JP2000266749A

JP2000266749A - センサ素子、検出方法、分析方法、分析装置およびトイレ装置

Info

Publication number: JP2000266749A
Application number: JP6843299A
Authority: JP
Inventors: Shuji Sonezaki; 修司曽根崎; Emika Ogawa; 恵美香小川; Hitoshi Ohara; 仁大原
Original assignee: Toto Ltd
Current assignee: Toto Ltd
Priority date: 1999-03-15
Filing date: 1999-03-15
Publication date: 2000-09-29

Abstract

(57)【要約】【課題】抗体分子が、立体構造の崩壊や部分的な分解
などを引き起こし、結果として抗原との結合能を失い、
センサ素子の感度が低下する。【解決手段】便器に取付可能な支持体と、便器の横断
方向に延長しリム側部の上面から上方に離間した水平な
回転軸線を中心として揺動可能に前記支持体に支持され
た揺動アームと、前記揺動アームの自由端に担持された
採尿容器と、便器リムの内側に近接する休止位置と便鉢
空間内に位置する採尿位置との間で前記採尿容器を移動
させるべく前記揺動アームを揺動させる駆動手段とを備
えた採尿手段と、前記採尿手段で収集された尿に含まれ
る所定の成分を分析する請求項２４に記載の分析装置と
を備える。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、分子改変、分子修
飾した抗体を担持したセンサ素子を用いた分析方法、分
析装置および尿成分分析装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】人々の長寿高齢化に伴い、健康管理に関
する個人の関心が高まっている。特に近年では疾病の早
期発見と疾病治療中或いは治療後の健康管理を目的とし
た自已健康チェックが重要なテーマとなっている。尿、
血液あるいは唾液は個人の健康状態に関する重要な情報
源であり、尿糖、尿蛋白、ウロビリノーゲン、潜血、血
糖、その他の成分を定量分折することにより、糖尿病の
ようなすい臓障害や肝臓障害や腎臓障害その他の機能障
害を検査することができる。特に、尿は非侵襲的に検査
できる利点を有しているため、家庭や職場その他のトイ
レットを利用して尿のサンプリングと分折を行い個人の
健康チェックを支援することの可能な種々の装置が提案
されている（特公平７−８４７５２、特開平１０−２８
５０、特開平１０−２６７９２５）。

【０００３】しかし、家庭や職場などで使用されるこの
ような装置には、通常の臨床検査機器・試薬とは異なっ
た要請がある。まず、特に家庭での使用においては１日
あたり数回程度の使用頻度であることが予想されるた
め、交感部品としてのセンサ素子の寿命がランニングコ
ストに大きく影響する。つまり、寿命が短ければ測定１
回あたりのコストが高くなってしまうのである。センサ
を用いた分析装置では、特定の標的成分に親和性を有す
る抗体などが用いられており、これらは蛋白質であるこ
とから経時的に変性し、センサ自体の感度低下を引き起
こす。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】特に、抗体を用いた免
疫センサ装置ではセンサ素子を再生して繰り返し使用す
るためには、測定後に抗原と抗体を解離する必要があ
り、そのためには低ｐＨや高塩濃度を初めとする蛋白質
分子にとっては過酷な条件での再生が行われている。こ
のような条件下におかれることは、抗体分子にとっては
ストレスとなり、立体構造の崩壊や部分的な分解などが
引き起こされ、結果として抗原との結合能が失われ、セ
ンサ素子の感度が低下していく。

【０００５】また、センサ素子の製造から使用開始まで
の間に認められるセンサ感度の低下や、装置装着時に上
記のような再生に伴うストレス以外に認められる経時的
な劣化も、すべて抗体分子の部分的な分解や立体構造の
崩壊に起因すると考えられる。

【０００６】

【課題を解決するための手段】抗体構造の概略を図１に
示した。抗体はＨ鎖、Ｌ鎖と呼ばれる大小２種類のサブ
ユニットがそれぞれ２つずつ会合したヘテロ４量体で、
Ｙ字型の構造で例示されることが多い。各サブユニット
間の会合は主にジスルフィド結合による。この結合が開
裂することで立体構造に変化が生じ、抗原との結合が失
われる。抗原と結合する領域は、Ｈ鎖、Ｌ鎖にまたがっ
ており、サブユニット間の構造の変化が抗原結合能に、
大きく影響することが理解できる。また、低ｐＨでのセ
ンサ素子再生などでは、抗体分子内の官能基がプラスに
荷電し、分子内反発が高まるため、立体構造が維持でき
なくなると考えられており、これによっても抗原結合の
低下が引き起こされる。

【０００７】上記のような問題を回避するためには、一
つには分子そのものの剛性を高める方法がある。これ
は、適当な官能基を介して分子内に架橋構造を構築し
て、立体構造の崩壊を防ぐものである。また、荷電の分
子内反発による立体構造崩壊を防ぐためには、分子表面
を親水性にすることが有効であり、そのような親水性基
（カルボキシル基、アミノ基、水酸基など）を抗体分子
へ導入することも、結合能低下防止に有効である。この
ような分子内架橋や官能基導入を動物血清より分離した
イムノグロブリンそのもの、あるいはイムノグロブリン
よりペプシンによる部分消化によって得られる誘導体F
(ab')2、F(ab')2を還元して得られるFab'、イムノグロ
ブリンよりパパインによる部分消化によって得られる誘
導体Fabに対して実施することで、立体構造の維持を達
成することができる。

【０００８】上述したように、抗体が有するサブユニッ
ト構造が結合能低下の機構に関わっているという側面が
ある。そこで、抗原との結合に必要な部分だけを取り出
した一本鎖抗体というものは、立体構造の崩壊による結
合能低下が抑制されると考えられる。図２に示したとお
り一本鎖抗体はＨ鎖とＬ鎖上にある抗原結合部位を含む
部分を人工的に設計したリンカーで接続したものであ
り、抗体遺伝子の遺伝子操作によって得ることができる
ものである。この一本鎖抗体そのもの利用でも、通常の
抗体よりも結合能低下が抑制されるが、この一本鎖抗体
にさらに上述したような分子内架橋や親水基導入を行う
ことで、結合能の低下をより強く抑制することができ
る。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明者らは、今般、分子改変し
た抗体を担持したセンサ素子が長期保存、長期使用に耐
え、在宅尿検査装置には特に有効であることを見いだし
た。通常の形態の抗体に分子改変するだけでなく、抗原
結合部位を含む領域を一本鎖構造とした抗体を用いた
り、さらにその一本鎖抗体に分子改変を施すことによっ
ても、長期保存、長期使用が可能なセンサ素子が得られ
ることを見出して本発明を完成させた。本発明は、長期
保存、長期使用が可能なセンサ素子を利用した生体成
分、特に尿成分への応用とそれを実現する装置の提供を
その目的としている。

【００１０】本発明によるセンサ素子は、分子改変した
抗体あるいは分子改変した一本鎖抗体を担持したもので
ある。

【００１１】本発明によれば、これらの抗体種は抗原と
結合する能力を保持したまま、立体構造の安定化が達成
されている。

【００１２】本発明の第一の好ましい態様によれば、使
用する抗体はＨ鎖とＬ鎖上にある抗原結合部位を含む部
分を人工的に設計したペプチドリンカーで接続した、い
わゆるScFv抗体とも呼ばれる一本鎖抗体である。

【００１３】本発明の第二の態様によれば、使用する抗
体は上記一本鎖抗体を分子内架橋あるいは官能基導入し
たものである。

【００１４】本発明の第三の態様によれば、使用する抗
体はイムノグロブリン及びその誘導体を分子内架橋ある
いは官能基導入したものである。

【００１５】これらいずれの使用態様によっても、試料
中の標的物質の定量が可能なセンサ装置が提供され、そ
のようなセンサ装置は生体成分や尿成分の測定に用いる
ことができる。以下に本発明による実施例を示すが、本
発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。

【００１６】（実施例１）一本鎖抗体（抗ヒトアルブミ
ン）の製造常法に従ってマウスに精製ヒトアルブミンを
投与して免疫し、抗ヒトアルブミン抗体（抗ヒトアルブ
ミンイムノグロブリンG）を産生させる。抗ヒトアルブ
ミン抗体の産生を確認した後、マウスを屠殺し、脾臓を
摘出する。脾臓より常法に従ってmRNAを抽出、精製す
る。精製mRNAより逆転写酵素を用いてcDNAを合成する。
マウスイムノグロブリンGのH鎖およびL鎖に特異的なプ
ライマーを用いて、各鎖の抗原結合部位をコードする遺
伝子領域をPCR法により増幅する。増幅したH鎖とL鎖の
遺伝子領域を合成ヌクレオチドであるリンカーで連結
し、大腸菌で複製・発現可能なpCAMTAB5Eなどのファジ
ミドに組み込む。

【００１７】このようにして得た組換えファジミドでア
ンバーサプレッサー株の大腸菌を形質転換すると、ヘル
パーファージの存在下で一本鎖抗体を提示するファージ
粒子を形成することができる。このようなファージ粒子
は抗体活性とその遺伝子を含んでいるため、アルブミン
に対する結合能に基づいたスクリーニングを行うと、同
時にその遺伝子も回収することができる。優れた特性を
有する一本鎖抗体提示ファージを、再びアンバーサプレ
ッサー欠損の大腸菌に形質転換すると、一本鎖抗体を可
溶態の蛋白質として生産することができる。これらは常
法に従って抽出、精製し、センサ素子の製造に用いるこ
とができる。

【００１８】（実施例２）ヒトアルブミン測定用センサ
素子の製造支持体としてのカバーガラス（サイズ２×４ｃｍ）を用
意し、希硝酸、中性洗剤、および超純水の順で超音波洗
浄した。この支持体上にマグネトロンスパッタリング法
によって、２ｎｍ厚のＣｒ接着層を付し、その後で５０
ｎｍ厚の金薄膜を蒸着した。続いて、同様のマグネトロ
ンスパッタリング法により、２ｎｍ厚のシリカ膜を形成
した。作成した基板を０．５（ｖ／ｖ）％のグリシドキ
シプロピルトリメトキシ−シラン溶液（溶媒イソプロピ
ルアルコール）に入れて、室温で５分間表面をシラン化
させた。その後、水で洗浄した。シラン化した基板を、
２３（ｗ／ｖ）％のCMデキストラン（分子量約７００，
０００）溶液中で２０時間振とうして、CMデキストラン
ゲル層を形成し、その後大量の水で洗浄した。、CMデキ
ストランは、１Ｍのブロモ酢酸と２ＮのＮａＯＨとを含
む溶液３０ｍｌにデキストラン（分子量約５００，００
０）１０ｇを添加し、溶解した後、室温で２０時間撹拌
して合成した。その後、溶液を中和して大量の水で透析
精製し、凍結乾燥し、使用時に所定濃度に溶解した。Ｃ
Ｍ化デキストランゲル層を０．１ＭのＮ−ヒドロキシス
クシンイミドおよびジメチルアミノプロピルカルボジイ
ミド（ＥＤＣ）で活性化した後、実施例１で製造した一
本鎖抗体を固定化した。このようにして製造したセンサ
素子は適当なサイズに切断して、表面プラズモン共鳴法
に基づく免疫センサに使用することができる。このよう
にして製造したセンサ素子を用いてヒトアルブミンを繰
り返し測定し、その間の感度低下を評価した結果を図３
に示した。対照としては、家ウサギ由来の抗ヒトアルブ
ミンイムノグロブリンＧを用いて同様の方法で製造した
センサ素子を用いた。本発明に基づくセンサ素子は、繰
り返し使用時の感度低下がわずかであることがわかる。

【００１９】（実施例３）尿蛋白分析装置の製造図４は実施例１の装置をトイレットに装着した状態を示
す外観図であり、図５は採尿手段を備えた装置（採尿
部）の内部概観図である。排尿時に採尿する手段は、便
器に取付可能な支持体１と、便器の横断方向に延長しリ
ム側部の上面から上方に離間した水平な回転軸線を中心
として揺動可能に前記支持体に支持された揺動アーム２
と、前記揺動アームの自由端に担持された採尿容器３
と、便器リムの内側に近接する休止位置と便鉢空間内に
位置する採尿位置との間で前記採尿容器を移動させるべ
く前記揺動アームを揺動させる駆動手段４とを備える。
支持体１は平面視において便器のリムの略前半の輸郭に
沿って湾曲しかつ該略前半を覆う形状に形成し、前記支
持体を便器リムの略前半の上面に載置することにより採
尿手段をリムに取付ける。

【００２０】測定装置本体（計測部）５には、前記採尿
手段で収集された尿をｐＨ緩衝液で希釈する手段と、前
記採尿手段で収集された尿の成分を分析するバイオセン
サと、前記バイオセンサを洗浄、再生する手段と、各手
段を制御する手段とを備える。本体上部には測定開始ボ
タンなどと測定結果を表示するパネルなどを備えた操作
・表示パネル６を備える。また、計測部内には尿の希釈
や流路の洗浄に用いる緩衝液と既知濃度のヒトアルブミ
ンを含む校正液に加えて抗原抗体の結合を解離させる再
生液を収納する溶液タンクも備える。溶液タンクは、溶
液毎に別体とすることも、単一のタンクを分画すること
もできる。また、必要に応じて溶液タンク、流路、バイ
オセンサ内の温度を制御するためのヒーター、冷却器を
備えることもできる。さらに、適当な部位に温度測定手
段（熱電対やサーミスタ）を配置して、測定時の温度を
測定し、その情報をもとにバイオセンサからの信号を補
正する手段を備えることもできる。このような温度制御
や温度補正は、計測部内の制御部に備えたマイコンなど
を用いて行うことができる。採尿部と計測部は連結部７
で接続されている。連結部内は、採尿した尿を計測部に
搬送する流路、採尿部を洗浄するための水や緩衝液を搬
送する流路、バイオセンサにて測定終了した尿試料や測
定時に発生した余剰の溶液などを便鉢内に排出するため
の流路、採尿部を駆動するための電力、制御信号などを
通す電線類などを適当なサイズのチューブ中に配管、配
線したものである。

【００２１】図６は計測部の内部構成をブロック図とし
て示したものである。採尿された尿は、シリンジポンプ
１０によって計測部内に搬送され、溶液タンク１１中の
緩衝液と適当な手段によって希釈される。ここで言う適
当な希釈手段とは、たとえば、流路の一部に尿試料を挟
むようにしてセンサに流入させることで希釈も同時に行
うフローインジェクションアナリシス（FIA）などがあ
り、これらは測定時のシリンジポンプやバルブ１２の動
作を制御することで達成できる。

【００２２】このようにして希釈された尿は、蛋白セン
サ１４（免疫センサ）へ搬送され、尿蛋白濃度が測定さ
れる。測定終了後、蛋白センサ素子上に結合した尿蛋白
を取り除き、再使用を可能とするため、溶液１１中の再
生液を蛋白センサへ搬送し、一定時間後、再び緩衝液を
搬送して再生液を排出する。測定の開始はスイッチ部に
て操作する。この時、採尿アームの位置を変えるために
「男性」「女性」を区別するためのスイッチを備えるこ
ともできる。スイッチ部より送られた信号をトリガーと
して制御部は一連の動作（採尿部の作動、採尿、尿の搬
送、尿の希釈、希釈尿のセンサへの搬送、センサの再
生、センサの洗浄、採尿部の洗浄）を行う。同時にセン
サから得られた信号を、既知濃度の校正液を用いて測定
した場合の信号と比較して尿中成分の濃度の算出も行
う。算出された結果は、表示部のパネルに表示され、使
用者に報告される。また、校正液は溶液タンク中に収納
されている。校正液を用いた測定（校正）の動作は、校
正液のセンサへの搬送、センサの再生、センサの洗浄の
順番に行い、この時得られた信号を尿成分測定時に参照
する。

【００２３】ここで、尿蛋白センサ１４の一例としては
表面プラズモン共鳴を励起できるような金属薄膜上に尿
蛋白（アルブミン）を特異的に検出する一本鎖抗体ある
いはその化学修飾体を担持し、尿蛋白との結合に伴うセ
ンサ上の屈折率変化を検出するようなものを使用するこ
とができる。また、圧電素子の上に同様の抗体を担持
し、尿蛋白との結合に伴うセンサ上の質量変化を圧電素
子の共振周波数の変化として検出するようなものも使用
することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】免疫グロブリンＧとその誘導体の構造

【図２】一本鎖抗体の構造と製造方法

【図３】実施例２の一本鎖抗体を用いたセンサ素子の使
用時の感度低下をイムノグロブリンＧを用いたセンサ素
子と比較したグラフ

【図４】本発明の実施例３の尿成分装置をトイレットに
装着した状態を示す図

【図５】本発明の実施例３の採尿手段を備える採尿部の
内部構造を示す図

【図６】本発明の実施例３の尿成分装置の計測部の概略
を示す図

【符号の説明】

１…支持体２…揺動アーム３…採尿容器４…駆動部５…測定装置本体（計測部）６…操作・表示パネル７…連結部１０…シリンジポンプ１１…溶液タンク１２…バルブ１３…センサ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/543 ５９５Ｇ０１Ｎ 33/543 ５９５ 33/563 33/563 Ｆターム(参考） 2D038 JF04 ZA03 2G045 AA16 AA22 AA36 CB03 CB04 CB07 FA03 FB03 FB05 FB16 GC07 GC09 GC18 HA06 HA10 HA14 JA07

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】分子修飾した抗体を物理的あるいは化学
的に担持したセンサ素子。
【請求項２】前記抗体が分子内架橋したイムノグロブ
リンである請求項１に記載のセンサ素子。
【請求項３】前記抗体が分子内架橋したイムノグロブ
リンF(ab')2である請求項１に記載のセンサ素子。
【請求項４】前記抗体が分子内架橋したイムノグロブ
リンFab'である請求項１に記載のセンサ素子。
【請求項５】前記抗体が分子内架橋したイムノグロブ
リンFabである請求項１に記載のセンサ素子。
【請求項６】前記抗体が官能基導入したイムノグロブ
リンである請求項１に記載のセンサ素子。
【請求項７】前記抗体が官能基導入したイムノグロブ
リンF(ab')2である請求項１に記載のセンサ素子。
【請求項８】前記抗体が官能基導入したイムノグロブ
リンFab'である請求項１に記載のセンサ素子。
【請求項９】前記抗体が官能基導入したイムノグロブ
リンFabである請求項１に記載のセンサ素子。
【請求項１０】前記抗体がイムノグロブリンＨ鎖およ
びＬ鎖の抗原結合部位を含む一本鎖抗体である請求項１
に記載のセンサ素子。
【請求項１１】前記抗体がイムノグロブリンＨ鎖およ
びＬ鎖の抗原結合部位を含む分子内架橋した一本鎖抗体
である請求項１に記載のセンサ素子。
【請求項１２】前記抗体がイムノグロブリンＨ鎖およ
びＬ鎖の抗原結合部位を含む官能基導入した一本鎖抗体
である請求項１に記載のセンサ素子。
【請求項１３】前記一本鎖抗体が人工的にアミノ酸配
列を改変した変異体であることを特徴とする請求項１０
〜１２に記載のセンサ素子。
【請求項１４】分子内架橋はジアミン類、ジカルボン
酸類、ジシステイン類からなる群の１つあるいは複数の
物質より選択することを特徴とする請求項２〜５、１１
に記載のセンサ素子。
【請求項１５】前記官能基が親水基であることを特徴
とする請求項６〜９、１２に記載のセンサ素子。
【請求項１６】前記親水基がカルボキシル基、アミノ
基、グアニジノ基、水酸基からなる群の１つあるいは複
数の基より選択することを特徴とする請求項１６に記載
のセンサ素子。
【請求項１７】請求項１〜１６に記載のセンサ素子に
担持した抗体と試料液中の標的物質との結合に由来する
屈折率の変化量を信号として測定する検出方法。
【請求項１８】請求項１〜１６に記載のセンサ素子に
担持した抗体と試料液中の標的物質との結合に由来する
質量の変化量を信号として測定する検出方法。
【請求項１９】請求項１〜１６に記載のセンサ素子に
担持した抗体と試料液中の標的物質との結合に由来する
キャパシタンスの変化量を信号として測定する検出方
法。
【請求項２０】請求項１〜１６に記載のセンサ素子に
担持した抗体と試料液中の標的物質との結合に由来する
インピーダンスの変化量を信号として測定する検出方
法。
【請求項２１】被験試料液中の標的物質の分析方法で
あって、請求項１７〜２０に記載の検出方法と被験試料
液とを接触させる工程と、各検出装置に固有の変化量を
観察する工程とセンサ素子上の抗体と標的物質の結合を
解離させる工程よりなる分析方法。
【請求項２２】前記検出方法が表面プラズモン共鳴を
利用したものである請求項２１に記載の分析方法。
【請求項２３】被験試料液中の標的物質の分析装置で
あって、請求項２１、２２に記載の分析方法の各工程を
行う機構を含んでなる分析装置。
【請求項２４】被験試料液中の標的物質を定量する装
置であって、請求項２１、２２に記載の分析方法を自動
的に行い、濃度既知の標的物質を含む標準液を対象とし
て分析した場合の信号と、被験試料液中の標的物質を対
象として分析した場合の信号とを比較することで、被験
試料液中の標的物質濃度を算出する分析装置。
【請求項２５】前記標的物質が生体成分である請求項
２３，２４に記載の分析装置。
【請求項２６】前記標的物質が尿中成分である請求項
２３，２４に記載の分析装置。
【請求項２７】前記標的物質が血中成分である請求項
２３，２４に記載の分析装置。
【請求項２８】前記標的物質が糞便成分である請求項
２３，２４に記載の分析装置。
【請求項２９】前記標的物質が唾液成分である請求項
２３，２４に記載の分析装置。
【請求項３０】便器に取付可能な支持体と、便器の横
断方向に延長しリム側部の上面から上方に離間した水平
な回転軸線を中心として揺動可能に前記支持体に支持さ
れた揺動アームと、前記揺動アームの自由端に担持され
た採尿容器と、便器リムの内側に近接する休止位置と便
鉢空間内に位置する採尿位置との間で前記採尿容器を移
動させるべく前記揺動アームを揺動させる駆動手段とを
備えた採尿手段と、前記採尿手段で収集された尿に含ま
れる所定の成分を分析する請求項２４に記載の分析装置
とを備えたことを特徴とする尿分析トイレ装置。
【請求項３１】前記支持体は平面視において便器のリ
ムの略前半の輸郭に沿って湾曲しかつ該略前半を覆う形
状に形成し、前記支持体を便器リムの略前半の上面に載
置することにより採尿手段をリムに取付けるようにした
ことを特徴とする請求項３０記載の尿分折トイレ装置。