JP2000262282A - セルロース合成酵素複合体の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 セルロース合成酵素複合体を精製する方法を
提供することを課題とする。 【解決手段】 植物細胞から調製した可溶化細胞膜画分
に対して、微小管を添加してインキュベートすることに
より、該画分に含まれるセルロース合成酵素複合体と微
小管との複合体を形成させることができ、これら複合体
を共沈殿により簡便に分離することができることを見出
した。さらに、これら複合体に対し塩を含むバッファー
を作用させ、次いで遠心を行うことにより、遠心後の上
清から精製されたセルロース合成酵素複合体を得ること
ができることを見出した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、セルロース合成酵
素複合体の精製方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】セルロースは、グルコースが2000〜2000
0個ほど結合した繊維状の高分子であり、植物体の約3分
の1を占める炭水化物である。セルロースは紙パルプの
原料、繊維原料、粗飼料、燃料の原料として利用されて
おり産業上非常に重要な物質である。

【０００３】このセルロースは植物細胞内の特定の酵素
の働きにより合成されていると考えられており、セルロ
ース合成酵素に関してはこれまでに原核生物である酢酸
菌から遺伝子の単離が報告されている（Saxena I.M.et
al.Plant Mol.Biol.15,673-683(1990):Wong H.C.et al.
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,8130-8134(1990)）。１つ
のグループは突然変異処理によりセルロース合成を行わ
ない酢酸菌の変異株を作製し、セルロース合成に必要な
４つのタンパク質をコードするオペロンを同定している
（Wong H.C.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,8130-81
34(1990)）。これら４つの遺伝子は、変異株の相補試験
・遺伝子破壊実験により、すべて完全なセルロース合成
を行うために必要であることが示されている。また別の
グループは、酢酸菌の膜分画からセルロース合成酵素を
分離し、アミノ酸配列を決定して遺伝子の単離を報告し
た（Saxena I.M.et al.Plant Mol.Biol.15,673-683(199
0)）。これらのタンパク質のなかには、UDP-グルコース
からセルロースの合成を行う活性の中心となるタンパク
質（Cel A）以外にも、グルカン鎖の結晶化に関与する
タンパク質の存在が示唆されている。

【０００４】アグロバクテリウムにおいてはセルロース
合成に必要な２つのオペロンが同定されている（Matthy
sse A.G.et al.J.Bacteriol.177,1069-1075(1995)）。
これは、セルロース合成を行わないアグロバクテリウム
の変異株から遺伝子を単離したもので、２つのオペロン
に５つの遺伝子の存在が報告されている。トランスポゾ
ンの挿入により、これらの遺伝子はすべてセルロース合
成に必要であることが示された。また、酢酸菌のセルロ
ース合成酵素オペロンとの比較により、UDP-グルコース
からセルロースの合成を行う活性の中心となるタンパク
質（Cel A）の遺伝子は共通に存在するが、その他の遺
伝子についてはホモロジーが見いだされていない。

【０００５】一方、高等植物のセルロース合成酵素につ
いての生化学的な解析はほとんど進んでいない。酢酸菌
のセルロース合成酵素と同じ抗原性をもつタンパク質を
植物から分離したり（Mayer R.et al.Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 88,5472-54768(1991)）、酢酸菌の遺伝子をプロ
ーブにして植物のセルロース合成酵素をクローニングす
る試みが数多く行われたが、現在まで遺伝子の単離は報
告されていない。また、Brownらはワタ繊維の膜分画か
ら1%digitoninで可溶化される分画に、セルロースの合
成活性が存在することが示したが（Okuda K.et al.Plan
t Physiol.101,1131-1142(1993)）、これについては他
の成分が多く含まれていることやセルロースの収量が非
常に少ないという指摘があり（Delmer D.P. et al.Plan
t Physiol.103,307-308(1993)）、セルロースの合成活
性を同定したということはできないであろう。

【０００６】最近、植物からもCel A遺伝子の単離が報
告された（Pear J.R.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9
3,12637-12642(1996)）。これはセルロース合成の盛ん
なワタ繊維から作製したcDNA約250個をランダムにシー
ケンスし、バクテリアのCel A遺伝子とホモロジーのあ
る遺伝子を単離したものである。また近年Cel A遺伝子
のホモログがriceとarabidopsisのESTでも見つかってい
る。DelmerらはCel A遺伝子の内部の領域が基質のUDP-
グルコースに結合することを示しているが、単離したCe
l A遺伝子が実際にセルロース合成を行っているという
証拠は得ていない。これは植物のセルロース合成装置が
非常に複雑な構造をしているため、１つの遺伝子を単離
しただけではその機能を同定することができないことに
よると思われる。このように植物のセルロース合成に関
しては知見がほとんどないのが現状であった。

【０００７】植物のセルロース合成は、原形質膜中のセ
ルロース合成酵素複合体と呼ばれる装置から合成されて
いることが、電子顕微鏡による観察から示されている
（Giddings T.H.et al.J.Cell Biol.84,327-339(198
0)）。このセルロース合成酵素複合体は、通称ロゼット
と呼ばれ、６個の顆粒からなるロゼット形をしている。
本発明者らは、チューブリンに対する抗体を用いて世界
で初めて植物のセルロース合成酵素複合体の単離を報告
しているが（１９９６年３月２７日開催の植物生理学
会、講演要旨集ｐ６７）、このセルロース合成酵素複合
体と呼んでいる顆粒の直径は約10nmであり、ロゼットを
構成している顆粒の１つの大きさとよく一致している。

【０００８】しかしながら、該報告においては単離した
セルロース合成酵素複合体および該複合体を構成するサ
ブユニットは完全に精製されていなかった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、セルロース
合成酵素複合体を精製する方法を提供することを課題と
する。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、微小管に
γチューブリンが結合することから、セルロース合成酵
素複合体がその構成要素であるγチューブリンを介して
微小管に結合するのではないかとの着想を得て、かかる
着想に基づき、微小管を利用してセルロース合成酵素複
合体を精製する方法を開発すべく鋭意研究を行った。

【００１１】その結果、本発明者らは、植物細胞から調
製した可溶化細胞膜画分に対して、微小管を添加してイ
ンキュベートすることにより、該画分に含まれるセルロ
ース合成酵素複合体と微小管との複合体を形成させるこ
とができ、これら複合体を共沈殿により簡便に分離する
ことができることを見出した。さらに、これら複合体に
対し塩を含むバッファーを作用させ、次いで遠心を行う
ことにより、遠心後の上清から精製されたセルロース合
成酵素複合体を得ることができることを見出した。

【００１２】即ち、本発明者らは、微小管を利用した共
沈殿という簡便な操作により、植物細胞からセルロース
合成酵素複合体を精製することに成功し、本発明を完成
するに至った。

【００１３】従って、本発明は、（１） セルロース合
成酵素複合体を精製する方法であって、（ａ）植物細胞
から細胞膜画分を分離し、該画分を可溶化する工程、
（ｂ）可溶化した細胞膜画分と微小管とを混合し、該画
分に含まれるセルロース合成酵素複合体と微小管とが複
合体を形成するのに十分な時間、インキュベートする工
程、（ｃ）形成したセルロース合成酵素複合体と微小管
との複合体を分離する工程、および（ｄ）分離したセル
ロース合成酵素複合体と微小管との複合体からセルロー
ス合成酵素複合体を分離する工程、を含む方法、（２）
工程（ｄ）に次いで、さらに遊離チューブリンを除去
する工程を含む、（１）に記載の方法、（３） 工程
（ａ）における細胞膜画分の分離が遠心を利用して行わ
れる、（１）または（２）に記載の方法、（４） 工程
（ｃ）におけるセルロース合成酵素複合体と微小管との
複合体の分離が共沈殿により行われる、（１）から
（３）のいずれかに記載の方法、（５） 工程（ｄ）に
おけるセルロース合成酵素複合体の分離が、セルロース
合成酵素複合体と微小管との複合体の塩による解離およ
びそれに続く遠心により行われる、（１）から（４）の
いずれかに記載の方法、（６） （１）から（５）のい
ずれかに記載の方法により単離される精製されたセルロ
ース合成酵素複合体、に関する。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明は、セルロース合成酵素複
合体を精製する方法を提供する。本発明の方法は、セル
ロース合成酵素複合体と微小管との結合を利用する方法
である。本発明の方法においては、まず、植物細胞から
細胞膜画分を分離し、該画分を可溶化する（工程
（ａ））。

【００１５】セルロース合成酵素複合体の単離に用いる
植物の種類としては特に制限はない。双子葉植物であっ
ても単子葉植物であってもよい。また、草本性植物であ
っても、木本性植物であってもよい。紙・パルプ産業へ
の応用のためには、特に優良セルロースを合成するユー
カリやアカシヤなどの木本性植物が好ましい。

【００１６】植物細胞からの細胞膜画分の分離は、例え
ば、次のように行うことができる。冷却した組織を冷却
した適当なバッファー（例えば、5 mM EDTA, 5 mM EGT
A,300 mMしょ糖、タンパク質分解酵素阻害剤を含む50
mM PIPES, あるいはHEPESバッファー, pH 7.6 近辺）で
破砕後、ガーゼなどで濾し、その濾液を8000ｇ程度で遠
心し、遠心後の上清にくる画分を採取し、これをさらに
100,000ｇ程度で遠心し、いわゆるミクロゾーム画分を
得る。この画分から、例えば、植物細胞膜の分離法とし
て確立されているデキストランとポリエチレングリコー
ルを用いた水性二層分配法により細胞膜を精製する。

【００１７】この方法では、本来の細胞膜の向きを示し
ている（ライトサイドアウトの）細胞膜粒子のみが上層
にくるため、これを取り適当なバッファー（例えば、25
0 mMしょ糖、タンパク質分解酵素阻害剤、1 mM DTT な
どを含む50 mM PIPES, HEPESバッファー pH 7.6など）
を添加した後、遠心（例えば、100,000ｇで20分）で洗
浄し、その沈澱を細胞膜試料として用いる（Yoshida,
S., Uemura, M., Niki, T., Sakai, A. and Gusta, L.
V. Plant Physiol. 72, 105-114 (1983)参照）。

【００１８】次いで、該細胞膜試料から以下のように可
溶化画分を得る。細胞膜試料は 上述のPIPESバッファー
等に分散した後、1％ CHAPS を含む同バッファーを等量
添加してよく混合し、氷上で30分程度静置する。CHAPS
濃度はこれで 0.5% となる。ここでCHAPS濃度が高い場
合には微小管の脱重合が激しくなるため好ましくない。
CHAPS 濃度は、0.5〜1% 程度が好適である。また、界面
活性剤としては、例えば、 NP-40やトライトン−X100な
どを用いることができる。遠心分離（例えば、100,000
ｇで4℃）後、上清を採取する。以上の過程は、好まし
くは、0から4℃の温度で行う。

【００１９】次いで、可溶化した細胞膜画分と微小管と
を混合し、該画分に含まれるセルロース合成酵素複合体
と微小管とが複合体を形成するのに十分な時間、インキ
ュベートする（工程（ｂ））。

【００２０】可溶化した細胞膜画分に混合するための微
小管は、チューブリンを重合させて調製することができ
る。例えば、チューブリン（3 mg/ml程度）は、１ mM M
gCl₂,10μmolタキソール,1mM GTP 存在下で、30℃で30
分、100 mM PIPESバッファー（pH 6.9）中で重合させる
ことができる。タキソールにより微小管は極めて安定化
される。上記バッファーに対し100,000ｇで30分の遠心
分離を30℃にて行い、これにより、重合した微小管をペ
レットとして得ることができる。微小管は、動物由来で
あっても、植物由来であってもよい。

【００２１】セルロース合成酵素と微小管との結合反応
は、例えば、次ぎのように行うことができる。上述のよ
うにして得られた可溶化細胞膜画分に対し、10μmolの
タキソールを添加後、この可溶化細胞膜画分と上記微小
管ペレットを混合し、室温で反応させ、微小管にセルロ
ース合成酵素を結合させる。反応は、15分以上、好まし
くは30分以上行わせる。可溶化細胞膜画分と微小管との
結合反応は、例えば、約50グラムの組織から精製した可
溶化細胞膜画分（8ml）に対し、微小管12 mgを添加して
行うことができるが、可溶化細胞膜画分と微小管の混合
比は、適宜選択することができる。

【００２２】次いで、形成したセルロース合成酵素複合
体と微小管との複合体を分離する（工程（ｃ））。

【００２３】セルロース合成酵素複合体と微小管との複
合体の分離は、共沈殿により行うことができる。共沈澱
は、次のように行うことができる。例えば、タキソール
存在下でインキュベートした微小管と可溶化細胞膜画分
との混合液に対し、27℃で100,000ｇの遠心を行う。こ
の際、遠心管の下部には60％グリセロールを含む PIPES
バッファーをクッションとして置きその上にサンプルを
重層する。この遠心により、セルロース合成酵素複合体
と微小管との複合体はペレットにくる。

【００２４】次いで、分離したセルロース合成酵素複合
体と微小管との複合体からセルロース合成酵素複合体を
分離する（工程（ｄ））。

【００２５】上記のセルロース合成酵素複合体と微小管
との複合体のペレットを、塩（例えば、0.8 M NaCl ）
を含むバッファーに懸濁させる。これにより、微小管に
結合していたセルロース合成酵素複合体が解離する。次
いで、遠心分離（例えば、100,000xg, 27℃、30分）に
より微小管を沈澱させ、セルロース合成酵素複合体が含
まれる上清を得る。

【００２６】なお、これにより分離された画分には、セ
ルロース合成酵素複合体以外に、微小管が脱重合して生
じたチューブリンが含まれている場合がある。従って、
本発明の方法においては、さらに遊離チューブリンを除
去する工程（工程（ｅ））を選択的に含むことができ
る。

【００２７】遊離チューブリンの除去には、例えば、ゲ
ル濾過カラム（Sephadex G-200 やSepharose 4B）など
を用いることができる。

【００２８】以下、本発明を実施例により具体的に説明
するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではな
い。

【００２９】

【実施例】[実施例１] 細胞膜とセルロース合成酵素複
合体の可溶化 アズキ、タバコ、シロイヌナズナなど植物細胞を50 mM
PIPESバッファーA (300 mM スクロース, 5 mM EDTA, 5
mM EGTA, ヂチオスレイトール、タンパク分解酵素阻害
剤を含む。pH 7.6) で氷冷下で破砕する。ガーゼで濾過
後 8,000 x g,4℃で10分間遠心する。上清はさらに100,
000 x g, 4℃で20分間遠心し、沈殿した膜分画は 250mM
スクロース を含む 10 mM K-りん酸バッファーに懸濁
し再度100,000 x g, 4℃で20分間遠心する。沈殿は少量
の10 mM K-りん酸バッファーに懸濁し、これをポリエチ
レングリコールとデキストランによる２相分配法にか
け、上相にくる細胞膜顆粒のみを分離する。細胞膜顆粒
分画は等量の 50 mM PIPESバッファーB (250 mM スクロ
ース, ヂチオスレイトール、タンパク分解酵素阻害剤を
含む。pH 7.6) と混合した後、100,000 xg、4℃で20分
間遠心し細胞膜の沈殿を得る。細胞膜沈殿は0.5％CHAPS
(界面活性剤) を加えよく撹拌し氷中で30分間おき、細
胞膜を可溶化した後 100,000x g, 4℃で20分間遠心し上
清をとる。この抽出液がセルロース合成酵素複合体の単
離の出発材料となる。

【００３０】[実施例２] MAPs (Microtubule Associat
ed Proteins) を含まない微小管の調製 ウシなどの脳から Shelanskiらの方法（Shelanski et
al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 70, 765-768(1973)）に
より微小管タンパク質を分離し、これをホスホセルロー
スカラムに通しMAPs を除きチューブリンのみを精製す
る。MAPs を含まないチューブリンを30％ グリセロー
ル, 20 μmol タキソール, 1 mM Mg, 1 mMGTP を含む P
IPESバッファーB, pH 6.9, により30℃、30分インキュ
ベートし重合させ MAPs を含まない微小管を形成する。
形成された微小管は 60% グリセロールを含むバッファ
ーB をクッションにし遠心分離（100,000xg）により半
透明の沈澱として得る。

【００３１】[実施例３] 微小管を用いた特異的な共沈
澱法によるセルロース合成酵素複合体の分離・精製 細胞膜を可溶化した抽出液とタキソールにより安定化さ
れた微小管を混合し室温で30分インキュベートする。こ
の間にセルロース合成酵素複合体は構成タンパク質とし
て存在するγチューブリンを介して微小管の表面に結合
する。このサンプルを60％ グリセロールを含むバッフ
ァーB をクッションとして重層し、100,000xg で30分27
℃で遠心分離し微小管のペレットを得る。これを0.8 M
NaCl を含むバッファーB に懸濁すると結合していたセ
ルロース合成酵素複合体がはずれてくる。遠心分離（10
0,000xg, 27℃、30分）により微小管を沈澱させ、セル
ロース合成酵素複合体が含まれる上清を得る。

【００３２】存在しうる遊離チューブリンを除去するた
めに、さらにSepharose 4Bカラムにかけることができ
る。

【００３３】[実施例４] SDSポリアクリルアミドゲル
電気泳動（SDS-PAGE）によるセルロース合成酵素複合体
の精製度の確認 実施例３に記載の方法により精製する前の膜可溶性画
分、および実施例３における微小管を用いた特異的な共
沈澱法による精製後の画分を Laemmliの方法（Laemml
i, U. K. Nature 227, 680-685 (1970)）により電
気泳動し、泳動後のゲルをCBB染色した。その結果を図
１に示す。図中のＡは、精製する前の膜可溶性画分であ
り、Ｂは微小管を用いた特異的な共沈澱法による精製後
の画分である。精製後の画分では、分子量50kDa付近に
チューブリンのバンドが確認されたほか、セルロース合
成酵素複合体を構成するタンパク質のバンドが複数確認
された。

【００３４】また、共沈澱法による精製後の画分をSeph
arose 4B カラムにかけ、遊離チューブリンを除去した
後、同様にSDS-PAGEによる検出を行った。その結果、お
よそ20, 30, 33, 35, 49, 52, 68, および100kDa付近に
セルロース合成酵素を構成するタンパク質と考えられる
バンドが検出された。

【００３５】[実施例５] セルロース合成酵素複合体と
微小管との会合の検出 50グラムの組織から分離した細胞膜の可溶化分画（タン
パク量約5 mg）を微小管（約10 mg）と共にインキュベ
ーション後、100,000ｇの遠心で共沈澱する分画をと
り、0.8 M NaCl を含む 100 mM PIPESバッファー（pH
6.9） (1 mM MgCl₂、１ mM EGTA を含む）1 ml で洗浄
し、微小管に結合しているセルロース合成酵素複合体を
可溶化した。この分画100 μlをとり、100mM PIPESバッ
ファー（pH 6.9） で5倍に希釈し、これに微小管（タン
パク量は100μg) を加え15分インキュベートした後、フ
ォルムバールでコートした銅グリッド（日新EM株式会社
製）に乗せ、0.1%酢酸ウランでネガテイブ染色し、電子
顕微鏡（JEM-1200EX；日本電子株式会社）で観察した
（図２）。その結果、微小管に会合しているセルロース
合成酵素複合体が観察された。

【００３６】

【発明の効果】本発明により、微小管を用いた共沈殿に
よるセルロース合成酵素複合体の精製方法が提供され
た。これにより、植物細胞からセルロース合成酵素複合
体を簡便に精製することが可能となった。この方法によ
り得られたセルロース合成酵素複合体は、これを構成す
るタンパク質およびその遺伝子の単離のための出発材料
となる。セルロース合成酵素複合体を構成するタンパク
質や遺伝子は、新しいセルロースの合成能をもつ樹木の
開発に利用することができ、紙・パルプ産業に対し大き
く貢献することが可能であると考えられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】精製前および精製後のセルロース合成酵素複合
体をSDS-PAGEにより検討した結果を示す電気泳動写真で
ある。Aは、精製前の膜可溶性画分を、Bは、微小管を用
いた特異的な共沈澱法による精製後の画分を電気泳動し
た。

【図２】本発明の方法により精製したセルロース合成酵
素複合体と微小管との会合を示す電子顕微鏡写真であ
る。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 セルロース合成酵素複合体を精製する方
   法であって、（ａ）植物細胞から細胞膜画分を分離し、
   該画分を可溶化する工程、（ｂ）可溶化した細胞膜画分
   と微小管とを混合し、該画分に含まれるセルロース合成
   酵素複合体と微小管とが複合体を形成するのに十分な時
   間、インキュベートする工程、（ｃ）形成したセルロー
   ス合成酵素複合体と微小管との複合体を分離する工程、
   および（ｄ）分離したセルロース合成酵素複合体と微小
   管との複合体からセルロース合成酵素複合体を分離する
   工程、を含む方法。
2. 【請求項２】 工程（ｄ）に次いで、さらに遊離チュー
   ブリンを除去する工程を含む、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 工程（ａ）における細胞膜画分の分離が
   遠心を利用して行われる、請求項１または２に記載の方
   法。
4. 【請求項４】 工程（ｃ）におけるセルロース合成酵素
   複合体と微小管との複合体の分離が共沈殿により行われ
   る、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
5. 【請求項５】 工程（ｄ）におけるセルロース合成酵素
   複合体の分離が、セルロース合成酵素複合体と微小管と
   の複合体の塩による解離およびそれに続く遠心により行
   われる、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
6. 【請求項６】 請求項１から５のいずれかに記載の方法
   により単離される精製されたセルロース合成酵素複合
   体。