JP2000166545A - Bile salt-activated lipase - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、ウシ膵臓由来の胆
汁酸活性化リパーゼ（Bile salt-activated lipase; 以
下、ＢＡＬという）及びその製造法に関する。本発明
は、ウシ膵臓由来のＢＡＬを初めて見出し、その製造法
を確立したものである。したがって、ＢＡＬを食品に添
加しようとする場合に解決されなければならないＢＡＬ
素材及びその製造法を提供するものであり、このこと
は、ＢＡＬの機能的な有効利用という観点から意義が大
きい。TECHNICAL FIELD The present invention relates to bile salt-activated lipase (BAL) derived from bovine pancreas and a method for producing the same. The present invention has found for the first time a bovine pancreas-derived BAL, and has established a production method thereof. Therefore, BAL that must be resolved when trying to add BAL to food
The present invention provides a material and a method for producing the material, which is significant from the viewpoint of functionally and effectively using the BAL.
【０００２】[0002]
【従来の技術】ＢＡＬは、現在までのところ、主に、哺
乳類の乳中、及び哺乳類の膵臓に存在すること、及びこ
の酵素の精製が報告されている。乳では、ヒト (例え
ば、(Hernell,O., Europ. J. Clin. Invest., vol.5, p
p.267-272, 1975)) 、ゴリラ(Freudenberg,E., Experie
ntia, vol.15, p.317, 1966)、ネコ及びイヌ(Freed,L.
M.et al., Biochim. Biophys. Acta, vol.878, pp.209-
215, 1986)が、また、膵臓では、ヒト (例えば、(Rouda
ni,S. et al., Biochim. Biophys. Acta, vol.1264, p
p.141-150, 1995))が、その代表的なＢＡＬの起源であ
ることが報告されている。BACKGROUND OF THE INVENTION BAL has been reported to date mainly in mammalian milk and in the mammalian pancreas, and the purification of this enzyme. In milk, humans (e.g., (Hernell, O., Europ. J. Clin. Invest., Vol. 5, p.
p.267-272, 1975)), gorilla (Freudenberg, E., Experie
ntia, vol. 15, p. 317, 1966), cats and dogs (Freed, L.
M. et al., Biochim. Biophys. Acta, vol.878, pp.209-
215, 1986), but also in the pancreas in humans (e.g., (Rouda
ni, S. et al., Biochim. Biophys. Acta, vol. 1264, p.
p.141-150, 1995)) have been reported to be the representative sources of BAL.
【０００３】そして、牛乳に関してはＢＡＬが存在しな
いこと(Freudenberg,E., Experientia, vol.15, p.317,
1966)が知られており、ウシ膵臓に関しては、リゾホス
ホリパーゼが含まれていること(Kyger,E.M. et al., Bi
ochim. Biophys. Acta, vol.296, pp.94-104, 1973) 、
また、コレステロールエステラーゼが含まれていること
(Bosch,H. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.,
vol.164, pp.1302-1309, 1989)が報告されている。さら
に、これらの酵素の精製法、並びに酵素の性質、遺伝子
の構造も、あわせて報告されている。しかしながら、ウ
シ膵臓からＢＡＬのタンパク質が精製されたという報告
はなく、無論、ウシ膵臓由来のＢＡＬの酵素化学的な性
質も調べられていないのが現状であった。The absence of BAL in milk (Freudenberg, E., Experientia, vol. 15, p. 317,
1966), and that bovine pancreas contains lysophospholipase (Kyger, EM et al., Bi
ochim. Biophys. Acta, vol.296, pp.94-104, 1973),
It also contains cholesterol esterase
(Bosch, H. et al., Biochem. Biophys. Res.Commun.,
vol.164, pp.1302-1309, 1989). Further, methods for purifying these enzymes, properties of the enzymes, and gene structures have also been reported. However, there has been no report that BAL protein was purified from bovine pancreas, and, of course, the enzymatic properties of bovine pancreatic BAL have not been investigated.
【０００４】この理由としては、ヒト由来のＢＡＬのタ
ンパク質がリパーゼ活性と共に、コレステロールエステ
ラーゼ活性やリゾホスホリパーゼ活性を示すことが知ら
れていること、さらに、ウシ膵臓由来のコレステロール
エステラーゼの遺伝子がヒト乳由来のＢＡＬの遺伝子と
高い相同性を示すことが挙げられる。つまり、ウシ膵臓
由来のコレステロールエステラーゼがウシ由来のＢＡＬ
のタンパク質であるという推測(Wang,C.S. and Hartsuc
k,J.A., Biochim. Biophys. Acta, vol.1166,pp.1-19,
1993)がなされたため、それ以降、リパーゼ活性を指標
としてウシ膵臓由来のＢＡＬを精製するという試みがな
されていなかった。したがって、現在までにリパーゼ活
性を有するＢＡＬのタンパク質がウシ膵臓から分離精製
されたという報告はなく、勿論、ウシ膵臓由来のＢＡＬ
のタンパク質の酵素化学的な性質も調べられていなかっ
た。[0004] The reason for this is that it is known that human-derived BAL protein exhibits cholesterol esterase activity and lysophospholipase activity together with lipase activity. Furthermore, the gene for cholesterol esterase derived from bovine pancreas is derived from human milk. Shows high homology with the BAL gene. In other words, cholesterol esterase from bovine pancreas is replaced with bovine BAL
Speculation (Wang, CS and Hartsuc
k, JA, Biochim. Biophys. Acta, vol.1166, pp.1-19,
1993), no attempt has been made since then to purify BAL derived from bovine pancreas using lipase activity as an index. Therefore, there is no report that BAL protein having lipase activity has been separated and purified from bovine pancreas.
The enzymatic properties of the protein have not been investigated.
【０００５】一方、ヒト乳由来のＢＡＬの生理学的な役
割に関しては、これまでに多くの研究者によって研究さ
れてきている。新生児の内臓機能は、未だ成熟の域に達
していないため、新生児の摂取した脂肪の消化吸収に関
わる膵臓リパーゼの分泌量も、新生児においては低いも
のとなっている。そこで、ヒト乳中に存在するＢＡＬ
が、未熟な膵臓の機能を助け、新生児の脂肪の消化能力
を高めることによって新生児の正常な発育を保証してい
る、という説明がなされている (例えば、(Olivecrona,
T. and Hernell,O., Pediatr. Padol., pp.600-604, 19
76))。また、ヒト乳由来のＢＡＬのリパーゼ活性が新生
児の脂質代謝に適した性質をもっていることが明らかに
なっている。例えば、新生児がヒト乳を摂取した際に
は、ヒト乳由来のＢＡＬはリパーゼ活性を発現しない。
しかし、ヒト乳と共に摂取したヒト乳由来のＢＡＬが新
生児の十二指腸に到達し、そこで胆嚢から十二指腸中へ
分泌された胆汁酸に接触することによりリパーゼ活性が
発現する。しかも、リパーゼ活性を発現するために必要
とされる胆汁酸濃度は１〜3 mMであることが報告されて
おり、新生児の十二指腸内の胆汁酸濃度は３〜５mM程度
で幼児や成人 (10mM程度) に比べると低いものの、ヒト
乳由来のＢＡＬのリパーゼ活性を発現させるのに充分で
あることが報告されている (例えば、(Harries,J.T., A
cta Paediatr. Scand. Suppl., vol.299, pp.17-23, 19
82))。[0005] On the other hand, the physiological role of BAL derived from human milk has been studied by many researchers. Since the visceral function of a newborn has not yet reached the stage of maturity, the amount of pancreatic lipase involved in the digestion and absorption of fat consumed by the newborn is also low in the newborn. Therefore, BAL present in human milk
Have been described as helping the immature pancreas to function and increasing the ability of newborns to digest fat by ensuring the normal development of newborns (e.g., (Olivecrona,
T. and Hernell, O., Pediatr. Padol., Pp. 600-604, 19
76)). In addition, it has been revealed that the lipase activity of BAL derived from human milk has properties suitable for lipid metabolism in neonates. For example, when a newborn ingests human milk, BAL derived from human milk does not express lipase activity.
However, BAL derived from human milk taken together with human milk reaches the duodenum of the newborn, where it contacts the bile acid secreted from the gallbladder into the duodenum, where lipase activity is expressed. In addition, it has been reported that the bile acid concentration required to express lipase activity is 1 to 3 mM, and the bile acid concentration in the duodenum of a newborn is about 3 to 5 mM. ) Has been reported to be sufficient to express the lipase activity of human milk-derived BAL (eg, (Harries, JT, A
cta Paediatr. Scand. Suppl., vol.299, pp.17-23, 19
82)).
【０００６】以上のように、ヒト乳由来のＢＡＬは、新
生児の脂質代謝に寄与して新生児の正常な発育を保証す
るという重要な役割を担うと考えられており、また、ヒ
ト乳由来のＢＡＬのリパーゼ活性も、新生児の脂質代謝
に適合するものとなっている。また、小猫を用いた実験
によると、ヒト乳由来のＢＡＬを摂取させた小猫は、摂
取させない小猫に比べて成長速度が速いことが報告され
ている(Wang,C.S. etal., Am. J. Clin. Nutr., vol.4
9, pp.457-463, 1989)。したがって、ＢＡＬは、ヒトの
みならず、他の哺乳動物においても、特に、それらの新
生児の生育に重要な役割を果たすことが明らかであり、
ＢＡＬ素材の供給が可能であれば、その利用範囲は大き
いものとなる。しかし、現在までのところ、ヒト乳中に
はＢＡＬが多量に存在するものの、その他の工業的に利
用可能な天然素材からＢＡＬを製造する方法は知られて
おらず、天然資源として工業的な規模で利用することが
できるウシ膵臓に関しては、上述のように、リパーゼ活
性において、ヒト乳由来のＢＡＬと同様の酵素化学的性
質を示すタンパク質の存在は知られておらず、勿論、そ
の製造法も確立されていない。As described above, BAL derived from human milk is considered to play an important role in contributing to lipid metabolism of newborns and ensuring normal growth of newborns. Lipase activity is also compatible with neonatal lipid metabolism. In addition, according to experiments using small cats, it has been reported that small cats that have taken BAL derived from human milk have a higher growth rate than small cats that have not taken BAL (Wang, CS et al., Am. J. Clin. Nutr., Vol.4
9, pp. 457-463, 1989). Therefore, it is clear that BAL plays an important role not only in humans but also in other mammals, especially in the growth of their newborns,
If the supply of BAL material is possible, its use range will be large. However, to date, although BAL is present in large amounts in human milk, there is no known method for producing BAL from other industrially available natural materials, and industrial scale as a natural resource is not available. As for the bovine pancreas which can be used in the above, the existence of a protein exhibiting the same enzymatic chemical properties as human milk-derived BAL in lipase activity is not known as described above. Not established.
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ウシ膵
臓中にリパーゼ活性を示す酵素が存在することを明らか
にし、また、リパーゼ活性において、ウシ膵臓由来の酵
素がヒト乳由来のＢＡＬと同様な酵素化学的性質を示す
かどうか明らかにするために鋭意、研究を進めてきた。
本発明は、このような天然資源として工業的な規模で利
用することのできるウシ膵臓からＢＡＬを得ることを課
題とする。また、本発明は、ウシ膵臓由来のＢＡＬの酵
素化学的性質を明らかにすることを課題とする。さら
に、本発明は、このようなウシ膵臓由来のＢＡＬを工業
的な規模で製造する方法を提供することを課題とする。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present inventors have clarified that an enzyme exhibiting lipase activity exists in bovine pancreas, and the enzyme derived from bovine pancreas is different from BAL derived from human milk in lipase activity. We have been working diligently to find out if they show similar enzymatic chemistry.
An object of the present invention is to obtain BAL from bovine pancreas which can be used on an industrial scale as such a natural resource. Another object of the present invention is to clarify the enzymatic chemical properties of BAL derived from bovine pancreas. Another object of the present invention is to provide a method for producing such bovine pancreas-derived BAL on an industrial scale.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、次
の性質を示すウシ膵臓由来の胆汁酸活性リパーゼ（Bile
salt-activated lipase; ＢＡＬ) である。 1) 分子量約 63,000(ドデシル硫酸ナトリウムポリアク
リルアミドゲル電気泳動法による) 2)a) トリオレインからオレイン酸を遊離させるリパー
ゼ活性を示す。この活性は、胆汁酸が存在しない場合に
は極端に弱く、1 mM以上のタウロコール酸ナトリウムの
存在により顕著に向上する。 b) パラニトロフェニル酢酸からパラニトロフェノール
を遊離させるエステラーゼ活性を示す。 3) フコース残基を含む糖タンパク質である。 4) 次のＮ末端アミノ酸配列を有する。 Ala-Lys-Leu-Gly-Ser-Val-Tyr-Thr-Glu-Gly-Gly-Phe-Va
l-Asn-Lys-Lys-Leu-Ser-Leu-Phe-Gly-AspThat is, the present invention provides a bile acid-active lipase derived from bovine pancreas (Bile
salt-activated lipase; BAL). 1) Molecular weight about 63,000 (by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 2) a) Lipase activity that releases oleic acid from triolein. This activity is extremely weak in the absence of bile acids, and is significantly improved by the presence of 1 mM or more of sodium taurocholate. b) Esterase activity to release paranitrophenol from paranitrophenylacetic acid. 3) A glycoprotein containing fucose residues. 4) has the following N-terminal amino acid sequence: Ala-Lys-Leu-Gly-Ser-Val-Tyr-Thr-Glu-Gly-Gly-Phe-Va
l-Asn-Lys-Lys-Leu-Ser-Leu-Phe-Gly-Asp
【０００９】また、本発明のウシ膵臓由来のＢＡＬは次
の方法で製造される。ウシ膵臓抽出液をヘパリンカラム
クロマトグラフィー処理してＢＡＬを吸着させた後、溶
出してＢＡＬを採取する。このＢＡＬは、さらに精製し
たウシ膵臓由来のＢＡＬと均等な酵素化学的性質を示
す。また本発明では、前記ヘパリンカラムクロマトグラ
フィーに続いて、陰イオン交換樹脂カラムクロマトグラ
フィー及びヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフ
ィーを順次行なってＢＡＬの吸着及び溶出をくり返して
ＢＡＬを精製し、採取する。本発明におけるウシ膵臓抽
出液は、ウシ膵臓をホモジナイズして得られるホモジネ
ートを酸処理した後、遠心処理して不溶物を除き、濃縮
することにより得ることができる。The bovine pancreas-derived BAL of the present invention is produced by the following method. The bovine pancreatic extract is subjected to heparin column chromatography to adsorb BAL, and then eluted to collect BAL. This BAL shows enzymatic properties equivalent to BAL derived from further purified bovine pancreas. Further, in the present invention, BAL is purified and collected by repeating adsorption and elution of BAL by sequentially performing anion exchange resin column chromatography and hydroxyapatite column chromatography subsequent to the heparin column chromatography. The bovine pancreas extract in the present invention can be obtained by subjecting a homogenate obtained by homogenizing bovine pancreas to acid treatment, followed by centrifugation to remove insolubles and concentration.
【００１０】[0010]
【発明の実施の形態】本発明のウシ膵臓から精製して得
られたウシ膵臓由来のＢＡＬが、これまでに知られてい
る他のＢＡＬと同様な性質を示すか否かに関する検討も
行った。ヒト乳からＢＡＬを精製し、得られたヒト乳由
来のＢＡＬの性質とウシ膵臓から精製されたＢＡＬの性
質を、リパーゼ活性及びエステラーゼ活性の両面から比
較検討した。その結果、本発明のウシ膵臓から精製され
た分子量が約63,000であるＢＡＬは、リパーゼ活性及び
エステラーゼ活性の両面において、ヒト乳由来のＢＡＬ
と同等な性質を示すことが明らかになった。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION It was also examined whether BAL derived from bovine pancreas obtained by purifying bovine pancreas of the present invention shows the same properties as other BALs known so far. . BAL was purified from human milk, and the properties of BAL derived from human milk and the properties of BAL purified from bovine pancreas were compared and examined from both aspects of lipase activity and esterase activity. As a result, the BAL purified from bovine pancreas of the present invention and having a molecular weight of about 63,000 was BAL derived from human milk in both lipase activity and esterase activity.
It became clear that it showed the property equivalent to.
【００１１】さらに、ウシ膵臓から精製されたＢＡＬの
Ｎ末端アミノ酸配列を分析したところ、既に報告されて
いるヒト乳由来のＢＡＬのＮ末端アミノ酸配列に極めて
高い相同性（88％）を示すことが明らかになった。ま
た、本発明でウシ膵臓から精製したＢＡＬのＮ末端アミ
ノ酸配列は、既に遺伝子の構造が明らかになっているウ
シ膵臓由来のコレステロールエステラーゼの遺伝子から
予想されるＮ末端アミノ酸配列と完全に一致することも
明らかになった。Furthermore, analysis of the N-terminal amino acid sequence of BAL purified from bovine pancreas revealed that it showed extremely high homology (88%) to the previously reported N-terminal amino acid sequence of human milk-derived BAL. It was revealed. In addition, the N-terminal amino acid sequence of BAL purified from bovine pancreas according to the present invention completely matches the N-terminal amino acid sequence predicted from the bovine pancreatic cholesterol esterase gene whose gene structure has already been elucidated. Also became apparent.
【００１２】以上、本発明によってウシ膵臓から精製さ
れた酵素タンパク質は、酵素化学的な性質の検討結果、
及び、酵素タンパク質の一次構造の分析結果からＢＡＬ
であることが証明された。As described above, the enzyme protein purified from bovine pancreas according to the present invention is characterized by its enzymatic properties.
And analysis of the primary structure of the enzyme protein from the BAL
It was proved that.
【００１３】次に、本発明におけるＢＡＬの製造法の概
要を説明する。ヒト乳由来のＢＡＬのタンパク質が酸性
域で耐性を示すことが報告されているので、ウシ膵臓由
来のＢＡＬの製造法に酸処理を取り入れた。次に酸処理
した粗酵素溶液を濃縮した後、ヘパリンカラムクロマト
グラフィーを実施し、さらに陰イオン交換樹脂クロマト
グラフィー及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ
ーを組み合わせることにより、ウシ膵臓由来のＢＡＬの
製造法を完成させた。Next, the outline of the method for producing BAL in the present invention will be described. Since it has been reported that BAL protein derived from human milk shows resistance in the acidic region, acid treatment was incorporated into the method for producing BAL derived from bovine pancreas. Next, after concentrating the acid-treated crude enzyme solution, heparin column chromatography was performed, and further, a method for producing bovine pancreas-derived BAL was completed by combining anion exchange resin chromatography and hydroxyapatite chromatography. .
【００１４】まず、ウシ膵臓を適宜ホモジナイズする。
ホモジナイザーは、どのような装置であっても使用可能
であるが、ウシ膵臓は脂肪に富む組織であるため、ホモ
ジナイズの強さと時間に注意する必要がある。過度のホ
モジナイズは脂肪の可溶化を促進することがある。ま
た、ホモジナイズ時に用いる緩衝液についても、中性域
で緩衝能のあるものであればいずれも使用できる。次
に、遠心分離によりホモジネートを分離する。遠心分離
の条件は、 5,000×g から10,000×g の遠心力で５〜30
分行えば良い。得られたホモジネートに6N程度の酢酸や
塩酸等の酸を滴下し、ホモジネートのpHを 4.5〜5.0 に
調整する。この酸処理によって析出した不溶物を遠心処
理で除去し、透明なウシ膵臓抽出液を得る。遠心分離の
条件は、 5,000×g から10,000×g の遠心力で５〜30分
行えば良い。First, the bovine pancreas is appropriately homogenized.
The homogenizer can be used with any device, but since the bovine pancreas is a tissue rich in fat, it is necessary to pay attention to the intensity and time of homogenization. Excessive homogenization can promote fat solubilization. As the buffer used for homogenization, any buffer having a buffering capacity in a neutral region can be used. Next, the homogenate is separated by centrifugation. The conditions for centrifugation are 5 to 30 at a centrifugal force of 5,000 xg to 10,000 xg.
You just have to go. About 6N of an acid such as acetic acid or hydrochloric acid is dropped into the obtained homogenate, and the pH of the homogenate is adjusted to 4.5 to 5.0. The insolubles precipitated by the acid treatment are removed by centrifugation to obtain a clear bovine pancreas extract. The conditions for centrifugation may be performed at a centrifugal force of 5,000 × g to 10,000 × g for 5 to 30 minutes.
【００１５】次に、このウシ膵臓抽出液を濃縮する。濃
縮方法は、硫酸アンモニウムを用いる方法か、限外濾過
膜を用いる方法のいずれかを選択できる。例えば、硫酸
アンモニウムを用いる方法では、抽出液に硫酸アンモニ
ウムを加えて飽和濃度とし、30分から一夜放置した後、
遠心分離によって沈澱物を回収する。得られた沈澱物を
適当な緩衝液で再溶解し、その後、透析操作によって混
在する硫酸アンモニウムを除去することができる。Next, the bovine pancreas extract is concentrated. As the concentration method, either a method using ammonium sulfate or a method using an ultrafiltration membrane can be selected. For example, in the method using ammonium sulfate, ammonium sulfate is added to the extract to a saturation concentration, and after 30 minutes to overnight,
Collect the precipitate by centrifugation. The resulting precipitate is redissolved in a suitable buffer, and then the ammonium sulfate contaminated can be removed by dialysis.
【００１６】次に、濃縮したウシ膵臓抽出液を連続的
で、かつ効果的なクロマトグラフィーの組み合わせ操作
により、ウシ膵臓由来のＢＡＬを精製する。最初のクロ
マトグラフィーには、ヘパリンカラムを用いる。濃縮し
たウシ膵臓抽出液をヘパリンカラムに添加し、ＢＡＬを
カラムに吸着させる。緩衝液は、中性域で緩衝能のある
ものであれば、いずれの緩衝液でも使用可能であるが、
中でも0.1M程度のリン酸緩衝液(pH 7.0)が適する。ヘパ
リンカラムに吸着したウシ膵臓由来のＢＡＬは、0.5M塩
化ナトリウムを含む緩衝液によってカラムから溶出する
ことができる。次のクロマトグラフィーには、Mono Qカ
ラム（ファルマシア社製）等の陰イオン交換樹脂クロマ
トグラフィーを用いる。中性域における陰イオン交換樹
脂クロマトグラフィーにおいても、ウシ膵臓由来のＢＡ
Ｌはカラムに吸着され、塩化ナトリウムを含む緩衝液を
用いることによって溶出することができる。実際、ＢＡ
Ｌは、 0.1〜0.2Mの塩化ナトリウム濃度によりカラムか
ら溶出させることができた。Next, the concentrated bovine pancreas extract is purified by continuous and effective chromatographic combination operation to purify BAL derived from bovine pancreas. The first chromatography uses a heparin column. The concentrated bovine pancreatic extract is added to a heparin column, and BAL is adsorbed to the column. Any buffer can be used as long as it has a buffering capacity in the neutral region.
Among them, a phosphate buffer of about 0.1 M (pH 7.0) is suitable. BAL from bovine pancreas adsorbed to the heparin column can be eluted from the column by a buffer containing 0.5 M sodium chloride. For the next chromatography, an anion exchange resin chromatography such as a Mono Q column (manufactured by Pharmacia) is used. Bovine pancreatic BA was also detected in anion exchange resin chromatography in the neutral region.
L is adsorbed on the column and can be eluted by using a buffer containing sodium chloride. In fact, BA
L could be eluted from the column with a sodium chloride concentration of 0.1-0.2M.
【００１７】精製の最終段階は、ヒドロキシアパタイト
カラムを用いてクロマトグラフィーを行う。陰イオン交
換樹脂クロマトグラフィーにより得られた粗精製物をヒ
ドロキシアパタイトカラムに添加し、ＢＡＬをカラムに
吸着させた。次に、リン酸緩衝液の濃度を変えることに
より、ＢＡＬをヒドロキシアパタイトカラムから特異的
に溶出させた。本発明の場合、ウシ膵臓由来のＢＡＬは
0.2〜0.3M濃度のリン酸緩衝液によりカラムから溶出さ
せることが可能であった。この濃度は、使用するヒドロ
キシアパタイトカラムにより変化することが予想される
が、ウシ膵臓由来のＢＡＬは、ある濃度のリン酸緩衝液
によってヒドロキシアパタイトカラムから溶出される。
以上の精製過程を経ることによって、ウシ膵臓からウシ
膵臓由来のＢＡＬを、ほぼ純粋な形で製造することがで
きる。In the final stage of purification, chromatography is performed using a hydroxyapatite column. The crude product obtained by anion exchange resin chromatography was added to a hydroxyapatite column, and BAL was adsorbed to the column. Next, BAL was specifically eluted from the hydroxyapatite column by changing the concentration of the phosphate buffer. In the case of the present invention, BAL from bovine pancreas is
It was possible to elute from the column with a phosphate buffer at a concentration of 0.2-0.3M. This concentration is expected to vary depending on the hydroxyapatite column used, but BAL from bovine pancreas is eluted from the hydroxyapatite column by a certain concentration of phosphate buffer.
Through the above purification process, bovine pancreas-derived BAL can be produced in almost pure form from bovine pancreas.
【００１８】次に、本発明で精製されたウシ膵臓由来の
ＢＡＬの性質に関する概要を示す。本発明で精製したウ
シ膵臓由来のＢＡＬは、トリオレインからオレイン酸を
遊離させる活性、すなわちリパーゼ活性を有している。
反応液に胆汁酸が存在しない場合には、ウシ膵臓由来の
ＢＡＬは、微少なリパーゼ活性を示した。一方、反応液
に１mM以上の胆汁酸が存在した場合には、ウシ膵臓由来
のＢＡＬのリパーゼ活性は、最大で約40倍、活性化され
た。この性質をヒト乳由来のＢＡＬと比較すると、ヒト
乳由来のＢＡＬは、胆汁酸が存在しない場合にはリパー
ゼ活性を発現せず、２mM以上の胆汁酸の存在によってリ
パーゼ活性が誘導された。次に、ウシ膵臓由来のＢＡＬ
のエステラーゼ活性を測定した。エステラーゼ活性は、
リパーゼ活性とは異なり、胆汁酸が存在しない場合にも
活性を示した。また、胆汁酸の添加により、ウシ膵臓由
来のＢＡＬのエステラーゼ活性は、さらに上昇した。な
お、ヒト乳由来のＢＡＬに関しても同様に検討を行った
結果、ウシ膵臓由来のＢＡＬと同様な性質が観察され
た。以上、本発明で精製された酵素タンパク質とヒト乳
由来のＢＡＬの諸性質に関する検討結果より、本発明で
精製された酵素タンパク質が、正にＢＡＬであることを
確認することができた。Next, the outline of the properties of BAL derived from bovine pancreas purified by the present invention will be described. BAL derived from bovine pancreas purified in the present invention has an activity of releasing oleic acid from triolein, that is, a lipase activity.
In the absence of bile acid in the reaction, BAL from bovine pancreas showed minimal lipase activity. On the other hand, when 1 mM or more bile acids were present in the reaction solution, the lipase activity of bovine pancreatic BAL was activated up to about 40 times. When this property was compared with BAL derived from human milk, BAL derived from human milk did not express lipase activity in the absence of bile acid, and lipase activity was induced by the presence of 2 mM or more bile acid. Next, BAL derived from bovine pancreas
Was measured for esterase activity. Esterase activity is
Unlike lipase activity, it also showed activity in the absence of bile acids. Further, the addition of bile acids further increased the esterase activity of bovine pancreas-derived BAL. In addition, as a result of conducting a similar study on BAL derived from human milk, properties similar to BAL derived from bovine pancreas were observed. As described above, from the examination results on the properties of the enzyme protein purified by the present invention and BAL derived from human milk, it was confirmed that the enzyme protein purified by the present invention was BAL.
【００１９】また、精製の各段階で得られた試料の酵素
化学的な性質を検討した結果、ヘパリンカラムクロマト
グラフィーを終了した段階の粗精製物が、精製されたウ
シ膵臓由来のＢＡＬに均等な性質を示すことが明らかに
なった。ヘパリンカラムクロマトグラフィーを終了した
段階の粗精製物は、ＢＡＬ以外のタンパク質を含んでい
るが、これらの混在するタンパク質は、ウシ膵臓由来の
ＢＡＬの酵素化学的な性質に影響を及ぼさないことが明
らかになった。また、ウシ膵臓抽出液中に存在する膵臓
リパーセ活性は、ヘパリンカラムクロマトグラフィーに
よってＢＡＬ活性と分離されることも、合わせて確認さ
れた。したがって、ウシ膵臓由来のＢＡＬを工業的に利
用して行く場合、精製物を使用するのも一つの方法であ
るが、さらに粗精製物が使用できる可能性があること
も、本発明によって示すことができた。In addition, as a result of examining the enzymatic properties of the samples obtained at each stage of the purification, the crude product at the stage where heparin column chromatography was completed was found to be equivalent to the purified BAL derived from bovine pancreas. It has been found to exhibit properties. The crude product at the stage of completion of heparin column chromatography contains proteins other than BAL, but it is clear that these mixed proteins do not affect the enzymatic properties of BAL derived from bovine pancreas. Became. It was also confirmed that the pancreatic lipase activity present in the bovine pancreatic extract was separated from the BAL activity by heparin column chromatography. Therefore, when using BAL derived from bovine pancreas industrially, it is one method to use a purified product, but it is also shown by the present invention that there is a possibility that a crude product can be further used. Was completed.
【００２０】それでは以下に実施例を示し、本発明をさ
らに詳しく説明する。酵素活性の測定 本発明では、リパーゼ活性とエステラーゼ活性を、以下
の方法に従って測定した。リパーゼ活性、すなわちトリ
アシルグリセリドから脂肪酸を遊離させる活性は、乳化
させたトリオレインを基質とし、トリオレインから遊離
したオレイン酸を比色法によって測定し、リパーゼ活性
の指標とした。2.5 mlのトリオレインを7.5 mlのポリビ
ニルアルコール(2％溶液) に混合し、ポリトロンホモジ
ナイザーを用いて氷冷しながら５分間、乳化させた。次
に、この基質を用いてリパーゼ反応溶液を調製した。基
質0.2 mlに、0.1 mlの0.2Mリン酸緩衝液(pH 7.5)を加
え、さらに0.08mlのタウロコール酸ナトリウム溶液を加
えた。次に0.2 mlの試料を加えてリパーゼ反応を開始さ
せ、37℃で10分間、又は30分間、反応溶液を振とうさせ
ながら反応させた。反応開始させてから10分後、又は30
分後に、反応溶液に５mlのクロロホルム・メタノール溶
液(2：1)を加えてリパーゼ反応を停止させ、停止後の溶
液0.025 mlを試験管に採取した。試験管を50℃で加温す
ることによりクロロホルム・メタノール溶液を蒸発さ
せ、残渣を0.025 mlの0.2 ％トリトンX-100 溶液で再溶
解させた。次に遊離脂肪酸定量キット（和光純薬社製、
NEFA Cテストワコー）を用いて、トリオレインから遊離
したオレイン酸量を定量した。最終的に、反応開始後10
〜30分の間に遊離したオレイン酸量を算出し、リパーゼ
活性の指標とした。なお、酵素活性は、上記の反応条件
において、１分間に１μ当量のオレイン酸を遊離させる
のに必要な酵素量を１単位と定義した。Now, the present invention will be described in further detail with reference to Examples. Measurement of enzyme activity In the present invention, lipase activity and esterase activity were measured according to the following methods. The lipase activity, that is, the activity of releasing fatty acids from triacylglyceride, was measured using an emulsified triolein as a substrate and oleic acid released from triolein by a colorimetric method, and used as an index of lipase activity. 2.5 ml of triolein was mixed with 7.5 ml of polyvinyl alcohol (2% solution) and emulsified for 5 minutes while cooling with ice using a Polytron homogenizer. Next, a lipase reaction solution was prepared using this substrate. To 0.2 ml of the substrate, 0.1 ml of a 0.2 M phosphate buffer (pH 7.5) was added, and further 0.08 ml of a sodium taurocholate solution was added. Next, a lipase reaction was started by adding 0.2 ml of the sample, and reacted at 37 ° C. for 10 minutes or 30 minutes while shaking the reaction solution. 10 minutes after starting the reaction, or 30 minutes
After one minute, 5 ml of a chloroform / methanol solution (2: 1) was added to the reaction solution to stop the lipase reaction, and 0.025 ml of the solution after the stop was collected in a test tube. The chloroform / methanol solution was evaporated by heating the test tube at 50 ° C., and the residue was redissolved in 0.025 ml of 0.2% Triton X-100 solution. Next, a free fatty acid determination kit (Wako Pure Chemical Industries,
NEFA C Test Wako) was used to quantify the amount of oleic acid released from triolein. Finally, 10 minutes after the start of the reaction
The amount of oleic acid released during 〜30 minutes was calculated and used as an index of lipase activity. The enzyme activity was defined as the amount of enzyme required to release 1 μ equivalent of oleic acid per minute under the above reaction conditions as one unit.
【００２１】エステラーゼ活性の測定には、水溶性の基
質であるパラニトロフェニル酢酸を用いた。0.1Mのパラ
ニトロフェニル酢酸をアセトニトリルに溶解し、使用時
に水で10倍希釈して、最終濃度が0.01 Mの溶液を基質と
して使用した。1.0 mlの0.2Mリン酸緩衝液(pH 7.5)に0.
2 mlの基質溶液を加え、さらに0.79mlのタウロコール酸
ナトリウム溶液を加えた。次に、0.05mlの試料を加えて
反応を開始させ、25℃で数分間、反応させた。反応を開
始して１分、２分、３分、４分、５分、６分後の吸光度
（Ａ418)を測定し、パラニトロフェニル酢酸から遊離し
たパラニトロフェノール量を測定し、エステラーゼ活性
の指標とした。酵素活性は、上記の反応条件において、
１分間に１μモルのパラニトロフェノールを遊離させる
のに必要な酵素量を１単位と定義した。For measuring the esterase activity, paranitrophenylacetic acid, which is a water-soluble substrate, was used. 0.1 M paranitrophenylacetic acid was dissolved in acetonitrile, diluted 10-fold with water at the time of use, and a solution having a final concentration of 0.01 M was used as a substrate. Add 1.0 ml of 0.2 M phosphate buffer (pH 7.5).
2 ml of the substrate solution was added, and a further 0.79 ml of sodium taurocholate solution was added. Next, 0.05 ml of the sample was added to start the reaction, and the reaction was performed at 25 ° C. for several minutes. After 1 minute, 2 minutes, 3 minutes, 4 minutes, 5 minutes, and 6 minutes after the start of the reaction, the absorbance (A 418 ) was measured, the amount of paranitrophenol released from paranitrophenylacetic acid was measured, and the esterase activity was measured. Index. Enzyme activity under the above reaction conditions,
The amount of enzyme required to release 1 μmol of paranitrophenol per minute was defined as one unit.
【００２２】[0022]
【実施例１】ウシ膵臓由来のＢＡＬの精製 540gのウシ膵臓を細切し、1 l の0.05 Mリン酸緩衝液(p
H 7.5)中でホモジナイズした。この時、緩衝液は0.5 mM
のPMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)、及び２mMの
ベンズアミジンを含んでいた。ホモジナイズはホモジナ
イザー（エース社製）を使用し、１分当たり10,000回転
の速度で２分間処理した。ホモジネートを10,000×g 、
10分間の条件で遠心処理し、上清を得た後、この上清に
1Nの酢酸を加えて溶液のpHを 5.0とした。次に、10,000
×g 、20分間の条件で、酸処理後の溶液を遠心分離し、
再び上清を得た。この上清に硫酸アンモニウムを加えて
飽和濃度とし、１時間静置させた後、10,000×g 、20分
間の条件で遠心分離し、沈澱を得た。沈澱を0.05 Mリン
酸緩衝液(pH 7.5)に溶解し、溶解した濃縮抽出液につい
ては、さらに0.05 Mリン酸緩衝液(pH 7.5)に対して透析
した。Example 1 Purification of BAL from Bovine Pancreas 540 g of bovine pancreas were minced and 1 l of 0.05 M phosphate buffer (p
H 7.5). At this time, the buffer was 0.5 mM
PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) and 2 mM benzamidine. Homogenization was performed using a homogenizer (manufactured by ACE) at a speed of 10,000 revolutions per minute for 2 minutes. 10,000 xg of homogenate,
After centrifugation under the conditions of 10 minutes to obtain the supernatant,
The pH of the solution was adjusted to 5.0 by adding 1N acetic acid. Next, 10,000
× g, under the conditions of 20 minutes, the solution after the acid treatment was centrifuged,
The supernatant was obtained again. Ammonium sulfate was added to the supernatant to make it a saturated concentration, allowed to stand for 1 hour, and then centrifuged at 10,000 xg for 20 minutes to obtain a precipitate. The precipitate was dissolved in 0.05 M phosphate buffer (pH 7.5), and the dissolved concentrated extract was further dialyzed against 0.05 M phosphate buffer (pH 7.5).
【００２３】次に、30mlの濃縮抽出液（透析後）をヘパ
リンカラム(Hi-Trap Heparin、 1.0×1.0 cm、ファルマ
シア社製）に添加した。カラムは、予め0.05 Mリン酸緩
衝液(pH 7.5)で平衡化しておき、試料の添加後、同じ緩
衝液を用いてカラムを十分洗浄した。この時、流速は１
分間当たり0.5 mlの速度とした。カラム体積の10倍量以
上の緩衝液を用いてカラムを洗浄した後、カラムに吸着
したタンパク質を、塩化ナトリウムの濃度勾配によって
カラムから溶出した。使用した溶出液は、０〜0.5M塩化
ナトリウムの濃度勾配を有する0.05 Mリン酸緩衝液(pH
7.5)であり、緩衝液の使用量は30mlとした。上記の条件
では、ＢＡＬ活性画分は、塩化ナトリウムの濃度が0.5
mMになった時点でヘパリンカラムから溶出した。Next, 30 ml of the concentrated extract (after dialysis) was added to a heparin column (Hi-Trap Heparin, 1.0 × 1.0 cm, manufactured by Pharmacia). The column was equilibrated with a 0.05 M phosphate buffer (pH 7.5) in advance, and after the addition of the sample, the column was sufficiently washed with the same buffer. At this time, the flow velocity is 1
The rate was 0.5 ml per minute. After washing the column with a buffer solution of 10 times or more the volume of the column, the protein adsorbed on the column was eluted from the column by a concentration gradient of sodium chloride. The eluate used was a 0.05 M phosphate buffer (pH: 0) having a concentration gradient of 0 to 0.5 M sodium chloride.
7.5), and the amount of buffer used was 30 ml. Under the above conditions, the BAL active fraction had a sodium chloride concentration of 0.5
When it became mM, it was eluted from the heparin column.
【００２４】次に、塩化ナトリウムによってヘパリンカ
ラムから溶出したＢＡＬ活性画分を、陰イオン交換クロ
マトグラフィー用のカラムであるMono Qカラム(0.5×5.
0 cm、ファルマシア社製）に添加した。カラムは、予め
0.05 Mリン酸緩衝液(pH 7.5)で平衡化しておき、１回の
クロマトグラフィー当たり10mlの試料を添加した後、同
じ緩衝液を用いてカラムを十分洗浄した。この時、流速
は１分間当たり1.0 mlの速度とした。カラム体積の10倍
量以上の緩衝液を用いてカラムを洗浄した後、カラムに
吸着したタンパク質を、塩化ナトリウムの濃度勾配によ
ってカラムから溶出した。使用した溶出液は、０〜1.0M
塩化ナトリウムの濃度勾配を有する0.05Mリン酸緩衝液
(pH 7.5)であり、緩衝液の使用量は40mlとした。上記の
条件では、ＢＡＬ活性画分は、塩化ナトリウムの濃度が
0.15 Mになった時点でMono Qカラムから溶出された。Next, the BAL active fraction eluted from the heparin column with sodium chloride was applied to a Mono Q column (0.5 × 5.
0 cm, manufactured by Pharmacia). The column is
After equilibration with 0.05 M phosphate buffer (pH 7.5) and addition of 10 ml of sample per chromatography, the column was thoroughly washed with the same buffer. At this time, the flow rate was 1.0 ml per minute. After washing the column with a buffer solution of 10 times or more the volume of the column, the protein adsorbed on the column was eluted from the column by a concentration gradient of sodium chloride. The eluate used was 0-1.0M
0.05M phosphate buffer with sodium chloride concentration gradient
(pH 7.5), and the used amount of the buffer was 40 ml. Under the above conditions, the BAL active fraction has a sodium chloride concentration
At 0.15 M, it was eluted from the Mono Q column.
【００２５】さらに、塩化ナトリウムによってMono Qカ
ラムから溶出したＢＡＬ活性画分を、ヒドロキシアパタ
イトカラム（GH-0810F、８×100 mm、PENTAX社製）に添
加した。カラムは、予め0.002 M リン酸緩衝液(pH 7.5)
で平衡化しておき、試料を添加した後、同じ緩衝液を用
いてカラムを十分洗浄した。この時、流速は１分間当た
り1.0 mlの速度とした。カラム体積の10倍量以上の緩衝
液を用いてカラムを洗浄した後、カラムに吸着したタン
パク質を、リン酸の濃度勾配によってカラムから溶出し
た。使用した溶出液は、0.01〜0.4M塩化ナトリウムの濃
度勾配を有するリン酸緩衝液(pH 7.5)であり、緩衝液の
使用量は20mlとした。上記の条件では、ＢＡＬ活性画分
は、リン酸緩衝液の濃度が0.26 Mになった時点でヒドロ
キシアパタイトカラムから溶出した。Further, the BAL active fraction eluted from the Mono Q column with sodium chloride was added to a hydroxyapatite column (GH-0810F, 8 × 100 mm, manufactured by PENTAX). The column must be prepared in advance with a 0.002 M phosphate buffer (pH 7.5).
After adding the sample, the column was sufficiently washed with the same buffer. At this time, the flow rate was 1.0 ml per minute. After washing the column with a buffer solution of 10 times or more the volume of the column, the protein adsorbed on the column was eluted from the column by a concentration gradient of phosphoric acid. The eluate used was a phosphate buffer (pH 7.5) having a concentration gradient of 0.01 to 0.4 M sodium chloride, and the amount of the buffer used was 20 ml. Under the above conditions, the BAL active fraction was eluted from the hydroxyapatite column when the phosphate buffer concentration reached 0.26 M.
【００２６】以上の操作により、ウシ膵臓からウシ膵臓
由来のＢＡＬを、ほぼ純粋な形で精製することができ
た。ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー後
に得られたＢＡＬ活性画分中に含まれるタンパク質種
を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電
気泳動で分析した結果を図１に示した。このＢＡＬ活性
画分には、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド
ゲル電気泳動上の分子量が63,000であるタンパク質が存
在し、このタンパク質のクロマトグラフィー上の溶出パ
ターンと、ＢＡＬ活性画分のクロマトグラフィー上での
溶出パターンとが一致したため、このタンパク質がＢＡ
Ｌであると断定した。By the above operation, BAL derived from bovine pancreas from bovine pancreas could be purified in almost pure form. FIG. 1 shows the results of analyzing the protein species contained in the BAL active fraction obtained after the hydroxyapatite column chromatography by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. This BAL active fraction contains a protein having a molecular weight of 63,000 on sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. The chromatographic elution pattern of this protein and the chromatographic elution of the BAL active fraction Since the pattern matched, this protein
L was determined.
【００２７】[0027]
【参考例１】ヒト乳由来のＢＡＬの精製 ヒト乳由来のＢＡＬは、WangとJohnson の報告(Anal. B
iochem., vol.133, pp.457-461, 1983) を参考としなが
ら精製した。まず、ヒト乳を25,000×g 、30分の条件で
遠心分離し、ヒト乳ホエーを得た。次に、ヒト乳ホエー
をヘパリンカラム(Hi-Trap Heparin、1.0 ×1.0 cm、フ
ァルマシア社製）に添加した。カラムは、予め0.05 Mリ
ン酸緩衝液(pH 7.5)で平衡化しておき、試料の添加後、
同じ緩衝液を用いてカラムを十分洗浄した。この時、流
速は１分間当たり0.5 mlの速度とした。カラム体積の10
倍量以上の緩衝液を用いてカラムを洗浄した後、カラム
に吸着したタンパク質を、塩化ナトリウムの濃度勾配に
よってカラムから溶出した。使用した溶出液は、０〜0.
5M塩化ナトリウムの濃度勾配を有する0.05 Mリン酸緩衝
液(pH 7.5)であり、緩衝液の使用量は30mlとした。次
に、塩化ナトリウムによってヘパリンカラムから溶出し
たＢＡＬ活性画分を、ゲル濾過カラムクロマトグラフィ
ーに供した。カラムはSuperose 6(1.0×30cm) を使用
し、緩衝液には0.15 M塩化ナトリウムを含む0.1Mリン酸
緩衝液(pH 7.0)を使用した。以上の操作により、ヒト乳
からＢＡＬを精製した。[Reference Example 1] Purification of BAL derived from human milk BAL derived from human milk was reported by Wang and Johnson (Anal. B).
iochem., vol. 133, pp. 457-461, 1983). First, human milk was centrifuged at 25,000 × g for 30 minutes to obtain human milk whey. Next, human milk whey was added to a heparin column (Hi-Trap Heparin, 1.0 × 1.0 cm, manufactured by Pharmacia). The column is pre-equilibrated with 0.05 M phosphate buffer (pH 7.5), and after addition of the sample,
The column was thoroughly washed with the same buffer. At this time, the flow rate was 0.5 ml per minute. Column volume of 10
After washing the column with twice or more buffer, the protein adsorbed on the column was eluted from the column by a concentration gradient of sodium chloride. The eluate used was 0-0.
A 0.05 M phosphate buffer (pH 7.5) having a concentration gradient of 5 M sodium chloride was used, and the amount of the buffer used was 30 ml. Next, the BAL active fraction eluted from the heparin column with sodium chloride was subjected to gel filtration column chromatography. The column used was Superose 6 (1.0 × 30 cm), and the buffer used was 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.15 M sodium chloride. By the above operation, BAL was purified from human milk.
【００２８】[0028]
【試験例１】ウシ膵臓由来のＢＡＬとヒト乳由来のＢＡ
Ｌとの酵素化学的な性質の比較 ウシ膵臓由来のＢＡＬ及びヒト乳由来のＢＡＬの酵素化
学的な性質を検討し、本発明で精製したウシ膵臓由来の
酵素タンパク質がＢＡＬであることを確認した。[Test Example 1] BAL derived from bovine pancreas and BA derived from human milk
Comparison of enzymatic chemical properties with L. The enzymatic chemical properties of bovine pancreas-derived BAL and human milk-derived BAL were examined, and it was confirmed that the bovine pancreatic-derived enzyme protein purified by the present invention was BAL. .
【００２９】図２には、ウシ膵臓由来の酵素タンパク質
のリパーゼ活性に及ぼす胆汁酸の影響の検討結果を示し
た。また、図３には、ヒト乳由来のＢＡＬのリパーゼ活
性に及ぼす胆汁酸の影響についての検討結果を示した。
図から明らかなように、ウシ膵臓由来の酵素タンパク質
及びヒト乳由来のＢＡＬは共に、タウロコール酸ナトリ
ウムが存在しない環境ではリパーゼ活性を発現しない
か、あるいは極く微少な活性を示すのみだが、ウシ膵臓
由来の酵素タンパク質では１mM以上の、また、ヒト乳由
来のＢＡＬでは２mM以上のタウロコール酸ナトリウムが
存在した場合に、リパーゼ活性が活性化された。一方、
図４に示したように、ウシ膵臓ホモジネートについて同
様の検討を行ったところ、胆汁酸が存在しない場合にも
顕著なリパーゼ活性を示した。FIG. 2 shows the results of examination of the effect of bile acids on the lipase activity of an enzyme protein derived from bovine pancreas. FIG. 3 shows the results of an investigation on the effect of bile acids on the lipase activity of human milk-derived BAL.
As is clear from the figure, both the bovine pancreas-derived enzyme protein and human milk-derived BAL do not express lipase activity or show only minimal activity in the absence of sodium taurocholate. Lipase activity was activated when sodium taurocholate was present in an amount of 1 mM or more for the enzyme protein of interest or 2 mM or more for BAL derived from human milk. on the other hand,
As shown in FIG. 4, a similar study was performed on bovine pancreatic homogenate. As a result, remarkable lipase activity was exhibited even in the absence of bile acid.
【００３０】図５には、ウシ膵臓由来の酵素タンパク質
のエステラーゼ活性に及ぼす胆汁酸の影響の検討結果を
示した。また、図６には、ヒト乳由来のＢＡＬのエステ
ラーゼ活性に及ぼす胆汁酸の影響の検討結果を示した。
図から明らかのように、ウシ膵臓由来の酵素タンパク質
及びヒト乳由来のＢＡＬは共に、胆汁酸非存在下におい
て、エステラーゼ活性を示した。また、これらの活性
は、胆汁酸濃度の上昇と共に、さらに活性化された。一
方、図７に示したように、ウシ膵臓ホモジネートについ
て同様の検討を行ったところ、胆汁酸が存在しない場合
に顕著なエステラーゼ活性を示すが、この場合、ウシ膵
臓由来の酵素タンパク質やヒト乳由来のＢＡＬと異な
り、胆汁酸濃度が 2mMまでの範囲では、エステラーゼ活
性が阻害される傾向を示した。FIG. 5 shows the results of examination of the effect of bile acids on the esterase activity of an enzyme protein derived from bovine pancreas. FIG. 6 shows the results of an examination of the effect of bile acids on the esterase activity of human milk-derived BAL.
As is clear from the figure, both the bovine pancreatic enzyme protein and the human milk-derived BAL exhibited esterase activity in the absence of bile acids. These activities were further activated with increasing bile acid concentrations. On the other hand, as shown in FIG. 7, when the same study was performed on bovine pancreatic homogenate, remarkable esterase activity was shown in the absence of bile acid. In this case, the enzyme protein derived from bovine pancreas and human milk-derived protein were used. Unlike BAL, the esterase activity tended to be inhibited when the bile acid concentration was up to 2 mM.
【００３１】以上、ウシ膵臓由来の酵素タンパク質のリ
パーゼ活性及びエステラーゼ活性の性質をヒト乳由来の
ＢＡＬのそれらと比較した結果、本発明で精製されたウ
シ膵臓由来の酵素タンパク質は、ヒト乳由来のＢＡＬに
非常に類似した酵素化学的な性質をもつことが明らかに
なった。したがって、本発明で精製されるウシ膵臓由来
の酵素タンパク質がＢＡＬであることが明らかになっ
た。As described above, the properties of lipase activity and esterase activity of the bovine pancreatic enzyme protein were compared with those of human milk-derived BAL. As a result, the bovine pancreatic enzyme protein purified in the present invention was derived from human milk. It was found to have enzymatic chemistry very similar to BAL. Therefore, it was revealed that the bovine pancreatic enzyme protein purified in the present invention is BAL.
【００３２】[0032]
【試験例２】ウシ膵臓由来のＢＡＬのＮ末端アミノ酸配
列 本発明で精製されるウシ膵臓由来の酵素タンパク質がＢ
ＡＬであることをさらに確認する目的で、精製したウシ
膵臓由来の酵素タンパク質のＮ末端アミノ酸配列を分析
し、さらにヒト乳由来のＢＡＬのＮ末端アミノ酸配列を
も分析し、両者の配列を比較した。Ｎ末端アミノ酸配列
の分析には、自動配列分析器（Model-476A、パーキンエ
ルマーアプライドバイオシステムズ社製）を使用した。
試料の調製は、Matsudairaの方法(Matsudaira,P., J. B
iol. Chem., vol.262, pp.10035-10038, 1987)に従っ
た。[Test Example 2] N-terminal amino acid sequence of BAL derived from bovine pancreas
Column The enzyme protein derived from bovine pancreas purified by the present invention is B
In order to further confirm that the protein is AL, the N-terminal amino acid sequence of the purified bovine pancreatic enzyme protein was analyzed, and the N-terminal amino acid sequence of BAL derived from human milk was also analyzed. . For analysis of the N-terminal amino acid sequence, an automatic sequence analyzer (Model-476A, manufactured by PerkinElmer Applied Biosystems) was used.
The sample was prepared according to the method of Matsudaira (Matsudaira, P., J. B.
iol. Chem., vol. 262, pp. 10035-10038, 1987).
【００３３】分析の結果、ウシ膵臓由来の酵素タンパク
質のＮ末端アミノ酸配列を次のように決定した；Ala-Ly
s-Leu-Gly-Ser-Val-Tyr-Thr-Glu-Gly-Gly-Phe-Val-Asn-
Lys-Lys-Leu-Ser-Leu-Phe-Gly-Asp- (配列表配列番号
1)。また、ヒト乳由来のＢＡＬのＮ末端アミノ酸配列を
次のように決定した；Ala-Lys-Leu-Gly-Ala-Val-Tyr-Th
r-Glu-Gly-Gly-Phe-Val-Asn-Lys-Lys-Leu-Gly-Leu-Leu-
Gly-Asp- (配列表配列番号2)。以上の結果から明らかな
ように、分析された25残基のＮ末端アミノ酸配列の中
で、22残基のアミノ酸がウシ膵臓由来のＢＡＬとヒト乳
由来のＢＡＬの両者で相同であった（相同性は88％）。
したがって、Ｎ末端アミノ酸配列の分析結果からも、本
発明で精製されるウシ膵臓由来の酵素タンパク質がＢＡ
Ｌであることが確認された。As a result of the analysis, the N-terminal amino acid sequence of the enzyme protein derived from bovine pancreas was determined as follows; Ala-Ly
s-Leu-Gly-Ser-Val-Tyr-Thr-Glu-Gly-Gly-Phe-Val-Asn-
Lys-Lys-Leu-Ser-Leu-Phe-Gly-Asp- (SEQ ID NO:
1). In addition, the N-terminal amino acid sequence of BAL derived from human milk was determined as follows; Ala-Lys-Leu-Gly-Ala-Val-Tyr-Th
r-Glu-Gly-Gly-Phe-Val-Asn-Lys-Lys-Leu-Gly-Leu-Leu-
Gly-Asp- (SEQ ID NO: 2 in Sequence Listing). As is clear from the above results, in the analyzed N-terminal amino acid sequence of 25 residues, 22 amino acids were homologous in both BAL derived from bovine pancreas and BAL derived from human milk (homologous). Sex is 88%).
Therefore, from the analysis result of the N-terminal amino acid sequence, the enzyme protein derived from bovine pancreas purified by the present invention was found to be BA protein.
L was confirmed.
【００３４】[0034]
【試験例３】ウシ膵臓由来のＢＡＬがフコース残基を含
有する糖タンパク質であることの確認 本発明で精製されるウシ膵臓由来のＢＡＬがヒト乳由来
のＢＡＬと同様に糖タンパク質であるか否かを検討し
た。ウシ膵臓由来のＢＡＬ、及びヒト乳由来のＢＡＬを
電気泳動した後、ポリビニルダイフルオリド(PVDF)膜上
に転写し、膜上のタンパク質に対してレクチン染色を行
った。使用したレクチンは、Ｎアセチルラクトサミン構
造を認識する Datura Sttamonium Agglutinin(ＤＳ
Ａ）、シアル酸を認識する Salvia Sclarea Agglutinin
(ＳＳＡ）、フコース残基を認識するAnguilla Anguill
a Agglutinin（ＡＡＡ）、及びガラクトース残基を認識
するRicinus Communis Agglutinin(ＲＣＡ-120) であっ
た。検討の結果、ウシ膵臓由来のＢＡＬは、ＡＡＡによ
って染色され、一方、ヒト乳由来のＢＡＬはＡＡＡ、Ｒ
ＣＡ-120、及びＳＳＡで染色された。これにより、ウシ
膵臓由来のＢＡＬが少なくともフコース残基を含有する
糖タンパク質であることと、ヒト乳由来のＢＡＬが少な
くともフコース残基、ガラクトース残基、及びシアル酸
残基を含有する糖タンパク質であることを確認した。[Test Example 3] BAL derived from bovine pancreas contains fucose residue
Confirmation that the BAL derived from bovine pancreas purified by the present invention is a glycoprotein in the same manner as BAL derived from human milk. After BAL from bovine pancreas and BAL from human milk were electrophoresed, they were transferred onto a polyvinyl difluoride (PVDF) membrane, and proteins on the membrane were subjected to lectin staining. The lectin used was Datura Sttamonium Agglutinin (DS
A), Salvia Sclarea Agglutinin that recognizes sialic acid
(SSA), Anguilla Anguill recognizes fucose residues
a Agglutinin (AAA) and Ricinus Communis Agglutinin (RCA-120) which recognize galactose residues. As a result of examination, BAL from bovine pancreas was stained by AAA, while BAL from human milk was AAA, R
Stained with CA-120 and SSA. Thus, BAL derived from bovine pancreas is a glycoprotein containing at least fucose residues, and BAL derived from human milk is a glycoprotein containing at least fucose residues, galactose residues, and sialic acid residues. It was confirmed.
【００３５】[0035]
【試験例４】ウシ膵臓由来の粗精製物の調製と酵素化学
的な性質、及び精製酵素との比較 本発明において、ウシ膵臓由来のＢＡＬを製造する過程
で、部分精製物が精製物の示す酵素化学的な性質を、既
に有することが確認された。[Test Example 4] Preparation of crude purified bovine pancreas and enzyme chemistry
Characteristic and Comparison with Purified Enzyme In the present invention, it was confirmed that in the process of producing bovine pancreas-derived BAL, the partially purified product already had the enzymatic chemistry exhibited by the purified product.
【００３６】[0036]
【表１】 [Table 1]
【００３７】表１には、ウシ膵臓からウシ膵臓由来のＢ
ＡＬを精製した際に観察された物質収支を、タンパク質
の回収率及びリパーゼ活性の観点からまとめたものであ
る。表から明らかなように、ウシ膵臓ホモジネートのリ
パーゼ活性は、10mMのタウロコール酸ナトリウムを添加
した場合に、僅か2.2 倍のリパーゼ活性の上昇が見られ
るのに止まるが、精製したウシ膵臓由来のＢＡＬでは、
42倍の活性化が観察された。ウシ膵臓由来のＢＡＬの各
精製段階において、胆汁酸の添加によるリパーゼ活性の
上昇倍率を検討したところ、濃縮後のウシ膵臓抽出液で
は2.8 倍であったのに対し、ヘパリンカラムクロマトグ
ラフィーを終了した段階の部分精製物では65倍となっ
た。さらに、陰イオン交換クロマトグラフィーを終了し
た段階の部分精製物では70倍であった。Table 1 shows that bovine pancreas derived from bovine pancreas
The material balance observed when AL was purified is summarized from the viewpoint of protein recovery and lipase activity. As is clear from the table, the lipase activity of the bovine pancreatic homogenate was only increased 2.2-fold when 10 mM sodium taurocholate was added. ,
A 42-fold activation was observed. In each purification step of bovine pancreas-derived BAL, the increase rate of lipase activity due to the addition of bile acid was examined. The concentration of bovine pancreatic extract after concentration was 2.8 times, whereas heparin column chromatography was terminated. It was 65-fold for the partially purified product at the stage. Further, the ratio was 70 times in the partially purified product at the stage where the anion exchange chromatography was completed.
【００３８】以上の結果から、ウシ膵臓ホモジネートを
ヘパリンカラムクロマトグラフィーで部分精製した段階
の素材が、酵素化学的な性質において、精製されたウシ
膵臓由来のＢＡＬに均等な性質を示すことが明らかにな
った。また、ヘパリンカラムクロマトグラフィー後に得
られる部分精製物のリパーゼ活性に及ぼす胆汁酸の影
響、及びエステラーゼ活性に関する酵素の性質に関して
も、部分精製物は精製酵素に類似する性質を示した。From the above results, it is apparent that the bovine pancreatic homogenate obtained by partially purifying the bovine pancreatic homogenate by heparin column chromatography exhibits properties equivalent to those of purified bovine pancreatic BAL in terms of enzymatic chemistry. became. In addition, the partially purified product exhibited properties similar to those of the purified enzyme with respect to the effect of bile acid on the lipase activity of the partially purified product obtained after heparin column chromatography and the properties of the enzyme with respect to esterase activity.
【００３９】[0039]
【発明の効果】本発明によるとウシ膵臓由来のＢＡＬを
提供することができる。このＢＡＬは、ヒト乳由来のＢ
ＡＬと類似した性質を示し、またウシ膵臓から工業的に
大量に生産することができるので、ＢＡＬとして従来の
ヒト乳由来のＢＡＬと同様に利用することができる。According to the present invention, BAL derived from bovine pancreas can be provided. This BAL is derived from B derived from human milk.
Since it exhibits properties similar to AL and can be industrially produced in large quantities from bovine pancreas, it can be used as BAL in the same manner as BAL derived from conventional human milk.
【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ 〈１１０〉 YUKIJIRUSHI NYUGYO KABUSHIKI GAISHA (Snow Brand Milk Products Co.,Ltd.) 〈１２０〉 Bile salt activated lipase and Manufacture thereof 〈１３０〉 ＳＮＭＦＰ９８３８６ 〈１６０〉 ２ 〈２１０〉 １ 〈２１１〉 ２２ 〈２１２〉 PRT 〈２１３〉 Bovine pancreas 〈４００〉 １ Ala Lys Leu Gly Ser Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Asn Lys Lys 1 5 10 15 Leu Ser Leu Phe Gly Asp 20 〈２１０〉 ２ 〈２１１〉 ２２ 〈２１２〉 PRT 〈２１３〉 human milk 〈４００〉 ２ Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Asn Lys Lys 1 5 10 15 Leu Gly Leu Leu Gly Asp 20[Sequence list] SEQUENCE LISTING <110> YUKIJIRUSHI NYUGYO KABUSHIKI GAISHA (Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) <120> Bile salt activated lipase and Manufacture there <130> SNMFP98386 <160> 2 <210> 1 <211> 211 <212> PRT <213> Bovine pancreas <400> 1 Ala Lys Leu Gly Ser Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Asn Lys Lys 1 5 10 15 Leu Ser Leu Phe Gly Asp 20 <210> 2 <211> 22 <212 〉 PRT 〈213〉 human milk 〈400〉 2 Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Asn Lys Lys 1 5 10 15 Leu Gly Leu Leu Gly Asp 20
【図１】実施例１のウシ膵臓由来のＢＡＬのタンパク質
とヒト乳由来のＢＡＬのタンパク質とのドデシル硫酸ナ
トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量
の比較を示す。FIG. 1 shows a comparison of the molecular weight of BAL protein derived from bovine pancreas and BAL protein derived from human milk by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis in Example 1.
【図２】試験例１のウシ膵臓由来のＢＡＬのリパーゼ活
性に及ぼす胆汁酸の影響を示す。FIG. 2 shows the effect of bile acids on the lipase activity of bovine pancreas-derived BAL in Test Example 1.
【図３】試験例１のヒト乳由来のＢＡＬのリパーゼ活性
に及ぼす胆汁酸の影響を示す。FIG. 3 shows the effect of bile acids on the lipase activity of BAL derived from human milk in Test Example 1.
【図４】試験例１のウシ膵臓ホモジネートのリパーゼ活
性に及ぼす胆汁酸の影響を示す。FIG. 4 shows the effect of bile acids on the lipase activity of the bovine pancreatic homogenate of Test Example 1.
【図５】試験例１のウシ膵臓由来のＢＡＬのエステラー
ゼ活性に及ぼす胆汁酸の影響を示す。FIG. 5 shows the effect of bile acids on the esterase activity of bovine pancreas-derived BAL in Test Example 1.
【図６】試験例１のヒト乳由来のＢＡＬのエステラーゼ
活性に及ぼす胆汁酸の影響を示す。FIG. 6 shows the effect of bile acids on the esterase activity of BAL derived from human milk in Test Example 1.
【図７】試験例１のウシホモジネートのエステラーゼ活
性に及ぼす胆汁酸の影響を示す。FIG. 7 shows the effect of bile acids on the esterase activity of bovine homogenate of Test Example 1.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B050 CC01 DD11 FF09C FF11C HH01 KK06 LL02 4H045 AA10 CA40 DA89 EA01 FA71 GA20 GA23 GA24 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page F term (reference) 4B050 CC01 DD11 FF09C FF11C HH01 KK06 LL02 4H045 AA10 CA40 DA89 EA01 FA71 GA20 GA23 GA24
Claims (5)
（Bile salt-activated lipase; 以下ＢＡＬという）。1. Bile salt-activated lipase (Bile salt-activated lipase; BAL) derived from bovine pancreas.
由来のＢＡＬ。 1) 分子量約 63,000(ドデシル硫酸ナトリウムポリアク
リルアミドゲル電気泳動法による) 。 2) a) トリオレインからオレイン酸を遊離させるリパー
ゼ活性を示す。この活性は、胆汁酸が存在しない場合に
は極端に弱く、1 mM以上のタウロコール酸ナトリウムの
存在により顕著に向上する。 b) パラニトロフェニル酢酸からパラニトロフェノール
を遊離させるエステラーゼ活性を示す。 3) フコース残基を含む糖タンパク質である。 4) 次のＮ末端アミノ酸配列を有する。 Ala-Lys-Leu-Gly-Ser-Val-Tyr-Thr-Glu-Gly-Gly-Phe-Va
l-Asn-Lys-Lys-Leu-Ser-Leu-Phe-Gly-Asp-2. The bovine pancreas-derived BAL according to claim 1, which has the following properties. 1) Molecular weight about 63,000 (by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis). 2) a) A lipase activity that releases oleic acid from triolein. This activity is extremely weak in the absence of bile acids, and is significantly improved by the presence of 1 mM or more of sodium taurocholate. b) Esterase activity to release paranitrophenol from paranitrophenylacetic acid. 3) A glycoprotein containing fucose residues. 4) has the following N-terminal amino acid sequence: Ala-Lys-Leu-Gly-Ser-Val-Tyr-Thr-Glu-Gly-Gly-Phe-Va
l-Asn-Lys-Lys-Leu-Ser-Leu-Phe-Gly-Asp-
トグラフィー処理してＢＡＬを吸着させた後、溶出して
ＢＡＬを採取することを特徴とする請求項１記載のウシ
膵臓由来のＢＡＬの製造法。3. The method for producing bovine pancreas-derived BAL according to claim 1, wherein the bovine pancreatic extract is subjected to heparin column chromatography to adsorb BAL, and then eluted to collect BAL.
トグラフィー、陰イオン交換樹脂カラムクロマトグラフ
ィー及びヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィ
ーで順次処理してＢＡＬの吸着及び溶出をくり返して精
製し、ＢＡＬを採取することを特徴とする請求項１記載
のウシ膵臓由来のＢＡＬの製造法。4. A method for treating a bovine pancreatic extract by heparin column chromatography, anion exchange resin column chromatography and hydroxyapatite column chromatography in order to repeat the adsorption and elution of BAL and purify the BAL to collect BAL. 2. The method for producing bovine pancreas-derived BAL according to claim 1.
イズして得られるホモジネートを酸処理した後、遠心処
理して不溶物を除き、濃縮したものである請求項３又は
請求項４記載のウシ膵臓由来のＢＡＬの製造法。5. The bovine pancreatic extract according to claim 3 or 4, wherein the bovine pancreatic extract is obtained by subjecting a homogenate obtained by homogenizing bovine pancreas to acid treatment, followed by centrifugation to remove insolubles and concentration. Method for producing BAL derived from pancreas.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2371371B (en) * | 1999-10-11 | 2003-11-12 | Torotrak Dev Ltd | Test apparatus |
| JP2006512054A (en) * | 2002-08-06 | 2006-04-13 | サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | Method for isolating intestinal cholesterol binding protein |
-
1998
- 1998-12-07 JP JP10347462A patent/JP2000166545A/en active Pending
Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| GB2371371B (en) * | 1999-10-11 | 2003-11-12 | Torotrak Dev Ltd | Test apparatus |
| JP2006512054A (en) * | 2002-08-06 | 2006-04-13 | サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | Method for isolating intestinal cholesterol binding protein |
| US7786103B2 (en) | 2002-08-06 | 2010-08-31 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method for isolating an intestinal cholesterol binding protein |
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