JP2000241373A - 非常に大きな分子の溶液ｎｍｒにおける相関緩和による分極移動 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 巨大分子を含む非常に多様な複合ＮＭＲ実験
用の「基礎的要素」として使用可能であり、ＩＮＥＰＴ
等の従来技術の方法と比較してより高感度な新規な分極
移動要素を提供する。 【解決手段】 核Ｉのスピンを励起する第１の９０°パ
ルスと核Ｓのスピンを励起する更なる９０°パルスある
いは核Ｉのスピンに作用する第２の９０°パルスのいず
れかとの間の期間Ｔの間に核Ｓのスピンに作用する反転
パルスがなく、そして、前記期間Ｔの長さは、 （式中、Ｒ_cは、核Ｉの横相関緩和速度であり、Ｒ_Iは、
核Ｉの全横緩和速度であり、そしてＪ_ISは、核Ｉ及びＳ
間のスカラー結合定数である）が、最小と成るように選
択される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、大きな分子、特
に、互いに結合した少なくとも２種類のスピン１／２核
Ｉ及びＳを含んで成る溶液中の生物学的巨大分子のスピ
ン系の核磁気共鳴（ＮＭＲ）実験において分極移動を行
う方法であって、前記スピン系には、均質な磁場Ｂ₀が
かけられ、核Ｉのスピンを励起する第１の９０°パルス
と、遅延時間の後に核Ｓのスピンを励起する更なる９０
°パルスとを含んで成るラジオ周波数（ｒｆ）パルス系
列が照射される方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】このような方法は、モリス及びフリーマ
ンによって、スピン−スピン結合を介した磁化移動を記
述した、J. Am. Chem. Soc.101, (1979) p.760-762中で
発表されたＩＮＥＰＴ型実験において用いられている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】今日では、ＩＮＥＰＴ
系列が、大きな生物学的巨大分子の研究のために、異核
ＮＭＲ実験の移動要素として広く用いられている。しか
し、分子量が１００，０００を超える場合、移動時間が
制限要因となり、ＩＮＥＰＴ系列は良好な結果を生み出
すことができないであろう。

【０００４】したがって、本発明の目的は、ＩＮＥＰＴ
法を改良し、１００，０００をはるかに超える分子量を
有する巨大分子を含む非常に多様な複合ＮＭＲ実験用の
「基礎的要素」として使用可能であり、従来技術の方法
と比較してより高い感度をもたらす新規な分極移動要素
を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明の目的は、前記ｒ
ｆパルス系列が、前記核Ｉのスピンを励起する前記第１
の９０°パルスと前記核Ｓのスピンを励起する前記更な
る９０°パルスあるいは前記核Ｉのスピンに作用する第
２の９０°パルスのいずれかとの間の期間Ｔの間に前記
核Ｓのスピンに作用する反転パルスがないように選択さ
れ、そして、前記期間Ｔの長さは、

【０００６】

【数２】

【０００７】（式中、Ｒ_cは、核Ｉの横相関緩和速度で
あり、Ｒ_Iは、核Ｉの全横緩和速度であり、そしてＪ_IS
は、核Ｉ及びＳ間のスカラー結合定数である）が、最小
と成るように選択されることにおいて達成される。

【０００８】かくして、スピン−スピン結合を介して磁
化を移動するＩＮＥＰＴ法の主要な特徴を、相関緩和誘
導分極移動の利点と組み合わせることができる。この組
み合わせは、主として前記期間Ｔ中の再結像及び反転パ
ルスの省略によって達成することができる．このこと
は、一見驚くべきことである。なぜならば、期間Ｔ中に
は、磁化成分は、分散し、したがって大きく減衰するの
で、いずれにせよｒｆパルス系列をかけた後の磁化の検
出のためにはこれらのパルスは必要であるというのが通
常の観念だからである。しかし、本発明のｒｆパルス系
列は上述の信号の損失を埋め合わせるにとどまらないの
で、再結像機構を省略したにもかかわらず、依然として
十分な磁化があるようであり、それゆえ、本発明の方法
は、いずれにせよ大きな分子に有効であることが判明し
た。

【０００９】本発明の方法の好ましい態様においては、
磁場勾配Ｇ₁が前記期間Ｔ内にかけられ、アーティファ
クトの除去を可能にする。

【００１０】本発明の別の好ましい態様においては、核
Ｉに作用する１８０°パルスが前記期間Ｔの中ほどで照
射され、かくして化学シフトによる磁化を再結像させ相
関弛緩による磁化移動のみを選択する。

【００１１】この態様の改善された方法では、磁場勾配
Ｇ₁が前記１８０°パルスの前に期間Ｔ／２内にかけら
れ、別の磁場勾配Ｇ₁が前記１８０°パルスの後に、期
間Ｔ／２内にかけられ、それによりアーティファクトが
効率的に除去される。

【００１２】一量子コヒーレンスを得るために、本発明
の方法の別の態様においては、核Ｓのスピンを励起する
前記更なる９０°パルスが、核Ｉのスピンに作用する前
記第２の９０°パルスと同時に照射される。

【００１３】あるいは、本発明の方法は、核Ｓのスピン
を励起する前記更なる９０°パルスが遅延時間の後に核
Ｉのスピンに作用する前記第２の９０°パルスに続くよ
うに行うことができる。

【００１４】この態様の改善された方法においては、核
Ｉのスピンに作用する前記第２の９０°パルスと核Ｓの
スピンを励起する前記更なる９０°パルスとの間の前記
遅延時間内に磁場勾配Ｇ₂がかけられる。これにより、
系列の終わりで実験において無用である磁化成分が除去
される。

【００１５】本発明の方法の別の代替となる態様におい
ては、核Ｓのスピンを励起する前記更なる９０°パルス
が、核Ｉのスピンを励起する前記第１の９０°パルスに
続く前記期間Ｔの後に照射され、そして核Ｉのスピンに
作用する前記第２の９０°パルスが省略され、かくして
ゼロ及び二量子コヒーレンスを得ることが可能になる。

【００１６】本発明の方法の別の好ましい態様は、前記
ｒｆパルス系列は、核Ｉのスピンを励起する前記第１の
９０°パルスに続く前記期間Ｔの後に核Ｓのスピンを励
起する前記更なる９０°パルスと同時に照射される核Ｉ
に作用する１８０°パルスを含んで成り、核Ｉのスピン
に作用する前記第２の９０°パルスが核Ｉに作用する前
記１８０°パルスに続く第２の期間Ｔの後に照射される
ことを特徴とする。これにより、化学シフトによる磁化
の展開を再結像させることが可能になる。

【００１７】この態様の改善された方法においては、磁
場勾配Ｇ₁が第１の前記期間Ｔ内にかけられ、もう１つ
の磁場勾配Ｇ₁が前記第２の期間Ｔ内にかけられ、それ
によってアーティファクトを除去する。

【００１８】好ましい態様においては、核Ｉのスピンを
励起する前記第１の９０°パルスの照射の前の実験の始
めにおいて、核Ｓのスピンに作用する９０°パルスが照
射され、引き続いて、核Ｓの初期磁化を損ずる磁場勾配
Ｇ₀がかけられる。かくして、Ｓ磁化の影響が、観察下
の系のにおけるスピンの更なる展開から除外される。

【００１９】前記ｒｆパルス系列が、溶媒のＮＭＲ信号
を抑制するのに適合した部分を含んで成る時、本発明の
方法にとって有利であり得る。

【００２０】また、前記ｒｆパルス系列が、均質な磁場
Ｂ₀に沿う溶媒の磁化を維持するのに適合した部分を含
んでなる時、有利であり得る。

【００２１】

【発明の実施の形態】溶液中の生物学的巨大分子の研究
のための通常の多次元ＮＭＲ実験において、スピン−ス
ピン結合を介した磁化移動（ＩＮＥＰＴ）は、パルス・
スキームの重要な要素である。１００，０００を超える
分子量の場合、移動期間中の横緩和は、制限要因となる
かもしれない。この発明は、ＣＲＩＮＥＰＴと呼ばれる
大きな分子に有効な新規な移動技術を提供するが、それ
は、相関緩和誘導分極移動の使用によりＩＮＥＴＰ移動
のサイズ制限を大きく除去するものである。相関緩和に
よる分極移動の速度は回転相関時間と逆比例する結果、
超高分子量の溶液ＮＭＲにとって高効率の移動機構にな
る。第１の実施形態としては、ＣＲＩＮＥＰＴ及びＴＲ
ＯＳＹの両方にとっての、¹⁵Ｎ−¹Ｈ部分の双極子−双
極子結合と化学シフト異方性との相関を利用する
［¹⁵Ｎ，¹Ｈ］相関実験が計画された。ＩＮＥＰＴベー
スの［¹⁵Ｎ，¹Ｈ］ＴＲＯＳＹと比較して、これらの新
規な実験では、約７０ｎｓの回転相関時間を有する、４
℃の水溶液中の１１０，０００ＭＷ（分子量）タンパク
質のアミド基の場合、３倍までの信号の改善が得られ
た。ＣＩＮＥＰＴは、例えば、ミセル又は脂質小胞に可
溶化された膜タンパク質、核酸断片に付着したタンパク
質、又はオリゴマータンパク質などの超分子構造の溶液
ＮＭＲにとって新しい道を開くものである。

【００２２】ＮＭＲによる溶液中のタンパク質の構造決
定（Weuthrich, 1986）は、今までのところ、約３０ｋ
Ｄａまでの範囲の分子量に制限されており(Clore & Gro
nenborn, 1997)、約６０ｋＤａまでの²Ｈ標識付けタン
パク質の主鎖帰属決定をもたらす実験が報告されている
（Shan et al, 1996）。より大きい分子種の場合、標準
的な実験技法（Bax & Grzesiek, 1993; Wider, 1998）
は、最適の同位体標識付けが用いられた時でさえ（LeMa
ster, 1994）も、横緩和により重大な感度喪失になる。

【００２３】状況は、異核ＮＭＲ実験における展開及び
観察期間中の横緩和を低減するＴＲＯＳＹ技法の導入に
より最近改善された（Pervushin et al., 1997; Salzma
nn et al., 1998）。例えば、タンパク質中の¹⁵Ｎ−¹Ｈ
部分の場合、¹⁵Ｎ展開及びアミドプロトン採取期間中の
横緩和のかなりの低減が、現在得られる最高の¹Ｈ周波
数で達成され得、ほぼ完全な解除が１ＧＨｚ（Pervushi
n et al., 1997）近傍の¹Ｈ周波数で予期される。ＴＲ
ＯＳＹは、既に、１００ｋＤａ（Salzmann et al., 199
8）を超える分子量を有するタンパク質の詳細なＮＭＲ
研究に適用されている。理論的検討によれば、異なる核
の間のスカラー結合を介したＩＮＥＰＴ型（Morris and
Freeman, 1979）磁化移動期間中の高速の横緩和のため
に、ＴＲＯＳＹは、やや大きいサイズでその限界に達す
るであろうことが示される。

【００２４】本発明は、非常に大きな分子に有効な新規
な移動技術、ＣＲＩＮＥＰＴ（Cross RelaxatIoN-Enhan
ced Polarization Transfer（相関向上分極移動））を
提示するが、ＣＲＩＮＥＰＴは、相関緩和（Goldman, 1
984; Wimperis & Bodenhausen, 1989; Boyld et al.,
1990; Breuschweiler & Ernst, 1991）とスカラー結合
に基づいている。分極移動のための相関緩和、即ちＣＲ
ＩＰＴ（Cross-correlated Relaxation-Induced Polari
zation Transfer（相関緩和誘導分極移動））、の性能
は、双極子−双極子結合（ＤＤ）による緩和及び化学シ
フト異方性（ＣＳＡ）による緩和との間に相関性を有す
る溶液中の非常に大きな粒子のための新規な実験用の具
体化例を用いて、¹⁵Ｎ−¹Ｈ部分について調べられた。
次に、¹⁵Ｎ展開及び¹Ｈ^N採取期間中にＴＲＯＳＹも利用
した［¹⁵Ｎ，¹Ｈ］相関実験におけるＣＲＩＮＥＰＴの
最初の実施形態を説明する。データセットは、約７０ｎ
ｓの有効な回転相関時間を用いた²Ｈ，¹⁵Ｎ−標識タン
パク質について記録された。

【００２５】理論的考察 ＤＤ及びＣＳＡ緩和間における相関による¹⁵Ｎ−¹Ｈ部
分における同相¹Ｈコヒーレンスの逆位相¹⁵Ｎコヒーレ
ンスへの移動（Goldman, 1984; Wimperis & Bodenhause
n, 1989; Breuschweiler & Ernst, 1991; Pervushin et
al., 1997）が考察される。プロダクト・オペレータ・
フォーマリズム（Sorensen et al., 1983）を用い、ス
ピン・オペレータＩは、¹Ｈに対応し、Ｓは、¹⁵Ｎに対
応し、そして二つのスピンはスカラー結合定数Ｊ_IS及び
共鳴周波数ω_I及びω_Sを有する。大きな分子サイズの場
合、高磁場では、ゼロ周波数におけるスペクトル密度関
数、Ｊ（０）、に比例する項のみが検討の必要がある
（Pervushin et al., 1997）。等方回転タンブリングの
場合、Ｊ（０）は２τ_c／５に等しい（式中、τ_cは分子
の異方回転相関時間である）。同相コヒーレンスの展開
は、相関緩和速度Ｒ_Cを介して逆位相コヒーレンスに結
合される。磁化移動期間Ｔの開始時におけるスピンＩへ
の同相磁化＜Ｉ_x＞（０）から始めて、期間Ｔ中のＣＲ
ＩＰＴにおける逆位相コヒーレンスの形成は、下記によ
り記述できる：

【００２６】

【数３】

【００２７】このとき、

【００２８】

【数４】

【００２９】そして

【００３０】

【数５】

【００３１】（式中、ｒ_ISは、関係のある二つの核間の
距離であり、Δσ_Iは、原子核ＩのスピンのＣＳＡテン
ソルであり、Ｂ₀は、静磁場であり、γ_I及びγ_Sは、Ｉ
及びＳの磁気回転比である。Ｔ_2I及びＴ_ISは、スピンＩ
の横緩和時間及びスピンＳの縦緩和時間を示す。) 可変回転相関時間τ_cでのＣＲＩＰＴ（式（１）〜
（３））又はＩＮＥＰＴ（Morris and Freeman, 1979）
を用いた分極移動の相対的効率は、図１（ａ）において
比較される。ＩＮＥＰＴにおける逆位相磁化の発生は、
下記の式により記述される：

【００３２】

【数６】

【００３３】式（１）において、移動時間Ｔは、常にτ
_cとの積の中に現れ、ＣＲＩＰＴ用の最適の移動時間
は、τ_cと逆比例している。したがって、Ｔを適切に調
節することにより、ＣＲＩＰＴにより移動可能な磁化の
最大量は分子サイズからは独立になる（図１（ａ））
が、この場合、約２０ｎｓより短いτ_c値の場合の最適
の時間Ｔが、法外に長いであろうということを考慮しな
ければならない。対照的に、ＩＮＥＰＴの効率は、サイ
ズの増大（式（４）、図１（ａ））とともに、急速に低
下する。

【００３４】十分に¹⁵Ｎ，²Ｈ標識付けされたタンパク
質（図１（ｂ））のβシート中に位置する¹⁵Ｎ−¹Ｈ部
分のＣＲＩＰＴの磁場依存性は、ＣＲＩＰＴを用いた最
大の理論的磁化移動が、ＩＮＥＰＴによる最大移動の約
半分であり、¹⁵Ｎ−¹Ｈ部分の最大ＣＲＩＰＴ移動が、
約1ＧＨｚで得られる（Pervushin et al., 1997; Weuth
rich, 1998; Salzmann et al., 1998）ということを示
す。図１（ａ）及び（ｂ）はさらに、ＣＲＩＰＴがτ_c
≧１００ｎｓを有する分子の場合、ＩＮＥＰＴより効率
的に成ること、しかし、ＩＮＥＰＴは、τ_c≒３００ｎ
ｓまでの分極移動にかなり効果があるということを示
す。

【００３５】図１（ａ）及び（ｂ）中のＣＲＩＰＴ及び
ＩＮＥＰＴの観察に基づいて、また、５０〜３００ｎｓ
の範囲のτ_c値を有する系に特に実用上の関心があるで
あろうということを考慮して、本発明者等は、ＣＲＩＮ
ＥＰＴにおいて２つの分極移動機構を組み合わせたが、
その際、プロトン逆位相コヒーレンスは、ラジオ周波数
パルスを欠いた遅延Ｔの間に発生させられ、その結果、
ＣＲＩＮＥＰＴ移動の場合の下記の項（５）及び（６）
と成る（Goldman, 1984の微分方程式（３２）から得ら
れる）：

【００３６】

【数７】

【００３７】

【数８】

【００３８】式（５）及び（６）は、それぞれ、得られ
た逆位相磁化のｘ成分及びｙ成分である。得られた全磁
化の相対的な向きは、したがって、τ_cと混合時間Ｔに
依存し、信号振幅Ａ_I（図１（ａ）参照）によって表さ
れるＣＲＩＮＥＰＴの移動効率は、全逆位相磁化の絶対
値に比例する。

【００３９】

【数９】

【００４０】式（７）により、ＩＮＥＰＴ及びＣＲＩＰ
Ｔの全分極移動への相対的貢献度を容易に評価すること
ができるが、式（５）及び（６）は、両項におけるスカ
ラー結合（三角関数）及びＣＲＩＰＴ（双曲線関数）を
介した分極移動の混合を含む。短いτ_cの場合、速度Ｒ_C
は、無視できるほど小さく、ＩＮＥＰＴのみがＣＲＩＮ
ＥＰＴに貢献するが、他方、長いτ_cの場合、Ｒ_Cは大き
くなり、ＣＲＩＰＴが主要な分極移動機構（式（３）及
び図１（ａ））である。原則として、ＣＲＩＮＥＴＰ
は、常に、ＩＮＥＰＴ又はＣＲＩＰＴより優れている
（図１（ａ））。しかし、ＣＲＩＮＥＰＴ移動中の遊離
プロトン化学シフトの展開は、別のパルス系列要素によ
り処理されねばならず、それにより全体の感度がやや低
下するかも知れない（下記参照）。

【００４１】ＣＲＩＰＴ、ＩＮＥＰＴ、及びＣＲＩＮＥ
ＰＴによる磁化移動の比較研究のためのパルス・スキー
ム 図２（ａ）〜（ｃ）中の３つの実験スキームは、先に検
討した３つの移動タイプによる¹Ｈ^N上の同相磁化から¹⁵
Ｎ上の逆位相磁化への単一の移動（図２（ａ）〜（ｃ）
中の矢印）の効率の測定に用いられた。各実験におい
て、¹⁵Ｎ逆位相コヒーレンスは、ｔ₁の期間中、周波数
標識付けされており、Ｉ及びＳへの前記２つの９０°パ
ルスを用いて¹Ｈ^N逆位相磁化と同一に移動される。すべ
ての測定において、水磁化は、全系列中、水選択的パル
スを用いてｚ軸に沿って維持される。

【００４２】ＣＲＩＰＴに用いられた新規なスキーム
（図２（ａ））においては、第１の９０°パルスにより
発生する同相¹Ｈ^N磁化が、式（１）にしたがって、相関
緩和により逆位相磁化に移動される。プロトン化学シフ
ト展開は、１８０°パルスにより再結像され、それが、
¹⁵Ｎからのプロトンのデカップリングも行う。期間Ｔの
終わりでは、Ｉ及びＳ上の９０°パルスは、逆位相コヒ
ーレンス２Ｉ_zＳ_yを発生させる。磁化フローは、略式表
記で、Ｉ_y→２Ｉ_yＳ_z→２Ｉ_zＳ_y（図２（ａ）参照）の
ように記述することができる。

【００４３】ＩＮＥＴＰスキーム（図２（ｂ））におい
ては、コヒーレンスのフローは、Ｉ _y→２Ｉ_xＳ_z→２Ｉ_z
Ｓ_yである。

【００４４】ＣＲＩＮＥＰＴ移動測定（図２（ｃ））に
おいては、期間Ｔ中の１８０°ラジオ周波数パルスの不
在により、相関緩和とスカラー結合とによる磁化移動が
得られる。さらに、期間Ｔ中に¹Ｈ化学シフト展開が発
生する。時点ａにおける結果としての逆位相コヒーレン
スは、密度マトリックス

【００４５】

【数１０】

【００４６】によって表現でき、式中、Ａ_1I及びＡ
_2Iは、式（５）及び（６）によって与えられる。ＣＲＩ
ＮＥＰＴ移動効率は、第２の９０°プロトン・パルス
（図２（ｃ））にそれぞれｘ又は−ｙ相を用いる２つの
実験により測定することができる。位相−ｙを用いて、
式（８）の第１項が検出され、位相−ｘを用い、第２項
が検出される。

【００４７】ＣＲＩＮＥＰＴ及びＴＲＯＳＹを用いた［
¹⁵Ｎ，¹Ｈ］相関実験 ＣＲＩＮＥＴＰの実際的な応用については、本発明者等
は、期間Ｔ中の勾配（図３（ａ））を用いたが、それ
は、式（８）を下記の式（９）に変える：

【００４８】

【数１１】

【００４９】前記勾配によるｚ軸に沿う位相のずれは、
Γ＝Ｇ₁γ_Hτｚ（式中、τは、パルス化された磁場勾配
の長さであり、Ｇ₁は、その強さ、及びｚは、ｚ軸に沿
う観察されたスピンの位置を表す）によって示される。
図２（ｃ）に示されるＣＲＩＮＥＰＴ移動要素の直接の
使用は、式（９）の成分の半分のみが回収可能であるた
め、感度が低減する結果となるであろう。さらに、図３
（ａ）の［¹⁵Ｎ，¹Ｈ］−ＣＲＩＮＥＰＴ−ＴＲＯＳＹ
実験で実証されたように、位相感受的な［¹⁵Ｎ，¹Ｈ］
相関実験を得るためには、再結像要素をパルス系列に導
入しなければならない。あるいはまた、第２の９０°プ
ロトン・パルス（図２（ｃ））を省略した場合、図３
（ｂ）の［¹⁵Ｎ，¹Ｈ］−ＣＲＩＮＥＰＴ−ＨＭＱＣ実
験で実証されたように、ゼロ及び二量子コヒーレンスが
発生し、式（９）の全ての項を移動、再結像させること
ができる。

【００５０】図３（ａ）は、充分に緩和補償されたＣＲ
ＩＮＥＴＰ相関実験を示す。下記の記述では、採取期間
中に検出可能な信号に至る磁化成分のみが保持されてい
る。第１の期間Ｔの後のパルス・スキームの時点ａにお
いては、磁化は式（９）によって記述される。その後の
パルスにより、式（９）の最初の項のみが¹⁵Ｎ上の横方
向磁化に移動され、それが次に、期間ｔ₁中に周波数標
識付けされ、時点ｂにおいて下記の項となる：

【００５１】

【数１２】

【００５２】時点ｂ及びｄ間のＣＲＩＮＥＰＴに基づく
系列成分は、第１のＣＲＩＮＥＰＴ成分の期間中のプロ
トン化学シフトの歳差運動と第１の勾配の効果を再結像
させ、¹⁵Ｎ上の最後の９０°パルスの直前に、式（１
０）の同相の項が下記のコヒーレンス：

【００５３】

【数１３】

【００５４】に移動される（式中、

【００５５】

【数１４】

【００５６】は、Ｉ_XＳ_Xの緩和を示す。Ａ_2S及びＡ
_1Sは、インデックスＩ及びＳの交換後、式（５）及び
（６）により、緩和速度Ｒ_I及びＲ_C（式（２）及び
（３））を用いて、算出される。最後に、位相Ψ₂＝ｘ
＋arctan（Ａ_2S／Ａ_1S）を有する¹⁵Ｎに最後の９０°パ
ルスをかけて、下記のプロトン逆位相コヒーレンスが発
生させられる（Ａ_Sは、式（７）により、インデックス
ＩをＳに置き換えて算出される）：

【００５７】

【数１５】

【００５８】式（１０）の逆位相項は、同相に変換され
る：

【００５９】

【数１６】

【００６０】（式中、

【００６１】

【数１７】

【００６２】は、図３（ａ）の再結像要素中の第１の期
間Ｔ中のＳ_zＩ_z状態の緩和による信号振幅の低減を表
す。）式（１２）及び（１３）中の同相及び逆位相の成
分は、反転相Ψ₂を有する２つのＦＩＤを記録すること
により分離される。

【００６３】図３（ｂ）の［¹⁵Ｎ、¹Ｈ］−ＣＲＩＮＥ
ＰＴ−ＨＭＱＣ実験においては、両方の移動要素がＣＲ
ＩＮＥＰＴ及び異なる位相に基づき、式（９）の移動方
法を用いて得られた化学シフト変調は、プロトンへの１
８０°パルス及び第２のＣＲＩＮＥＰＴ要素により最適
に再結像される。実験は、［¹⁵Ｎ、¹Ｈ］−ＨＭＱＣ（M
ueller, 1979）に基づいており、それは、¹⁵Ｎ展開期間
中のＴＲＯＳＹ補償を含まず、多量子状態期間中のＤＤ
緩和の欠如の恩恵を受ける。

【００６４】実験 ＮＭＲ実験は、スタヒロコッカス・アウレウスから得ら
れた７，８−ジヒドロネオプテリン・アルドラーゼを用
いて記録された。このタンパク質は、１２１個のアミノ
酸残基のサブユニットを有するホモ８量体である。本明
細書の実験の場合、それは、¹⁵Ｎを用いて均一に、そし
て²Ｈで７５％まで同位体標識付けされ、０．４ｍＭの
タンパク質濃度を用いてＨ₂Ｏ中４℃で調べられた。２
０℃での^{1 5}ＮのＴ₁及びＴ₂緩和測定（Kay et al., 198
9）に基づいて、本実験の条件下の回転相関時間τ_cは、
７０ｎｓであると推定された。全てのＮＭＲスペクトル
は、４つのラジオ周波数チャンネルとｚ方向に沿うシー
ルドされたパルス化磁場勾配を備えたBruker DRX-750ス
ペクトロメータ上で測定された。

【００６５】結果 ＣＲＩＰＴ、ＩＮＥＴＰ及びＣＲＩＮＥＰＴによる磁化
移動 ＣＲＩＮＥＰＴの使用のための基礎を与えるために、４
℃のＨ₂Ｏ溶液中の¹⁵Ｎ，²Ｈ標識付けされたＳ．アウレ
ウス・アルドラーゼを用いて、約７０ｎｓの有効回転相
関時間で、巨大分子系中で図２（ａ）〜（ｃ）の３つの
移動機構の各々につき、最適の移動時間Ｔを評価した。
移動効率は、可変移動時間Ｔで図２（ａ）〜（ｃ）中の
パルス系列を用いた連続実験から測定された。０〜１５
ｍｓのＣＲＩＰＴの場合の発生曲線は、高速の増大と、
それに続くプラトー及び指数関数的減衰を示し、それ
は、シミュレーション（図４）について得られた密切な
適合により実証されるように式（１）に対応する。最適
な移動減衰は、アルドラーゼの異なる¹⁵Ｎ−¹Ｈ基につ
いては、４〜１３ｍｓの観察範囲で、約６ｍｓである。

【００６６】ＣＲＩＰＴの場合に示される同じ¹⁵Ｎ−¹
Ｈ部分のＩＮＥＴＰ移動の場合は、最適の遅延は、約３
ｍｓ（図４）であり、緩和なしで得ることが可能であろ
う最大の移動の約５０％のみが達成される（図１（ａ）
及び４）。にもかかわらず、τ_c＝７０ｎｓで、現在調
べられた系の場合、観察されたＩＮＥＰＴ移動の最大値
は、最大のＣＲＩＰＴ移動を約１．５倍（図４）上回
る。

【００６７】ＣＲＩＮＥＴＰ（図４）を用いた実験及び
式（９）の測定された発生（build-up）への適合によ
り、式（９）の全てのコヒーレンスが、実験でさらに使
用可能であれば、ＣＲＩＮＥＰＴは、全ての相関時間に
対して、ＩＮＥＰＴ及びＣＲＩＰＴより優れているとい
う理論上の予測（図１（ａ））の正しさが確認された。
図４の系においては、ＣＩＮＥＰＴの最適な移動遅延
は、約４ｍｓであり、かくして前記２つの基礎的な実験
の最適Ｔ値の間にある。ＣＲＩＮＥＰＴ、ＩＮＥＴＰ及
びＣＲＩＰＴの場合の相対的最大移動は、約７．６：
５：３．４（図４）であり、それは、τ_c＝７０ｎｓ
（図１（ａ））のタンパク質の場合の理論値とよく符合
する。

【００６８】ＣＲＩＮＥＰＴ移動を用いた［¹⁵Ｎ，
¹Ｈ］相関実験 ［¹⁵Ｎ，¹Ｈ］−ＣＲＩＮＥＰＴ−ＴＲＯＳＹ実験（図
３（ａ））は、移動遅延及び発生期間中の横緩和最適化
を含む。図５に示されるピークの測定により、［¹⁵Ｎ，
¹Ｈ］−ＴＲＯＳＹと比較して、２倍の信号増大が得ら
れた。その他の高速緩和アルドラーゼ信号の場合は、
１．５と３との間のゲインが得られた。図３（ａ）の実
験スキームは、図５（式（１２）及び（１３））中の塗
りつぶした円により示される¹⁵Ｎ−¹Ｈ信号の２つの多
重線成分を選択するように設計されている。アルドラー
ゼについて得られたスペクトルにおいては、これらの２
つの成分のうちのより急速に緩和する方が、検出可能な
範囲を超えて広げられたほとんどの信号中にある（図５
（ａ）の中ほどのパネル）。両方の成分が、１つの高度
に柔軟な主鎖¹⁵Ｎ−¹Ｈ基とアルギニン側鎖のいくつか
についてのみ観察可能であった。

【００６９】［¹⁵Ｎ，¹Ｈ］−ＣＲＩＮＥＰＴ−ＨＭＱ
Ｃ実験（図３（ｂ））では、ＣＲＩＮＥＰＴ要素の間の
プロトン化学シフト展開による磁化の損失は全くない。
間接的な次元においてはＴＲＯＳＹ補償がないので、［
¹⁵Ｎ，¹Ｈ］−ＴＲＯＳＹ（図５）と比較して、¹⁵Ｎ−
線幅の約２倍の増大がある。同等の¹⁵Ｎ線幅を強制する
ために¹⁵Ｎ次元中に強力な複素（ガウス）窓関数を適用
した後に、信号対雑音比において、標準的な［¹⁵Ｎ，¹
Ｈ］−ＴＲＯＳＹと比較して１．４倍の増大が測定され
た（図５）。採取中にデカップリングが適用されない
（図３（ｂ））ので、¹⁵Ｎ−¹Ｈ部分毎に２つの多重線
ピークが予期される。しかし、移動要素及びｔ₁展開中
の低磁場成分の高速緩和により、アルドラーゼ中のほと
んどの¹⁵Ｎ−¹Ｈ基について緩慢な緩和成分のみが検出
可能であった（図５（ｂ））。この［¹⁵Ｎ，¹Ｈ］相関
ピークは、４線信号の成分のいかなるもののピークとも
異なった位置にある、即ち、それは、ＴＲＯＳＹ成分を
基準にしてω₁（¹⁵Ｎ）に沿って約４５Ｈｚだけ高磁場
側にシフトしている（図１５）。

【００７０】検討 現在のところ、ほとんど全ての異核多次元ＮＭＲ実験
は、異なるスピン種間で磁化を移動するのにＩＮＥＰＴ
を用いている（Wider, 1998）が、ＩＮＥＰＴの効率
は、回転相関時間τ_cの増大とともに劣化する（図１
（ａ））。対照的に、ＣＲＩＰＴによる分極の移動は、
τ_cからは、独立である。さらに、アミド基類において
は、ＣＲＩＰＴの効率は、約１ＧＨｚプロトン周波数ま
で外部磁場の強さを増大させるに伴って高くなるが、Ｉ
ＮＥＰＴ移動の感度は、増大したＣＳＡ緩和のためにさ
らに劣化する。１１０ｋＤａのＳ．アウレウス・アルド
ラーゼを用いた本実験により、回転相関時間が約５０〜
３００ｎｓの分子の場合、ＩＮＥＰＴ及びＣＲＩＰＴの
両方が、アミド基類中の¹Ｈ及び¹⁵Ｎ間の分極移動をか
なり促進することを示して、図１（ａ）及び（ｂ）の理
論的考察が確認されたが、それがＣＲＩＮＥＰＴで利用
されている。

【００７１】図３（ａ）及び（ｂ）に示された２つのＣ
ＲＩＮＥＰＴベースの［¹⁵Ｎ，¹Ｈ］相関実験は、大き
な分子の多種多様なＮＭＲ実験のための基礎的要素とし
て使用可能であり、その実験には、単純な２次元実験
（Bodenhausen & Ruben, 1980;Ernst et al., 1987, We
uthrich, 1986）、連続した残余内主鎖帰属用の３重共
鳴実験（Montelione & Wagner, 1989; Ikura et al., 1
990; Bax & Grzesiek, 1993）、側鎖帰属用の実験（Bax
et al., 1990; Ikura et al., 1991; Grzesiek& Bax,
1992）、及び分子力学の研究のための実験（Kay et a
l., 1989; Peng &Wagner, 1992; Kay et al, 1992; Day
ie & Wagner, 1994）が含まれてよい。例えば、
［¹⁵Ｎ，¹Ｈ］−ＣＲＩＮＥＰＴ−ＴＲＯＳＹ実験（図
３（ａ））は、３重共鳴実験に用いてよく、［¹⁵Ｎ，¹
Ｈ］−ＣＲＩＮＥＰＴ−ＨＭＱＣ（図３（ｂ））は、３
Ｄ¹⁵Ｎ溶解［¹Ｈ，¹Ｈ］−ＮＯＥＳＹなどの短い¹⁵Ｎ展
開期間を用いる多次元実験における好ましい選択となり
得る。

【００７２】τ_c≧３００ｎｓを用いた系の場合は、Ｃ
ＲＩＰＴは、ＣＲＩＮＥＰＴとほとんど同じくらい感度
がよいことが予見される（図１（ａ））。ＣＲＩＰＴ
は、そのとき、最適移動時間Ｔがτ_cに逆比例するので
（式（１））、より小さい分子から発生する共鳴を除去
する「フィルタ」としても使用可能である。

【００７３】本発明は、ＤＤ結合及びＣＳＡ間の相関緩
和による磁化移動に焦点を当てているが、ＣＲＩＮＥＰ
Ｔ原理のより一般的な利用は、他の種類の相関緩和を含
んでいてよい。全般に、ＴＲＯＳＹと組み合わされたＣ
ＲＩＮＥＰＴは、ミセル又は脂質小胞に可溶化された膜
タンパク質、大きな核酸断片に付着したタンパク質、又
はオリゴマー・タンパク質などの、数百ｋＤａの分子量
のＮＭＲ研究のための新しい道を開くものである。

【００７４】参考文献 Abragam, A. ( l961 ) The Principles of Nuclear Mag
netism (Clarendon Press, Oxford). Bartels, C., Xia, T., Billeter, M., Guentert, P. &
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Acids (Wiley, New York). Wuethrich, K. (1998) Nature Struct. Biol., 5, 492-
95.

【００７５】

【発明の効果】以上説明したように、本発明のＣＲＩＮ
ＥＰＴ（相関向上分極移動）は、１００，０００をはる
かに超える分子量を有する巨大分子を含む非常に多様な
複合ＮＭＲ実験用の「基礎的要素」として使用可能であ
り、ＩＮＥＰＴ等の従来技術の方法と比較してより高感
度な新規な分極移動要素となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】同図（ａ）は、等方回転相関時間τ_cにより表
される分子サイズに対する７５０ＭＨｚプロトン周波数
でのＣＲＩＰＴ、ＩＮＥＰＴ及びＣＲＩＮＥＰＴ用の最
適移動遅延Ｔ（式（１）〜（７）参照）を用いた相対的
磁化移動効率を図示したものである。ＣＲＩＰＴグラフ
は、最適遅延時間Ｔが法外に長くなるであろうというこ
とを示すために小さいτ_c値が破線を用いて示されてい
る。同図（ｂ）は対応する¹Ｈ周波数で表される静磁場
Ｂ₀に対するＣＲＩＰＴを用いて得ることができる最大
分極移動を図示したものである。曲線は、充分に¹⁵Ｎ，
²Ｈ標識付けされたたんぱく質のβシート中に位置する
¹⁵Ｎ−¹Ｈ部分について式（１）〜（７）を用いて計算
された。下記のパラメータが同図（ａ）及び（ｂ）で使
用された（Salzmann et al., 1998）： ｒ_HN＝１．０
４Å，ΔσＨ＝１５ｐｐｍそしてΘ＝１０°。検討され
た遠隔プロトンは、それぞれ距離４．３、４．３及び
３．３Åの¹Ｈ^N（ｉ−１），¹Ｈ^N（ｉ＋１）及び¹Ｈ
^N（ｊ）である。これらは、¹⁵Ｎ，²Ｈ標識付けタンパク
質中のβシートにとって典型的な値であり、ｉは観察さ
れた残基であり、（ｉ−１）及び（ｉ＋１）が連続する
隣同士であり、ｊがβシートを横切る長い範囲の接触を
示す（Weuthrich, 1986）。

【図２】図２は、ＣＩＲＰＴ（同図（ａ））、ＩＮＥＰ
Ｔ（同図（ｂ））及びＣＲＩＮＥＰＴ（同図（ｃ））に
よる磁化移動の直接の比較のために用いられたパルス系
列を示す図である。各スキームにおいて、コヒーレンス
のフローは、灰色の曲線の矢印で示されている。狭いバ
ー及び広いバーは、非選択的９０°及び１８０°パルス
を示す。サイン−ベル（Sine-bell）の形は、水共鳴上
の選択的９０°パルスを表わし、それが系列全体のｚ軸
に沿う水磁化を維持している（Grzesiek &Bax, 199
3）。ＰＦＧという印のついた線上で、四角形は、ｚ軸
に沿ってかけられるパルス化された磁場勾配を示す。Ｓ
定常状態磁化は、Ｓへの９０°パルスと、それに続く第
１のプロトンパルスより前のパルス化された磁場勾配に
よって抑制された。同図（ｃ）においては、図示されて
いるように第２のプロトン・パルス上の位相ｘを有する
実験と位相−ｙを有する実験との２つの実験が記録され
た。関連する水フリップ・バック・パルスの位相も変更
された。

【図３】ＣＲＩＮＥＰＴに基づく分極移動を用いた［¹⁵
Ｎ，¹Ｈ］相関実験である。同図（ａ）は、充分に緩和
最適化された［¹⁵Ｎ，¹Ｈ］−ＣＲＩＮＥＰＴ−ＴＲＯ
ＳＹである。同図（ｂ）は、［¹⁵Ｎ，¹Ｈ］−ＣＲＩＮ
ＥＰＴ−ＨＭＱＣである。狭いバー及び広いバーは、プ
ロトン（¹Ｈ）又は窒素（¹⁵Ｎ）周波数でかけられた非
選択的９０°及び１８０°パルスを示す。¹Ｈの印がつ
いた線上のサイン−ベル（Sine-bell）の形は、系列全
体中のｚ軸に沿う水磁化を維持するための水共鳴への選
択的９０°パルスを示す（Grzesiek & Bax, 1993; Piot
to et al.,1992）。期間Ｔの最適の長さは、式（７）に
より設定され、典型的には、３ｍｓ及び５．４ｍｓの間
である。ＰＦＧの印がついた線上では、四角形は、z軸
に沿ってかけられたパルス化された磁場勾配の期間及び
強さを示す。同図（ａ）：Ｇ₀：４００μS，１５Ｇ／ｃ
ｍ； Ｇ₁：４００μｓ，１５Ｇ／ｃｍ。同図（ｂ）：
Ｇ₁：１０００μS，３０Ｇ／ｃｍ。両方の実験の位相
サイクルは、φ₁＝｛ｘ，−ｘ｝、Ψ₁＝｛ｘ，−ｘ｝で
ある。ほかの全てのラジオ周波数パルスは、異なる標識
付けがなされない場合、位相ｘでかけられた。同図
（ａ）においては、２つの自由誘導減衰（ＦＩＤ）が各
ｔ₁増分について、それぞれ、Ψ₂＝｛ｘ，ｘ｝及びΨ₂
＝｛−ｘ，−ｘ｝で、記録され、両次元において９０°
位相補正を用いて加算された。¹⁵Ｎ（ｔ₁）次元におけ
る直角離角検出は、位相Ψ₁に適用された状態−ＴＴＰ
Ｉ法（Marison et al., 1989）により達成された。水選
択的パルスは、ガウスの（複素）形状を有し、長さ１．
３ｍｓである。

【図４】７５０ＭＨｚで測定されたω₁(¹⁵Ｎ)＝１２
１．０ｐｐｍ，ω₂(¹Ｈ)＝１１．１ｐｐｍの¹⁵Ｎ，²Ｈ
標識付けされたＳ．アウレウス・アルドラーゼ（タンパ
ク質濃度０．４ｍＭ、溶媒Ｈ₂Ｏ、温度４℃）の良く分
解された¹⁵Ｎ−¹ＨクロスピークについてのＣＲＩＰ
Ｔ、ＩＮＥＰＴ及びＣＲＩＮＥＰＴの磁化移動の生成曲
線である。生成曲線は、可変Ｔ値で図２のパルス系列を
用いた連続的測定により得られた。ＣＲＩＮＥＰＴの場
合、それぞれ位相シフト−ｘ及びｙを有する２つのＦＩ
Ｄが、各増分ｔ₁（図２（ｃ））について測定された。
このようにして得られた２つのスペクトルは、期間ｔ₁
中のプロトン化学シフト発生に関してコサイン又はサイ
ン変調され、個別のクロス・ピークの絶対値強度を算出
するのに使用された（式（７））。ＣＲＩＰＴ、ＩＮＥ
ＰＴ及びＣＲＩＮＥＰＴ生成曲線は、式（１）、（４）
及び（７）をそれぞれ使用し、ＣＲＩＰＴには、Ｒ_C＝2
36 +/- 10s^-1 及びＲ_I＝172 +/- 13s^-1、ＩＮＥＰＴに
は、Ｒ_C＝254 +/- 18ｓ^-1、そしてＣＲＩＮＥＰＴに
は、Ｒ_C＝238 +/- 13ｓ^-1及びＲ_I＝153 +/- 13^-1を用い
て適合させられた。

【図５】［¹⁵Ｎ，¹Ｈ］−ＴＲＯＳＹ(Pervushin et a
l., 1998)、 ［¹⁵Ｎ，¹Ｈ］−ＣＲＩＮＥＰＴ−ＴＲＯ
ＳＹ（図３（ａ））及び［¹⁵Ｎ，¹Ｈ］−ＣＲＩＮＥＰ
Ｔ−ＨＭＱＣ（図３（b））の信号強度及び線形の比較
を示す図である。データは、Ｈ₂Ｏ中の、均一に¹⁵Ｎ，
７５％²Ｈ標識付けされたＳ．アウレウス・アルドラー
ゼを用いて温度４℃、７５０ＭＨｚ¹Ｈ周波数で記録さ
れ、Ｇｌｙ４３の主鎖アミド部分が示されている。フー
リエ変換前に、３つのデータセットは、全ての次元にお
いてコサイン窓関数を用いて乗算され、プログラムＰＲ
ＯＳＡ（Guenter et al., 1992）を用いて２５６＊２０
４８複合ポイントのサイズに変換された。総測定時間
は、各実験ごとに４時間であり、それぞれ、ｔ_1max＝５
０ｍｓ及びｔ_2max＝９８ｍｓ、Ｔ＝５．４ｍｓ、Ψ₂＝
｛ｘ，ｘ｝及び｛−ｘ，−ｘ｝であり、インタースキャ
ン遅延は、０．７ｓであった。最上部のパネルは、３つ
の実験によるピーク選択を示す。黒い丸で示されるよう
に、大きな分子の場合は、４成分信号のもっともゆっく
り緩和する成分のみがＴＲＯＳＹ（Pervushin et al.,
1997）で検出され、［¹⁵Ｎ，¹Ｈ］−ＣＲＩＮＥＰＴ−
ＴＲＯＳＹは、最も遅い緩和成分及び最も速い緩和成分
を選択し、［¹⁵Ｎ，¹Ｈ］−ＣＲＩＮＥＰＴ−ＨＭＱＣ
は、プロトン次元において、２重線を生み出した。最上
段から２段目のパネルは、主鎖¹⁵Ｎ−¹Ｈ基の１つの信
号を含むスペクトル領域の輪郭図を示す。図の下半分の
２段のパネルは、輪郭図に示されているピークを通るω
₂（¹Ｈ）及びω₁（¹⁵Ｎ）に沿う断面を示す。同図
（ｂ）には、２つのピークが示され、細い線は、他の２
つの実験について同一のデータ処理で得られた信号を示
し、太い線は、ＴＲＯＳＹに関して同じ線幅を得るため
に（テキスト参照）、フーリエ変換前に、¹⁵Ｎ次元にお
いて、強力な複素（ガウス）窓関数を用いて得られた結
果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 コンスタンティン ペルヒューシン スイス国 チューリッヒ 8057 ミルヒブ ッフシュトラーセ １ (72)発明者 クルト ビュートリッヒ スイス国 バリゼーリン 8304 フリーダ ーシュトシュトラーセ ７

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 大きな分子、特に、互いに結合した少な
   くとも２種類のスピン１／２核Ｉ及びＳを含んで成る溶
   液中の生物学的巨大分子のスピン系の核磁気共鳴（ＮＭ
   Ｒ）実験において分極移動を行う方法であって、前記ス
   ピン系には、均質な磁場Ｂ₀がかけられ、核Ｉのスピン
   を励起する第１の９０°パルスと、遅延時間の後に核Ｓ
   のスピンを励起する更なる９０°パルスとを含んで成る
   ラジオ周波数（ｒｆ）パルス系列が照射される方法にお
   いて、 前記ｒｆパルス系列が、前記核Ｉのスピンを励起する前
   記第１の９０°パルスと前記核Ｓのスピンを励起する前
   記更なる９０°パルスあるいは前記核Ｉのスピンに作用
   する第２の９０°パルスのいずれかとの間の期間Ｔの間
   に前記核Ｓのスピンに作用する反転パルスがないように
   選択され、そして、前記期間Ｔの長さは、 【数１】 （式中、Ｒ_cは、核Ｉの横相関緩和速度であり、Ｒ_Iは、
   核Ｉの全横緩和速度であり、そしてＪ_ISは、核Ｉ及びＳ
   間のスカラー結合定数である）が、Ｔに対して最大と成
   るように選択されることを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 磁場勾配Ｇ₁が前記期間Ｔ内にかけられ
   ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 核Ｉに作用する１８０°パルスが前記期
   間Ｔの中ほどで照射されることを特徴とする請求項１に
   記載の方法。
4. 【請求項４】 磁場勾配Ｇ₁が前記１８０°パルスの前
   に期間Ｔ／２内にかけられ、別の磁場勾配Ｇ₁が前記１
   ８０°パルスの後に、期間Ｔ／２内にかけられることを
   特徴とする請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 核Ｓのスピンを励起する前記更なる９０
   °パルスが、核Ｉのスピンに作用する前記第２の９０°
   パルスと同時に照射されることを特徴とする請求項１〜
   ４のいずれか１項に記載の方法。
6. 【請求項６】 核Ｓのスピンを励起する前記更なる９０
   °パルスが、遅延時間の後に核Ｉのスピンに作用する前
   記第２の９０°パルスに続くことを特徴とする請求項１
   〜４のいずれか１項に記載の方法。
7. 【請求項７】 核Ｉのスピンに作用する前記第２の９０
   °パルスと核Ｓのスピンを励起する前記更なる９０°パ
   ルスとの間の前記遅延時間内に磁場勾配Ｇ₂がかけられ
   ることを特徴とする請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 核Ｓのスピンを励起する前記更なる９０
   °パルスが、核Ｉのスピンを励起する前記第１の９０°
   パルスに続く前記期間Ｔの後に照射され、そして核Ｉの
   スピンに作用する前記第２の９０°パルスが省略される
   ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の
   方法。
9. 【請求項９】 前記ｒｆパルス系列は、核Ｉのスピンを
   励起する前記第１の９０°パルスに続く前記期間Ｔの後
   に核Ｓのスピンを励起する前記更なる９０°パルスと同
   時に照射される核Ｉに作用する１８０°パルスを含んで
   成り、核Ｉのスピンに作用する前記第２の９０°パルス
   が、核Ｉに作用する前記１８０°パルスに続く第２の期
   間Ｔの後に照射されることを特徴とする請求項１に記載
   の方法。
10. 【請求項１０】 磁場勾配Ｇ₁が第１の前記期間Ｔ内に
    かけられ、もう１つの磁場勾配Ｇ₁が前記第２の期間Ｔ
    内にかけられることを特徴とする請求項９に記載の方
    法。
11. 【請求項１１】 核Ｉのスピンを励起する前記第１の９
    ０°パルスの照射の前の実験の始めにおいて、核Ｓのス
    ピンに作用する９０°パルスが照射され、引き続いて、
    核Ｓの初期磁化を損ずる磁場勾配Ｇ₀がかけられること
    を特徴とする請求項１〜10のいずれか１項に記載の方
    法。
12. 【請求項１２】 前記ｒｆパルス系列が、均質な磁場Ｂ
    ₀に沿う溶媒の磁化を維持するのに適合した部分を含ん
    でなることを特徴とする請求項１〜11のいずれか１項に
    記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記ｒｆパルス系列が、溶媒のＮＭＲ
    信号を抑制するのに適合した部分を含んで成ることを特
    徴とする請求項１〜12のいずれか１項に記載の方法。