JP2000146897A - 電極及びそれを用いるスルフィドリル化合物の測定方法 - Google Patents
電極及びそれを用いるスルフィドリル化合物の測定方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 食品、食品素材並びに生体試料中のＳＨ化合
物の電気化学分析において測定妨害物質の影響を抑えた
測定が可能な電極、及びそれを使用した測定方法を提供
する。 【構成】 ２電極方式の電気化学分析においてコバルト
フタロシアニンを練り込んだカーボンペースト電極を透
析膜によって被膜した電極を作用電極として使用する。
物の電気化学分析において測定妨害物質の影響を抑えた
測定が可能な電極、及びそれを使用した測定方法を提供
する。 【構成】 ２電極方式の電気化学分析においてコバルト
フタロシアニンを練り込んだカーボンペースト電極を透
析膜によって被膜した電極を作用電極として使用する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、食品、食品素材及
びそれらの製造工程中でのスルフィドリル化合物（以下
ＳＨ化合物と略す。）の電気化学測定並びに生体試料中
のＳＨ化合物の電気化学測定に関する。
びそれらの製造工程中でのスルフィドリル化合物（以下
ＳＨ化合物と略す。）の電気化学測定並びに生体試料中
のＳＨ化合物の電気化学測定に関する。
【０００２】
【従来の技術】酵母エキス等の食品素材中のグルタチオ
ン（以下ＧＳＨと略す。）等のＳＨ化合物の測定は、簡
便的にはヨード滴定法が用いられているが、還元性物質
が共存すると正の誤差が生じる。生体試料中のグルタチ
オンを選択的に測定する方法としてグリオキサラーゼＩ
を使用する酵素的な測定法（Hans Ulrich Bergmeyer,Me
thods of Enzymatic Analysis,Academic Press,Inc.,4
(1974)）があるが、高価な酵素を使用し操作が煩雑で簡
便な方法とは言い難い。高速液体クロマトグラフィーに
よる方法も一般的に行われているが、特別な装置が必要
な上に測定にある程度時間を要する。そこで測定の自動
化等を考えると電極だけによる簡便な電気化学的な測定
法が望まれる。
ン（以下ＧＳＨと略す。）等のＳＨ化合物の測定は、簡
便的にはヨード滴定法が用いられているが、還元性物質
が共存すると正の誤差が生じる。生体試料中のグルタチ
オンを選択的に測定する方法としてグリオキサラーゼＩ
を使用する酵素的な測定法（Hans Ulrich Bergmeyer,Me
thods of Enzymatic Analysis,Academic Press,Inc.,4
(1974)）があるが、高価な酵素を使用し操作が煩雑で簡
便な方法とは言い難い。高速液体クロマトグラフィーに
よる方法も一般的に行われているが、特別な装置が必要
な上に測定にある程度時間を要する。そこで測定の自動
化等を考えると電極だけによる簡便な電気化学的な測定
法が望まれる。
【０００３】電極を用いた方法としてはコバルトフタロ
シアニンを練り込んだカーボンペースト電極を用いる方
法が報告（M.K.Halbert et.al.,Anal.Chem..54 591(198
5)）されているが、そこで設定されている強酸性下では
酵素反応の追跡、あるいは酵素の使用は困難であり、設
定された測定電位では基底電流が高くなる。また、電極
表面の汚染が生じやすいなど、クロマト法の検出には使
用出来ても、一般的な生物試料での測定には好ましくな
い点が多い。
シアニンを練り込んだカーボンペースト電極を用いる方
法が報告（M.K.Halbert et.al.,Anal.Chem..54 591(198
5)）されているが、そこで設定されている強酸性下では
酵素反応の追跡、あるいは酵素の使用は困難であり、設
定された測定電位では基底電流が高くなる。また、電極
表面の汚染が生じやすいなど、クロマト法の検出には使
用出来ても、一般的な生物試料での測定には好ましくな
い点が多い。
【０００４】
【発明が解決しょうとする課題】本発明は上記の問題を
解決し、測定妨害物質の影響を受けず、正確でかつ簡便
で、測定の自動化も可能なＳＨ化合物の測定が行える電
気化学測定用電極及びそれを用いた測定法を提供する。
解決し、測定妨害物質の影響を受けず、正確でかつ簡便
で、測定の自動化も可能なＳＨ化合物の測定が行える電
気化学測定用電極及びそれを用いた測定法を提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は定電位電解装置
において、作用電極と参照電極の間に安定した電圧を加
えて作用電極での反応で生じた電流によって、ＳＨ化合
物の濃度を測定する際に、作用電極を透析膜で被膜する
ことによって試料溶液中の高分子化合物の影響を除き、
蛋白質のＳＨ基の影響がなく、また蛋白質による電極の
汚染がなく、さらにｐＨや濁りに影響されずに基底電流
が低い状態で測定が出来る電極を開発した。
において、作用電極と参照電極の間に安定した電圧を加
えて作用電極での反応で生じた電流によって、ＳＨ化合
物の濃度を測定する際に、作用電極を透析膜で被膜する
ことによって試料溶液中の高分子化合物の影響を除き、
蛋白質のＳＨ基の影響がなく、また蛋白質による電極の
汚染がなく、さらにｐＨや濁りに影響されずに基底電流
が低い状態で測定が出来る電極を開発した。
【０００６】定電位電解装置は作用電極と参照電極の間
に安定した電圧を加える装置で、レコーダーによって作
用電極で生じた電流を記録する。参照電極は基準電極と
も呼ばれ、作用電極に定電位電解装置によって加電圧が
正確になされるために使用するもので銀塩化電極や飽和
カロメル電極がよく使用される。参照電極に対して作用
電極の電位を負方向に高くしていくとＳＨ化合物の様な
被酸化性物資が存在する溶液では還元電流が出現する。
作用電極にコバルトフタロシアニンを練り込んだカーボ
ンペースト電極を用いると未修飾の電極に比べてより負
の電位で高感度にＳＨ化合物が測定出来ることは知られ
ている。
に安定した電圧を加える装置で、レコーダーによって作
用電極で生じた電流を記録する。参照電極は基準電極と
も呼ばれ、作用電極に定電位電解装置によって加電圧が
正確になされるために使用するもので銀塩化電極や飽和
カロメル電極がよく使用される。参照電極に対して作用
電極の電位を負方向に高くしていくとＳＨ化合物の様な
被酸化性物資が存在する溶液では還元電流が出現する。
作用電極にコバルトフタロシアニンを練り込んだカーボ
ンペースト電極を用いると未修飾の電極に比べてより負
の電位で高感度にＳＨ化合物が測定出来ることは知られ
ている。
【０００７】試料中の高分子化合物の影響を除くためと
安定した定常状態の電流を得るために作成した本発明の
透析膜で被膜したコバルトフタロシアニンを練り込んだ
カーボンペースト電極を用いると中性付近のｐＨ領域
で、未修飾の電極に比べて２００ｍＶほどの低い負の電
位でＳＨ化合物を再現性よく測定出来る。つまり本発明
の電極では従来の電極に比べて尿酸のような被酸化性の
共存物質の影響をより少なく、また基底電流がほぼ０の
電位で測定出来る。すなわち多くの生体物質は２００ｍ
Ｖでは電気化学的に不活性であるので測定における選択
性が良好となる。
安定した定常状態の電流を得るために作成した本発明の
透析膜で被膜したコバルトフタロシアニンを練り込んだ
カーボンペースト電極を用いると中性付近のｐＨ領域
で、未修飾の電極に比べて２００ｍＶほどの低い負の電
位でＳＨ化合物を再現性よく測定出来る。つまり本発明
の電極では従来の電極に比べて尿酸のような被酸化性の
共存物質の影響をより少なく、また基底電流がほぼ０の
電位で測定出来る。すなわち多くの生体物質は２００ｍ
Ｖでは電気化学的に不活性であるので測定における選択
性が良好となる。
【０００８】
【作用】この測定は試料溶液を撹拌しながら行う。この
ようにすると透析膜を透過して電極の表面に到達する物
質量が試料溶液中の濃度に比例し、電極表面にやってく
るＳＨ化合物の様な被酸化性物質量に相応する電流が流
れるので定量可能となる。この電極表面に到達する物質
量はその物質の分子量や型及び被膜する透析膜のポアサ
イズで変化する。分画分子量が３千〜２万の透析膜を使
用することがグルタチオン等の低分子ＳＨ化合物の測定
には好ましい。分画分子量が小さくなると選択性は増す
が感度が低くなる。
ようにすると透析膜を透過して電極の表面に到達する物
質量が試料溶液中の濃度に比例し、電極表面にやってく
るＳＨ化合物の様な被酸化性物質量に相応する電流が流
れるので定量可能となる。この電極表面に到達する物質
量はその物質の分子量や型及び被膜する透析膜のポアサ
イズで変化する。分画分子量が３千〜２万の透析膜を使
用することがグルタチオン等の低分子ＳＨ化合物の測定
には好ましい。分画分子量が小さくなると選択性は増す
が感度が低くなる。
【０００９】水溶液中のＳＨ化合物に５，５’−ジチオ
ビス（２−ニトロ安息香酸）（以下ＤＴＮＢと略す。）
を加えるとＳＨ−ＳＳ変換反応でＳＨ化合物に相当する
チオニトロ安息香酸が生成する。この分子量１９９のチ
オニトロ安息香酸もその分子量に応じて分子量３０７の
グルタチオンや分子量１２１のシステインと異なった膜
透過性のため異なった単位濃度あたりの電流値を示す。
この原理を使用すると被験液にＤＴＮＢを加えその電流
値の変化を調べることによって被験液中に含まれるＳＨ
化合物がグルタチオンであるかシステインであるか判断
がより確かとなる。すなわち電流値はＳＨ化合物の分子
量にほぼ反比例するのでグルタチオンの場合はＤＴＮＢ
を加えることによって電流値は３．３倍、システインの
場合は１７％減となる。生体中の非タンパク性のＳＨ化
合物の大部分はグルタチオンであるが、場合によっては
システインの様なＳＨ化合物も存在するので、ＳＨ化合
物に非特異的に応答する本電極での測定には曖昧さが残
るが、試料を添加して電流が一定となった後ＤＴＮＢを
添加してその電流値の変化を見ることによってグルタチ
オンによるものかどうか確認することが出来る。
ビス（２−ニトロ安息香酸）（以下ＤＴＮＢと略す。）
を加えるとＳＨ−ＳＳ変換反応でＳＨ化合物に相当する
チオニトロ安息香酸が生成する。この分子量１９９のチ
オニトロ安息香酸もその分子量に応じて分子量３０７の
グルタチオンや分子量１２１のシステインと異なった膜
透過性のため異なった単位濃度あたりの電流値を示す。
この原理を使用すると被験液にＤＴＮＢを加えその電流
値の変化を調べることによって被験液中に含まれるＳＨ
化合物がグルタチオンであるかシステインであるか判断
がより確かとなる。すなわち電流値はＳＨ化合物の分子
量にほぼ反比例するのでグルタチオンの場合はＤＴＮＢ
を加えることによって電流値は３．３倍、システインの
場合は１７％減となる。生体中の非タンパク性のＳＨ化
合物の大部分はグルタチオンであるが、場合によっては
システインの様なＳＨ化合物も存在するので、ＳＨ化合
物に非特異的に応答する本電極での測定には曖昧さが残
るが、試料を添加して電流が一定となった後ＤＴＮＢを
添加してその電流値の変化を見ることによってグルタチ
オンによるものかどうか確認することが出来る。
【００１０】本発明の被膜作用電極は被験液のｐＨや濁
りに影響されず、また基底電流が０の電位で共存物質の
影響の少ない条件でＳＨ化合物が測定出来るので、微量
な血液中のＳＨ化合物の測定にも有効である。グルタチ
オン及びその生成に関わる酵素量を調べることは白血病
の診断に有効とされており、それらを簡便に測定する方
法が望まれている。また最近はＨＩＶ感染者の病状悪化
の新しい指標としてＴ細胞中のグルタチオンの測定が提
唱されている。
りに影響されず、また基底電流が０の電位で共存物質の
影響の少ない条件でＳＨ化合物が測定出来るので、微量
な血液中のＳＨ化合物の測定にも有効である。グルタチ
オン及びその生成に関わる酵素量を調べることは白血病
の診断に有効とされており、それらを簡便に測定する方
法が望まれている。また最近はＨＩＶ感染者の病状悪化
の新しい指標としてＴ細胞中のグルタチオンの測定が提
唱されている。
【００１１】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明の内容を更に
詳細に説明するが、もちろん本発明はこれらに限定され
るものではない。
詳細に説明するが、もちろん本発明はこれらに限定され
るものではない。
【００１２】実施例１ 図面により測定装置を説明する。図１は測定装置の構成
概略図であり、作用電極１と参照電極２の間に、定電位
電解装置３（この実施例では柳本製作所のポーラログラ
フィックアナライザーＰ１１００を使用）で安定した電
圧を加え、試料セル５に入れた被験液をスターラー６で
撹拌しながら反応によって生じた電流を記録計４で記録
する。
概略図であり、作用電極１と参照電極２の間に、定電位
電解装置３（この実施例では柳本製作所のポーラログラ
フィックアナライザーＰ１１００を使用）で安定した電
圧を加え、試料セル５に入れた被験液をスターラー６で
撹拌しながら反応によって生じた電流を記録計４で記録
する。
【００１３】（１）透析膜被膜電極の作成方法 図２は、図１の作用電極１の先端部分を拡大したもの
で、ＢＳＡ社製カーボンペースト電極７（コード11-240
8 内径３ｍｍ）先端の凹部８に日本黒鉛製粉末グラファ
イト３００ｍｇ、パラフィンオイル１００ｍｇ、コバル
トフタロシアニン２０ｍｇを練り合わせたものを詰め表
面を滑らかにする。そこへ半径３ｍｍに丸く切ったユニ
オンカーバイド社製の透析膜９（コード411-03、分画分
子量１〜2万）を張り付け、ナイロンネット１０で覆っ
てＯリング１１で固定する。比較例用としてコバルトフ
タロシアニンを練り込まず、また透析膜で被膜しない作
用電極も作成した。
で、ＢＳＡ社製カーボンペースト電極７（コード11-240
8 内径３ｍｍ）先端の凹部８に日本黒鉛製粉末グラファ
イト３００ｍｇ、パラフィンオイル１００ｍｇ、コバル
トフタロシアニン２０ｍｇを練り合わせたものを詰め表
面を滑らかにする。そこへ半径３ｍｍに丸く切ったユニ
オンカーバイド社製の透析膜９（コード411-03、分画分
子量１〜2万）を張り付け、ナイロンネット１０で覆っ
てＯリング１１で固定する。比較例用としてコバルトフ
タロシアニンを練り込まず、また透析膜で被膜しない作
用電極も作成した。
【００１４】（２）測定方法 透析膜を被膜した作用電極（Ｂ）並びに比較例用の作用
電極を測定装置（Ａ）にセットし、（Ａ）の試料セル５
の部分に１ｍｌのｐＨ７．３の１００ｍＭトリス緩衝
液、それにシステインを０．６ｍＭ、グルタチオンを
２．４ｍＭ、尿酸を０．１５ｍＭになる様に加えた液を
それぞれ入れて、直径１ｃｍの磁気回転子を用いてスタ
ーラーで５００ｒｐｍで撹拌しながら飽和カロメル電極
を対照電極として種々の電圧下で定常状態の電流値を記
録した。
電極を測定装置（Ａ）にセットし、（Ａ）の試料セル５
の部分に１ｍｌのｐＨ７．３の１００ｍＭトリス緩衝
液、それにシステインを０．６ｍＭ、グルタチオンを
２．４ｍＭ、尿酸を０．１５ｍＭになる様に加えた液を
それぞれ入れて、直径１ｃｍの磁気回転子を用いてスタ
ーラーで５００ｒｐｍで撹拌しながら飽和カロメル電極
を対照電極として種々の電圧下で定常状態の電流値を記
録した。
【００１５】（３）結果 各電圧下で得られた電流値の変化の様子は図３の様にな
った。透析膜を被膜した本発明の作用電極では比較例の
作用電極に比してシステイン（Ａとａ）、グルタチオン
（Ｂとｂ）は２００ｍＶほど負の電位に平行移動した形
となった。一方、尿酸（Ｃとｃ）及びトリス緩衝液（Ｄ
とｄ）では透析膜を被膜した作用電極と比較例の作用電
極ではそのような変動はなかった。このことより透析膜
を被膜した作用電極で２００ｍＶの電圧を設定すること
によつて、基底電流がゼロで尿酸等の測定妨害物質の影
響を受けることなく生体試料中のグルタチオン等のＳＨ
化合物の測定が出来ることになる。
った。透析膜を被膜した本発明の作用電極では比較例の
作用電極に比してシステイン（Ａとａ）、グルタチオン
（Ｂとｂ）は２００ｍＶほど負の電位に平行移動した形
となった。一方、尿酸（Ｃとｃ）及びトリス緩衝液（Ｄ
とｄ）では透析膜を被膜した作用電極と比較例の作用電
極ではそのような変動はなかった。このことより透析膜
を被膜した作用電極で２００ｍＶの電圧を設定すること
によつて、基底電流がゼロで尿酸等の測定妨害物質の影
響を受けることなく生体試料中のグルタチオン等のＳＨ
化合物の測定が出来ることになる。
【００１６】実施例２ （１）透析膜被膜電極の作成方法 実施例１と同様に行った。今回は透析膜を被膜しない比
較例の作用電極は作成、使用しなかった。
較例の作用電極は作成、使用しなかった。
【００１７】（２）測定方法 電圧を２００ｍＶに設定して実施例１と同様に行った。
試料液として０．１ｍＭリン酸緩衝液に図４の矢印ａ、
ｂ、ｃ、ｄのところでそれぞれ６０μＭとなる様にシス
テイン（分子量２５０）、γーグルタミルシステイン
（分子量２５０）、グルタチオン（分子量３０７）、コ
ーエンザイムＡ（分子量７８５）を順次添加した。図４
においてＢ、Ｄ、Ｆはそれぞれ０．１ｍＭリン酸緩衝液
に、矢印のところで、酵素法でグルタチオン含量が８．
８％と測定されている酵母エキス粉末を５６６μｇ／ｍ
ｌ（グルタチオンとして５０μｇ／ｍｌ）、グルタチオ
ンを５０μｇ／ｍｌ（１６６μＭ）、システインを１６
６μＭとなる様に添加した。Ｃ，Ｅ，ＧはそれぞれＤＴ
ＮＢを３００μＭ含む０．１ｍＭリン酸緩衝液に、矢印
のところで、酵素法でグルタチオン含量が８．８％と測
定されている酵母エキス粉末を５６６μｇ／ｍｌ（グル
タチオンとして５０μｇ／ｍｌ）、グルタチオンを５０
μｇ／ｍｌ（１６６μＭ）、システインを１６６μＭと
なる様に添加した。
試料液として０．１ｍＭリン酸緩衝液に図４の矢印ａ、
ｂ、ｃ、ｄのところでそれぞれ６０μＭとなる様にシス
テイン（分子量２５０）、γーグルタミルシステイン
（分子量２５０）、グルタチオン（分子量３０７）、コ
ーエンザイムＡ（分子量７８５）を順次添加した。図４
においてＢ、Ｄ、Ｆはそれぞれ０．１ｍＭリン酸緩衝液
に、矢印のところで、酵素法でグルタチオン含量が８．
８％と測定されている酵母エキス粉末を５６６μｇ／ｍ
ｌ（グルタチオンとして５０μｇ／ｍｌ）、グルタチオ
ンを５０μｇ／ｍｌ（１６６μＭ）、システインを１６
６μＭとなる様に添加した。Ｃ，Ｅ，ＧはそれぞれＤＴ
ＮＢを３００μＭ含む０．１ｍＭリン酸緩衝液に、矢印
のところで、酵素法でグルタチオン含量が８．８％と測
定されている酵母エキス粉末を５６６μｇ／ｍｌ（グル
タチオンとして５０μｇ／ｍｌ）、グルタチオンを５０
μｇ／ｍｌ（１６６μＭ）、システインを１６６μＭと
なる様に添加した。
【００１８】（３）結果 図４Ａで示すように、各々６０μＭのシステイン、γー
グルタミルシステイン、グルタチオン、コーエンザイム
Ａの添加によってそれぞれの分子量にほぼ反比例する電
流値の増加があった。また、Ｂ、Ｄで示すようにグルタ
チオン５０μｇ／ｍｌ含有する酵母エキスサンプルの電
流値（Ｂ）は純粋なグルタチオン５０μｇ／ｍｌの電流
値（Ｄ）と一致し、本測定法で酵母エキス中のグルタチ
オンが定量出来ることがわかった。それらを３００μＭ
のＤＴＮＢを含むリン酸緩衝液中で測定した場合はＣ，
Ｅ，Ｇで示すように酵母エキス（Ｃ）、グルタチオン
（Ｅ）では電流値が約３．３倍となり、システイン
（Ｇ）では約１７％減の電流値を示し、Ｃ、Ｅと一致し
た。これはいずれもグルタチオンあるいはシステインに
よるＳＨ−ＳＳ変換反応によって生成した相当するモル
数のチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ：分子量１９９）によ
る電流値と考えられる。
グルタミルシステイン、グルタチオン、コーエンザイム
Ａの添加によってそれぞれの分子量にほぼ反比例する電
流値の増加があった。また、Ｂ、Ｄで示すようにグルタ
チオン５０μｇ／ｍｌ含有する酵母エキスサンプルの電
流値（Ｂ）は純粋なグルタチオン５０μｇ／ｍｌの電流
値（Ｄ）と一致し、本測定法で酵母エキス中のグルタチ
オンが定量出来ることがわかった。それらを３００μＭ
のＤＴＮＢを含むリン酸緩衝液中で測定した場合はＣ，
Ｅ，Ｇで示すように酵母エキス（Ｃ）、グルタチオン
（Ｅ）では電流値が約３．３倍となり、システイン
（Ｇ）では約１７％減の電流値を示し、Ｃ、Ｅと一致し
た。これはいずれもグルタチオンあるいはシステインに
よるＳＨ−ＳＳ変換反応によって生成した相当するモル
数のチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ：分子量１９９）によ
る電流値と考えられる。
【００１９】このことは本発明の透析膜を被膜した作用
電極では試料液中のＳＨ化合物の測定が可能であること
を示しており、そこで得られる電流値は試料中のＳＨ化
合物の分子量によって変動し、低分子のＳＨ化合物ほど
大きな値となる。またＤＴＮＢ存在下で同様の測定を行
いその電流値の変化を見ることによって、対象のＳＨ化
合物の分子量を類推することが出来て、グルタチオンか
システインの判定も可能である。
電極では試料液中のＳＨ化合物の測定が可能であること
を示しており、そこで得られる電流値は試料中のＳＨ化
合物の分子量によって変動し、低分子のＳＨ化合物ほど
大きな値となる。またＤＴＮＢ存在下で同様の測定を行
いその電流値の変化を見ることによって、対象のＳＨ化
合物の分子量を類推することが出来て、グルタチオンか
システインの判定も可能である。
【００２０】実施例３ （１）透析膜被膜電極の作成方法 実施例１と同様に行った。今回は透析膜を被膜しない比
較例の作用電極は作成、使用しなかった。
較例の作用電極は作成、使用しなかった。
【００２１】（２）測定方法 電圧を２００ｍＶに設定して実施例１と同様に行った。
試料液として０．１Ｍリン酸緩衝液に、図５の矢印のと
ころでアスコルビン酸５．６μＭ（Ａ）、グルタチオン
６４μＭ（Ｂ）および赤血球３０μｌをリン酸緩衝液で
溶血した液１．５ｍｌ（Ｃ）を添加して電流値が定常値
になったＡＯの矢印のところでアスコルビン酸オキシダ
ーゼ（シグマ社製）を６Ｕ／ｍｌ添加して電流値を調べ
た。
試料液として０．１Ｍリン酸緩衝液に、図５の矢印のと
ころでアスコルビン酸５．６μＭ（Ａ）、グルタチオン
６４μＭ（Ｂ）および赤血球３０μｌをリン酸緩衝液で
溶血した液１．５ｍｌ（Ｃ）を添加して電流値が定常値
になったＡＯの矢印のところでアスコルビン酸オキシダ
ーゼ（シグマ社製）を６Ｕ／ｍｌ添加して電流値を調べ
た。
【００２２】（３）結果 アスコルビン酸（Ａ）では電流値の増加があるが、アス
コルビン酸オキシダーゼ（ＡＯ）の添加によって分解さ
れて基底電流に戻る。グルタチオン（Ｂ）ではアスコル
ビン酸オキシダーゼ（ＡＯ）を添加しても電流値の変化
はない。赤血球試料（Ｃ）では電流値が定常値になった
後、共存するアスコルビン酸の影響を排除するためにア
スコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯ）を添加したところ電
流値は減少し、グルタチオン６４μＭの電流値と一致し
た。この様にアスコルビン酸が存在するような生体試料
についても、本電極によってアスコルビン酸オキシダー
ゼとの組み合わせでグルタチオン等の低分子ＳＨ化合物
が測定出来る。
コルビン酸オキシダーゼ（ＡＯ）の添加によって分解さ
れて基底電流に戻る。グルタチオン（Ｂ）ではアスコル
ビン酸オキシダーゼ（ＡＯ）を添加しても電流値の変化
はない。赤血球試料（Ｃ）では電流値が定常値になった
後、共存するアスコルビン酸の影響を排除するためにア
スコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯ）を添加したところ電
流値は減少し、グルタチオン６４μＭの電流値と一致し
た。この様にアスコルビン酸が存在するような生体試料
についても、本電極によってアスコルビン酸オキシダー
ゼとの組み合わせでグルタチオン等の低分子ＳＨ化合物
が測定出来る。
【００２３】実施例４ （１）透析膜被膜電極の作成方法 実施例１と同様に行った。今回は透析膜を被膜しない比
較例の作用電極は作成、使用しなかった。
較例の作用電極は作成、使用しなかった。
【００２４】（２）測定方法 電圧を２００ｍＶに設定して実施例１と同様に行った。
試料液として０．１ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０に酸化
型グルタチオン２ｍＭ、ＮＡＤＰＨ ０．６ｍＭとなる
ように加え、それに酵母由来のグルタチオンリダクター
ゼ（シグマ社製）を１０Ｕ／Ｌ（図６におけるＡ）、３
Ｕ／Ｌ（図６におけるＢ）、１Ｕ／Ｌ（図６における
Ｃ）となるように添加して電流値の変化を測定した。
試料液として０．１ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０に酸化
型グルタチオン２ｍＭ、ＮＡＤＰＨ ０．６ｍＭとなる
ように加え、それに酵母由来のグルタチオンリダクター
ゼ（シグマ社製）を１０Ｕ／Ｌ（図６におけるＡ）、３
Ｕ／Ｌ（図６におけるＢ）、１Ｕ／Ｌ（図６における
Ｃ）となるように添加して電流値の変化を測定した。
【００２５】（３）結果 図６に示すように、グルタチオンリダクターゼの添加量
に比例して電流値が増加した。これはグルタチオンリダ
クターゼによって酸化型グルタチオンが還元されてグル
タチオンが生成するためで、その増加すなわち酵素活性
に比例してグルタチオンとしての電流値が増加するため
である。このようにグルタチオンが生成するかまたは消
失する酵素反応を触媒する酵素の活性の測定も本電極を
使用することによって容易に行える。
に比例して電流値が増加した。これはグルタチオンリダ
クターゼによって酸化型グルタチオンが還元されてグル
タチオンが生成するためで、その増加すなわち酵素活性
に比例してグルタチオンとしての電流値が増加するため
である。このようにグルタチオンが生成するかまたは消
失する酵素反応を触媒する酵素の活性の測定も本電極を
使用することによって容易に行える。
【００２６】
【発明の効果】本発明により、測定妨害物質の影響を抑
えた、低分子ＳＨ化合物の簡便な電気化学分析が可能と
なり、またその対象とするＳＨ化合物の推定も可能とな
った。
えた、低分子ＳＨ化合物の簡便な電気化学分析が可能と
なり、またその対象とするＳＨ化合物の推定も可能とな
った。
【図１】 実施例１，２において用いた２電極方式の電
気化学分析装置の構成概略図である。
気化学分析装置の構成概略図である。
【図２】 実施例１，２において用いた２電極方式の電
気化学分析装置の作用電極の先端部分（Ｂ）を拡大した
構成概略図である。
気化学分析装置の作用電極の先端部分（Ｂ）を拡大した
構成概略図である。
【図３】 実施例１において得られたトリス緩衝液
（Ｄ、ｄ）及びそれにシステイン（Ａ，ａ）、グルタチ
オン（Ｂ、ｂ）、尿酸（Ｃ、ｃ）を加えた試料液の透析
膜を被膜したコバルトフタロシアニンを練り込んだ作用
電極（Ａ−Ｄ）とそれらを付加していない作用電極（ａ
−ｄ）の定常状態の電流値（Ｉ／ｎＡ）と電圧（Ｅ／
Ｖ）の関係を示す。
（Ｄ、ｄ）及びそれにシステイン（Ａ，ａ）、グルタチ
オン（Ｂ、ｂ）、尿酸（Ｃ、ｃ）を加えた試料液の透析
膜を被膜したコバルトフタロシアニンを練り込んだ作用
電極（Ａ−Ｄ）とそれらを付加していない作用電極（ａ
−ｄ）の定常状態の電流値（Ｉ／ｎＡ）と電圧（Ｅ／
Ｖ）の関係を示す。
【図４】 実施例２において得られた結果で、Ａはトリ
ス緩衝液にａ，ｂ，ｃ，ｄの矢印のところでそれぞれシ
ステイン、γーグルタミルシステイン、グルタチオン、
コーエンザイムＡを加えたときの電流値（Ｉ／ｎＡ）を
示している。Ｂ、Ｄ、Ｆはそれぞれ矢印のところでグル
タチオン含量が８．８％の酵母エキス、グルタチオン、
システインを添加したときに得られた電流値を示す。
Ｃ，Ｅ，ＧはＤＴＮＢを含むトリス緩衝液にグルタチオ
ン含量が８．８％の酵母エキス、グルタチオン 、シス
テインを添加した場合の電流値を示す。
ス緩衝液にａ，ｂ，ｃ，ｄの矢印のところでそれぞれシ
ステイン、γーグルタミルシステイン、グルタチオン、
コーエンザイムＡを加えたときの電流値（Ｉ／ｎＡ）を
示している。Ｂ、Ｄ、Ｆはそれぞれ矢印のところでグル
タチオン含量が８．８％の酵母エキス、グルタチオン、
システインを添加したときに得られた電流値を示す。
Ｃ，Ｅ，ＧはＤＴＮＢを含むトリス緩衝液にグルタチオ
ン含量が８．８％の酵母エキス、グルタチオン 、シス
テインを添加した場合の電流値を示す。
【図５】 実施例３において得られた結果で、矢印のと
ころでそれぞれ（Ａ）はアスコルビン酸、（Ｂ）はグル
タチオン、（Ｃ）は赤血球試料を添加し、それぞれ矢印
ＡＯのところでアスコルビン酸オキシダーゼを添加した
ときの電流値（Ｉ／ｎＡ）の変化を示す。
ころでそれぞれ（Ａ）はアスコルビン酸、（Ｂ）はグル
タチオン、（Ｃ）は赤血球試料を添加し、それぞれ矢印
ＡＯのところでアスコルビン酸オキシダーゼを添加した
ときの電流値（Ｉ／ｎＡ）の変化を示す。
【図６】 実施例４において得られた結果で、酸化型グ
ルタチオン、ＮＡＤＰＨを含むリン酸緩衝液に、矢印の
ところで、グルタチオンリダクターゼをＡは１０Ｕ／
Ｌ、Ｂは３Ｕ／Ｌ、Ｃは１Ｕ／Ｌ添加したときの電流値
（Ｉ／ｎＡ）の変化を示す。
ルタチオン、ＮＡＤＰＨを含むリン酸緩衝液に、矢印の
ところで、グルタチオンリダクターゼをＡは１０Ｕ／
Ｌ、Ｂは３Ｕ／Ｌ、Ｃは１Ｕ／Ｌ添加したときの電流値
（Ｉ／ｎＡ）の変化を示す。
１ 作用電極 ２ 参照電極 ３ 定電位電解装置 ４ 記録計 ５ 試料セル ６ スターラー ７ 作用電極（カーボンペースト電極） ８ 作用電極先端凹部 ９ 透析膜 １０ ナイロンネット １１ Ｏリング
Claims (5)
- 【請求項１】 作用電極に透析膜を被覆した、スルフィ
ドリル化合物の２電極方式電気化学分析用の電極。 - 【請求項２】 作用電極が、コバルトフタロシアニンを
練り込んだカーボンペースト電極である請求項１記載の
電極。 - 【請求項３】 ２電極方式の電気化学分析において、請
求項１又は２記載の電極を用いることを特徴とするスル
フィドリル化合物の測定方法。 - 【請求項４】 請求項３のスルフィドリル化合物を測定
する際に５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）
を添加することによりスルフィドリル化合物を確認する
ことが出来るスルフィドリル化合物の測定方法。 - 【請求項５】 請求項３又は４記載の電気化学分析の対
象がシステイン、グルタチオン、γーグルタミルシステ
イン、コーエンザイムＡであるスルフィドリル化合物の
測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10323192A JP2000146897A (ja) | 1998-11-13 | 1998-11-13 | 電極及びそれを用いるスルフィドリル化合物の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10323192A JP2000146897A (ja) | 1998-11-13 | 1998-11-13 | 電極及びそれを用いるスルフィドリル化合物の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000146897A true JP2000146897A (ja) | 2000-05-26 |
Family
ID=18152096
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10323192A Pending JP2000146897A (ja) | 1998-11-13 | 1998-11-13 | 電極及びそれを用いるスルフィドリル化合物の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000146897A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013208259A (ja) * | 2012-03-30 | 2013-10-10 | Keio Gijuku | ダイヤモンド微小電極を用いた還元型グルタチオンの測定装置 |
| WO2015045606A1 (ja) * | 2013-09-30 | 2015-04-02 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | イオン選択電極 |
-
1998
- 1998-11-13 JP JP10323192A patent/JP2000146897A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013208259A (ja) * | 2012-03-30 | 2013-10-10 | Keio Gijuku | ダイヤモンド微小電極を用いた還元型グルタチオンの測定装置 |
| WO2015045606A1 (ja) * | 2013-09-30 | 2015-04-02 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | イオン選択電極 |
| JP2015068796A (ja) * | 2013-09-30 | 2015-04-13 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | イオン選択電極 |
| EP3054290A4 (en) * | 2013-09-30 | 2017-06-21 | Hitachi High-Technologies Corporation | Ion-selective electrode |
| US9885683B2 (en) | 2013-09-30 | 2018-02-06 | Hitachi High-Technologies Corporation | Ion-selective electrode |
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