【発明の詳細な説明】
細胞培養生成物
本発明は、適合性キャリアー上での哺乳動物の固定依存性細胞の培養に関する
。さらに詳しくは、本発明は、熱傷、皮膚移植供与部位および静脈性潰瘍や臥位
潰瘍のような潰瘍といった創傷を治療するに適切な創傷用ドレッシングの形成な
らびにそのようなドレッシングを製造するために使用されるシステムに関する。
懸濁した液体培養中で増殖させることはできないが、キャリアーの表面上で増
殖させるようにすることができる哺乳動物の細胞は固定依存性と言われている。
ケラチノサイトのような上皮細胞は固定依存性である。非阻害性で非細胞毒性
なキャリアーの存在下培養されたそのような細胞は、重層化したコロニー中で増
殖し、結局は集密性(confluent)の層を生産する。この型の細胞培養は、皮膚成
長を調査するのに使用されたり植皮として使用されてきた。皮膚細胞を成長させ
る生体外技術やこれの全層性創傷の治療への使用について記載している、様々な
技術論文が発行されている。例えば、Ｅ．ベル（Ｅ．Ｂｅｌｌ）ら（Ｊ Ｉｎｖ
ｅｓｔ Ｄｅｒｍ ８１；２ｓ−１０ｓ １９８３）；Ｅ．ベルら（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２１１；１０５２−１０５４ １９８１）；Ｄ．アセリネウ（Ｄ．Ａｓｓ
ｅｌｉｎｅａｕ）およびＭ．プルニラス（Ｍ．Ｐｒｕｎｅｉｒａｓ）（Ｂｒ Ｊ
Ｄｅｒｍ １９８４ III，
Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２７，２１９−２２２）；およびＪ．Ｆ．バーク（Ｂｕ
ｒｋｅ）ら（Ａｎｎ Ｓｕｒｇ ９４；４１３−４２８ １９８１）。
特有のキャリアーに固定する細胞の能力は、キャリアーの性質、温度といった
培養条件および培地の成分によって左右される。培養は、成長培養液に対し実質
的に不活性かつ細胞に対し非細胞毒性である材料から作られている硬質プラスチ
ックのフラスコ中で一般に行なわれる。ポリスチレンは培養フラスコに一般的に
使用されている材料である。
植皮として使用される上皮細胞の培養のために硬質プラスチックのフラスコを
使用する際の問題の一つには、細胞のシートが収集される前にそれらが一般に集
密(confluence)に達しなければならないことがある。集密に達するのに時間がか
かることがある。さらに、細胞の層が機械的に非常に強くはなく、支持されてい
ない細胞が酵素ディスパーゼ(dispase)を使用して移動されたり支持されずに取
り扱われた時に容易に傷めやすい。
国際特許出願第ＷＯ８９／０３２２８号には、ヒト上皮細胞を付着して有して
いるコラーゲンで被覆された、合成外科的ドレッシングが記載されている。その
複合物を製造する方法には、合成外科的ドレッシングをコラーゲンの溶液中でイ
ンキュベートすることおよび水を蒸発させ合成ドレッシングの表面にコラーゲン
の被覆をすることが含まれている。蒸発工程は細菌の汚染を避けるため無菌状態
で行なわれるのが好ましい。
細胞のシートは、表面から移動された後、取り扱いを容易に
し創傷表面へ移すために支持されることが知られている。しかしこの技術は、硬
質な表面の培養に伴う問題や細胞の移動に伴う危険を克服していない。
本発明の目的は、親水性で細胞生育に対し非阻害性で非細胞毒性なポリマーか
らなる、容易に操作しやすく適合性キャリアー上で細胞を成長させることにより
上述の問題を克服することである。本発明のポリマーは、細胞が集密に達する前
に細胞層を治療部位に運ぶことを可能にしている。
本発明によれば、創傷用ドレッシングは、キャリアーが、少なくとも１６ｗ／
ｗ％の吸水性を有し非細胞毒性で細胞生育に非阻害性である合成ポリマー層から
なる、培養哺乳動物細胞の層が固定される対創傷面を有する適合性キャリアーか
らなる。
本発明は、また、キャリアーが培地の表深部位置に保持され、哺乳動物細胞を
含有する水性培地をキャリアーの対創傷面と接触して保持する手段とで、キャリ
アーが細胞生育に非阻害性で非細胞毒性でありかつ少なくとも１６ｗ／ｗ％の吸
水性を有する合成ポリマーからなり、対創傷面に培養哺乳動物細胞の層が固定さ
れる適合性キャリアーとからなる創傷用ドレッシングを製造するシステムを提供
するものである。
さらに本発明は、キャリアーが、細胞生育に非阻害性で非細胞毒性で少なくと
も１６ｗ／ｗ％の吸水性を有する合成ポリマー層からなる、培養哺乳動物細胞の
層が固定される対創傷面を有する適合性キャリアーからなる創傷用ドレッシング
を、治療すべき領域に貼付することからなる創傷治療の方法を提供す
る。
本発明の更なる具体例には、細胞生育に非阻害性で非細胞毒性で少なくとも１
６ｗ／ｗ％の吸水性を有している合成ポリマーからなり創傷表面に面している適
合性キャリアーと、栄養溶液または成長する哺乳動物の細胞からなるコンテナー
と、キャリアーおよび栄養溶液を収容する容器とからなるキットが提供される。
キットはそのうえ哺乳動物の細胞のサンプルを含んでもよい。
本発明で利用する哺乳動物の細胞は固定依存性であり、すなわち増殖できる前
にそれらの細胞が結合できる表面を必要とする。
用語「適合性」により、ドレッシングが貼付される体の部分の輪郭における変
化にドレッシングが従うことを意味している。
合成ポリマー層は、合成ポリマーフィルムが好ましい。
一つの形としては、キャリアーは単一のポリマー層からなる。別の形としては
、キャリアーは、二層の合成ポリマー層の積層品からなり、その少なくとも二層
の少なくとも一層のポリマーは、細胞生育に非阻害性で非細胞毒性で少なくとも
１６ｗ／ｗ％の吸水性を有している。親水性ポリマーが膨張するかまたはさもな
ければ培地に暴露された後に壊れやすくなったり取り扱いが困難になる場合、積
層品を使用するのは有益である。
創傷のドレッシングが１６ｗ／ｗ％未満の吸水性を有しているポリマー層から
なる場合には、細胞層はこのポリマー層に固定されてもよい。
代わりに、細胞層は少なくとも１６ｗ／ｗ％の吸水性を有しているポリマー層
に固定されてもよい。
キャリアーが、細胞の固定を可能にするような望ましい表面の特性を持つため
に、表面を処理してもよい。表面処理の適切な形態は、コロナ放電処理がある。
コロナ放電処理は、材料の表面エネルギーを増大させ、細胞固定のための改良し
た状態を提供しうる。コロナ放電処理の効果は、処理した材料上の水の接触角を
測定することにより判断できる。接触角を測定する方法は、以後に述べる。適切
には、接触角は少なくとも１０％だけ、望ましくは少なくとも１５％だけ、好ま
しくは少なくとも２０％だけ減少さすべきである。キャリアーに適用できる他の
適切な処理には、ゴロー放電またはプラズマ処理、化学的エッチングおよび火炎
処理がある。
それ故、本発明の一つの具体例としては、創傷用ドレッシングは、少なくとも
１６ｗ／ｗ％の吸水性を有しているポリマー層と疎水性ポリマー層の積層からな
り、そのポリマーは細胞生育に非阻害性で非細胞毒性である適合性キャリアーか
らなっている。
疎水性ポリマーとは、ポリマーが１６ｗ／ｗ％未満の吸水性を有していること
を意味する。
ポリマー層のパーセンテージ吸水性は、以下の方法で評価される。ポリマー層
のサンプルは乾燥状態でその重量を測定する。その後、サンプルは過剰の蒸留水
中に浸され、２４時間の間２０℃で放置される。水和したサンプルはその後除き
、過剰の水
をサンプルの表面から除き、サンプルは再び重量を測定する。得られた重量にお
ける増加パーセンテージがパーセンテージ吸水性ｗ／ｗ％である。以下の式はパ
ーセンテージ吸水性（ｗ／ｗ％）を計算するのに使用される。
ｗ／ｗ％吸水性＝（サンプルの集まり＋水）−サンプルの集まり）×１００
サンプルの集まり
キャリアーのパーセンテージ吸水性ｗ／ｗ％は、上述の方法でポリマー層のサ
ンプルよりむしろキャリアーのサンプルをとることにより評価される。
キャリアーは透明性で表面の細胞を顕微鏡で検査させうるものか好ましい。し
かし、細胞は細胞培養の間見える必要はなく、それ故非透明または不透明なキャ
リアーも本発明のドレッシングに使用できる。
親水性ポリマーはヒドロゲルまたはヒドロコロイドでもよい。ヒドロゲルは、
透明であるため好ましい。
キャリアーは、細胞生育に阻害性であるべきではない。そのような阻害の程度
は、以下に述べるように試験キャリアーなしに成長させた細胞に対し測定して、
パーセンテージ細胞成長減少として表される。適切には、キャリアーは細胞成長
において５０％より多く減少すべきではない。より適切には、キャリアーは細胞
成長において４０％より多く減少すべきではない。望ましくは、キャリアーは細
胞成長において３０％より多く減
少すべきではなく、好ましくはキャリアーは細胞成長において２０％より多く減
少すべきではない。キャリアーは、非細胞毒性であるべきである。細胞毒性は、
以下に述べるような方法で非細胞毒性な対照材料に対して測定される。適切には
、キャリアーの細胞毒性は３０％を超えない。より適切には、キャリアーの細胞
毒性は２０％を超えない。好ましくは、キャリアーの細胞毒性は１５％を超えな
い。
キャリアーは、少なくとも二枚のフィルムまたは少なくとも二枚のシートから
なる積層品でも、一枚のフィルムおよび一枚のシートからなる積層品でもよい。
適切な合成ポリマーには、親水性のポリウレタン、例えばＨＹＴＲＥＬ（商標
）のようなポリエーテルポリエステル（熱可塑性エーテルエステルエラストマー
またはコポリエステルコポリマーとしても知られている）、例えはＰＥＢＡＸ（
商標）のようなポリエーテルポリアミド、ポリアクリルアミドおよびポリエチレ
ンオキシドが含まれる。それ故、適切な積層品は、エチレン酢酸ビニルのような
、固定依存性の哺乳動物細胞が付着できる材料で被覆されたポリウレタンフィル
ムからなってもよい。
キャリアーは、ヒドロゲル、ヒドロコロイドまたは他の適切なポリマーからな
っていてもよい。適切なヒドロゲルの例としては、ポリヒドロキシエチルメタク
リル酸（ポリＨＥＭＡ）、架橋したポリビニルアクリル酸（ＰＶＡ）、トリアリ
ルスクロースで架橋されたポリアクリル酸（カルボポール）およびポ
リビニルピロリドンが挙げられる。適切なヒドロコロイド材料の例としては、カ
ルボキシメチルセルロースナトリウムのようなカルボキシメチルセルロースが挙
げられる。カルボキシウレチルセルロースは、架橋されていても架橋されていな
くてもよい。ヒドロコロイドは、さらにヒドロコロイドを共に保持するポリイソ
ブチレンを含んでいてもよい。ヒドロゲルは、フィルムまたはシートの形でもよ
い。シートは、自立性でもよい。代わりにシートは適切な支持層、例えばポリマ
ーフィルムまたはポリマーネットで支持されてもよい。シートが支持層により支
持されている場合には、シートおよび支持層がキャリアーを構成する。
キャリアーが疎水性ポリマー層からなる場合、特に高度に滲出性の創傷におい
て、貼付する場所から滲出物を取り扱うことができるように開口していることが
望ましい。それ故、連続ポリマー層は、細胞層が望ましい程度の集密に達した後
に、穿孔されるように適合できる。そのようなフィルムの例としては、例えはＥ
Ｐ−０１４１５９２号、ＧＢ−１０５５９６３号およびＧＢ−９１４４８９号に
記載の二軸延伸フィルムが挙げられる。
滲出物が開口を経て容易に排出でき、ドレッシングの下には蓄積しないことか
ら、上述のようにキャリアーを開口させることは、例えば高度に滲出性の創傷で
の滲出物の蓄積がないことを確実にする。
キャリアーを穿孔するのは、熱ピン穿孔またはスリットする
ことなどのいずれかの適切な方法を使用して、細胞層を固定する前または後に行
なわれてもよい。細胞成長の後の穿孔は、細胞の破裂や損失を最小にして行なわ
れるべきである。穿孔は創傷の滲出物の排出中の適当な開放領域を与えるように
すべきである。開放領域の最小限度は、フィルムまたは積層品の透湿性に左右さ
れる。
必要な柔軟性と適合性を有するようにするためにキャリアーが二層のポリマー
フィルムまたはネットの積層品の場合、０．０７５ｍｍを超えない厚さが適当で
ある。より適当には、０．０５ｍｍを超えない厚さであり、望ましくは０．０４
ｍｍを超えない厚さであり、より望ましくは０．００５から０．０３ｍｍの厚さ
であり、好ましくは０．０１から０．０２５ｍｍの厚さであり、例えは０．０１
５ｍｍまたは０．０２０ｍｍである。キャリアーがシートおよびポリマーフィル
ムまたはネットからなる場合、０．０７５ｍｍから約５ｍｍまでの範囲の厚さで
もよいが、そのポリマーフィルムまたはネットは上述の限定された寸法を有して
いる。
網目状にすることは、慣習的に植皮の移植の前に行なわれ、移植の表面積を増
加させる。同様に、本発明の創傷用ドレッシングがポリマーフィルムからなる場
合、従来の網目−移植装置によって輸送することができる。
キャリアーとして利用できる適切なフイルムは、平らかまたは輪郭を描かれた
ものでもよい。輪郭は、例えば型押で製造される。適切には、輪郭付フィルムは
、開口を有していてもよい。
そのようなフィルムは、ＷＯ９０／００３９８号に記載されている。
キャリアーは水蒸気、酸素および二酸化炭素の透過性なものが適切である。創
傷の場所にあるドレッシングは創傷が治る間、細胞が生きていられるように湿っ
た状態を提供する。キャリアーは、好ましくは液体の水に不浸透性であるが、少
なくとも３００ｇｍ-2２４時間-1の垂直(upright)透湿度（ＭＶＴＲ）を有すべ
きである。キャリアーは、２０００ｇｍ-2２４時間-1未満の垂直透湿度（ＭＶＴ
Ｒ）を有するのが適切である。キャリ アーは、少なくとも２５００ｇｍ-2２４
時間-1の逆(inverted)透湿度（ＭＶＴＲ）を有するべきである。逆透湿度（ＭＶ
ＴＲ）は、２５０００ｇｍ-2２４時間-1を超えないのが適当である。支持体の垂
直および逆ＭＶＴＲを決定する方法は、以下の通りである：
透湿度（ＭＶＴＲ）はペイン・カップ法により測定される。この方法は、フラ
ンジ付き蓋を有する１．５ｃｍの深さのカップを使用する。フランジの内径は水
蒸気が通過する試験材料の１０ｃｍ2の面積を提供するものである。この方法で
は、１０ｍｌの蒸留水をカップに加え、フランジを完全に覆うように充分大きい
試験材料のサンプルをカップの上部に固定する。試験材料が接着性の表面を有し
ている場合、その接着性表面がカップの中に面するように固定する。完全な組み
立てられた品は、次いで重量を測定され、温度と相対湿度がそれぞれ３７℃およ
び１０％に維持されている送風機付電気オーブン中に置く。
オーブンの床に３−８メッシュの無水塩化カルシウムを１ｋｇ置くことにより、
オーブン中の相対湿度は１０％に保たれている。適切な時間、例えば１７時間の
後、カップはオーブンから移され、２０分間室温に達するまで放置する。再び重
量を測定した後、蒸気透過による水の損失量を計算する。透湿性（ＭＶＰ）は、
ｇｍ-2２４時間-1３７℃、１００％から１０％の相対湿度の違いの単位で表現さ
れる。試験材料が水蒸気に接している時、これはＭＶＰである。ＭＶＴＲを計算
するために、読み取ったものを試験材料の標準の厚さ、すなわち１ミルの厚さに
訂正する。材料が水に接触している時のＭＶＰは、オーブン中に位置を逆にした
パインコップを単に置くことにより液体の水（水蒸気ではなく）が試験材料に接
触でき、そのことにより同じ器具を使用し、試験材料の厚さに必要な調節を行い
測定することができる。
本発明の改良としては、キャリアーは小さいメッシュサイズの目のつんだ織物
を形成するために、編物、織物または不織物の合成ポリマーから作られていても
よい。細胞培養の後、織物は細胞の損失なしにより大きなメッシュサイズを有す
る織物を形成するために伸はされてもよい。
自己培養上皮細胞を用いることか、宿主（患者）に貼付した際に免疫学的拒絶
問題が少ないか全くないため、好ましい。しかし、非自己細胞も例えは同種移植
または異種移植をするのに使用しうる可能性がある。細胞はケラチノサイトが好
ましい。我々は、創傷用ドレッシングを創傷部位に移動する前に、細胞
層が集密に達しないようにし、それにより適当な創傷用ドレッシングが２、３時
間内で生じるようにさせることが好ましいことを見出した。細胞層が亜集密性(s
ub-confluent)なため、創傷用ドレッシングは一層の細胞からなることが考えら
れる。
キャリアーは、適切な公知の滅菌方法の何れかを使用して滅菌してもよい。滅
菌の適切な形態としては、エチレンオキシド（ガス抜きに必要な時間をみておく
）、ガンマ照射または蒸気滅菌が含まれる。滅菌の後低分子量の汚染物質をすべ
て除くため、例えば重合していないモノマーは細胞毒性なので、キャリアーが合
成ポリマーの場合、重合していないモノマーを除くため、キャリアーは洗浄され
る。洗浄工程は連続ステップにおいて脱イオン化した滅菌水を使用して、幾つか
の連続洗浄を含んでいてもよい。
代わりに、キャリアーは無菌的に製造されてもよい。
本発明のシステムによると、細胞がその上で成長しているキャリアーは、その
システムの他の部分すなわち細胞を含有する水性培地をキャリアーの対創傷面と
接触して保持させる手段から、容易に除去できることが好ましい。例えば、キャ
リアーが培地を含んでいる容器の壁を形成している場合、キャリアーは容器の他
の部分から容易に除かれるべきである。キャリアーは、細胞培養が成長した容器
の全部分の一部を形成してもよい。容器または培養器の他の部分は、従来組織培
養器の製造に使用されている適当な材料から形成される。耐衝撃性ポリスチレン
が好ましい。
代わりの具体例では、基質を移動させることかできるように適合させた適当な
デザインのフラスコ中に、キャリアーを置いてもよい。キャリアーが培養フラス
コの一体部分である場合、キャリアーはフラスコの他の部分に除去できるように
例えばヒートシールまたは接着剤により封止されてもよい。キャリアーは平らな
表面を形成するのが好ましく、フラスコの基底を形成するのが適切である。
キャリアーがフラスコ中に含まれる場合、フラスコはそれに固定されている細
胞を破壊することなく、キャリアーを容易に除くことができるのに十分な直径を
有している閉鎖可能な開口部を備えていてもよい。
開口したキャリアーが培養フラスコの一体部分を形成するのに使用されている
場合、フラスコの水を密に保ち殺菌性を維持するためにそれらは連続フィルムな
どにより覆われてもよい。キャリアーがフラスコ中に置かれている場合、例えば
予備殺菌されたステンレスの輪により、または代わりとして組織培地の存在下に
粘性を維持することができる非細胞毒性な接着剤層でキャリアーの片側を被覆す
ることにより、キャリアーは保持されてもよい。
栄養素、成長因子または抗生物質もしくは抗炎症剤のような薬剤は、細胞培養
が行なわれる水性培養液中に含まれてもよい。そのような添加成分の性質および
重量および／または容量は従来よく知られている。
本発明の創傷用ドレッシングは、様々な創傷に使用してもよ
い。本発明のドレッシングは特に、表皮およびおそらく真皮の一部のみが失われ
た場所である、部分的に厚い創傷を治療するのに適している。そのような創傷は
例えば植皮移植供与部位、第１度またはおそらく第２度のやけど、浅い脚潰瘍ま
たは床づれが含まれる。ドレッシングはまた、静脈性の潰瘍等の全部深部(full
thickness)創傷を治療するのに適している。連続したポリマーフィルムキャリア
ーは、望ましい速度で創傷が治るような、水蒸気、酸素および二酸化炭素に対し
充分に透過性であると同時に、バクテリアに対しバリアーとして機能することが
適切である。基質が穿孔された時、水蒸気、酸素および二酸化炭素の透過性を望
ましい程度に保つために第二のドレッシングを適用することができる。適当な材
料は、同じ状態を作るために創傷の上に置くことができるＯＰＳＩＴＥ（商標）
のようなポリウレタンフィルムのドレッシングである。ドレッシングは、特定の
創傷の性質および患者の状態により、創傷が３０−９０％再上皮化される（治る
）のに適切な期間の間、創傷の上に置かれているのが適当である。この時、ドレ
ッシングは除去して、従来の創傷用ドレッシングと置き換えることができる。
１９７５年、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）らは、皮膚培養を拡大するために、供給
層システムとしてマウス由来の転換された細胞ライン３Ｔ３細胞の使用を提案し
た。３Ｔ３細胞は、非常に低密度で接種されたケラチノサイトの成長のために必
須な因子を製造する。さらに３Ｔ３細胞は好ましくない線維芽細胞の成長を阻害
する。３Ｔ３細胞を含む皮膚細胞の製造法は、細胞を
殺すためでなく細胞分裂を抑制するために、まずガンマ線照射（典型的には約６
０００ラド）でなければならない。そのように照射された細胞は幾日か生き続け
、その間宿主のケラチノサイト細胞のために材料を合成し供給するであろう。結
局、３Ｔ３細胞は皮膚細胞層から吐出される。しかし、必然的にいくらかのマウ
ス細胞は残り、それ故宿主ケラチノサイトに移植される。
本発明のドレッシングでは、３Ｔ３のような供給細胞はキャリアーの逆側と接
触している培養液に接種されてもよい。これらの細胞は、その後宿主細胞のため
に材料を合成するであろう。供給細胞が宿主細胞と接触しないので、それらを照
射する必要はない。キャリアーが培養フラスコから除かれた時、逆の側は洗浄さ
れ、浮動的な供給細胞を取り除いてもよい。
供給細胞層が開口されたキャリアーとともに用いられる場合、開口は培地の交
換が自由にできうるのに充分な大きさで、細胞が通過することはできない大きさ
を有しているべきである。開口の大きさは、一番大きな開口で半径５μを超えな
いものが適切である。適切には開口の大きさは０．５から２μである。
本発明のドレッシングは、それらが宿主に適用される場所で、適切に資格を受
けた人員により製造されてもよい。それ故、ドレッシングは病院細胞培養製造所
で細胞培養者により先に記載の方法により製造されるのが適当である。代わりと
して、ドレッシングはそれが適用される病院などの場所から離れた場所で製造さ
れてもよい。後者の場合では、ドレッシングは適当な
状態のもと、例えば正確に管理された温度のもと輸送されてもよい。それ故、ド
レッシングは低温保存すなわち−１９０℃で維持され、その後使用直前に室温に
戻されてもよい。代わりに、ドレッシングは使用可の状態で輸送されてもよい。
したがって、ドレッシングは望ましい温度で適当な細菌培養器中で輸送されても
よい。
接触角は、カーン（Ｃａｈｎ）ＤＣＡ−３２２動的接触角分析機を使用し、ウ
イルヘルミー・プレート（Ｗｉｌｈｅｍｙ Ｐｌａｔｅ）動的接触角測定システ
ムにより測定する。前進接触角および後退接触角の両方を測定する。使用された
試験液体は水でもよい（ＨＰＬＣ等級）。１５０ミクロン／秒の浸漬／抜き取り
速度を使用してもよい。フィルムのサンプルはフィルムを約２４ｍｍ×３０ｍｍ
のカバーガラスの上に貼り付けるか溶液からスライドを浸漬被覆してもよい。試
験は２３℃／５０％ＲＨで行なわれてもよい。
細胞成長減少を測定する適切な方法はＷＯ９１／１３６３８号に記載してある
。
基質の細胞毒性のパーセンテージを測定する方法は、ＷＯ９１／１３６３８号
に記載してある。
本発明のドレッシングシステムの具体例は以下の図を参考にして説明する。図
１に関しては、培養フラスコ１の基底の壁は一枚の開口されたフィルム２および
一枚の連続したフィルム３の積層品からなる。積層品の端はフラスコ３の他の壁
部分５に除去可能に結合している。培地４および供与細胞は、頚６を経
てフラスコ３の中に挿入されて、栓７によりその中に封止される。
システムは適当な細胞培養状態下でインキュベートされた後、積層品２および
３は、はがすことによりフラスコ１から移動することができる。
図２は、第一のフィルム２を第二のフィルム３に注型することにより形成され
た構造２および３を図示している。フィルム３は多数の凸部８を有している。そ
の結果のフィルム２は、多数の薄い９および厚い１０領域を有している。フィル
ム３からフィルム２を分離する際に、薄い領域９が破れ図３に示すように開口１
２が形成する。それにより形成した開口した形状は、その後ポリマー層に積層さ
れ、本発明のドレッシング中のキャリアーとして使用するのに適当な積層品を形
成する。
図３に関しては、培養フラスコ１は親水性ポリマー層１４および穿孔した疎水
性フィルム２からなるキャリアーにより、区画２１および３１に分割される。
培地４はフラスコ中に挿入され、区画２１および３１の両方を占める。３Ｔ３
のような供給細胞は通路口１１を経て区画３１に接種され、一方皮膚細胞は頚６
を経て区画２１に接種される。
栄養素、成長因子または抗生物質または抗炎症剤のような薬剤は細胞培養が成
長する水性培地に含まれてもよい。そのような添加成分の重量の性質および／ま
たは容量は従来よく知られている。
皮膚細胞の層が必要な程度集密に達した後、キャリアーはフラスコの壁部分５
から分離され、通路口１３から移動される。
細胞層は亜集密性なのが好ましい。代わりに、集密性でもよい。
本発明は、以下の表中のポリマーのいずれかを使用することにより説明される
。実施例
ヒト上皮細胞（ケラチノサイト）は１６％より大なる吸水性を有するポリマー
のフィルムおよび積層品上で生育させた。使
用した材料および方法は以下に詳しく述べる。
使用した細胞はＳｃａＢＥＲ細胞ラインから由来し、米国メリーランドのＡｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎにより提供さ
れた。
細胞は光学顕微鏡で検出しやすくするために、染料マーカーでラベルを貼り付
けた。これはあるサンプルの非均質な表面に対し細胞を検出するのが困難なため
、必要であった。米国セントルイスのシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）により供給されているシグマイムノケミカルズ（Ｓ
ｉｇｍａ Ｉｍｍｕｎｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）ＰＫＨ２６赤色蛍光性の一般的
な細胞リンカーキットを使用してそのキットに与えられている指示にしたがい、
細胞はラベルを貼り付けられた。サンプル上の培養のための新鮮な培養液中に再
懸濁される前に、細胞はその後血清が含まれていない培地で洗浄した。
対照実験は蛍光性の染料マーカーがポリマー基質により取り込まれているかど
うか決定するために行なった。その結果は、染料がポリマーに吸収されておらず
細胞に特定的であり、それにより実験サンプルに観察される蛍光はポリマー表面
に接着した細胞に由来することが示された。
使用した培地はアールズ（Ｅａｒｌｅ’ｓ）最低必須培地（ＭＥＭ）＋１０％
胎児の子牛血清であり、以下のように作製した：
３４８ｍｌ アールズ ＭＥＭ（Ｌ−グルタミン抜き）、ギブ
コ（Ｇｉｂｃｏ） ＢＲＬ提供。
４０ｍｌ 熱−不活性化された胎児の子牛血清
４ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシン（５０００ＩＵ／ｍｌ−５０００
μｇ／ｍｌ）、ギブコ ＢＲＬ提供。
４ｍｌ 非必須アミノ酸類
４ｍｌ Ｌ−グルタミン（１００ｘ）２００ｍＭ、ギブコＢＲＬ提供。
細胞は培養液３ｍｌにつき１０6細胞の密度で接種した。
先の濃度で細胞を含んでいる培地は、試験されるサンプルフィルムに接触して
ペトリ皿中に置かれ、３７℃で最初２４時間、ついでさらに２４時間から最大３
日間の間、インキュベートした。ポリマー基質は、その後ペトリ皿から移動され
、注意深く洗浄され、そして紫外線光の下でラベルをつけられた赤色蛍光性細胞
を検出するようにロジウムフィルターで調節されたニコン逆転顕微鏡を使用して
、接着した細胞の存在を検出された。
使用したポリマー層はすべて薄いフィルムであり、フィルムが平らになりその
後の取り扱いが容易になるように金属の輪を使用し、ペトリ皿の底に置かれた。
キャリアーに使用されたポリマー層は、創傷用ドレッシング構成に使用され医
療目的で皮膚に貼付するに適していると知られている親水性フィルムのサンプル
であった。実施例１
押出成形され、約２０μｍの厚さかつ上述の方法で測定した時６４％の吸水性
を有するフィルムを形成した熱可塑性ポリエーテル−ポリウレタンが、キャリア
ー層として使用された。
フィルムはペトリ皿の基底に置かれ、細胞を含んでいる培地をフィルムの上部
表面上に挿入した。２４時間のインキュベーションの後、キャリアーは除かれ、
洗浄された。ｕ．ｖ．ライトの下での観察により細胞がフィルム表面に接着して
いることが示された。フィルムは培地の吸収により膨れ上がった。実施例２
約２０μｍの厚さの熱可塑性ポリエーテル−ポリウレタンのフィルムは、５０
μｍのエチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）のフィルムに積層されキャリアー層を形成
した。ＥＶＡ材料は約０．３％の吸水性を有していた。培地および細胞は積層品
のポリエーテル−ポリウレタン側の上に置いた。いくつかの細胞は２４時間後に
接着しており、２、３日後にはさらに多くの数の細胞が接着していることが確認
された。
サンプルは広く平らを保っているように見え、おそらく培地中で親水性フィル
ムが膨らんだことによる隆起がフィルムの表面に見られた。実施例３
実施例２で記載した積層品はキャリアー層として使用され、細胞は積層品のＥ
ＶＡ側に成長した。細胞は２４時間後にはフィルムに接着し生育していることが
観察された。実施例４
使用したキャリアーは，スミス＆ネフューヘルスケア（Ｓｍｉｔｈ＆Ｎｅｐｈ
ｅｗ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）Ｌｔｄにより商標「ＯＰＳＩＴＥ ＩＶ３０００
」の名で販売されている、市販のドレッシングであった。そのキャリアーは、親
水性ポリウレタンフィルムの裏打ち層と、その対創傷面に接着したアクリリック
圧力感受性接着剤の層からなる。ドレッシングの吸水性は測定すると約６８％で
あった。
細胞は非接着性のドレッシングのポリウレタン側にコロニーを作っていること
が観察された。実施例５
キャリアーは、細胞運搬層として使用されたドレッシングの接着性側を有する
実施例４のドレッシングであった。細胞は接着剤に接着し増殖したことが観察さ
れた。実施例６
使用したキャリアーは、実施例１で使用した二層の２０マイクロメーターの熱
可塑性ポリエーテル−ポリウレタンフィルムの積層品であった。予想されたよう
に、細胞は培地に接触しているフィルム範囲上によく分散して、フィルム表面に
接着していることが観察された。サンプルは培養液と接触した後泡だった外観を
有し、しかしこれが表面への細胞の接着にはなはだしく影響しているようではな
かった。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Cell culture products
The present invention relates to the culture of mammalian fixation-dependent cells on a compatible carrier.
. More particularly, the invention relates to burns, skin graft donor sites and venous ulcers and supine positions.
To form a wound dressing suitable for treating wounds such as ulcers
And systems used to produce such dressings.
It cannot grow in suspended liquid culture, but grows on the surface of the carrier.
Mammalian cells that can be made to grow are said to be fixation-dependent.
Epithelial cells such as keratinocytes are fixation-dependent. Non-inhibitory and non-cytotoxic
Such cells cultured in the presence of a suitable carrier grow in the stratified colonies.
Breed and eventually produce a confluent layer. This type of cell culture is
It has been used to survey heads and as a skin graft. Grow skin cells
Various in vitro techniques and their use in treating full-thickness wounds are described.
Technical papers have been published. For example, E. E. Bell et al. (J Inv.
est Derm 81; 2s-10s 1983); Bell et al. (Scien
ce 211; 1052-1054 1981); Acerineu (D. Ass
elineau) and M.E. M. Pruneiras (Br J
Derm 1984 III,
Supplement 27, 219-222); F. Burke (Bu
rke) et al. (Ann Surg 94; 413-428 1981).
The ability of cells to fix to a particular carrier depends on the nature of the carrier,
It depends on the culture conditions and the components of the medium. The culture is substantive to the growth
Rigid plasties made from materials that are chemically inert and non-cytotoxic to cells
This is generally done in a bottle flask. Polystyrene is commonly used in culture flasks
The material used.
Hard plastic flasks for culturing epithelial cells used as skin grafts
One of the problems with use is that they are generally collected before the sheets of cells are collected.
Sometimes it is necessary to reach confluence. It takes time to reach congestion
It may be. In addition, the layer of cells is not mechanically very strong and supported
No cells are transferred or unsupported using the enzyme dispase
Easily damaged when handled.
International Patent Application No. WO 89/03228 discloses that human epithelial cells are attached and
Synthetic surgical dressings coated with collagen have been described. That
The method of making the composite involves synthesizing a surgical dressing in a solution of collagen.
Collagen on surface of synthetic dressing by incubating and evaporating water
Coating. Evaporation process is aseptic to avoid bacterial contamination
It is preferred to be carried out at
After the cell sheet is moved off the surface, it is easier to handle
It is known to be supported for transfer to wound surfaces. But this technology is hard
It does not overcome the problems associated with culturing quality surfaces and the dangers associated with cell migration.
It is an object of the present invention to provide a polymer which is hydrophilic, non-inhibiting against cell growth and non-cytotoxic.
By growing cells on a compatible carrier
Overcoming the above problems. The polymer of the present invention is used before cells reach confluence.
The cell layer to the treatment site.
According to the invention, the dressing for wounds comprises a carrier comprising at least 16 w /
from a synthetic polymer layer that is non-cytotoxic and non-inhibiting cell growth
A compatible carrier having a wound surface against which a layer of cultured mammalian cells is fixed
Become.
The present invention also relates to a method wherein the carrier is retained at a position at the surface of the medium,
Means for holding the aqueous medium containing the carrier in contact with the wound surface of the carrier.
Is non-inhibiting and non-cytotoxic to cell growth and has at least 16% w / w
A layer of cultured mammalian cells is immobilized on the wound surface, consisting of an aqueous synthetic polymer.
To provide a system for manufacturing dressings for wounds with compatible carriers
Is what you do.
Further, the present invention relates to a carrier, wherein the carrier is non-inhibiting, non-cytotoxic and at least
Of cultured mammalian cells consisting of a synthetic polymer layer having a water absorption of 16 w / w%.
Wound dressing comprising a compatible carrier having an anti-wound surface to which a layer is secured
A method of treating a wound, comprising: affixing the wound to an area to be treated.
You.
In a further embodiment of the present invention, at least one non-inhibiting, non-cytotoxic and non-cytotoxic cell growth
Suitable for facing the wound surface, comprising a synthetic polymer having a water absorption of 6% w / w.
Container consisting of a compatible carrier and a nutrient solution or growing mammalian cells
And a container comprising a carrier and a nutrient solution.
The kit may further comprise a sample of mammalian cells.
The mammalian cells utilized in the present invention are fixation-dependent, ie,
Need a surface to which those cells can bind.
The term "compatibility" refers to changes in the contour of the body part to which the dressing is applied.
Means that the dressing follows the change.
The synthetic polymer layer is preferably a synthetic polymer film.
In one form, the carrier consists of a single polymer layer. Another form is
The carrier comprises a laminate of two synthetic polymer layers, of which at least two
At least one polymer is non-inhibiting, non-cytotoxic and at least
It has a water absorption of 16 w / w%. Swelling or swelling of hydrophilic polymer
If they become fragile or difficult to handle after exposure to medium,
It is beneficial to use a layered product.
Wound dressing from a polymer layer having a water absorption of less than 16 w / w%
If so, the cell layer may be fixed to this polymer layer.
Alternatively, the cell layer is a polymer layer having at least 16% w / w water absorption
May be fixed.
Because the carrier has desirable surface properties that allow for cell fixation
Alternatively, the surface may be treated. A suitable form of surface treatment is corona discharge treatment.
Corona discharge treatment increases the surface energy of the material and improves it for cell fixation.
May be provided. The effect of corona discharge treatment is to reduce the contact angle of water on the treated material.
It can be determined by measuring. The method for measuring the contact angle will be described later. Appropriate
Preferably, the contact angle is at least 10%, preferably at least 15%.
Or at least 20%. Other applicable to carrier
Appropriate treatments include Goro discharge or plasma treatment, chemical etching and flame
There is processing.
Therefore, in one embodiment of the present invention, the wound dressing comprises at least
It consists of a laminate of a polymer layer having a water absorption of 16 w / w% and a hydrophobic polymer layer.
Is the polymer a compatible carrier that is non-inhibiting and non-cytotoxic to cell growth?
It has become.
Hydrophobic polymer means that the polymer has a water absorption of less than 16 w / w%
Means
The percentage water absorption of the polymer layer is evaluated by the following method. Polymer layer
Of the sample is measured in a dry state. The sample is then
And left at 20 ° C. for 24 hours. The hydrated sample is then removed
, Excess water
Is removed from the surface of the sample and the sample is weighed again. To the weight obtained
The percentage increase in w / w is the percentage water absorption w / w%. The following equation
-Used to calculate percentage water absorption (w / w%).
w / w% water absorption = (collection of samples + water) −collection of samples) × 100
Collection of samples
The percentage water absorption w / w% of the carrier is determined by the method described above for the polymer layer.
It is evaluated by taking a sample of the carrier rather than the sample.
The carrier is preferably transparent so that the cells on the surface can be examined microscopically. I
However, the cells do not need to be visible during cell culture and therefore are non-transparent or opaque
Rears can also be used in the dressing of the present invention.
The hydrophilic polymer may be a hydrogel or hydrocolloid. Hydrogels are
It is preferable because it is transparent.
The carrier should not be inhibiting cell growth. The extent of such inhibition
Is measured on cells grown without a test carrier as described below,
Expressed as a percentage decrease in cell growth. Suitably, the carrier is cell growth
Should not be reduced by more than 50%. More suitably, the carrier is a cell
Should not decrease more than 40% in growth. Preferably, the carrier is fine
More than 30% reduction in cell growth
Should not be reduced, preferably the carrier reduces more than 20% in cell growth.
Should not be less. The carrier should be non-cytotoxic. Cytotoxicity,
It is measured against a non-cytotoxic control material in the manner described below. Properly
The carrier cytotoxicity does not exceed 30%. More suitably, the carrier cell
Toxicity does not exceed 20%. Preferably, the carrier has a cytotoxicity of no more than 15%.
No.
The carrier is made up of at least two films or at least two sheets
Or a laminate composed of one film and one sheet.
Suitable synthetic polymers include hydrophilic polyurethanes, such as HYTREL ™
) -Like polyether polyester (thermoplastic ether ester elastomer)
Or also known as a copolyester copolymer), such as PEBAX (
Trademark), polyacrylamides and polyethylenes
Oxides. Therefore, suitable laminates are such as ethylene vinyl acetate
, Polyurethane fill coated with a material to which fixation-dependent mammalian cells can adhere
May consist of
The carrier may comprise a hydrogel, hydrocolloid or other suitable polymer.
It may be. Examples of suitable hydrogels include polyhydroxyethyl methacrylate
Lylic acid (poly HEMA), cross-linked polyvinyl acrylic acid (PVA), triary
Polyacrylic acid (carbopol) cross-linked with sucrose
And vinylvinylpyrrolidone. Examples of suitable hydrocolloid materials include
Carboxymethylcellulose such as sodium ruboxylmethylcellulose
I can do it. Carboxyuretyl cellulose is cross-linked but not cross-linked.
You may not. Hydrocolloids are also polyisomers that hold the hydrocolloid together.
It may contain butylene. The hydrogel can be in the form of a film or sheet.
No. The sheet may be self-supporting. Alternatively, the sheet may be a suitable support layer, for example a polymer
-It may be supported by a film or a polymer net. The sheet is supported by the support layer
If carried, the sheet and the support layer constitute the carrier.
When the carrier consists of a hydrophobic polymer layer, especially in highly exudative wounds
Be open so that exudates can be handled from where
desirable. Therefore, after the continuous polymer layer has reached the desired degree of confluence,
Can be adapted to be pierced. An example of such a film is E
Nos. P-0141592, GB-1055963 and GB-914489
The biaxially stretched film described above may be used.
Exudate can be easily drained through the opening and does not accumulate under the dressing
Opening the carrier as described above can be used, for example, in highly exudative wounds.
Ensure that no exudate accumulates.
Carrier piercing, hot pin piercing or slitting
Before or after fixing the cell layer using any suitable method such as
May be done. Perforations after cell growth should be performed with minimal cell rupture or loss.
Should be. Perforations should provide adequate open area during drainage of wound exudate
Should. The minimum open area depends on the moisture permeability of the film or laminate.
It is.
The carrier is a two-layer polymer to have the required flexibility and compatibility
For film or net laminates, a thickness not exceeding 0.075 mm is appropriate.
is there. More suitably, it has a thickness not exceeding 0.05 mm, preferably 0.04 mm.
mm, and more preferably 0.005 to 0.03 mm thick
And preferably has a thickness of 0.01 to 0.025 mm, for example, 0.01
5 mm or 0.020 mm. Carrier is sheet and polymer fill
If it is made up of a net or a net, it has a thickness ranging from 0.075mm to about 5mm
The polymer film or net may have the limited dimensions described above.
I have.
Reticulation is customarily done prior to skin graft implantation to increase the surface area of the graft.
Add. Similarly, when the wound dressing of the present invention comprises a polymer film.
If so, it can be transported by a conventional mesh-implant device.
Suitable film available as carrier, flat or contoured
It may be something. The contour is produced, for example, by stamping. Suitably, the contoured film is
, May have an opening.
Such films are described in WO 90/00398.
The carrier is suitably permeable to water vapor, oxygen and carbon dioxide. Wound
The dressing at the wound site is moist so that cells can survive while the wound heals.
To provide a state. The carrier is preferably impervious to liquid water, but less
At least 300gm-224 hours-1Should have an upright moisture vapor permeability (MVTR)
It is. Carrier is 2000gm-224 hours-1Vertical moisture permeability less than (MVT
R) is suitable. Carrier is at least 2500gm-224
time-1Should have an inverted moisture permeability (MVTR). Reverse moisture permeability (MV
TR) is 25000 gm-224 hours-1It is appropriate not to exceed. Support hanging
The method for determining the direct and inverse MVTR is as follows:
Moisture permeability (MVTR) is measured by the Payne cup method. This method is
Use a 1.5 cm deep cup with a flanged lid. The inner diameter of the flange is water
10cm of test material through which steam passesTwoIs provided. using this method
Add 10 ml of distilled water to the cup and large enough to completely cover the flange
A sample of the test material is fixed on top of the cup. Test material has an adhesive surface
If so, secure it so that its adhesive surface faces into the cup. Complete set
The erect product is then weighed, and the temperature and relative humidity are 37 ° C and 37 ° C, respectively.
And placed in an electric oven with a blower maintained at 10%.
By placing 1 kg of 3-8 mesh anhydrous calcium chloride on the floor of the oven,
The relative humidity in the oven is kept at 10%. An appropriate time, for example, 17 hours
Thereafter, the cup is removed from the oven and left to reach room temperature for 20 minutes. Again heavy
After measuring the amount, calculate the amount of water loss due to vapor permeation. Moisture permeability (MVP)
gm-224 hours-137 ° C, expressed in units of 100% to 10% relative humidity
It is. When the test material is in contact with water vapor, this is an MVP. Calculate MVTR
The reading to the standard thickness of the test material, ie 1 mil.
correct. MVP inverted position in oven when material is in contact with water
Liquid water (rather than water vapor) contacts the test material by simply placing the pine glass.
And thereby make the necessary adjustments to the thickness of the test material using the same instrument.
Can be measured.
According to an improvement of the invention, the carrier is a tightly woven fabric of small mesh size
To form a knitted, woven or non-woven synthetic polymer
Good. After cell culture, the fabric has a larger mesh size without cell loss
May be stretched to form a woven fabric.
Use of self-cultured epithelial cells or immunological rejection when applied to the host (patient)
Preferred because there are few or no problems. However, non-autologous cells are also allogeneic transplants
Or it could be used to do xenografts. Keratinocytes are preferred for cells
Good. Before moving the wound dressing to the wound site,
Ensure that the layers do not reach confluence, so that a suitable wound dressing
It has been found that it is preferable to make it occur within the interval. If the cell layer is subconfluent (s
ub-confluent), dressing for wounds may consist of more cells.
It is.
The carrier may be sterilized using any suitable known sterilization method. Destruction
The appropriate form of the bacteria is ethylene oxide (see the time required for degassing
), Gamma irradiation or steam sterilization. Remove any low molecular weight contaminants after sterilization.
For example, non-polymerized monomers are cytotoxic, so the carrier
In the case of synthetic polymers, the carrier is washed to remove unpolymerized monomers.
You. The cleaning process uses several steps of deionized sterile water in successive steps.
May be included.
Alternatively, the carrier may be manufactured aseptically.
According to the system of the present invention, the carrier on which the cells are growing
The other part of the system, the aqueous medium containing the cells, is combined with the carrier against the wound surface.
Preferably, it can be easily removed from the means for contacting and holding. For example,
If the rear forms the wall of the container containing the medium, the carrier is
Should be easily removed from the part. The carrier is a container in which the cell culture has grown
May be partially formed. Containers or other parts of the incubator should be
It is formed from any suitable material used in the manufacture of cultivators. High impact polystyrene
Is preferred.
In an alternative embodiment, a suitable substrate adapted to allow or
A carrier may be placed in the flask of the design. Carrier is culture frus
If it is an integral part of the flask, the carrier can be removed to other parts of the flask
For example, it may be sealed by a heat seal or an adhesive. Carrier is flat
Preferably, it forms a surface and suitably forms the base of the flask.
If the carrier is contained in a flask, the flask is
Large enough to easily remove the carrier without destroying the cells
It may have a closable opening.
Open carrier is used to form an integral part of the culture flask
If necessary, they should be continuous films to keep the water in the flask tight and maintain sterility.
It may be covered by any. If the carrier is placed in a flask, for example
By pre-sterilized stainless steel rings or alternatively in the presence of tissue culture media
Cover one side of the carrier with a non-cytotoxic adhesive layer that can maintain viscosity
By doing so, the carrier may be retained.
Nutrients, growth factors or drugs such as antibiotics or anti-inflammatory drugs are
May be included in the aqueous culture solution in which the reaction is performed. The nature of such additional ingredients and
Weight and / or volume are well known in the art.
The wound dressing of the present invention may be used for various wounds.
No. The dressing of the present invention is particularly so that only the epidermis and possibly part of the dermis are lost.
It is suitable for treating partially thick wounds where it is too thick. Such a wound
For example, at the site of skin graft transplantation, first-degree or possibly second-degree burns, shallow leg ulcers
Or floor consolidation. The dressing may also be used for full veins such as venous ulcers.
thickness) Suitable for treating wounds. Continuous polymer film carrier
Is sensitive to water vapor, oxygen and carbon dioxide so that the wound heals at the desired rate.
It is sufficiently permeable and at the same time acts as a barrier to bacteria
Is appropriate. When the substrate is pierced, water vapor, oxygen and carbon dioxide permeability is desired
A second dressing can be applied to keep it to a good degree. Suitable material
The material can be placed over the wound to create the same condition OPSITE ™
Dressing of a polyurethane film. Dressing is a certain
Depending on the nature of the wound and the condition of the patient, the wound can be re-epithelialized 30-90% (healed
Suitably, it is placed on the wound for a period of time appropriate for). At this time,
The dressing can be removed and replaced with a conventional wound dressing.
In 1975, Green et al., Supplied to expand skin culture
Proposed the use of a mouse-derived transformed cell line 3T3 cells as a layer system
Was. 3T3 cells are necessary for the growth of keratinocytes seeded at very low density.
Produces important factors. In addition, 3T3 cells inhibit unwanted fibroblast growth
I do. A method for producing skin cells including 3T3 cells comprises the steps of:
In order to suppress cell division but not kill, first gamma irradiation (typically about 6
000 rad). The cells so irradiated can survive for days
In the meantime, it will synthesize and supply material for the host keratinocyte cells. Conclusion
Locally, 3T3 cells are ejected from the skin cell layer. But inevitably some mau
The cells remain and are therefore transplanted into the host keratinocytes.
In the dressing of the present invention, a feeder cell such as 3T3 contacts the opposite side of the carrier.
The culture in contact may be inoculated. These cells are then used for host cells
The material will be synthesized. Since the feed cells do not come into contact with the host cells,
No need to fire. When the carrier is removed from the culture flask, the other side is washed
The floating feeder cells may be removed.
If the feeder cell layer is used with an open carrier, the opening is
Large enough to allow cell exchange, but not large enough for cells to pass through
Should have. The size of the opening should not exceed a radius of 5μ at the largest opening.
Are appropriate. Suitably the size of the aperture is between 0.5 and 2μ.
The dressings of the present invention are properly qualified where they are applied to the host.
It may be manufactured by a single digit person. Therefore, the dressing is a hospital cell culture factory
It is suitable to be produced by a cell culturer according to the method described above. Instead
The dressing is manufactured at a location remote from the hospital or other location where it is applied.
May be. In the latter case, dressing is appropriate
It may be transported under conditions, for example under precisely controlled temperatures. Therefore, de
The dressing is stored at low temperature, i.
May be returned. Alternatively, the dressing may be shipped ready for use.
Therefore, the dressing can be transported in a suitable bacterial incubator at the desired temperature.
Good.
Contact angles were determined using a Cahn DCA-322 dynamic contact angle analyzer,
Wilhemy Plate Dynamic Contact Angle Measurement System
Measure with a timer. Measure both the advancing and receding contact angles. Used
The test liquid may be water (HPLC grade). 150 micron / second immersion / extraction
Speed may be used. Film sample is about 24mm x 30mm
May be stuck on a cover glass or dip-coated on a slide from a solution. Trial
The experiment may be performed at 23 ° C./50% RH.
Suitable methods for measuring cell growth reduction are described in WO 91/13638.
.
A method for determining the percentage of cytotoxicity of a substrate is described in WO 91/13638.
It is described in.
A specific example of the dressing system of the present invention will be described with reference to the following drawings. Figure
With respect to 1, the base wall of the culture flask 1 has a single open film 2 and
It consists of a laminate of one continuous film 3. The end of the laminate is on the other wall of flask 3
It is removably connected to the part 5. Medium 4 and donor cells were passed through neck 6
Into the flask 3 and sealed therein by the stopper 7.
After the system has been incubated under the appropriate cell culture conditions, the laminate 2 and
3 can be moved from the flask 1 by peeling.
FIG. 2 is formed by casting a first film 2 into a second film 3.
Figures 2 and 3 show the structures 2 and 3 shown. The film 3 has many projections 8. So
The resulting film 2 has a number of thin 9 and thick 10 regions. fill
When the film 2 is separated from the film 3, the thin area 9 is torn and the opening 1 as shown in FIG.
2 form. The resulting open shape is then laminated to the polymer layer.
To form a laminate suitable for use as a carrier during the dressing of the present invention.
To achieve.
Referring to FIG. 3, the culture flask 1 comprises a hydrophilic polymer layer 14 and a perforated hydrophobic layer.
Is divided into sections 21 and 31 by a carrier made of the conductive film 2.
Medium 4 is inserted into the flask and occupies both compartments 21 and 31. 3T3
Feeder cells such as are inoculated into compartment 31 via passage opening 11, while skin cells are injected into neck 6
Is inoculated into the compartment 21 via
Nutrients, growth factors or drugs such as antibiotics or anti-inflammatory drugs are
It may be included in a growing aqueous medium. The nature of the weight and / or
Or the capacity is well known in the art.
After the layer of skin cells has reached the required degree of confluence, the carrier is placed on the wall 5 of the flask.
From the passage opening 13.
Preferably, the cell layer is subconfluent. Alternatively, confluence may be used.
The invention is illustrated by using any of the polymers in the table below
.Example
Human epithelial cells (keratinocytes) are polymers with greater than 16% water absorption
Were grown on films and laminates. Use
The materials and methods used are described in detail below.
The cells used were derived from the ScaBER cell line, Am
Provided by erican Type Culture Collection
Was.
Label cells with dye markers to make them easier to detect with a light microscope
I did. This is because it is difficult to detect cells on a heterogeneous surface of a sample.
Was needed. Sigma Chemical Company of St. Louis, USA
Sigma Mine Chemicals (S) supplied by Ical Company
igma Immuno Chemicals) PKH26 red fluorescent general
Using a simple cell linker kit and following the instructions provided with the kit,
Cells were labeled. Reconstitute in fresh broth for culture on sample
Before being suspended, the cells were then washed with serum-free medium.
Control experiments determine whether fluorescent dye markers are incorporated by the polymer substrate.
Or to determine. The result is that the dye is not absorbed by the polymer
The fluorescence that is cell-specific and thus observed in the experimental sample is
It was shown to be derived from cells adhered to.
The medium used was Earle's minimum essential medium (MEM) + 10%
Fetal calf serum, made as follows:
348ml Earls MEM (without L-glutamine), give
Provided by Gibco BRL.
40 ml heat-inactivated fetal calf serum
4 ml penicillin / streptomycin (5000 IU / ml-5000
μg / ml), provided by Gibco BRL.
4ml non-essential amino acids
4 ml L-glutamine (100 ×) 200 mM, provided by Gibco BRL.
Cells are 10 per 3 ml of culture.6Inoculated at the density of the cells.
The medium containing the cells at the previous concentration is brought into contact with the sample film to be tested.
Place in Petri dish, first 24 hours at 37 ° C, then another 24 hours up to 3
Incubated for days. The polymer substrate is then removed from the Petri dish
Red fluorescent cells, carefully washed and labeled under UV light
Using a Nikon Inversion Microscope Adjusted with a Rhodium Filter to Detect
, The presence of adhered cells was detected.
The polymer layers used were all thin films, which flattened
It was placed on the bottom of a Petri dish using a metal loop to facilitate later handling.
The polymer layer used in the carrier is used in a wound dressing
A sample of a hydrophilic film known to be suitable for application to the skin for therapeutic purposes
Met.Example 1
Extruded, about 20 μm thick and 64% water absorption as measured by the method described above
The thermoplastic polyether-polyurethane formed into a film having
-Used as a layer.
The film is placed on the bottom of the Petri dish and the medium containing the cells is placed on top of the film.
Inserted on the surface. After 24 hours of incubation, the carrier is removed and
Washed. u. v. Cells adhere to the film surface when observed under light
Was shown. The film swelled due to the absorption of the medium.Example 2
A film of thermoplastic polyether-polyurethane about 20 μm thick has a thickness of 50 μm.
Laminated on μm ethylene vinyl acetate (EVA) film to form carrier layer
did. The EVA material had a water absorption of about 0.3%. Medium and cells are laminated
On the polyether-polyurethane side. Some cells are 24 hours later
It is confirmed that a larger number of cells adhere after a few days.
Was done.
The sample appears to remain broad and flat, possibly with a hydrophilic filter
A bump due to the expansion of the film was seen on the surface of the film.Example 3
The laminate described in Example 2 was used as a carrier layer, and cells were
It grew on the VA side. Cells should adhere to the film and grow after 24 hours
Was observed.Example 4
The carrier used was Smith & Nephew Healthcare (Smith & Neph)
ew Healthcare) Ltd. under the trademark “OPSITE IV3000”
It was a commercial dressing sold under the name " The carrier is a parent
Acrylic adhered to the backing layer of water-based polyurethane film and its wound surface
Consists of a layer of pressure sensitive adhesive. The measured water absorption of the dressing is about 68%
there were.
Cells are colonizing the polyurethane side of the non-adhesive dressing
Was observed.Example 5
The carrier has an adhesive side of the dressing used as the cell transport layer
This was the dressing of Example 4. Cells were observed to adhere to the adhesive and proliferate
Was.Example 6
The carrier used was the two-layer 20 micrometer heat used in Example 1.
It was a laminate of a plastic polyether-polyurethane film. As expected
In addition, cells are well dispersed over the area of the film in contact with the
Adhesion was observed. The sample appears foamy after contact with the culture
But this does not seem to have any significant effect on cell attachment to the surface.
won.
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ
Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ
，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ
，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ
Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ
，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ
Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ
，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 マシュー ジェーン ブリジット
イギリス、ヨーク ワイオー２ １デイー
ピー、サウス バンク アベニュー 84
(72)発明者 ドリューベリー ジョージ ロバート
イギリス、ノース ハンバーサイド ワイ
オー４ ３エッチティー、マーケット ウ
ェイグトン、グッドマンハン ロード
13、ハイフィールド────────────────────────────────────────────────── ───
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(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE,
DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L
U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF)
, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE,
SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, S
Z, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD
, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ
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DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, I
L, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK
, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK,
MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, R
U, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR
, TT, UA, UG, US, UZ, VN
(72) Inventor Matthew Jane Bridget
United Kingdom, York Wyo 21 Day
P, South Bank Avenue 84
(72) Inventor Drewberry George Robert
North Humberside Wye, United Kingdom
Oh 43 etch tea, market c
Eigton, Goodmanhan Road
13, high field