２基体間に配置
されるサンドイッチ構造を形成し、接着剤の硬化の最中にサンドイッチ構造の外
部に圧力が施される請求の範囲第４項に記載の方法。
７．ファイバーが対としておかれ、それぞれの対はその間に小さい空間を有し
、接着剤が前記ファイバー対の間の小さい空間において全体的に配置される請求
の範囲第１項ないし第６項のいずれか１項に記載の方法。
８．（ａ）平面の第1基体；
（ｂ）平面の第2基体；
（ｃ）前記第1基体および第2基体間に配置された複数のファイバーを含み、
前記ファイバーは、接着剤により前記第１および第２基体に接着され、かつ前
記ファイバー、前記第1基体および第2基体は、前記ファイバーの直径により定め
られる厚さを有するゲルチャンバーを共同して形成する、使い捨て可能な1回限
りで使用される電気泳動ゲルのためのゲルホルダー。
９．ファイバーガラス製である請求の範囲第10項に記載のゲルホルダー。
１０．ファイバーが２５０μｍ以下の直径を有する請求の範囲第8項または第9項
に記載のゲルホルダー。
１１．第1基体および第2基体が光学的に異なる性質を有する請求の範囲第8項な
いし第10項のいずれか1項に記載のゲルホルダー。
１２．基体のうちの1つが、光吸収性でかつ非蛍光性である請求の範囲第11項に
記載のゲルホルダー。
１３．基体のうちの1つが、他の基体よりも薄い厚さである請求の範囲第11項に
記載のゲルホルダー。
１４．基体のうちの1つが、ファイバーに対して鉛直方向に伸びる一つの末端部
付近に設けられた薄い部分を有する請求の範囲第11項に記載のゲルホルダー。
１５．ファイバーが対としておかれ、各対はその間に小さい空間を有し、接着剤
が前記ファイバ一対の間の小さい空間において全体的に配置される請求の範囲第
８項ないし第１４項のいずれか１項に記載のゲルホルダー。
１６．ファイバーが円形の断面を有する請求の範囲第８項ないし第１５項のいず
れか１項に記載のゲルホルダー。
１７．（ａ）第１基体および第２基体間に複数のファイバーをおき；
（ｂ）接着剤により基体とファイバーとを永久的に接着させ、これにより前記
第１基体および第２基体間のゲルチャンバーを形成させ、前記ゲルチャンバーは
ファイバーにより決定された厚さを有し；および
（ｃ）電気泳動ゲルでゲルチャンバーを満たす、使い捨て可能な1回限りで使
用される電気泳動ゲルの形成方法。
１８．基体間におかれる前にファイバーが接着剤でコーティングされる請求の範
囲第１７項に記載の方法。
１９．接着剤でコーティングされたファイバーが第1基体の表面上におかれ、第
２基体がファイバーの上部におかれてファイバーが第１基体および第2基体間に
配置されるサンドイッチ構造を形成し；圧力が基体に施されて基体へのファイバ
ーの接着がなされる請求の範囲第１８項に記載の方法。
２０．接着剤でコーティングされたファイバーが第１基体の表面上におかれ、接
着剤を活性化する光線に暴露され；第２基体がこの活性化された接着剤でコーテ
ィングされたファイバー上におかれ、ファイバーが第１基体および第２基体間に
配置されるサンドイッチ構造を形成し；圧力が接着剤の硬化の最中にサンドイッ
チ構造の外部に施される請求の範囲第１８項に記載の方法。
２１．ファイバーが対としておかれ、各対はその間に小さい空間を有し、接着剤
が前記ファイバー対の間の小さい空間において全体的に配置される請求の範囲第
１７項ないし第２１項のいずれか１項に記載のゲルホルダー。
２２．（ａ）平面の第1基体；
（ｂ）平面の第2基体；
（ｃ）前記第1基体および第2基体間に配置された複数のファイバーを含み、
前記ファイバーは、接着剤により少なくとも前記第１基体に接着し、前記ファ
イバー、前記第１および第２基体は、前記ファイバーの直径により定められる厚
さを有するゲルチャンバーを共同して形成し；および
（ｄ）前記ゲルチャンバーの内部に配置された重合したゲルを含む、使い捨て
可能な1回限りで使用される電気泳動ゲル。
２３．重合するゲルが、ポリアクリルアミドである請求の範囲第22項に記載の電
気泳動ゲル。
２４．第1基体および第2基体が光学的に異なる性質を有する請求の範囲第22項ま
たは第23項に記載の電気泳動ゲル。
２５．基体のうちの1つが、光吸収性でかつ非蛍光性である請求の範囲第24項に
記載の電気泳動ゲル。
２６．基体のうちの1つが、他の基体よりも薄い厚さである請求の範囲第24項に
記載の電気泳動ゲル。
２７．基体のうちの1つが、ファイバーに対して鉛直方向に伸びる一つの末端部
付近に設けられた薄い部分を有する請求の範囲第24項に記載の電気泳動ゲル。
２８．（ａ）平面の基体上に複数のファイバーをおき、
（ｂ）接着剤により前記基体にファイバーを接着させ、
（ｃ）前記ファイバーとほぼ同じ深さまで、基体上にゲル形成溶液を導入し；
（ｄ）ゲル形成溶液を重合させ、重合したゲルを形成させ；および
（ｅ）前記の重合したゲル上に柔軟性のある薄いカバーを適用するステップを
含む電気泳動ゲルの形成方法。[Procedure of Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act
[Submission date] December 10, 1997 (Dec. 10, 1997)
[Correction contents]
Plastic materials that do not interfere with the observation of the fragment can be used.
However, preferably, the substrate is made of glass, and optimally, is fluorescent.
It is good to be formed from glass which does not emit much. 1mm box with high UV transmittance
Losilicate glass is another suitable material.
At least one of the substrates used to form the gel holder of the present invention comprises:
It must be formed of a material that allows observation of the material in the electrophoresis gel. I
However, in some devices, the detection light source, for example, the fluorescent molecules in the gel 43
Detects a laser 41 that generates a light beam 42 for exciting light and a light beam 45 that is emitted
As shown in FIG. 4, the detector 44 is mounted on the same side of the electrophoresis gel.
May be In this case, the base 11 at the bottom is a function that allows observation of the sample.
Rather, it is chosen to minimize backside illumination. For example, fluorescence
Gel holder for use in a sequencing device with a
The substrate 11 absorbs all of the excitation light that reaches it, ie, is substantially non-fluorescent.
From colored glass. Fluorescence on the back is a fluorescent impurity on the substrate
This significantly reduces the amount of fluorescence on the back, since most of them are emitted.
And the sensitivity of observation can be improved.
Another way to reduce backside fluorescence is to use a transparent thin substrate. example
If one substrate 50 is thick (and preferably absorptive and non-fluorescent) as shown in FIG.
And the other substrate 51 is very thin (ie, less than 0.1 mm).
Manufactured from a transparent, low fluorescent material. A suitable thin material is a "coverslip" glass
Including Also, the thin region 61 is perpendicular to the fiber as shown in FIG. 6A.
Direction or in the excitation / detection area so as to cover one end of the gel as shown in FIG. 6B.
Can be placed. Such a substrate is formed by molding a continuous substrate into a desired shape.
(FIG. 7A) or a block of thick material on a continuous thin substrate 72.
It can be formed by fixing the hook 71. In the latter case, a thicker material
Lock 71 is formed from an absorbing, non-fluorescent material to reduce backside fluorescence
be able to.
The fibers are first placed on one surface of the substrate to form a gel holder.
It is. The fibers are parallel to each other and to the two opposite ends of the substrate
Should. The fibers are placed in a frame that keeps them parallel to each other,
Also, they can be arranged at a certain distance from each other. If you use two fibers
If so, these are advantageously located near the edge of the substrate, and one
A gel chamber can be formed. Gel chamber divided into multiple parts
As will be appreciated, more than one fiber can be used. In this case, the file
The bar is large enough for each part of the chamber to receive four samples
One for each strand-end oligonucleotide mixture used in the sequencing process
The sample lanes are preferably arranged at regular intervals. in this way,
In a gel with 16 lanes (4 complete sequences), a total of 5 fibers
used. Use of more than two fibers is particularly suitable for a wide range of gels
. Because the internal fibers prevent the substrate from sinking in the center of the gel chamber
In this manner, a gel chamber having a more harmonized width is formed.
Can be
In one aspect of the method of the present invention, the next step is that the fiber comprises two substrates.
A second substrate is placed on the fiber to form a sandwich structure disposed therebetween.
It is to put. The substrate contacts either side of the fiber array. enough
Pressure is applied to fix the fibers to the substrate in a sandwich configuration. next
The sandwich structure cures in a manner that depends on the adhesive used. For example, if you use
If the applied adhesive is EPO-TEK ND, cure will be at 80 ° C for 15 minutes or at 100 ° C for 5 minutes.
Achieved in minutes. After the curing process is complete, the fan extends beyond the edge of the substrate.
The part of the iver is cut with scissors or other means.
In a second embodiment of the method of the present invention, the fibers are adhered to a first substrate, and
A second substrate is placed on top. For example, an adhesive activated by ultraviolet light
It can be cured before the second substrate is placed on top of the substrate. Next, the second base is
On top of the partially melted fiber, the substrates are pressed together and the adhesive is
To cure.
To form a gel holder like the configuration shown in FIG.
The pairs are placed in the desired alignment and suspended in air by an external frame.
The fibers are paired with a narrow gap of 0.5-2.5 mm. This gap
Is determined by the width of the adhesive necessary for fixing the substrates. Aligned files
The iva is placed on one of the substrates. When the fiber is in the proper position,
The space between the ivas is filled with epoxy glue, for example EPO-TEK 353ND
. The second substrate is placed on the aligned fibers to form a sandwich structure.
The sandwich structure is then cured under pressure, if necessary, and extends over the substrate.
All Eva are removed.
The size of the gel chamber in the gel holder of the present invention depends on the inside of the fiber.
It is determined by the thickness of the core. For rapid sequencing of nucleic acids, these
The fiber preferably has a diameter of less than 250 μm, optimally 50-100 μm.
No. However, to obtain a thinner constant core diameter, and also very small
In order to uniformly introduce the gel-forming solution without forming bubbles in the gap,
Can be smaller. In fact, the present invention relates to the size of the gap
Rather, it provides an easy way to achieve very small spaces between substrates
is there. Similarly, the method of the present invention can be used to form gel holders with large gaps.
Applied to Such a gel holder can be used as a high-speed analyzer for nucleic acid fragments.
Is not suitable.
Once the gel holder has been formed by any of the above methods, the next step is
Filling the chamber with a gel-forming solution and polymerizing the solution to form a gel.
This process can be done in any number of ways obvious to one skilled in the art. Preferably
No. 08/33, filed Nov. 1, 1994.
No. 2,892, filed Oct. 31, 1995,
International Patent Application PCT / US95 / 13 published as WO 96/13715
95, using a device of the type described. These are here as reference
To quote.
In a further aspect of the invention, the gel is provided with a second substrate on the fiber.
Before placing it in the chamber. In this embodiment, the fiber is light absorbing and
A single or paired on a first substrate that is non-fluorescent and contacts the substrate.
Be worn. The gel-forming solution is then poured onto the substrate to approximately the same depth as the fibers.
Polymerizes. Temporary glass fiber is attached to both sides to prevent the gel from migrating to the outside.
The scope of the claims
1. (A) disposing a plurality of fibers between a first planar substrate and a second planar substrate;
;
(B) permanently bonding the fiber to the substrate with an adhesive,
Forming a gel chamber between the first substrate and the second substrate;
Is disposable, characterized in that the fiber has a determined thickness
Method of forming a gel holder for an electrophoresis gel that can be used once only.
2. 2. The method according to claim 1, wherein the fiber is made of glass.
3. 3. The method according to claim 1, wherein the fiber has a diameter of 250 μm or less.
The method described in the section.
4. Claims wherein the fibers are coated with an adhesive before being placed between the substrates.
4. The method according to any one of paragraphs 1 to 3.
5. An adhesive-coated fiber is placed on a planar first substrate surface.
A planar second substrate is placed on top of the fiber, and the fiber is
Forming a sandwich structure disposed between the second substrates; applying pressure to the substrates to form a substrate;
5. The method according to claim 4, wherein the fibers are bonded to the fibers.
6. An adhesive-coated fiber is placed on the surface of the first substrate;
Exposed to a light beam that activates the adhesive; the second substrate is coated with the activated adhesive.
The fiber is placed between the first substrate and the second substrate.
The sandwich structure is formed during the curing of the adhesive.
5. The method according to claim 4, wherein pressure is applied to the section.
7. The fibers are put in pairs, each pair having a small space between them
Wherein the adhesive is disposed entirely in the small space between the fiber pairs
The method according to any one of claims 1 to 6.
8. (A) a planar first substrate;
(B) a planar second substrate;
(C) including a plurality of fibers disposed between the first substrate and the second substrate;
The fibers are bonded to the first and second substrates by an adhesive and
The fiber, the first substrate and the second substrate are defined by the diameter of the fiber.
Disposable one-off, jointly forming a gel chamber with a defined thickness
Gel holder for electrophoresis gel used in gels.
9. 11. The gel holder according to claim 10, wherein the gel holder is made of fiber glass.
10. 10. The fiber according to claim 8, wherein the fiber has a diameter of 250 μm or less.
The gel holder according to 1.
11. 9. The method according to claim 8, wherein the first substrate and the second substrate have optically different properties.
11. The gel holder according to any one of paragraphs 10 to 10.
12. 12. The method according to claim 11, wherein one of the substrates is light-absorbing and non-fluorescent.
Gel holder as described.
13. 12. The method according to claim 11, wherein one of the substrates has a smaller thickness than the other substrates.
Gel holder as described.
14． One of the substrates is one end that extends perpendicular to the fiber
12. The gel holder according to claim 11, comprising a thin portion provided in the vicinity.
15. The fibers are put in pairs, each pair having a small space between them, adhesive
Are disposed entirely in a small space between the pair of fibers.
15. The gel holder according to any one of items 8 to 14.
16. A method according to any one of claims 8 to 15, wherein the fiber has a circular cross section.
2. The gel holder according to claim 1.
17． (A) placing a plurality of fibers between a first substrate and a second substrate;
(B) permanently bonding the substrate and the fiber with an adhesive;
Forming a gel chamber between the first substrate and the second substrate, wherein the gel chamber is
Having a thickness determined by the fiber; and
(C) Fill the gel chamber with an electrophoresis gel and use it only once.
The method of forming the electrophoresis gel used.
18. Claims wherein the fiber is coated with an adhesive before being placed between the substrates
18. The method according to clause 17.
19. An adhesive coated fiber is placed on the surface of the first substrate and
Two substrates are placed on top of the fiber and the fiber is between the first and second substrates
Forming a sandwich structure to be placed; pressure applied to the substrate to provide fibers to the substrate
19. The method according to claim 18, wherein the bonding is performed.
20. An adhesive coated fiber is placed on the surface of the first substrate and
Exposed to a light beam that activates the adhesive; a second substrate is coated with the activated adhesive.
The fiber between the first substrate and the second substrate.
Forming a sandwich structure to be placed; pressure is applied during the curing of the adhesive
19. The method according to claim 18, wherein the method is applied to an exterior of the switch structure.
21. The fibers are put in pairs, each pair having a small space between them, adhesive
Are located entirely in a small space between the fiber pairs.
The gel holder according to any one of items 17 to 21.
22. (A) a planar first substrate;
(B) a planar second substrate;
(C) including a plurality of fibers disposed between the first substrate and the second substrate;
The fiber is adhered to at least the first substrate with an adhesive, and the fiber
Iver, the first and second substrates have a thickness defined by a diameter of the fiber.
Jointly form a gel chamber having the same; and
(D) a disposable, including a polymerized gel disposed inside the gel chamber.
An electrophoresis gel that can be used only once.
23. 23. The electrode according to claim 22, wherein the gel to be polymerized is polyacrylamide.
Electrophoresis gel.
24. Claim 22 wherein the first substrate and the second substrate have optically different properties.
Or an electrophoresis gel according to item 23.
25. 25. The method according to claim 24, wherein one of the substrates is light-absorbing and non-fluorescent.
Electrophoresis gel as described.
26. Claim 24 wherein one of the substrates is thinner than the other substrates.
Electrophoresis gel as described.
27. One of the substrates is one end that extends perpendicular to the fiber
25. The electrophoretic gel according to claim 24, comprising a thin portion provided in the vicinity.
28. (A) placing a plurality of fibers on a planar substrate,
(B) adhering the fiber to the substrate with an adhesive;
(C) introducing a gel-forming solution onto the substrate to about the same depth as the fibers;
(D) polymerizing the gel-forming solution to form a polymerized gel; and
(E) applying a flexible, thin cover over the polymerized gel.
And a method for forming an electrophoresis gel.
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ
Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ
，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ
，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，
ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ
Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ
，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，
ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ
Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ
，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，
ＶＮ
(72)発明者 ザレスキー、ヘンリク
カナダ国、エル２ジー・６エックス７・オ
ンタリオ、ナイアガラ・フォールズ、ウィ
ローバイ・ドライブ 8646、ユニット ４
(72)発明者 ウォーターハウス、ポール
カナダ国、エル０アール・１ジェイ０・オ
ンタリオ、コープタウン、ガヴァナーズ・
ロード 2145
【要約の続き】
用することができる。────────────────────────────────────────────────── ───
Continuation of front page
(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE,
DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L
U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF)
, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE,
SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, S
Z, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD
, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ
, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN,
CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, G
E, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR
, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV,
MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, P
L, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK
, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ,
VN
(72) Inventors Zaleski, Henrik
L2G6 X7 O Canada
Nantario, Niagara Falls, Wi
Lowby Drive 8646, unit 4
(72) Inventor Waterhouse, Paul
L0, J1, O0, Canada
Nantario, Corptown, Governors
Road 2145
[Continuation of summary]
Can be used.