JP2000336100A - 細胞死レギュレータ - Google Patents

細胞死レギュレータ

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JP2000336100A
JP2000336100A JP2000132104A JP2000132104A JP2000336100A JP 2000336100 A JP2000336100 A JP 2000336100A JP 2000132104 A JP2000132104 A JP 2000132104A JP 2000132104 A JP2000132104 A JP 2000132104A JP 2000336100 A JP2000336100 A JP 2000336100A
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polypeptide
amino acid
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Stanley J Korsmeyer
ジェイ コルスメイヤー，スタンリー
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Washington University in St Louis WUSTL
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University of Washington
Washington University in St Louis WUSTL
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、ｂｃｌ−２関連蛋白質及びｂｃｌ
−２突然変異蛋白質と、それらの使用法とを提供する。 【解決手段】 本発明による死抑制体活性を実質的に欠
き及び／又はＢａｘへの結合を実質的に欠く突然変異ｂ
ｃｌ−２蛋白質を生成する方法は、自然発生的なｂｃｌ
−２蛋白質と実質的に一致しＢＨ１又はＢＨ２ドメイン
にアミノ酸置換又は欠失を有するポリペプチド配列から
なり、実質的にＢａｘに結合し得ず及び／又は実質的に
死抑制体活性化し得ない突然変異ｂｃｌ−２蛋白質をエ
ンコードするポリヌクレオチドを細胞又は翻訳反応中に
発現させる段階を有する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】権利宣言 米国政府は、本発明に関する支払い済の使用許諾と、国
立衛生研究所により発行された認可第４９７１２−０５
号の合意によって設けられた合理的な条件で特許権者に
他者への使用許諾を要求する制限付き権利とを有する。
【０００２】発明の分野 本発明は、生体内でヘテロマルチマー（ヘテロダイマ
ー）を形成するためｂｃｌ−２蛋白質と相互に作用する
新規の蛋白質の同定と、純粋化と、分離とに係り、特
に、以下Ｂａｘと呼ぶｂｃｌ−２関連蛋白質、アミノ連
鎖の置換、添加又は欠失を有し、Ｂａｘへの実質的に低
下した結合及び／又は実質的に低下した死抑制体活性を
示すＢＨ１及び／又はＢＨ２ドメインよりなるｂｃｌ−
２突然変異蛋白質、及び、ＢＨ１及び／又はＢＨ２ドメ
インよりなるｂｃｌ−２断片の純粋化、分離及び使用
と、Ｂａｘのｂｃｌ−２への結合を変調（例えば、抑
制）する作用物質を同定する方法とに関する。
【０００３】
【従来の技術】発明の背景 関連技術の説明 細胞死は、主要器官系の胚又は生後発育中に重要な局面
である。更に、アポプトシス(アポトーシス)、又は、プ
ログラムされた細胞死は、多くの成人組織においてホメ
オスタシスの維持に重大な役割を果たしている。脊椎動
物内で、ｂｃｌ−２は、細胞死の経路で最も良く知られ
た遺伝子であり、細胞死抑制体として作用する。
【０００４】アポプトシスは、プログラムされた細胞死
の過程を表わす用語であり、数種類の細胞タイプについ
て説明されている（ワーリング他によるメディカルリサ
ーチレビュー、第11号（1991年）の219 ページ(Waring
et al. (1991) Med. Res. Rev. 11: 219)と、ウィリア
ムズによる細胞、第65号（1992年）の1097ページ(Willi
ams GT (1991) Cell 65: 1097)と、ウィリアムズによる
トレンド細胞生化学、第２号（1992年）、263 ページ(W
illiams GT (1992) Trends Cell Biol. 2: 263) と、ヨ
ニッシュ−ローハ他によるネイチャー誌、第352 号（19
91年）、345 ページ(Yonisch-Rouach et al. (1991) Na
ture, 352: 345) ）。アポプトシスは、リンパ球及び造
血系列のその他の細胞のようなある種の分化細胞タイプ
の量及び分布を制御する点に関連していると考えられて
いる。アポプトシスの誘発が生じる調節経路は完全には
分からないので、細胞内にアポプトシスが生じるメカニ
ズムも完全には分からない。
【０００５】アポプトシスメカニズム アポプトシスは、当初、細胞収縮、膜ブレビング、及
び、細胞断片内で最高度に達する染色質凝縮を特徴とす
る細胞死の形態的パターンであると説明されていた（ケ
ル(Kerr)他、1972年）。細胞死の初期における一つの証
明パターンは、ヌクレオソーム間(internucleosomal)の
ＤＮＡ分割である（ワイリー(Wyllie)、1980年）。ＲＮ
Ａと蛋白質合成の中断の死−蘇生効果と、発生中の細胞
死の定型化パターンは、細胞死の細胞自律性遺伝プログ
ラムと矛盾しなかった（ワイリー他による細胞学の国際
レビュー、第68号（1980年）、251 ページ(Wyllie et a
l. (1980) Int. Rev. Cytol. 68: 251)と、サルスト
ンとホルビッツによる発生生物学、第56号（1977年）、
110 ページ(Sulston, J.and Horvitz, H. (1977) Devel
op. Biol. 56: 110)と、アブラムス他による発生、第1
17 号（1993年）、29ページ(Abrams et al. (1993) Dev
elopment 117:29)）。線虫カエノルハブディティス
エレガンス(nematode caenorhabditis elegans) におけ
る発生学的細胞死に対し欠陥のある突然変異体の分離に
よって上記考え方は裏付けられた（エリスとホルビッツ
による細胞学、第44号（1986年）、817 ページ(Ellis,
H. and Horvitz, H. (1986) Cell 44: 817)と、ヘンガ
ートナー他によるネーチャー誌、第356 号（1986年）、
494 ページ(Hengartner etal. (1992) Nature 356: 49
4) ）。
【０００６】通常の発生中に、別々の細胞タイプ及び種
の範囲内のアポプトシスとして、かつ、外部刺激に対す
る応答として定義された形態的及び生化学的パターンの
無矛盾性は、細胞死の共通の原因と矛盾しない。この仮
説は、細胞死と、アポプトシスの陽性及び陰性のレギュ
レータである遺伝子産物の存在とに寄与する内因性プロ
グラムの概念によって裏付けられている。最も良く研究
されたアポプトシスの陽性レギュレータはｂｃｌ−２癌
原遺伝子生成物である。ｂｃｌ−２癌原遺伝子生成物
は、多様な細胞死モデルを阻止する機能によって哺乳類
の死の経路が共通していることの最も明らかな証拠を与
える。
【０００７】ｂｃｌ−２ ｂｃｌ−２癌原遺伝子によってエンコードされた蛋白質
は、多数の造血細胞系においてアポプトシスを抑制し得
ることが報告されている。癌原遺伝子ｂｃｌ−２は、分
離され、ヒト濾胞性リンパ腫の中の８０％を上回るリン
パ腫に存在するｔ（１４；１８）染色体内に免疫グロブ
リンＨ鎖エンハンサーに隣接する頻繁な転座の結果とし
て表されている（チェン−レヴィ他による分子細胞生物
学、第９号（1989年）、701 ページ(Chen-Levy et al.
(1989) Mol. Cell. Biol. 9: 701)と、クリアリー他に
よる細胞学、第47号（1986年）、19ページ(Cleary et a
l.(1986) Cell 47: 19) ）。かかる新生物は、通常そ
の細胞の代謝回転を生じさせるアポプトシスの阻止によ
って得られると考えられる成熟した静止Ｂ細胞の蓄積を
特徴としている。Ｅμエンハンサーの制御下でｂｃｌ−
２を発現する遺伝子導入マウスは、同様に、悪性リンパ
腫に発育する高い発生率を有する濾胞性リンパ腫を発生
する（ホッケンベリー他によるネーチャー誌、第348 号
（1990年）、334 ページ(Hockenbery et al. (1990) Na
ture 348: 334) と、マクドネルとコルスメイヤーによ
るネーチャー誌、第349 号（1991年）、254 ページ(McD
onnellTJ and Korsmeyer SJ (1991) Nature 349: 25
4) と、ストレッサー他による細胞学、第67号（1991
年）、889 ページ(Strasser et al. (1991)Cell 67: 8
89)）。
【０００８】ｂｃｌ−２蛋白質は、２６ｋＤの膜会合細
胞質蛋白質である（ツジモト他による癌遺伝子、第2 号
（1987年）、3 ページ(Tsujimoto et al. (1987) Onco
gene2: 3) と、米国特許第5,202,429 号及び第5,015,56
8 号と、上記チェン−レヴィ他による文献（1989年）(C
hen-Levy et al. (1989) op.cit)と、上記ホッケンベリ
ーによる文献（1990年）(Hockenbery et al. (1990) o
p.cit) ）。多くの他の原癌遺伝子とは異なり、ｂｃｌ
−２蛋白質は、Ｔ及びＢ原形の造血細胞タイプの増殖を
直接促進させるのではなく、むしろＴ及びＢ原形の造血
細胞の生残を高めることによって少なくとも部分的に作
用することが分かる（ボークス他によるネーチャー誌、
第335 号、1988年、440 ページ(Vaux et al. (1988) Na
ture 335: 440) と、ツジモトによるナショナルアカデ
ミー学会（米国）講演予稿集、第86号、1989年、1958ペ
ージ(Tsujimoto Y (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.
S.A.) 86: 1958)と、ツジモトによる癌遺伝子、第4
号、1989年、1331ページ(Tsujimoto Y (1989) Oncogene
4: 1331)と、リード他による癌遺伝子、第4 号、1989
年、1123ページ(Reed et al. (1989) Oncogene 4: 112
3)と、ヌネズ他によるナショナルアカデミー学会（米
国）講演予稿集、第86号、1989年、4589ページ(Nunez e
t al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:
4589)と、ヌネズ他による免疫学ジャーナル、第144
号、3602ページ、1990年(Nunez et al. (1990) J.Immu
nol. 144: 3602)と、リード他によるナショナルアカデ
ミー学会（米国）講演予稿集、第87号、3660ページ、19
90年(Reed et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci.
(U.S.A.) 87: 3660)と、アルネムリ他によるナショナ
ルアカデミー学会（米国）講演予稿集、第89号、7295ペ
ージ、1992年(Alnemri et al. (1992) Proc. Natl. Ac
ad. Sci. (U.S.A.) 89: 7295)）。ｂｌｃ−２の細胞生
残を増強する性能は、サイトカイン隔離、放射線照射、
糖質コルチコイド処理、及び、抗ＣＤ−３性抗体のよう
な幾つかの因子によって初発されたアポプトシスを抑制
する能力に関係している（ヌネズ他の1990年発行の上記
文献と、ホッケンベリー外の1990年発行の上記文献と、
ボークス他の1988年発行の上記文献と、アルネムリ他に
よる1992年発行の癌治療、第52号、491ページ(Alnemri
et al. (1992) Cancer Res. 52: 491)と、セントマン
他による1991年発行の細胞学、第67号、879 ページ(Sen
tman et al. (1991) Cell 67: 879)と、ストラッサー
他による1991年発行の上記文献）。更に、ｂｃｌ−２発
現の上方調節(up-regulation)はＥＢＶ−感染Ｂ細胞系
を抑制する（ヘンダーソン他による1991年発行の細胞
学、第65号、1107ページ(Henderson et al. (1991)Cell
65: 1107) ）。ｂｃｌ−２の発現は、血清又は成長因
子の無い場合に陽性細胞成長調節始原−癌遺伝子ｃ−ｍ
ｙｃの発現から生じるアポプトシスを阻止することが分
かっている（ワーグナー他による1993年発行の分子細胞
生物学、第13号、2432ページ(Wagner et al.(1993) Mo
l. Cell. Biol. 13: 2432) ）。しかし、ｂｌｃ−２が
アポプトシスを抑制し得る正確なメカニズムは未だ完全
には確定されていない。
【０００９】ｂｃｌ−２始原−癌遺伝子は、多数の状況
においてアポプトシス性の死を阻止する能力の点でかな
り特殊な細胞遺伝子である（コルスメイヤーによる1992
年発行の血液、第80号、879 ページ(Korsmeyer, S. (19
92) Blood 80: 879)）。遺伝子導入モデルにおけるｂ
ｃｌ−２の過剰な発現によって、正常な細胞死のメカニ
ズムの回避に起因する細胞の蓄積が生じる（マクドネル
他による1989年発行の細胞学、第57号、79ページ(McDon
ell et al. (1989) Cell 57: 79)）。放射線、温熱療
法、成長因子使用中止、糖質コルチコイド、及び、化学
療法物質の多数のクラスのようなダイバース(diverse.)
刺激によるアポプトシスの誘発は、生体外モデルにおけ
るｂｃｌ−２によって抑制される（ボークス他による19
88年発行のネーチャー誌、第335 号、440 ページ(Vaux
et al. (1988) Nature 335: 440)と、ツジモトによる1
989年発行の癌遺伝子、第4 号、1331ページ(Tsujimoto,
Y. (1989) Oncogene 4: 1331)と、ヌネズ他による199
0年発行の免疫学ジャーナル、第144 号、3602ページ(Nu
nez et al. (1990) J.Immunol. 144: 3602)と、ホッ
ケンベリー他による1990年発行のネーチャー誌、第348
号、334 ページ(Hockenbery et al. (1990) Nature 34
8: 334) と、セントマン他による1991年発行の細胞学、
第67号、879 ページ(Sentman et al. (1991) Cell67:
879)と、ワルトン他による1993年発行の癌治療、第53
号、1853ページ(Walton et al. (1993) Cancer Res.
53: 1993) と、ミヤシタとリードによる1993年発行の血
液、第81号、151 ページ(Miyashita, T and Reed, J (1
993) Blood 81: 151)）。上記効果は、ｂｌｃ−２の発
現のレベルと比例する。その上、ｂｃｌ−２の発現の内
因性パータンは、生体内の細胞生残の調節に非常に暗示
的な役割を担っている（ホッケンベリー他による1991年
発行の米国アカデミー学会講演予稿集、第88号、6961ペ
ージ(Hockenbery et al. (1991) Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 88: 6961)と、レブルン他による1993年
発行のアム ジェー パソール、第142 号、743ページ
(LeBrun et al. (1993) Am. J. Pathol. 142: 743)
）。ｂｃｌ−２蛋白質は、細胞死中に活動する中心メ
カニズムの拮抗体の作用を行なうように考えられる。
【００１０】ホッケンベリー(Hockenbery, D.M.)、ヌネ
ズ(Nunez, G.) 、ミリマン(Milliman, C.)、シュライバ
ー(Schreiber, R.D)及びコルスメイヤー(Korsmeyer) に
よって1990年発行のネーチャー誌、第378 号、334-336
ページ(Nature 378, 334-336, 1990) に「ｂｃｌ−２は
プログラムされた細胞死を阻止する内部ミトコンドリア
膜蛋白質である。」と記載されているように、ｂｃｌ−
２は、ミトコンドリア膜に局在化されている点で特有の
始原癌遺伝子である。ｂｃｌ−２はプログラムされた細
胞死を阻止する発癌作用でり、一方、デレギュレートさ
れた(deregulated) ｂｃｌ−２は、成長因子の隔離に続
いてある種の造血細胞系列の生残を延長することが分か
っている。プロ−Ｂ細胞又は前骨髄球細胞系列は、イン
ターロイキン ３から隔離されたとき、通常、プログラ
ムされた死と呼ばれるアポプトシスで死ぬ。かかる形態
学的細胞死のパターンは、劇的な原形質膜ブレブ(plasm
amembrane blebbing)、細胞体積収縮、核凝縮、エンド
ヌクレアーゼの活性化に続くヌクレオソーム間ＤＮＡ分
解を特徴としている。ミトコンドリアｂｃｌ−２の過剰
な発現は、上記処理に対する解毒剤として作用し、増殖
の促進とは無関係にプログラムされた細胞死を阻止する
特有の作用を有する。
【００１１】ｂｌｃ−２の始原癌遺伝子は、ヒト濾胞性
リンパ腫の細胞発生の証明であるｔ（１４；１８）（ｑ
３２；ｑ２１）の染色体切断点で発見された。概ね濾胞
の８５％と瀰漫性Ｂ細胞リンパ腫の２０％は、上記転座
を占有する。濾胞性リンパ腫は、屡々、小さい静止Ｉｇ
Ｍ／ＩｇＤ Ｂ細胞からなる低等級の悪性として存在す
る。時間外に、瀰漫性の大きい細胞構造を有するより攻
撃的な高い等級のリンパ腫への変換が頻繁に発生する。
【００１２】ｂｃｌ−２の研究によって、新生物の発生
に多数の経路が存在することが強調されている。新生物
の組織内の増加した細胞数は、通常のホメオスタシスの
侵害と見なすことが可能である。正常組織内のホメオス
タシスの維持は、多くの点で、入力（細胞増殖及び更
新）対出力（細胞死）の単純な平衡式を反映している。
このことは、前立腺のような被包された組織の場合に最
も容易に想像されるが、再循環性の造血系列の場合にも
真である。非常に変化のない細胞の数を維持すること
は、制御された増殖と同様に固く調節された死の経路を
反映する。例えば、コルスメイヤー(S.J. Korsmeyer)の
“新しい癌遺伝子のカテゴリーを初発するｂｃｌ−２：
細胞死のレギュレータ(bcl-2 Initiates a New categor
y of Oncogenes: Regulators of Cell Death）”、血
液、第80巻、第 4号、879-886 ページ、1992年 8月15日
発行を参照のこと。
【００１３】プログラムされた細胞死は、細胞数の制限
を助ける細胞の自律的な自己不活化経路を表わしてい
る。特定の細胞の的確な損失は、器官発生の一部として
の胚の発育中に非常に重大である。成熟した組織におい
て、一般的にプログラムされた死は、細胞の体積を調節
する。アポプトシスと呼ばれる形態学的に識別され時間
的に調節された細胞死は、ワイリー(Wyllie AH) の“ア
ポプトシス：組織レギュレーション中の細胞死(Apoptos
is: Cell death in tissue regulation)”で認定され
た。1987年発行のジャーナル パソール(J. Pathol) の
第153 号、413 ページには、原形質膜ブレブ、体積収
縮、核凝縮、ＤＮＡをヌクレオソーム長の断片に分割す
るエンドヌクレアーゼの活性化によって印されたアポプ
トシスの表示による細胞の死が記載されている。
【００１４】ｂｃｌ−２は、染色体移行への末端小粒内
の染色体部分１８ｑ２１．３に局在化されている。ｂｃ
ｌ−２遺伝子は、三つの構造配列を有し、その中の第１
番目は翻訳されていない。二つの潜在的な促進因子部が
存在する。Ｐ１は多数のＳＰ１部位でＧＣ（グアニン・
シトシン）が豊富であり、優先的に使用される。ｂｃｌ
−２は巨大な遺伝子であり、２２５−ｋｂの介在配列II
は蛋白質エンコーディング構造配列II及びIIIを分割す
る。この点については、シルバーマン(Silvermann GA)
他の“酵母人工染色体の間の減数組換による完全なｂｃ
ｌ−２始原癌遺伝子を含有する単一クローンの産出(Mei
toic recombination between yeast artificial chromo
somes yieles a single clone containing the entire
bcl-2 proto-oncogene)"、ナショナルアカデミー学会講
演予稿集、第87号、9913ページ(1990 年) を参照のこ
と。翻訳の分子的結果として、キメリック(chimeric)Ｒ
ＮＡを発生するＩｇ Ｈ鎖の座と同一の転写方向にｂｃ
ｌ−２を配置するｄｅｒ（１４）染色体へのｂｃｌ−２
遺伝子の動きが得られる。しかし、転座は蛋白質エンコ
ーディング部を妨害しないので、正常な転座された対立
遺伝子は、同一サイズの２５−ｋｄの蛋白質を産出す
る。
【００１５】始原Ｂ−細胞を含む造血始原は、高レベル
のｂｃｌ−２を含有する。例えば、ホッケンベリー(Hoc
kenbery D)と、ズーター(ZuterM)と、ヒッケイ(Hickey
W)と、ナーム(Nahm M)と、コルスメイヤー(Korsmeyer S
J)とによる“アポプトシス細胞死によって表わされた組
織内で局所的に制限されたｂｃｌ−２蛋白質(bcl-2 is
topographically ristricted in tissues characterize
d by apoptotic celldeath)”、米国アカデミー学会講
演予稿集、第88号、6961ページ（1991年） (Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. 88: 6961, 1991)を参照のこ
と。成熟Ｂ細胞、特に、Ｂ−細胞系列の中には、低レベ
ルのｂｃｌ−２ ＲＮＡを有するものがある。一方、ｔ
（１４；１８）−支持Ｂ細胞は、不適当な上昇レベルの
ｂｃｌ−２−Ｉｇ融合ＲＮＡを有する。グラニンガー(G
raninger WB)と、セト(Seto M)と、ブタイン(Boutain
B) と、ゴールドマン(Goldman P) と、コルスメイヤー
(Korsmeyer SJ)による：正常かつ新生物性細胞内におけ
るｂｃｌ−２とｂｃｌ−２−Ｉｇ融合転写の発現(Expre
ssion of bcl-2 and bcl-2-Ig fusion transcripts inn
ormal and neoplastic cells)、雑誌臨床研究(J. Clin.
Invest) 、第80号、1512ページ(1987 年) を参照のこ
と。上記安定状態のＲＮＡはｂｃｌ−２−Ｉｇ融合対立
遺伝子の増加した転写と処理の利点の両方を反映してい
る。
【００１６】ｂｃｌ−２は成長因子の経路に含まれてい
るかどうかを判定するため多様なインターロイキン（Ｉ
Ｌ）−依存性細胞系に導入されている。これに関し、上
記コルスメイヤー(SJ Korsmeyer)の文献を参照のこと。
上記系列は、ｂｃｌ−２が特定の配位子／受容体の相互
作用を必要としないかどうかを決めるため検査される。
しかし、長い頂端成長因子依存性細胞系は、系を必要と
するＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、又は、ＩＬ−６内
のｂｃｌ−２の過剰な発現の後に現れなかった。しか
し、ｂｃｌ−２によれば、ＩＬ−３−依存性の初期造血
細胞系ＦＤＣＰ１と、ＦＬ５．１２と、３２Ｄ内の成長
因子の使用中止の後、死−蘇生効果がある種の造血細胞
系に得られた。顆粒−マクロファージ 群体−刺激因子
（ＧＭ−ＣＳＦ）と、ＩＬ−４隔離細胞が同様の反応を
示した点で、上記効果はＩＬ−３／ＩＬ−３受容体信号
伝達経路には限られなかった。しかし、ＩＬ−２依存性
Ｔ細胞系、或いは、ＩＬ−６依存性骨髄種系は、何れも
因子の使用中止に一貫した影響を与えないので、ｂｃｌ
−２の増強された細胞生残は普遍的ではなかった。
【００１７】ｂｃｌ−２は、細胞サイクルの進行を直接
促進させることは認められず、必ずしもＩＬ−３の濃度
の制限に応じて投与量を変更する必要はない。この点に
関し、ヌネズ(Nunez G) と、ロンドン(London L.) と、
ホッケンベリー(HockenberyD)と、アレキサンダー(Alex
ander M) と、マッカーン(McKearn J) と、コルスメイ
ヤー(Korsmeyer SJ)による：“成長因子の隔離された造
血細胞系の生残を選択的に延長するデレギュレートされ
たｂｃｌ−２遺伝子の発現(Deregurated bcl-2gene exp
ression selectively prolongs survival of growth fa
ctor-deprivedhemopoietic cell lines)”、免疫学ジャ
ーナル(J. Immunol)、第144 号、3602ページ(1990 年)
を参照のこと。或いは、ｂｃｌ−２は、原形質膜ブレ
ブ、体積収縮、核凝縮、アポプトシスとして周知のＤＮ
Ａのエンドヌクレオライティック(endonucleolytic) 分
割を阻止した。因子を隔離された細胞は生き返るが死ぬ
ことはない。しかし、ＩＬ−３の添加による３０日の隔
離後、上記細胞を救助することが可能であり、これによ
り、上記細胞は末端分化しない、或いは、永久に停止し
ないことが示される。
【００１８】ｂｃｌ−２細胞死の経路を認定することは
重要であるが、ｂｃｌ−２の経路を調節する方法は発見
されていない。ｂｃｌ−２の効果を下方調節(down-regu
late) する能力は、癌治療法、良性前立腺肥大（ＢＰ
Ｈ）のようなような増生の制御、死効果器分子を好発す
ることによる自己免疫病の自己反応性クローンの除去の
際に利点がある。ｂｃｌ−２の効果を上方調節し、か
つ、死抑制器分子を好発することにより、エイズを含む
免疫不全疾患の処置及び診断、神経性変性及び虚血性細
胞死に利点が得られる。
【００１９】細胞増殖制御及び新生物 多数の病理的な状態は、細胞増殖、分化、及び／又はア
ポプトシスの異常な制御から少なくとも部分的に得られ
る。例えば、新生物は、正常な細胞増殖制御信号に応答
する限定された能力を有するクローンとして得られた細
胞個体群によって表わされる。細胞の癌遺伝子変換によ
って、細胞の代謝、生理及び形態に多数の変化が生じ
る。癌遺伝子的に変換された細胞の一つの特徴的な変性
は、細胞成長調節遺伝子の適当な発現によって通常加え
られる細胞増殖と分化の制約に対する寄与が失われるこ
とである。神経性変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化
症）と、ＨＩＶ−１病原は、遊離基形成及び毒性と関連
付けられ、アポプトシスの現象はその疾患の病因に関連
している（メイアード(Meyaard) 他によるサイエンス誌
(science) 、第257 号、217 ページ(1992 年) ）。
【００２０】正確な分子経路と、多数の細胞タイプの悪
性変換を生じる２次変化は、明らかではない。しかし、
８０パーセントを上回るヒト濾胞性Ｂ細胞リンパ腫及び
２０パーセントの瀰漫性リンパ腫におけるアポプトシス
に関連したｂｃｌ−２遺伝子の免疫グロブリンＨ鎖遺伝
子座ｔ（１４；１８）への特徴的な転座と、高いレベル
のｂｃｌ−２を発現する遺伝子導入マウスに現れるリン
パ球増殖は、ｂｃｌ−２遺伝子が腫瘍形成の疾患及び、
異常な細胞増殖、分化及び／又はアポプトシスから生じ
る他の病理的な状態と因果関係があることを示してい
る。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】かくして、治癒的又は
予防的な利益のため細胞の増殖、分化及び／又はアポプ
トシスを変調するようｂｃｌ−２蛋白質の活性を変更し
得る作用物質を同定することが望ましい。その上、上記
作用物質は、実験的な応用において細胞の増殖、分化及
び／又はアポプトシスを制御するため、及び／又は、試
験管内、生体外治療、又は、生体内における所定の造血
幹細胞又は神経性細胞個体群の制御された増殖及び分化
のための商業的研究試薬としても利用できる。
【００２２】変換された表現型及びアポプトシスの基に
ある分子メカニズムのより確定したモデルの開発におけ
る進展にも係わらず、癌の処置に適用可能な従来の化学
療法よりも重要な治療法は殆ど得られていない。上記作
用物質は、腫瘍形成、リンパ球増殖状態、関節炎、炎
症、神経性変性疾患、自己免疫性疾患等の処置のための
新規の化学療法的作用物質を提供することが可能であ
る。本発明は、上記及びその他の要求を実現する。
【００２３】
【課題を解決するための手段】発明の概要 本発明は、ｂｃｌ−２が他の蛋白質、特に、Ｂａｘとい
う名前の関係する２１ｋＤの蛋白質と相互作用するとい
う予想外の発見に関連している。Ｂａｘは、高度に保存
されたドメインＩ及びII内で病巣化されたｂｃｌ−２
と、多量の相同アミノ酸を共有している。Ｂａｘは、ホ
モダイマー化し、生体内でｂｃｌ−２とホモダイマーを
形成することが予想外に分かった。過剰に発現したＢａ
ｘは、ＩＬ−３依存性細胞系内のサイトカイン欠乏によ
って誘発されたアポプトシス死を加速し、過剰に発現し
たＢａｘは、更に、ｂｃｌ−２の死抑制体活性を抑える
ことが分かった。この発見によってｂｃｌ−２／Ｂａｘ
の比がアポプトシス刺激の後に続く細胞生残又は死を決
定するモデルが得られる。
【００２４】従って、本発明の一実施例は、図８のドメ
インＩ又はIIのアミノ酸配列を有し、純粋化、分離され
たｂｃｌ−２関連蛋白質（Ｂａｘ）と、その断片の形成
に関係する。
【００２５】他の実施例は、ｂｃｌ−２とＢａｘ突然変
異体の形成に関係し、天然の蛋白質又は断片は、欠失又
は他のアミノ酸によって置換された少なくとも一つのア
ミノ酸を有し、突然変異体は天然の蛋白質又は断片から
変えられた生物学的活性を示す。
【００２６】他の実施例は、ｂｃｌ−２関連蛋白質又は
その断片と結合されたＢａｘ蛋白質からなる関連蛋白質
に関係する。
【００２７】更なる実施例は、本質的にヒトＢａｘをエ
ンコーディングするゲノムＤＮＡ配列からなるポリヌク
レオチド（例えば、ＤＮＡアイソレート）、特に、Ｂａ
ｘ蛋白質をエンコードするｃＤＮＡ分子からなる合成物
に関係する。
【００２８】本発明の一面において、Ｂａｘポリペプチ
ドとその合成物が提供される。Ｂａｘポリペプチドは、
図３、４、６又は７に示された配列と実質的に一致する
ポリペプチド配列からなる。一実施例において、Ｂａｘ
ポリペプチドは、Ｂａｘポリペプチド配列のドメインＩ
及び／又はドメインIIよりなり、好ましくは、アミノ酸
配列 −Ｗ−Ｇ−Ｒ− 及び／又は −Ｑ−Ｄ−Ｎ−を
有し、環状ポリペプチドの形で実施しても構わない。
【００２９】他の面は、２１ｋＤ、２４ｋＤ又は４ｋＤ
のＢａｘ蛋白質をエンコードするαＲＮＡ、βＲＮＡ、
及び／又は、γＲＮＡの合成物と、かかるＲＮＡ種を生
成する細胞系とに関係する。
【００３０】本発明の他の面は、薬学的に効果のある量
のＢａｘポリペプチドと、適当な薬学的な担体とを含む
Ｂａｘの薬学上の合成物に関係する。
【００３１】更に、Ｂａｘポリペプチドをエンコーディ
ングするポリヌクレオチド配列が提供される。クローン
化された配列の特徴は、ヌクレオチドと、図３、４、６
及び７の予測されたアミノ酸配列とに関連して決められ
る。上記アミノ酸配列をエンコードする配列からなるポ
リヌクレオチドは、ヒトのＢａｘ及びマウスのＢａｘの
ようなＢａｘポリペプチドの量の組換表現用のテンプレ
ートとして利用される。
【００３２】本発明は、更に、宿主細胞の自然に発生す
るＢａｘ遺伝子ではなく、ポリヌクレオチドによってエ
ンコードされたＢａｘポリペプチドを発現する宿主細胞
を提供する。
【００３３】本発明の一面によれば、Ｂａｘポリペプチ
ドをエンコードするポリヌクレオチドは、外植されたリ
ンパ球、造血幹細胞、骨髄細胞等のような細胞に送られ
る。
【００３４】本発明の他の面は、ｂｃｌ−２の細胞死抑
制体活性を制御する方法に関係し、かかる方法は、Ｂａ
ｘ／ｂｃｌ−２を含有するヘテロダイマーの形成を可能
にさせるため、Ｂａｘ蛋白質又はその断片をｂｃｌ−２
活性を有する細胞に投与する段階と、ｂｃｌ−２細胞死
抑制体活性を阻害する段階とからなる。
【００３５】本発明の一面によれば、細胞、典型的には
リンパ球のアポプトシスを変調する方法が提供される。
上記方法は、特に、ｂｃｌ−２とＢａｘ、及び／又は、
ｂｃｌ−２又はＢａｘのホモマルチマーの間のヘテロマ
ルチマー（例えば、ヘテロダイマー）の形成を抑制する
ことにより、ｂｃｌ−２とＢａｘ蛋白質の間の分子間結
合を変える作用物質を細胞に投与する段階からなる。
【００３６】本発明の一面によれば、ｂｃｌ−２とＢａ
ｘ蛋白質の間の分子間結合を変える作用物質を投与する
ことにより細胞のアポプトシスを変調する方法は、患者
の病理的な状態を処置するため使用される。
【００３７】更なる実施例において、本発明はアポプト
シス的な細胞死の疾病素質の検定方法に関係し、上記検
定方法は：試験すべき検体を収集する段階と；上記検体
をｂｃｌ−２又はＢａｘ蛋白質と反応する材料と接触さ
せる段階と；Ｂａｘ及びｂｃｌ−２蛋白質の有無及び上
記検体内のそれらの比を検出又は判定する段階とからな
る。
【００３８】本発明によれば、Ｂａｘポリペプチドのｂ
ｃｌ−２ポリペプチドへの結合を変調（例えば、抑
制）、及び／又は、ＢａｘポリペプチドのＢａｘポリペ
プチドへの結合を変調（例えば、抑制）する作用物質を
同定するスクリーニング検定が得られる。
【００３９】更に、本発明は、細胞生残−対−死を監視
し、或いは、疾患の推移を検出又は監視するために、蛋
白質又はその関連蛋白質ｂｃｌ−２の検出及び判定の免
疫化学的方法を実行する蛋白質Ｂａｘ、又は、ｂｃｌ−
２、又は、突然変異体、又は、それらの断片の使用に関
係する。
【００４０】本発明によれば、更に、Ｂａｘ ｍＲＮ
Ａ、又は、患者から外植された細胞内のＢａｘ遺伝子の
再配列欠失又は増幅の検出、或いは、疾病特徴的なＢａ
ｘ対立遺伝子の検出（例えば、ＲＦＬＰ、又は、対立遺
伝子−特異ＰＣＲ分析）による病理的な状態（例えば、
腫瘍形成、エイズ、増生、先天的遺伝病）の診断用のＢ
ａｘポリヌクレオチドのプローブが得られる。
【００４１】本発明の一面において、Ｂａｘポリペプチ
ド及び／又はｂｌｃ−２ポリペプチドをエンコードする
形質転換を担持するマウスのような遺伝子導入非ヒト動
物が提供される。上記形質転換は、宿主染色体に相同的
に組換えられてもよく、或いは、非相同的に組み込まれ
ても構わない。
【００４２】本発明は、更に、過剰なｂｃｌ−２を発生
させることにより細胞の生残を促進するべくｂｃｌ−２
のＢａｘに対する割合を調節するため、ｂｃｌ−２の有
効量を増加、Ｂａｘを減少、或いは、突然変異体又はそ
の断片を患者に投与する段階からなる神経性変性疾患、
免疫不全、又は、虚血の治療方法と；Ｂａｘを好発させ
細胞死を促進するべくｂｃｌ−２のＢａｘに対する割合
を調節するため、ｂｃｌ−２の有効量を減少、Ｂａｘを
増加或いは、突然変異体又はその断片を患者に投与する
段階からなる増生、肥大、癌と、自己免疫性疾患の治療
方法とに関係する。
【００４３】本発明の一面において、アンチセンスポリ
ヌクレオチドは、細胞内のＢａｘの転写及び／又は翻訳
を抑制するため投与される。
【００４４】本発明は、少なくとも略１×１０7 Ｍ-1、
典型的には少なくとも１×１０8 Ｍ -1以上の親和力でＢ
ａｘポリペプチドに結合する単クローン性抗体及び多ク
ローン性抗血清の両抗体を提供する。
【００４５】本発明は、自然発生のｂｃｌ−２蛋白質
（例えば、非病理的なヒト検体から得られた自然発生の
ｂｃｌ−２蛋白質）に対してアミノ酸置換、付加、及び
／又は、欠失を有するアミノ酸配列からなるＢＨ１部
（ヒトｂｃｌ−２の残基１３６−１５５）及び／又はＢ
Ｈ２部（ヒトｂｃｌ−２の残基１８７−２０２）よりな
るｂｃｌ−２突然変異蛋白質を提供する。他の例によれ
ば、本発明は、ＢＨ１ドメイン及び／又はＢＨ２ドメイ
ン、好ましくは両部からなるｂｃｌ−２断片を提供し、
ここで、上記断片は、自然発生的ｂｃｌ−２アミノ酸配
列からなり、Ｂａｘへの結合を示し、及び／又は、細胞
死抑制体機能を示し、或いは、上記断片は、自然発生的
ｂｃｌ−２ポリペプチド配列に対するアミノ酸置換、付
加、又は、欠失からなり、Ｂａｘへの結合は実質的に不
足し、及び／又は、ｂｃｌ−２競合性拮抗体としての活
性を有し、及び／又は、死抑制体活性を欠き又は内因性
ｂｃｌ−２蛋白質の死抑制体活性を阻害する。
【００４６】本発明は、更に、Ｂａｘのｂｃｌ−２への
結合を抑制する作用物質の同定方法を提供し、これによ
り、上記作用物質は適当な結合条件の下で細胞、或い
は、Ｂａｘに結合し得る（例えば、機能的ＢＨ１及び／
又はＢＨ２ドメインからなる）ｂｃｌ−２とｂｃｌ−２
ポリペプチドに結合し得るＢａｘポリペプチドよりなる
生体内検定溶液に付加される。Ｂａｘポリペプチドのｂ
ｃｌ−２ポリペプチドへの結合を抑制する作用物質は、
これによって、アポプトシスを変調する候補薬として同
定される。
【００４７】本発明は、更に、Ｂａｘへの結合を実質的
に欠き、及び／又は、死抑制体活性を実質的に欠く突然
変異ｂｃｌ−２蛋白質を同定する方法からなり、上記方
法は：ＢＨ１又はＢＨ２ドメインのアミノ酸置換又は欠
失からなる突然変異ｂｃｌ−２ポリペプチドをエンコー
ドする変異したｂｃｌ−２ポリヌクレオチドを生成する
ため、ｂｃｌ−２ポリペプチドをエンコードするｂｃｌ
−２ポリヌクレオチドに変異を誘発する段階と；Ｂａｘ
を発現し、ｂｃｌ−２−感受性アポプトシスに従うこと
ができる哺乳類細胞に突然変異ｂｃｌ−２ポリペプチド
を発現させる段階と；突然変異ｂｃｌ−２ポリペプチド
の発現は、上記哺乳類細胞に内生するｂｃｌ−２蛋白質
の死抑制体活性を阻害するかどうか、及び／又は、上記
突然変異体ｂｃｌ−２ポリペプチド自体は、死抑制体活
性に欠け、及び／又は、上記ｂｃｌ−２−感受性アポプ
トシスを阻害し得ないかどうかを判定する段階と；内因
性ｂｃｌ−２死抑制体活性を阻害し、Ｂａｘへの結合が
なく、及び／又は、死抑制体活性が実質的にないｂｃｌ
−２蛋白質のように上記ｂｃｌ−２−感受性アポプトシ
スを阻害し得ない突然変異体ｂｃｌ−２蛋白質を同定す
る段階とからなる。
【００４８】本発明は、更に、候補ｂｃｌ−２−変調作
用物質を同定する方法を提供し、上記方法は：ＢＨ１及
び／又はＢＨ２ドメインからなるｂｃｌ−２ポリペプチ
ドをＢａｘポリペプチド及び作用物質と共に封入するヘ
テロダイマー化検定を行なう段階と；上記作用物質がｂ
ｃｌ−２ポリペプチドのＢａｘポリペプチドへのヘテロ
ダイマー化を阻害するかどうかを判定する段階と；ｂｃ
ｌ−２の死抑制体活性を阻害する候補ｂｃｌ−２変調作
用物質として上記ヘテロダイマー化を阻害する作用物質
を同定する段階とからなる。
【００４９】本発明の本質と利点の更なる理解は、明細
書の残りの部分と図面を参照することにより明らかにな
る。
【００５０】
【発明の実施の形態】好ましい実施例の説明 別途定義しない限り、ここで使用される全科学技術用語
は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解
されている意味と同一の意味を有する。ここで説明した
方法及び材料と同等又は等価な全ての方法及び材料を本
発明の実施又は試験に使用することが可能であるが、好
ましい方法及び材料だけを説明した。本発明の目的のた
め、以下の用語を予め定義する。
【００５１】以下に使用するように、２０種類の従来の
アミノ酸とそれらの短縮は従来の使用法に従う（ゴルブ
とグレン編による免疫学−合成、第２版、マサチューセ
ッツ州サンダーランド、シナウエ アソシエィツ（1991
年）出版(Immunology - A Synthesis, 2nd Edition, E.
S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates,
Sunderland, Massachusetts (1991)) を参考に引用す
る）。２０種類の従来のアミノ酸の立体異性体（例え
ば、Ｄ−アミノ酸）と、α，α−ジサブスティチューテ
ィッド(disubstituted) アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ
酸、乳酸、及び、その他の通例的ではないアミノ酸のよ
うな非天然アミノ酸は、本発明のポリペプチドの適当な
構成要素をなす。通例的ではないアミノ酸の例の中に
は：４−ヒドロキシプロライン、γ−カルボキシグルタ
ミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−
アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリ
ン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、
５−ヒドロキシリシン、ω−Ｎ−メチルアルギニン、及
び、その他の同様のアミノ酸と、イミノ酸（例えば、４
−ヒドロキシプロライン）が含まれる。ここで使用して
いるポリペプチド表記において、標準的な用法及び慣例
に従って、左側の方向(direction) はアミノ末端の方向
であり、右側の方向はカルボキシ末端の方向である。同
様に、特に指摘がない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配
列の左側の末端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオ
チド配列の左側の方向は、５’方向と呼ばれる。発生期
のＲＮＡ転写の５’から３’への付加の方向は転写方向
と呼ばれ；ＲＮＡと同一配列を有し、５’から５’末端
へのＲＮＡ転写であるＤＮＡ鎖上の配列領域は“上流(u
pstream)配列”と呼ばれ；ＲＮＡと同一配列を有し、
３’から３’末端へのＲＮＡ転写であるＤＮＡ鎖上の配
列領域は“下流(downstream)配列”と呼ばれる。用語
“自然発生的" は、自然界で検出し得るという事実に関
連する対象物に適用されるように使用されている。例え
ば、自然のソースから隔離可能であるが、実験室内で人
による意図的な変更がされていない生体（ウイルスを含
む）に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列
は、自然発生的である。一般的に言うと、用語自然発生
的は、非病理的（疾患のない）個体に存在し、種にとっ
て典型的であるような対象物を示している。
【００５２】ここで使用されている用語“Ｂａｘ”は、
別に指定されない限り、α、β及びγ異性体を含む哺乳
類Ｂａｘ遺伝子と哺乳類Ｂａｘ蛋白質とを意味し；ヒト
とマウスのＢａｘ蛋白質及び遺伝子は哺乳類Ｂａｘの好
ましい実施例であり、最狭義の用法の場合、Ｂａｘはヒ
トＢａｘポリヌクレオチドとポリペプチド配列とに関連
する。
【００５３】用語“対応する”は、ポリヌクレオチド配
列が基準ポリヌクレオチド配列の全部又は一部と相同的
である（即ち、同一性があり、厳密に進化的には関係が
ない）こと、或いは、ポリペプチド配列は基準ポリペプ
チド配列と一致していることを意味する。これに対し、
用語“相補的である”は、相補的配列が基準ポリヌクレ
オチド配列の全部又は一部と相同的であることを意味す
る。例えば、ヌクレオチド配列“ＴＡＴＡＣ”は基準配
列“ＴＡＴＡＣ”と対応し、基準配列“ＧＴＡＴＡ”と
相補的である。
【００５４】以下の用語：“基準配列”、“比較ウィン
ドウ”、“配列同一性”、“配列同一性のパーセンテー
ジ”及び“実質的な同一性”は、少なくとも二つのポリ
ヌクレオチドの間の配列関係を示すため使用される。
“基準配列”は配列比較の基礎として使用される確定し
た配列であり；基準配列は、より大きな配列のサブセッ
ト、例えば、図３及び４又は図６及び７のポリヌクレオ
チド配列のように配列リストに与えられた全体の長さの
ｃＤＮＡ又は遺伝子配列のセグメントでもよく、或い
は、完全なｃＤＮＡ又は遺伝子配列でも構わない。一般
的に基準配列は、長さが少なくとも２０のヌクレオチド
であり、頻繁には長さが少なくとも２５のヌクレオチド
であり、屡々長さが少なくとも５０のヌクレオチドであ
る。二つのポリヌクレオチドは、各々、（１）上記二つ
のポリヌクレオチドの間で同様の配列（例えば、完全な
ポリヌクレオチド配列の一部分）からなり、（２）二つ
のポリヌクレオチドの間の分岐である配列を更に有する
ので、二つ（或いはそれ以上）のポリヌクレオチドの間
の配列比較は、典型的に、配列の類似性の局部領域を同
定及び比較するため、二つのポリヌクレオチドの配列を
“比較ウィンドウ”に亘って比較することにより行なわ
れる。
【００５５】ここで使用される“比較ウィンドウ”は、
少なくとも２０個の連続的なヌクレオチド位置からなる
概念的なセグメントを表わし、ポリヌクレオチド配列
は、少なくとも２０個の連続的なヌクレオチドの基準配
列と比較され、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配
列の一部は、二つの配列の最適的なアライメントのため
の基準配列（基準配列は付加又は欠失がない）と比べて
２０パーセント以下の付加又は欠失（即ち、ギャップ）
よりなる。比較ウィンドウを整列する配列の最適的なア
ライメントは、1981年に発行された高等応用数学(Adv.
Appl. Math.)、第2号、482 ページに記載されたスミス
(Smith) とウォーターマン(Waterman)の局部相同アルゴ
リズム、1970年に発行された分子生物学ジャーナル(J.
Mol. Biol.) 、第48号、443 ページに記載されたニード
ルマン(Needleman) とワンシュ(Wunsch)の相同性アライ
メントアルゴリズム、1988年に発行された（米国）ナシ
ョナルアカデミー学会講演予稿集(Proc. Natl. Acad. S
ci. (U.S.A.) 、第85号、2444ページに記載されたペア
ソン(Pearson)とリップマン(Lipman)の類似性の探索方
法、上記アルゴリズムのコンピュータ化された実装（ウ
ィスコンシン州マディソンの５７５サイエンス Ｄｒ．
にあるジェネティックス コンピュータ グループ(Gen
etics Computer Group) のウィスコンシン ジェネティ
ックス ソフトウェア パッケージ リリース ７．０
(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0)
のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴ
Ａ）、又は、検査によって行なわれ、種々の方法によっ
て生成された最良のアライメント（即ち、比較ウィンド
ウに亘る相同性の最高のパーセンテージが得られる）が
選択される。
【００５６】用語“配列同一性”は、比較ウィンドウに
亘って二つのポリヌクレオチド配列が同一である（即
ち、ヌクレオチド−バイ−ヌクレオチドに基づいていて
いる）ことを意味する。用語“配列同一性のパーセンテ
ージ”は、比較ウィンドウに亘って最適的に調整された
二つの配列を比較し、一致した位置の数を得るため同一
の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、又はＩ）が
両方の配列に発生する位置の数を判定し、一致した位置
の数を比較ウィンドウ内の位置の全数（即ち、ウィンド
ウサイズ）で除算し、配列同一性のパーセンテージを得
るため結果を１００倍することにより計算される。ここ
で使用される用語“実質的同一性”はポリヌクレオチド
配列の特徴を表わしている。このポリヌクレオチドは、
少なくとも２０パーセントのヌクレオチド位置の比較ウ
ィンドウに亘って、屡々少なくとも２５乃至５０のヌク
レオチドのウィンドウに亘って基準シーケンスと比較し
て、少なくとも８５パーセントの配列同一性、好ましく
は、少なくとも９０乃至９５パーセントの配列同一性、
より一般的には少なくとも９９パーセントの配列同一性
を有する配列からなる。上記配列同一性のパーセンテー
ジは、基準配列を比較のウィンドウに亘って基準配列の
２０パーセント以下に達する欠失又は付加を含むポリヌ
クレオチド配列と比較することにより計算される。基準
配列は、例えば、図３及び４又は図６及び７に示したよ
うな完全な長さのヒトＢａｘポリヌクレオチド配列、或
いは、残基１３６−１５５（ＢＨ１）及び／又は１８７
−２０２（ＢＨ２）に亘る断片のようなヒトｂｃｌ−２
蛋白質のセグメントの如く、より大きい配列のサブセッ
トでも構わない。
【００５７】用語“実質的同一性”をポリペプチドに対
し適用する場合、この用語は、二つのペプチド配列が、
例えば、デフォルトのギャップウェイトを使用するプロ
グラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって最適的に連係
されたとき、少なくとも８０パーセントの配列同一性、
好ましくは少なくとも９０パーセントの配列同一性、よ
り好ましくは少なくとも９５パーセント以上の配列同一
性（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有する
ことを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は
保存的アミノ酸置換による相違がある。
【００５８】保存的アミノ酸置換は類似の側鎖を有する
残基の相互交換可能性に関連する。例えば、脂肪族側鎖
を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリ
ン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族−ヒド
ロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレ
オニンであり；含アミド側鎖を有するアミノ酸の群は、
アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有す
るアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及び
トリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の
群は、リシン、アルギニン、及びヒスチジンであり；含
硫側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオ
ニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は：バリン
−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシ
ン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアス
パラジン−グルタミンである。
【００５９】ここで使用される用語“Ｂａｘ天然蛋白
質”及び“完全な長さのＢａｘ蛋白質”は、以下に示す
如く、１９２アミノ酸、２１８アミノ酸、又は４１アミ
ノ酸の完全な長さのＢａｘのα、β、又はγイソ型に関
連する（図５を参照のこと）。好ましいＢａｘ天然蛋白
質は、図３及び４に示すように推移したアミノ酸配列に
対応するポリペプチド、又は、他の種の同類の完全な長
さのｃＤＮＡの推移したアミノ酸配列に対応する。更
に、例えば、Ｂａｘ遺伝子を発現する自然発生的なリン
パ球に存在する天然Ｂａｘ蛋白質は、完全な長さのＢａ
ｘ蛋白質であると考えられる。
【００６０】ここで使用される用語“断片”は、アミノ
末端及び／又はカルボキシ末端欠失を有するポリペプチ
ドに関連するが、一方、残りのアミノ酸配列は、完全な
長さのｃＤＮＡ配列（例えば、図３及び４に示されたｃ
ＤＮＡ配列）から得られた配列内の対応する位置と一致
している。断片は、典型的には、少なくとも１４個のア
ミノ酸の長さであり、好ましくは、少なくとも２０個の
アミノ酸の長さであり、一般的に、少なくとも５０個以
上のアミノ酸の長さがある。
【００６１】ここで使用される用語“類似体”、“突然
変異蛋白質”又は“突然変異体”は、自然発生的蛋白質
の一部に実質的な同一性を有する少なくとも１０個のア
ミノ酸のセグメントにより構成されるポリペプチドに関
連する。例えば、Ｂａｘ類似体は、例えば、好ましく
は、図３及び４に示したような推移したアミノ酸配列又
は図６及び７に示したような推移したアミノ酸配列であ
り、適当な結合条件下でｂｃｌ−２又は天然Ｂａｘ蛋白
質へ結合する特性の中の少なくとも一つを有するヒト
α、β、又はγ イソ型のようなＢａｘ蛋白質に実質的
な同一性を有する少なくとも１０個のアミノ酸のセグメ
ントにより構成される。典型的には、類似体ポリペプチ
ドは、自然発生的配列に関し保存的アミノ酸置換（或い
は、付加又は欠失）を有する。類似体は、典型的に、少
なくとも２０個のアミノ酸の長さであり、好ましくは、
少なくとも５０個以上のアミノ酸の長さであり、より一
般的には、完全な長さの自然発生的蛋白質（例えば、ヒ
トＢａｘ α、β、及びγ夫々の１９２、２１８、又は
４１アミノ酸残基）と同じ長さである。類似体の中に
は、生物学的活性（例えば、ｂｃｌ−２結合）が欠ける
ものがあるが、それにも係わらず、アフィニティー・ク
ロマトフラフィーによってα−Ｂａｘ抗体を検出及び／
又は純粋化する免疫学的試薬として、或いは、競合又は
非競合性作用物質、拮抗体、又は天然Ｂａｘ蛋白質作用
の部分作用物質として、抗体をＢａｘエピトープに変え
るような種々の用途に利用される。
【００６２】用語“Ｂａｘポリペプチド”は、天然蛋白
質、断片、又はＢａｘの類似体を表わすための一般的な
用語として使用されている。従って、天然Ｂａｘ、Ｂａ
ｘの断片、及びＢａｘの類似体は、Ｂａｘポリペプチド
遺伝子の種である。好ましくは、Ｂａｘポリペプチドに
は：図３及び４に示したマウスのポリペプチド配列によ
って構成されるマウスの完全な長さのＢａｘ蛋白質、図
３及び４に示したポリペプチド配列によって構成される
完全な長さのヒトＢａｘ蛋白質、本質的にヒトＢａｘド
メインＩ又はドメインIIの配列からなるポリペプチド、
及び、自然発生的ヒトＢａｘ α、β、及びγ イソ型
が含まれている。
【００６３】用語“ｂｃｌ−２ ポリペプチド”は、天
然蛋白質、断片、又はｂｃｌ−２の類似体、好ましくは
ヒト又はマウスｂｃｌ−２、一般的にはヒトｂｃｌ−２
を表わすため一般的用語として使用されている。
【００６４】用語“同類”は、種の間で進化的及び機能
的に関係のある遺伝子配列を表わすため使用されてい
る。その例に限定されることのない例として、ヒトゲノ
ムの場合、ヒトＣＤ４遺伝子は、マウスＣＤ４と同類の
遺伝子であり、上記二つの遺伝子の配列及び構造は、両
者が非常に相同的であり、両方の遺伝子は、ＭＨＣクラ
スII−制限された抗原認識を介してＴ細胞の活性を通知
する際に機能する蛋白質をエンコードする。従って、マ
ウスＢａｘ遺伝子と同類のヒト遺伝子は、マウスＢａｘ
蛋白質に最大の配列同一性の程度を有し、（例えば、リ
ンパ球に発現された）マウスＢａｘの発現パターンと類
似した発現パターンを示す発現された蛋白質をエンコー
ドするヒト遺伝子である。好ましくは、同類Ｂａｘ遺伝
子は：ラットＢａｘ、ウサギＢａｘ、イヌＢａｘ、非ヒ
ト霊長類Ｂａｘ、ブタＢａｘ、ウシＢａｘ、及びハムス
ターＢａｘである。
【００６５】用語“作用物質”は、化学化合物、化学化
合物の混合物、生物高分子、或いは、バクテリア、植
物、カビ、又は動物（特に哺乳類）の細胞又は組織のよ
うな生物材料から生成された抽出物を表わすため使用さ
れている。作用物質は、以下に説明するスクリーニング
検定への封入によって抗腫瘍性又はアポプトシスの変調
器としての潜在的活性を評価される。
【００６６】用語“抗腫瘍性作用物質”は、ヒトにおけ
る新生物の発生又は進行、特に、リンパ性白血病、リン
パ腫又は前−白血病状態を抑制する機能的特性を有する
作用物質を表わすため使用される。
【００６７】使用されている用語“標識”又は“標識化
された”は、例えば、放射標識化されたアミノ酸の取込
み、又は、マークされたアビジン（例えば、光学的又は
熱量測定方法によって検出可能な蛍光マーカー又は酵素
的活性を含有するストレプトアビジン）によって検出し
得るビオチニル部分のポリペプチドへの付着による検出
可能なマーカーの取込みを表わしている。ポリペプチド
と糖蛋白を標識化する種々の方法は従来技術において周
知であり、使用することが可能である。ポリペプチドの
標識の限定されない例の中には：放射性同位元素（例え
ば、3 Ｈ、14Ｃ、35Ｓ、125 Ｉ、131 Ｉ）、蛍光標識
（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光
体）、酵素的標識（例えば、ホースラディッシュ ペル
オキシダーゼ、β−ガラクトダーゼ、ルシフェラーゼ、
アルカリ性ホスファターゼ）、ビオチニル基、二次リポ
ータによって認識された所定のポリペプチドエピトープ
（例えば、ロイシン ジッパーのペア配列、二次抗体用
の結合部位、金属結合部、エピトープタグ）が含まれて
いる。ある実施例において、標識は潜在的な立体障害を
除去するため種々の長さのスペーサーアームによって付
着させられる。
【００６８】ここで使用されているように“実質的な純
粋”とは、対象の種は支配的に存在する種（即ち、分子
ベースで化合物内の他の個々の種よりも多量に発生的）
であり、好ましくは、実質的に純粋化された部分は化合
物であり、ここで、対象の種は存在する全高分子の種の
中の少なくとも（分子ベースで）約５０パーセントから
なる。一般的に、実質的に純粋な化合物は、化合物中に
存在する全高分子種の中の８０乃至９０パーセントより
も多くの種からなる。最も好ましくは、対象の種は本質
的な均質性に純粋化される（不純物の種は、従来の検出
法によって化合物内で検出し得ない）。
【００６９】“正常血液”又は“正常なヒトの血液”
は、能動的な腫瘍形成疾患、或いは、他のリンパ球増殖
の疾病、或いは、腫瘍形成疾患を発生する同定された疾
病素質のない健康なヒトの個体からの血液を表わすため
使用されている。同様に、“正常細胞”、“正常細胞の
標本”、“正常組織”、及び“正常リンパ節”は、能動
的な腫瘍形成疾患又は他のリンパ球増殖性疾病のない健
康なヒトの個体から得られた夫々の標本を表わしてい
る。
【００７０】ここで使用されている用語“疾病特徴的な
濃度”、“疾病特徴的な量”、及び“疾病特徴的な染色
パターン”は、リンパ性白血病のような腫瘍形成疾患の
発生に関する病理的（例えば、腫瘍形成）条件又は疾病
素因の存在を示すサンプル内のＢａｘ蛋白質又はｍＲＮ
Ａの濃度、量、又は局在パターンを夫々表わしている。
疾病特徴的な量は、予想的及び／又は回想的な統計的臨
床研究によって確立された正常な臨床値の範囲を外れた
細胞又は細胞のサンプル内のＢａｘ蛋白質又はＢａｘ
ｍＲＮＡの量を表わしている。一般的に、腫瘍形成疾患
（例えば、リンパ性白血病）を有する個体は、細胞、又
は、正常な無病の個体を表わす濃度の範囲外にある組織
標本内のＢａｘ蛋白質又はｍＲＮＡの量を示し；典型的
には、疾病特徴的な濃度は、平均正常値から少なくとも
１標準偏差外側であり、より一般的には、平均正常値の
周りで少なくとも２標準偏差以上外側にある。しかし、
本質的に全ての臨床的診断テストは、偽陽性と偽陰性の
あるパーセンテージを生成する。診断的検定の感度及び
選択性は、診断目的と関連する調節の要求を十分に満足
させる必要がある。一般的に、本発明の診断方法は、疾
病の候補として個体を同定するため使用され、有能な健
康専門家によって作成された特異な疾病診断の付加的パ
ラメータが得られる。
【００７１】製造者によって提供された仕様に従ってア
プライド バイオ システムズ(Applid Bio Systems)の
オリゴヌクレオチド合成器でオリゴヌクレオチドを合成
することが可能である。
【００７２】ＰＣＲ増幅の方法は、ここに引用された従
来の（1992年にニューヨーク州ニューヨークのフリーマ
ンプレスから発行されたエリック編のＰＣＲ技術：ＤＮ
Ａ増幅の原理と応用 (PCR Technology: Principles an
d Applications for DNA Amplification ed. HA Erlic
h, Freeman Press, New York, NY (1992))、1990年にカ
リフォルニア州サンディエゴのアカデミックプレスから
出版されたインニス、ゲルフランド、スニスキー、及び
ホワイト編のＰＣＲプロトコル：方法と応用へのガイド
(PCR Proocols: A Guide to Methods and Applicatio
ns, eds. Innis, Gelfland, Snisky, and White, Acade
mic Press, San Diego, CA (1990))、1991年発行のマッ
ティラ他による核酸研究、第19号、4967ページ(Mattila
et al.(1991)Nucleic Acids Res. 19: 4967) 、1991
年発行のエッカートとクンケルによるＰＣＲの方法と応
用、第 1号、17ページ(Eckert, K.A. and Kunkel, T.A.
(1991) PCR Methods and Applications 1: 17)、オ
ックスフォードのＩＲＬプレスから出版されたマックフ
ァーソン、キルケス、テイラー編のＰＣＲ(PCR, eds. M
cPherson, Quirkes, and Taylor, IRL Press, Oxford)
と、米国特許第4,683,202 号明細書）に記載されてい
る。
【００７３】多数の成人細胞の発生と維持は、細胞増
殖、分化及びプログラムされた細胞死を含む幾つかの動
的に調節された処理によって実現される。後者の処理の
場合、細胞は、アポプトシスという名前の非常に特徴的
な自己不活化プログラムによって除去される。
【００７４】ｂｃｌ−２は濾胞性Ｂ細胞リンパ球を産出
するｔ（１４；１８）の染色体切断点で最初に分離され
た。上記転座を反復発生するｂｃｌ−２−Ｉｇミニ遺伝
子を産出する遺伝子導入マウスは、静止Ｂ細胞の四分増
加と共に多クローン性濾胞性増生を示し、上記Ｂ細胞
は、増加した増殖よりはむしろ延長した細胞生残のため
蓄積する。
【００７５】成人細胞の研究によって、ｂｃｌ−２は多
数の細胞結合において幾つかの役割を果たすことが分か
った。ホルモン性刺激又は成長因子に反応して増生又は
退縮をうける腺上皮は、ｂｃｌ−２を発現する。皮膚及
び腸管のような複合上皮の場合、ｂｃｌ−２は幹細胞と
増殖ゾーンに制限されている。成人神経系内で、ｂｃｌ
−２は、中枢神経系よりも末梢神経系においてより顕著
である。従って、ｂｃｌ−２は、多数の細胞結合におい
て、始原及び長寿細胞を節約するため必要である。
【００７６】ｂｃｌ−２の生理的機能の確立の進展にも
係わらず、ｂｃｌ−２の機能の生化学的基礎は本発明に
至るまで不明瞭なままである。レーザー走査共焦顕微鏡
で検査された細胞の２重の蛍光染色は、Ｂ細胞系内のｂ
ｃｌ−２蛋白質はミトコンドリアの分布と併発したこと
を示している。亜細胞分画の研究により、大多数のｂｃ
ｌ−２は、一体的なミトコンドリア膜細部として局在化
され、ｂｃｌ−２はエネルギー生成に関係のあるミトコ
ンドリアの機能を変更し得ることが示唆される。しか
し、ｂｃｌ−２は、ミトコンドリアＤＮＡのない線維芽
細胞内の細胞死を阻止することができた。
【００７７】ｂｃｌ−２は、幾つかの亜細胞位置で機能
することが分かるが、しかし、生化学的機能に関連する
周知のモティーフ(motif) を欠いている。予想外ではあ
るが、ｂｃｌ−２は生体内で、Ｂａｘという名前の２１
ｋＤの蛋白質パートナーと関連することが分かった。Ｂ
ａｘは、ｂｃｌ−２と広範のアミノ酸相同性を示し、そ
れ自体とホモダイマーを形成し、生体内でｂｃｌ−２と
ヘテロダイマーを形成する。Ｂａｘは６個の構造配列に
よってエンコードされ、２１ｋｄの膜（α）と、細胞質
ゾル蛋白質の二つの形態（β及びγ）を予測する交代Ｒ
ＮＡスプライシングの複雑なパターンの例を示してい
る。Ｂａｘが優先する場合、プログラムされた細胞死は
加速され、ｂｌｃ−２の死抑制体活性は抑えられる。
【００７８】本発明によれば、共通のイムノ沈澱処理
は、ｂｃｌ−２と関連した新規の蛋白質Ｂａｘを同定す
るため使用された。Ｂａｘは、特に、二つの非常に保存
された領域内でｂｃｌ−２と広範囲に亘る相同性を共有
することが分かることは全く予想されなかった。上記領
域は、ヒト、マウス、ニワトリのｂｃｌ−２の中で最も
良く保存された領域である。上記領域は、エプスタイン
−バーウイルスと、フォルボールエステルとの誘導に続
いて骨髄性白血病細胞系から最後に分離された遺伝子Ｍ
ｃｌ−１の中でオープンリーディングフレームＢＨＲＦ
−１内に保存されている（コゾパス(Kozopas)他の1993
年の文献）。従って、ｂｃｌ−2 のような遺伝子の明瞭
な族が現れ、単一の死の経路、又は、平行の死の経路の
レギュレータの連続的な番号である可能性がある。
【００７９】上記の如く、Ｂａｘは生体内ｂｃｌ−２と
ホモダイマー化又はヘテロダイマー化する。上記相互作
用の正確な多重度は完全には知られていないが、保存さ
れたドメインＩ及びIIはダイマー化モティーフの領域で
ある。Ｂａｘαは、膜スパンニングであると予測される
ＣＯＯＨ−末端疎水性セグメントを有し、ｂｃｌ−２と
同様の二次構造を有する。従って、二つの蛋白質は同一
の方向で同じ膜に挿入される可能性がある。しかし、共
通挿入は、ｂｃｌ−２のΔＣ−２２細胞質ゾル形態は、
膜から溶解させられた場合、依然としてＢａｘαを共沈
させる点で、会合のため必要とされない。ｂｃｌ−２の
ΔＣ−２２は細胞を死から部分的に保護するので、ｂｃ
ｌ−２／Ｂａｘ相互作用の重要性は更に強調される。そ
の上、ＦＬ５．１２細胞を使用した結果によって、Ｂａ
ｘのホモダイマー化はｂｃｌ−２とのヘテロダイマー化
よりも好ましいことが示されている。導入されたＨＡ−
Ｂａｘαの大多数は、ＦＬ５．１２細胞内の適度な量の
内因性ｂｃｌ−２よりもむしろ内因性Ｂａｘαとダイマ
ー化することが分かった。上記細胞内のｂｃｌ−２の過
剰な発現は、Ｂａｘのホモダイマー化と競合し、ＨＡ−
Ｂａｘα及び内因性Ｂａｘαとホモダイマーを形成す
る。
【００８０】ＲＮＡスプライシングの複雑さは、上記の
点でＢａｘ活性と局在化の重要な差動レギュレータであ
ることが分かる。予想されたＢａｘの膜α及び細胞質ゾ
ルβの形態は、ｂｃｌ−２のα一体膜形態及び予想され
たβ細胞質ゾルの形態と並行している。α及びβＲＮＡ
に寄与する構造配列／介在配列の連結は進化的に保存さ
れるので、２４ｋＤのＢａｘβ蛋白質の存在は明らかで
あると考えられる。これと整合して、ＲＬ−７細胞は、
ｂｃｌ−２と関連した２４ｋＤの蛋白質を示し、１．５
ｋｂのβＲＮＡを有し、一方、ＦＬ５．１２細胞は両方
を欠く。細胞質ゾルＢａｘβは、Ｂａｘ及びｂｃｌ−２
の一体膜形態とホモダイマー化又はヘテロダイマー化す
ることにより付加的な調節レベルを提供することが可能
である。Ｂａｘ ＲＮＡのγ形態によって切形されたγ
蛋白質が得られ、或いは、完全な長さの生成物の生成を
避けるためスプライシング戦略を表わすことが可能であ
る。
【００８１】ｂｃｌ−2/Ｂａｘの比は、アポプトシス性
刺激に続く死に対する細胞の感受性を判定することが分
かった。ＩＬ−３が存在する場合、過剰発現されたＢａ
ｘは正常細胞の分割又は生存度を著しく変えることはな
い。Ｂａｘが存在し、成長因子の欠乏の前にｂｃｌ−２
と会合させられる。その上、ＦＬ５．１２細胞内のｂｃ
ｌ−２／Ｂａｘの比は、ＩＬ−３の欠乏後、１２時間は
実質的に変えられない。ＢａｘのＲＮＡは、死誘発信号
の前に正常細胞内及び多数の細胞系内で発現させられ
る。従って、Ｂａｘの合成は、死の刺激に続く新規の応
答であるようには見えず、Ｂａｘ自体は、ＩＬ−３の欠
乏のような死の信号に続く場合に限りアポプトシス的な
細胞死を加速させる。過剰なＢａｘはｂｃｌ−２の死抑
制体活性を抑止する。ｂｃｌ−２が過剰にあるとき、細
胞は保護される。しかし、Ｂａｘが過剰にあり、Ｂａｘ
ホモダイマーが支配的であるとき、細胞はアポプトシス
に感受性がある。
【００８２】ｂｃｌ−２の単一のアミノ酸置換はｂｃｌ
−２／Ｂａｘヘテロダイマーを除去するが、ｂｃｌ−２
ホモダイマーを除去せず、死抑制体活性を破壊する。以
下説明するように、ｂｃｌ−２の始原癌遺伝子は、多数
の細胞タイプ内の多数の信号によって誘発されたアポプ
トシスを阻害する。ｂｃｌ−２分子の一つの保存された
領域、ドメインＩ内の単一のアミノ酸置換と同様に少数
である蛋白質の突然変異体は、更に、その死抑制体活性
を除去する。変異したｂｃｌ−２は、因子の欠乏、糖質
コルチコイド治療、又はガンマ線照射によって誘発され
た細胞死をそれ以上阻止しない。ｂｃｌ−２突然変異体
は、これ以上機能せず、これ以上Ｂａｘとヘテロダイマ
ー化せず、過剰に発現されたとき、プログラムされた細
胞死を加速する。ｂｃｌ−２のドメインII内の突然変異
体は、その死抑制体活性を部分的に崩壊し、対応して、
Ｂａｘとのヘテロダイマー化を部分的に阻害する。しか
し、突然変異体ｂｃｌ−２は、依然として野性型ｂｃｌ
−２と共にホモダイマーを効率的に形成する。上記結果
は、保存された配列、特にドメインＩの重要性と、ｂｃ
ｌ−２とＢａｘのヘテロダイマー化におけるその役割を
表わしている。更に、上記ドメインは、Ｂｃｌ−ｘ、Ｍ
ＣＬ−１、ＬＭＷ５−ＨＬ及びＢＨＲＦ１を含む他のｂ
ｃｌ−２の系統群メンバー内にホモ及びヘテロダイマー
化の形成を指令する際に助けになるように思われる。現
在のデータは、ヘテロダイマー化によって蛋白質Ｂａｘ
を加速する死を中和することによりｂｃｌ−２が機能す
るモデルをサポートする。ｂｃｌ−２／Ｂａｘヘテロダ
イマーを崩壊する治療法は、細胞死を促進する際に非常
に効果的であることが分かる。
【００８３】幾つかの機械論的可能性は上記蛋白質−蛋
白質相互作用の調節の役割を説明すると考えられる。Ｂ
ａｘはｂｃｌ−２によって中和された死効果器分子とし
て機能する可能性がある。上記説明において、ｂｃｌ−
２はＢａｘホモダイマーの形成を崩壊する不活性の手錠
に過ぎない。或いは、ｂｃｌ−２はＢａｘに全く対抗す
る生化学的機能を有する場合がある。一方、ｂｃｌ−２
は不活性Ｂａｘ分子との競合によって中和された死抑制
体分子として機能する。何れにしても、ヘテロダイマー
を介して互いに競合するＢａｘとｂｃｌ−２の能力によ
って、ｂｃｌ−２モノマー又はホモダイマーは生残を優
先する傾向があり、Ｂａｘホモダイマーは死滅を優先す
る傾向がある相互関係が示されている。
【００８４】哺乳類細胞は、屡々、成長及び生残因子又
は細胞−細胞接触分子を含む細胞外環境に依存する。早
期造血細胞系ＦＬ５．１２の生残及び増殖のためのＩＬ
−３への依存性は典型的な一例である。しかし、多数の
生物学的系統は、同一結合内の細胞は一定の死刺激に対
し遺伝的感受性又は耐性を有することを示している。例
えば、ＣＤ４+ ８+ 皮質胸腺細胞は糖質コルチコイド誘
発アポプトシスに感受性があり、より多くの成熟延髄胸
腺細胞は耐性がある。この差動的感受性は、ｂｃｌ−２
蛋白質の存在と相関する。ｂｃｌ−２／Ｂａｘ相互作用
は、アポプトシスの感受性の一つの内因性調節を表わし
ている。この発見は、細胞の死信号への反応がｂｃｌ−
２／Ｂａｘの比のような予め設定されたメカニズムによ
って決められるモデルを示唆している。
【００８５】上記相互作用に起因して、例えば、蛋白質
抗原特性に関し、組織又は器官分離手術、或いは、免疫
化学的技術からの切片内のＢａｘ又はｂｃｌ−２の検出
及び判定に本発明を使用することが可能である。上記蛋
白質で動物の免疫に特異抗体を形成することが可能であ
る。ｂｃｌ−２に対する単クローン性抗体が既に存在す
ることは周知である。
【００８６】上記目的のため利用される抗血清は、通常
の処理によって得られる。一つの例示的な処理には、Ｂ
ａｘに対する多クローン性抗体の形成を誘発するラビッ
トのような哺乳動物の免疫が含まれる。単クローン性抗
体は、既に免疫化されたハムスターから生成される。こ
の抗体はＢａｘ蛋白質の有無とレベルを検出するため使
用することが可能である。
【００８７】更に、放射線免疫測定法又は酵素免疫測定
法である標準検定及びマーカーを使用する検定によるＢ
ａｘ、ｂｃｌ−２、それらの対合の免疫学的検出のため
上記蛋白質を使用し得る。
【００８８】Ｂａｘ及び／又はｂｃｌ−２の検出及び判
定は、重要な診断的意味がある。例えば、死効果器分子
を好発する蛋白質の検出は、癌治療、肥大の制御、自己
免疫における自己反応性クローンの除去に利点がある。
死抑制体分子を好発する蛋白質の検出又は判定は、ＨＩ
Ｖ−Ｉ、II及びIIIを含む免疫不全疾患と、神経性変性
及び虚血性細胞死に利点がある。従って、上記蛋白質と
それらの抗体は、病気の進行の監視、検査又は検出のた
めマーカーとして利用される。
【００８９】更に詳細に言うと、蛋白質Ｂａｘは、細胞
成長の監視、或いは、病気の進行の検出又は監視のた
め、蛋白質又はその関連した蛋白質ｂｃｌ−２の検出及
び判定の免疫化学的方法を行なうため使用される。蛋白
質Ｂａｘは、更に、神経性変形疾患、又は、免疫不全
症、或いは、心筋梗塞及び神経発作のような損傷によっ
て誘発された虚血の治療方法として使用することが可能
であり、上記方法は、過剰な量のｂｃｌ−２を生成する
ことにより細胞の生残を促進させるべくＢａｘに対する
ｂｃｌ−２の比を調節するため有効な量の化合物を患者
に投与する段階からなる。
【００９０】増生、肥大、癌及び自己免疫性疾患の治療
方法は：Ｂａｘ蛋白質を好発し、細胞死を促進すべくＢ
ａｘに対するｂｃｌの比を調節するため有効な量の化合
物を患者に投与する段階からなる。
【００９１】Ｂａｘ蛋白質と化合物の特定の試料は、薬
学試料の投与用に調製される。かかる調製は製薬の当業
者に周知の種々の方法で行なうことが可能である。
【００９２】Ｂａｘとｂｃｌ−２の厳密な化学的構造
は、多数の因子に依存していることが分かる。例えば、
イオン化可能なアミノ基及びカルボキシル基が分子内に
存在しているので、酸又は塩基として、或いは、中性の
形で特定の蛋白質が得られる。本発明の目的のため治療
的活性を維持するＢａｘのあらゆる形は、Ｂａｘの定義
の範囲内で予定されている。
【００９３】用語“組換”は、組換えＤＮＡ技術によっ
て生成されたＢａｘ及びｂｃｌ−２を表わすため使用さ
れ、ここで、蛋白質のための遺伝子コーディングは、周
知の組換えＤＮＡ技術によって複製される。例えば、Ｂ
ａｘのヒト遺伝子は、適当な宿主を転換するため使用さ
れるバクテリア核外遺伝子のような適当なＤＮＡベクタ
ーに挿入される。遺伝子は、組換え蛋白質を生成するた
め宿主内で発現される。転換された宿主は、哺乳動物、
酵母、コウジカビ属及び昆虫細胞を含む真核生物又は原
核生物である。好ましい一実施例によれば、バクテリア
細胞が宿主として採用されている。
【００９４】治療的に有効なＢａｘの誘導体は、蛋白質
の主アミノ酸配列を、グルコース成分、脂質、リン酸塩
基、アセチル基、ヒドロキシル基、サッカリド、メチル
基、プロピル基、アミノ酸、及びポリマー分子からなる
群より選択された少なくとも一つの付加分子で増強する
ことによって調製される。増強は、宿主生成の後−翻訳
的処理系統によって実行され、生体内で行なってもよ
い。両技術とも従来より周知である。
【００９５】Ｂａｘの配列記述を参照するに、ペプチド
は幾つかの潜在的な糖鎖形成部位を有する点に注意が必
要である。糖鎖形成は蛋白質誘導体を形成する処理であ
り、蛋白質のアミノ酸配列の一部分は、糖成分によって
増強される。従って、治療的に有効なＢａｘの誘導体
は、少なくとも一つの糖残基を蛋白質に添加し、或い
は、Ｂａｘ分子上の糖鎖形成部位から糖残基の一部又は
全部を除去することにより調製されることが分かる。
【００９６】治療的に有効な他のＢａｘの誘導体は、酸
化、還元、或いは、それ以外の従来技術において周知の
誘導化処理によってＢａｘ又はｂｃｌ−２の少なくとも
一つのアミノ酸残基を修飾することにより形成される。
【００９７】蛋白質の活性を修飾するＢａｘ及びｂｃｌ
−２の突然変異体は、本発明の能動的処置物質として使
用される。突然変異蛋白質は、翻訳中に配列内に組み込
まれたアミノ酸の欠失、付加、変更によって蛋白質自体
の主構造を修飾することにより調製される。例えば、ド
メインI内のＢａｘ又はｂｃｌ−２の少なくとも一つの
グリシン残基は、アラニン又はグルタミン酸のようなア
ミノ酸で置換してもよい。更に、蛋白質の生物活性を除
くためｂｃｌ−２ドメインＩのＦＲＤＧ又はＷＧＲ配列
のようなアミノ酸の群を除去又は置換することが望まし
い。
【００９８】Ｂａｘ及びｂｃｌ−２は、二つの同一の非
共有結合形に結合された蛋白質サブユニットのダイマー
として天然に存在することが分かっている。従って、各
サブユニットは配列番号１及び２に示したアミノ酸配列
を有することが考えられるので、本発明によれば、Ｂａ
ｘ又はｂｃｌ−２のサブユニットは、治療的な活性又は
診断的な物質として使用することが可能である。更に、
本発明は、天然、又は、従来の人工的な技術の何れかで
共有結合形、又は、非共有結合形に結合された蛋白質の
サブユニットの使用法を含んでいる。
【００９９】その上、Ｂａｘ及びｂｃｌ−２の断片は、
治療的な活性を維持するならば、本発明において有用で
あると考えられる。
【０１００】図８のドメインＩ及びドメインIIのアミノ
酸残基によって画成された断片は、本発明の目的のため
治療的に活性があると考えられる。上記残基によって画
成された断片が治療的に活性があると考えられる理由
は：その断片はジスルフィド染色体橋を含まない直線状
配列であり、細胞死を阻止するためのキーであると見な
されるからである。
【０１０１】上記Ｂａｘ及びｂｃｌ−２の形態は、患者
の中に既に存在するＢａｘとｂｃｌ−２のレベルに依存
して変化する有効な治療的量で使用され、投与の部位及
び方法、利用される蛋白質の形態、及びその他の因子
は、当業者に理解されている。
【０１０２】Ｂａｘポリヌクレオチドのクローン化 Ｂａｘをエンコードするゲノミック又はｃＤＮＡクロー
ンは、図３及び４と図６及び７に示したヌクレオチド配
列に基づいて設計された交雑プロープを用いて、及び、
従来の交雑スクリーニング法（例えば、1977年に発行さ
れたベントンとディビスによるサイエンス誌、第196
号、180 ページ(Benton WD and Davis RW(1977) Scienc
e 196: 180) と、1989年に発行されたグッドスピード
他による遺伝子、第76号、1 ページ(Goodspeed et al.
(1989) Gene 76: 1)を参照のこと）を用いてクローン
ライブラリー（例えば、カリフォルニア州パロアルトの
クロンテック(Clontech)から入手可能）から分離され
る。ｃＤＮＡクローンが望ましい場合、リンパ球ｍＲＮ
Ａ又は他のＢａｘ−発現細胞ｍＲＮＡから得られたｃＤ
ＮＡを含有するクローンライブラリが好ましい。或い
は、図３及び４と図６及び７に示された配列の全部又は
一部に対応する合成ポリヌクレオチド配列は、オリゴヌ
クレオチドの化学合成によって構成される。その上、図
３及び４と図６及び７に開示された配列データに基づい
てプライマーを用いる重合酵素鎖反応（ＰＣＲ）は、ゲ
ノミックＤＮＡ、ｍＲＮＡプール、又は、ｃＤＮＡクロ
ーンライブラリからのＤＮＡ断片を増幅するため使用さ
れる。米国特許第4,683,195 号及び第4,683,202 号には
ＰＣＲ法が記載されている。更に、図３及び４に開示さ
れた配列データに基づく一つのプライマーと、上記配列
データには基づかない第２のプライマーを利用するＰＣ
Ｒ法を使用してもよい。例えば、ポリアデニル化セグメ
ントに相同的、或いは、相補的な第２のプライマーを使
用してもよい。
【０１０３】ヌクレオチド置換、欠失、及び付加を本発
明のポリヌクレオチドに組み込んでもよいことは当業者
にとって明らかである。ヌクレオチド配列変化は、種々
のＢａｘ対立遺伝子、小さい配列化誤差等の配列多形現
象から生じる。しかし、上記ヌクレオチド置換、欠失、
及び付加は、特定の交雑を得るため十分にストリンジェ
ントな交雑化条件下で図３及び４又は図６及び７に示さ
れたポリヌクレオチドがポリヌクレオチド配列の一つに
交雑する能力を実質的に崩壊するべきではない。
【０１０４】特定の交雑は、プローブのヌクレオチド
（例えば、置換、欠失、及び／又は付加を含む本発明の
ポリヌクレオチド）と特定の標的ポリヌクレオチド（例
えば、図３及び４又は図６及び７の配列を有するポリヌ
クレオチド）との間の交雑の形式として定義され、ここ
で、上記プローブは、好ましくは、例えば、Ｂａｘ
（α、β又はγ）の交互にスプライスされたｍＲＮＡ種
の少なくとも一つのイソ型に対応する単一結合が適当な
細胞源（例えば、Ｔ又はＢ細胞発現Ｂａｘ）から調製さ
れたＲＮＡのノーザンブロット上で同定できるように、
特定の標的と交雑する。本発明のポリヌクレオチドと、
組換え的に生成されたＢａｘと、それらの断片又は類似
体は、従来技術において周知であり、以下の文献に記載
された方法に従って図５と、図６及び７に与えられた配
列データに基づいて調製される。参考のため引用する上
記文献は、1989年にニューヨークのコールドスプリング
ハーバーで発行されたマニアティス他による分子クロー
ニング：実験室マニュアル、第２版(Maniatis et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.,
(1989), Cold Spring Harbor, N.Y. ) と、1987年にカ
リフォルニア州サンディエゴのアカデミックプレス社か
ら発行されたバーガーとキムメルによる酵素学の方法、
第152 巻、分子クローニング法入門(Berger and Kimme
l, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Mol
ecular Cloning Techniques (1987), AcademicPress, I
nc., San Diego, CA) である。
【０１０５】Ｂａｘポリヌクレオチドは、交雑化プロー
ブ及びＰＣＲ（又はＬＣＲ）プライマーとして使用する
ような短いオリゴヌクレオチド（例えば、２５−１００
個の塩基長）である。Ｂａｘポリヌクレオチド配列は、
より長いポリヌクレオチド（例えば、Ｂａｘクローンか
らなるクローン化ベクター）の一部分から構成され、ポ
リヌクレオチド結合によって、融合蛋白質の発現をエン
コードする別の蛋白質（例えば、グルタチオン Ｓ−ト
ランスフェラーゼ、又は、β−ガラクトシダーゼ）をエ
ンコードする別のポリヌクレオチド配列とフレーム内で
融合される。典型的に、Ｂａｘポリヌクレオチドは、自
然発生的なＢａｘ配列（例えば、図３及び４を参照のこ
と）と実質的に一致する少なくとも２５個の連続的なヌ
クレオチドにより構成され、より一般的には、Ｂａｘポ
リヌクレオチドは、自然発生的なＢａｘ配列と実質的に
一致する少なくとも５０乃至１００個の連続的なヌクレ
オチドにより構成される。しかし、Ｂａｘ標的配列への
特定の交雑化に必要とされるＢａｘポリヌクレオチドの
最小長は、特に以下の幾つかの因子：Ｇ／Ｃ含量、一致
しない塩基の位置（存在する場合）、標的ポリヌクレオ
チドの個体群と比較した配列の固有性の程度、及び、ポ
リヌクレオチドの化学的性質（例えば、ホスホン酸メチ
ルのバックボーン、ホスホロチオラート等）に依存して
いることが当業者によって認められるであろう。
【０１０６】望まれるならば、実質的に完全な長さのｃ
ＤＮＡコピーを増幅するＰＣＲアンプリマー(amplimer)
は、当業者の考えで選択してもよい。同様に、単一のＢ
ａｘ構造配列、又は、Ｂａｘ遺伝子（マウス又はヒト）
の一部分を増幅するアンプライマーが選択される。
【０１０７】上記配列の各々は、例えば、リンパ球内の
増大又は減少したＢａｘ ｍＲＮＡレベルの存在によっ
て表わされるリンパ球増殖性疾患の診断用、或いは、組
織分類の実行用（即ち、Ｂａｘ ｍＲＮＡの発現によっ
て表わされた細胞を同定する）等のようなＢａｘ ｍＲ
ＮＡの存在を検出する交雑化プローブ又はＰＣＲアンプ
ライマーとして使用される。上記配列は、法医学のＤＮ
Ａ分析用（例えば、ＲＦＬＰ分析、ＰＣＲ生成物の長さ
分布等による）、或いは、Ｂａｘ遺伝子の増幅及び／又
は再配列によって表わされた疾病の診断用のようなＤＮ
Ａ標本内のゲノミックＢａｘ遺伝子配列を検出するため
使用される。
【０１０８】Ｂａｘポリペプチドの生成 図３及び４と、図６及び７に示されたヌクレオチドとア
ミノ酸の配列によって、当業者は、完全な長さのヒト及
びマウスのＢａｘポリペプチド配列の全部又は一部に対
応するポリペプチドを生成し得るようになる。上記ポリ
ペプチドは、Ｂａｘをエンコードするポリヌクレオチ
ド、或いは、それらの断片及び類似体の発現によって、
真核又は原核宿主細胞に生成される。或いは、上記ポリ
ペプチドを、化学的方法によって合成してもよく、又
は、翻訳を指図するためポリヌクレオチドのテンプレー
トを使用する生体外翻訳系統によって生成してもよい。
組換え宿主内の非相同蛋白質の発現方法、ポリペプチド
の化学合成方法、及び、生体外翻訳法は、従来技術にお
いて周知であり、1989年にニューヨークのコールドスプ
リングハーバーで発行されたマニアティス他による分子
クローニング：実験室マニュアル、第２版(Maniatis et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd
Ed., (1989), Cold Spring Harbor, N.Y.)と、1987年に
カリフォルニア州サンディエゴのアカデミックプレス社
から発行されたバーガーとキムメルによる酵素学の方
法、第152 巻、分子クローニング法入門(Berger and Ki
mmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to
Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Pres
s, Inc., San Diego, CA) に記載されている。
【０１０９】Ｂａｘの断片又は類似体は当業者によって
調製される場合がある。好ましくは、Ｂａｘの断片又は
類似体のアミノ−又はカルボキシ−末端は、機能的なド
メインの境界付近に発生する。その例に限定されること
のない一例によれば、上記機能的なドメインには、ｂｃ
ｌ−２ポリペプチドに結合特性を与えるドメインと、
（２）Ｂａｘポリペプチドに結合特性を与えるドメイン
とが含まれる。
【０１１０】構造的かつ機能的なドメインが同定される
一方法は、図３及び４又は図６及び７に示されたヌクレ
オチド及び／又はアミノ酸配列データを公開又は閉鎖的
な配列データベースと比較することからなる。好ましく
は、計算機化された比較方法は、配列モティーフ、或い
は、ドメインＩ又はドメインIIのような周知の構造及び
／又は機能からなる他の蛋白質に発生する予想蛋白質配
列ドメインを同定するため使用される。例えば、脱水素
酵素、特に乳酸脱水素酵素、及びリンゴ酸脱水素酵素
は、配列的に類似し、相同的に検出され得るアミノ酸配
列を有する（1984年にニューヨークのダブリュー エイ
チ フリーマン アンド カンパニーから出版されたク
レイトン編による蛋白質、構造と分子的原理(Proteins,
Structures and Molecular Principles, (1984) Creig
hton (ed.), W.H. Freeman and Company, New York)を
参考のため引用する）。
【０１１１】更に、図３及び４又は図６及び７に示され
た配列の既存の配列データベースとの計算機化された比
較は、他の蛋白質、又は、Ｂａｘ蛋白質の類似したドメ
インを示すコーディング配列内に発見された配列モティ
ーフ及び構造的配列を同定することが可能である。その
例に限定されることのない一例によれば、ウィスコンシ
ン ジェネティックス ソフトウェア パッケージ（ウ
ィスコンシン州マディソンの５７５ サイエンス Ｄ
ｒ．にあるジェネティックス コンピュータ グループ
(Genetics Computer Group) ）のプログラムＧＡＰ、Ｂ
ＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＦＡは、Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ／ＥＭＢＬのようなデータベース内でＢａｘ配
列と相同性のある領域を有する配列を同定するため使用
することが可能である。上記相同性領域は候補の構造的
又は機能的ドメインである。或いは、配列データから上
記ドメインを同定する他のアルゴリズムが得られる。更
に、ハードウェア又はソフトウェアの何れに組み込まれ
たかには係わらず、（１）関係する蛋白質配列とヌクレ
オチド配列を同定し、（２）Ｂａｘポリペプチド内に構
造的又は機能的ドメインを定義するため、ニューラルネ
ットワーク法を使用してもよい（1991年に発行されたブ
ルナック他の分子生物学ジャーナル、第220 号、49ペー
ジ(Brunak et al. (1991) J. Mol. Biol. 220: 49)を
参考のため引用する）。
【０１１２】実質的に少なくとも一つの機能的ドメイン
からなる断片又は類似体は、非相同ポリペプチドに融合
してもよく、得られた融合蛋白質は、Ｂａｘ断片によっ
て与えられた機能的特性を示す。或いは、少なくとも一
つの機能的ドメインが削除されたＢａｘポリペプチドは
失った断面により通常与えられた特性の損失を示す。
【０１１３】その例に限定されることのない例として、
ｂｃｌ−２に結合特性を与えるドメインは、結合反応中
に免疫化されたｂｃｌ−２ポリペプチドを結合し、色素
産生性基質を染色体に酵素的に変換し得る融合蛋白質を
生成するためβ−ガラクトシダーゼに融合される。
【０１１４】好ましい実施例の中の一つのクラスは、機
能的ドメイン境界付近のアミノ酸位置に対応するアミノ
−及び／又はカルボキシ−末端を有する断片であるが、
それ以外のＢａｘ断片を調製してもよい。上記断片のア
ミノ−及びカルボキシ−末端の選択は、当業者の考え次
第であり、構造の簡単化、蛋白質分解に対する安定性、
熱的安定性、免疫学的反応性、アミノ−又はカルボキシ
ル末端残基修飾、或いは、その他の考察のような経験的
考察に基づいて行なわれる。
【０１１５】断片の他に、Ｂａｘの類似体を生成するこ
とができる。この類似体は、アミノ−又はカルボキシ−
末端、又は、内部の何れか、或いは、その両方にアミノ
酸配列の少なくとも一つの欠失又は付加を有し；類似体
は配列転位を更に有する。類似体は、アミノ酸置換、好
ましくは、保存的置換からなる。その上、類似体は、ア
ミノ−又はカルボキシ−末端で一般的に結合された非相
同配列を有し、上記非相同配列は、天然Ｂａｘ蛋白質に
固有ではないその得られた類似体に機能的特性を付与す
る。しかし、Ｂａｘ類似体は、図３及び４又は図６及び
７に示されたアミノ酸配列の一部、或いは、他の哺乳動
物Ｂａｘ蛋白質の夫々に実質的類似性があり、必須の機
能的特性の中の少なくとも一つを有する（即ち、ｂｃｌ
−２とヘテロダイマーを形成し、及び／又はＢａｘとホ
モダイマーを形成する）２５のアミノ酸のセグメントに
より構成されることが必要である。好ましいアミノ酸置
換は：（１）蛋白質分解への感受性を低下し、（２）酸
化への感受性を低下し、（３）可能であればリン酸化を
含む類似体の後−翻訳的修飾を変更し、（４）上記類似
体の他の物理化学的又は機能的特性を付与又は変更する
置換である。Ｂａｘ類似体には、自然発生的ペプチド配
列以外のＢａｘ配列の種々の突然変異体が含まれる。例
えば、単一又は多数のアミノ酸置換（好ましくは、保存
的アミノ酸置換）は、自然発生的Ｂａｘ配列内（好まし
くは、ドメインI及びIIの外側のポリペプチドの部分）
に生成される。
【０１１６】保存的アミノ酸置換は、類似した特徴を有
する置換型アミノ酸によるアミノ酸の置換である（例え
ば、酸性特性のある：Ａｓｐ及びＧｌｕ）。保存的（又
は同義的）アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質
的に変更してはならない（例えば、置換型アミノ酸は親
配列に生じるらせんを切断、或いは、親配列を表わす二
次的構造の別の形を崩壊する傾向を示してはならな
い）。従来認められているポリペプチドの二次的及び三
次的構造は、1984年にニューヨークのダブリューエイチ
フリーマン アンド カンパニーから出版されたクレ
イトン編による蛋白質、構造と分子的原理 (Protein
s, Structures and Molecular Principles,(1984) Crei
ghton (ed.), W.H. Freeman and Company, New York)
と、1991年にニューヨーク州ニューヨークのガーランド
パブリッシングから発行されたブランデンとトーゼに
よる蛋白質構造入門 (Introduction to Protein Struct
ure, (1991), C. Branden and J. Tooze, Garland Publ
ishing, New York, NY) と、1991年に発行されたソーン
トン他によるネーチャー誌、第354 号、105 ページ(Tho
rnton et al. (1991) Nature 354: 105) とに記載さ
れ、上記文献は参考のため引用されている。
【０１１７】同様に、当業者は、入手可能なｂｃｌ−２
遺伝子、ｃＤＮＡ、及び蛋白質配列（例えば、ＧｅｎＢ
ａｎｋ）から完全な長さのｂｃｌ−２ポリペプチドとそ
の断片又は類似体を生成し得る。
【０１１８】天然Ｂａｘ蛋白質、その断片、又はその類
似体は、Ｂａｘ機能を妨害する作用物質を同定するため
ｂｃｌ−２への結合又はＢａｘへの結合を検出するため
結合検定の試薬として使用され、上記試薬は、これによ
って、例えは、アポプトシスを阻止し、アポプトシスを
誘発（例えば、リンパ性白血病を治療）する等のため使
用される候補薬として同定される。典型的に、Ｂａｘの
ｂｃｌ−２への結合を測定する生体外結合検定は、ドメ
インI及びドメインIIを含む天然Ｂａｘ（α又はβイソ
型）を利用する。ｂｃｌ−２（又はＢａｘ）ポリペプチ
ドは、典型的に当業者に周知の種々の手段の中の何れか
を用いて個体基質に結合され；上記結合は、非共有結合
形（例えば、ナイロン６６(Nylon 66)のような大きく帯
電された表面への結合）でもよく、或いは、共有結合形
結合（例えば、典型的に化学結合）によってもよい。Ｂ
ａｘポリペプチドは、典型的に、放射標識化されたアミ
ノ酸の組み込み又は蛍光標識によって標識化される。標
識化されたＢａｘポリペプチドは、一般的に、ナノモル
からマイクロモルの範囲（１ｎＭ乃至９９９μＭ）のＺ
ｎ2+及び／又はＭｎ2+及び／又はＭｇ2+を含む約１×１
０5 Ｍ -1以上の結合親和力との対照結合反応物内（例え
ば、１０−２５０ｍＭの塩化ナトリウム又は塩化カリウ
ムと、ｐＨ５−９、通常はｐＨ６−８の５−１００ｍＭ
のトリス塩酸）に特定の結合が得られる水性条件下で免
疫化されたｂｃｌ−２（又はＢａｘ）ポリペプチドと接
触させられる。結合の特異性は、典型的に、当業者の考
えによって選択された種々の濃度で標識化されていない
競合物を添加することによって確定される。標識化され
ていない蛋白質の競合物のそれに限定されることのない
例には：標識化されていないＢａｘポリペプチド、ウシ
血清アルブミン、細胞蛋白質抽出物が含まれている。少
なくとも一つの試薬が添加される結合反応は、試薬を含
まない対照結合反応と並行して行なわれる。Ｂａｘポリ
ペプチドのｂｃｌ−２ポリペプチド及び／又はＢａｘポ
リペプチドへの特定の結合を阻害する試薬は、対照反応
と比較した場合、薬を変調する候補Ｂａｘとして同定さ
れる。
【０１１９】当業者は、ｂｃｌ−２ポリペプチドを生成
するため、Ｂａｘポリヌクレオチド及びポリペプチドを
生成するため使用される方法を変更することが可能であ
る。例えば、ヒトｂｃｌ−２ α 蛋白質の配列は： MAHAGRTGYDNREIVMKYIHYKLSQRGYEWDAGDVGAAPPGAAP APGIFSSQPGHTPHPAASRDPVARTSPLQTPAAPGAAAGPALSP VPPVVHLALRQAGDDFSRRYRGDFAEMSSQLHLTPFTARGRFAT VVEELFRDGVNWGRIVAFFEFGGVMCVESVNREMSPLVDNIALW MTEYLNRHLHTWIQDNGGWDAFVELYGPSMRPLFDFSWLSLKTL LSLALVGACITLGAYLSHK である。ヒトｂｃｌ−２ β 蛋白質の配列は： MAHAGRTGYDNREIVMKYIHYKLSQRGYEWDAGDVGAAPPGAAP APGIFSSQPGHTPHPAASRDPVARTSPLQTPAAPGAAAGPALSP VPPVVHLALRQAGDDFSRRYRGDFAEMSSQLHLTPFTARGRFAT VVEELFRDGVNWGRIVAFFEFGGVMCVESVNREMSPLVDNIALW MTEYLNRHLHTWIQDNGGWVGASGDVSLG である。
【０１２０】ペプチドマメティックス(Peptidomimetic
s) 自然発生的アミノ酸だけからなるＢａｘ又はｂｃｌ−２
ポリペプチドの他に、Ｂａｘ又はｂｃｌ−２ペプチドミ
メティックスが得られる。例えば、ｂｃｌ−２のＢＨ１
及び／又はＢＨ２ドメインのペプチドマメティックス
は、ｂｃｌ−２細胞死抑制体活性の阻害用の薬として適
している（即ち、ｂｃｌ−２機能を阻止する）。
【０１２１】ペプチド類似体は、一般的に、テンプレー
トペプチドの特性と類似した特性を有する非−ペプチド
薬として製薬業で使用されている。上記タイプの非−ペ
プチド化合物は、“ペプチド マメティックス(Peptido
mimetics)”又は“ペプチドマメティックス(Peptidomi
metics) ”と呼ばれ（ここに、参考のため以下の文献：
1986年に発行されたフォーシャーによる最新薬学研究、
第15号、29ページ(Fauchere, J. (1986) Adv. Drug Re
s. 15: 29) と、1985年に発行されたベェーバーとフ
レインジンガーによるティンズ、392 ページ(Veber and
Freidinger (1985) TINS p.392) と、1987年に発行さ
れたエバンス他による医学化学ジャーナル第30号、1229
ページ(Evans et al. (1987) J. Med. Chem 30: 122
9) とを引用する）、通常、計算機化された分子モデル
の助けを借りて開発されている。治療的に有効なペプチ
ドと構造的に類似したペプチド マメティックスは、等
価的な治療的又は予防的効果を生成するため使用され
る。一般的に、ペプチドマメティックスは、ヒトＢａｘ
のようなパラダイム ポリペプチド（即ち、生物学的又
は薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に類似
しているが、以下の：−ＣＨ2 ＮＨ−、−ＣＨ2 Ｓ−、
−ＣＨ2 −ＣＨ2 −、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトラン
ス）、−ＣＯＣＨ2 −、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2 −、及び
−ＣＨ2 ＳＯ−からなる群より選択された結合によって
随意的に置換された少なくとも一つの結合を有する。上
記置換は、従来周知であり、かつ、参考のため引用した
以下の文献：ニューヨークのマーセルデッカー(Marcel
Dekker) から1983年に発行されたワインスタイン(B. We
instein)編による“アミノ酸、ペプチド及び蛋白質の化
学及び生化学(Chemistry and Biochemistry of Amino A
cids, Peptides, and Proteins)”の297 ページに掲載
のスパトラ(Spatola, A.F.) の論文；1983年3 月にベガ
データ(Vega Data) の第１巻、第３冊、“ペプチド バ
ックボーン 修飾(Peptide Backbone Modifications)”
（一般的考察）；モーレイ(Morley, J.S.)による薬理科
学のトレンド(Trends Pharm Sci (1980) pp.463-468
（一般的考察）；ハドソン(Hudson, D.)他によるペプチ
ド蛋白質研究国際ジャーナル(Int J PeptProt res) (19
79) 第14号、177-185 ページ（−ＣＨ2 ＮＨ−、ＣＨ2
−ＣＨ2−）；スパトラ(Spatola, A.F.) 他の生命科学
(Life Sci) (1986)、第38号、1243-1249 ページ（−Ｃ
Ｈ2Ｓ）；ハン(Hann, H.M.)の化学学会 パーキン会報
Ｉ論文誌(J Chem Soc Perkin TransI) (1982)、307-31
4 ページ（−ＣＨ−ＣＨ−、シス及びトランス）；アル
ムクイスト(Almquist, R.G.)他による医学化学ジャーナ
ル(J Med Chem) (1990)、第23号、1392-1398 ページ
（−ＣＯＣＨ2 −）；ジェニングス−ホワイト(Jenning
s-White, C.)他による論文テトラドロン(Tetrahedron L
ett) (1982)、第23号、2533ページ（−ＣＯＣＨ2
−）；ゼルク(Szelke, M.)他による欧州特許出願第4566
5 号(1982)CA: 第97号、39405 ページ(1982)（−ＣＨ
（ＯＨ）ＣＨ2 −）；ホラディ(Holladay, M.W.)他の論
文テトラドロン(Tetrahedron Lett) (1983)、第24号、
4401-4404ページ（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−）；フルビィ
(Hruby, V.J.) の生命化学(Life Sci) (1982) 、第31
号、189-199 ページ（−ＣＨ2 Ｓ−）に記載されてい
る。特に好ましい非ペプチド結合は、ＣＨ2 ＮＨ2 −で
ある。上記ペプチド マメティックスはポリペプチドの
実施例に対し、例えば：高い経済的生産性、高い化学的
安定性、増強された薬理学的特性（半減期、吸収性、効
力、効率等）、変更された特異性（例えば、生物学的活
性の広域スペクトル）、低下した拮抗性、及びその他の
ような重要な利点がある。ペプチドマメティックスの標
識化には、通常、少なくとも一つの標識を、直接的又は
スペーサ（例えば、アミド基）を介して、量的な構造活
性データ及び／又は分子モデリングによって予想される
ペプチドマメティックス上の非干渉位置に共有結合的に
付着することが含まれる。ペプチドマメティックスのデ
リビタイゼーション(derivitization)（即ち、標識化）
は、ペプチドマメティックスの所望の生物学的又は薬理
学的活性を実質的に妨害してはならない。
【０１２２】コンセンサス配列の少なくとも一つのアミ
ノ酸と同一タイプのＤ−アミノとの系統的置換（例え
ば、Ｌ−リシンの代わりのＤ−リシン）は、より安定な
ペプチドを生成するため使用される。その上、コンセン
サス配列又は実質的に同一のコンセンサス配列変化から
なる束縛されたペプチドは、例えば、ペプチドを環状化
させる分子内ジスルフィド架橋を形成し得る内部システ
イン残基を付加することによる従来周知の方法（参考の
ため引用する1992年に発行されたリゾ(Rizo)とギラシュ
(Gierash) による生化学研究会報(Ann. Rev. Biochem.)
第61号、387 ページ）で生成することができる。配列
−ＷＧＲ− 及び／又は −ＱＤＮ− 及び／又は −
ＦＲＦＧ−からなる環状ペプチドは、屡々、好ましいと
考えられる。
【０１２３】ここで同定されるＢａｘポリペプチドのア
ミノ酸配列によれば、当業者は、Ｂａｘペプチド配列と
その配列の変形とに対応するポリペプチドを生成するこ
とが可能になる。上記ポリペプチドは、屡々、大きいポ
リペプチドの一部としてＢａｘペプチド配列をエンコー
ドするポリヌクレオチドの発現によって、真核又は原核
宿主細胞内に生成される。或いは、上記ペプチドを化学
的方法により合成してもよい。組換え宿主内の非相同の
蛋白質の発現、ポリペプチドの化学的合成、及び、生体
外翻訳の方法は、従来周知であり、以下参考に引用した
1989年にニューヨークのコールドスプリングハーバーで
発行されたマニアティス他による分子クローニング：実
験室マニュアル、第２版(Maniatis et al., Molecular
Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed., (1989), Cold
Spring Harbor, N.Y.)；1987年にカリフォルニア州サ
ンディエゴのアカデミックプレス社から発行されたバー
ガーとキムメルによる酵素学の方法、第152 巻、分子ク
ローニング法入門(Bergerand Kimmel, Methods in Enzy
mology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Tec
hniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, C
A) ；1969年に発行されたメリーフィールド(Merrifiel
d, B.)の米国化学学会誌(J. Am. Chem. Soc.) 、第91
号、501 ページ；1981年に発行されたチャイケン(Chaik
en I.M.)のＣＲＣ クリット 生化学会誌(CRC Crit. R
ev. Biochem.) 、第11号、255 ページ；1989年に発行さ
れたカイサー(Kaiser et al.) 他のサイエンス誌(Scien
ce) 、第243 号、187 ページ；1986年に発行されたメリ
ーフィールド(Merrifield, B.)のサイエンス誌(Scienc
e) 、第232 号、342 ページ；1988年に発行されたケン
ト(Kent S.B.H.) の生化学研究会報(Ann. Rev. Bioche
m.) 第57号、957 ページ；1980年にウィレイパプリッ
シング(Wiley Publishing)から発行されたオフォード(O
fford, R.E.)の半合成蛋白質(Semisynthetic Proteins)
に記載されている。
【０１２４】配列Ｎ−Ｗ−Ｒ−Ｇ又はＷ−Ｇ−Ｒのペプ
チドは、典型的に直接化学合成によって生成し、Ｂａｘ
／ｂｃｌ−２ヘテロダイマー形成を競合的に阻害する試
薬として使用することが可能である。Ｎ−Ｗ−Ｒ−Ｇ及
びＷ−Ｇ−Ｒペプチドは、Ｎ−末端及び／又はＣ−末端
への共有結合形結合によるペプチド マメティックスの
付着のない修飾されたペプチドとして屡々生成される。
ある種の好ましい実施例において、カルボキシ−末端又
はアミノ末端の何れか一方、或いは、両方が化学的に修
飾される。最も一般的な末端アミノ及びカルボキシル基
の修飾は、夫々、アセチル化とアミド化である。アクリ
ル化（例えば、アセチル化）又はアルキル化（例えば、
メチル化）のようなアミノ末端修飾と、アミド化のよう
なカルボキシ−末端修飾と、循環化を含むその他の終端
修飾は、本発明の種々の実施例に組み込まれている。あ
るアミノ−末端及び／又はカルボキシ−末端修飾及び／
又はコア配列へのペプチド延長は、増強された安定性、
増大した効力及び／又は効率、血清蛋白質分解酵素への
耐性、望ましい薬物動態特性等のような有利な物理的、
化学的、生化学的、及び薬理学的特性を提供する。上記
Ｎ−Ｗ−Ｒ−Ｇ及びＷ−Ｇ−Ｒペプチドは、患者の細胞
個体群内のアポプトシスの進行を変更することにより、
疾患を処置するため治療的に使用される。
【０１２５】α−Ｂａｘ抗体の生成及び応用 天然Ｂａｘ蛋白質、その断片、或いはその類似体は、特
定の抗体の生成用の動物を免疫化するため使用される。
上記抗体は、多クローン性の抗血清によって構成しても
よく、或いは、雑種細胞によって生成された単クローン
性抗体により構成してもよい。抗体を調製する一般的な
方法については、以下参考のため引用した1988年にニュ
ーヨークのコールドスプリングハーバーのコールドスプ
リングハーバーラボラトリーから発行されたハーロウと
レインによる抗体：実験室マニュアル、(E. Harlow and
D. Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, (198
9),Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harb
or, N.Y.)を参照のこと。
【０１２６】それに限定されることのない例として、組
換え的に生成されたヒトＢａｘの断片は、免疫反応を生
成するよう当業者に周知の免疫化プロトコルに従う免疫
助成剤と共にマウスに注入可能である。典型的に、少な
くとも略１乃至５０μｇのＢａｘ断片又は類似体をポリ
ペプチドの長さに依存して初期免疫化のため使用するこ
とが可能である。組換え的に生成されたＢａｘポリペプ
チドとは別に、或いは、それと組み合わせて、Ｂａｘ配
列を有する化学的に合成されたペプチドは、図３及び４
に本質的に示された配列を有する天然のヒトＢａｘポリ
ペプチド、又は、図６及び７に本質的に示された配列を
有する天然のヒトＢａｘポリペプチドのようなＢａｘ蛋
白質を結合する抗体を産出するため免疫抗原として使用
してもよい。組換え断片を少なくとも１×１０7 Ｍ-1の
結合親和力で結合する免疫グロブリンは、血清として免
疫化された動物から採収され、或いは、イムノアフィニ
ティ・クロマトグラフィー又は他の手段によって更に純
粋化してもよい。その上、脾臓細胞は免疫化された動物
（典型的にはラット又はマウス）から収集され、抗体−
分泌雑種細胞のバンクを生成するため、骨髄腫細胞に融
合される。雑種細胞のバンクは、組換え的に生成された
Ｂａｘポリペプチド（又は化学的に合成されたＢａｘポ
リペプチド）を少なくとも１×１０6 Ｍ-1の親和力で結
合する免疫グロブリンを分泌するクローンのためスクリ
ーニングされる。マウスとラット以外の動物は、抗体を
産出するため使用され；例えば、ヤギ、ラビット、ヒツ
ジ、及びニワトリを、Ｂａｘ蛋白質と反応する抗体を産
出するため使用してもよい。実質的にヒト抗体を生成す
る能力のある遺伝子導入マウスは免疫化され、α−Ｂａ
ｘ血清のソースとして、及び／又は、単クローン−分泌
雑種細胞を作成するため使用することが可能である。
【０１２７】バクテリオファージ抗体呈示ライブライ
は、更に、完全な長さのヒトＢａｘ蛋白質、Ｂａｘ断
片、又はＢａｘエピトープ（一般的に、少なくとの３乃
至５個の連続的なアミノ酸）からなるＢａｘポリペプチ
ド配列により構成される融合蛋白質のようなＢａｘポリ
ペプチドに結合するためスクリーニングしてもよい。一
般的に、上記Ｂａｘペプチドと、抗体ライブラリをスク
リーニングするＢａｘ配列からなる融合蛋白質部とは、
少なくとも略３乃至５個の連続的なＢａｘのアミノ酸、
屡々少なくとも７個の連続的なＢａｘの蛋白質、通常
は、少なくとも１０個の連続的なＢａｘの蛋白質、及
び、より一般的には、図３及び４又は図６及び７に示さ
れたように少なくとも１４個の連続的なアミノ酸のＢａ
ｘ配列により構成される。抗体の組み合わせライブラリ
は、バクテリオファージ斑又は溶原のクローンとしてス
クリーニングされるバクテリオファージラムダ発現系統
に生成された（ヒューズ他による1989年のサイエンス
誌、第246 号、1275ページ(Huse et al. (1989) Scien
ce 246: 1275) ；1990年に発行されたカトンとコプロ
ウスキによる米国アカデミー学会講演予稿集、第87号、
6450ページ(Caton and Koprowski (1990) Proc. Natl.
Acad. Sci. (U.S.A.) 87: 6450) ；1990年に発行され
たマリナックス他による米国アカデミー学会講演予稿
集、第87号、8095ページ(Mullinax et at. (1990) Pro
c. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)87: 8095) ；1991年に
発行されたパーソン他による米国アカデミー学会講演予
稿集、第88号、2432ページ(Persson et at. (1991) Pr
oc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 2432)を参照の
こと）。バクテリオファージ抗体呈示ライブラリーと、
ラムダファージ発現ライブラリーの種々の実施例は、以
下参考に引用した1991年に発行されたカン他による米国
アカデミー学会講演予稿集、第88号、4363ページ(Kang
et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)
87: 6450) ；1991年に発行されたクラクソン他によるネ
ーチャー誌、第352 号、624 ページ(Clackson et al.
(1991) Nature 352: 624)；1990年に発行されたマッカ
アフェルティ他によるネーチャー誌、第348 号、552 ペ
ージ(McCafferty et al. (1990) Nature 348: 552)；
1991年に発行されたバートン他による米国アカデミー学
会講演予稿集、第88号、10134 ページ(Burton et al.
(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 1013
4)；1991年に発行されたホーゲンブーム他による核酸研
究、第19号、4133ページ(Hoogenboom et al. (1991) Nu
cleic Acids Res. 19; 4133）；1991年に発行されたチ
ャン他による免疫学ジャーナル、第147 号、3610ページ
(Chang etal. (1991) J. Immunol. 147; 3610)；199
1年に発行されたマークス他による分子生物学ジャーナ
ル、第222 号、581 ページ(Marks et al. (1991) J. M
ol.Biol. 222: 581) ；1992年に発行されたバーバス他
による米国アカデミー学会講演予稿集、第89号、4457ペ
ージ(Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci.
(U.S.A.) 89: 4457) ；1992年に発行されたホーキン
スとウィンターによる免疫学ジャーナル、第22号、867
ページ(Hawkins and Winter (1992) J. Immunol. 2
2: 867)；1992年に発行されたマークス他によるバイオ
テクノロジー、第10号、779 ページ(Marks et al. (199
2) Biotechnology 10: 779)；1992年に発行されたマー
クス他による生物化学ジャーナル、第267 号、16007 ペ
ージ(Marks et al. (1992) B. Biol. Chem. 267: 160
07) ；1991年に発行されたローマン他による生化学、第
30号、10832 ページ(Lowman et al (1991) Biochemistr
y 30: 10832)；1992年に発行されたラーナー他による
サイエンス誌、第258 号、1313ページ(Lerner et al.
(1992) Science 258: 1313) に記載されている。典
型的に、バクテリオファージ抗体呈示ライブラリーは、
（例えば、アフィニティ・クロマトグラフィーによる反
応ファージを強化するクロマトグラフィー樹脂への共有
結合形結合による）免疫化、及び／又は、（例えば、斑
又は群体リフトをスクリーニングするため）標識化され
たＢａｘポリペプチドでスクリーニングされる。
【０１２８】標本内のα−Ｂａｘ抗体の診断的検出用、
（例えば、標準化された競合的酵素結合免疫吸着検定法
（ＥＬＩＳＡ）による）標本内のＢａｘ蛋白質の診断的
検出及び定量化用、又は、バクテリオファージ抗体呈示
ライブラリのスクリーニング用に免疫抗原として有効な
Ｂａｘポリペプチドは、実質的に純粋な形態、即ち、典
型的に約５０パーセント（ｗ／ｗ）以上の純度、実質的
に妨害蛋白質及び不純物のない形態で適当に得られる。
上記ポリペプチドは、好ましくは少なくとも８０パーセ
ント（ｗ／ｗ）の純度で、より好ましくは少なくとも約
９５パーセント（ｗ／ｗ）の純度で分離及び合成され、
他のヒト、マウスの蛋白質、或いは、それ以外の不純物
を実質的に含まない。
【０１２９】免疫交叉活性蛋白質の同定のような上記抗
体の応用の際、所望の血清又は単クローン性抗体は単特
異性ではない。上記の場合、天然蛋白質の全体を使用す
るよりはむしろ、抗原としてＢａｘの合成的又は組換え
断片を使用することが好ましい。より具体的に言うと、
ｂｃｌ−２結合ドメインのような特定の構造的成分から
なる免疫交叉活性ポリペプチドを同定することを目的と
する場合、Ｂａｘ蛋白質内の釣り合った構造的ドメイン
の一部又は全部に対応する断片を抗原として使用するこ
とが好ましい。上記定義のアミノ−及びカルボキシ−末
端を有する組換え又は合成的断片の生成物は、図３及び
４と、図６及び７に示したＢａｘ配列により得られる。
【０１３０】血清がβ−ガラクトシダーゼ又はグルタチ
オン Ｓ−トランスファーゼに融合されたＢａｘ免疫抗
原からなる融合蛋白質のようなＢａｘ融合ポリペプチド
に成育されるならば、好ましくは血清は、免疫抗原とし
て機能する融合蛋白質の非Ｂａｘ部分を反応させる（即
ち、特異的に結合する）抗体の血清を除去するため、非
Ｂａｘ融合パートナー（例えば、β−ガラクトシダー
ゼ、又は、グルタチオンＳ−トランスファーゼ）で予め
吸収される。ヒト及び／又はマウスのＢａｘ蛋白質に結
合する単クローン性又は多クローン性抗体は、患者のリ
ンパ球標本から得られた熱変性蛋白質のウェスタンブロ
ット（例えは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのニトロセルロースブ
ロット）のような標本内のヒト又はマウスのＢａｘポリ
ペプチドの存在を検出するため使用される。好ましく
は、比重走査及びウェスタンブロットの信号蓄積等によ
って定量的な検出は行なわれる。単クローン性又は多ク
ローン性抗体は、熱変性Ｂａｘエピトープに結合し、従
来周知の方法に従って、標識化された第２抗体、又は、
標識化された黄色ブトウ球菌蛋白質Ａで視覚的に、或い
は、他の光学的手段によって同定される。
【０１３１】上記抗体の一つの使用法は、候補の新規ｂ
ｃｌ−２結合因子又はＢａｘ関連蛋白質であり構造的に
関連した免疫交叉活性蛋白質をエンコードするｃＤＮＡ
挿入を含むクローンを同定するため、好ましくは、種々
の組織のヒト又はマウスのｍＲＮＡから得られたｃＤＮ
Ａを含むｃＤＮＡ発現ライブラリをスクリーニングする
ことである。上記ｃＤＮＡ発現ライブラリのスクリーニ
ングは従来より周知であり、以下に引用したヤング他に
よる米国アカデミー学会講演予稿集、第80号、1194-119
8 ページ(1983)(Young et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A. 80:1194-1198 (1983)) とその他の刊行物に
記載されている。上記抗体の別の使用法は、抗体を生成
するため使用される天然Ｂａｘ蛋白質又は対応するＢａ
ｘ断片（例えば、機能的ドメイン；ｂｃｌ−２−結合ド
メイン）に構造的又は進化的に関係した免疫交叉活性蛋
白質を同定及び／又は純粋化することである。本発明の
抗Ｂａｘ抗体は、例えば、患者から得られた細胞外植
（例えば、リンパ球標本）内のような細胞内又は細胞個
体群内のＢａｘ蛋白質のレベルを測定するため使用する
ことができる。ｂｃｌ−２に特異的に結合する抗体と共
に使用する場合、本発明の抗Ｂａｘ抗体は、細胞内又は
細胞個体群内のＢａｘ蛋白質のｂｃｌ−２蛋白質に対す
る比（例えば、ＢａＸ：ｂｃｌ−２の比）を測定するた
め使用することができる。抗Ｂａｘ及び抗ｂｃｌ−２抗
体は、以下の種々の方法によって対応する蛋白質レベル
（夫々、Ｂａｘ又はｂｃｌ−２）を測定するため使用す
ることが可能であり、その例に限定されることはない上
記種々の方法は：（１）細胞抽出物上の標準化されたＥ
ＬＩＳＡ、（２）イムノ沈殿された生成物のポリアクリ
ルアミド ゲル電気泳動が後に続く細胞抽出物のイムノ
沈澱と、Ｂａｘ及び／又はｂｃｌ−２に対応するバンド
の定量的検出、（３）抗Ｂａｘ及び／又は抗ｂｃｌ−２
抗体で免疫組織化学的株化による切片上検出と、標識化
された第２抗体での検出を含む。細胞内又は細胞個体群
内のＢａｘ：ｂｃｌ−２比の測定は細胞又は細胞個体群
のアポプトシス状態に関して情報性がある。
【０１３２】上記抗体の他の種々の使用法は、白血病又
は他の腫瘍を診断及び／又はステージ化すること、及
び、腫瘍形成、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ等を処置するた
め、（例えば、キャプション化された抗体として、或い
は、標的とされるリポゾーム性の導出による）治療的に
応用することである。
【０１３３】Ｂａｘポリヌクレオチド 図３及び４と、図６及び７に示したマウス及びヒトのＢ
ａｘの完全なコーディング配列の開示によって、Ｂａ
ｘ、Ｂａｘの断片、又は、Ｂａｘの類似体の発現を指示
し得る分離されたポリヌクレオチドの構成が可能にな
る。その上、図３及び４と、図６及び７に示された配列
によって、核酸交雑プローブと、Ｂａｘをエンコードす
るＲＮＡ及びＤＮＡ配列を検出するため使用されるＰＣ
Ｒプライマーとの構成が可能になる。
【０１３４】完全な長さのＢａｘ、或いは、その断片又
は類似体をエンコードするポリヌクレオチドは、コーデ
ィング配列の転写（発現配列）と翻訳とを容易化するの
で、エンコードされたポリペプチド生成物が生成され
る。上記ポリヌクレオチドの構成は従来より周知であ
り、1989年にニューヨークのコールドスプリングハーバ
ーで発行されたマニアティス他による分子クローニン
グ：実験室マニュアル、第２版(Maniatis et al., Mole
cular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., (198
9), Cold Spring Harbor, N.Y.)に記載されている。そ
れに限定されることのない一例によれば、上記ポリヌク
レオチドは、促進因子と、転写終端部位（真核発現宿主
内のポリアデニル化部位）と、リボゾーム結合部位と、
随意的に真核発現宿主内で用いるエンハンサーと、随意
的にベクターの複製に必要な配列とを含む場合がある。
典型的な真核発現カセットには、随意的にエンハンサー
と下流ポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０ 巨大Ｔ
Ａｇ ポリＡ付加部位）に結合されたＨＳＶ ｔｋ
促進因子又はｐｇｋ（ホスホグルセラーテ キナーゼ）
促進因子のような促進因子の下流（即ち、翻訳のリーデ
ィングフレームの方向；ポリヌクレオチド結合）に結合
されたＢａｘポリペプチドをエンコードするポリヌクレ
オチド配列が含まれる。
【０１３５】好ましくは、上記アミノ酸配列は所定の順
序（アミノ末端からカルボキシ末端への方向）で発生
し、他の介在及び／又は末端配列からなり；一般的に上
記ポリペプチドは長さで１０００アミノ酸未満であり、
より一般的には、長さで５００アミノ酸未満であり、屡
々、長さで略４１乃至２１８アミノ酸である（例えば、
１９２アミノ酸又は２１８アミノ酸；α又はβヒト イ
ソ型）。遺伝子コードの縮重によって上記アミノ酸配列
をエンコードするポリヌクレオチド配列の有限のセット
が得られ；かかる縮重配列のセットは、手動で、或い
は、商業的に入手可能なソフトウェア（ウィスコンシン
ジェネティック ソフウェア パッケージリリース
７．０）を用いてコンピュータで容易に生成される。分
離されたＢａｘポリヌクレオチドは、典型的に、長さで
略１０，０００ヌクレオチド未満である。
【０１３６】更に、ポリペプチドの発現が望まれない場
合、本発明のポリヌクレオチドは、機能的蛋白質をエン
コードする必要がない。本発明のポリヌクレオチドは、
ＢａｘＲＮＡ又はＤＮＡ配列を検出する交雑プローブ及
び／又はＰＣＲプライマー（アンプリマー）及び／又は
ＬＣＲオリゴマーとして機能する。
【０１３７】或いは、本発明のポリヌクレオチドは、構
造的又は進化的に関連した蛋白質をエンコードする関連
遺伝子のＲＮＡ又はＤＮＡ配列を検出する交雑プローブ
又はプライマーとして機能する。上記交雑化及びＰＣＲ
応用の場合、本発明のポリヌクレオチドは、Ｂａｘ配列
に対する特異交雑又は特異増幅が維持される限り、実質
的な欠失、付加、ヌクレオチド置換及び／又は転位を含
む。
【０１３８】以下に定義する特異交雑は、存在する各イ
ソ型に対応する単一のバンドがＢａｘ−発現細胞から調
製されたＲＮＡのノーザンブロット上で同定されるよう
に、（置換、欠失、及び／又は付加を含む場合がある）
本発明のポリヌクレオチドと、マウス又はヒトＢａｘの
ｍＲＮＡのような特定の標的ポリヌクレオチドの間の交
雑の形成として概略的に要約することができる（即ち、
離散的なＢａｘのｍＲＮＡバンドを検出し得るような交
雑化と洗浄の条件を確定することが可能である）。かく
して、当業者は、図３及び４又は図６及び７に示された
配列と比べてヌクレオチドの実質的な付加、欠失、置
換、又は転位を含む本発明のポリヌクレオチドを調製
し、ＢａｘのｍＲＮＡを発現するリンパ球細胞系から調
製されたＲＮＡを使用するノーザンブロットの実行、及
び／又は、ＢａｘのＤＮＡクローン（ｃＤＮＡ又はゲノ
ムクローン）への交雑化によって特異交雑化がポリヌク
レオチドの特性であるかどうかを判定することが可能で
ある。
【０１３９】特異増幅は、ＰＣＲのＢａｘポリヌクレオ
チドとの反応に共に使用されるとき、Ｂａｘ遺伝子配列
又はｍＲＮＡ配列に対応する単一の主増幅生成物を実質
的に生成するＰＣＲアンプリマーのセットの能力として
定義される。一般的に言うと、Ｂａｘ発現ヒト細胞（例
えば、ジャーカット(Jurkat)細胞系）からのヒトゲノム
ＤＮＡ又はｍＲＮＡは、ＰＣＲ反応のためのテンプレー
トＤＮＡ標本として使用される。特異増幅を示すＰＣＲ
アンプリマーは、定量的ＰＣＲ増幅によるＢａｘのｍＲ
ＮＡの定量的判定に適している。Ｂａｘ対立遺伝子増幅
生成物は、配列及び／又は長さの多形性を有するにも係
わらず、上記定義の目的のための単一の増幅生成物を構
成すると考えられている。
【０１４０】一般的に、交雑化プローブは、（ヒト及び
マウスのバックス検出用の）図３及び４又は図６及び７
に示された配列をなす少なくとも約１０、好ましくは２
５の連続的なヌクレオチドからなり、好ましくは、交雑
化プローブは、図３及び４又は図６及び７に示された配
列をなす少なくとも５０の連続的なヌクレオチドからな
り、より好ましくは、図３及び４又は図６及び７に示さ
れた配列をなす少なくとも１００の連続的なヌクレオチ
ドからなる。ＰＣＲアンプリマーは、典型的に、図３及
び４又は図６及び７に示された配列をなす略２５乃至５
０の連続的なヌクレオチドからなり、通常は、本質的
に、図３及び４又は図６及び７に示された配列をなす略
２５乃至５０の連続的なヌクレオチドと、場合によって
は、重合酵素−媒介鎖延長と干渉しないように一般的に
５’末端にある付加的なヌクレオチドとからなる。ＰＣ
Ｒアンプリマーの設計と、交雑化プローブの選択は、当
業者の考えの範囲内で構わない。
【０１４１】新規及びアポプトシス−変調試薬を同定す
る方法 本発明の基礎は、新規の蛋白質、Ｂａｘがアポプトシス
に晒される多数の細胞タイプの中に存在し、Ｂａｘは、
細胞内のアポプトシスを変調（阻害）することが知られ
ている蛋白質ｂｃｌ−２に特異的に結合することの実験
的な発見である。例えば、Ｂａｘ機能を阻止、及び／又
は、ｂｃｌ−２機能を阻止する試薬は、潜在的な人間の
治療薬として開発される。
【０１４２】細胞死を阻害する試薬は、Ｂａｘ機能（即
ち、Ｂａｘ／Ｂａｘホモダイマーの形成、及び／又は、
アポプトシスの誘発）のｂｃｌ−２−依存性阻害を変調
することにより、例えば、ｂｃｌ−２／Ｂａｘヘテロダ
イマーの形成を促進し、これによって、Ｂａｘ／Ｂａｘ
ホモダイマーの形成を低減することにより、薬剤として
使用される。上記薬剤は：リパーフュージョン傷(reper
fusion injury)と、心筋梗塞と、発作と、外傷性脳損傷
と、神経性変性疾患と、老化と、毒血症と、感染と、Ａ
ＩＤＳと、肝炎等のような多様な人間、家畜の疾病を処
置するため使用される。
【０１４３】Ｂａｘ／ｂｃｌ−２ヘテロダイマーと、Ｂ
ａｘ／Ｂａｘホモダイマーのレベルを変調することによ
って細胞死を促進（誘発）する治療薬は、薬剤して使用
することが可能である。上記薬剤は、例えば、以下の例
に限定されることはないが：増生、腫瘍形成、自己免疫
性疾患、移植拒絶反応、リンパ球増殖性疾患等を含む多
数の病気を処置するため使用することができる。
【０１４４】候補抗腫瘍性試薬は、人間の抗腫瘍性薬と
しての使用の適性を予測するため慣例的に使用される検
定において抗腫瘍性が更に試験される。それに限定され
ることのない上記検定の例には：（１）足場非依存性の
変換細胞を軟寒天内で成長させる能力を阻害する候補試
薬の能力、（２）ｎｕ／ｎｕマウスに外植された変換細
胞の腫瘍化を低減する能力、（３）変換細胞の形態学的
転換を反転する機能、（４）ｎｕ／ｎｕマウスに外植さ
れた成長を低減する能力、（５）自然又は化学的に誘発
された発癌性の動物モデル内の腫瘍又は前腫瘍形成細胞
の形成を阻害する能力、（６）試薬が適用される変換細
胞により分化された表現型を誘発する能力が含まれてい
る。
【０１４５】Ｂａｘ／ｂｃｌ−２ 分子間結合 本発明の基礎は、Ｂａｘ蛋白質が生理的条件下でｂｃｌ
−２蛋白質と複合体を形成するという意外な発見であ
る。上記発見は、Ｂａｘ蛋白質がｂｃｌ−２機能の変調
器として機能すること、及び、その逆を示している。上
記機能的変調は、（Ｂａｘを介する）信号形質導入経路
をアポプトシス調節蛋白質（即ち、ｂｃｌ−２）に結合
することが可能である。
【０１４６】Ｂａｘのｂｃｌ−２への結合を阻害又は増
強する試薬の能力を検出する検定によって、Ｂａｘ又は
ｂｃｌ−２の拮抗体又は作用物質を同定するため試薬バ
ンク（例えば、化合物ライブラリー、ペプチドライブラ
リ等）の容易な高スループットのスクリーニングが得ら
れれる。かかるＢａｘ又はｂｃｌ−２の拮抗体及び作用
物質は、Ｂａｘ及び／又はｂｃｌ−２の活性を変調し、
これによって、アポプトシスを変調する。
【０１４７】Ｂａｘ／ｂｃｌ−２化合物の形成、又は、
ｂｃｌ−２／ｂｃｌ−２化合物の形成を特異的に阻害し
得る試薬の効果量の患者への投与は、Ｂａｘ及び／又は
ｂｃｌ−２の活性及びアポプトシスを変調することによ
って効果的に処置される病理学的状態（例えば、癌、炎
症、リンパ球増殖性疾患、自己免疫性疾患、神経性変性
疾患等）を処置する治療的又は予防的方法として使用す
ることが可能である。結合検定(binding assay) は、一
般的に以下の二つの形態の中の一方をとる：免疫化され
たＢａｘ蛋白質は標識化されたｂｃｌ−２ポリペプチド
を結合するため使用可能であり、又は、逆に、免疫化さ
れたｂｃｌ−２ポリペプチドは標識化されたＢａｘポリ
ペプチドを結合するため使用可能である。或いは、結合
検定はＢａｘポリペプチドとホモダイマーを形成すべく
Ｂａｘポリペプチドの結合を検出するため行なってもよ
く；典型的に、標識化されたＢａｘポリペプチドは水性
結合条件化で免疫化されたＢａｘポリペプチドと接触さ
せられ、結合の程度は免疫化され標識化されたＢａｘの
量を測定することによって定められる。何れの場合で
も、標識化されたポリペプチドは、ポリペプチドの特異
的な結合によって添加試薬の無い場合にＢａｘ／ｂｃｌ
−２複合体を形成させる水性条件で、免疫化されたポリ
ペプチドと接触させられる。特定の水性条件は、従来の
方法に従って当業者が選択してもよい。一般的な手引き
の場合、以下の緩衝水性条件：二価の陽イオン及び／又
は金属キレート化剤及び／又は非イオン性洗浄剤及び／
又は膜分画が随意的に添加された１０−２５０ｍＭの塩
化ナトリウム、５−５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ ５−
８が使用される。付加、欠失、（ｐＨのような）修飾、
（塩化ナトリウムを置換する塩化カリウム、又は緩衝置
換のような）置換が上記条件に対し行なわれることは当
業者によって認められる。Ｂａｘポリペプチドのｂｃｌ
−２ボリペプチドへの特異的な結合が対照反応中に生じ
る限り、修飾を基本結合反応条件に対し行なうことが可
能である。検定によってＢａｘ／Ｂａｘホモダイマーの
形成が検出されるある種の実施例の場合、Ｂａｘポリペ
プチドのＢａｘボリペプチドへの特異的な結合が対照反
応中に生じる限り、修飾を基本結合反応条件に対し行な
うことが可能である。（試薬が含まれていない）対照反
応中の特異的な結合を許容しない条件は、結合検定に適
当ではない。
【０１４８】好ましくは、少なくとも一つのポリペプチ
ド種は、検出可能なマーカーによって標識化される。そ
の例に限定されることのない適当な標識化の中には、放
射標識化されたアミノ酸（例えば、14Ｃ−標識ロイシ
ン、3 Ｈ−標識グリシン、35Ｓ−標識メチオニン）の取
込みによる放射標識化、125 Ｉ又は131 Ｉ（例えば、ボ
ールトン−ハンター反応(Bolton-Hunter reaction)とク
ロラミンＴ）との後−翻訳放射標識化による放射標識
化、32Ｐ（例えば、ホスホリラーゼ及び無機性放射標識
リン酸塩）との後−翻訳リン酸化による標識化、蛍光標
識（例えは、フルオレセイン又はローダミン）の取込み
による蛍光標識化、又は、従来技術において周知の他の
方法による標識化が含まれる。ポリペプチド種の中の一
つが基質への結合によって免疫化される実施例におい
て、他のポリペプチドは検出可能なマーカーによって標
識化される。
【０１４９】更に、ある種の実施例の場合、Ｂａｘ又は
ｂｃｌ−２ポリペプチドを副蛋白質（例えば、生体内ポ
リペプチドと複合体を形成する蛋白質）と組み合わせて
用いてもよく、個体性、及び／又は、ヘテロダイマー
性、及び／又は、マルティマー性の複合体の結合を識別
することができるよう各ポリペプチド種に対し別々の標
識を使用することが好ましい。その例に限定されない例
として、Ｂａｘポリペプチドをフルオレセインで標識化
し、副蛋白質を、異なる励起波長又は放射波長、或い
は、両方で蛍光する蛍光マーカーで標識化しても構わな
い。或いは、Ｂａｘポリペプチドは一つの同位元素（例
えば、3 Ｈ）で標識化され、第２のポリペプチド種は弁
別法を使用するシンチレーションカウンティングによっ
て識別可能な別の同位元素（例えば、14Ｃ）で標識化さ
れる２重のシンチレーションカウンティングを使用して
もよい。
【０１５０】標識ポリペプチドは以下に説明する水性条
件下で免疫化されたポリペプチドと接触させられる。選
択条件が特異的な結合を試薬の存在しない対照反応中に
発生させる限り、結合反応の培養の時間と温度は変化す
る。培養期間は長い程好ましく、ある実施例では結合平
衡状態が得られるにも係わらず、好ましい実施例によれ
ば、およそ摂氏１５度、より好ましくは、摂氏３５乃至
４２度の反応温度と、少なくとも略１５秒の培養時間が
採用される。結合されたＢａｘ／ｂｃｌ−２複合体の結
合動態と熱力学的安定性によって、時間、温度、塩、ｐ
Ｈ、及びその他の反応条件の変更に利用可能な許容範囲
が定められる。しかし、ある特定の実施例の場合、スカ
ッチャード分析(Scatchard analysis)、ヒル分析(Hill
analysis) 、及びその他の方法（1984年にニューヨーク
のフリーマン アンド カンパニーから出版されたクレ
イトン編の蛋白質、構造と分子の原理 (Proteins, Str
uctures and Molecular Principles, (1984) Creighton
(ed.), W.H. Freeman andCompany, New York) ）を使
用する結合分析を含む従来技術の方法を使用する当業者
は、所望の結合反応条件を容易に較正することが可能で
ある。
【０１５１】標識Ｂａｘ又はｂｃｌ−２ポリペプチドの
免疫化ｂｃｌ−２又はＢａｘポリペプチドへの特異性結
合は、夫々、標識のない競合蛋白質（例えば、アルブミ
ン）を含めることによって定められる。結合反応の終了
後、免疫化ポリペプチドに特異的に結合された標識ポリ
ペプチドが検出される。その例に限定されることのない
例によれば、結合のための適当な培養期間の後、免疫化
されていない蛋白質を水性相は除去され、免疫化ポリペ
プチド種と、その免疫化ポリペプチド種に結合された任
意の標識蛋白質を含む基質は、随意的に標識のない遮断
薬を含む適当な緩衝剤で洗浄され、上記洗浄緩衝剤は除
去される。洗浄後、免疫化ポリペプチドに特異的に結合
し続けている検出可能な標識の量は、（例えば、光学
的、酵素的、オートラジオフラフ的、又は他の放射線化
学的方法によって）判定される。
【０１５２】ある種の実施例には、特異性のない結合を
阻害する標識のない遮断薬の付加が含まれている。上記
遮断薬のそれに限定されることのない例には：ウシ胸腺
ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、酵母ＲＮＡ、種々の長さの混
合配列（ランダム又は疑似ランダム配列）オリゴヌクレ
オチド、ウシ血清アルブミン、非イオン性洗浄剤（ＮＰ
−４０、ＴＷＥＥＮ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００等）、
脱脂粉乳蛋白質、デンハーツ(Denhardt's)試薬、ポリビ
ニルピロリドン、フィコール、及び他の遮断薬が含まれ
ている。当業者は、自分の考えに従って、結合検定に含
めるべき適当な濃度で遮断薬を選択するが；反応条件
は、対照結合反応内のＢａｘポリペプチドとｂｃｌ−２
ポリペプチドの間の特異結合を許容するよう選択され
る。遮断薬は、標識蛋白質の免疫化蛋白質への特異性の
ない結合を阻害、及び／又は、標識ポリペプチドの免疫
化基質への特異性のない結合を阻害するため含有され
る。
【０１５３】ポリペプチドが免疫化された実施例の場
合、基質への共有結合形又は非共有結合形の結合が使用
される。共有結合の化学には、その例に限定されること
のない従来周知の明瞭に表わされた方法が含まれている
（カドナガとチャンによる1986年の米国アカデミー学会
講演予稿集、第83号、5889ページ(Kadonaga and Tijan
(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 83: 5889)
）。それに限定されることのない一例は、（ＣＮＢｒ
−誘導セファローゼ(Sepharose) ４Ｂのような）臭化シ
アンによって誘導された基質への共有結合形結合であ
る。基質からの潜在的な立体障害を低減するためスペー
サを使用することが望ましい。蛋白質の基質への非共有
結合形結合には、その例に限定されることはないが、蛋
白質の帯電された表面への結合と、特異抗体との結合と
が含まれる。
【０１５４】実施例の一つのクラスによれば、並行結合
反応物は接触させられ、反応物の一組は対照の機能を果
たし、少なくとも一つの別の組には、Ｂａｘポリペプチ
ドのｂｃｌ−２ポリペプチドへの結合を阻害し、及び／
又は、Ｂａｘポリペプチドとホモマルチマー（ホモダイ
マー）を形成するためＢａｘポリペプチドの結合を阻害
する能力がテストされる種々の量の作用物質と、作用物
質の混合物と、生物学的抽出物とが含まれている。
【０１５５】酵母２−ハイブリッドスクリーニング検定 酵母は、（１）Ｂａｘポリペプチドに結合可能なｂｃｌ
−２の結合断片に融合されたＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメ
イン（又はＧＡＬ４活性化体ドメイン）をエンコードす
る発現カセットと、（２）ｂｃｌ−２ポリペプチドに結
合可能なＢａｘの結合断片に融合されたＧＡＬ４ ＤＮ
Ａ活性化体ドメイン（又はＧＡＬ４結合ドメイン夫々）
をエンコードする発現カセットと、（３）ｃｉｓ−結合
したＧＡＬ４ 転写反応素子よりなるリポーター遺伝子
（例えば、β−ガラクトシダーゼ）とからなり、作用物
質のスクリーニングに使用することが可能である。上記
酵母は試験作用物質で培養され、リポーター遺伝子（例
えば、β−ガラクトシダーゼ）の発現は判定され；対照
培養と比較されたリポーター遺伝子の発現を阻害する作
用物質の能力は、候補のｂｃｌ−２変調作用物質又はＢ
ａｘ変調作用物質といて作用物質を同定する。
【０１５６】酵母２−ハイブリッド系統(Yeast Two-Hyb
rid Systems)は、哺乳類（典型的にヒト）ｃＤＮＡの発
現ライブラリーをスクリーニングするため使用され、こ
こで、ｃＤＮＡは、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン又は
活性化体ドメインに融合され、Ｂａｘ又はｂｃｌ−２ポ
リペプチド配列の一方は、ＧＡＬ４活性化体ドメイン又
はＤＮＡ結合ドメイン夫々に融合されている。かかる酵
母２−ハイブリッド系統は、Ｂａｘ又はｂｃｌ−２配列
に結合する蛋白質をエンコードするｃＤＮＡをスクリー
ニングすることが可能である。例えば、ｃＤＮＡライブ
ラリーを、ヒト成熟Ｂ細胞（Ｎａｍａｌｗａ）系（アム
ブルス他の1993年の米国アカデミー学会講演予稿集(Amb
rus et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.
A.)）、又は、その他の適当な細胞タイプからのｍＲＮ
Ａより生成することが可能である。酵母２−ハイブリッ
ド発現系統にクローン化された上記ｃＤＮＡライブラリ
ー（チエン他の1991年の米国アカデミー学会講演予稿
集、第88号、9578ページ(Chien et al. (1991) Proc. N
atl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 9578) ）は、Ｂａｘ又
はｂｃｌ−２と相互に作用する蛋白質をエンコードする
ｃＤＮＡを同定するため使用し、これにより、ＧＡＬ４
−依存性のリポーター遺伝子の発現を生成することが可
能である。Ｂａｘ又はｂｃｌ−２と相互に作用するポリ
ペプチドは、共−析出種の抗体及び同一体とのＢａｘ又
はｂｃｌ−２のイムノ沈澱によって同定可能である。更
に、Ｂａｘ又はｂｃｌ−２を結合するポリペプチドは、
ペプチドライブラリー（例えば、バクテリオファージ
ペプチド呈示ライブラリー、空間的に定義されたＶＬＳ
ＩＰＳペプチド配列等）をＢａｘ又はｂｃｌ−２ポリペ
プチドでスクリーニングすることにより同定可能であ
る。
【０１５７】アンチセンス ポリヌクレオチド 腫瘍形成又はアポプトシスの変調を目的とした他の実施
例は、図３及び４又は図６及び７に示された配列の全部
又は一部に特異アンチセンス(antisense) ポリヌクレオ
チド相補体を採用する方法を含んでいる。上記相補体ア
ンチセンスポリヌクレオチドは、図３及び４又は図６及
び７に対応する当該標的配列への特異性交雑化がポリヌ
クレオチドの機能的特性として維持される限り、ヌクレ
オチド置換、付加、欠失、又は転位を有する。相補体ア
ンチセンスポリヌクレオチドは、ＢａｘのｍＲＮＡ種に
特異的に交雑し、ｍＲＮＡ種の転写及び／又はエンコー
ドされたポリペプチドの翻訳を妨害し得る溶解性アンチ
センスＲＮＡ又はＤＮＡオリゴヌクレオチドを有する
（参考のため、チン他の1989年の米国アカデミー学会講
演予稿集、第86号、10006 ページ(Ching et al. (1989)
Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 10006)、ブロ
ーダー他の1990年の国際医学会誌、第113 号、604ペー
ジ(Broder et al. (1990) Ann. Int. Med. 113: 604)
と、ローレウ他の1990年のＦＥＢＳ論文集、第274 号、
53ページ(Loreau et al. (1990) FEBS Letters 274: 5
3)と、ホルセンバーグ(Holcenberg)他の国際公開特許第
91/11535号；米国特許出願第07/530,165号；国際公開特
許第91/09865号；国際公開特許第91/04753号；国際公開
特許第90/13641号；及び欧州特許第386563号を引用す
る）。従って、アンチセンスポリヌクレオチドは、Ｂａ
ｘポリペプチドの生成を阻害する。Ｂａｘポリペプチド
に対応するｍＲＮＡの転写及び／又は翻訳を妨害するア
ンチセンスポリヌクレオチドは、アポプトシス、老化、
ＡＩＤｓ等を阻害し、及び／又は細胞の変換表現型を逆
転する。上記アンチセンスポリヌクレオチドは、典型的
に、自然発生的なＢａｘポリヌクレオチドに実質的に同
一であり、典型系には、図３及び４、或いは、図６又は
７に示された配列と同一性がある少なくとも約２５個の
連続的なヌクレオチドからなるが、種々の長さのアンチ
センスポリヌクレオチドを生成可能である。
【０１５８】アンチセンスポリヌクレオチドは、個々の
造血幹細胞個体群の全部又は一部を再構成するため使用
される形質転換多能造血幹細胞のような形質移入細胞又
は形質転換細胞内の非相同発現カセットから生成するこ
とができる。或いは、アンチセンスポリヌクレオチド
は、生体外培養媒体、或いは、生体内循環系又は組織間
液のいずれかで外部環境に投与された溶解性オリゴヌク
レオチドにより構成される。外部環境にある溶解性アン
チセンスポリヌクレオチドによって、細胞質のアクセス
が得られ、特異ｍＲＮＡ種の変換が阻害されることが分
かった。ある種の実施例において、アンチセンスポリヌ
クレオチドは、ホスホン酸メチル成分からなる。アンチ
センスポリヌクレオチドに関係する一般的な方法に関し
ては、1988年にニューヨークのコールドスプリングハー
バーのコールドスプリングハーバーラボラトリーから発
行されたメルトン編によるアンチセンス ＲＮＡとＤＮ
Ａ(D. A. Melton, Ed., Antisense RNA and DNA, (198
8), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Har
bor, N.Y.) を参照のこと。
【０１５９】遺伝子導入動物の実施例 Ｂａｘ、特に、マウス同族のＢａｘ遺伝子のゲノムクロ
ーンは、少なくとも一つの機能的に崩壊されたＢａｘ対
立遺伝子を有する細胞及び遺伝子導入非ヒト動物を発生
する相同性標的構成体を構成するため使用される。相同
性標的構成体の構成のための指針は、ラーエムツラ他の
1991年のネーチャー誌、第353 号、180ページ(Rahemtul
la et al. (1991) Nature 353: 180) 、ジェイシン他
の1990年の遺伝子開発、第4 号、157 ページ(Jasin et
al. (1990)Genes Devel. 4: 157) 、コー他の1992年の
サイエンス誌、第256 号、1210ページ(Koh et al. (199
2)Science 256; 1210)、モリナ他の1992年のネーチャ
ー誌、第357 号、161 ページ(Molina et al. (1992) Na
ture 357: 161) 、グルスバイ他の1991年のサイエンス
誌、第253 号、1417ページ(Grusby et al. (1991) Sci
ence 253; 1417)、ブラッドレイ他による1992年のバイ
オ／テクノロジー、第10号、534 ページ(Bradley et a
l. (1992) Bio/Technology 10: 534)等により従来よ
り周知である。相同性の標的は、不活性化されたＢａｘ
対立遺伝子に対し異型接合性又は同型接合性である所謂
“ノックアウト”マウスを生成するため使用される。か
かるマウスは、免疫系の開発、腫瘍形成、アポプトシス
の調査、及びその他の用途の研究動物として商業的に販
売されている。
【０１６０】キメラ標的マウスは、1988年にコールドス
プリングラボラトリーから発行されたホーガン他のマウ
ス胚の取扱：ラボラトリーマニュアル(Hogan et al., M
anipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory (1988))と、1987年に
ワシントンディーシーのＩＲＬプレスから発行されたロ
バートソン他の編による奇形癌腫と胚幹細胞：実践的方
法 (Teratocarcinomasand Embryonic Stem Cells: A Pr
actical Approach, E.J. Robertson, ed., IRL Press,
Washington D.C., (1987)) とに従って得られた。胚幹
細胞は、以下の文献（1987年にワシントンディーシーの
ＩＲＬプレスから発行されたロバートソン他の編による
奇形癌腫と胚幹細胞：実践的方法 (Teratocarcinomas a
nd Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.
J. Robertson, ed., IRL Press, Washington D.C., (19
87)) 、ジルストラ他による1989年発行のネーチャー
誌、第342 号、435 ぺージ(Zjilstra et al. (1989) Na
ture 342: 435) 、シュワルツバーグ他による1989年発
行のサイエンス誌、第246 号、799 ページ(Schwartzber
g et al. (1989) Science 246 : 799)）に公開された
処理に従って取り扱われた。
【０１６１】更に、ＢａｘのｃＤＮＡ又はゲノム遺伝子
のコピーは、高いレベル、及び／又は、Ｂａｘ遺伝子の
隣に自然には発生しない転写対照配列の転写対照の下で
Ｂａｘポリペプチドを発現する形質転換を構成するため
使用される。限定されない例として、構成促進因子（例
えば、ＣＭＶ又はｐｇｋ促進因子）或いは細胞結合特異
転写調節配列（例えば、ＬＣＫ又は免疫グロビン遺伝子
促進因子／エンハンサー）は、形質転換を形成するため
Ｂａｘ−エンコーディング ポリヌクレオチド配列に動
作的に結合された。かかる形質転換を細胞（例えば、受
精卵、ＥＳ細胞、造血幹細胞）及び形質転換細胞に導入
可能であり、遺伝子導入非ヒト動物は従来の方法に従っ
て得られる。Ｂａｘの過剰な発現又はＢａｘの不適当な
発現は、前腫瘍形成又は腫瘍形成状態を発生させ、新生
物の発生を妨害し、或いは、特異リンパ球区画の未熟老
化又は除去又は切除を生じる場合があるので、形質転換
細胞及び／又は遺伝子導入非ヒト動物は、抗腫瘍性作用
物質をスクリーニングするため、及び／又は、潜在的な
発癌剤又はアポプトシスを変調する作用物質をスクリー
ニングするため使用してもよい。
【０１６２】Ｂａｘを結合する蛋白質の同定及び分離 Ｂａｘ及び／又はＢａｘ／ｂｃｌ−２複合体に結合する
蛋白質は、潜在的に重要な調節蛋白質である。かかる蛋
白質は、新規の抗腫瘍性の作用物質及び他の新規の薬で
ある。以下上記蛋白質を副蛋白質と呼ぶ。副蛋白質は従
来技術において周知の種々の方法で分離することができ
る。
【０１６３】副蛋白質を分離する好ましい一方法は、Ｂ
ａｘを結合する抗体に細胞抽出物内のＢａｘポリペプチ
ドを接触させ、得られた免疫複合体を分離することから
なる。副蛋白質は、熱変性作用物質、好ましくは、還元
剤で免疫複合体を熱変性することにより同定、分離され
る。熱変性、好ましくは、還元された蛋白質を、ポリア
クリルアミドゲル上で電気泳動させ得る。推定副蛋白質
は、ポリアクリルアミド上に同定可能である。種々の周
知の方法（例えば、クーマッシー染色(Coomassie stain
ing)、ウェスタン・ブロット、シルバー染色等）の中の
少なくとも一つの方法によって同定され、当該同定され
たポリペプチドを含むポリアクリルアミドゲルの一部の
切除と、上記ゲル部からのポリペプチドの溶出とによっ
て分離される。
【０１６４】他の方法は、ＢＨ１及び／又はＢＨ２ドメ
インからなるｂｃｌ−２ポリペプチドを利用する方法で
ある。
【０１６５】一方のＧＡＬ４融合蛋白質は、典型的に完
全な長さのＢａｘポリペプチド配列（例えば、図３及び
４の配列）に近い完全な長さをなすＢａｘポリペプチド
配列からなり、他方のＧＡＬ４融合蛋白質はｃＤＮＡラ
イブラリーのメンバーからなる酵母２−ハイブリッド系
は、チエン他の1991年の上記引用文献の一般的な方法に
従って、Ｂａｘ−相互作用蛋白質をエンコードするｃＤ
ＮＡを同定するため使用される。或いは、Ｅ．ｃｏｌｉ
／ＢＣＣＰ相互作用性スクリーニング系（参考として引
用したゲルミノ他による1993年の米国アカデミー学会講
演予稿集、第90号、1639ページ(Germino et al. (1993)
Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90: 1639) を参照
のこと）をＢａｘ−相互作用蛋白質配列の同定に使用し
てもよい。更に、λｇｔ１１ ｃＤＮＡ発現ライブラリ
ーのような発現ライブラリー（ダン他による1989年の生
物化学ジャーナル、第264 号、13057 ページ(Dunn et a
l.(1989) J. Biol. Chem. 264: 13057) ）は、Ｂａｘ
を特異的に結合するポリペプチドをエンコードするｃＤ
ＮＡを同定するため、標識Ｂａｘポリペプチドでスクリ
ーニングしてもよい。上記処理の場合、ｃＤＮＡライブ
ラリーは、通常、哺乳類、典型的には、ヒト、マウス、
又はラットのｃＤＮＡ個体群からなり、ＲＮＡから生成
されたｃＤＮＡと、一つの細胞タイプ、組織又は生体
と、少なくとも一つの発達段階とを表わしている。ｃＤ
ＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングする特異結合
は、通常、標識Ｂａｘポリペプチド（及び／又は標識抗
Ｂａｘ抗体）を含む前、及び／又は、含むのと同時に、
少なくとも一つの遮断薬（例えば、アルブミン、脱脂粉
乳固体等）を含有することにより得られる。
【０１６６】推定副蛋白質は、蛋白質がＢａｘ及び／又
はＢａｘ／ｂｃｌ−２複合体に結合することを実証する
ことにより、副蛋白質として同定される。かかる結合
は、限定されることのない例として、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法による分離に続いて復元された推定副
蛋白質を採用する結合検定を含む種々の手段によって生
体外で示される。或いは、組換え的又は化学合成された
推定副蛋白質を利用する結合検定を使用してもよい。例
えば、エドマン分解(Edman degradation) のような化学
的配列法によって、推定副蛋白質を分離し、アミノ酸配
列の全部又は一部を決定してもよい。アミノ酸配列情報
は、推定副蛋白質を化学的に合成するため使用される。
更に、アミノ酸配列は：（１）アミノ酸配列データに従
って縮重オリゴヌクレオチドプローブでｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングすることにより推定副蛋白質を
エンコードするｃＤＮＡクローンを分離し、（２）宿主
細胞内のｃＤＮＡを発現させ、（３）推知得副蛋白質を
分離することによって組換え推定副蛋白質を生成するた
め使用してもよい。
【０１６７】生体外でＢａｘ及び／又はＢａｘ／ｂｃｌ
−２複合体を結合する推定副蛋白質は、副蛋白質として
同定される。副蛋白質は、更に、二機能の架橋試薬（例
えば、ジメチルスベリミダーテ(dimethylsuberimidat
e)、グルタルアルデヒド等）との生体内架橋と、次のＢ
ａｘポリペプチドを含有する架橋生成物の分離とによっ
て同定される。架橋の一般的な説明については、1981年
に発行されたクンケル他の分子細胞生化学、第34号、3
ページ(Kunkel et al. (1981) Mol. Cell. Biochem.
34: 3)を参照のこと。好ましくは、上記二機能の架橋試
薬は、Ｂａｘポリペプチドからの副蛋白質の分離を容易
にさせるよう架橋複合体の分離後に特異条件下で反転さ
れる架橋を生成する。Ｂａｘポリペプチドを含有する架
橋複合体の分離は、好ましくは、少なくとも１×１０7
Ｍ-1の親和力でＢａｘポリペプチドを架橋複合体の固体
群に結合する抗体を結合し、少なくとも１×１０7 Ｍ-1
の親和力で抗体に結合する上記複合体だけを復元するこ
とにより行なわれる。Ｂａｘポリペプチドに架橋された
ポリペプチドは、副蛋白質として同定される。
【０１６８】スクリーニング検定は、候補抗腫瘍性作用
物質を、適当な結合条件下でＢａｘの副蛋白質への結合
を阻害する作用物質として同定するため開発することが
可能である。
【０１６９】法医学的同定の方法 本発明のＢａｘポリヌクレオチド配列は、死者の認定、
父系の判定、犯罪認定等のような個々のヒトの法医学的
同定のため使用することが可能である。限定されること
のない例として、ＤＮＡ標本は、人又は細胞標本（例え
ば、血液、唾液、精液等）から採取され、Ｂａｘ遺伝子
領域の構造を判定するため、ＲＦＬＰ分析、対立遺伝子
−特異ＰＣＲ、ＰＣＲクローン化、及び、増幅生成物の
配列決定をうける。Ｂａｘ遺伝子構造に基づいて、標本
が得られた個体は、彼／彼女の遺伝子型に関し同定され
る。Ｂａｘの遺伝子型は、個体を最終的に同定するた
め、又は、過失の可能性のある者としてその個体を除外
するため、単独又は他の遺伝性マーカーと組み合わせて
使用される。
【０１７０】一実施例において、個体の個体群（典型的
に、少なくとも種々の人種の５０人）からのヒトゲノム
ＤＮＡ標本は、反応管（例えば、マイクロ滴定プレート
上の穴）に個別に部分標本化される。各部分標本は、適
当な反応条件下（例えば、ニューイングランド バイオ
ラブズ １９９３ カタログ(New England Biolabs 199
3 catalog)を参照のこと）で少なくとの一つの制限酵素
（例えば、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、Ｂ
ａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＮｏｔＩ、ＡｃｃＩ、ＡｐａＩ、
ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩ、ＰｓｔＩ）を用いて消化（培
養）される。各個体からの対応する消化生成物は、電気
泳動ゲル（典型的にアガロース）に別個にロードされ、
電気泳動され、サウザン・ブロット(Southern blottin
g) により膜にブロットされ、標本Ｂａｘプローブ（例
えば、図３及び４又は図６及び７の完全な長さのヒトＢ
ａｘ ｃＤＮＡ配列）と交雑される。個体のメンバー間
で多形性がある制限断片（バンド）は、Ｂａｘの遺伝子
型を弁別する基礎として使用されるので、そのＢａｘ遺
伝子型に基づいて個体を分類する。
【０１７１】Ｂａｘ遺伝子型の同様の分類は、個体の個
体群からのＰＣＲ増幅生成物を配列決定し、対立遺伝子
（遺伝子型）を同定するため配列の多形性を使用するこ
とによって行なわれ、これにより、個体を同定又は分類
する。
【０１７２】合理的な薬の設計方法 Ｂａｘ及びｂｃｌ−２ポリペプチド、特に、そのＢａｘ
／ｂｃｌ−２ヘテロダイマー内の直接的な接触を形成す
る部分は、候補ｂｃｌ−２−変調作用物質（例えば、抗
腫瘍剤及び免疫調節剤）の合理的な薬の設計のため使用
される。実質的に純粋化されたＢａｘ／ｂｃｌ−２ヘテ
ロダイマーと、ここで得られたようなｂｃｌ−２の断尾
パートナーとしてのＢａｘの同定によって、実質的に純
粋なＢａｘ／ｂｃｌ−２ポリペプチド複合体の生成物
と、蛋白質Ｘ線結晶学又はドック（ＤＯＣＫ）プログラ
ム（クンツ他による1982年の分子生物学ジャーナル、第
161号、269 ページ(Kuntz et al. (1982) J. Mol. Bio
l. 161: 269) 、クンツによる1992年のサイエンス
誌、第257 号、1078ページ(Kuntz ID (1992) Science25
7: 1078)）とその変形のようなその他の構造分析法のた
め使用される計算機モデルが得られる。潜在的な治療薬
は、かくして得られた構造情報に基づいて合理的に設計
することができる。一実施例において、上記薬は、Ｂａ
ｘポリペプチド：ｂｃｌ−２ポリペプチド複合体の形成
を妨害するため設計される。従って、本発明は、Ｂａｘ
のｂｃｌ−２への結合を阻害する能力のある薬を含む薬
を設計するため使用できる。他の一実施例において、上
記薬は、ｂｃｌ−２のＢＨ−１又はＢＨ−２ドメインの
構造的な擬態である。
【０１７３】
【実施例】以下の例は本発明を実証するため記載されて
いるが、その例に限定されることはない。明細書全体に
使用されている全てのパーセンテージの表記は、特に指
示のない限り、重量ベースで表わされている。全ての蛋
白質の分子量は、特に指示のない限り、中間平均分子量
に基づいている。
【０１７４】以下に使用される命名法、細胞培養の実験
室処理、分子遺伝学、核酸化学及び以下に説明する交雑
化には、従来技術において周知であり、かつ、一般的に
利用される処理が含まれている。標準的な手法が、組換
え核酸法、ポリヌクレオチド合成、微生物培養及び転換
（例えば、エレクトロポーレーション(electroporatio
n) 、リポフェクション(lipofection) ）のため使用さ
れている。上記技術及び処理は、一般的に、従来技術の
方法と、本明細書の全体を通して与えられた種々の一般
的な参考文献（参考のため引用したニューヨーク市コー
ルドスプリングハーバーのコールドスプリングハーバー
ラボラトリープレスから1989年に発行されたサムブルッ
ク他にる分子クローン化：ラボラトリーマニュアル、第
２版(Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laborato
ry Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Labor
atory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) を全体的に
参照のこと）とに従って行なわれる。
【０１７５】オリゴヌクレオチドは、製造社によって提
供された仕様書に従ってアプライドバイオ システムズ
(Applied Bio Systems) のオリゴヌクレオチド合成器で
合成することができる。
【０１７６】ＰＣＲ増幅の方法は従来技術に記載されて
いる（1992年にニューヨーク州ニューヨーク市のフリー
マンプレスから発行されたエイチ エー エリック編の
ＰＣＲテクノロジー：ＤＮＡ増幅の原理と応用 (PCR T
echnology: Principles andApplications for DNA Ampl
ification ed. HA Erlich, Freeman Press, New York,
NY (1992)) ；1990年にカリフォルニア州サンディエゴ
のアカデミックプレスから発行されたインニス、ゲルフ
ランド、スニスキー、ホワイト編によるＰＣＲプロトコ
ルズ：方法と応用の入門 (PCR Protocols: A Guide to
Methods andApplications, eds. Innnis, Gelfland,
Snisky, and White, Academic Press, San Diego, CA
(1990))；1991年発行のマッテイラ他による核酸研究、
第19号、4967ページ(Mattila et al. (1991) Nucleic
Acids Res. 19: 4967) ；1991年発行のエッカートとク
ンケルによるＰＣＲの方法及び応用、第１号、17ページ
(Eckert, K.A. and Kunkel, T.A. (1991) PCR Methods
and Applications 1: 17) ；オックスフォードのＩ
ＲＬプレスから発行されたマクファーソン、キルケス、
テーラ編によるＰＣＲ (PCR, eds. McPherson, Quirke
s, and Taylor, IRL Press, Oxford)；米国特許第4,68
3,202 号を参考のため引用する）。
【０１７７】経験的処理、試薬、初期材料、及び、ここ
で行なったテスト処理は、以下の技術を使用した。
【０１７８】実施例 実施例１：ＢＡＸ方法 Ａ）細胞培養 ｔ（１４；１８）を有し高レベルのｂｃｌ−２を発現す
るヒトＢ細胞系であるＲＬ７を、１０％のウシ胎児血清
(FCS)(Gibco により提供）を加えたイスコブ(Iscove)修
正ダルベッコ培地中で培養した。インターロイキン−３
（ＩＬ−３）依存マウス細胞系ＦＬ５．１２、リンパ系
前駆クローン、及びその全ての派生物を、１０％ＦＣＳ
及びＩＬ−３の源として１０％ＷＥＨＩ−３Ｂならし培
地を加えたイスコブ修正ダルベッコ培地中で培養した。 Ｂ）抗体 ヒトｂｃｌ−２特異性ハムスターｍｏＡｂ（Hockenbery
等, 1990)である６Ｃ８；インフルエンザウイルス赤血
球凝集素蛋白質エピトープ特異性マウスｍｏＡｂ(Kolod
ziej及びYoung, 1991)である１２ＣＡ５；マウスｂｃｌ
−２特異性ハムスターｍｏＡｂ (Veis等, 1993) である
３Ｆ１１を使用した。ヒトｂｃｌ−２特異性ハムスター
ｍｏＡｂである１２４をＤＡＫＯから購入した。ヒトＴ
ＮＦ特異性ハムスターｍｏＡｂ(Sheehan, 1989) である
ＴＮ３ １９．１２を対照抗体として使用した。ウェス
タンイムノ染色のための予備の抗体希釈度は、６Ｃ８
（１：１００）、３Ｆ１１（１：１００）、１２ＣＡＳ
（１：５０）であった。３Ｆ１１抗体をイムノブロット
用に記述された (Veis等, 1993) ように直接ビオチン化
した。他の抗体は、種に共通のビオチン化第二抗体によ
って検出した。
【０１７９】Ｃ）イムノ沈殿法及びウェスタンブロット
法 代謝標識に先立ち、余熱し血清及びメチオニンを含まな
いダルベッコ培地中で細胞を洗浄した。１０％の透析Ｆ
ＣＳと５％の完全培地又は５％のＷＥＨＩ３Ｂ上澄みの
何れかとを加えたメチオニンを含まないダルベッコ培地
に、３−５×１０6 細胞／ｍｌの濃度で細胞を再び懸濁
させた。代謝標識は４０μＣｉ／ｍｌの（35Ｓ）メチオ
ニン、（35Ｓ）システインを用いて溶解の９−１２時間
前に行った。イムノ沈殿の全ての段階は氷上又は低温の
室内で行った。細胞を冷燐酸緩衝溶液で２度洗い、３０
分間のニューテーション(nutation)により、プロテアー
ゼ阻害剤を新たに加えたＮＰ−４０等張溶解緩衝液(iso
tonic lysis buffer)(142.5 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 m
M HEPES pH:7.2, 1 mM EGTA, 0.2% NP-40, 0.2 mMフェ
ニルメチルスルフォニルフロリド, 0.1% Aprotinin, 0.
7 ug/ml Pepstatin及び1 ug/ml Leupeptin)中に溶解し
た。２１５０００×ｇで１０分間遠心分離器にかけ、核
及び溶解しなかった細胞の残りを取り除いた。溶解質を
１０％ｖ／ｖのプロティンＡ−セファロース（Ｐｒｏ
ｔ．Ａ−Ｓ）を用いて３０分の間前処理し、４００×ｇ
で２分間遠心分離器にかけて除去した。実験において
は、抗体の添加１５分前に、溶解質を１０倍の寒冷細胞
溶解質と混合した。特異性抗体を９０分間加え、イムノ
沈殿物を１０％ｖ／ｖのＰｒｏｔ．Ａ−Ｓを用いて６０
分間取り込んだ。幾つかの実験においては、第一イムノ
沈殿物の上澄みを１０％ｖ／ｖのＰｒｏｔ．Ａ−Ｓを用
いて再び前処理し、適当な第二抗体を用いて再度沈殿さ
せたイムノ沈殿物を（特に指摘しない限りは）溶解緩衝
液を用いて１度洗浄し、次にＮＰ−４０を含まない溶解
緩衝液で１度洗った。イムノ沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
検体緩衝液に溶解させ、１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲルを使用して電気泳動を行った。（35Ｓ）メ
チオニンにより標識された蛋白質を１０％の氷酢酸及び
３０％のメタノールにより１晩固定し、市販のフルオロ
グラフィーエンハンシング溶液(Enhance by DuPont) に
より強化(enhance) し、水中で３０分間沈殿させた。次
に、ゲルを乾燥させ−７０Ｃ゜でオートグラフィーを行
った。
【０１８０】イムノブロットのために、蛋白質をニトロ
セルロース膜上で４Ｃ゜で電気移動させた。３％の無脂
乳を含む燐酸緩衝溶液でフィルターを２時間遮断した。
全ての追加イムノ染色段階は、０．０５％のトゥイーン
−２０（ＰＢＳ−トゥイーン）含有燐酸緩衝溶液中で室
温で行った。フィルターを第一抗体と共に２時間培養し
た。種に共通のビオチン化第二抗体（１：３００）もま
た２時間反応させた。イムノブロットを山葵−過酸化酵
素−ストレプタビジン（１：１０００）と１時間反応さ
せた。フィルターをそれぞれの段階の間においてＰＢＸ
−トゥイーン中で５分間４回洗い、ジアゾベンジジン(B
ioRad)で染色し、塩化ニッケル（０．０３％）で強化し
た。
【０１８１】Ｄ）ペプチド配列 蛋白質分離のため、上述したように１×１０9 ＲＬ−７
又はＦＬ５．１２−ｈｂｃｌ−２細胞を大量にイムノ沈
殿させた。イムノ沈殿物を３ｍｍ厚の予備１２．５％Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動し、ク
ーマシーブルー染料で１０分間染色し、２０分間脱色し
た。適切な蛋白質バンドをゲルから切り取り、上述した
ように(cleveland等, 1976) 適量のS. aureus V8プロテ
アーゼ(calbiochem)"in gel"を用いて部分的に分解し
た。第二１７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに
よる分離の後、得られたペプチド断片を二フッカポリビ
ニリジン(immobilon PVDF by Millipore) 膜に電気移動
させた。フィルターを５０％メタノール中の０．１％ｗ
／ｖクーマシーブルー染料により７分間染色し、５０％
メタノール、１０％氷酢酸により５分間脱色し、水によ
り数回すすいで乾燥させた。染色したペプチド断片を切
り取り、直接Ｎ末端エドマン分解法(Matsudaira, 1987)
によりミクロ配列決定を行うまで、マクロファージ管中
に２０Ｃ゜で保存した。
【０１８２】臭化シアン（ＣＮＢｒ）及びｏ−フタルデ
ヒド（ＯＰＡ）プロトコル用に、上述のように大量のイ
ムノ沈殿物を３ｍｍ厚の予備１２．５％ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲルを通して電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に電
気移動させ、クーマシーブルー染料で染色した。ｐ２１
バンドを切り取り、ＣＮＢｒを用いてメチオニン残基で
分解し、配列決定した。特定の検体では、サイクルにお
いてアミノ酸プロリンが出現した場合にアミノ酸両末端
をＯＰＡにより遮断した (Hulmes等, 1989)。配列決定
を、そのＮ末端が遮断されていないイミノ酸プロリンを
有するシングルペプチド断片から再開した。
【０１８３】Ｅ）ＰＣＲ増幅及びクローニング ＲＬ−７細胞からオリゴ（ｄＴ）１５ｍｅｒ及びランダ
ムヘキサマー(randomhexamer, Pharmeciaより供給）で
プライムした標準プロトコルによりポリ（Ａ＋）ＲＮＡ
を調製し、モロニー(Moloney) マウスリンパ趣向性ウイ
ルス逆転写酵素（ＢＲＬ）により逆転写した。生成され
た相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を混合オリゴヌクレオチド
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）(Gould等,1989)に使用
した。全ての可能なコドン縮重を含む２つの混合オリゴ
ヌクレオチド貯留を、配列決定された２１ｋＤのヒトＢ
ａｘのアミノ酸配列を基に合成した。第一のプライマー
貯留はアミノ酸配列ＤＰＶＰＱＤに対応する２０５６
１７ｍｅｒの混合物であった。第二（アンチセンス）の
プライマー貯留はアミノ酸配列ＩＧＤＥＬＤから得、そ
れは２０５６ １７ｍｅｒの混合物であった。１００μ
ｌのＰＣＲ混合物は、７８９０ｐｍｏｌのそれぞれのプ
ライマー、０．１２５μｇのｃＤＮＡ、２ｍＭのそれぞ
れのｄＮＴＰ、１０ｍＭのトリスＨＣＬ（ｐＨ８．
３）、５０ｍＭのＫＣｌ、２１．５ｍＭのＭｇＣｌ2 及
び２．５ユニットのThermus aquatics (Taq)ＤＮＡポリ
メラーゼ(Perkin-Elmer/Cetus より提供) を含有してい
た。３８回の増幅サイクルは、９４Ｃ゜で２分間（最初
のサイクルでは４分間）の変性、６０Ｃ゜で２分間のア
ニーリング、７２Ｃ゜で１０分間( 最後のサイクルでは
６０分間）の伸展(extension) からなった。ＰＣＲ生成
物をアガロース電気泳動によりサイズ分別し、７１ｂｐ
生成物と予想されるものを精製し、ＰＣＲクローニング
ベクター (InVitrogenによるTAクローニングシステム）
に直接連結した。インサートを含有するコロニーを選択
し、プラスミドベクターのＴ７及びＳＰ６領域へのプラ
イマーを用いてインサートをシークエナーゼ (Sequenas
e, United States Biochemicalより提供) 配列決定し
た。
【０１８４】Ｆ）ｃＤＮＡの及びゲノムライブラリーの
スクリーニング 特に記述がない場合は、上述した分子クローニングの標
準的技法を用いた。制限酵素はBoehringer Mannheim Bi
ochemicals及びNew England Biolabs のものである。７
１２ｂｐのＰＣＲｃＤＮＡ（図３、ｂｐｓ１４２−２１
２）をＰＣＲ法によって放射標識し、lambda-ZAP II(St
ratageneにより提供）中のEpstein-Barrウイルス形質転
換ヒト成熟Ｂ細胞(Namalwa) ｃＤＮＡライブラリー(Amb
rus 等,1993) を標準ハイブリッド形成及び５０Ｃ゜で
の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの洗浄によりスクリーニ
ングするのに使用した。３つの独立したポジティブクロ
ーンをin vivo で切り取り配列決定した。配列決定した
インサートの最長のもの（８２０ｂｐ）をプローブとし
て使用し、lambda-ZAP II (Inaba等, 1992) 中の Namal
waヒトｃＤＮＡライブラリー、ヒト t(17;19) ALL earl
y B 細胞(UOC-B1)ｃＤＮＡライブラリー、又はlambda g
t 11 (Ben-Neriah, 1986) pre-β細胞ｃＤＮＡライブラ
リーを更にスクリーニングした。幾つかのヒト及びマウ
スｃＤＮＡクローンを得、サブクローンし、配列決定し
た。両方のストランドについてＢａｘ配列を最終決定し
た。
【０１８５】ゲノムスクリーニングに関しては、lambda
FIX II (Stratagene より入手) 中の１２９ＳＶマウス
ゲノムライブラリーをマウスＢａｘｃＤＮＡクローン全
長を用いてスクリーニングした。ｃＤＮＡの５’及び
３’末端に対してプローブと反応したプラーク精製ゲノ
ムクローンを選択した。ｃＤＮＡ配列の全ての５’から
３’末端を有するファージクローンＦ１のインサートを
ブルースクリプト(Bluescript)にサブクローンした。エ
キソンポジションを制限分析(restriction analysis)に
より配置し、ＤＮＡ配列がエキソン／イントロン境界を
定義した。
【０１８６】Ｇ）ノーザン分析 ＲＬ−７及びＦＬ５．１２細胞からポリ（Ａ＋）ＲＮＡ
を調製し、変性１．２％アガロース−ホルムアルデヒド
ゲルで電気泳動し、ニトロセルロース膜に移した。フィ
ルターを様々なプローブによりハイブリッド形成し、標
準プロトコルにより洗浄した。しかしながら、エキソン
２特異性プローブに関しては高緊縮(stringency)洗浄を
５０Ｃ゜において２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで行っ
た。
【０１８７】Ｈ）エピトープタッグ(Epitope tagging)
及び発現ベクター構成 インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）蛋白質の
よく特徴付けられたエピトープを含有する１１のアミノ
酸タッグを３段階のＰＣＲアプローチ(Kolodziej及びYo
ung)によりマウスＢａｘα（ＨＡ−Ｂａｘα）に結合さ
せた。第一、第二、及び第三ＰＣＲにおいて、Ｎ末端が
エピトープ及び共通翻訳開始部位(Kozak, 1986) を有し
Ｃ末端が停止コドンを有する２４−２６ｂｐのプライマ
ーを用いて、ＢａｘαＯＲＦの末端を段階的に延長し
た。更に、第三増幅に使用されるそれぞれのプライマー
にEcoRI 部位を導入した。ＰＣＲ混合物は、２０ｐｍｏ
ｌのそれぞれのプライマー、５０ｎｇのｃＤＮＡ、２ｍ
ＭのそれぞれのｄＮＴＰ、１０ｍＭのトリスＨＣＬ（ｐ
Ｈ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ
2 及び２．５ユニットのThermus aquatics (Taq)ＤＮＡ
ポリメラーゼを含有していた。３８回サイクルを通した
標的ｃＤＮＡの増幅は、９４Ｃ゜で１分間（最初のサイ
クルでは４分間）の変性、６０Ｃ゜（最初のサイクルで
は５２Ｃ゜）で１分間のアニーリング、７２Ｃ゜で１分
間（最後のサイクルでは１０分間）の伸展からなり、Ｐ
ＣＲ生成物を精製し、次の増幅サイクル用の鋳型として
使用するか、ＰＣＲクローニングベクター (InVitrogen
によるTAクローニングシステム）に直接連結した。ＰＣ
Ｒ反応の信憑性を配列決定により確認した。インサート
をEcoRI 分解により切り取り、SFFVLTR-Neo 発現ベクタ
ー(Fuhlbrigge 等,1988)のEcoRI クローニング部位にク
ローニングし、コンピテントＸＬ−１ブルー細胞(Srtat
egene)にトランスフォームした。インサートを含有する
コロニーを選択し、プラスミドベクターのＴ７及びＳＰ
６領域へのプライマーを用いてインサートをシークエナ
ーゼ (Sequenase, United States Biochemicalより提
供) 配列決定した。ＣｓＣｌにより２度精製し、線状化
したセンス−オリエンテーションプラスミド構成体(con
structs)を、ＢＴＸ３００トランスフェクターと共に電
気穿孔法（２００Ｖ，９００ｍＦ）によりＦＬ５．１２
細胞中に形質移入した。非選択性培地において細胞を２
４−４８時間回復させ、その後４−１２×１０4 の細胞
を０．２ｍｌのウェルでプレーティングすることによ
り、２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８(Gibcoより提供) 中のネオ
マイシン抵抗性、又は２ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシン
(Calbiochem より提供）によるハイグロマイシン抵抗性
に関して安定に形質移入された細胞を選択した。生存し
た細胞を展開(expand)し、溶解及びトータル蛋白質と同
量のイムノブロットにより、ＨＡ−Ｂａｘα及び内因(e
ndogenous)マウス又は形質移入されたヒトｂｃｌ−２蛋
白質の発現レベルに関してスクリーニングを行った。高
／低ＨＡ−Ｂａｘα及び（又は）ヒトｂｃｌ−２発現ク
ローンを次の分析のために選択した。
【０１８８】Ｉ）成長因子枯渇調査 細胞生存に対するＢａｘαの影響を評価するために、安
定に形質移入された細胞をＩＬ−３の存在下で２×１０
5 細胞／ｍｌの濃度で２４時間培養した。成長因子を除
去するために血清を含まない培地中で３度にわたり細胞
を完全に洗浄し、３重複製して５×１０5 細胞／ｍｌで
培養した。様々な時間経過ポイントにおいてそれぞれの
培地から少なくとも１００の細胞に対しトリパンブルー
排除計算を行い、生存率を求めた。
【０１８９】例２ 本実施例はｂｃｌ−２と２１ｋＤ蛋白質との共同沈降(c
o-precipitation)を実証するものである。
【０１９０】共同イムノ沈降実験を、ヒトｂｃｌ−２に
特異的な６Ｃ８モノクローナル抗体（ｍｏＡｂ）とｔ
（１４；１８）トランスロケーションを有し高レベルの
ｂｃｌ−２を発現するヒトＢ細胞系であるＲＬ−７とを
用いて行った。様々な界面活性剤コンディションをｂｃ
ｌ−２会合蛋白質を確認するためにテストした。ＲＬ−
７細胞を代謝的に35Ｓ−メチオニンで標識し、溶解し、
０．２％のＮＰ−４０に溶かした際に多量の２１ｋＤ蛋
白質が（ｐ２１）ｂｃｌ−２と共に共同沈降した。より
少量の２４ｋＤ蛋白質もまた検出された（図１）。
【０１９１】図１において、35Ｓ−メチオニンで標識し
たＲＬ−７細胞の溶解質は競合冷(cold)溶解質の存在下
（＋）又は非存在下（−）においてアンチヒトｂｃｌ−
２ｍｏＡｂと共にイムノ沈降し、上記のそれぞれのレー
ンに示したように洗浄した。イムノ沈降物を等張溶解緩
衝液で洗浄した際に会合物はそのまま残った。しかしな
がら、０．１％のＳＤＳの添加によりｐ２１は取り除か
れた。これはｐ２１がｂｃｌ−２の分解による生成物で
あるというよりはむしろ非共有的会合蛋白質であること
を示している。
【０１９２】過剰冷ＲＬ−７細胞溶解質の存在下でも放
射標識ｐ２１はまだｂｃｌ−２と共に共同沈降し、これ
は細胞溶解による非生理的会合ではないことを示してい
る。ｂｃｌ−２及びｐ２１及びｎ特異的相互作用を確認
するために、インターロイキン−３（ＩＬ−３）依存マ
ウス細胞系であるＦＬ５．１２を調査した。ＩＬ−３の
非存在下においてはＦＬ５．１２はアポプトシスにより
死滅するがｂｃｌ−２の過剰発現(overexpression)はそ
の生存を延長する。
【０１９３】ＦＬ５．１２発現野生型ヒトｂｃｌ−２
（ＦＬ５．１２ｈｂｃｌ−２）又はＣＯＯＨ末端シグナ
ル−アンカー配列を有しないヒトｂｃｌ−２コンストラ
クト(construct) の安定トランスフェクタントを生成し
た。ｂｃｌ−２△Ｃ−２２蛋白質はもはや膜内存性蛋白
質ではないが、細胞死からの部分的保護を依然として提
供する。ヒトｂｃｌ−２と種特異性６Ｃ８ｍｏＡｂとの
イムノ沈降はＦＬ５．１２ｈｂｃｌ−２細胞中の会合マ
ウスｐ２１蛋白質を明確にした（図２）。図２におい
て、ベクターのみ（Ｎｅｏr ) 、野生型ヒトｂｃｌ−２
（ｂｃｌ−２）、又はヒトｂｃｌ−２のシグナル−アン
カー配列が欠如した欠失変異株（△Ｃ−２２）と形質移
入した35Ｓ−メチオニンで標識したＦＬ５．１２クロー
ンの細胞溶解質を、アンチ−ヒトｂｃｌ−２ｍｏＡｂ
（６Ｃ８）又は対照抗体（ＮＳ）と共にイムノ沈降させ
た。イムノ沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
ＮｅｏRベクターのみと形質移入したＦＬ５．１２細胞
を６Ｃ８とイムノ沈降させた場合にはｐ２１分子は検出
されなかった。同様に、イソタイプ合致(isotype mache
d)対照抗体であるＴＮ３１９．１２（ＮＳ）はＦＬ５．
１２−ｈｂｃｌ−２細胞を認識しなかった。
【０１９４】幾分効果的ではなかったにせよ、△Ｃ−２
２細胞質ゾル形態のｂｃｌ−２もまた０．２％ＮＰ−４
０溶解質からマウスｐ２１を共同沈降させた。これらの
発見は、種々間におけるｐ２１及びｂｃｌ−２間の相互
関係の特異性及び保存(conservation)を証明するもので
ある。この理由の故に、ｐ２１をＢａｘ（つまりｂｃｌ
−２会合Ｘ蛋白質）と呼ぶものである。
【０１９５】例３ 本実施例はプログラムされた細胞死の誘導がｂｃｌ−２
とＢａｘとの関連を変化させるかどうかを実証するもの
である。
【０１９６】ＩＬ−３の使用中止後、ＦＬ５．１２細胞
が死滅し始めた時間、及びＩＬ−３の追添加が細胞を援
助することができなくなった後１２時間に渡ってイムノ
沈降を行った。ＩＬ−３欠乏後の野生型又はトランケー
ト(truncated) ｂｃｌ−２に会合するＢａｘの量に変化
はなかった。
【０１９７】例４ 本実施例はＢａｘの分子クローニングを実証するもので
ある。
【０１９８】Ｂａｘの本質を決定するために大量のヒト
ＲＬ−７及びマウスＦＬ５．１２−ｈｂｃｌ−２細胞の
６Ｃ８ｍｏＡｂイムノ沈降物を、予備ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲルを用いて電気泳動し、二フッカポリビニ
リジン（ＰＶＦＤ）膜に電気ブロットした。ｐ２１（Ｂ
ａｘ）含有バンドをミクロシークエンシング(microsequ
encing) 用に調製し、Ｎ末端を遮断した。結果として、
Ｖ８プロテアーゼ、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、又はｏ−
フタルデヒドに続くＣＮＢｒによるin situ 分解によ
り、内部ペプチド断片が生成した。ペプチド断片をエド
マン分解により配列決定し、２つのオーバーラップ内部
断片がヒト又はマウス配列の２９個のアミノ酸を提供し
た（図３及び４）。
【０１９９】図３及び４において、ヒトＢａｘのコード
ストランド(coding strand) のＤＮＡ配列及び予想され
たアミノ酸配列が示されている。不一致(divergent) の
マウス残余蛋白質のみが示されている。太いアンダーラ
インが引かれた残余アミノ酸はヒト（上）及びマウス
（下）Ｂａｘの配列決定されたペプチドに相当する。細
いアンダーラインが引かれたアミノ酸は、ｃＤＮＡ配列
と臭化シアン分解により生成されたペプチド断片の混合
物を配列決定することによりに得られた残余アミノ酸と
を連係(align) することによりその位置が明確に決定さ
れた残基に相当する。ジグザグの線は予想されたＢａｘ
のトランス膜ドメインを示している。エキソン境界はｃ
ＤＮＡ配列上の数字によって示されている。矢印は混合
オリゴヌクレオチドＰＣＲ増殖中に使用された縮重(deg
enerate)プライマーの元を示す。α及びβ形態のＢａｘ
間の分岐開始点は★により示されている。
【０２００】分離された配列は既知の蛋白質と同一でも
類似でもなく、ＢａｘｃＤＮＡのクローニングの基礎を
提供した。配列決定されたヒト断片のＤＰＶＰＱＤ（セ
ンス）及びＩＤＧＥＬＤ（アンチセンス）アミノ酸領域
に相当する２つの縮重プライマー（図３及び４、矢印）
を、ＲＬ−７ｃＤＮＡを鋳型として用いた混合オリゴヌ
クレオチドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用し
た。予想されたサイズの７１ｂｐＰＣＲ生成物をサブク
ローンし、その信憑性をＤＮＡ配列決定により証明し、
ヒトＢ細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする
為のプローブとして使用した。８２０ｂｐの部分的ｃＤ
ＮＡクローンを得、配列決定し、追加ヒト及びマウスｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用し
た。多数のヒト及びマウスｃＤＮＡクローンを得、サブ
クローンし、Ｂａｘの完全なアミノ酸配列を確立するた
めに配列決定した。ｃＤＮＡ配列から推定される予想蛋
白質の信憑性を証明するために、エドマン分解により得
られた残余アミノ酸を連係させた。図３及び４はヒト及
びマウス双方のＢａｘの直接アミノ酸配列と同様にヒト
ｃＤＮＡ配列及び推定配列を示している。全ての配列決
定されたアミノ酸はｃＤＮＡから予想された蛋白質配列
を説明し又それと同一であった。
【０２０１】ヒト及びマウスＢａｘ双方の読み取り枠(o
pen reading frame, oRF) は５７６ｂｐであり、８９．
４％がお互いに同一のものであった。双方のＯＲＦは１
９２のアミノ酸蛋白質をエンコードしており、それは２
１．４ｋＤの分子量を予想させるものである。マウス及
びヒトｃＤＮＡ双方のメチオニン開始コドンはコザック
共通配列(Kozak, 1986) と同一であった。マウスおよび
ヒトＢａｘは高度に保存されており、９６％が一致して
おり、６個の保存及び８個の非保存アミノ酸が殆どＮ末
端ハーフにおいて異なるのみであった。双方の蛋白質
は、燐酸化部位である可能性のある７個のＳｅｒ／Ｔｈ
ｒ残余蛋白質を有している。ヒドロパシシティ(hydropa
thicity)分析(Eisenberg等, 1984) はＣ末端トランス膜
ドメインの存在を予想し、Ｂａｘが膜内存性蛋白質であ
ることを示唆している。
【０２０２】例５ 本実施例は、Ｂａｘ遺伝子のゲノム構成を実証するもの
である。
【０２０３】マウスゲノムクローンをゲノムファージラ
イブラリーをマウスＢａｘｃＤＮＡプローブと共にスク
リーニングすることにより分離した。クローンをプラー
ク精製し、制限(restriction) 分析により特徴付けた。
エキソン及びエキソン−イントロン境界の位置を制限酵
素分析及びゲノム配列により決定した。転写の方向は左
から右であった。
【０２０４】ファージクローンＦ１はｃＤＮＡの全５’
から３’末端を有する１６ｋｂのゲノムインサートを含
有していた。エキソン−イントロン境界をｃＤＮＡから
のプライマーにより配列し、全てのケースにおいて共通
エキソン／イントロンスプライシング配列要求に合致し
ていた。Ｂａｘ遺伝子は全て４．５ｋｂ領域内である６
個のエキソンよりなっていた。蛋白質エンコード情報は
６個全てのエキソンにより寄与されていた。
【０２０５】例６ 本実施例はＢａｘ遺伝子の副(alternative) 転写及び組
織分布を実証するものである。
【０２０６】７０−Ｚ／３マウスｐｒｅ−Ｂ細胞ｃＤＮ
Ａライブラリーは、その配列が図３及び４に示されるシ
ングルＢａｘ種を安定して生成した。しかしながら、ナ
マルワ(Namalwa) ヒト成熟Ｂ細胞及びｔ（１７／１９）
初期Ｂ白血病細胞(UOC-B1)ｃＤＮＡライブラリーもまた
図３及び４に示された配列から分岐した幾つかのクロー
ンを生成した。これらのライブラリーは図５に示される
３種のＢａｘｃＤＮＡを有していた。
【０２０７】図５において箱型は数字によって確認され
るエキソンを示している。そのＲＮＡに対するエキソン
３とＢａｘγ中の蛋白質生成物との間の影の度合いの違
いはエキソン２の副スプライシングによるエキソン３の
フレームシフトを示している。１．０ｋｂのαＲＮＡは
予想されたトランス膜セグメント(segment A) と共に１
９２個アミノ酸による２１ｋＤの蛋白質をエンコード
し、１．５ｋｂβＲＮＡは疎水性末端を含有せず又細胞
質ゾル形状であることのできる２１８個アミノ酸２４ｋ
Ｄ蛋白質をエンコードする。このβＲＮＡは６３０ｂｐ
の非スプライシングイントロンを有し、１．０から１．
５ｋｂまでの明確なサイズ増加の主な原因となる（図５
及び６）。図６において、Ｂａｘβ形態のＤＮＡ配列及
び予想アミノ酸配列コードはエキソン５−イントロン境
界から始まる。イントロン５は停止コドンの前に６０個
のアミノ酸に寄与し、トランス膜ドメインを欠いてい
る。ＲＮＡのγ形態を示す多数のｃＤＮＡは小さな５３
ｂｐエキソン２を欠いている（図５）。１．０ｋｂ及び
１．５ｋｂ形態のγＲＮＡ種の双方に注目し、イントロ
ン５の副スプライシングにより識別した（図５）。エキ
ソン２の除去は、停止コドンの前に３０の新規アミノ酸
に寄与したであろうエキソン３のリーディングフレーム
をシフトする（図７）。図７には、Ｂａｘγ形態のＤＮ
Ａ配列及び予想アミノ酸配列が示されている。もし翻訳
するならば、γＲＮＡは分子量４．５ｋｄの４１個のみ
のアミノ酸による蛋白質を予想することになる（図
５）。
【０２０８】細胞内に予想されたＢａｘ種が成熟ｍＲＮ
Ａとして存在するかどうかをテストするために、ＦＬ
５．１２及びＲＬ−７からのポリ（Ａ＋）ＲＮＡのノー
ザンブロット分析を行った。ｃＤＮＡプローブを含有す
るエキソン１、３、４、５、６はＦＬ５．１２内のシン
グル１．０ｋｂＲＮＡ種を確認したが、ＲＬ−７内の
１．０及び１．５ｋｂＲＮＡは確認できなかった。１．
０及び１．５ｋｂ双方のＲＮＡをエキソン６特異性プロ
ーブにより検出したが、１．５ｋｂＲＮＡのみを確認し
た。エキソン２特異性プローブはＩＬ−３依存ＦＬ５．
１２細胞のＲＮＡに対し無限分裂ＲＬ−７細胞系よりも
強くハイブリッド形成した。従って、３つのタイプの蛋
白質を予想する副スプライスされたα、β、γＲＮＡ種
の存在がノーザン及びｃＤＮＡ分析により証拠付けられ
た。ＦＬ５．１２細胞は１．０ｋｂαＲＮＡを有し、ｂ
ｃｌ−２に会合するｐ２１分子のみを実証した（図
２）。可能性のある関係として、ＲＬ−７ｈａ１．０ｋ
ｂα及び１．５ｋｂδＲＮＡ双方を明らかにし、ｂｃｌ
−２に会合するｐ２１及びｐ２４分子双方を示した（図
１）。それは更に、ＲＬ−７中のｂｃｌ−２会合ｐ２４
分子が１．５ｋｂＢａｘβＲＮＡの生成物であることを
明らかにした。
【０２０９】臓器調査からの全ＲＮＡのノーザン分析
は、Ｂａｘがリンパ球に制限されず、様々な組織におい
て幅広く発現されることを示した。肺、胃、腎臓、及び
脾臓を含む多くの組織が１．０及び１．５ｋｂ両方のＲ
ＮＡ種を発現した。１．０ｋｂＲＮＡは心臓及び平滑筋
において幾分優先され、一方、十二指腸は主に１．５ｋ
ｂＲＮＡを明らかにした。１．０ｋｂＲＮＡは膵臓にお
いて最も豊富である一方、肝臓は実質的な量の遺伝子を
発現しなかった。興味深いことに、脳は１．５ｋｂＲＮ
Ａ及びより分子量の大きい種を有している。ノーザン分
析はＢａｘの幅広い発現並びに種類及び細胞タイプの間
で異なるスプライシングパターンを示している。
【０２１０】例７ 本実施例はＢａｘ蛋白質とｂｃｌ−２とが相同性である
ことを実証するものである。
【０２１１】ＢＬＡＳＴ及びＴＦＡＳＴＡアルゴリズム
によりＧｅｎＢａｎｋデータべースを調査した際に、ｐ
２１Ｂａｘとｂｃｌ−２との間に２０．８％の同一性及
び４３．２％の類似性があることが明らかとなった（図
８）。この一致は欠損(minuses) により標識したインサ
ートを導入した際に最高になった。全ての４つの蛋白質
間の同一性は黒影により示され、保存的変化は点彩さ
れ、エキソン境界は数字により示されている。２つの最
も領域であるドメインＩ及びドメインＩＩは箱に入れら
れている。分子全体を通して幾つかの類似が存在する一
方、Ｂａｘのエキソン４及び５に相当する領域が最も保
存されている。ｂｃｌ−２とＢａｘとの間の最も高く保
存されている箇所が図８においてドメインＩ及びドメイ
ンＩＩとして示されている。ドメインＩはＢａｘエキソ
ン４上に、ドメインＩＩはエキソン５上に、及び推定ト
ランス膜ドメインはエキソン６上に位置している。ドメ
インＩＩ末部のＢａｘエキソン５／６接合(juncture)は
ｂｃｌ−２のエキソン２／３接合の位置と同一である。
興味深いことに、この部位でのイントロン５の保持(ret
ention) は、トランス膜ドメインを欠いたβ形態のＢａ
ｘＲＮＡを生じる。同様に、エキソン３を欠きイントロ
ン２で終了するｂｃｌ−２のαβＲＮＡ形態はが観察さ
れており、シグナル−アンカーセグメントが欠如したβ
蛋白質が予想される。
【０２１２】例８ 本実施例は過剰発現されたＢａｘαがプログラムされた
細胞死を促進することを実証するものである。
【０２１３】Ｂａｘ及びｂｃｌ−２の間の合致及び物理
的連係もまたプログラムされた細胞死を調節する可能性
がある。当然の帰結として、ＩＬ−３の使用中止後通常
はアポプトシスにより死滅するＦＬ５．１２内のＢａｘ
を過剰発現させた。形質移入されたＢａｘの蛋白質レベ
ルを追うために、よく特徴付けられたインフルエンザウ
イルス赤血球凝集素（ＨＡ）蛋白質エピトープを含有す
る１１アミノ酸タグをＰＣＲ法によりマウスＢａｘαの
Ｎ末端に結合させた。ＳＦＦＶＬＴＲを構造性発現プロ
モーターとして使用し、このＨＡ−Ｂａｘαインサート
を発現コンストラクト中にサブクローンした。ＦＬ５．
１２細胞を電気穿孔し、Ｇ４１８抵抗安定クローンを制
限希釈により選択した。マウスｂｃｌ−２特異性３Ｆ１
１ｍｏＡｂと共に内因マウスｂｃｌ−２のレベル、及び
ＨＡエピトープタッグ特異性１２ＣＡ５ｍｏＡｂと共に
Ｂａｘ、に関してクローンを評価した（図９（Ｂ）、
（Ｃ））。
【０２１４】一連の高及び低Ｂａｘ発現クローンをＩＬ
−３欠如培地に入れ、細胞生存率を生体色素排除により
監視した。野生型ＢａｘαもＨＡ−Ｂａｘαのどちらの
過剰発現も、評価された多数のクローンに対し生存優位
性を与えなかった。その代わり、高レベルのＢａｘの存
在は図９（Ａ）の細胞死の速度を着実に増加した。
【０２１５】図９（Ａ）において、細胞生死判定検定を
行った。ＦＬ５．１２対照細胞（Ｎｅｏr ) 、ヒトｂｃ
ｌ−２形質移入（ｂｃｌ−２）、及び構造的にＨＡ−Ｂ
ａｘαを発現する幾つかの独立クローンを三重複製し、
ＩＬ−３を枯渇させた。ＩＬ−３投与中止後１２、１
８、２４、３０、４８時間後にトリパンブルー排除法に
より生存の確率を測定し、平均±標準誤差としてグラフ
作成した。
【０２１６】図９の（Ｂ）及び（Ｃ）において、ＦＬ
５．１２対照細胞（Ｎｅｏ）及びＨＡ−Ｂａｘα（ｃ
ｌ．）中の内因性マウスｂｃｌ−２（Ｂ）又はＨＡ−Ｂ
ａｘα（Ｃ）蛋白質のウェスタンブロット分析はＦＬ
５．１２クローンを形質移入した。マウスｂｃｌ−２特
異性ｍｏＡｂ３Ｆ１１（Ｂ）、又は赤血球凝集素エピト
ープタッグ特異性ｍｏＡｂ１２ＣＡ５（Ｃ）を使用し
た。ＨＡ−Ｂａｘαは１６、１８、２０、２２、２３ク
ローンを安定して形質移入し、Ｂａｘインサート（Ｎｅ
ｏR ) を欠く対照ベクターと共に形質移入されたＦＬ
５．１２細胞は比較できるレベルの内因性マウスｂｃｌ
−２を有していた（図９の（Ｂ））。Ｂａｘα蛋白質の
レベルは最低（ＣＬ２０）から高（ＣＬｓ１６、１８、
２２、２３）の間で変化した（図９の（Ｃ））。図９に
示される通り、ＣＬ２０はＩＬ−３投与中止後２４−４
８時間ほんの僅かＮｅｏR 対照から外れただけである。
しかしながら、高発現１６、１８、２２、及び２３ＣＬ
は、ＮｅｏR 系の１８％の生存率と比較して、１８−３
０時間で細胞死が加速され、４８時間後には殆ど全てが
死滅した。
【０２１７】例９ 本実施例はｂｃｌ−２のＢａｘに対する比率がプログラ
ムされた細胞死の速度に影響することを実証するもので
ある。
【０２１８】ｂｃｌ−２とＢａｘとの間の内なる関係を
調査するために、高レベルのＨＡ−Ｂａｘαと共に２つ
の細胞系でｂｃｌ−２を過剰発現させた。確立されたＨ
Ａ−Ｂａｘαの１６及び２３クローンをＳＦＦＶ−ｈｂ
ｃｌ−２ベクター及びハイグロマイシン選択標識を提供
する発現ベクター（ＬＡＰ２６７）と共に形質移入し
た。ハイグロマイシン抵抗性クローンを選択し、６Ｃ８
ｍｏＡｂとのｈｂｃｌ−２の発現及び１２ＣＡ５ｍｏＡ
ｂとのＨＡＢａｘαレベルに関して評価した（図１０の
（Ｂ），（Ｃ））。
【０２１９】図１０の（Ａ）において、ＦＬ５．１２対
照細胞（Ｎｅｏr ) 、ヒトｂｃｌ−２形質移入（ｂｃｌ
−２）、及び構造的にＨＡ−Ｂａｘα及びヒトｂｃｌ−
２（１６−８、１６−５、２３−５）双方を発現する３
つの独立ＦＬ５．１２細胞を三重複製し、ＩＬ−３を枯
渇させて細胞生死判定検定を行った。幾つかの時間ポイ
ントにおいてトリパンブルー排除法により生存確率を測
定し、平均±標準誤差としてグラフ作成した。図１０の
（Ｂ）及び（Ｃ）には、ＦＬ５．１２対照細胞（Ｎｅ
ｏ）、ヒトｂｃｌ−２形質移入（ｂｃｌ−２）、及び構
造的にＨＡ−Ｂａｘα及びヒトｂｃｌ−２（１６−８、
１６−５、２３−５）双方を発現する３つの独立ＦＬ
５．１２細胞クローン中の形質移入ヒトｂｃｌ−２
（Ｂ）及びＨＡ−Ｂａｘα（Ｃ）のウェスタンブロット
分析が示されている。ヒトｂｃｌ−２特異性ｍｏＡｂ６
Ｃ８（Ｂ）又は赤血球凝集素エピトープタッグ特異性ｍ
ｏＡｂ１２ＣＡ５を使用した。
【０２２０】高レベルのｂｃｌ−２を発現する１６−５
及び２３−５クローン並びに中間量のｈｂｃｌ−２を発
現する１６−８クローンを次の研究用に選択した。これ
らの細胞中の２つの蛋白質の比較量の濃度概算は、１６
−５ＣＬに対し２．０４、２３−５ＣＬに対し１．６
５、及び１６−８クローンに対し０．５５のｈｂｃｌ−
２／ＨＡＢａｘα比率であった。ＩＬ−３投与中止後の
アポプトシス死の時間経過を、これらのクローンとＮｅ
ｏR 対照ベクターのみ又はｈｂｃｌ−２のみを有するＦ
Ｌ５．１２とで比較した（図１０の（Ａ））。ｈｂｃｌ
−２の添加はＢａｘにより促進される細胞死を一部逆行
させた。複数の実験において、細胞死の速度はｈｂｃｌ
−２／ＨＡ−Ｂａｘαの比率と対応していた。二重形質
移入した１６−５及び２３−５クローンは２４時間死滅
しなかったのに対し、ＮｅｏR 対照系はこの時間におい
て４３％の生存率しかなかった。最低のｈｂｃｌ−２／
ＨＡＢａｘα比率を有する１６−８クローンは２４時間
で７３％が生存していたが、第７日には全て死滅した。
高ｈｂｃｌ−２／ＨＡ−Ｂａｘα比率を有する１６−５
及び２３−５クローンはＩＬ−３枯渇後２週間たっても
生存細胞を有していた。共通性のあるｂｃｌ−２レベル
を有するにもかかわらず、１６−５クローン及び２３−
５クローンはｈｂｃｌ−２のみを発現するクローンに観
察された生存率には決して近づかなかった（図１０の
（Ａ））。従って、Ｂａｘの存在はｂｃｌ−２の死滅抑
制体活性にも逆行するものである。
【０２２１】例１０ 本実施例はＢａｘがホモダイマーを形成し、ｂｃｌ−２
と共にヘテロダイマーを形成することを実証するもので
ある。
【０２２２】ｂｃｌ−２、Ｂａｘ及び細胞生存間の相応
及び相互関係はそれらのin vivo での関連に対する更な
る実験を促した。ＨＡ−Ｂａｘαシングル形質移入細胞
をＨＡタッグ特異性１２ＣＡ５ｍｏＡｂと共にイムノ沈
降させた際に、相当量の内因性ｐ２１Ｂａｘが共に沈降
した（図１１、５レーン）。ヒトｂｃｌ−２（ｂｃｌ−
２）、ＨＡタッグされたマウスＢａｘ（Ｂａｘ）、又は
ヒトｂｃｌ−２及びＨＡタッグされたＢａｘ両方（Ｂ＋
Ｂ）と共に形質移入された（35Ｓ）メチオニン標識クロ
ーンの細胞溶解質を、アンチ−ヒトｂｃｌ−２ｍｏＡｂ
（６Ｃ８）、ＨＡ特異性ｍｏＡｂ（１２ＣＡ５）、又は
マウスｂｃｌ−２特異性ｍｏＡｂ（３Ｆ１１）と共にイ
ムノ沈降させた。イムノ沈降した蛋白質をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより分解した。
【０２２３】図１２において、ビオチン化３Ｆ１１ｍｏ
Ａｂと共にマウスｂｃｌ−２の（左）、又は６Ｃ８ｍｏ
Ａｂと共に形質移入されたヒトｂｃｌ−２の（右）、第
一イムノ沈降物のウェスタンブロット分析を行った。Ｆ
Ｌ５．１２対照細胞（Ｎｅｏ r ）又はＨＡＢａｘαによ
り形質移入されたクローン（Ｂａｘ）又はヒトｂｃｌ−
２＋ＨＡＢａｘα（Ｂ＋Ｂ）を、マウスｂｃｌ−２特異
性ｍｏＡｂ（３Ｆ１１）、ＨＡ特異性ｍｏＡｂ（１２Ｃ
Ａ５）、又はヒトｂｃｌ−２特異性ｍｏＡｂ（１２
４）、と共にイムノ沈降した。
【０２２４】図１３において、図１１における沈降物か
らの上澄みの第二イムノ沈降を行った。指示は図１１と
全く同じである。第一イムノ沈降に使用されたｍｏＡｂ
は括弧内に示されている。第二イムノ沈降に使用された
ｍｏＡｂが続いて示されている。イムノ沈降された蛋白
質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展進した。
【０２２５】加えて、非常に少量の内因性マウスｂｃｌ
−２もまたＨＡ−Ｂａｘαと共に沈降した。１２ＣＡ５
ｍｏＡｂ沈降物のウェスタンブロットはマウスｂｃｌ−
２の同一性を確認した（図１２、１レーン）。残余上澄
みとマウスｂｃｌ−２特異性３Ｆ１１ｍｏＡｂとのイム
ノ沈降は、大部分の内因性ｂｃｌ−２がＢａｘに会合し
ていなかったことを明らかにした（図１３、４レー
ン）。この発見は実験を逆の順序で行うことにより確認
した。３Ｆ１１ｍｏＡｂとの第一イムノ沈降物中のマウ
スｂｃｌ−２の大分部は、ＨＡ−Ｂａｘα又は内因性Ｂ
ａｘと複合されてはいなかった（図１１、６レーン）。
しかし、１２ＣＡ５ｍｏＡｂとの残余上澄みの第二イム
ノ沈降は、ＨＡ−Ｂａｘαの大部分が内因性Ｂａｘ蛋白
質と複合していたことを明確にした（図１３、５レー
ン）。ビオチン化３Ｆ１１ｍｏＡｂとのイムノブロット
は、ＨＡ−Ｂａｘαに会合する内因性マウスマウスｂｃ
ｌ−２の量が総合マウスｂｃｌ−２に比較して少量であ
ることを立証した。
【０２２６】しかしながら、ｂｃｌ−２発現構造により
導入された高レベルのｂｃｌ−２蛋白質はｂｃｌ−２／
ＢａｘヘテロダイマーとＢａｘホモダイマーとの比を変
化させた。二重形質移入された細胞を６Ｃ８ｍｏＡｂと
共にイムノ沈降させた際に、エピトープタッグ及び内因
性Ｂａｘ双方は過剰発現されたｈｂｃｌ−２と複合した
（図１１、３レーン）。１２ＣＡ５ｍｏＡｂとの残余上
澄みの第二イムノ沈降は、幾つかのＢａｘはｂｃｌ−２
と複合せず、代わりにホモダイマーを形成していたこと
を明確にした（図１３、３レーン）。相互実験におい
て、１２ＣＡ５、ｍｏＡｂイムノ沈降物もまたｈｂｃｌ
−２を含有していた（図１１、４レーン）。相当量のｈ
ｂｃｌ−２がＢａｘに依存していない様であった（図１
１、３、４レーン比較）。しかしながら、１２ＣＡ５の
イムノ沈殿は、６Ｃ８ｍｏＡｂとのイムノ沈殿がｂｃｌ
−２と会合する内因性Ｂａｘ及びＨＡ−Ｂａｘαを明確
にした際に、残余上澄みの点で完全ではなかった（図１
３、２レーン）。しかし、そのバンド濃度はｈｂｃｌ−
２の一部がＢａｘ分子から独立していることを証明して
いる（図１３、２レーン）。イムノブロットは相当量の
ｈｂｃｌ−２がＨＡ−Ｂａｘαのイムノ沈殿物中に存在
したことを立証した（図１２、４レーン）。
【０２２７】これらの研究はＢａｘがホモダイマー化す
ること及びｂｃｌ−２の過剰発現がヘテロダイマー化で
Ｂａｘと競合することを立証する（図１１、２、３、４
レーン）。このことはまた全ての指示された蛋白質形態
がダイマー又は長鎖オリゴマーである図１４に示されて
いる。幾つかのｂｃｌ−２のホモダイマー化を既に記述
したので、遊離ｂｃｌ−２を代わりにモノマー又はホモ
ダイマーとして図示している。
【０２２８】ｂｃｌ−２の部位特異性突然変異誘発並び
にその蛋白質−蛋白質相互作用及び死滅への委託におけ
る決定段階最終調整への関連もまた思いがけず発見され
た。このことは次の図により詳細に示されている。
【０２２９】図１５において、ＢａｘｃＤＮＡのクロー
ニングは、ドメインＩ及びドメインＩＩとして知られて
いるセグメント内に最も高度に保存されている遺伝子に
緊密に関連しているｂｃｌ−２の系統群を立証した。今
ではこれが、ｂｃｌ−ｘ、ＭＣＬ−１、及び２つのＤＮ
Ａウイルス蛋白質、エプスタインバー(Epstein Barr)ウ
イルスのＢＨＲＦ−１と同様にＬＭＷ５−ＨＬを含有す
るより広い分子の系統群であることがはっきりしてい
る。見て分かるとおり、これらの蛋白質における相応は
ドメインＩ及びＩＩに集中している。特に印象的なもの
は、図８におけるドメインＩの中間セグメントであり、
エプスタインバーウイルス蛋白質まで全て保存されてい
るＮＷＧＲはＧＲモティーフを保持している。Ｂａｘ及
びｂｃｌ−２がin vivo 及びin vitroの両方において相
互作用を及ぼす能力の証明は、これらの他のｂｃｌ−２
関連蛋白質もまたこの系統群の異なるメンバーとのホモ
ダイマー化及びヘテロダイマー化に関連していることを
強く示している。従って、ｂｃｌ−２／Ｂａｘの相互作
用及び物理的機能に影響を与えることを示したドメイン
Ｉ及びドメインＩＩの全ての操作は、記述された全ての
系統群のメンバーに等しく適用することができる。
【０２３０】図１５の（Ｂ）は用いられたｂｃｌ−２中
のドメインＩ全体における点変異(point mutation)を示
しており、図１５の（Ｃ）は図８中の保存ドメインＩＩ
におけるテストされた変異を示している。
【０２３１】図１６は流動細胞計測法により決定され
た、細胞内にｂｃｌ−２蛋白質を安定に形質移入された
ＩＬ−３依存ＦＬ５．１２細胞系におけるｂｃｌ−２蛋
白質発現レベルの分析を示したものである。示されてい
るとおり、変異性生成物のレベルは野生型ｂｃｌ−２ク
ローンのそれと比較することができる。図１７はＦＬ
５．１２の同一安定トランスフェクタントであり、安定
状態蛋白質の比較レベルを立証するものである。図１８
は、ガンマ線誘導死と同様にデキサメタソン(dexametha
sone) に感受性のある２Ｂ４ Ｔ細胞ハイブリドーマ(h
ybridoma) におけるこれらの発現構成を有する安定トラ
ンスフェクタントの平行分析である。これらの試剤もま
た比較レベルの安定状態ｂｃｌ−２蛋白質を有してい
る。この図は、これらの分子が有する機能における全て
の物理的相違が変形点変異に固有のものであり、ｂｃｌ
−２蛋白質の量的レベルに固有のものではないことを立
証するものである。
【０２３２】図２０は、ＦＬ５．１２の安定形質移入の
ＩＬ−３枯渇時間経緯を示すものである。これは野生型
ｂｃｌ−２が、ネオマイシン抵抗性発現ベクターのみを
受けた対照と比較して、ＦＬ５．１２細胞をプログラム
された細胞死から救うということを証明するものであ
る。さらに重要なことには、ＦＲＤＨ配列又はＷＧＲ配
列の何れかを除去するドメインＩにおける変異は、死を
抑制するｂｃｌ−２生成物の能力を実質的に除去する。
細胞死の速度はＮｅｏ対照クローンの時間経過と同一の
ものに戻る。これに加えて注目すべきことは、ＷＧＲ配
列におけるグリシンの代わりにｍＩ−３中のアラニン又
はｍＩ−４内のグルタミン酸の何れかを置換するという
ＷＧＲ配列中の１つのアミノ酸の変更が、細胞死を抑制
するというｂｃｌ−２の能力を完全に取り除いてしまう
ということである。実際、これらのクローンは対照との
比較において細胞死の加速を示す。この後記述されるよ
うに、このことはｂｃｌ−２がＢａｘ以外に他の蛋白質
と関連しているという可能性の証拠を提供するものであ
る。
【０２３３】図２０の（Ｂ）は、この死がヌクレオゾー
ム的長さ(nucleosomal) のＤＮＡ分解パターンが見うけ
られるアポプトティクにプログラムされた細胞死である
ことを立証するものである。図２０の（Ｃ）において
は、ジフェニルアミン検定による開放されたＤＮＡの測
定としてＤＮＡの断片化のパーセンテージを観察すると
いうかかる主題のより量的測定が提供されている。ここ
では変異ｂｃｌ−２を発現するクローンが野生型ｂｃｌ
−２と比較してそのＤＮＡをより開放するということを
示している。このことは死のパターンがアポプトシスに
よるものであるということを実質的に証明するものであ
る。
【０２３４】図２１は、２Ｂ４ Ｔ細胞ハイブリドーマ
がドメインＩ内に野生型ｂｃｌ−２又はＷＡＲ若しくは
ＷＥＲ変異体を有する生存度の平行研究を示している。
野生型ｂｃｌ−２はグルココルチコイド又はガンマ線放
射誘導細胞死の何れかに抵抗性を与える。ＳＭ３及びＳ
Ｍ４変異の存在は、アポプトシスのこれらのシグナル形
質導入経路においてもｂｃｌ−２の細胞死抑制活性を除
去する。ここでもまたＷＥＲ変異体は、ネオマイシン抵
抗性含有対照との比較において加速された細胞死の速度
を示している。
【０２３５】図２２の（Ａ）は、放射標識されたＦＬ
５．１２安定トランスフェクタントのイムノ沈降、及び
Ｂは２Ｂ４安定トランスフェクタントのイムノ沈降を示
している。野生型ｂｃｌ−２のイムノ沈降では会合する
Ｂａｘが必ず観察され、又ｐ２４分子が時々観察され
る。しかしながら、ｂｃｌ−２の細胞死を遮断する能力
を途絶させる全ての変異体はまた、Ｂａｘを認識するそ
れ自体の能力をも途絶してしまう。
【０２３６】図２３は、ドメインＩＩを変異させたＦＬ
５．１２及び２Ｂ４細胞の安定トランスフェクタントの
平行評価である。ｂｃｌ−２蛋白質レベルの流動細胞計
測法試験はこれらの安定クローン中に野生型ｂｃｌ−２
と比較して比較量の変異体を示している。パネル１９
Ｂ、Ｃ，及びＤはウェスタンブロットレベルにおいてそ
れを実証している。
【０２３７】図２４はドメインＩＩ変異体を有するＦＬ
５．１２細胞、図２６は同じく２Ｂ４細胞、の細胞死応
答を試験するものである。Ｍ３及びＭ５変異体は、ＦＬ
５．１２又は２Ｂ４何れにおいても細胞死パターンに影
響を与えない。従って、ドメインＩＩ内の全ての保存ア
ミノ酸が、ｂｃｌ−２分子における機能差異に介在する
わけではない。しかしながら、Ｍ２セットの変異体にお
けるＱＤＮの変異はｂｃｌ−２機能を明らかに乱す。け
れども、Ｍ４の単一の置換では効果が十分ではないとい
う点においてＱＤＮ全体を除去しなければならない。図
２５及び２７のパネルはこれらの変異分子の第一イムノ
沈降物である。これらはｂｃｌ−２の機能を一部破壊す
るＭ２変異体ではＢａｘとの会合度が減少されているこ
とを証明するものである。しかしながら、通常通り機能
しているＭ４変異体はＢａｘとフルに会合している。従
って、ｂｃｌ−２機能に影響を与えるドメインＩＩにお
ける変化でさえ、Ｂａｘ分子との相関を失うことにより
実現されるように思われる。
【０２３８】図２８において、２つの発現コンストラク
トを有する細胞が生成されている。Ｄα１５細胞系はヒ
トｂｃｌ−２野生型及びマウスｂｃｌ−２野生型ベクタ
ーを有するＦＬ５．１２である。ＤＮ２は対照ネオマイ
シン抵抗性発現ベクター及びマウスｂｃｌ−２野生型ベ
クターを有している。ＤＳＭ４−５クローンはドメイン
Ｉの変異体ｂｃｌ−２及びマウスｂｃｌ−２野生型を含
有しており、一方ＤＳＭ−４はヒト起源の別のｂｃｌ−
２をマウス野生型ｂｃｌ−２と共に有している。図２８
における血球計算ヒストグラムの流れは、二重トランス
フェクタントがマウス野生型ｂｃｌ−２蛋白質を比較に
値する量有していることを示している。図２８の（Ｂ）
及び（Ｃ）は、Ｂａｘと会合するそれ自体の能力を阻害
するｂｃｌ−２の変異体がｂｃｌ−２ホモダイマーの形
成をまだ許容するということを証明している。図２８の
（Ｂ）では、３−４及び４−７変異体が会合するＢａｘ
を有していない野生型ヒトｂｃｌ−２又はヒトｂｃｌ−
２変異体のイムノ沈降が示されている。これらのイムノ
沈降物を、アンチ−マウスｂｃｌ−２抗体と共にウェス
タンブロット分析により展開した。ｍＩ３−４及びｍＩ
４−７の２つの変異体と同様に野生型ヒトｂｃｌ−２も
野生型マウスｂｃｌ−２に会合している。更に、架橋実
験においてはｂｃｌ−２のヘテロダイマー化能力のみな
らずホモダイマー化能力も示されている。ｂｃｌ−２ホ
モダイマーはｍＩ３−４においてもｍＩ４−７において
も観察されている。
【０２３９】このデータの結果は、ｂｃｌ−２がＢａｘ
と相互作用する能力を途絶させる試薬が細胞死抑制活性
を除去することを確固たるものとする。かかる細胞はプ
ログラムされた細胞死に対して非常に攻撃を受けやす
い。結果として、この蛋白質−蛋白質ヘテロダイマー化
を除去する全ての治療法は、細胞を殺傷する基本的かつ
非常に優秀な機構となるであろう。そのようなアプロー
チの仕方は、ガン治療、自己免疫における自己反応性細
胞の除去、及び良性前立線肥大症、リンパ球増殖過多等
の様々な肥大性疾患における増性細胞(hyperplasias)の
除去に重要性を有している。
【０２４０】これらはスクリーニング試薬としてin viv
o の哺乳類細胞系で造られただけではなく、ｂｃｌ−２
／Ｂａｘ相互作用を途絶させる化学化合物及び合成ペプ
チドをスクリーニングするためのイーストの２つのハイ
ブリッドシステム検定と同様にin vitro蛋白質−蛋白質
会合検定をもまた造りだした。このアプローチは、ドメ
インＩ及びドメインＩＩを通して相互作用するこれらの
系統群の全てのメンバー間の相互作用の破壊に適用され
る。
【０２４１】グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）に
タッグされグルタチオン含有ビーズに付着させられたＢ
ａｘがｂｃｌ−２等の放射標識されたこの系統群のメン
バーと相互作用するin vitroの蛋白質相互作用システム
を造った。かかるシステムにおいてｂｃｌ−２はＢａｘ
と会合し、ビーズと共に沈降させることが可能である。
これはドメインＩ及びドメインＩＩ構造を模倣する合成
ペプチドを、それらのｂｃｌ−２並びにＢａｘ及び他の
関連する系統群のメンバーの会合を途絶させる能力に関
してスクリーニングすることのできる迅速なin vitroス
クリーニング検定を提供する。かかるシステムを、選択
された及び任意の化学ライブラリーをそれらの上記相互
作用を阻害する能力に関してスクリーニングする迅速な
スループットとして使用することもまた可能である。
【０２４２】蛋白質−蛋白質ヘテロダイマー化の第一レ
ベルのin vivo 阻害として、イースト２ハイブリッドシ
ステムを造った。このシステムにおいて、ｂｃｌ−２△
Ｃ２２はｇａ１４のＤＮＡ結合ドメインと融合され、一
方、Ｂａｘ△Ｃ２３はｇａ１４の活性ドメインと融合さ
れる。我々はｂｃｌ−２とＢａｘとが相互作用し、イー
スト菌細胞内でヘテロダイマー化し、ｇａ１４のＤＮＡ
認識モティーフにより操作されるｌａｃＺリポーターの
活性化を可能にすることを示してきた。これは、ｂｃｌ
−２／Ｂａｘ相互作用の崩壊につながる可能性のある医
療様生成物のための容易に数量化することのできる迅速
なスループットの簡単な分光分析検定を提供するもので
ある。in vitro蛋白質−蛋白質相互作用により認識され
た又は上記検定により主に分離された分子を確認するこ
とが可能である。
【０２４３】最終的に、上記システムにおいて確認され
た試薬が哺乳類細胞系で生物学的重要性を有するという
ことが立証された。それらはｂｃｌ−２の安定トランス
フェクタントを有するＦＬ５．１２及び２Ｂ４クローン
並びにそれらの改良された類似物を包含するものであ
る。結果的にｂｃｌ−２過剰発現又はＢａｘ過剰発現ト
ランスジェニックマウスを有するin vivo モデルにおい
て全ての医療用試薬を試験することができる。
【０２４４】従って、本発明は多数の処置養生法及び診
療用に幅広く適用することのできるものである。
【０２４５】本発明はまたｂｃｌ−２／Ｂａｘの比率を
調整し、死滅に対して細胞が生存を選択するレオスタッ
トを変化させる全ての療法に使用することが可能であ
る。上記比率をＢａｘ及び細胞死を優先させるように変
化させる強力な医療的薬剤使用法は、増性細胞、肥大性
疾患、ガン及び自己免疫疾患に適用可能である。ｂｃｌ
−２を過剰に有することにより細胞の生存を促進するよ
うに比率を変化させることは、免疫不全症、心筋梗塞等
の虚血誘導傷害、及び神経性卒中と同様に神経変性疾患
の療法における非常に有効な方法となるであろう。これ
は遺伝子転写レベル又は蛋白質半減期若しくは蛋白質改
質レベルでのｂｃｌ−２又はＢａｘ何れかの調節を包含
するものである。
【０２４６】この点に関して、細胞、特にリンパ球、の
アポプトシスを調節する方法が本発明により提供され
る。その方法は、典型的にｂｃｌ−２及びＢａｘ間での
ヘテロマルチマー（例えば、ヘテロダイマー）の形成及
び／又はｂｃｌ−２若しくはＢａｘのホモマルチマーの
形成を阻害することにより、ｂｃｌ−２及びＢａｘ蛋白
質間の分子間結合を変化させる試薬を細胞に投与するこ
とからなる。かかる試薬を投与することにより、Ｂａｘ
／Ｂａｘホモダイマー又はＢａｘ／ｂｃｌ−２ヘテロダ
イマー又は生物学的活性を有するそれ以上のマルチマー
形態の形成を選択的に阻害することができる。１つの実
施形態において、その試薬はＢａｘ蛋白質ドメインＩ又
はドメインＩＩポリペプチドドメイン構造を有してお
り、例えば、ＢａｘドメインＩ又はドメインＩＩ配列を
含むポリペプチドを、もし細胞内誘導できるのであれ
ば、上記試薬として使用することが可能である。１つの
実施の形態において、かかる試薬は、自然発生のｂｃｌ
−２からなるｂｃｌ−２／ｂｃｌ−２ホモダイマーの形
成を競合して阻害するが、ｂｃｌ−２／Ｂａｘヘテロダ
イマー又は他のヘテロマルチマーの形成は実質的に阻害
しない、Ｂａｘに対してはその試薬の親和力を減少さ
せ、ｂｃｌ−２に対してはその試薬の親和力を実質的に
減少させない配列変化（例えば、突然変異体）を含むｂ
ｃｌ−２蛋白質ドメインＩ又はドメインＩＩポリペプチ
ドドメインである。
【０２４７】本発明の他の形態において、ｂｃｌ−２及
びＢａｘ蛋白質間の細胞内結合を変化させる試薬を投与
することにより細胞のアポプトシスを調節する方法が、
患者の病状を治療するために用いられる。例えば、細胞
の異常増殖又は細胞の異常アポプトシスが病気の基本的
な原因である病状の患者を、細胞（例えば、腫瘍性又は
過形成細胞）中に存在するＢａｘ蛋白質の量及び／又は
Ｂａｘ：ｂｃｌ−２蛋白質の細胞中の比率及び／又はＢ
ａｘ／Ｂａｘホモマルチマー、Ｂａｘ／ｂｃｌ−２ヘテ
ロマルチマー、及びｂｃｌ−２／ｂｃｌ−２ホモマルチ
マーの比率を調節する試薬を投与することにより治療す
ることができる。
【０２４８】本発明の他の形態において、アンチセンス
ポリヌクレオチドが細胞中でのＢａｘの転写及び／又は
翻訳を阻害するために投与される。
【０２４９】本発明の他の形態において、Ｂａｘポリペ
プチドをエンコードするポリヌクレオチドが、体外培養
されたリンパ球、造血幹細胞、骨髄細胞、等の細胞に送
られる。Ｂａｘポリペプチドの発現を提供するＢａｘを
エンコードしたポリヌクレオチドの転写を行う操作可能
にリンクされたプロモーター（及び任意にエンハンサ
ー）を典型的に含有する移送されたポリヌクレオチド
は、Ｂａｘ蛋白質が前以て決定された転写制御配列の統
制の下で発現される、安定に若しくは過渡的に形質移入
された細胞又は相同組換え細胞を形成するために細胞に
移入される。例えば腫瘍性疾患のような病気の治療のた
めに、上記のように形質移入された細胞を患者（例え
ば、その細胞がそこから実際に分離された患者）に移入
することができ、１つの実施の形態においては、造血細
胞を復元するために化学療法／放射線療法に続けて用い
ることが可能である。上記のような方法は、例えば遺伝
子療法（例えば、腫瘍性細胞、過形成細胞、自己免疫疾
患等の）に使用することができ、Ｂａｘポリヌクレオチ
ドを適切な遺伝子療法様式及び移送システム（例えば、
アデノイドベクター等）と共に用いることができる。
【０２５０】本発明の他の形態において、Ｂａｘポリペ
プチド及び／又はｂｃｌ−２ポリペプチドをエンコード
するトランスジーン(transgene) を有する例えばマウス
等のトランスジェニック非ヒト動物が提供される。かか
るトランスジーンは宿主染色体に相同的に組み換えら
れ、又は非相同的に組み入れられる。そのようなトラン
スジーンは、典型的に、ポリヌクレオチド配列が調節可
能な（例えば、誘導及び／又は抑制）又は構成転写のた
めのＢａｘ（又はｂｃｌ−２）エンコード配列用に転写
制御配列（例えば、プロモーター／エンハンサー）に操
作可能にリンクされている、Ｂａｘポリペプチド（又は
ｂｃｌ−２ポリペプチド）をエンコードする配列からな
っている。１つの変形例において、内因性Ｂａｘ遺伝子
は標的コンストラクトによる相同組み換えを通した標的
遺伝子により機能的に途絶される。かかる機能的に途絶
されたＢａｘ対立遺伝子（つまり遺伝子ノックアウト、
一般的にかかるＢａｘノックアウトに対しホモ接合であ
る）、を宿している非ヒト動物はまたＢａｘトランスジ
ーンをも有しており、非ヒト動物の内因性Ｂａｘ遺伝子
用の自然発生による転写制御配列以外の操作可能にリン
クされた転写制御配列の転写制御下でＢａｘが発現され
る。
【０２５１】本発明はまた、宿主細胞の自然発生Ｂａｘ
遺伝子以外のポリヌクレオチドによりエンコードされた
Ｂａｘポリペプチドを発現する宿主細胞を提供する。Ｂ
ａｘポリペプチド又はその一部をエンコードする外因性
のポリヌクレオチド配列を宿主細胞に移入し、Ｂａｘポ
リペプチドが発現されるように転写制御配列の下で転写
することが可能である。１つの変形例において、Ｂａｘ
ポリペプチドを宿主細胞単独又はそれに会合する１つ以
上の他のポリペプチド種と共同して回復(recover) する
ことができる。そのような宿主細胞は、宿主細胞の自然
発生ｂｃｌ−２遺伝子以外のｂｃｌ−２ポリペプチドを
エンコードするポリヌクレオチド配列を更に含むことが
でき；かかる細胞はｂｃｌ−２ポリペプチド及びＢａｘ
ポリペプチドを発現することができ；かかる細胞は更に
Ｂａｘ及び／又はｂｃｌ−２のノックアウト対立遺伝子
を含有することができる。１つの変形例において、宿主
細胞はイースト細胞であり、Ｂａｘ及び／又はｂｃｌ−
２ポリペプチドが融合蛋白質として発現され、この変形
例の１つの具体例においてはイースト２−ハイブリッド
発現システムが用いられる。
【０２５２】本発明は、共にモノクローナル抗体である
抗体、及び少なくともおよそ１×１０7 Ｍ-1、典型的に
は少なくとも１×１０8 Ｍ-1以上、の親和力でＢａｘポ
リペプチドに特異的に結合する多クローン性抗血清を提
供する。
【０２５３】これをまた、ｂｃｌ−２死抑制活性の除去
により細胞の死につながるｂｃｌ−２／Ｂａｘヘテロダ
イマー化を途絶する全ての療法に用いることが可能であ
る。これは、分子モデリングを通して上記会合を途絶す
る有機化合物につながるペプチドと同様に、それが可能
な化学薬品及び化合物の任意のスクリーンを包含するも
のである。
【０２５４】この点に関して、本発明はＢａｘポリペプ
チドのｂｃｌ−２ポリペプチドへの結合を調節（例えば
抑制）する及び／又はＢａｘポリペプチドのＢａｘポリ
ペプチドへの結合を調節（例えば抑制）する確認試薬(i
dentifying agents)のためのスクリーニング検定を提供
するものである。かかるスクリーニング検定の組成は、
一般的に、適切な水性結合溶液又は細胞（例えばイース
ト又は哺乳類細胞、細菌、植物細胞）中のＢａｘポリペ
プチド及びｂｃｌ−２ポリペプチドを含有し、Ｂａｘ及
びｂｃｌ−２ポリペプチドは一般的にドメインＩ配列及
び／又はドメインＩＩ配列を含む。かかるスクリーニン
グ検定においては試薬が添加され、Ｂａｘ／ｂｃｌ−２
ヘテロマルチマー（ヘテロダイマー）の形成が測定さ
れ、Ｂａｘ／ｂｃｌ−２ヘテロマルチマーの形成を減少
又は論拠(argue) する試薬は、その試薬を欠いた平行対
照におけるＢａｘ／ｂｃｌ−２の結合反応と比較して、
Ｂａｘ／ｂｃｌ−２調節剤として確認される。任意に、
又はその代わりに、ｂｃｌ−２／ｂｃｌ−２ホモマルチ
マー（ホモダイマー）及び／又はＢａｘ／Ｂａｘホモマ
ルチマー（ホモダイマー）の形成を抑制する又は論拠す
る試薬の能力はその試薬を欠いた対照結合反応と比較し
て測定することができ、かかる検定はｂｃｌ−２調節剤
及び／又はＢａｘ調節剤を確認する。Ｂａｘ／Ｂａｘ又
はｂｃｌ−２／ｂｃｌ−２ホモマルチマー（ホモダイマ
ー）形成と比較してＢａｘ／ｂｃｌ−２ヘテロマルチマ
ー（ホモダイマー）形成を選択的又は優先的に抑制する
試薬を検定によって確認することが可能である。
【０２５５】他の形態においては、候補試薬がＢａｘポ
リペプチドのｂｃｌ−２ポリペプチドへの結合を遮断す
るそれらの能力により確認される。Ｂａｘポリペプチド
はｂｃｌ−２蛋白質が特異的に結合する１つ以上のｂｃ
ｌ−２結合部位を有している。Ｂａｘポリペプチドのｂ
ｃｌ−２ポリペプチドへの結合を検出する１つの方法
は、例えば固体支持体への共有又は非共有化学結合によ
ってポリペプチドのうち１種を固定し、固定したＢａｘ
（又はｂｃｌ−２）を検出可能な標識（例えば放射標識
したアミノ酸の取り込み）によりラベル付けしたｂｃｌ
−２（又はＢａｘ）ポリペプチドに接触させることであ
る。かかる接触は、Ｂａｘ（又はｂｃｌ−２）ポリペプ
チドのドメインＩ又はドメインＩＩのような結合配列を
含有するｂｃｌ−２（又はＢａｘ）ポリペプチドへの結
合を可能にする水性条件下において典型的に行われる。
標識されたＢａｘ（又はｂｃｌ−２）の固定されたｂｃ
ｌ−２（又はＢａｘ）への結合は、特異性結合相互作用
の結果として標識ポリペプチドが固定された結果を決定
することにより測定される。かかる特異性結合は可逆性
であることができ、又は、もし適切な実験条件下で架橋
剤が添加されるならば任意に非可逆性であることができ
る。
【０２５６】本発明の変形例において、腫瘍又は異常ア
ポプトシスが関与する病的症状又は遺伝性疾病及びＢａ
ｘの構造又は数の変化が関与するより明確な症状及び疾
患の治療に、本発明のポリヌクレオチドが使用される。
【０２５７】本発明はまた、患者から体外移植された細
胞中のＢａｘｍＲＮＡ又はＢａｘ遺伝子の転移若しくは
増殖を検出することにより、或いは特有的症徴のＢａｘ
対立遺伝子を検出することにより（例えば、ＲＦＬＰ又
は対立遺伝子特異性ＰＣＲ分析により）、病状（例え
ば、腫瘍、ＡＩＤＳ、過形成、先天性遺伝病）治療のた
めのＢａｘポリヌクレオチドプローブを提供する。Ｂａ
ｘ特異性プライマーを用いたＰＣＲ増殖法と同様に細胞
検体から分離したバルク(bulk)ＲＮＡ又はポリ（Ａ+ ）
ＲＮＡのノーザンブロット、ドットブロット、又は溶液
ハイブリッド形成を用いることができるが、検出は典型
的に標識（例えば32Ｐ、35Ｓ，14Ｃ， 3Ｈ、蛍光、ビオ
チン化、ジゴキシゲニン化）されたＢａｘポリヌクレオ
チドを使用したin situ ハイブリッド形成により行われ
る。疾患のない通常の対照源から得た同種の細胞と比較
して増加した又は減少した量のＢａｘｍＲＮＡ或いは変
形したＢａｘｍＲＮＡを含有する細胞は、異常細胞の候
補と見なされる。同様に、細胞検体中のＢａｘ遺伝子座
又は緊密につながった遺伝子座の特徴的転移又は増殖の
検出は、病気に特有の症状又は病気に特有の症状を進展
させる傾向（例えば、ガン、遺伝病）の存在を確認し、
法廷において個人の身元及び出所を確認するために使用
することができる。
【０２５８】Ｂａｘをエンコードするポリヌクレオチド
配列もまた提供される。図３及び４、６及び７中のヌク
レオチド及び予想されるアミノ酸配列を含めてクローン
された配列の特徴が与えられている。これらのアミノ酸
配列をエンコードする配列を含むポリヌクレオチドは、
ヒトＢａｘ及びマウスＢａｘ等の相当量のＢａｘポリペ
プチドの組み換え発現用の鋳型として使用できる。かか
る配列を有するポリヌクレオチドはまた、in situ ハイ
ブリッド形成により個々のリンパ球（又は他の種類の細
胞）における、或いはノーザンブロット分析及び／又は
in situ ハイブリッド形成(Alwine 等(1977)Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5350) 及び／又はＰＣＲ増
殖及び／又はＬＣＲ検出により特種リンパ球群におけ
る、ＢａｘｍＲＮＡの転写及びｍＲＮＡ量を検出するた
めの核酸ハイブリッド用のプローブとして使用すること
ができる。かかる組み換えポリペプチド及び核酸ハイブ
リッド形成プローブを、薬剤（例えば、抗腫瘍剤、免疫
賦活剤）用の、並びに腫瘍若しくは前腫瘍病的症状、遺
伝病、及び他の病状の診療及び処置用のin vitroスクリ
ーニング法と共に使用することが可能である。
【０２５９】本明細書中における全ての出版物及び特許
出願は、個々の出版物又は特許出願が明確にかつ個々に
参照として包含されると示されたと同程度に、参照とし
て包含されるものである。
【０２６０】更に、ｂｃｌ−２／Ｂａｘ実験システム
は、細胞死を抑制又は促進する全ての分子の特異的調節
のための一般化されるパラダイムとして用いられる。そ
れらの固有の比率の変化、又はホモダイマー若しくはヘ
テロダイマー何れかとしてのそれらの蛋白質−蛋白質相
互作用の途絶は、これらの実験データからの強力なそし
て予想されたアプローチを反映するものである。
【０２６１】例１１ 本実施例は、ｂｃｌ−２のＢＨ１及びＢＨ２ドメインに
おけるアミノ酸置換が、結果としてできる突然変異蛋白
質がＢａｘに結合する活性度及び細胞死調節剤としての
その活性度に与える影響を実証するものである。
【０２６２】ｂｃｌ−２を濾胞(follicular)Ｂ細胞リン
パ種のｔ（１４；１８）染色体ブレークポイントから分
離した(Tsujimoto等(1985) Science 229:1390-1393; Ba
khski 等(1985) Cell 41:899-906; Cleary & Sklar (19
85) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 82: 7439-7443) 。ｂ
ｃｌ−２は様々なアポプトシス的な死を抑制することに
より細胞生存を延長させる新規の腫瘍性(oncogenic) 役
割を有している(Vaux等(1988) Nature 335:440-442; Mc
Donnell等(1989) Cell 57:79-88; Hockenbery等(1990)
Nature 348:334-336; Nunez等(1990) J. Immunool. 14
4:3602-3610; Sentman等(1991) J. Cell 67:879-888; S
trasser 等(1991) Cell 67:889-899; Vaux等(1992) Sci
ence 258:1955-1957; Garcia等(1992) Science 258:302
-304; Allsopp 等(1993) Cell 73:295-307; Hockenbery
(1993) Cell 75:241-251) 。出現するｂｃｌ−２関連蛋
白質の系統群は、ここにｂｃｌ−２相同性１及び２ドメ
イン（図１）として参照される２つの非常に保存された
領域を共有している(Oltvai 等(1993) Cell 74: 609-61
9; Boise等(1993) Cell 74:597-608; Kozopas 等(1993)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3516-3520; Lin 等(1
993) J. Immunol. 151:1979-1988; Neilan等(1993)J. V
irol. 67:4391-4394; Baer(1984) Nature 310:207-211;
Williams 及びSmith (1993) Cell 74:777-779) 。これ
はｂｃｌ−２とヘテロダイマー化し、過剰発現された際
にはｂｃｌ−２を中和(counteract)するＢａｘを包含す
る(Oltvai 等(1993) Cell 74:609-619) 。従って、ＢＨ
１及びＢＨ２は機能又は蛋白質相互作用に関与するドメ
インを表す場合がある。２つのドメインを新規のダイマ
ー化モティーフとして確立するｂｃｌ−２の部位特異性
突然変異生成を行った。ＢＨ１ドメインにおけるgly145
又はＢＨ２ドメインにおけるtrp188の置換は、ＩＬ−３
枯渇、γ線放射、及びグルココルチコイド誘導アポプト
シスにおけるｂｃｌ−２の死抑制活性を完全に阻害し
た。ｂｃｌ−２の機能に影響を与える突然変異もまた、
ｂｃｌ−２ホモダイマー化は許容したがＢａｘとのヘテ
ロダイマー化は途絶した。これらの結果は、ＢＨ１及び
ＢＨ２ドメインの機能的役割を確立し、ｂｃｌ−２がそ
の活動をＢａｘとのヘテロダイマー化を通して行うとい
うことを示唆するものである。
【０２６３】ｂｃｌ−２系統群において最も高度に保存
されたドメインであるＢＨ１及びＢＨ２をおよそ３０の
アミノ酸に分離した（図２９、３０及び３１）。双方の
ドメインの最も保存されたアミノ酸の突然変異生成を行
った（図３０、３１）。突然変異型ｂｃｌ−２蛋白質
を、マウスＩＬ−３依存細胞系であるＦＬ５．１２及び
グルココルチコイド感受性マウスＴ細胞ハイブリドーマ
である２Ｂ４中で発現させた(Nunez等(1990) J. Immuno
l. 144:3602-3610; Ucker 等(1989) J. Immunol.143:34
61-3469) 。相当量のｂｃｌ−２変異（ｍＩ、ｍＩＩ）
又は野生型（ｗｔ）蛋白質を安定して発現するクローン
を、流動細胞計測法（図３２）及びウェスタンブロット
分析（図３３）により選択した。
【０２６４】ｗｔ又は変異ｂｃｌ−２を有するＦＬ５．
１２クローンに対し、ＩＬ−３枯渇に続く細胞死検定に
より評価を行った。ＢＨ１ドメイン内において、アラニ
ン置換ＦＲＤＧ（ｍＩ−１）又はＷＧＲ（ｍＩ−２）
は、試験を行った３つのクローンのそれぞれにおいてｂ
ｃｌ−２の死抑制活性を顕著に減少させた（図３４の
（Ａ））。変異蛋白質を有するクローンは、オリゴゾー
ム長のＤＮＡ断片化及びＤＮＡ開放と共にアポプトシス
の構造的死を明確にした（図３４の（Ｂ）)(Wyllie等(1
980) Rev. Cytol. 68:251-307)。
【０２６５】グリシン残基の頻繁な構造的重要性は(Cre
ighton (1984) in Proteins, structures and Molecula
r Principles, Chap. 1, 5, & 6. (W. H. Freeeman and
Cop., New York)) gly145 のアラニン（ｍＩ−３）に
よる単一アミノ酸置換を促した。試験された５つ全ての
ｍＩ−３クローンは死抑制活性を欠いていた（図３４の
（Ａ），（Ｂ））。ｃｅｄ−９の機能的変異を得た際に
同じグリシンの位置がグルタミン酸に変わっていること
が発見された(Hengartner 及びHorovitz (1994) 提
出）。ｃｅｄ−９はＣ．エレガンス(elegans) における
ｂｃｌ−２の同類体である(Hengartner 及びHorvits (1
994) Cell)。必然的に、同じグルタミン酸の置換をｂｃ
ｌ−２（ｍＩ−４）において行ったが、哺乳類の細胞内
で評価を行った際には機能が失われていることが判明し
た（図３４の（Ａ）、（Ｂ））。これらの僅かの修正が
他の死経路においてｂｃｌ−２活性を除去するか否かを
評価するために、コンストラクトを２Ｂ４細胞中に導入
した。ｍＩ−３又はｍＩ−４何れのｂｃｌ−２蛋白質
も、グルココルチコイド誘導（図３４の（Ｃ））又はγ
放射線誘導細胞死を遮断するこができなかった。それぞ
れの一連の変異体の全てのクローンは類似した動態で死
滅し、ｍＩ−４変異体は対照細胞（Ｎｅｏ）と比較して
死滅率が幾分増加した（図３４）。
【０２６６】ＢＨ２ドメイン内においてtrp 残基（ｂｃ
ｌ−２中のtrp188）は全ての系統群メンバー中にくまな
く存在している（図３１）。このアミノ酸をアラニン
（ｍＩＩ−１）に置換することにより、ＩＬ−３が投与
を中止された際にｂｃｌ−２がＦＬ５．１２細胞を保護
する能力が廃棄された（図３４の（Ｄ））。ＱＤＮ190-
192 モティーフ及びglu200は多くの系統群メンバー中に
保持されている。これらの位置（それぞれｍＩＩ−２及
びｍＩＩ−５）での置換と共にｂｃｌ−２を発現するク
ローンは、野生型ｂｃｌ−２のおよそ半分の死抑制活性
を示した。しかしながら、アラニンをasn192(mII-4) の
代わりにするという単一アミノ酸置換はｂｃｌ−２の死
抑制活性に対して影響を及ぼさなかった（図３４の
（Ｄ））。保持されたＧＷＤＡ194-197 モティーフを削
除したｂｃｌ−２変異体（ｍＩＩ−３）もまた、アポプ
トシスを遮断するというｂｃｌ−２の能力を完全に除去
した。しかし、ｍＩＩ−３蛋白質のレベルはｂｃｌ−２
ｗｔのそれよりも一貫して低く、この変異体がまた蛋白
質安定性にも影響を及ぼしたことを示唆している。ＦＬ
５．１２細胞における結果と矛盾することなく、ｍＩＩ
−１ｂｃｌ−２蛋白質もまたデキサメタソン又はγ放射
線誘導死から２Ｂ４細胞を保護することができなかっ
た。一方、ｍＩＩ−２蛋白質は、再び、野生型ｂｃｌ−
２のおよそ半分の活性を示した。
【０２６７】Ｂａｘがｂｃｌ−２の活性に対抗しｂｃｌ
−２とヘテロダイマーを形成する(Oltvai 等(1993) Cel
l 74:609-619) という理由から、それぞれのｂｃｌ−２
変異体をＢａｘとの会合に関して調査した。６Ｃ８ＭＡ
ｂを使用したヒトｂｃｌ−２ｗｔ蛋白質のイムノ沈降(H
ockenber等(1990)Nature 348:334-336) は、ＦＬ５．１
２細胞からマウスＢａｘを共通沈降した。しかし、ｂｃ
ｌ−２の死抑制活性を除去した全ての変異体はＢａｘと
相互作用することができなかった。これはgly1 45又はtr
p188の単一置換を包含するものである。更に、少量が存
在するＧＷＤＡモティーフを除去したｍＩＩ−３ｂｃｌ
−２蛋白質もまたＢａｘと会合することができなかっ
た。ヘテロダイマー化と機能との関連は、ｍＩＩ−２及
びｍＩＩ−５ｂｃｌ−２蛋白質の調査により更に強固な
ものとされた。それらは減少された死抑制活性を示し、
またＢａｘとの減縮された相互作用を説明した。対照的
に、細胞を死から十分に保護したｍＩＩ−４蛋白質は、
ｂｃｌ−２ｗｔと同程度にＢａｘと作用した（図３５の
（Ｂ））。２Ｂ４細胞中で発現されたこの一連のｂｃｌ
−２変異体は、同一のヘテロダイマー化パターンを示し
た。従って、ｂｃｌ−２機能に要求されるアミノ酸と同
一のアミノ酸がＢａｘとのヘテロダイマー化に必要とさ
れる。
【０２６８】ｂｃｌ−２がホモダイマーを形成すること
ができるか否か、又、同一の変異体がそのホモダイマー
化に影響を及ぼすかどうか、を調べるために３つのアプ
ローチを行った。最初に、ヒトｂｃｌ−２ｗｔを発現す
る細胞からの溶解質を架橋剤であるＤＳＰにより処理し
た(Lomant 及びFairbanks (1976) J. Mol. Biol. 104:2
43-261) 。ポリアクリルアミドゲルを使用した電気泳動
の後で、ウェスタンブロットを６Ｃ８ＭＡｂでイムノ染
色し、それぞれ予想された大きさのｂｃｌ−２／Ｂａｘ
ヘテロダイマー及びｂｃｌ−２ホモダイマーを示す４６
ｋｄ及び５０ｋｄの複合体と同様に２５ｋｄの単肢のｂ
ｃｌ−２が明らかとなった（図３６の（Ａ））。二番目
に、インフルエンザウイルス血球凝集素のエピトープを
有する野生型ヒトｂｃｌ−２(Olitvai等(1993)Cell 74:
609-619)(HA-Bcl-2)を、ヒトｂｃｌ−２ｗｔ、又は変異
蛋白質、を発現するＦＬ５．１２細胞中に導入した。Ｈ
Ａ特異性ＭＡｂ（１２ＣＡ５）は２５Ｋｄのｂｃｌ−２
ｗｔ及び２１ＫｄのＢａｘを２７ＫｄのＨＡ−ｂｃｌ−
２分子と共に共通沈降し、ｂｃｌ−２ホモダイマーの存
在を示した（図３６の（Ｂ）及び（Ｃ））。更には、ヘ
テロダイマー化に影響を及ぼしたＢＨ１変異体（ｍＩ−
３及びｍＩ−４）及びＢＨ２変異体はまだＨＡ−ｂｃｌ
−２との会合を立証し、これらの変異体がｂｃｌ−２ホ
モダイマー化を途絶させなかたことを示している。ビオ
チン化アンチ−ヒトｂｃｌ−２ｍＡｂ（６Ｃ８）により
イムノ染色されたこれらのイムノ沈降物のウェスタンブ
ロットは、同量のヒト起源ｂｃｌ−２ｗｔ又は変異蛋白
質が共通沈降したことを確認する（図３６の（Ｄ））。
最後に、通常最少量のマウスｂｃｌ−２を、ヒトｂｃｌ
−２ｗｔ又は変異蛋白質何れかを有するＦＬ５．１２細
胞中で過剰発現させた（図３６の（Ｅ）、（Ｆ））。放
射標識したヒトｂｃｌ−２をマウスｂｃｌ−２を認識し
ない６Ｃ８ＭＡｂと共にイムノ沈降させた（図３６の
（Ｅ））。これらのイムノ沈降物のウェスタンブロット
をヒトｂｃｌ−２を認識しないビオチン化アンチ−マウ
スｂｃｌ−２ＭＡｂ（３Ｆ１１）によりイムノ染色した
（図３６の（Ｆ）)(Veis等(1993) J. Immunol. 151:254
6-2554) 。野生型ヒトｂｃｌ−２蛋白質と同様に変異体
もマウスｂｃｌ−２とダイマー化した（図３６の
（Ｆ））。これらの結果を組み合わせると、ｂｃｌ−２
はホモダイマーを形成することができ、この特性は機能
及びヘテロダイマー化を廃棄した選択された変異体によ
りそのまま残されていることが示されている。
【０２６９】ｂｃｌ−２及びＢａｘの死を抑制又は促進
する相反の能力は、ｂｃｌ−２変異体の機能及びダイマ
ー化の分析を促した。ＢＨ１及びＢＨ２ドメインはｂｃ
ｌ−２の機能及びｂｃｌ−２／Ｂａｘヘテロダイマーの
形成に重要なものであることが判明した。ＢＨ１又はＢ
Ｈ２ドメインの選択変異はまだｂｃｌ−２ホモダイマー
化を可能にしたが、ｂｃｌ−２ホモダイマーは細胞を死
から保護するのに不十分であった。gly145又はtrp188等
の保持されたｂｃｌ−２残基が他の役割を担っていると
いう可能性を除外することはできなかったが、それぞれ
のアミノ酸はＢａｘとのヘテロダイマー化に明らかに必
要とされる。加えて、ｂｃｌ−２はＲ−ｒａｓ等の更な
るパートナーを有しているようであり(Fernandez-Sarab
ia及びBischoff (1993) Nature 366:274-275) 、追加の
機能的ドメインを有していることが証明できるであろ
う。しかしながら、ｂｃｌ−２の細胞死を抑制する能力
とそのＢａｘとヘテロダイマー化する能力との間の著し
い相関は、ｂｃｌ−２がＢａｘと複合化することにより
細胞死を抑制することを示唆している。
【０２７０】拡張されたｂｃｌ−２系統群における新規
なＢＨ１及びＢＨ２ダイマー化モチーフの保持は、他の
メンバーもまたこれらのドメインを通してダイマー化の
競合に関与していることを示している。同一のＢＨ１グ
リシン残基がＣｅｄ−９ゲインオブファンクション(gai
n-of-function)変異体において変化しているという事実
は、多細胞生命体において一般的である細胞死の経路の
調節におけるこの蛋白質インターフェースの重要性を強
調するものである。しかし、ｂｃｌ−２におけるgly145
からgly への置換が機能を失わせる結果となる発見は、
Ｃ．エレガンスにおいてｂｃｌ−２ｗｔが完全にはＣｅ
ｄ−９を補わないという事実(Vaux 等(1992) Science 2
58:1955-1957; Hengartner及びHorvitz (1994) Cell)と
合わせて、それらの蛋白質相互作用における差異を示す
可能性がある。コンピュータによる予想(GGBSM又はGarn
iner法) は、全てのｂｃｌ−２系統群メンバーのＢＨ１
及びＢＨ２双方は主にβシート又はコイル構造であるこ
とを示している。この２つのドメインはループ構造とし
て表される結合インターフェースであることが示される
可能性がある。ＢＨ１及びＢＨ２ドメイン双方がＢａｘ
と結合するために必要である一方、他の系統群メンバー
に対するそれらの重要性は調査中である。現在までのデ
ータによれば、総合的に見て、ｂｃｌ−２がその死抑制
活性を発揮するには必ずＢａｘに結合しなければならな
いというモデルを優先しており、ｂｃｌ−２／Ｂａｘヘ
テロダイマーを途絶する方法が細胞死を促進させること
を示唆している。
【０２７１】方法 図２９〜３３：ｂｃｌ−２変異体はＰＣＲ介在部位特異
的突然変異誘発(Cormack (1991) in Current Protocols
in Molecular Biology (eds Ausubel,F. M.等) 8.5.1-
8.5.9 (Greene Publishing Associates, New York)) に
より生成した。ヒトｂｃｌ−２ｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ断
片(Seto 等(1988) EMBO J. 7:123-131)をＳａｃＩ及び
ＢａｍＨＩ部位が除去された改良ｐブルースクリプト・
ＩＩ・ＫＳベクターにクローンした。１５３ｂｐのＢＨ
１ドメイン含有ＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ断片を置換ヌクレ
オチド含有ＰＣＲ合成断片に取り替えた。ｍＩＩ−２、
３、４、５に関しては、６０ｂｐのＢＨ２ドメイン含有
ＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ断片を相互的感作合成(mutually
primed synthesis)(Cormack (1991) in Current Protoc
ils in Molecular Biology (eds Ausubel, F. M.等) 8.
5.1-8.5.9 (GreenePublishing Associates, New York))
により置換ヌクレオチド含有断片に置き換えた。ｍＩ
Ｉ−１に関しては、trp188がＢａｍＨＩ部位にあるた
め、１５３ｂｐのＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ断片をala188含
有ＰＣＲ合成断片に取り替えた。特定の位置のみが改良
されたことを確実にするために全てのコンストラクトを
配列決定した。変異ｂｃｌ−２分子をｐＳＦＦＶ−Ｎｅ
ｏベクターにクローンし、前述したように形質移入した
(Hockenber等(1990)Nature 348:334-336; Oltvai等(199
3)Cell 74:609-619) 。クローンを任意に選択し、ヒト
ｂｃｌ−２の発現に関して調査を行った。流動細胞計測
法及びウェスタンブロットを前述したように行った(Hoc
kenber等(1990)Nature 348:334-336; Oltvai等(1993) C
ell 74:609-619; Veis等(1993) J. Immunol. 151:2546-
2554))。
【０２７２】図３４：前述したようにＩＬ−３を枯渇さ
せることによりＦＬ５．１２細胞にアポプトシスを導入
したNunez 等(1990) J. Immunool. 144:3602-3610)。グ
ルココルチコイド誘導アポプトシスに関して、６−８×
１０4 の２Ｂ４細胞を９６のウェルプレートにおいて１
０-6m のデキサメタソンと共に培養した。トリパンブル
ー排除法により計画された時間ポイントにおいて生存度
を測定した。全ての実験は、それぞれの変異体に関して
少なくとも３−６個のクローンを用いて少なくとも３回
行った。ＩＬ−３枯渇後のＦＬ５．１２細胞中のＤＮＡ
断片の量をジフェニルアミン法(Sentman等(1991) J. Ce
ll 67:879-888)により測定した。
【０２７３】図３５：イムノ沈降を前述したように行っ
た(Oltvai 等(1993) Cell 74:609-619) 。簡潔に言う
と、個々の検体（５−１０×１０6 細胞）に関して同量
の細胞を１００μＣｉの35Ｓ−Ｍｅｔにより一晩標識
し、０．２５％ＮＰ−４０緩衝液中ですすいだ。プロテ
ィンＡセファロースビードに続き６Ｃ８ＭＡｂを用いて
イムノ沈降を行った。蛋白質を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲルで分離し、１０％の冷酢酸及び３０％のメタノ
ールで固定し、蛍光光度法増強溶液(EN3HANCE, DuPont)
により処理した(Oltvai 等(1993) Cell 74:609-619) 。
【０２７４】図３６：ヒトｂｃｌ−２ｗｔ蛋白質を発現
するＦＬ５．１２細胞を０．２５％ＮＰ−４０緩衝液中
に溶かし、ポスト−核上澄みを最終濃度が０．２５、
０．５、若しくは１．０ｍＭになるようにＤＳＰ(Pierc
e)と混合、又は同量のＤＭＳＯ溶媒と混合した(Lomant
及びFairbanks (1976) J. Mol. Biol. 104:243-261) 。
氷で３０分間冷却した後、最終濃度が５０ｍｍになるよ
うにＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を加え、反応を抑制した。
前述したように電気泳動及びウェスタン分析を行った(O
ltvai 等(1993) Cell 74:609-619) 。ＨＡ−ｂｃｌ−２
コンストラクトは血球凝集素エピトープによってタッグ
されたヒトｂｃｌ−２ｗｔであり(Oltvai等(1993) Cell
74:609-619)、ＲＳＶプロモーター−操作(driven)発現
ベクターにクローンした。第二のトランスフェクション
に関して、コンストラクトをハイグロマイシン抵抗性遺
伝子を有するＬＡＰ２６７ベクターと共に共通形質移入
し(Oltvai 等(1993) Cell 74:609-619) 、２ｍｇ／ｍｌ
のハイグロマイシンによってクローンを選択した。クロ
ーンを35Ｓ−Ｍｅｔにより一晩標識し、ＨＡ−ｂｃｌ−
２／ｂｃｌ−２二重トランスフェクタント（ｂ、ｃ）に
関してはアンチ−ＨＡ・ＭＡｂ、１２ＣＡ５と共に、マ
ウス／ヒトｂｃｌ−２二重トランスフェクタント（ｅ）
に関しては６Ｃ８と共にイムノ沈降させた。パネルｄ及
びｆについて、イムノ沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
大きさにより分別し、ビオチン化されたアンチ−ヒトｂ
ｃｌ−２（６Ｃ８）ＭＡｂ（ｄ）又はビオチン化アンチ
−マウスｂｃｌ−２（３ＦＩＩ）ＭＡｂ（ｆ）を用いて
ウェスタン分析を行い、強化ケミルミネッセンスである
ＥＣＬ(Amersham)により染色(develop) した。ＥＣＬ染
色に用いた短期間の暴露時間は35Ｓ信号を検出するのに
は十分でなかった。ウェスタン分析の結果を得た後、Ｅ
ＣＬ基質を除去するためにブロットをＰＢＳ含有０．０
５％トゥイーン−２０により洗浄した。オートラジオグ
ラムを繰り返しＥＣＬ基質が全く残っていないことを確
認した。イムノ沈降35Ｓ−Ｍｅｔ標識蛋白質（ｃ及び
ｅ）を明らかにするために、次にブロットを室温にて暴
露した。
【０２７５】本発明は以上のように記述されるものであ
るが、同一の事物から多くの変形例を創り出すことがで
きることは明らかである。かかる変形例は、本発明の趣
旨及び範囲から逸脱するものではなく、かかる改良の全
ては以下に記載された請求項の範囲に含まれることを意
図するのものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＲＬ−７細胞を用いて（35Ｓ）メチオニン−標
識化されたイムノ沈澱の分析を示す図である。
【図２】ＦＬ５．１２クローンを用いて（35Ｓ）メチオ
ニン−標識化されたイムノ沈澱の分析を示す図である。
【図３】ｃＤＮＡと、ヒトとマウスのＢａｘの蛋白質配
列を示す図である（配列番号１及び２）。
【図４】ｃＤＮＡと、ヒトとマウスのＢａｘの蛋白質配
列を示す図である（配列番号１及び２）。
【図５】Ｂａｘ遺伝子の他のα、β、γ転写及び蛋白質
を示す図である。
【図６】 βＲＮＡからエンコードされたアミノ酸を示
す図である（配列番号３）。
【図７】γＲＮＡからエンコードされたアミノ酸を示す
図である（配列番号４）。
【図８】マウスとヒトのＢａｘと、ｂｃｌ−２蛋白質の
配列を示す図である（配列番号５乃至１３）。
【図９】過剰に発現したＢａｘが細胞死を加速する例を
示す図である。
【図１０】ｂｃｌ−２とＢａｘの比がＩＬ−３欠乏ＦＬ
５．１２細胞の生存度に影響を与える例を示す図であ
る。
【図１１】Ｂａｘがホモダイマー化し、ｂｃｌ−２と共
にホモダイマーを形成する例を示す図である。
【図１２】ヘテロダイマーのウェスタンブロット分析を
示す図である。
【図１３】上澄みのイムノ沈澱を示す図である。
【図１４】ｂｃｌ−２とＢａｘの相互関係と、プログラ
ムされた細胞死の調節の例を示す図である。
【図１５】ｂｃｌ−２の密接に関連した遺伝子と、生成
されたｂｃｌ−２突然変異体の系統群を示す図である。
【図１６】二つの細胞系（ＦＬ５．１２と２Ｂ４）にお
ける突然変異ｂｃｌ−２蛋白質のレベルの分析を示す図
である。
【図１７】二つの細胞系（ＦＬ５．１２と２Ｂ４）にお
ける突然変異ｂｃｌ−２蛋白質のレベルの分析を示す図
である。
【図１８】二つの細胞系（ＦＬ５．１２と２Ｂ４）にお
ける突然変異ｂｃｌ−２蛋白質のレベルの分析を示す図
である。
【図１９】二つの細胞系（ＦＬ５．１２と２Ｂ４）にお
ける突然変異ｂｃｌ−２蛋白質のレベルの分析を示す図
である。
【図２０】安定な細胞の形質移入とＤＮＡ断片形成検定
（ＦＬ５．１２）のＩｌ−３欠乏の時間経過を示す図で
ある。
【図２１】細胞系（２Ｂ４）の二つの生存度調査を示す
図である。
【図２２】放射標識化された形質移入のイムノ沈澱を示
す図である。
【図２３】ドメインIIのｂｃｌ−２突然変異体の安定な
形質移入の並行アセスメントの例を示す図である。
【図２４】ドメインIIのｂｃｌ−２突然変異体を伴う細
胞内の細胞死応答と、放射標識化され形質移入された細
胞の二つのイムノ沈澱の例を示す図である。
【図２５】ドメインIIのｂｃｌ−２突然変異体を伴う細
胞内の細胞死応答と、放射標識化され形質移入された細
胞の二つのイムノ沈澱の例を示す図である。
【図２６】ドメインIIのｂｃｌ−２突然変異体を伴う細
胞内の細胞死応答と、放射標識化され形質移入された細
胞の二つのイムノ沈澱の例を示す図である。
【図２７】ドメインIIのｂｃｌ−２突然変異体を伴う細
胞内の細胞死応答と、放射標識化され形質移入された細
胞の二つのイムノ沈澱の例を示す図である。
【図２８】ホモダイマー化とヘテロダイマー化の際のｂ
ｃｌ−２ドメインＩの突然変異の影響を構成し表わす二
つの発現を有する細胞を示す図である。
【図２９】ＢＨ１ドメイン及びＢＨ２ドメインの概略的
な表現の図である。
【図３０】ｂｃｌ−２系統群のメンバーの間でＢＨ１ド
メインとＢＨ２ドメインを夫々比較する配列を示す図で
ある（オルトバイ他による1993年発行の細胞学、第74
号、609-619 ページ(Oltvai et al. (1993) Cell 74:6
09-619) と、コゾパス他による1993年発行の米国アカデ
ミー学会講演予稿集、第90号、3516-3520 ページ(Kozop
as et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3
516-3520) と、リン他による1993年発行の免疫学ジャー
ナル、第151 号、1979-1988 ページ(Lin et al. (1993)
J. Immunol. 151:1979-1988)と、ネイラン他による19
93年発行のウイルス学ジャーナル、第67号、4391-4394
ページ(Neilan et al. (1993) J. Virol. 67:4391-43
94) と、バエ他による1984年発行のネーチャー誌、第31
0 号、207-211 ページ(Baer et al. (1984) Nature 31
0:207-211)と、ウィリアムズとスミスによる1993年発行
の細胞学、第74号、777-779 ページ(Williams and Smit
h(1993) Cell 74:777-779) ）。上記配列は破線でマ
ークされた挿入を導入することによって最大化される。
同一アミノ酸は黒色で示され、保存された残基は陰影が
付けられている。各部の下で、各突然変異体（ｍＩ又は
ｍII）におけるアミノ酸置換の概略的な表現は、変化な
しを示すため破線を利用し、欠失を表わすため星印を利
用している。
【図３１】図３０と比較される図である。
【図３２】フロー・サイトメトリにより検出され、野性
型と、ＦＬ５．１２クローンを表わす突然変異体（ｍ
Ｉ，ｍII）ｂｃｌ−２との表現であり、Ｎｅｏは、ベク
ター不足挿入で形質移入されたクローンであり、突然変
異体の最後の数字は、クローン番号を示している。
【図３３】ｂｃｌ−２のレベルと比較可能な抗ヒト６Ｃ
８ ｂｃｌ−２ Ｍａｂ． ２Ｂ４ クローンで発生さ
せられた夫々の安定ＦＬ５．１２クローンのウェスタン
ブロットが選択されている。
【図３４】安定的に形質移入されたクローンの細胞死検
定を示す図であり、（Ａ）には、Ｎｅｏ対照物、ｂｃｌ
−２野性型、又は、ＢＨ１突然変異体（ｍＩ）ベクター
を担持するＦＬ５．１２クローンを表わすＩＬ−３欠乏
後の生存度が示され、（Ｂ）には、２４又は４８時間の
ＩＬ−３の欠乏後にＦＬ５．１２クローンを表わすＤＮ
Ａ断片形成の百分率が示され、（Ｃ）には、１０-6Ｍの
デキサメタゾンで培養されたとき、Ｎｅｏ対照物、ｂｃ
ｌ−２野性型、又は、ＢＨ１突然変異体ベクターを担持
する２Ｂ４クローンを表わす生存度検定が示され、
（Ｄ）には、ＩＬ−３の欠乏後にＢＨ２突然変異体（ｍ
II）ベクターを担持するＦＬ５．１２クローンを表わす
生存度が示され、図示された全データは、３倍のサンプ
ルからの平均値±ＳＤである。
【図３５】ｂｃｌ−２野性型のイムノ沈澱と、突然変異
体蛋白質を表わす図であり、（Ａ）及び（Ｂ）におい
て、野性型又はＢＨ１（ａ）、或いは、ＢＨ２（ｂ）突
然変異体ｂｃｌ−２を表現するＦＬ５．１２クローン
は、対照ハムスター抗体（ｃ）又は６ｃ８ ＭＡｂの何
れかでイムノ沈殿された。
【図３６】野性型及び突然変異体ｂｃｌ−２ホモダイマ
ーの分析が示され、（Ａ）において、ウェスタンブロッ
トは、ＦＬ５．１２−ヒトＢｃｌ−２野性型抽出物の指
示された濃度のＤＳＰ〔ジチオビス（スクシニミジル
プロピオネート）〕との架橋に続いて６ｃ８ 抗Ｂｃｌ
−２ＭＡｂで発生させられ、（Ｂ）において、放射標識
化され、対照用Ａｂ（レーン１）又は１２ＣＡ５抗ＨＡ
ＭＡｂ（１４）（レーン２乃至６）の何れかで２重に形
質移入されたクローンのイムノ沈澱が示され、野性型又
は突然変異体（ｍＩ）ヒトＢｃｌ−２の何れかを有する
ＦＬ５．１２クローンは、次いで、括弧内に示されたよ
うにＨＡ標識化されたヒトＢｃｌ−２野性型又はＨＡ−
Ｂａｘで形質移入され、（Ｃ）において、ＦＬ５．１２
細胞のイムノ沈澱は、Ｂｃｌ−２野性型又はＢＨ２突然
変異体（ｍII）で、次いで、ＨＡ−Ｂｃｌ−２又はＨＡ
−Ｂａｘで（図中括弧で示されているように）２重に形
質移入され、放射標識化された細胞は、抗ＨＡ ＭＡｂ
でイムノ沈殿され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分離とニトロ
セルロース紙への転移の後、ブロットは乾燥され、35Ｓ
−Ｍｅｔ信号に晒され、（Ｄ）において、パネルｃに示
されたものと同一のブロットは、抗ヒトＢｃｌ−２ Ｍ
Ａｂで染色され、ＥＣＬ基質で発生させられ、（Ｅ）に
おいて、35Ｓ−Ｍｅｔ放射標識化され２重に形質移入さ
れたＦＬ５．１２クローンのイムノ沈澱又はＲＬ−７が
示され、ヒトＢ細胞系（オルトバイ他による1993年発行
の細胞学、第74号、609-619 ページ(Oltvai et al. (19
93)Cell 74:609-619) ）は、対照Ａｂ（レーン１）又
は６Ｃ８ ＭＡｂ（レーン２乃至６）の何れかで高いレ
ベルのＢｃｌ−２を発現する。クローンは、最初、野性
型又は突然変異ヒトＢｃｌ−２で形質移入され、次い
で、括弧内に示されているようにマウスＢｃｌ−２野性
型で再度形質移入された。（Ｆ）において、パネル
（Ｅ）に示された同一のイムノ沈澱からのウェスタンブ
ロットはビオチニレート化された３Ｆｌｌ抗マウスＢｃ
ｌ−２ ＭＡｂで発生させられた。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 死抑制体活性を実質的に欠き及び／又は
    Ｂａｘへの結合を実質的に欠く突然変異ｂｃｌ−２蛋白
    質を生成する方法であって、 自然発生的なｂｃｌ−２蛋白質と実質的に一致しＢＨ１
    又はＢＨ２ドメインにアミノ酸置換又は欠失を有するポ
    リペプチド配列からなり、実質的にＢａｘに結合し得ず
    及び／又は実質的に死抑制体活性化し得ない突然変異ｂ
    ｃｌ−２蛋白質をエンコードするポリヌクレオチドを細
    胞又は翻訳反応中に発現させる段階を有する方法。
  2. 【請求項２】 上記突然変異ｂｃｌ−２蛋白質は本質的
    に自然発生的なヒトｂｃｌ−２蛋白質のポリペプチド配
    列により構成され、少なくとも一つのアミノ酸置換又は
    欠失は、アミノ酸位置１３６−１５５（−ＥＬＦＲＤＧ
    ＶＮＷＧＲＩＶＡＦＦＥＦＧＧ−）からなるＢＨ１ドメ
    イン、又は、アミノ酸位置１８７−２０２（−ＴＷＩＱ
    ＤＮＧＧＷＤＡＦＶＥＬＹ−）からなるＢＨ２ドメイン
    にある請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 上記突然変異ｂｃｌ−２蛋白質は、図３
    ０及び３１に示されたアミノ酸番号付けの慣例に従って
    位置１３７、１３８、１３９、１４０、１４３、１４
    ４、１４５、１８７、１８８、１８９、１９０、１９
    １、１９３、１９４、１９５、１９６及び１９９からな
    る群より選択されたアミノ酸位置のアミノ酸置換又は欠
    失により構成される請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 上記突然変異ｂｃｌ−２蛋白質は、ＦＲ
    ＤＧモティーフ（位置１３７−１４０）の中の少なくと
    も一つのアミノ酸位置のアミノ酸置換又は欠失、ＮＷＧ
    Ｒモティーフ（位置１４２−１４５）、ＧＷＤＡモティ
    ーフ（位置１９３−１９６）の中の少なくとも一つのア
    ミノ酸位置の置換又は欠失、或いは、位置１８８のトリ
    プトファンの置換により構成される請求項２記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 上記アミノ酸置換は、アラニン、ロイシ
    ン、及びグルタミン酸からなる群より選択された置換型
    アミノ酸よりなる請求項３記載の方法。
  6. 【請求項６】 上記突然変異ｂｃｌ−２蛋白質は、本質
    的にＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメイン、又は、ポリペプ
    チドリンケージに連結されたＢＨ１及びＢＨ２ドメイン
    により構成される請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 上記ポリペプチドリンケージに連結され
    たＢＨ１及びＢＨ２ドメインは、図２９、３０及び３１
    に示されたようなアミノ酸位置１３６−２０２により構
    成される請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】 候補ｂｃｌ−２−変調作用物質を同定す
    る方法であって、 Ｂａｘポリペプチド及び作用物質でＢＨ１及び／又はＢ
    Ｈ２ドメインからなるｂｃｌ−２ポリペプチドを含むヘ
    テロダイマー化検定を行なう段階と、 上記作用物質が上記ｂｃｌ−２ポリペプチドの上記Ｂａ
    ｘポリペプチドへのヘテロダイマー化を阻害するかどう
    かを判定する段階と、 ｂｃｌ−２の死抑制体活性を阻害する候補ｂｃｌ−２変
    調作用物質として該ヘテロダイマー化を阻害する作用物
    質を同定する段階とを有する方法。
  9. 【請求項９】 上記ｂｃｌ−２ポリペプチドは、−ＥＬ
    ＦＲＤＧＶＮＷＧＲＩＶＡＦＦＥＦＧＧ−からなる位置
    １３６−１５５のポリペプチド配列により構成され、完
    全長のＢａｘ蛋白質に結合する完全長のｂｃｌ−２蛋白
    質である請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 上記ｂｃｌ−２ポリペプチドは、−Ｔ
    ＷＩＱＤＮＧＧＷＤＡＦＶＥＬＹ−からなる位置１８７
    −２０２のポリペプチド配列により構成され、完全長の
    Ｂａｘ蛋白質に結合する完全長のｂｃｌ−２蛋白質であ
    る請求項８記載の方法。
  11. 【請求項１１】 図２９、３０及び３１に示された番号
    付けの慣例に従ってアミノ酸位置１３６−１５５又は１
    ８７−２０２から選択されたアミノ酸位置にあるＢＨ１
    又はＢＨ２ドメインのアミノ酸置換又は欠失により構成
    される突然変異ｂｃｌ−２ポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 本質的に自然発生的なヒトｂｃｌ−２
    蛋白質のポリペプチド配列により構成され、少なくとも
    一つのアミノ酸置換又は欠失は、アミノ酸位置１３６−
    １５５（−ＥＬＦＲＤＧＶＮＷＧＲＩＶＡＦＦＥＦＧＧ
    −）からなるＢＨ１ドメイン、又は、アミノ酸位置１８
    ７−２０２（−ＴＷＩＱＤＮＧＧＷＤＡＦＶＥＬＹ−）
    からなるＢＨ２ドメインにある請求項１１記載の突然変
    異ｂｃｌ−２ポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 図２９、３０及び３１に示されたアミ
    ノ酸番号付けの慣例に従って位置１３７、１３８、１３
    ９、１４０、１４３、１４４、１４５、１８７、１８
    ８、１８９、１９０、１９１、１９３、１９４、１９
    ５、１９６及び１９９からなる群より選択されたアミノ
    酸位置のアミノ酸置換又は欠失により構成される請求項
    １２記載の突然変異ｂｃｌ−２ポリペプチド。
  14. 【請求項１４】 ＦＲＤＧモティーフ（位置１３７−１
    ４０）、ＮＷＧＲモティーフ（位置１４２−１４５）、
    又はＧＷＤＡモティーフ（位置１９３−１９６）の中の
    少なくとも一つのアミノ酸位置のアミノ酸置換又は欠失
    により構成される請求項１３記載の突然変異ｂｃｌ−２
    ポリペプチド。
  15. 【請求項１５】 上記アミノ酸置換は、アラニン、ロイ
    シン、及びグルタミン酸からなる群より選択された置換
    型アミノ酸よりなる請求項１４記載の突然変異ｂｃｌ−
    ２ポリペプチド。
  16. 【請求項１６】 本質的にＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメ
    イン、又は、ポリペプチドリンケージに連結されたＢＨ
    １及びＢＨ２ドメインにより構成される請求項１５記載
    の突然変異ｂｃｌ−２ポリペプチド。
  17. 【請求項１７】 上記ポリペプチドリンケージに連結さ
    れたＢＨ１及びＢＨ２ドメインは、図２９、３０及び３
    １に示されたようなアミノ酸位置１３６−２０２により
    構成される請求項１１記載の突然変異ｂｃｌ−２ポリペ
    プチド。
  18. 【請求項１８】 ＢＨ１又はＢＨ２ドメインにアミノ酸
    置換又は欠失を有し、実質的にＢａｘに結合し得ず及び
    ／又は実質的に死抑制体活性化し得ない突然変異ｂｃｌ
    −２ポリペプチドをエンコードする突然変異型ｂｃｌ−
    ２ポリヌクレオチドを生成するため、ｂｃｌ−２ポリペ
    プチドをエンコードするｂｃｌ−２ポリヌクレオチドに
    突然変異を採り入れる段階を含む、ｂｃｌ−２の細胞死
    抑制体活性を阻害する方法。
  19. 【請求項１９】 図３０及び３１に示されたアミノ酸番
    号付けの慣例に従って位置１３７、１３８、１３９、１
    ４０、１４３、１４４、１４５、１８７、１８８、１８
    ９、１９０、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６
    及び１９９からなる群より選択されたアミノ酸位置のア
    ミノ酸置換又は欠失により構成される突然変異ｂｃｌ−
    ２を同定する方法であって、 ｂｃｌ−２蛋白質をエンコードするポリヌクレオチドを
    含む標本を得る段階と、 上記ポリヌクレオチドが自然発生的なｂｃｌ−２蛋白質
    に対し位置１３７、１３８、１３９、１４０、１４３、
    １４４、１４５、１８７、１８８、１８９、１９０、１
    ９１、１９３、１９４、１９５、１９６又は１９９に置
    換を有するｂｃｌ−２蛋白質をエンコードするかどうか
    を検出する段階とを含む方法。
  20. 【請求項２０】 ＢＨ１又はＢＨ２ドメインのアミノ酸
    位置のアミノ酸置換又は欠失により構成される突然変異
    ｂｃｌ−２を同定する方法であって、 ｂｃｌ−２蛋白質をエンコードするポリヌクレオチドを
    含む標本を得る段階と、 上記ポリヌクレオチドが自然発生的なｂｃｌ−２蛋白質
    に対しＢＨ１又はＢＨ２内の位置に置換を有するｂｃｌ
    −２蛋白質をエンコードするかどうかを検出する段階と
    を含む方法。
  21. 【請求項２１】 ＢＨ１又はＢＨ２ドメインのアミノ酸
    位置のアミノ酸置換又は欠失により構成される突然変異
    ｂｃｌ−２を同定する方法であって、 ｂｃｌ−２蛋白質を含む標本を得る段階と、 上記ｂｃｌ−２蛋白質が自然発生的なｂｃｌ−２蛋白質
    に対しＢＨ１又はＢＨ２内の位置に置換を有するかどう
    かを検出する段階とを含む方法。
  22. 【請求項２２】 上記検出段階は、ｂｃｌ−２蛋白質が
    適当な水性結合条件下でＢａｘを結合し得るかどうかを
    検出することにより行なわれる請求項２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 実質的にＢａｘへの結合を欠き及び／
    又は実質的に死抑制体活性を欠く突然変異ｂｃｌ−２蛋
    白質を同定する方法であって、 ＢＨ１又はＢＨ２ドメインのアミノ酸置換又は欠失によ
    り構成される突然変異ｂｃｌ−２ポリペプチドをエンコ
    ードする突然変異型ｂｃｌ−２ポリヌクレオチドを生成
    するため、ｂｃｌ−２ポリペプチドをエンコードするｂ
    ｃｌ−２ポリヌクレオチドに突然変異を導入する段階
    と、 Ｂａｘを発現しｂｃｌ−２−感受性アポプトシスを受け
    る得る哺乳類細胞に、該突然変異ｂｃｌ−２ポリペプチ
    ドを発現させる段階と、 上記突然変異ｂｃｌ−２ポリペプチドの発現は該哺乳類
    細胞に内生のｂｃｌ−２蛋白質の死抑制体活性を阻害す
    るかどうか、及び／又は、該突然変異蛋白質自体は死抑
    制体活性を欠き及び／又は該ｂｃｌ−２−感受性アポプ
    トシスの阻害を提供し得ないかどうかを判定する段階
    と、 Ｂａｘへの結合を欠き及び／又は実質的に死抑制体活性
    を欠くｂｃｌ−２蛋白質として、内因性ｂｃｌ−２死抑
    制体活性を阻害し、及び／又は、該ｂｃｌ−２−感受性
    アポプトシスの阻害を提供し得ない突然変異ｂｃｌ−２
    蛋白質を同定する段階とを含む方法。
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