JP2000125858A - Ｎ−グリカン遊離酵素の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 植物由来のＮ−グリカン遊離酵素を、高い
回収率で、高度純度に精製する方法を提供することを課
題とする。 【解決手段】酵母由来のハイマンノース型糖タンパク質
を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用して精
製する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酵素の精製方法に
関するものである。本発明は、詳しくは、アフィニティ
ークロマトグラフィーを用いた植物由来のＮ−グリカン
遊離酵素の精製方法及びこの方法により新規に単離され
た酵素に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】糖蛋白質は、種々の生理活性を有し、細
胞相互の認識や細胞間情報伝達に重要な役割を果たして
いるものと考えられている。

【０００３】動物糖蛋白質を対象としたＮ−グリカンの
構造と機能に関する研究は７０年代後半より長足の進歩
を遂げ、糖鎖の有する多彩な生理機能が明かにされてき
ている。特に、動物細胞の分化、脱分化現象が糖転移酵
素群の発現と深く関係する事実は、細胞認識機構におけ
る糖鎖の重要性を示すものである。

【０００４】これに対し、植物糖蛋白質については、糖
鎖構造の特徴や生合成機構が明かになりつつある段階で
ある。そして、その糖鎖の役割についても、蛋白質構造
の安定性や糖蛋白質の分泌に関与していることが明かに
なりつつある程度で、その機能研究は殆どされていな
い。

【０００５】植物由来のＮ−グリカン遊離酵素として
は、従来から、エンドグリコシダーゼとグリコアミダー
ゼがあることが知られている。これらのＮ−グリカン遊
離酵素は、植物蛋白質中の糖鎖に作用して、動物由来の
糖蛋白質同様に、種々の機構に関与していると考えられ
る。しかし、植物由来のＮ−グリカン遊離酵素は安定性
が低く、純粋な精製酵素を得ることが困難であったた
め、その研究はほとんどされていなかった。

【０００６】これらの植物由来のＮ−グリカン遊離酵素
の中、エンドウ、イチョウについては、(Biosci.Biotec
hnol Biochem. 60, 228-232, 1996, Biosci.Biotechnol
Biochem. 62, 253-261, 1998）に記載されている方法
により、精製酵素が得られることが知られている。しか
し、トマト、ダイズのＮ−グリカン遊離酵素は安定性が
低いため、多段階の精製ステップが必要であるこの方法
を用いて精製すると、精製ステップの途中で急激に活性
が低下してしまい、完全に精製することは非常に困難で
あった。

【０００７】また、細菌由来のＮ−グリカン遊離酵素に
ついては、精製に酵母マンナンカラムを用いた細菌のエ
ンドグリコシダーゼを精製する方法が報告されている(B
iochim.Biophys.Acta,749,211-213,1983）。しかし、こ
の方法は、トマト等の植物由来のＮ−グリカン遊離酵素
の精製には適していない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、植物由来の
Ｎ−グリカン遊離酵素を、高回収率で、高純度に精製す
る方法および、この方法により新規に単離されたＮ−グ
リカン遊離酵素を提供することを課題とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するため、鋭意研究を重ねた結果、酵母由来のハ
イマンノース型糖タンパク質を用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーを用いることにより、植物由来のＮ−
グリカン遊離酵素を高純度に精製することができること
を見出し本発明を完成させた。

【００１０】即ち、本発明は、ハイマンノース型糖タン
パク質が結合されたアフィニティークラマトグラフィー
用担体である。また、本発明は、前記ハイマンノース型
糖タンパク質が酵母由来であることを特徴とする前記の
担体である。

【００１１】更に、本発明は、前記酵母由来のハイマン
ノース型糖タンパク質がインベルターゼである前記の担
体である。更にまた、本発明は、植物の組織からＮ−グ
リカン遊離酵素を精製する方法であって、前記担体を用
いたアフィニティークラマトグラフィーを用いる工程を
含むことを特徴とするＮ−グリカン遊離酵素の精製方法
である。

【００１２】また、本発明は前記Ｎ−グリカン遊離酵素
がエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである
前記の方法である。また、本発明は前記Ｎ−グリカン遊
離酵素がペプチド−Ｎ−グリカナーゼである前記の方法
である。

【００１３】また、本発明は前記植物がトマトまたはダ
イズである前記の方法である。また、本発明は、以下の
性質を示すトマト由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグル
コサミニダーゼである。 １．作用：ハイマンノース型糖鎖に存在するＧｌｃＮＡ
ｃβ１−４ＧｌｃＮＡ間のβ１−４結合を切断する。 ２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量：６３ｋＤ ３．至適反応ｐＨ：６.０ ４．至適反応温度：４０℃ ５．基質特異性：ハイマンノース型糖鎖を選択的に切断
するが、複合型糖鎖は切断しない。 ６．比活性：３（ユニット／Ａ２８０_nm）以上 以下、本発明の酵母由来のハイマンノース型糖タンパク
質が結合されたアフィニティークラマトグラフィー用担
体を、「リガンド結合担体」ということがある。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明のリガンド結合担
体、この担体を用いたＮ−グリカン遊離酵素の精製方
法、及び後記実施例においてこの方法により得られた新
規なエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ精製
酵素について、詳細に説明する。

【００１５】はじめに、リガンド結合担体について説明
する。 ＜１＞ハイマンノース型糖タンパク質が結合されたアフ
ィニティークラマトグラフィー用担体 まず、リガンド結合担体を作製するためにリガンドとし
て用いる酵母由来のハイマンノース型糖タンパク質につ
いて説明する。

【００１６】（１）酵母由来のハイマンノース型糖タン
パク質 本発明のリガンドとしては酵母由来のハイマンノース型
糖タンパク質を使用することができる。ハイマンノース
型は、Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−
４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（以下、「Ｍ３Ｇ
Ｎ２」ということがある）を基本骨格にして、この構造
に更に２〜６個のマンノース残基がα結合した糖鎖のも
のが好ましい。例えば、表１に示すような各種ハイマン
ノース型の糖鎖が例示できる。この中では、Ｍａｎα１
−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−
２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−
４ＧｌｃＮＡｃ（以下、「Ｍ６ＧＮ２」とういことがあ
る）が更に好ましい。

【００１７】尚、Ｍａｎはマンノースを、ＧｌｃＮＡｃ
はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを表す。

【００１８】

【表１】 尚、表１中、Ｍ７ＧＮの化合物は７個のマンノース残基
からなり、末端のＭａｎα１−２残基は、Ｍａｎα１−
６残基またはＭａｎα１−２残基の何れか一方とのみ結
合している。ハイマンノース型糖タンパク質全量中の糖
鎖の含有量は、効率良く目的とするＮ−グリカン遊離酵
素を精製するという点からは、５〜７０重量％であるが
好ましく、２０〜６０重量％であるが更に好ましく、特
に５０重量％程度であるのが好ましい。ここで、糖鎖の
含有量（％）とは、糖タンパク質全重量（タンパク質及
び糖鎖の重量の合計）に対する糖鎖の全重量を百分率で
表したものをいう。

【００１９】また、糖蛋白質中の蛋白質分子量は特に限
定されるものではないが、５万〜３０万であるのが好ま
しい。酵母由来のハイマンノース型糖タンパク質の中で
は、酵母由来のインベルターゼを使用するのが好まし
い。尚、酵母由来のインベルターゼは、Saccharomycesc
erevisiae由来の酵素についてはそのアミノ酸配列、糖
鎖の含有量も明かにされている。また、この酵素は市販
されているため入手可能である。

【００２０】酵母由来のインベルターゼは、適当な処理
により変性させてリガンドとして使用するのが、この酵
素に存在するアミノ酸官能基の影響を受けず目的の酵素
を精製できるという点からは好ましい。変性剤として
は、酵素に存在する糖鎖に影響を与えないものを広く使
用することができ、例えば、尿素、塩酸グアニジン等が
例示できる。酵母由来のインベルターゼは、変性された
酵素に限られず、各種の修飾剤により修飾された酵素を
使用してもよい。

【００２１】（２）リガンド結合担体の調製 上記のリガンドと結合させる担体の材料としては、アガ
ロース、架橋アガロース、架橋デキストラン、多孔性セ
ルロース、デンプン等の多糖類の誘導体、親水性ビニル
ポリマー、架橋ポリアクリルアミド等の重合体等の各種
樹脂があり、これらを使用することができる。これらの
樹脂の中では多糖類の誘導体が好ましく、アガロースま
たは架橋アガロースが更に好ましい。架橋アガロースと
しては、例えば、セファロース（ファルマシア社）等を
使用することができる。

【００２２】担体へのリガンドの結合方法は、例えば、
酵母インベルターゼを上述のように、必要に応じて変性
させたのち、活性化させた担体と結合させればよい。具
体的には、セファロースなどに隣接する−ＯＨ基をもつ
担体を臭化シアンで活性化させ、リガンドとする酵素中
のアミノ基と固定化させる方法が挙げられる。

【００２３】結合させる方法は特に限定されるものでは
なく、リガンドである酵素（例えば、酵母インベルター
ゼ）中のアミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、
スルフヒドリル基、イミダゾール基などを介してリガン
ドを固定化できるようにした官能基とこれらの官能基に
適当なスペーサーを入れた種々の担体が市販されている
ため、これらを適宜使用することで結合させることがで
きる。

【００２４】担体とリガンドとの比率は、担体１００重
量部に対してリガンド１〜２０重量部であるのが好まし
く、５〜１０重量部であるのが更に好ましい。このよう
にして作製されたリガンド結合担体を用いた、本発明の
アフィニティークロマトグラフィーは以下のように作用
するものと考えられる。

【００２５】本発明のリガンド結合担体が、Ｎ−グリカ
ン遊離酵素（以下「目的酵素」ということがある）の精
製に有効であるのは、結合させた糖タンパク質中の糖鎖
がリガンドとして作用するためであると考えられる。

【００２６】酵母インベルターゼは糖鎖の含有量が高く
（５０％）、糖鎖であるＮ−グリカンは全てエンドグリ
コシダーゼの基質となり得るハイマンノース型糖鎖であ
る。これにより、クロマトグラフィー中でリガンドとし
て機能する糖鎖の数が多くなり、目的酵素のクロマトグ
ラフィーの効率を高くすることができる。

【００２７】また、従来から、通常使用される「多糖と
担体」をカップリングさせたカラム担体では、リガンド
である多糖を担体の周りに張り付く様な配向を取る可能
性があり、リガンドとして用いた多糖が担体の外側に伸
張させるのが困難であった。

【００２８】一方、本発明のハイマンノース型糖タンパ
ク質を結合させたリガンド結合担体は、糖鎖が結合した
タンパク質をリガンドとして使用するため担体に結合し
た糖タンパク質中の糖鎖は必ず担体の外側に伸張するも
のと考えられる。このため、通常使用される「多糖と担
体」を使用して精製するよりも、本発明の「酵素と担
体」を使用して精製する方が、カップリング効率良く酵
素を精製することができる。

【００２９】そして、その結果作製されたリガンド結合
担体は目的の酵素と親和性のあるハイマンノース型糖鎖
を多く有するため、クロマトグラフィー中で目的の酵素
との親和性が高くなり、このリガンド結合担体を使用す
ることで効率よく目的酵素を精製できる。

【００３０】また、酵素をリガンドとして使用している
ので、ペプチド鎖が適当なスペーサーとなり、リガンド
と酵素の結合が容易となるものと考えられる。このよう
な理由から、本発明のクロマトグラフィーを使用するこ
とにより、容易にＮ−グリカン遊離酵素の高純度精製が
可能となる。＜２＞本発明のＮ−グリカン遊離酵素の精
製方法本発明のＮ−グリカン遊離酵素の精製方法は、植
物の組織からＮ−グリカン遊離酵素を精製する際に、上
記リガンド結合担体を用いたアフィニティークラマトグ
ラフィーを用いる工程を含むことを特徴とする。

【００３１】Ｎ−グリカン遊離酵素を含む植物は、Ｎ−
グリカン遊離酵素を有する限り特に限定されるものでは
ないが、例えばエンドウ、イチョウ、トマト、ダイズ、
ヒマ、インゲン等が好ましく、トマトまたはダイズが更
に好ましい。

【００３２】また、植物の組織は、Ｎ−グリカン遊離酵
素が含まれる限り特に制限されないが、例えば果実、種
子、根茎等の組織をいう。特に、Ｎ−グリカン遊離酵素
は果実、種子に多く含まれているため、これらの組織を
用いることが好ましい。

【００３３】本発明の方法においては、Ｎ−グリカン遊
離酵素の精製にリガンド結合担体を用いたアフィニティ
ークロマトグラフィーを用いる以外は、通常の酵素の精
製に用いられる方法を採用することができる。このよう
な通常用いられる方法としては、例えば物理的または化
学的な方法による組織の破砕、抽出、ゲル濾過クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロ
マトグラフィー等の各種クロマトグラフィー、塩析、溶
媒沈殿等の方法が挙げられる。

【００３４】従来知られているＮ−グリカン遊離酵素の
粗精製酵素は、上記のような方法を組み合わせることに
より得られたものであるが、Ｎ−グリカン遊離酵素はそ
の精製工程の途中、特に後半の工程で急激に活性が低下
し、最終的に殆ど分解されてしまうため、精製酵素は得
られていなかった。これは、Ｎ−グリカン遊離酵素が、
プロテアーゼ又は自身のプロテアーゼ活性により、分解
されてしまうものと推定される。

【００３５】本発明は、リガンド結合担体を用いたアフ
ィニィークロマトグラフィーを用いると、その工程及び
その後の工程における酵素の失活を非常に低減させるこ
とができることを見い出した結果、なされたものであ
る。

【００３６】上記のように、本発明の方法においては、
アフィニィークロマトグラフィーを、各種クロマトグラ
フィー、塩析、溶媒沈殿等の通常酵素の精製に用いられ
る方法と組み合わせて、Ｎ−グリカン遊離酵素の精製を
行う。これらの各種方法及びアフィニィークロマトグラ
フィーの工程の順序は、特に制限されないが、Ｎ−グリ
カン遊離酵素の失活又は分解を防ぐという観点からは、
精製工程の途中に用いることが好ましい。尚、後記実施
例においては、トマト果実の抽出液から、硫酸アンモニ
ウムを用いた塩析及び疎水クロマトグラフィーにより得
られた粗精製酵素をリガンド結合担体を用いたアフィニ
ィークロマトグラフィーにより分画し、さらに陽イオン
交換クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラ
フィーにより、精製されたＮ−グリカン遊離酵素が得ら
れた。

【００３７】尚、精製に用いる各手段の種類及び順序
は、精製途中の粗精製酵素の比活性を測定し、精製効率
あるいは酵素の失活、分解の程度を調べることにより、
適宜設定することができるが、精製過程の後半にアフィ
ニティークロマトグラフィーを用いることが好ましい。

【００３８】植物の組織からＮ−グリカン遊離酵素を抽
出するには、例えば植物の種子または果実等の組織に緩
衝液を加えて、ワーリングブレンダー、ポリトロンまた
は乳鉢と乳棒等で破砕して、抽出液を回収することによ
って行うことができる。この抽出液から、必要に応じ
て、ヘキサデシルピリジニウムクロリドによる沈殿、あ
るいは硫酸アンモニウムによる塩析等により、粘着質等
の不要物を除去することにより、粗酵素液を得ることが
できる。

【００３９】次に、リガンド結合担体を用いたアフィニ
ティークラマトグラフィーについて説明する。本発明の
アフィニティークロマトグラフィーは、アフイニティー
リガンドとして、ハイマンノース型糖タンパク質を用い
る以外は、通常のアフィニティークロマトグラフィーと
同様に行えばよく、カラム法、バッチ法のいずれの方法
でもよい。

【００４０】クロマトグラフィーの具体的方法について
以下説明する。カラム法では、上記のリガンド結合担体
を充填したカラムに酵素を含む溶液を通液してカラム中
の担体に吸着させた後、洗浄し、その後、カラムに溶出
液を流して担体に吸着した酵素を溶出させる。カラムの
形状等は特に限定されない。

【００４１】バッチ法では、容器中で酵素を含む溶液と
リガンド結合担体を混合し、担体に酵素を吸着させた後
に、濾過、デカンテーション等により担体と溶液を分離
し、酵素の吸着した担体を別の溶出液と混合して担体に
結合した酵素を溶出させる。

【００４２】クロマトグラフィーの吸着及び溶出の条件
は、吸着時にハイマンノース糖鎖と酵素の間で結合が形
成されやすい条件を、溶出時にそれを破壊する条件を設
定すればよい。

【００４３】これらの条件は、適宜吸着、溶出条件に変
更を加えて、酵素が失活、分解しない条件下で、精製結
果を調べることにより、最適な条件を決定することがで
きる。

【００４４】酵素の溶出は、イオン強度の増強、ｐＨの
変化、リガンドと拮抗する物質の添加などの方法で行う
ことができるが、イオン強度を増強させて溶出させるの
が好ましい。溶出の際のイオン強度は、０.００１〜４
Ｍであるのが好ましく、０.１〜１Ｍであるのが更に好
ましい。

【００４５】本発明の方法によるＮ−グリカン遊離酵素
の精製は酵素の安定性を考慮すると、ｐＨ４.０〜７．
５で行うのが好ましく、ｐＨ５.５〜７.０で行うのが更
に好ましい。

【００４６】本発明の方法により精製するＮ−グリカン
遊離酵素としては、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサ
ミニダーゼ（以下「エンドグリコシダーゼ」ということ
がある）が挙げられる。

【００４７】また、本発明の精製方法は、植物由来のペ
プチド−Ｎ−グリカナーゼ（以下「グリコアミダーゼ」
ということがある）の精製にも同様に適用できる。この
際、各精製工程における活性画分の測定はグリコアミダ
ーゼの活性を測定することにより行う。

【００４８】＜３＞本発明のエンドグリコシダーゼ 本発明のエンドグリコシダーゼは、以下に示す性質を有
する。 １．作用：ハイマンノース型糖鎖に存在するＧｌｃＮＡ
ｃβ１−４ＧｌｃＮＡ間のβ１−４結合を切断する。 ２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量：６３ｋＤ ３．至適反応ｐＨ：６.０ ４．至適反応温度：４０℃ ５．基質特異性：ハイマンノース型糖鎖を切断するが、
複合型糖鎖は切断しない。

【００４９】複合型糖鎖とは、ハイマンノース型糖鎖の
構造に、キシロース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサ
ミンまたはガラクトース残基が結合した糖鎖をいう。
尚、ここで、「複合型糖鎖は切断しない」とは、ほとん
どの複合型糖鎖を切断しないことを意味し、本発明の酵
素によって切断される複合型糖鎖が存在しないことを意
味するものではない。 ６．比活性：３（ユニット／Ａ２８０_nm）以上 ここで、Ａ２８０_nmは、酵素溶液の２８０ｎｍにおける
吸光度を示す。

【００５０】また、酵素１ユニットは、３７℃で１分間
に１ｎｍｏｌのＭ６Ｂ：（Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１
−３）Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−
３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ
−ＰＡ）を加水分解する量である。尚、エンドグリコシ
ダーゼの活性は、実施例で記載した方法により酵素活性
を求めることができる。

【００５１】本発明のエンドグリコシダーゼは、粗精製
酵素は知られていたが、高純度に精製された酵素は知ら
れていなかった。そのため、この酵素のｃＤＮＡ配列、
アミノ酸配列等は知られていない。

【００５２】本発明の方法により、はじめて、比活性が
３.０以上の高純度に精製されたエンドグリコシダーゼ
を得ることができる。本発明の方法を使用して精製され
た酵素は純度が高いため、アミノ酸配列の決定、ｃＤＮ
Ａの決定等の各種解析に使用することができる。また、
精製した酵素は、ハイマンノース型糖鎖を選択的に切断
するため、植物におけるハイマンノース型糖鎖の機能等
の解析に利用することができる。

【００５３】

【実施例】以下実施例により、本発明を更に具体的に説
明する。

【００５４】

【実施例１】インベルターゼ・セファロースカラムの作
製 酵母（Saccharomyces cerevisiae）のインベルターゼ
(グレード VII)はシグマ社から購入した。Crestfieldら
の手法（J.Biol.Chem.238,622-627,1963）に従って、還
元カルボキシメチル化（アルキル化）されたインベルタ
ーゼを作製した（モノヨード酢酸にてカルボキシメチル
化した）。アルキル化されたインベルターゼ(cm-YI)を
脱イオン水で透析処理を行った。次に、Axenらの手法
（Nature 214,1302-1304）に従って、臭化シアン法によ
り活性化したセファロース４Ｂ（ファルマシア）にアル
キル化インベルターゼをカップリングさせた。そして、
１ｍｌのゲル中に１４ｍｇのインベルターゼを固定化し
たリガンド結合担体を得た。この担体をカラムにつめイ
ンベルターゼ・セファロースカラム（２．８×４０ｃ
ｍ）を作製した。

【００５５】

【実施例２】トマト果実からエンドグリコシダーゼの精
製 トマトから以下の方法により、エンドグリコシダーゼを
精製した。 （１）硫酸アンモニウム（１００％飽和）塩析 トマトは、カゴメ９４１(Lycopersicon esculetum Mil
l. Cov. Kagome 941）の緑熟期トマト果実を使用した。
緑熟期トマト果実１５.７ｋｇを２０Ｌの５０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、０.２ＭＮａＣｌバッファー、ｐＨ７．
５中ですりつぶした後、４℃で２時間攪拌した。次にガ
ーゼで濾し、ろ液に０.１％のヘキサデシルピリジニウ
ムクロリド（１水和物）を加えて、４℃で１晩放置する
ことで粘着質(mucilage)を沈殿させた。遠心して上清を
回収した後、硫酸アンモニウム（固体）を混ぜながら添
加していき、１００％飽和化させた。そして、生じた凝
集物を粗酵素として回収した。尚、酵素の精製ステップ
はすべて４℃の環境にて行った。

【００５６】（２）ブチルトーヨーパール（東ソー）カ
ラムクロマトグラフィー 上記の粗酵素を、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファ
ー、ｐＨ７.５で溶解した後、同様のバッファーで透析
した。遠心して上清を回収し酵素溶液とした。次に最終
濃度で２.０Ｍとなるように硫酸アンモニウムをこの酵
素溶液に添加し、２.０Ｍ硫酸アンモニウム、５ｍＭＤ
ＤＴ、５０ｍＭショ糖を含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
バッファー、ｐＨ７.５で平衡化したＴＳＫブチルトー
ヨーパール６５０Ｍカラムに供与した後、濃度勾配溶出
（２.０Ｍ〜０Ｍ硫酸アンモニウム）により酵素活性画
分を回収した（０.５Ｍ近辺の濃度で活性画分が溶出さ
れた）。

【００５７】（３）インベルターゼ・セファロースアフ
ィニティークロマトグラフィー バッファー（２０ｍＭＭＥＳｐＨ６.５）で平衡化した
インベルターゼ・セファロースカラム（２.８×４０ｃ
ｍ）に、前のステップの粗精製酵素画分を供与した。次
にカラムを同様のバッファーで洗浄した後、ＮａＣｌに
よる濃度勾配溶出（０〜０.２Ｍ）にて溶出し、酵素活
性画分を回収した。なお、インベルターゼ・セファロー
スカラムは実施例１で作製したカラムを使用した。イン
ベルターゼ・セファロースアフィニティークロマトグラ
フィーの溶出パターンを図１に示す。

【００５８】（４）Ｑ−セファロース（ファルマシア）
カラムクロマトグラフィー 上記の酵素活性画分を、５０ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、バッファー、ｐＨ７.５で透析し
酵素溶液とした。この酵素溶液を５０ｍＭＮａＣｌを含
む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、バッファーｐＨ７．５で
平衡化したＱ−セファロースＦＦカラム（２.８×３３
ｃｍ）に供与した後、同様のバッファーで洗浄した。次
に濃度勾配溶出（５０ｍＭ〜０.３ＭＮａＣｌ）により
酵素活性画分を回収した。

【００５９】（５）ＤＥＡＥ−５ＰＷカラムクロマトグ
ラフィー 上記の酵素活性画分を、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッ
ファー、ｐＨ７.５で平衡化したＤＥＡＥ−５ＰＷカラ
ムに供与した。カラムを２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッ
ファー、ｐＨ７.５で洗浄した後、０.１ＭＮａＣｌを含
む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７.５で
酵素を溶出し、酵素活性画分を回収した。

【００６０】（６）エンドグリコシダーゼの活性測定 エンドグリコシダーゼの活性は以下のようにして測定し
た。基質としてＭ６Ｂ：（Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１
−３）Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−
３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ
−ＰＡ）を用いた。また、内部スタンダードとしてＭ３
ＦＸ：（Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）（Ｘｙｌβ
１−２）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４（Ｆｕｃ
α１−３）ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ）を用いた。酵素溶液
（１０μｌ）に対して、Ｍ６Ｂ１００ｐｎｏｌ、Ｍ３Ｆ
Ｘ７０ｐｍｏｌ、５ｍＭＤＤＴ、８０μＭ sawainsonin
eを含む０.１ＭＭＥＳバッファー、ｐＨ６.５６０μｌ
と混合し、３７℃で３０分反応させた。反応は１００℃
で３分熱処理を行って停止した。遠心後、１０μｌをＨ
ＰＬＣ分析にかけて解析した。ＨＰＬＣ分析はジャスコ
８８０−ＰＵＨＰＬＣ装置（ジャスコインテリジェント
スペクトロフルオロメーター装備）を使用し、カラムは
アサヒパックＮＨ２Ｐ−５０カラム（０.４６×２５ｃ
ｍ）を使用した。目的とするＰＡ糖鎖は溶液（アセトニ
トリル／水）の水比率を４５〜５０％とすることで溶出
された（流速０.８ｍｌ／分）。検出はスペクトロフル
オロメーターを使用し、３１０ｎｍ波長光照射による３
２０ｎｍ波長光の蛍光を測定することにより行った。酵
素１ユニットは、３７℃で１分間に１ｎｍｏｌの基質を
加水分解する量とした。尚、Ｘｙｌはキシロースを表
す。

【００６１】（７）結果 酵素の精製結果を表２に示す。また、従来からの、本発
明のインベルターゼ・セファロースカラムを使用しない
場合の精製結果を表３に示す。

【００６２】

【表２】

【００６３】

【表３】 本発明の精製方法により、硫酸アンモニウムで塩析した
粗酵素の比活性を１７００倍に精製することができた。
従来の方法の場合、同様の硫酸アンモニウムで塩析した
粗酵素の比活性を３６４倍にしか精製できなかった。即
ち、本発明の方法により、精製度を約４倍上昇させるこ
とができた。

【００６４】また、本発明のインベルターゼ・セファロ
ースカラムを使用した精製工程は、この精製工程単独
で、比活性を４.２倍上昇させた。そして、この工程は
酵素回収率が９７％と極めて高く、この工程中で酵素活
性の大部分が維持されることがわかった。

【００６５】更に、本願発明の方法により精製された酵
素の活性は、従来法により精製した酵素に比べてより安
定であることがわかった。従来法により精製された酵素
は、０℃で保存すると１ヶ月後には、活性が無くなっ
た。一方、本願発明の方法により精製された酵素は、同
様の温度条件で保存した場合１ヶ月後でも、活性の６０
〜７０％が維持された。

【００６６】精製された酵素はＳＤＳ-ＰＡＧＥ後、銀
染色により、高純度に精製されたものと推定した。精製
酵素の比活性を測定したところ、６．０（ユニット／Ａ
２８０_nm）であった。精製されたエンドグリコシダーゼ
の性質を以下に示す。 １．ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量：６３kD ２．至適反応ｐＨ：６.０ ３．至適反応温度：４０℃ ４．基質特異性：ハイマンノース型糖鎖を選択的に切断
するが、複合型糖鎖は切断しない。

【００６７】

【実施例３】イチョウ種子からのエンドグリコシダーゼ
の精製 トマトの場合と同様に、イチョウ果実からエンドグリコ
シダーゼを以下の方法により精製した。 （１）硫酸アンモニウム（８０％飽和）塩析 脂肪成分を除去したイチョウ（Gingo bilioba)種子粉末
３２５.２５ｇを２．５Ｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、０.２ＭＮａＣｌバッファー、ｐＨ７.５中ですりつ
ぶした後、４℃で２時間攪拌した。次にガーゼで濾し、
ろ液に０.１％のヘキサデシルピリジニウムクロリド
（１水和物）を加えて、４℃で１晩放置することで粘着
質（mucilage）を沈殿させた。遠心して上清を回収した
後、硫酸アンモニウム（固体）を混ぜながら添加してい
き、８０％飽和化させた。生じた凝集物を粗酵素として
回収した。尚、酵素の精製ステップはすべて４℃の環境
にて行った。

【００６８】（２）ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマ
トグラフィー 上記の粗酵素（凝集物）を２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバ
ッファー、ｐＨ７.５に溶解し、同様のバッファーで透
析した。遠心して上清を回収し、２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌバッファー、ｐＨ７.５で平衡化したＤＥＡＥ−セ
ルロースカラムに供与した。カラムを２０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７.５および０.１ＭＮａＣｌ
を含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７.
５で洗浄した後、０．１ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７.５で粗酵素を溶出し
た。

【００６９】（３）ブチルトーヨーパール（東ソー）カ
ラムクロマトグラフィー 最終濃度２.０Ｍとなるように硫酸アンモニウムを上記
の酵素溶液に添加し、２．０Ｍ硫酸アンモニウム、５ｍ
ＭＤＤＴ、５０ｍＭショ糖を含む２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌバッファー、ｐＨ７.５で平衡化したＴＳＫブチル
トーヨーパール６５０Ｍカラムに供与した後、濃度勾配
溶出（２.０Ｍ〜０Ｍ硫酸アンモニウム）により酵素活
性画分を回収した（０.５Ｍ近辺の濃度で活性画分が溶
出された）。

【００７０】（４）セファクリルＳ−３００（Ｈｉｐｒ
ｅｐＳ−３００）（ファルマシア）カラムクロマトグラ
フィー クロマトグラフィーはジャスコ−ＰＵＨＰＬＣ機（検出
機ジャスコインテリジェントＵＶ／ＶＩＳ（８７０Ｕ
Ｖ）を装備したもの）を利用し、２本のＨｉｐｒｅｐＳ
−３００（１.６×１２０ｃｍ）を使用した。カラムは
５０ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６.８で
平衡化した。上記の酵素溶液をカラムに供与し、同様の
バッファーで流速０.５ｍｌ／分で溶出させ、酵素精製
画分を得た。酵素画分の同定は吸光度（２３０ｎｍ）に
てモニターした。

【００７１】（５）インベルターゼ・セファロースアフ
ィニティークロマトグラフィー バッファー（２０ｍＭＭＥＳｐＨ６.５）で平衡化した
インベルターゼ・セファロースカラム（２.８×４０ｃ
ｍ）に、前のステップの粗精製酵素画分を供与した。次
にカラムを同様のバッファーで洗浄した後、ＮａＣｌに
よる濃度勾配溶出（０〜０.２Ｍ）にて溶出した。な
お、インベルターゼ・セファロースカラムは実施例１で
作製したカラムを使用した。インベルターゼ・セファロ
ースアフィニティークロマトグラフィーの溶出パターン
を図２に示す。

【００７２】（６）結果 精製結果を表４に示す。

【表４】 本発明の精製方法により、硫酸アンモニウムで塩析した
粗酵素を２０３倍製することができた。

【００７３】また、本発明のインベルターゼ・セファロ
ースカラムを使用した精製工程は、この精製工程単独
で、比活性を３.８倍上昇させた。そして、この工程は
酵素回収率が９４％と極めて高く、この工程中で酵素活
性の大部分が維持されることがわかった。

【００７４】

【発明の効果】本発明により、Ｎ−グリカン遊離酵素を
高い回収率で精製できるアフィニィークロマトグラフィ
ーを提供することができる。そして、このアフィニィー
クロマトグラフィーを使用することで、高い回収率で、
高純度にＮ−グリカン遊離酵素を精製することができ
る。このようにして精製された酵素は、高純度精製品で
あり、活性が安定であるため、酵素の解析に使用でき、
また一定期間保存が可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 トマト果実由来のエンドグリコシダーゼのイ
ンベルターゼ・セファロースアフィニティークロマトグ
ラフィーの溶出パターンを示す図。

【図２】 イチョウ種子由来のエンドグリコシダーゼの
インベルターゼ・セファロースアフィニティークロマト
グラフィーの溶出パターンを示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｒ

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ハイマンノース型糖タンパク質が結合さ
   れたアフィニティークラマトグラフィー用担体。
2. 【請求項２】 前記ハイマンノース型糖タンパク質が酵
   母由来であることを特徴とする請求項１記載の担体。
3. 【請求項３】 前記酵母由来のハイマンノース型糖タン
   パク質がインベルターゼである請求項２に記載の担体。
4. 【請求項４】 植物の組織からＮ−グリカン遊離酵素を
   精製する方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に
   記載の担体を用いたアフィニティークラマトグラフィー
   を用いる工程を含むことを特徴とするＮ−グリカン遊離
   酵素の精製方法。
5. 【請求項５】 前記Ｎ−グリカン遊離酵素がエンド−β
   −Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである請求項４に記
   載の方法。
6. 【請求項６】 前記Ｎ−グリカン遊離酵素がペプチド−
   Ｎ−グリカナーゼである請求項４に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記植物が、トマトまたはダイズである
   請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 【請求項８】 以下の性質を示すトマト由来のエンド−
   β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ。 １．作用：ハイマンノース型糖鎖に存在するＧｌｃＮＡ
   ｃβ１−４ＧｌｃＮＡ間のβ１−４結合を切断する。 ２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量：６３ｋＤ ３．至適反応ｐＨ：６.０ ４．至適反応温度：４０℃ ５．基質特異性：ハイマンノース型糖鎖を選択的に切断
   するが、複合型糖鎖は切断しない。 ６．比活性：３（ユニット／Ａ２８０_nm）以上