JP2000500123A

JP2000500123A - ヘリコバクターピロリタンパク質

Info

Publication number: JP2000500123A
Application number: JP9514063A
Authority: JP
Inventors: ボウホ
Original assignee: コーテックスインターナショナルリミテッド
Priority date: 1995-09-29
Filing date: 1996-09-27
Publication date: 2000-01-11
Also published as: WO1997012910A1; ZA968185B; NO981407L; CA2233328A1; KR19990063833A; GB9519865D0; NO981407D0; BR9610953A; CN1201464A; EP0859788A1; AU7137896A; MX9802486A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヘリコバクターピロリから入手可能な新規な抗原タンパク質を提供するものである。ヘリコバクターピロリの検出方法およびワクチンの製造におけるこの抗原タンパク質の使用も、開示される。ヘリコバクターピロリの球菌様型をクローニングする方法もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】ヘリコバクターピロリタンパク質本発明は、ヘリコバクターピロリ（H．pylori）の球菌様型から誘導された新規な抗原、薬剤における一般的な使用、ワクチン製造における使用、および球菌様型の検出及びヘリコバクターピロリ感染の診断における使用、並びに被検者の疾患予後の決定に関する。ヘリコバクターピロリは、慢性活動性胃炎や消化性潰瘍疾病に強く関係しているグラム陰性細菌である（Marshall et al，Medical Journal of Australia， 142:439-444(1985); Buck，G.E.，Journal of clinical Microbiology,3:1-12(1 990)）。インビトロ培養において、ヘリコバクターピロリは、二つの別個の形態、すなわち培養可能ならせん型と培養できない球菌様型で存在する（Marshall et al，Microbios letters，25:83-88(1984); Kung，J.S.L.，and HO，B.，Wor kshop on Gastroduodenal Pathology and Campylobacter pylori(abstract P9) ，editedby F．Megraud and H．Lamouliatte，Bordeaux，France(1988)）。細菌のらせん型は、空気にさらされると、約２時間を越えて生存しない。好ましくない条件のもとで、らせん型は球菌様型へ分化する（Vijayakumari and Ho，Acta Gastro-enterologica Belgica，56:101(1993)）。今日まで、球菌様型のらせん型へのインビトロでの転換に関する成功はただ一例報告されているだけであり、その実験では再現できないことが証明されている（Mai et al，Gastroduodenal Pathology and Campylobacter pylori，pp28-33 ，edited by F．Megraud and H．Lamouliatte，Elsevier Science Publishers(1 989)）。球菌様型の形成はインビトロで抗生物質または栄養素の欠乏（Nilius e t al，Zbl．Bakt．280:259 -272(1993)）によって誘導できたけれども、球菌様型の研究は、この型及びヘリコバクターピロリのライフサイクルにおける役割に関する情報やこの型の同調培養株を得る方法が欠けているため、妨げられていた。今日まで、ヘリコバクターピロリ球菌様型は「死んだもの」、細菌のライフサイクルにおける役割が不明である生存できない形態と事実上みなされている。ここで議論された結果は、球菌様型は実際に生存可能な型で存在でき、ヘリコバクターピロリのライフサイクルである役割を有することを示し、かつこの役割はヘリコバクターピロリ感染の診断、予後、処置に関わることを示す。今日、ヘリコバクターピロリのらせん型の各種の抗原が同定されており（WO 93/22682を参照のこと）、例えば、コーテックスリミテッド（CORTECS LTD）から市販されている「ヘリサル（HELISAL^TM）」テストなどのヘリコバクターピロリの検出用診断キットで使用される。しかしながら、ここで記載された結果から、正確で完全な（すなわち球菌様型だけの感染）診断を確保するために、細菌の球菌様型の検出が必須であることが示される。命日、球菌様型用の特異抗原は同定されていない。このように、第１の概念において、本発明は、ヘリコバクターピロリの球菌様型から入手できる、６０ｋＤａの分子量（未変性ＰＡＧＥにより決定された）を有する抗原タンパク質を提供する。特に、そのタンパク質は、さらに、次のＮ −末端アミノ酸配列：Ｄ−Ｔ−Ｈ−Ｋ−Ｓ−Ｅ−Ｉ−Ａ−Ｈ−Ｒ−Ｆ−Ｎ−Ｄ−Ｌ−Ｇで特徴づけることができる。このタンパク質の抗原性並びに球菌様型における独特の存在は、ヘリコバクターピロリ球菌様型の存在を検出する手段として有用である。また、第２の概念において、本発明は、ヘリコバクターピロリ、特に検出された球菌様型に対する抗体の検出における本発明の抗原の使用を提供するものである。さらに、本発明の新規な抗原は、ヘリコバクターピロリを検出するより高感度な方法を提供するために、その他の抗原、特にヘリコバクターピロリのらせん型から得られるものと組み合わせて用いることができる。さらに、本発明の球菌様抗原は、抗体を育てるために使用され、この抗体は、完全な球菌様型の部分として存在するときの抗原を含む抗原の検出に用いることができる。例えば、抗体はラベルされ、組織検体などにおいて球菌様型を検出する手段として使用できた。抗原を使用して抗体を育成する方法は、かかる方法において使用する抗体にラベルを付す手段であり当業者に公知である。このように、第３の概念において、本発明は、抗体、例えばポリクロナール抗体の調製における、本発明の球菌様抗原の使用を提供するものである。別の概念において、本発明は、本発明の球菌様抗原に対して育成された抗体を含むヘリコバクターピロリ球菌様型の検出における、かかる抗体の使用を提供するものである。また、本発明の抗原は、ヘリコバクターピロリらせん及び球菌様の型の双方に対する抗原を含む抗原組成物の部分としての使用を見出す。第６の概念において、本発明は、本発明の抗原タンパク質、および任意成分として一以上のその他のヘリコバクターピロリ抗原であってヘリコバクターピロリのらせんまたは球菌様の形態のいずれかから得られる抗原を含む組成物を提供するものである。第７の概念において、本発明は、例えば抗体を検出することによって、ヘリコバクターピロリの球菌様型を検出する方法を提供し、これは本発明の抗原または本発明の抗原組成物を検体と接触させる段階を含む。通常検体は、生体試料、例えば血液試料、尿試料または唾液試料である。抗原または抗原組成物は、生体試料と直接接触させることができる。もしくは、生体試料は、例えばろ過、ｐＨ調整などによって、より好ましくするために最初に処理できる。好ましい方法の例は、英国特許出願９４２２９９１．１号に記載されている方法である。第８の概念において、本発明は、本発明の抗原タンパク質を被検者から得られた生体試料と接触させる段階を含む、ヘリコバクターピロリ感染の診断方法を提供するものである。かかる抗原は、ここで記載されるように、抗原組成物の形態で提供できる。一般的に、本発明の診断方法は、ヘリコバクターピロリのらせんまたは球菌様型のいずれかから得られる他の抗原の検出段階をも含んでいる。この方法において、ヘリコバクターピロリ感染のより高感度な診断方法が提供される。本発明の診断方法は、血液検体、尿検体または唾液検体について行うことが好ましい。本発明の診断方法は、例えば「ヘリサル（HELISAL^TM）」テストで使用される、テスト装置またはテストキットを用いて行うことが好ましい。別の概念において、本発明は、本発明の抗原タンパク質を含むヘリコバクターピロリ感染の診断用キットを提供する。一般に、本発明のキットは、ヘリコバクターピロリのらせんまたは球菌様型のいずれかから得られる他の一以上の抗原をも含んでいる。本発明の独特な抗原の同定は、また、細菌のらせん及び球菌様型の双方に対して活性なヘリコバクターピロリに対するワクチンを提供する可能性を切り開く。第１０の概念において、本発明は、本発明の抗原と一以上のアジュバントおよび／または坦体を含む、ヘリコバクターピロリ感染の予防用または治療用のワクチンを提供するものである。この概念の好適な実施態様において、ワクチンには、ヘリコバクターピロリのらせん型から誘導された一以上の抗原が含まれる。これらの付加的な抗原が、らせん型に対して独特である少なくとも一つの抗原を含むことが好ましい。別の概念において、ワクチンは、細胞がＧＩ域(Gl tract)で、免疫応答を誘導するので、ヘリコバクターピロリ自体の球菌様型（死または生存のいずれか）を含むことができる。さらに、本来の球菌様型とらせん型との間に現われるヘリコバクターピロリの形態は、これらが新規な抗原を発現しているため使用することができる。すなわち、ヘリコバクターピロリの球菌様または中間の型は、免疫応答を達成する新規な抗原の運搬用の乗り物として使用される。さらに、本発明の新規な抗原は、ヘリコバクターピロリ感染に対する応答において子供らから得られたＩｇＭ抗体を検出するために使用できることが見出された。第１１の概念において、本発明は、本発明の抗原を子供から得られた生体試料と接触させる段階を含む、子供らにおけるヘリコバクターピロリの球菌様型に対するＩｇＭ抗体を検出する方法を提供するものである。生体試料は、血液検体、尿検体または唾液検体が好ましい。ここで述べたように、生存できるヘリコバクターピロリの球菌様型を培養する方法を考案できた。このように、最後の概念において、本発明は、球菌様型へ分化しかつ得られた球菌様型が生存するように、ヘリコバクターピロリのらせん型を含む培養培地に二酸化炭素を定期的に加える段階を含む、ヘリコバクターピロリの球菌様型を培養する方法を提供するものである。ＣＯ₂は少なくとも一日に２回加え、培養は分化を確実なものとするために、９週間実施することが好ましい。本発明は次の実施例を参照して記載されるが、本発明を限定することを意図するものではない。実施例は図面を引用する。図１は、同一のｐＨとウレアーゼ測定装置を備えるケモスタットで成長したヘリコバクターピロリの一般的な成長曲線を示し；図２は、位相差顕微鏡、倍率ｘ１０００のもとで見られる（ａ）らせんと（ｂ）球菌様の湿式調製を示す。らせん細胞は均一密度であるが、球菌様の場合は二つのタイプがある：（Ａ）濃い細胞質を有するコンパクトと（Ｂ）「ゴースト」細胞のような粗な細胞質を有するもの；図３は、球菌様型の透過型電子顕微鏡写真、倍率ｘ８００００、を示す；図４は、鞭毛を有する球菌様型の透過型電子顕微鏡写真、倍率ｘ８００００を示す；図５は、銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質特性を示す。レーン１：高分子量マーカー（Ｓｉｇｍａ）、レーン２：低分子量マーカー（Ｓｉｇｍａ）、レーン３：らせんＮＣＴＣ１１６３７、レーン４：球菌様ＮＣＴＣ１１６３７、レーン５：らせんＶ₂、レーン６：球菌様Ｖ₂；図６は、（ａ）らせん及び（ｂ）球菌様の修正過ヨウ素酸シッフ染色塗抹標本を示す、倍率ｘ１０００；図７は、球菌様型の修正グラム染色を示す、ここで、（ａ）は唾液酵素αアミラーゼで処理され、（ｂ）は処理されていない；図８は、ヘリコバクターピロリのＤＮＡを示し、レーン１：ＨｉｎｄＩＩＩ切断λＤＮＡ、レーン２：らせんＮＣＴＣ１１６３７、レーン３：球菌様ＮＣＴＣ１１６３７、レーン４：らせんＶ₂、レーン６：球菌様Ｖ₂；図９は、修正アルバーツ（Albert）染色の結果を示す、倍率ｘ１０００；図１０は、ＰＡＧＥによるウレアーゼ酵素活性の検出を示す。レーン１：高分子量マーカー（Pharmacia）、レーン２：らせんＮＣＴＣ１１６３７、レーン３：球菌様ＮＣＴＣ１１６３７、レーン４：らせんＶ₂、レーン５：球菌様Ｖ₂；図１１は、銀染色未変性ＰＡＧＥタンパク質特性を示す。レーン１：高分子量マーカー（Pharmacia）、レーン２：らせんＮＣＴＣ１１６３７、レーン３：球菌様ＮＣＴＣ１１６３７、レーン４：らせんＶ₂、レーン５：球菌様Ｖ₂；図１２は、球菌様抗原に関する非変性条件下でのウエスタンイムノブロットを示す。レーン１：分子量マーカー（Pharmacia）、レーンＡ：前免疫抗らせん血清、レーンＢ：抗らせん血清、レーンＣ：前免疫抗球菌様血清、レーンＤ：抗球菌様血清；図１３は、球菌様型の間接蛍光抗体試験を示す、倍率ｘ１０００、ここで、らせん型のように球菌様型は、紫外線のもとで蛍光を発し、これらの表面抗原が類似することを示す。実施例１（ａ）細菌株およびヘリコバクターピロリの分化形態の調製非潰瘍性消化不良症の患者から単離された局所ヘリコバクターピロリ株Ｖ₂ が用いられた。この株は最初に、その純度を調べるために、チョコレートブロッド寒天培地（ＣＢＡ）において培養された。次いで、平板培養に、接触材料として、３０ｍｌＢＨＩＨ（１０％ウマ血清および０．４％酵母抽出物を追補してなる脳心臓浸出物）を収容する２５０ｍｌスコット（Schott）平底丸瓶を用い、３７℃で７２時間インキュベートした。すなわち、これは次々にケモスタットまたは回分培養の接種材料として働くものである。５４０ｍｌのＢＨＩＨを収容する１．５リットル発酵槽が、ホウとビジャヤクマリ（Ho and Vijayakumari）(Microbios，76:59-66(1993))において述べられるようにして立ち上げられた。培養基に３日令ヘリコバクターピロリ培養株の２×３０ｍｌを接種し、１：１０（接種材料：培養基）の割合とした。これゆえ、二酸化炭素を１日に２回、それぞれ５秒づつ供給し、約３５〜４０ｒｐｍの羽根速度のフィードバック制御によって溶解酸素を維持した。試料が所定時間間隔毎に引き抜かれ、ウレアーゼ活性、ｐＨ、生存率が検査され、および形態学的変化に関する顕微鏡的試験が行われた。培養菌は、細胞の毎日の観察を続けながらこのような条件下に最長３カ月まで維持された。同質／同調培養株が観察されると、細胞は１００００ｇで４０分間の遠心分離によって回収され、そして１回洗浄された。このペレットが次に、修正グリシン法(Ho，B.，and Jiang，B.，European Journal of Gastroenterology and Hepatology，7:121-124(1995))を用いて、球菌様型抗原を調製するために使用された。あるいはまた、２７０ｍｌのＢＨＩＨを収容する、きつくはまるゴム栓をはめた、１リットル容スコット(Schott)丸底丸瓶あるいは１リットル容エレンマイヤー枝付きフラスコが用いられた。７ｍｍ直径の穴が、５０ｍｍ直径を有する０．２２μｍフィルターを有する使い捨てフィルターユニット（例えば、ゲルマン(Gelman)）の装着に適応できるように、開けられた。ＢＨＩＨの各２７０ｍｌは３日令ヘリコバクターピロリ培養株に接種された。二酸化炭素が１日に２回、前記０．２２μｍフィルターを介して供給された。培養菌は、９０ｒｐｍに維持された３７℃振盪インキュベーター（ニューブランスウィック(New Brunswick)）中で、最大９週間までインキュベートされ、そして細胞はこれに続いて１００００ｇで４０分間の遠心分離によって回収された。細胞ペレットは一回洗浄され、そして上述したようにして抗原が調製された。チョコレートブロッド寒天培地上における４８時間令培養株が、「同調」らせんを提供するために、使用された。（ｉｉ）血清検体胃十二指腸疾患の５０人の患者、および５０人の血液供給者からの血清がそれぞれ、シンガポールの、トアペイヨホスピタル(Toa Payoh Hosptal)のケイエムフォック教授(A/Prof K M Fock)およびナショナルユニバーシティホスピタルのディークペラン博士(Dr D Kuperan)によって、親切にも提供された。（ｉｉｉ）ＥＬＩＳＡおよびウエスタンイムノブロッティング非直接的ＥＬＩＳＡおよびウエスタンイムノブロッティングは、カイアとホウの方法(Khia and Ho，Biomed．Letts．50:71-78(1994))に従って実施された。結果図１は、代表的な培養株の生存率、ｐＨおよびウレアーゼ比活性を示すものである。これより、９週で培養株は球菌様型培養株となったように見える。このことは、ＣＢＡにおける成長に関するらせん型の顕微鏡的試験の衰退によって確証された。らせん形態から球菌様型形態へと分化するために要する時間は二酸化炭素の定量供給に依存する。さらに、球菌様型の２つの形態が存在することも明らかである。その１つは密な細胞形質を有するのに対し、他方は「ゴースト(ghost )」様の外観を有する。この後者の形態は、生存不能であると考えられる。他の報告（ニリアスら(Nilius et al)、上記）に反して、ケモスタット培養体は、ほとんどが密な球菌様型を示した。これらの球菌様型はまた回収され、そして２０％グリセロールを追補されたＢＨＩＨに懸濁された。次いで、懸濁された球菌様型は、必要とされるまで−８０℃で貯蔵された。ＥＬＩＳＡＥＬＩＳＡによって、５０人の患者のうち３７人（７４％）が、球菌様型およびらせんの抗原に対するヘリコバクターピロリＩｇＧ抗体に血清的に陽性であった（表１）。５０人の血液提供者のうち、１６人（３２％）および１４人（２８％）はそれぞれ、球菌様型およびらせんの抗原に対するＩｇＧ抗体に対して血清的に反応性であることがわかった（表１）。比較のための標準としてらせん抗体を用いると、球菌様型抗原に対するＩｇＧＥＬＩＳＡの感受性および特異性はそれぞれ、９８％および９４％であった。感受性９８％特異性９４％これらの結果は、用いた試料において、４％より高い検出割合が球菌様型特1 異性抗原ならびにらせん抗原の双方を用いた場合に達成されることを示すものである。これゆえ、明らかに、診断およびそれゆえの治療の良好な割合が、球菌様型特異性抗原の使用から得られるであろう。ウエスタンブロッティングウエスタンブロッティングによって、血清ＩｇＧは、球菌様型のおよびらせんの抗原の双方における同様の主要なタンパク質バンドを認識することが示された。双方の抗原に検出されたこの保存タンパク質バンドは、１２８、１１６、１１０、９５、９１、６６、６０、５４、５０および３３ｋＤａであった。実施例２細菌株上記実施例１において言及した、非潰瘍性消化不良症の患者から単離された局所ヘリコバクターピロリ株Ｖ₂、および標準株ＮＣＴＣ１１６３１７という２つの株のヘリコバクターピロリが用いられた。培養菌の調製実施例１において述べたようにして、球菌様型およびらせんの培養菌が調製された。球菌様型型に関しては、回分培養菌が以前に述べられた（ホウとビジャヤクマリ(Ho and Vijayakumari)、後記）ようにして育成された。小量が、チョコレートブロッド寒天培地上における培養能を評価するために所定の時間間隔で無菌的に取り除かれ、そしてマイルズとミスラの技法(Miles and Misra，Journal of Hygiene，38:732-738(1938))を用いて生存数が数えられた。位相差顕微鏡下のニューバウワー(Neubauer)細菌計数チャンバーを用いて、球菌様型に対するらせん型の数を三回数えることによって、球菌様型のパーセンテージを概算した。ウレアーゼ比活性は、培養培地のｐＨをモニターしながら、上記したハミルトン −ミラーとジェーガン(Hamilton-Miller and Ger gan)のフェノール分光光度法を用いて測定された。培養菌の光学および電子顕微鏡検査培養菌は、位相差顕微鏡を用いて運動性および形態を観察した。希釈石炭酸フクシンでの対比染色が、通常の１分に代えて１０〜３０分間実行されるという修正グラム染色を用いて、培養菌の空気乾燥塗抹標本が染色された。多糖類に関する過ヨウ素酸シッフ染色において、ホッチキス(Hotchkiss)の方法(Archives in biochemistry，16:131-141(1948))は、亜硫酸フクシンでの通常１５〜４５分間と比較してより長い９０分間の染色時間、およびマラカイトグリーンでの４５分間の延長された対比染色による等の点で変更された。ボルチン顆粒に関するアルバート染色のレイボウン修正(Laybourn'smodificat ion of Albert's strain)(Cruickshank，Medical Microbiology:A guide to lab oratory diagnosis and control of infection，pp656-657(1968))は、さらに、らせん型で使用する通常の３〜５分間に代えて、球菌様型では４５分間というより長い染色時間を用いることにより、さらに変更された。透過型電子顕微鏡用の細胞は、４％グルタルアデヒド中で固定され、銅製グリッドの上で乾燥され、そして０．５％リンタングステン酸（ｐＨ６．８）でネガティブ染色された。グリッドはフィリップスＪＯＥＬ−ＪＥＭ−１２００ＥＸ透過型電子顕微鏡を用いて観察された。生化学的検定１９の異なる酵素反応の存在およびバイオタイプが、市販のストリップＡＰＩＺＹＭキット２５２０(Kung et al．Journal of Medical Microbiology， 29:203-206(1989))を用いて測定された。ウレアーゼ比活性はハミルトン−ミラーとジェーガン(Hamilton-Miller and Gergan)のフェノール分光光度法(Investi gative Urology，15:327-328(1979))を用いて定量的に測定され、一方、タンパク質含量は、修正ローリー検定法(modified Lowry assay)(Schacterle & Pollac k，Analytical Biochemistry，51:654-655(1973))によって検定された。ＡＴＰはバイオルミネッセンス検定キット(Bio-Orbit，Finland)を用いて定量され、また多糖類含量は、チャプリンとケネディ(Chaplin and Kennedy)(Carbohydrate A nalysis: a practical approach，ppl-2．Edited by M．F．Chaplin and J．F． Kennedy，Oxford: IRL press(1986))により記載されたＬ−システイン硫酸検定法で測定された。ＤＮＡ抽出およびミクロ試験双方の形態のＤＮＡを、クレイトンら(Clayton et al)の手順(Infection and Immunity，57:623-629(1988))に従って抽出し、１％アガロースゲル上において電気泳動した。１細胞当たりの全ＤＮＡ含量は、カプシンスキーとスコクジラス (Kapuscinski and Skoczylas)(Analytical Biochemistry，83:252-257(1977))による方法に従い検定された。タンパク質特性およびウエスタンイムノブロッティングタンパク質特性はラムリ(Laemmli)(Nature，227:680-685(1970))の方法に従ってポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＥＧＥ）によって解明された。変性していない未変性ＰＡＧＥで、完全細胞試料の３０μｇ総タンパク質を、６％セパレーティングゲルおよび５％スタッキングゲル上で電気泳動した。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）変性ＰＡＧＥは、同じ量のタンパク質を、１０％セパレーティングゲルおよび５％スタッキングゲル上において電気泳動した。相対分子量が、それぞれの電気泳動条件下において走査した対照タンパク質を用いて測定された。双方のタイプのゲルが、サムブロックら(Sambrock et al)(Molecular Cloning: A Laboratory Manual，2nd edn．Cold Spring Harbour，New York: Cold Spring Harbour Laboratory(1989))の手順に従い銀染色によって可視化された。加えて、未変性ＰＡＧＥおよびＳＤＳＰＡＧＥの双方のタンパク質バンドを、トウビンら(Towbin et al)の方法(PNAS USA 76: 4350-4354(1979))を用いてイムノバイロンＰ(Immobilon P)（ミリポア）膜上ヘエレクトロトランスブロッティング(electro transblotting)した。らせん型または球菌様型のいずれかに対するウサギにおいて生じた抗体が、双方の形態における特異的かつ免疫遺伝的なタンパク質を同定するためのプローブとして用いられた。血球凝集および血球凝集抑制試験モーガンら(Morgan et al)の微量滴定プレート法(Journal of Clinical Micro biology 29:395-397(1991))の僅かな変更が、個々の微量滴定ウェル中において１０⁷〜１０¹²細胞／ｍｌの範囲を含有する細菌培地２５μｌに対して添加される、２０μｌの２v/v％赤血球細胞（ヒトまたはウサギ）に関して実施された。各混合物は、血球凝集パターンを判読する前に、４℃で一晩、４通りにインキュベートされた。血球凝集抑制試験は、１ｍｇ・ｍｌ^-1プロテアーゼ(pronase E， Sigma)を用いて３７℃で６０分間予め処理された、あるいは６０℃で１０分間加熱された細菌を用いて実施された。同様に赤血球細胞は、血球凝集試験の前に、４．０μｇ・ｍｌ^-1ノイラミニダーゼ(Neuraminidase，Sigma)または１ｍｇ・ｍｌ^-1プロテアーゼを用いて３７℃で６０分間予め処理された。非直接蛍光抗体試験球菌様型およびらせん型の塗抹標本を、ヘリコバクターピロリに対するＩｇＧ抗体陽性であるヒト血清で処理される前に、ガラススライド(HTC，Wellcome) 上で乾燥した。３０分間のインキュベーションの後、塗抹標本はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−ｐＨ７．６）を用いて、それぞれ１０分間づつ３回洗浄された。塗抹標本は次いで、３０分間にわたり１：４０希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ接合ＦＩＴＣ(Wellcome)で処理された。塗抹標本は、ＰＢＳを用いてそれぞれ１５分間づつ４回洗浄され、緩衝化グリセロールを用いて載置され、レイチャート−ユング蛍光顕微鏡(Reichert-Jung fluorescence microscope)を用いて紫外線下で観察された。結果および考察球菌様型の同調培養球菌様型の同調培養が、ケモスタット環境下で首尾よく調製された。図１は、ケモスタット内のヘリコバクターピロリの一般的成長曲線を示す。最初の２週間の成長は、ホ(Ho)やビジャヤクマリ(Vijayakumari 下記参照)により記載されたのと類似していた。後の無変化相は、次の２週間内に生存数１０⁵ＣＦＵ／ｍｌへの漸進的な減少を示した。続いて、下降する死滅基が次の５週間直線的に続いた。およそ９週間の培養期間を通じ、球菌様型のパーセンテージはらせん型に対し反比例することを示した。培養基のｐＨは最初の３日で中性から６．５８に減少し、次の４週間の変化の無い相では６．５３＋／−０．１３に保たれた。ｐＨは次の２週間６．８４＋／ −０．０２で安定した後、第７週に最高６．９８に増加した。カルトレニッチとメーキン(Catrenich & Makin)は、ｐＨと生存数との間のよく似た反比例関係を報告し(Scandinavian Journal of Gastroenterology，6(suppl．181):58-64(199 1))、生存数の損失と球菌様型への転換がデアミナーゼ活性により生産された内因性の塩基性ｐＨによるものと仮定した。しかしながら、我々の研究において、マーシャル(Marshall)らおよびディック(Dick)により報告されたように(Ann.Rev .Microbiology，44:249-269(1990))、ヘリコバクターピロリが生育するために認容できる範囲内に培養基のｐＨが維持されるので（ｐＨ６．５−７．５）、らせん型から球菌様型への転換は、ｐＨ変化より栄養欠乏または代謝抑制による可能性が最も高い。指数関数的増殖期の平均ウレアーゼ特異活性（ＵＳＡ）は４．９０＋／−４．４２Ｕｍｇ^-1タンパク質であり、定常期では１１．５８＋／−１０．０３Ｕｍｇ^-1 タンパク質へ増加した。この期間に、第１８時間、第１５時間、および第３３３時間における最も高いピークである峰性のピークがおのおの観察された。ＵＳＡは減衰する死期に直線的に減少した。培養の終期において、ＵＳＡは０．１８＋／−０．０３Ｕｍｇ^-1タンパク質であった。これは、ウレアーゼ活性がらせん型を活発に再生産するために重要であり、球菌様型型の形成と共に減少することを示す。マーシャルらは、インビトロのヘリコバクターピロリのウレアーゼ活性の主要な作用は、酸から細菌を保護することであると報告した(Gastroenterol ogy，99:697-702(1990))。このように、定常期のＵＳＡの増加は、代謝による酸性ｐＨの増加に対するらせん型の好ましい反応である。付随して、衰退期でｐＨが増加するため、このＵＳＡは減少する。顕微鏡検査位相差顕微鏡のもとで、らせん型は細胞質密度が一様の湾曲またはＳ型の桿状として現れる(図２ａ)。一方球菌様型は円形でかつ２つのタイプから構成される。一つのタイプは、密度の濃い細胞質を有するコンパクトであり、他のタイプは粗の細胞質を有し、ゴースト細胞の外観を示していた（図２ｂ）。蔗糖密度勾配遠心分離を用いて球菌様型の２つのタイプを分離することは不可能である。透過型電子顕微鏡では、我らの観察は、マーシャルら(Marshall et al 1984 infra) による初期の報告と類似し、らせん型は細胞の寸法が０．３−０．５μ×１．０ −３．０μであり、丸く膨らんだチップにおいて１−６の鞭毛末尾の房を有する。反対に、球菌様型は、２００−３００ｎｍの範囲に及ぶ直径の環状を示し、完全な細胞膜を有する(図３)。らせん型は特徴的な突進運動性を有するが、反対に球菌用型は位相差顕微鏡下での観察で運動性がなかった。一方、透過型電子顕微鏡はある球菌様型で鞭毛の存在を示した（図４）。これは、鞭毛は、らせん型の遺残組織であること(Marsh all et al，1984 infra)、または球菌様型はその運転のためのエネルギーの欠損または優勢状態であるために不活性であるが、実際鞭毛を有するということのいずれかを意味する。スエルバウムら(Suerbaum et al)は、クローン化された鞭毛遺伝子を有し(Journal of bcteriology，175:3278-3288(1993))、少量の鞭毛遺伝子の変異は正常な鞭毛化および運動性の細菌を生じるけれども、大多数の鞭毛遺伝子の変異が非運動性の結果となること、およびヘリコバクアーピロリの鞭毛化の結果となることを観察した。この研究において、変性ＳＤＳＰＡＧＥタンパク質特性は、多くの５２ｋＤａ鞭毛タンパク質がらせん型と比較して球菌用型で強度が低下しているが、５８ｋＤａの少量の鞭毛タンパク質は、らせん型および球菌様型において同じ強度で存在することを示す（図５）。少量の鞭毛が鞭毛ホックの基部に近いところに局在し、その構造は鞭毛付属装置を要求するので(Kostrzynska et al，Journal of Bacteriology，173 :937-946(1991))、この発見は、運動性は欠如するが球菌様型の完全な鞭毛を説明することができた。修正グラム染色法において、球菌様型は３０分の対比染色の後に弱いグラム陰性を示すが、らせん型は１０分間の対比染色でグラム陰性を示した。修正過ヨウ素酸シッフ染色において、らせん型はグリーンに染色され(図６ａ)、球菌様型は明るい赤であり、これらの細胞膜の多糖類の存在が示された（図６ｂ）。この反応は、透過型電子顕微鏡での観察として、球菌様型の周りのおよそ５０−６０ｎｍのラジウムのあいまいな光により持続された(図３)。５０％を越える球菌様型細胞成分であるこの多糖類層は、修正グラム染色反応における球菌様型の染色性が悪いことを説明できる。一貫して、球菌様型の多糖類成分を消化するための染色前の唾液酵素αアミラーゼによる球菌様型の処理は、大変にグラム染色反応を改良した(図７)。更に、球菌様型のこの多糖類成分はらせん型より１０倍以上であった(表２)。これは、多糖類被膜の存在は不利な環境下での細菌の生存を助けることを示す。この吸湿性層は、細胞内ガス交換の調整バッファとして働き、細胞分解および細胞死となる流体の損失または過吸着を妨害する(Wilkinson，Bact eriological Review，22:46-73(1958))。＊単位はμｍｏｌ／細胞このように、球菌様型は、好ましくない環境下および大気酸素圧下でも厚い多糖類層により提供された保護により人体外で生存しうる。同様の観察は、ローリンスおよびカルウェル(Rollins and Colwell)らによりカンピロバクタージェジュニ(Campylobacter Jejuni)でおこり(Applied and Environmental Microbiol ogy，52:531-538(1985))、ここで培養懸濁液の粘度の増加は、らせん型から球菌様型への転移をうけるものと指摘された。かれらは、適性を確保するための細胞外粘性の多糖類の生産がカンピロバクタージェジュニの生存性を拡大したと示唆した。ヘリコバクターピロリの培養において、顆粒状のらせん型では凝集する傾向があったが、粘度の増加は観察されなかった。位相差顕微鏡下で、同調した球菌様型は大きな凝集と観察された。この多糖類層は、互いに凝集物となっている球菌様型を保持するよう作用するらしい。ＤＮＡ含量完全なクロモソームＤＮＡは、生存していると思われる球菌様型から抽出された(図８)。球菌様型の全ＤＮＡ含量は、３．１３×１０^-7ｎｇ／細胞であるが、らせん型の全ＤＮＡ量は、およそ５．２２×１０^-7ｎｇ／細胞であった(表２)。らせん型と比較した球菌様型のＤＮＡの減少は、位相差顕微鏡下で観察されたように、細胞質の漏洩および遊離している球菌様型群によって説明できる(図２ｂ)。一方、らせん型と比較して全ＤＮＡ含量のたった半分を有する球菌用型は、不活性化またはこの異なる形態の生存計画をも示す。ノビスキー(Novitsky)とモリタ(Morita)は、生存計画下でマリンビブリオＡＮＴ３００(marine vibria ANT 300)におけるＤＮＡ量の４８％の減少を報告した(Applied and Environmental Microbiology，33:635-641(1977))。かれらは、これがエネルギー保存の計画であり、外来性ＤＮＡの分解または部分的なＤＮＡの複製の結果と示唆した。生物学的特徴らせん型はオキシダーゼおよびカタラーゼ陽性であるが、球菌様型はこれらの定性試験のいかなる視覚的反応をも示さない（表３）。らせん型と球菌様型の双方は、ＡＰＩＺＹＭテストで同じクング等が記載(Journal of Medical Microb iology，29:203-206(1989))したバイオタイプＩＩに属すると同様の酵素特性を示した。興味深いことには、等しい酸性ホスファターゼ活性とアルカリ性ホスファターゼ活性とがらせん型および球菌様型で観察された（表３）。休眠球菌様型 (dormant coccoid)にこれらの酵素が存在すると、無機リン酸塩の輸送とＡＴＰ型エネルギー源の発生とに作用する可能性があった。球菌様型はＡＴＰを含んでいたが、らせん型より１００倍少なかった（表２）。これは、球菌様型は休眠型であるが生存可能であることを示す。同様に、固有呼吸の９９％が減少することが、マリンビブリオＡＮＴ３００(marine vibrio ANT 300)において、長期間の栄養飢餓状態下でその生存計画の一部として示された(Novitsky & Morita，Applied and Environment Microbiology ，32:617-622(1976))。＋＝陽性 −＝陰性Ｗ＝弱陽性加えて、最近の研究は、逆条件下でヘリコバクターピロリのらせん型が細胞内ポリホスフェートを形成することを明らかにした(Bode et al，Journal of Ge neral Microbiology，139: 3029-3033(1993); Caselli et al，Gut，34:1507-15 09(1993))。これらの機構はエネルギーとリンとの貯蓄を示し、かつＡＴＰの供給が不足する場合の代替えエネルギー源とみさなれる。ボルチン顆粒（ポリホスフェート）は、アルベルト株(Albert's strain)の球菌様型で観察され（表９）、生存計画の構築となり得る。更に、ホフフォヒドラーゼ酵素の存在は、これらポリホフフェートを代謝する役目を果たす。球菌様型の平均ウレアーゼ特異活性はらせん型より２０倍低く、らせん型が３．６１＋／−０．５２Ｕｍｇ^-1タンパク質であるのと比較して０．１８＋／−０．０３Ｕｍｇ^-1タンパク質であった。球菌様型でウレアーゼ活性が低いことは、球菌様型で前形成酵素が残っていることまたは休眠球菌様型が活発に再生産しているらせん型のように、多くのウレアーゼ酵素活性を要求しないことによる。これは、球菌様型でのラピッドウレアーゼテスト(rapid urease test)が４８時間後でも陰性であった理由、および表１０に示すように、ウレアーゼ活性バンドがシェイク法(Shaik et al，Analytical Biochemistry，103:140-143(1980))によるＰＡＧＥの感度の高い染色によって検出されなかったことの理由となる。それにも拘わらず、２９ｋＤと６６ｋＤのウレアーゼサブユニットＡとＢは、変性のＳＤＳＰＡＧＥ（表５）で示すように球菌様型で保存される。留意すべき興味あることは、球菌様型では２０倍も低いにも拘わらず、これら２つのウレアーゼサブユニットの等しいバンド強度がらせん型および球菌様型で観察されたことである。球菌様型のウレアーゼＡとＢサブユニットのみにおける優勢的存在は、ヘリコバクターピロリでウレアーゼ活性に必須であるウレアーゼサブユニットＣとＤ (Labigne et al，Journal of Bacteriology，173:1920-1931(1991))が存在しなかったので、ウレアーゼ活性が低下したことを説明することができる。タンパク質特性ＳＤＳ−ＰＡＧＥが示すように(表５)、休眠を示している球菌様型において分子量１４より小さく２００ｋＤより大きい種々のタンパク質の数とバンド強度が減少したことも観察された。このことは、球菌様型での細胞に対する全タンパク質成分量は、らせん型で観られたもののたった半分であったという事実によっても更に増強される(表２)。リーブら(Journal of Bacteriology ，160:1041-1046(1984))は、タンパク質の分解は、エシェリキアコーリ(Esche richia coli)とサルモネラティフィムリウム(Salmonella typhimurium)の飢餓下の生存に必要であることを示した。一方、ウレアーゼサブユニットＡとＢの保存および鞭毛タンパク質の存在は、ウレアーゼ酵素と鞭毛とが球菌様型のらせん型への変化および続くらせん型の胃環境での生存に必要であること意味しうる。未変性ＰＡＧＥでの、痕跡量の９５５、８７１および６６１ｋＤａの３つの新規なタンパク質の存在および６０ｋＤａの別個のバンドが観察された(図１１)。新規なタンパク質バンドの出現は、球菌様型がある目的を有し、かつ単にヘリコバクターピロリの退化的な形態を示すものではないことを示す。加えて、ウエスタンイムノブロッテイングが、特異的かつ球菌様型に免疫遺伝性を有する６０ｋＤａのタンパク質を同定した。血球凝集反応試験および血球凝集阻止反応試験ヘリコバクターピロリの大部分の株が、ヒトやウサギ等の種々の赤血球を凝集することは知られている(Morgan et al，1991 後記; Taylor et al，Journal of Microbiology，37:299-303(1992))。この研究で、らせん型と球菌様型の双方は細菌濃度１０⁸以上で等しくよくヒト赤血球を凝集させた。ウサギ赤血球では、らせん型は最低１０⁸で凝集し、球菌様型は観察できる血球凝集の生産のために１０⁹が必要とされた。血球凝集反応は、加熱と赤血球のプロテアーゼ処理で抑制された。このことは、らせん型でのハング(Huang)等による観察されたもの( FEMS Microbiolog y Letters，56:109-112(1988))と同様で、レセプターはタンパク質ではなくシアル酸であるが、球菌様型の血球凝集物はタンパク質であることを示した。故に、らせん型の血球凝集特性はワスロム(Wadstrom)らにより観察された(European Jo urnal of Gastroenterology and Hepatology，5(suppl,2):s12-s15(1993))と同様に、球菌様型でも維持された。間接的蛍光抗体法球菌様型は、紫外線下蛍光を発することが観察（図１３）され、これらの表面タンパク質は無傷であるらせん型と似ていることが示されていた。この特性は、特異的存在とその環境下でのヘリコバクターピロリの生存性の検出に使用することができ、感染経路の解明を助ける。同様の特性が、サルモネラエンテリティデス(Salmonella enteritides)、ビブリオコレラ(Vibrio cholerae)、イ．コーリ(E．coli)(Xu et al，Microbiol，Ecology 8:313-323(1982))のその環境下における非培養形態を除く生存可能数の研究のために試験された(Roszak et a l，Canadian Journal of Microbiology 30:334-338(1983))。この結果から、以前に信じられていたこととに反し、球菌様型は生存可能な形態で出現し得ると考えられた。これは、完全なＤＮＡ、ＡＴＰ酵素活性、新規かつ保存されたタンパク質の存在、およびその環境下でそれを保護するための厚い多糖類の存在を示す。栄養要求性および生理的要求性双方において、らせん型の好適性の本質は、この環境下での生存を抑制する(Marshall et al，1984 infra; Dick，1990 infra) 。微好気的ならせん型は酸素に感受性があり、２時間以上酸素にさらされると生存可能でなくなると報告されている(Slotesz et al，Journal of Clinical Micr obiology，30:1453-1456(1992))。このように、代替形態的状態としての球菌様型は、細胞周期と、ことによるとヘリコバクターピロリの伝染様式とを結び付けるものである。培養できず異なる形態であるものを除く同様の生存可能な形態が、ミクソコッカスキサンタス(Myxococcous xanthus)(White et al，Journal of Bacteriology，95:218 6-2197(1968))、マリンビブリオＡＮＴ３００(Marine Vibrio ANT 300)(N ovitsky & Morita，1977 infra)およびアルスロバクタークリスタロポエテス( Arthrobacter crystallopoietes)(Boylen & Ensign，Journal of Bacteriology ，103:569-577(1970))等の他の微生物の細胞周期で観察され、反対の条件でのこれらの生存計画の一つの必須の役割を果たすようにみられる。多くの報告は、³Ｈチミジンの取り込み等の非培養方法による水中のヘリコバクターピロリの検出（Shahamat et al，Klin．Wochenschr.，67:62-62(1989) ）、糞便中における(Mapstone et al，Lancet，341:447(1993))およびペル(Peru )での水道中におけるポリメラーゼ連鎖反応による検出(Westblom et al，Acta E nterolgica Belgica，56(suppl):47(1993))を引用した。³Ｃ尿素呼吸試験によるヘリコバクターピロリ流行に関する研究は、河川水の消費にも関連する(Klein et al，Lancet，337:1503-1508(1991))。これらの間接的検出手段は、この研究が球菌様型におけるＤＮＡの存在を示すため、その環境下での球菌様型検出の可能性を締め出すものではない。更に、排出直後のヒト糞便からのヘリコバクターピロリの単離は、らせん型は、これらの微好気的本質および酸素毒性(Krieg & Hoffman，Ann．Rev．Microbiol.，40:107-130(1989))により、２時間以上正常大気中で生存しないという可能性を締め出すものではない(Slotesz et al，1992 infra)。これらの初期の報告は、ヘリコバクターピロリにおける一つ以上の形態が存在するという事実を確立するのにのみ役立つ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヘリコバクターピロリの球菌様型から入手できる、未変性ＰＡＧＥにより同定される、分子量６０ｋＤａの抗原タンパク質。２．次のＮ末端アミノ酸配列：Ｄ−Ｔ−Ｈ−Ｋ−Ｓ−Ｅ−Ｉ−Ａ−Ｈ−Ｒ−Ｆ−Ｎ−Ｄ−Ｌ−Ｇを含む請求の範囲第１項記載の抗原タンパク質。３．ヘリコバクターピロリに対する抗体の検出における、請求の範囲第１項または第２項記載の抗原タンパク質の使用。４．抗体の検出が、ヘリコバクターピロリの球菌様型の存在を検出するために使用されるものである請求の範囲第３項記載の使用。５．ヘリコバクターピロリの球菌様型の抗原タンパク質が、ヘリコバクターピロリのらせん型または球菌様型のいずれかから入手できる１以上の他の抗原と共に使用される、請求の範囲第３項記載の使用。６．抗体の製造における請求の範囲第１項または２項記載の抗原タンパク質の使用。７．抗体がポリクローナル抗体である、請求の範囲第６項記載の使用。８．ヘリコバクターピロリの球菌様型の検出における、請求の範囲第６項または７項記載の抗体の使用。９．請求の範囲第７項または８項記載の抗体からなる、請求の範囲第８項記載の方法で使用するためのキット。１０．請求の範囲第１項または２項記載の抗原タンパク質と、必要に応じて１以上の他のヘリコバクターピロリ抗原とを含有する組成物。１１．任意の１以上の他の抗原がヘリコバクターピロリのらせん型または球菌様型のいずれかの形態またはその双方から得られるものである、請求の範囲第１０項記載の組成物。１２．請求の範囲第１項または第２項記載の抗原タンパク質と検体とが接触する段階を含むヘリコバクターピロリの検出方法。１３．ヘリコバクターピロリの球菌様型の検出用である請求の範囲第１２項記載の方法。１４．抗原タンパク質が請求の範囲第１０項または第１１項記載の組成物のかたちである請求の範囲第１２項または第１３項記載の方法。１５．試料が生体試料である請求の範囲第１２項から第１４項のいずれかに記載の方法。１６．生体試料が被検者から得た血液試料、尿試料または唾液試料である請求の範囲第１５項記載の方法。１７．請求の範囲第１項または第２項記載の抗原タンパク質と、被検者から得た生体試料とが接触する段階を含むヘリコバクターピロリ感染の診断方法。１８．抗原タンパク質が請求の範囲第１０項または第１１項記載の組成物のかたちである請求の範囲第１７項記載の方法。１９．ヘリコバクターピロリのらせん型または球菌様型のいずれかから得られる他の抗原の検出段階を含む請求の範囲第１２項から第１８項のいずれか１項記載の方法。２０．生物試料が血液試料、尿試料または唾液試料である、請求の範囲第１９項記載の方法。２１．請求の範囲第１項または第２項記載の抗原タンパク質を含むヘリコバクターピロリ感染の診断で使用するためのキット。２２．ヘリコバクターピロリのらせん型または球菌様型のいずれかから得られる１以上の他の抗原を更に含有する請求の範囲第２１項記載のキット。２３．請求の範囲第１項または第２項記載の抗原タンパク質と１以上のアジュバントおよび／または坦体とを含有するヘリコバクターピロリ感染の予防用または治療用ワクチン。２４．ヘリコバクターピロリのらせん型または球菌様型のいずれかから得られる１以上の他の抗原を更に含有する請求の範囲第２３項記載のワクチン。２５．抗原タンパク質がヘリコバクターピロリの球菌様型のかたちで提供される、請求の範囲第２３項または第２４項記載のワクチン。２６．抗原タンパク質が球菌用型とらせん型との間のヘリコバクターピロリの中間形態で提供され、抗原を運搬するものである、請求の範囲第２３項または第２４項記載のワクチン。２７．請求の範囲第１項または第２項記載の抗原タンパク質を幼児から得た生体試料と接触させる段階を含む、幼児におけるヘリコバクターピロリの球菌様型に対するＩｇＭ抗体を検出する方法。２８．得られた球菌様型が生存可能であり、ヘリコバクターピロリの球菌様型への転換が生ずるようにらせん型を含む培養基に二酸化炭素を定期的に添加する段階を含む、ヘリコバクターピロリの球菌様型を培養する方法。２９．二酸化炭素が３ヶ月までの期間に１日２回供給される、請求の範囲第２８項記載の方法。