JP2000065837A - Measurement of glycosaminoglycan or glycosaminoglycan bonding molecule and measurement kit thereof - Google Patents
Measurement of glycosaminoglycan or glycosaminoglycan bonding molecule and measurement kit thereofInfo
- Publication number
- JP2000065837A JP2000065837A JP10237738A JP23773898A JP2000065837A JP 2000065837 A JP2000065837 A JP 2000065837A JP 10237738 A JP10237738 A JP 10237738A JP 23773898 A JP23773898 A JP 23773898A JP 2000065837 A JP2000065837 A JP 2000065837A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glycosaminoglycan
- gag
- lipid
- carrier
- binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、被検体中に含有さ
れるグリコサミノグリカン又はグリコサミノグリカン結
合性分子の測定方法及びその測定用キットに関する。The present invention relates to a method for measuring glycosaminoglycan or a glycosaminoglycan-binding molecule contained in a subject and a kit for measuring the same.
【0002】[0002]
【従来の技術】グリコサミノグリカン(以下GAGとも云
う)はヘキソサミンを含む二糖繰り返し構造を基本骨格
とする多糖体の総称であり、多くはウロン酸を構成糖と
し、糖の水酸基に硫酸基が置換していることが多く、酸
性の多糖体を構成する。また、天然ではヒアルロン酸以
外のGAGは、いろいろな種類の蛋白質に一本ないし数
百本結合した構造を取っており、その糖−蛋白結合体を
プロテオグリカンと総称している。蛋白質部分をコア蛋
白質と呼び、そのセリン残基に結合領域と呼ばれる4糖
が、キシロース、ガラクトース、ガラクトース、グルク
ロン酸の順に結合し、そこから前述の二糖繰り返し構造
が数糖から数千糖繋がったGAG鎖が結合している。しか
し実際には、単一な繰り返し二糖構造を取っているので
はなく、硫酸基の位置、硫酸基の置換数、ウロン酸のエ
ピメリ化の度合い(グルクロン酸とイズロン酸の割
合)、分子量など、動物種、組織、年齢、疾患などによ
り変動する。一つのプロテオグリカン分子においてさ
え、GAG鎖は多様な構造を取っている。BACKGROUND ART Glycosaminoglycans (hereinafter also referred to as GAGs) are a general term for polysaccharides having a basic skeleton of a repeating disaccharide structure containing hexosamine. Many of them are composed of uronic acid as a constituent sugar, and a sulfate group is added to a hydroxyl group of the sugar. Are often substituted to form an acidic polysaccharide. Naturally, GAGs other than hyaluronic acid have a structure in which one or several hundreds of GAGs are bound to various kinds of proteins, and their sugar-protein conjugates are collectively referred to as proteoglycans. The protein part is called a core protein, and a tetrasaccharide called a binding region is bonded to the serine residue in the order of xylose, galactose, galactose, and glucuronic acid, from which the disaccharide repeating structure described above is linked to several to several thousand sugars. GAG chains are bound. However, in reality, it does not have a single repeating disaccharide structure, but rather the position of the sulfate group, the number of substitutions of the sulfate group, the degree of epimerization of uronic acid (the ratio of glucuronic acid to iduronic acid), molecular weight, etc. , Animal species, tissue, age, disease and the like. Even in one proteoglycan molecule, the GAG chain has various structures.
【0003】この様な多様なGAG構造は、発生や老化、
癌化やアルツハイマーなどの病変により変化することが
知られており、生命現象と密接な繋がりがあると考えら
れている。特に特異的なGAGの微細構造が、特定の蛋白
質と特異的に結合することが最近知られるようになり、
注目されている。つまり、GAG鎖には特異的微細構造が
存在し、その微細構造に特異的に作用する生理活性蛋白
質が結合することで、重要な生理活性が育まれていると
考えられている。従って、GAG鎖の多様な構造を区別
して、GAG鎖を測定することは臨床的にも非常に重要で
ある。実際、血中や組織中の各種GAG鎖の変動が疾患
(関節炎、肝炎、腎炎、アルツハイマー、癌、皮膚炎、
炎症、分娩など)と密接に関連していることが知られて
いる。例えば、関節炎や肝硬変においては血中ヒアルロ
ン酸濃度が上昇することや、腎炎や糖尿病、アルツハイ
マーや癌化によりある種のヘパラン硫酸が変動すること
などが云われている。[0003] Such various GAG structures are generated, aged,
It is known that it changes due to lesions such as canceration and Alzheimer's disease, and is considered to be closely related to life phenomena. In particular, it has recently become known that a specific GAG ultrastructure specifically binds to a specific protein.
Attention has been paid. In other words, it is thought that the GAG chain has a specific fine structure, and important bioactivity is cultivated by binding of a bioactive protein that specifically acts on the fine structure. Therefore, it is very important clinically to measure the GAG chain while distinguishing various structures of the GAG chain. In fact, fluctuations of various GAG chains in blood and tissues can cause diseases (arthritis, hepatitis, nephritis, Alzheimer, cancer, dermatitis,
(Inflammation, parturition, etc.). For example, in arthritis and cirrhosis, it is said that the concentration of hyaluronic acid in the blood increases, and that certain heparan sulfate changes due to nephritis, diabetes, Alzheimer's disease, and canceration.
【0004】一方、グリコサミノグリカンの還元末端に
リン脂質であるホスファチジルエタノールアミン(P
E)を共有結合で結合させる方法が開発され(特開平4-
80201、 J.Biol.Chem.(1993) 268, 15779-15787)、更
に、このリン脂質結合グリコサミノグリカン誘導体(以
下GAG-PEとも記す)に関しては、プラスチック製培養皿
に培養基質として固相化させて肝細胞を培養し、球状集
塊化(スフェロイド化)して、人工肝臓等を作成するた
めに用いられたり(特開平5-236951)、ヒアルロン酸
(HA)に対する抗体を作る為に、抗原としてHAとホ
スファチジルエタノールアミンが共有結合したHA−ホ
スファチジルエタノールアミンでマウスを免疫したり、
免疫したマウスの血清中に存在する抗体の力価測定の為
に、HA−ホスファチジルエタノールアミンを蒸留水に
溶解した物を抗原液として用いたりされた例(特開平9-
12600)がある。又、このリン脂質結合グリコサミノグ
リカン誘導体は、血管壁や関節軟骨などの組織、細胞表
面などに疎水的に結合し、様々な生物・薬理活性を示す
ことも知られている(特開平4-80201、特開平4-80202、
特開平4-82836、特開平6-72893)。更に、グリコサミノ
グリカンの一種であるヒアルロン酸を直接固相化し、検
体中のヒアルロン酸を測定する方法(特開平63-15066
9、Cancer Research 57,773-777,February 15, 1997)
も既に知られているが、上記何れも、脂質結合グリコサ
ミノグリカンの脂質残基部位で固体表面に結合させてグ
リコサミノグリカンを固相化し、GAG又はGAG結合
性分子の測定を目的として利用したとの記載は無い。On the other hand, phosphatidylethanolamine (P) is a phospholipid at the reducing end of glycosaminoglycan.
E) was developed by covalent bonding
80201, J. Biol. Chem. (1993) 268, 15779-15787), and the phospholipid-bound glycosaminoglycan derivative (hereinafter, also referred to as GAG-PE) is solid-phased as a culture substrate in a plastic culture dish. Culturing and culturing hepatocytes and using them to make spherical agglomerates (spheroidization) to create artificial livers etc. (Japanese Patent Laid-Open No. 5-236951) or to produce antibodies against hyaluronic acid (HA) Immunizing mice with HA-phosphatidylethanolamine in which HA and phosphatidylethanolamine are covalently bound as antigens,
An example in which a product obtained by dissolving HA-phosphatidylethanolamine in distilled water was used as an antigen solution in order to measure the titer of an antibody present in the serum of an immunized mouse (Japanese Patent Application Laid-Open No.
12600). It is also known that this phospholipid-linked glycosaminoglycan derivative is hydrophobically bound to tissues such as blood vessel walls and articular cartilage, cell surfaces, etc., and exhibits various biological and pharmacological activities (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 4 -80201, JP-A-4-80202,
JP-A-4-82836, JP-A-6-72893). Furthermore, a method for directly immobilizing hyaluronic acid, which is a kind of glycosaminoglycan, and measuring hyaluronic acid in a sample (JP-A-63-15066)
9, Cancer Research 57,773-777, February 15, 1997)
Although all of the above are known, any of the above-mentioned methods is used for immobilizing glycosaminoglycan by binding to a solid surface at a lipid residue site of lipid-bound glycosaminoglycan and measuring GAG or a GAG-binding molecule. There is no mention that it was used.
【0005】血中など体液のGAG濃度を測定して診断に
役立てる試みは種々行われており、ヒアルロン酸では実
際に診断薬として市販されているものもある。これらの
多くはGAG結合蛋白質や抗GAG抗体をELISA等
の免疫測定用プレートに塗布し、これにGAGを含む検
体を反応させ、その固定化GAG結合性分子に結合した
GAGをさらに別の標識したGAG結合性分子と結合さ
せることで、検体中のGAG濃度を測定する方法が一般
的である(参照:特公平6-41952)。また、ヒアルロン
酸をプレートに直接塗布する試みもなされているが、高
分子のヒアルロン酸を高濃度溶液で処理することでプレ
ートに吸着させ、このプレートに吸着したヒアルロン酸
と検体中のヒアルロン酸をヒアルロン酸結合蛋白(HA
BP)のヒアルロン酸結合領域に対して競合反応させ、
ヒアルロン酸濃度を測定している(A.J.Fosang etal.,
Matrix, (1990) 10, 306-313)。[0005] Various attempts have been made to measure the GAG concentration in body fluids such as blood to assist in diagnosis, and some hyaluronic acids are actually marketed as diagnostic agents. In many of them, a GAG-binding protein or an anti-GAG antibody is applied to an immunoassay plate such as an ELISA, and a sample containing GAG is reacted therewith, and GAG bound to the immobilized GAG-binding molecule is further labeled. A method of measuring the concentration of GAG in a sample by binding to a GAG-binding molecule is generally used (see Japanese Patent Publication No. 6-41952). Attempts have also been made to apply hyaluronic acid directly to the plate.However, high-molecular-weight hyaluronic acid is treated with a high-concentration solution to be adsorbed on the plate, and the hyaluronic acid adsorbed on this plate and the hyaluronic acid in the sample are removed. Hyaluronic acid binding protein (HA
BP) with a hyaluronic acid binding region,
Hyaluronic acid concentration is measured (AJ Fosang et al.,
Matrix, (1990) 10, 306-313).
【0006】ただ、前者の方法は感度が比較的良い反
面、GAG鎖の分子量に測定結果が大きく依存し、比較
的低分子のGAGは極めて反応性が悪くなる欠点を持
ち、後者の直接ヒアルロン酸をプレートに塗布する方法
では高分子ヒアルロン酸を非特異的吸着現象を利用して
プレートに吸着させており(実際はヒアルロン酸標品に
混在する蛋白質とプレートとの吸着と考えられてい
る)、吸着処理に高濃度(100μg/ml)のヒアルロン酸が
必要なことと、吸着量が安定せず結果のばらつきが多い
問題がある。また、比較的低分子の他のGAGでは同種
の処理をしても、まったくプレートへの吸着現象は見ら
れず、この方法で測定法は確立できない。Although the former method has relatively good sensitivity, the measurement result largely depends on the molecular weight of the GAG chain, and the relatively low-molecular GAG has a disadvantage that the reactivity is extremely poor. Is applied to the plate by using the non-specific adsorption phenomenon (actually, it is considered to be the adsorption of the protein mixed with the hyaluronic acid sample and the plate). There is a problem that a high concentration (100 μg / ml) of hyaluronic acid is required for the treatment, and the amount of adsorption is not stable and the results are often varied. In addition, even with other GAGs of relatively low molecular weight, even when the same type of treatment is performed, no adsorption phenomenon to the plate is observed at all, and a measurement method cannot be established by this method.
【0007】また、検体中に存在するGAGの構造を特
定乃至推定することは、病気の診断等に有益な情報を提
供することができるため、その簡易な解析方法が望まれ
ている。[0007] In addition, since specifying or estimating the structure of GAG present in a specimen can provide useful information for diagnosing a disease or the like, a simple analysis method is desired.
【0008】[0008]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、簡単な操作
で、安定して検体中のグリコサミノグリカン又はグリコ
サミノグリカン結合性分子を測定できる方法及びそれに
用いられるキットを提供することを目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a method for stably measuring glycosaminoglycan or a glycosaminoglycan-binding molecule in a sample by a simple operation, and a kit used therefor. Aim.
【0009】[0009]
【課題を解決するための手段】本発明は、以下の構成か
らなり、これにより上記課題を解決することができる。 1.担持体表面に脂質結合グリコサミノグリカンを固着
した担持体を用いることを特徴とするグリコサミノグリ
カン又はグリコサミノグリカン結合性分子の測定方法。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention comprises the following constitutions, which can solve the above-mentioned problems. 1. A method for measuring glycosaminoglycan or a glycosaminoglycan-binding molecule, comprising using a carrier having lipid-bound glycosaminoglycan immobilized on the surface of the carrier.
【0010】2.脂質結合グリコサミノグリカンが、グ
リコサミノグリカンの還元末端において脂質と共有結合
したものであることを特徴とする上記1記載のグリコサ
ミノグリカン又はグリコサミノグリカン結合性分子の測
定方法。 3.脂質結合グリコサミノグリカンを構成するグリコサ
ミノグリカンが、ヒアルロン酸又はコンドロイチン硫酸
であることを特徴とする上記1又は2記載のグリコサミ
ノグリカン又はグリコサミノグリカン結合性分子の測定
方法。[0010] 2. 2. The method for measuring glycosaminoglycan or a glycosaminoglycan-binding molecule according to 1 above, wherein the lipid-bound glycosaminoglycan is covalently bonded to a lipid at a reducing end of the glycosaminoglycan. 3. 3. The method for measuring a glycosaminoglycan or a glycosaminoglycan-binding molecule according to the above 1 or 2, wherein the glycosaminoglycan constituting the lipid-bound glycosaminoglycan is hyaluronic acid or chondroitin sulfate.
【0011】4.脂質結合グリコサミノグリカンを構成
するグリコサミノグリカンが、分子量3KDa〜200
KDaのヒアルロン酸であることを特徴とする上記1〜
3の何れか1項に記載のグリコサミノグリカン又はグリ
コサミノグリカン結合性分子の測定方法。 5.担持体に固着した脂質結合グリコサミノグリカンと
グリコサミノグリカン結合性分子とを反応させる工程を
含むことを特徴とする上記1〜4の何れか1項に記載の
グリコサミノグリカン又はグリコサミノグリカン結合性
分子の測定方法。4. The glycosaminoglycan constituting the lipid-bound glycosaminoglycan has a molecular weight of 3 kDa to 200 kDa.
The above-mentioned 1 characterized by being a hyaluronic acid of KDa
4. The method for measuring glycosaminoglycan or a glycosaminoglycan-binding molecule according to any one of the above items 3. 5. 5. The glycosaminoglycan or glycosamily according to any one of the above items 1 to 4, which comprises a step of reacting the lipid-bound glycosaminoglycan fixed to the carrier with a glycosaminoglycan-binding molecule. A method for measuring a noglycan binding molecule.
【0012】6.グリコサミノグリカン結合性分子が、
抗グリコサミノグリカン抗体又はグリコサミノグリカン
結合蛋白質である上記1〜4の何れか1項に記載のグリ
コサミノグリカン又はグリコサミノグリカン結合性分子
の測定方法。 7.グリコサミノグリカン結合性分子が、標識物質で直
接標識されたものであるか、又は標識物質で間接的に標
識されうるものである上記1〜4の何れか1項に記載の
グリコサミノグリカン又はグリコサミノグリカン結合性
分子の測定方法。6. Glycosaminoglycan binding molecule,
The method for measuring a glycosaminoglycan or a glycosaminoglycan-binding molecule according to any one of the above items 1 to 4, which is an anti-glycosaminoglycan antibody or a glycosaminoglycan-binding protein. 7. The glycosaminoglycan according to any one of the above items 1 to 4, wherein the glycosaminoglycan-binding molecule is one that is directly labeled with a labeling substance or that can be indirectly labeled with a labeling substance. Or a method for measuring a glycosaminoglycan binding molecule.
【0013】8.担持体表面に脂質結合グリコサミノグ
リカンを固着した担持体を含むことを特徴とするグリコ
サミノグリカン又はグリコサミノグリカン結合性分子質
の測定用キット。 9.測定対象グリコサミノグリカンに脂質を結合させる
ための試薬と、脂質結合グリコサミノグリカンを固着さ
せるための担持体とを少なくとも含むグリコサミノグリ
カン測定用キット。8. A kit for measuring glycosaminoglycan or a glycosaminoglycan-binding molecule, comprising a carrier having a lipid-bound glycosaminoglycan fixed to the surface of the carrier. 9. A glycosaminoglycan measurement kit comprising at least a reagent for binding a lipid to a glycosaminoglycan to be measured and a carrier for fixing the lipid-bound glycosaminoglycan.
【0014】10.コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸
抗体、ケラタン硫酸、又はこれらの分解物に対する抗体
を更に含む上記9記載のグリコサミノグリカン測定用キ
ット。 11.担持体表面に脂質結合グリコサミノグリカンを固
着した担持体からなることを特徴とするグリコサミノグ
リカン結合性分子の解析又は検索用プローブ。10. 10. The glycosaminoglycan measurement kit according to the above 9, further comprising an antibody against chondroitin sulfate, heparan sulfate antibody, keratan sulfate, or a degradation product thereof. 11. A probe for analyzing or retrieving glycosaminoglycan-binding molecules, comprising a carrier having lipid-linked glycosaminoglycans fixed to the surface of the carrier.
【0015】本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭
意検討を重ねた結果、脂質結合グリコサミノグリカンを
用いると、GAGをELISA用プレート等の担持体に
効率よく固着でき、GAG結合性物質(GAG結合蛋白
質、抗GAG抗体等)と組み合わせることで、安定で感度
良くGAG又はGAG結合性分子を測定することがで
き、更にGAGが解析できることを見出した。特に、低
分子GAGに脂質を結合させる事により、プレート等へ
の担持体に効率よく固着できようになることを見出し
た。The present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems. As a result, the use of lipid-linked glycosaminoglycans allows GAG to be efficiently fixed to a carrier such as an ELISA plate, and the GAG binding property is improved. By combining with a substance (such as a GAG-binding protein or an anti-GAG antibody), it has been found that GAG or a GAG-binding molecule can be measured stably and with high sensitivity, and that GAG can be analyzed. In particular, it has been found that by attaching a lipid to low-molecular-weight GAG, it becomes possible to efficiently adhere to a carrier such as a plate.
【0016】[0016]
【発明の実施の形態】以下に本発明を実施の形態により
詳述する。本発明において「グリコサミノグリカン又は
グリコサミノグリカン結合性分子の測定」とは、既知の
グリコサミノグリカン又はグリコサミノグリカン結合性
分子を定量的又は定性的に測定することだけでなく、そ
の種類、結合性等が未知のグリコサミノグリカン又はグ
リコサミノグリカン結合性分子を、それと結合する可能
性のある複数の既知のグリコサミノグリカン結合性分子
又はグリコサミノグリカンを用いて、解析したり、検索
することも包含する概念として使用する。DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The present invention will be described below in detail with reference to embodiments. In the present invention, `` measurement of glycosaminoglycan or glycosaminoglycan binding molecule '' means, not only quantitatively or qualitatively measuring a known glycosaminoglycan or glycosaminoglycan binding molecule, The type, binding property, etc. of unknown glycosaminoglycan or glycosaminoglycan-binding molecule, using a plurality of known glycosaminoglycan-binding molecules or glycosaminoglycans that may bind thereto, It is used as a concept that includes analysis and search.
【0017】また、本発明において、「グリコサミノグ
リカン結合性分子」と「グリコサミノグリカン結合分
子」は、同様の概念を表す用語として使用するものと
し、具体的には、抗ヘパラン硫酸抗体、抗コンドロイチ
ン硫酸抗体、抗ケラタン硫酸抗体等、グリコサミノグリ
カン又はそのフラグメントを動物に免役して得られ、こ
れらに対して特異的な結合親和性を示す免役グロブリン
である抗GAG抗体;あるいはヒアルロン酸と結合性を
有するヒアルロン酸結合蛋白(HABP;ヒアルロン酸
結合領域)や、CD44及び、ヘパラン硫酸/ヘパリン
と結合性を有する繊維芽細胞増殖因子(FGF)、肝実
質細胞増殖因子(HGF)等、GAGに対して結合親和
性を示すが、抗体ではないがGAG結合蛋白質を包含す
る。本発明は、脂質結合グリコサミノグリカン(以下、
「L−GAG」とも記す)を、免役測定用のプレート、
ビース、ゲル、チューブ、ストリップ、膜等の担持体に
脂質残基をアンカー分子として働かせることにより結合
させたプレートを用いて、検体中のGAG又はGAG結
合性分子を測定する方法及びその測定用キットを提供す
るものである。また、該L−GAGを固着させた担持体
は、新規なGAG結合性分子の解析、検索などに有効な
プローブとしても用いられる。In the present invention, "glycosaminoglycan-binding molecule" and "glycosaminoglycan-binding molecule" are used as terms representing the same concept. Specifically, an anti-heparan sulfate antibody An anti-GAG antibody, which is an immunoglobulin obtained by immunizing an animal with glycosaminoglycan or a fragment thereof, such as an anti-chondroitin sulfate antibody, an anti-keratan sulfate antibody or the like, and having a specific binding affinity to these; Hyaluronic acid-binding protein (HABP; hyaluronic acid-binding domain) having an acid-binding property, fibroblast growth factor (FGF) having a binding property to CD44 and heparan sulfate / heparin, hepatocyte growth factor (HGF), etc. , Which exhibit binding affinity for GAGs but are not antibodies but include GAG binding proteins. The present invention provides a lipid-linked glycosaminoglycan (hereinafter, referred to as
"L-GAG"), a plate for measuring the duty,
Method for measuring GAG or GAG-binding molecule in a specimen using a plate in which lipid residues are bound to a carrier such as beads, gels, tubes, strips, and membranes by acting as anchor molecules, and a kit for the measurement Is provided. Further, the carrier to which the L-GAG is fixed is also used as a probe effective for analysis and search of a novel GAG-binding molecule.
【0018】L−GAGを構成するGAGとしては、ヒ
アルロン酸(HA)、コンドロイチン、コンドロイチン硫
酸(CS)(例えば、コンドロイチン硫酸 A、デルマタン
硫酸(コンドロイチン硫酸B)、コンドロイチン硫酸
C、コンドロイチン硫酸D、コンドロイチン硫酸E、コ
ンドロイチン硫酸K、コンドロイチンポリ硫酸、等)、
ヘパリン(Hep)、ヘパラン硫酸(HS)、ケラタン硫酸
(KS)、ケラタンポリ硫酸、あるいはこれらのGAGを
GAG分解酵素で分解したGAGのフラグメント(例え
ば、非還元末端不飽和オリゴ糖)などが挙げられ、脂質
としては、GAGを直接又はスペーサーを介して結合可
能な官能基を有し、担持体に固着しうるものであれば特
に限定されないが、1級アミノ基を有する脂質あるいは
リン脂質が好ましく、L−(α−ホスファチジル)エタ
ノールアミン、D,L−ホスファチジル−L−セリン、
エタノールアミンプラスマロゲン、セリンプラスマロゲ
ン、ステアリルアミン、パルミチルアミン、スフィンゴ
シン等を用いることが出来る。特に脂質としては、ホス
ファチジルエタノールアミンが好ましい。本明細書中実
施例に於いては、ジパルミトイルホスファチジルエタノ
ールアミン(PE)を使用した。GAGs constituting L-GAG include hyaluronic acid (HA), chondroitin, chondroitin sulfate (CS) (eg, chondroitin sulfate A, dermatan sulfate (chondroitin sulfate B), chondroitin sulfate C, chondroitin sulfate D, chondroitin sulfate). Sulfate E, chondroitin sulfate K, chondroitin polysulfate, etc.),
Heparin (Hep), heparan sulfate (HS), keratan sulfate (KS), keratan polysulfate, or a GAG fragment obtained by decomposing the GAG with a GAG-degrading enzyme (eg, a non-reducing terminal unsaturated oligosaccharide); The lipid is not particularly limited as long as it has a functional group capable of binding GAG directly or via a spacer and can be fixed to a carrier, but a lipid or a phospholipid having a primary amino group is preferable. -(Α-phosphatidyl) ethanolamine, D, L-phosphatidyl-L-serine,
Ethanolamine plasmalogen, serine plasmalogen, stearylamine, palmitylamine, sphingosine and the like can be used. In particular, phosphatidylethanolamine is preferable as the lipid. In the examples herein, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine (PE) was used.
【0019】本発明に使用されるL−GAGを構成する
GAGは、測定目的に応じて適宜選択される。例えば、
既知の特定のGAGの定量に使用する場合は、そのGA
Gと同一のGAG又は構造的に類似したGAGを使用す
るべきであり、特に特定分子量範囲のGAGを測定する
際には、その分子量範囲のGAGを選択すべきである。The GAG constituting the L-GAG used in the present invention is appropriately selected according to the purpose of measurement. For example,
When used for quantification of a specific known GAG, the GA
The same GAG as G or a structurally similar GAG should be used, especially when measuring GAGs in a specific molecular weight range, GAGs in that molecular weight range should be selected.
【0020】また、既知の特定のGAG結合性分子の定
量に使用する場合は、その分子に特異的に結合する種類
及び/又は分子量のGAGを選択すべきである。例え
ば、あるGAGの不飽和二糖に対する抗体を定量する場
合は、非還元末端をその抗体が特異的な結合親和性を有
する不飽和似二糖にしたGAGを使用する。さらに、未
知のGAG結合性分子を解析したり、検索する場合に
は、その分子が結合親和性を有すると予想される単一又
は複数種のGAGを本発明に従って担持体に結合させた
ものを用意する必要がある。When used for quantification of a specific known GAG-binding molecule, GAG having a type and / or molecular weight that specifically binds to the molecule should be selected. For example, when quantifying an antibody against an unsaturated disaccharide of a certain GAG, a GAG whose non-reducing end is an unsaturated analogous disaccharide having a specific binding affinity for the antibody is used. Furthermore, when analyzing or searching for an unknown GAG-binding molecule, one or more GAGs whose molecules are expected to have a binding affinity are bound to a carrier according to the present invention. It is necessary to prepare.
【0021】さらにまた、GAGの二糖繰り返し構造の
解析、例えば二糖単位中の硫酸基の位置等を解析するに
は、解析すべきGAGを本発明に従って担持体に結合さ
せる。この場合、担持体に固着されたGAGを、結合特
異性が明らかな抗GAG抗体等を用いて解析する。本発
明に於ける、L−GAGは、GAGと脂質とが共有結合
した構造のものであれば良いが、好ましい構造として
は、GAGのカルボキシル基(ラクトンを含む)、ホルミル基、
水酸基若しくは1級アミノ基、又はGAGに化学的処理に
より別途導入された前記基と、脂質のカルボキシル基、
ホルミル基もしくは1級アミノ基、又は脂質に別途導入された
前記基との間で形成される酸アミド結合(-CONH
-)、エステル結合又はアミノアルキル結合(-CH2N
H-)によって共有結合した構造である。とりわけ、G
AGの還元末端糖に形成または導入された前基と脂質の
一級アミノ基が結合した構造のものが好ましい。Furthermore, in order to analyze the disaccharide repeating structure of GAG, for example, to analyze the position of a sulfate group in a disaccharide unit, the GAG to be analyzed is bound to a carrier according to the present invention. In this case, the GAG fixed to the carrier is analyzed using an anti-GAG antibody or the like whose binding specificity is clear. In the present invention, L-GAG may have a structure in which GAG and a lipid are covalently bonded. Preferred structures include a carboxyl group (including lactone), a formyl group, and a carboxyl group of GAG.
A hydroxyl group or a primary amino group, or the group separately introduced into GAG by a chemical treatment, and a carboxyl group of a lipid;
An acid amide bond (—CONH) formed between a formyl group or a primary amino group, or the group separately introduced into a lipid.
-), An ester bond or an aminoalkyl bond (—CH 2 N
It is a structure covalently bonded by H-). Above all, G
AGs having a structure in which a pre-group formed or introduced into the reducing terminal sugar of the AG and a primary amino group of the lipid are preferable.
【0022】上記リン脂質又はL−GAGの製造法は特
に限定されず、公知の合成法(例えば、特開平4-8020
1、特開平4-80202号参照)を採用することが出来る。代
表的な合成法については以下に説明する。The method for producing the above-mentioned phospholipid or L-GAG is not particularly limited, and a known synthesis method (for example, JP-A-4-8020)
1, JP-A-4-80202) can be employed. A typical synthesis method will be described below.
【0023】〈還元末端限定酸化法〉この方法は、GA
Gの還元末端の糖残基であるキシロース残基、ガラクト
ース残基、ウロン酸残基又はヘキソサミン残基を還元
し、限定酸化(部分酸化)することにより、還元末端の
ピラノース環を特異的に開環させるとともに、該GAG
の還元末端にホルミル基を形成させてアルデヒド化合物
とし、このアルデヒド化合物のホルミル基と脂質の1級
アミノ基とを反応させてシッフ塩基を形成させ、次いで
シッフ塩基を還元し、アミノアルキル結合を形成させ
て、GAGと脂質を共有結合させる方法である。<Reducing Terminal Limited Oxidation Method>
The xylose residue, galactose residue, uronic acid residue or hexosamine residue, which is the sugar residue at the reducing end of G, is reduced and subjected to limited oxidation (partial oxidation) to specifically open the pyranose ring at the reducing end. And the GAG
A formyl group is formed at the reducing end of the compound to form an aldehyde compound, the formyl group of the aldehyde compound is reacted with a primary amino group of lipid to form a Schiff base, and then the Schiff base is reduced to form an aminoalkyl bond. Then, the GAG and the lipid are covalently bonded.
【0024】〈還元末端ラクトン化法〉この方法は、G
AGの還元末端の糖残基であるキシロース残基、ガラク
トース残基、ウロン酸残基又はヘキソサミン残基を酸化
することにより、還元末端のピラノース環を特異的に開
環させて該GAGの還元末端にカルボキシル基を形成さ
せて、次いでラクトン形成反応に付すことによって、該
GAGの還元末端をラクトン構造とし、このラクトンと
脂質の1級アミノ基とを反応させて酸アミド結合を形成
させることによって、GAGと脂質を共有結合させる方
法である。<Reducing terminal lactonization method>
By oxidizing a xylose residue, a galactose residue, a uronic acid residue or a hexosamine residue that is a sugar residue at the reducing end of AG, the pyranose ring at the reducing end is specifically opened to reduce the reducing end of the GAG. By subjecting the reducing end of the GAG to a lactone structure and reacting the lactone with a primary amino group of a lipid to form an acid amide bond, This is a method of covalently bonding GAG and lipid.
【0025】本明細書中実施例に於いては、還元末端ラ
クトン法により、L−GAGを作成した。L−GAGを
固着させる担持体としては、通常、脂質と疎水的相互作
用によって固着しうる疎水性の表面を持つものであれば
限定されない。担持体としては、例えば、プレート(E
LISA等免役測定用プレート等)、ビーズ、ゲル、チ
ューブ、ストリップ、膜等が挙げられる。材質として
は、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリア
クリルアミド、セルロース、ニトロセルロース等が挙げ
られ、特に脂質と疎水結合が可能な、表面が疎水的な材
質が好ましい。特に、プレートを担持体として用いる方
が測定手技が簡便であり、好ましい。In the examples of the present specification, L-GAG was prepared by the reducing terminal lactone method. The carrier to which L-GAG is fixed is not particularly limited as long as it has a hydrophobic surface that can be fixed to lipid by hydrophobic interaction. As the carrier, for example, a plate (E
LISA and other immune measurement plates, etc.), beads, gels, tubes, strips, membranes and the like. Examples of the material include polystyrene, polypropylene, nylon, polyacrylamide, cellulose, nitrocellulose, and the like. In particular, a material that can form a hydrophobic bond with lipid and has a hydrophobic surface is preferable. In particular, it is preferable to use a plate as a carrier because the measurement procedure is simpler.
【0026】また、これら担持体にL−GAGを固着さ
せる方法としては、脂質を固定化するのに用いられる一
般的な方法を応用する事が出来る。特に疎水結合が好ま
しく本実施例に於いては、疎水的結合法を用いた。ま
た、L−GAGが固着していない部分を血清アルブミ
ン、ゼラチン、カゼイン、スキムミルク等によってブロ
ッキングしても良く、かつそのようにすることが好まし
い。As a method for fixing L-GAG to these carriers, a general method used for immobilizing lipids can be applied. In particular, hydrophobic bonding is preferred, and in this embodiment, a hydrophobic bonding method was used. Further, the portion where L-GAG is not fixed may be, and preferably is, blocked by serum albumin, gelatin, casein, skim milk or the like.
【0027】本発明の方法を用いるGAGの測定法は、
担持体に固着したL−GAGと検体中のGAGが、GA
G結合性物質に対して競合的に反応し、検体中のGAG
濃度に反比例してL−GAGに結合したGAG結合性物
質を検出することによって検体中のGAGを測定する方
法である。例えば、以下の各工程によって行うことが出
来るがこれに限定されるべきものではない。特に固体表
面としてプレートを用い、ELISA(Enzyme−
Linked ImmunosorbentAssa
y)法を適用した例を挙げ説明する。 1)L−GAGをELISA用プレートに固着させる。 2)GAGを測定すべき検体と、一定量の抗GAG抗体
の混合物を上記プレートに施し、抗GAG抗体に対して
プレート上のL−GAGと検体中のGAGとを競合的に
反応させる。 3)反応後、プレートを検体から分離し、洗浄する。 4)標識物質により直接標識された一定量の二次抗体を
上記プレートに施し、上記抗GAG抗体と反応させる。 5)プレートに固着されているL−GAGと結合した標
識二次抗体の定量から、検体中のGAG量を算出する。The method of measuring GAG using the method of the present invention is as follows.
The L-GAG fixed to the carrier and the GAG in the sample are GA
GAG reacts competitively with G-binding substances and
This is a method of measuring GAG in a sample by detecting a GAG-binding substance bound to L-GAG in inverse proportion to the concentration. For example, it can be performed by the following steps, but is not limited thereto. In particular, using a plate as a solid surface, an ELISA (Enzyme-
Linked ImmunosorbentAssa
An example of applying the method y) will be described. 1) L-GAG is fixed to an ELISA plate. 2) A mixture of a sample for which GAG is to be measured and a fixed amount of an anti-GAG antibody is applied to the plate, and L-GAG on the plate and GAG in the sample are allowed to react competitively with the anti-GAG antibody. 3) After the reaction, the plate is separated from the sample and washed. 4) A certain amount of a secondary antibody directly labeled with a labeling substance is applied to the plate and reacted with the anti-GAG antibody. 5) The amount of GAG in the sample is calculated from the quantification of the labeled secondary antibody bound to L-GAG fixed to the plate.
【0028】また、上記ELISA法において、抗G
AG抗体の代わりに標識物質で直接標識された抗GAG
抗体を使用し、プレート上のL−GAGと結合した標識
抗GAG抗体を定量する、抗GAG抗体の代わりに標
識物質で直接標識されたGAG結合蛋白質を使用し、プ
レート上のL−GAGと結合した標識GAG結合蛋白質
を定量する等の方法を採用することもできる。さらに、
上記のそれぞれの方法において、直接標識する代わり
に、例えば、特異的リガンド:レセプター結合対のリガ
ンドであるピオチンを二次抗体、抗GAG抗体、GAG
結合蛋白質等に結合したものを使用し、プレート上のL
−GAGと結合したピオチンを、該結合対のレセプター
であるアピジン、ストレプトアピジン等と標識物質を結
合したもので検出する間接的な標識法を採用してもよ
い。In the above ELISA method, the anti-G
Anti-GAG directly labeled with a label instead of AG antibody
Using an antibody, quantify the labeled anti-GAG antibody bound to L-GAG on the plate. Using a GAG binding protein directly labeled with a labeling substance instead of the anti-GAG antibody, bind to L-GAG on the plate For example, a method of quantifying the labeled GAG-binding protein may be employed. further,
In each of the above methods, instead of direct labeling, for example, a specific antibody: a ligand for a receptor binding pair, biotin, is used as a secondary antibody, an anti-GAG antibody,
Use the protein bound to the binding protein, etc.
-An indirect labeling method may be employed in which the biotin bound to GAG is detected by binding a labeling substance to a binding substance such as apidine, streptapidine or the like.
【0029】上記方法において、標識物質の種類及びそ
の検出方法としては、特に限定されないが、以下の方法
が挙げられる。標識物質としては、通常、蛋白質の標識
に使用可能なものであれば制限されるべきものではない
が、酵素(ペルオキシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチル
コリンエステラーゼ等)、アイソトープ(125I、
131I、3H等)、蛍光物質(フルオレセインイソチオシ
アネート、ウンベリフェロンなど)、化学発光物質(ル
ミノール等)、アビジン、ビオチン等が挙げられる。In the above method, the type of the labeling substance and the detection method thereof are not particularly limited, but the following methods are exemplified. The labeling substance is not usually limited as long as it can be used for labeling proteins, but enzymes (peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, luciferase, acetylcholinesterase, etc.), isotopes ( 125 I,
131 I, 3 H, etc.), fluorescent substances (fluorescein isothiocyanate, umbelliferone, etc.), chemiluminescent substances (luminol, etc.), avidin, biotin and the like.
【0030】また、標識方法は、公知の手段が適用でき
るが、例えば、酵素で標識する際には、グルタルアルデ
ヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボ
ジイミド法、活性化エステル法等、アイソトープで標識
する場合は、クロラミンT法、ラクトペルオキシダーゼ
法等(続化学実験講座2「タンパク質の化学(下)」、
東京化学同人、1987年発行参照)から適宜選択する
ことができる。Known methods can be used for the labeling method. For example, when labeling with an enzyme, for example, glutaraldehyde method, periodic acid crosslinking method, maleimide crosslinking method, carbodiimide method, activated ester method, etc. When labeling with an isotope, the chloramine T method, lactoperoxidase method, etc. (Sequence Chemistry Experiment Course 2 “Protein Chemistry (bottom)”,
Tokyo Kagaku Dojin, published in 1987).
【0031】標識物質の検出方法としては、用いる標識
物質により異なる。例えば標識物質として蛍光物質や、
化学発光物質を使用する場合には、反応後の溶液の蛍光
や、発光を測定する方法等が挙げられる。標識物質とし
て、酵素を用いた場合を説明する。酵素として、ペルオ
キシダーゼを用いた場合、検体の反応後、分離されたプ
レートに結合したペルオキシダーゼの活性を発色剤O-フ
ェニレンジアミン又はテトラメチルベンジジン及び過酸
化水素水を添加し、発色量を吸光光度計にて測定する方
法等が採用される。The method for detecting the labeling substance differs depending on the labeling substance used. For example, a fluorescent substance as a labeling substance,
When a chemiluminescent substance is used, a method of measuring fluorescence or luminescence of a solution after the reaction may be used. The case where an enzyme is used as a labeling substance will be described. When peroxidase is used as the enzyme, after the reaction of the sample, the activity of the peroxidase bound to the separated plate is added with a coloring agent O-phenylenediamine or tetramethylbenzidine and an aqueous hydrogen peroxide solution, and the amount of coloring is measured by an absorptiometer. And the like.
【0032】検体中のGAGの濃度は、濃度既知の測定
対象であるGAG標準液を用いて、標準液のGAG濃度
と、GAG結合性物質との検出強度との関係について予
め検量線を作成しておき、検体を用いた場合のGAG結
合性物質に対応する標識物質の検出強度と、前記検量線
とを用いる方法等によって測定することが出来る。前記
ELISA法は、本発明の測定方法の一例であり、本発
明方法に使用されるGAG結合性物質は、抗GAG抗
体、GAG結合蛋白質に限定されるべきものではない。The concentration of GAG in the sample is determined by preparing a calibration curve in advance using the GAG standard solution whose concentration is known and measuring the relationship between the GAG concentration of the standard solution and the detection intensity of the GAG-binding substance. In advance, it can be measured by a method using the detection intensity of the labeling substance corresponding to the GAG-binding substance in the case of using the sample and the above-mentioned calibration curve. The ELISA method is an example of the measurement method of the present invention, and the GAG-binding substance used in the method of the present invention is not limited to an anti-GAG antibody or a GAG-binding protein.
【0033】抗GAG抗体としては、各種GAGに対す
る抗体が挙げられ、ポリクローナル抗体、モノクローナ
ル抗体、それら抗体のフラグメントを使用できるが、特
異性及び安定供給の点でモノクローン抗体が好ましい。
また、L−GAGを構成するGAGとして、腫瘍やアル
ツハイマー病などの疾病の組織や細胞から単離されたも
のを使用することにより、各種疾病の診断乃至その寄与
が可能となる。同様にある疾病に対して相関性の強いG
AGを選択することにより、その疾病の診断乃至その寄
与が可能となる。Examples of the anti-GAG antibody include antibodies against various GAGs, and polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and fragments of these antibodies can be used. Monoclonal antibodies are preferred in terms of specificity and stable supply.
In addition, by using GAGs constituting L-GAGs isolated from tissues or cells of a disease such as a tumor or Alzheimer's disease, diagnosis or contribution of various diseases can be achieved. Similarly, G is strongly correlated with a certain disease.
By selecting AG, the diagnosis of the disease or its contribution becomes possible.
【0034】本発明では、構造を解析しようとするGA
Gに脂質を結合し、担持体に固着させ、互いに異なるモ
ノクローン抗体を複数用いて上記測定方法を繰り返すこ
とにより、モノクローン抗体の既知の抗原決定基である
GAGとL−GAGとの該抗体に対する結合力の相違等
の関係からL−GAGを構成するGAGの解析を行うこ
とができる。例えば、GAGの構成糖の組成、配列、構
造等を推測乃至決定に寄与することができる。In the present invention, the GA for which the structure is to be analyzed
G is attached to a lipid, fixed to a carrier, and the above-described measurement method is repeated using a plurality of different monoclonal antibodies, whereby GAG and L-GAG, which are known antigenic determinants of monoclonal antibodies, are obtained. The analysis of GAGs constituting L-GAG can be performed based on the relationship such as the difference in binding force to GAG. For example, the composition, sequence, structure, etc. of the constituent sugars of GAG can be estimated or contributed to.
【0035】上記方法において、あるGAGの酵素分解
物、例えば不飽和二糖に対する抗体を利用する場合、L
−GAGを担持体に固着した後に、L−GAGを構成す
るGAGを不飽和構成二糖に分解する酵素、例えば、コ
ンドロイチナーゼABC及びAC等で処理し、GAGが
固着された状態で非還元末端を不飽和二糖として抗GA
G抗体との反応性を解析する方法が例示される。In the above method, when an enzymatic degradation product of a certain GAG, for example, an antibody against an unsaturated disaccharide is used, L
After the GAG is fixed to the carrier, the LAG is treated with an enzyme that decomposes the GAG constituting the L-GAG into an unsaturated disaccharide, for example, chondroitinase ABC and AC, and the non-reduced GAG is fixed. Anti-GA as terminal unsaturated disaccharide
A method for analyzing the reactivity with the G antibody is exemplified.
【0036】HABPを測定物質とする場合、L−GA
Gを構成するHAとしては、好ましくは分子量3〜20
0kDaのHAを用い、より好ましくは10〜30kD
aを用いる。本発明の測定方法を用いる対象となる検体
とは、GAG乃至GAG結合性分子を含みうる液体であ
れば特に限定されないが、特に生体内から取り出した体
液検体(尿、血液、血漿、血清等)、臓器抽出液、細胞
抽出液又は、培養上清等が挙げられる。When HABP is used as a measuring substance, L-GA
HA constituting G preferably has a molecular weight of 3 to 20.
Using 0 kDa HA, more preferably 10 to 30 kD
Use a. The sample to be subjected to the measurement method of the present invention is not particularly limited as long as it is a liquid that can contain GAG or a GAG-binding molecule. In particular, a body fluid sample (urine, blood, plasma, serum, etc.) taken out of a living body , An organ extract, a cell extract or a culture supernatant.
【0037】構造が既知のL−GAGが固着された担持
体をプローブとして用いて新規なGAG結合性分子を検
索する場合、任意の未知試料溶液を種々の条件(pH、
イオン強度等)でL−GAG固着担持体に接触させてG
AGに未知物質を結合させた後、種々の条件で未知物質
を溶離して、更に必要ならば、他の分離手段を併用して
単離することが挙げられる。単離された未知物質は、公
知の解析手段により特定される。When a novel GAG-binding molecule is searched for using a carrier to which L-GAG having a known structure is immobilized as a probe, any unknown sample solution can be subjected to various conditions (pH,
Ionic strength, etc.) to contact the L-GAG
After binding the unknown substance to AG, the unknown substance is eluted under various conditions, and if necessary, isolation is performed by using another separation means in combination. The isolated unknown substance is specified by a known analysis means.
【0038】[0038]
【実施例】以下の実施例により、本発明を具体的に説明
する。 実施例 1.各種GAG-PEとモノクローン抗体MO225との反
応性 各種GAG−すなわち、サメ軟骨由来コンドロイチン硫
酸〔CS(S)あるいは単にCS(二糖単位の組成比: -HexA-
GalNAc(6-SO3 -)-残基(以下、6S); 72,9%,-HexA-GalNAc
(4-SO3 -)-残基(以下、4S); 15.4%, -HexA(2-SO3 -)-GalN
Ac(6-SO3 -)-残基(以下、diSD); 9.3% (ここで、HexA:
ヘキスロン酸、GalNAc:N−アセチルガラクトサミンを
指す。また、(6-SO3 -)は、6位硫酸基、(4-SO3 -)は、4
位硫酸基、(2-SO3 -)は、2位硫酸基を各々示す) 、重量
平均分子量 20,000)〕、ウシ気管軟骨由来コンドロイ
チン硫酸〔CS(T)(6S; 39.3%, 4S; 54,9%, diSD;0.4%、
重量平均分子量 12,000)〕、クジラ軟骨由来コンドロ
イチン硫酸〔CS(W)(6S;19.3%,4S; 76.2%, diSD; 2.7
%、重量平均分子量 13,000)〕、ブタ腎臓由来デルマタ
ン硫酸〔DS(4S; 91.3%、重量平均分子量 16,000)〕、
ニワトリ鶏冠由来ヒアルロン酸〔HA(重量平均分子量2
3,000、ウシ睾丸ヒアルロニダーゼで限定分解し、分子
ふるいにて精製した標品)〕、ブタ小腸由来ヘパリン
〔Hep(-HexA(2-SO3 -)-GlcN-SO3 -(6-SO3 -)-残基(以
下、triS); 68.8%(ここで、GlcN-SO3 -は、N−硫酸グ
ルコサミンを示す)、重量平均分子量 10,000)〕(全
て生化学工業(株)製)−を原料として、それぞれのリ
ン脂質(ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミ
ン;PE、日本油脂(株)製)の結合体(GAG-PE)を特許
出願公開平4-8021の実施例1の方法に準じて合成した
(CS(S)-PEあるいは単にCS-PE、CS(T)-PE、CS(W)-PE、D
S-PE、HA-PE、Hep-PE)。The present invention will be described specifically with reference to the following examples. Embodiment 1 FIG. Reactivity between various GAG-PE and monoclonal antibody MO225 Various GAG-, ie, chondroitin sulfate derived from shark cartilage [CS (S) or simply CS (composition ratio of disaccharide unit: -HexA-
GalNAc (6-SO 3 − ) -residue (hereinafter, 6S); 72,9%, -HexA-GalNAc
(4-SO 3 -) - residue (hereinafter, 4S); 15.4%, -HexA (2-SO 3 -) -GalN
Ac (6-SO 3 − ) -residue (hereinafter diSD); 9.3% (where HexA:
Hexuronic acid, GalNAc: refers to N-acetylgalactosamine. (6-SO 3 − ) is a sulfate group at the 6-position, and (4-SO 3 − ) is 4
Sulphate group, (2-SO 3 − ) indicates the sulphate group at position 2), weight average molecular weight 20,000)), chondroitin sulfate derived from bovine tracheal cartilage [CS (T) (6S; 39.3%, 4S; 54, 9%, diSD; 0.4%,
Weight average molecular weight 12,000), whale cartilage-derived chondroitin sulfate [CS (W) (6S; 19.3%, 4S; 76.2%, diSD; 2.7
%, Weight average molecular weight 13,000)], pig kidney-derived dermatan sulfate [DS (4S; 91.3%, weight average molecular weight 16,000)],
Hyaluronic acid [HA (weight average molecular weight 2
3000, and limited hydrolysis with bovine testicular hyaluronidase, preparations were purified by molecular sieve)], porcine intestinal heparin [Hep (-HexA (2-SO 3 -) -GlcN-SO 3 - (6-SO 3 -) - residues (hereinafter, Tris); 68.8% (here, GlcN-SO 3 - shows the N- glucosamine sulfate), manufactured by a weight average molecular weight 10,000)] (all Seikagaku Corporation) - as a raw material A conjugate (GAG-PE) of each phospholipid (dipalmitoyl phosphatidylethanolamine; PE, manufactured by NOF Corporation) was synthesized according to the method of Example 1 of Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-8021 (CS (S) -PE or simply CS-PE, CS (T) -PE, CS (W) -PE, D
S-PE, HA-PE, Hep-PE).
【0039】それらGAG-PEを濃度を変えてリン酸緩衝食
塩水(PBS, pH 7.2)に溶解し、96穴ポリスチレン製EL
ISAプレート(住友ベークライト MS-8496F)にそれぞれ
100μl ずつ添加した。4℃で一晩静置した後、PBSで3回
洗浄することで、該GAG-PEが固着されたプレート(以
下、「GAG-PE固着プレート」とも言う。GAG が特定の場
合も同様である)が作製された。そのプレートにウシ血
清アルブミン(BSA)のPBS溶液(10mg/ml)を100μl添
加し、37℃で1時間ブロッキング処理をした。PBSで洗浄
した後、一次抗体としてコンドロイチン硫酸特異的マウ
スモノクローン抗体MO225(生化学工業(株))の0.05%
(w/v) Tween 20含有PBS(PBS-Tween)希釈液(1/500)10
0μlを添加し、室温で1時間処理、PBS/Tween 20(150μ
l )で3回洗浄した。次いで、二次抗体であるパーオキ
シダーゼ結合ヤギ抗マウスIgM抗体(オルガノンテクニ
カ社製)のPBS-Tween希釈液(1/500)100μlを添加、室
温で1時間処理した後、PBS-Tween(150μl )で4回洗浄
した。0.1 mg/ml のo-フェニレンジアミン−0.003% (V/
V)過酸化水素水(OPA-H2O2)を150μl添加し、室温で10
分間反応させた後、3M硫酸水を50μl加えた。反応液の4
92nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダー(日本
インターメッド社製、IMMUNO-MINI NJ-2300)で測定し
た(図1参照) モノクローン抗体MO225はCSの6S構造すなわち -HexA-Ga
lNAc(6-SO3 -)-残基を認識し、特にdiSD構造すなわち -H
exA(2-SO3 -)-GalNAc(6-SO3 -)-残基と強く反応する。従
って、サメ軟骨由来のCSに非常に強く反応した。つい
で、ウシ気管軟骨由来のCS、クジラ軟骨由来CSの順でMO
225との反応性が低下していった。また、ブタ肝臓由来
デルマタン硫酸(DS)はほとんどが4S構造を持つため、ク
ジラ軟骨由来CSよりもかなり低い反応性を示した。な
お、CS糖鎖骨格を持たないHA,HS,HepのPE結合体ではま
ったくMO225との反応性を示さなかった。また、PEと結
合していない遊離のCSを高濃度(1 mg/ml; 50nmol/ml)
処理しても、全くMO225との反応性を示さず、プレート
に固着されていないことが示された。The GAG-PE was dissolved in phosphate buffered saline (PBS, pH 7.2) at different concentrations, and the solution was mixed with a 96-well polystyrene EL.
Each ISA plate (Sumitomo Bakelite MS-8496F)
100 μl was added. After allowing to stand at 4 ° C. overnight, the plate is washed three times with PBS to thereby fix the plate on which the GAG-PE is fixed (hereinafter, also referred to as “GAG-PE-fixed plate”. The same applies to a specific case of GAG. ) Was made. 100 µl of a PBS solution (10 mg / ml) of bovine serum albumin (BSA) was added to the plate, and a blocking treatment was performed at 37 ° C for 1 hour. After washing with PBS, 0.05% of chondroitin sulfate-specific mouse monoclonal antibody MO225 (Seikagaku Corporation) was used as the primary antibody.
(w / v) Tween 20-containing PBS (PBS-Tween) diluent (1/500) 10
Add 0 μl, treat for 1 hour at room temperature, PBS / Tween 20 (150 μl
l) was washed three times. Subsequently, 100 μl of a PBS-Tween diluent (1/500) of a peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgM antibody (manufactured by Organon Technica), which is a secondary antibody, was added, and the mixture was treated at room temperature for 1 hour, and then PBS-Tween (150 μl) For 4 times. 0.1 mg / ml o-phenylenediamine-0.003% (V /
V) Add 150 μl of aqueous hydrogen peroxide (OPA-H 2 O 2 ) and
After reacting for 3 minutes, 50 μl of 3M aqueous sulfuric acid was added. 4 of reaction solution
The absorbance at 92 nm was measured with a microplate reader (IMMUNO-MINI NJ-2300, manufactured by Nippon Intermed Co., Ltd.) (see FIG. 1). Monoclonal antibody MO225 has the 6S structure of CS, ie, -HexA-Ga
Recognizes lNAc (6-SO 3 − ) -residues, especially the diSD structure, ie, -H
exA (2-SO 3 -) -GalNAc (6-SO 3 -) - strongly react with residues. Therefore, it reacted very strongly with shark cartilage-derived CS. Then, the MO derived from bovine tracheal cartilage-derived CS and whale cartilage-derived CS in this order.
The reactivity with 225 decreased. In addition, dermatan sulfate (DS) derived from porcine liver showed a much lower reactivity than CS derived from whale cartilage because most of it had a 4S structure. In addition, the PE conjugate of HA, HS, and Hep without the CS sugar chain skeleton did not show any reactivity with MO225. High concentration of free CS not bound to PE (1 mg / ml; 50 nmol / ml)
Even after treatment, no reactivity with MO225 was shown, indicating that it was not fixed to the plate.
【0040】実施例 2.CS分子量差によるMO225抗体反
応性 分子量の異なるサメ軟骨由来コンドロイチン硫酸(CS;
重量平均分子量 46,000、20,000、11,000、8,000、4,60
0、2,800;分子量1万以上の標品は天然物の精製品、1万
未満は天然物をウシ睾丸由来ヒアルロニダーゼ(生化学
工業(株)製)で限定分解し分子ふるいで精製した。)
のPE結合体を実施例1と同様に合成し、実施例1と同様
に濃度を変えてELISA用プレートに固着し、MO225と反応
させた。(図2参照) 分子量が大きいほど反応性は高くなり、分子量1万前後
での反応性に大きな変化が見られた。また、分子量3000
以下のCS-PEは殆ど反応性を示さなかった。Embodiment 2 FIG. MO225 antibody reactivity due to CS molecular weight difference Chondroitin sulfate derived from shark cartilage with different molecular weight (CS;
Weight average molecular weight 46,000, 20,000, 11,000, 8,000, 4,60
0, 2,800; a sample having a molecular weight of 10,000 or more was purified from a natural product, and a sample having a molecular weight of less than 10,000 was subjected to limited digestion of bovine testis-derived hyaluronidase (manufactured by Seikagaku Corporation) and purified by molecular sieve. )
The PE conjugate was synthesized in the same manner as in Example 1, fixed to an ELISA plate at a different concentration as in Example 1, and reacted with MO225. (See FIG. 2) The higher the molecular weight, the higher the reactivity, and a significant change was observed in the reactivity at around 10,000. In addition, molecular weight 3000
The following CS-PE showed little reactivity.
【0041】実施例 3. CS-PE固着プレートにコンドロ
イチナーゼを処理した後の抗体反応性(CS-PE構成CSの
解析) 実施例2と同様にプレートに固着したCS-PE(サメ軟骨
由来、重量平均分子量20,000、10μg/ml; 100μl/wel
l)をコンドロイチナーゼABC(C-ABC)の酵素濃度を変化
させて37℃で1時間処理した後、それぞれ特異性の異な
る抗CS検体として、抗CS抗体MO225、抗不飽和6S二糖
抗体 3B3、抗不飽和4S二糖抗体2B6、抗不飽和0S二
糖抗体1B5 (各1/500稀釈;いずれも生化学工業(株)
製)を用いそれぞれ実施例1と同様に反応させた(図
3)。Example 3 Antibody Reactivity After Treatment of CS-PE-Fixed Plate with Chondroitinase (Analysis of CS Constituting CS-PE) CS-PE (shark cartilage-derived) fixed to the plate in the same manner as in Example 2 , Weight average molecular weight 20,000, 10 μg / ml; 100 μl / wel
l) was treated at 37 ° C. for 1 hour while changing the enzyme concentration of chondroitinase ABC (C-ABC), and then, as anti-CS specimens having different specificities, anti-CS antibody MO225 and anti-unsaturated 6S disaccharide antibody 3B3, anti-unsaturated 4S disaccharide antibody 2B6, anti-unsaturated 0S disaccharide antibody 1B5 (diluted 1/500 each; Seikagaku Corporation)
Were reacted in the same manner as in Example 1 (FIG. 3).
【0042】MO225との反応はC-ABC 0.5 mU/well以上
の処理で急激に低下し、抗原としてある一定以上の分子
量が抗原抗体反応に必要との実施例2の結果を支持し
た。また、3B3抗体に対してはC-ABC処理ですぐに反応性
が上昇するのに対し、2B6抗体の反応はそれよりも遅れ
ピークも低かった。これはサメ軟骨由来CSが4Sよりも6S
含量が高いことだけでなく、非還元末端に6S二糖がより
多く存在することを示唆する。1B5抗体ではあまり反応
しなかったのは、本CS-PE中の0S二糖(−HexA−G
alNAc−)含量は少ないためであろう。The reaction with MO225 sharply decreased by treatment with C-ABC of 0.5 mU / well or more, supporting the result of Example 2 that a certain molecular weight or more as an antigen was required for the antigen-antibody reaction. The reactivity of the 3B3 antibody was immediately increased by the C-ABC treatment, whereas the response of the 2B6 antibody had a lower delayed peak. This is 6S from shark cartilage derived CS from 4S
Not only is the content high, but also suggests more 6S disaccharide at the non-reducing end. The one that did not react very much with the 1B5 antibody was the OS disaccharide (-HexA-G) in this CS-PE.
This may be due to the low alNAc-) content.
【0043】この様に、GAGをPE化する事で、GAGの配列
構造を推定することが可能となる。 実施例4.CS濃度測定 CS-PE固着プレート(1,10,100μg/ml)を用い、MO225抗
体で、阻害法により、検体中のCS濃度測定を行った。す
なわち、CS-PEのPBS溶液(1, 10, 100μg/ml)100μl
を室温で一晩処理し、10mg/ml BSA のPBS溶液(100 μ
l)でブロッキング後、PBS-Tween で洗浄して、CS-PE固
着プレートを作製した。このプレートに各種濃度の遊離
コンドロイチン硫酸(CS;サメ軟骨由来 重量平均分子
量 20,000)のPBS溶液 50μlとモノクローン抗体MO225
のPBS-Tween希釈液(1/500)50μlを添加混合し、室温
で2時間振盪させた。PBS-Tween(150μl)で4回洗浄
後、2次抗体としてパーオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス
IgM抗体のPBS-Tween希釈液(1/1000)100μlを添加、室
温で1時間処理した後、実施例1と同様にOPA-H2O2の発色
を行い492nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測
定した(図4参照) CS添加量と抗体反応との用量反応曲線から、CS-PE 10μ
g/ml以上の固着量で遊離CSを 10〜1000μg/mlの濃度範
囲で測定可能であった。すなわちこの濃度範囲での検体
中のCS濃度を定量できることが示された。As described above, by converting GAG into PE, the sequence structure of GAG can be estimated. Embodiment 4 FIG. CS Concentration Measurement Using a CS-PE-fixed plate (1, 10, 100 μg / ml), the CS concentration in the sample was measured by the inhibition method using the MO225 antibody. That is, 100 μl of CS-PE PBS solution (1, 10, 100 μg / ml)
At room temperature overnight, and add 10 mg / ml BSA in PBS (100 μl
After blocking in l), the plate was washed with PBS-Tween to prepare a CS-PE fixing plate. 50 μl of PBS solution containing various concentrations of free chondroitin sulfate (CS; shark cartilage-derived weight average molecular weight 20,000) and monoclonal antibody MO225
Of PBS-Tween diluted solution (1/500) was added and mixed, and shaken at room temperature for 2 hours. After washing 4 times with PBS-Tween (150μl), peroxidase-conjugated goat anti-mouse as secondary antibody
After adding 100 μl of a diluted solution of IgM antibody in PBS-Tween (1/1000) and treating at room temperature for 1 hour, color the OPA-H 2 O 2 in the same manner as in Example 1 and measure the absorbance at 492 nm using a microplate reader. (See Fig. 4) From the dose response curve of the amount of CS added and the antibody response, CS-PE 10μ
Free CS could be measured in the concentration range of 10 to 1000 µg / ml with an amount of fixation of g / ml or more. That is, it was shown that the CS concentration in the sample in this concentration range can be quantified.
【0044】また、分子量の異なるコンドロイチン硫酸
もその分子量に応じて、検体中の濃度が測定された。 実施例 5. 固着化HA-PEとヒアルロン酸結合性蛋白質と
の反応性、遊離ヒアルロン酸との比較 重量平均分子量104,000及び20,000のヒア
ルロン酸(HA;共にニワトリ鶏冠由来のヒアルロン酸
をウシ睾丸ヒアルロニダーゼで限定分解し、分子ふるい
にて精製した標品)を用い、実施例1と同様の方法でH
A−PE結合体を合成した。The concentration of chondroitin sulfate having a different molecular weight in the specimen was also measured according to the molecular weight. Example 5. Reactivity of immobilized HA-PE with hyaluronic acid-binding protein, comparison with free hyaluronic acid Hyaluronic acid with weight average molecular weight of 104,000 and 20,000 (HA; HB in the same manner as in Example 1 using a sample that has been limitedly degraded with bovine testicular hyaluronidase and purified through a molecular sieve.
A-PE conjugate was synthesized.
【0045】実施例1と同様に、これらHA-PEのPBS溶液
を濃度を変えて96穴ELISA用プレートに固着した後、10
mg/mlのBSA溶液でブロッキングし、HA-PE固着プレート
を作製した。そのプレートにビオチンで標識したウシ軟
骨プロテオグリカン由来のヒアルロン酸結合蛋白質(bHA
BP)のPBS-Tween溶液0.4μg/ml(100μl)を添加
し、室温で2時間処理した。PBS-Tweenで3回洗浄後、パ
ーオキシダーゼ結合アビジン(アマーシャム社製:1/
500希釈)のPBS-Tween溶液(100μl)を添加、室温
で1時間処理後、PBS-Tween(150 μl)4回洗った。OPA-
H2O2試薬(150μl)を添加、室温で30分間反応させた。
反応後3M硫酸(50μl)を加え停止させ、マイクロプレー
トリーダーで492nm の吸光度を測定した(図5参照)。In the same manner as in Example 1, these PBS solutions of HA-PE were fixed at different concentrations to a 96-well ELISA plate, and then
Blocking was performed with a mg / ml BSA solution to prepare an HA-PE-fixed plate. A biotin-labeled hyaluronic acid binding protein (bHA) from bovine cartilage proteoglycan on the plate
BP) in PBS-Tween was added at 0.4 μg / ml (100 μl), and the mixture was treated at room temperature for 2 hours. After washing three times with PBS-Tween, peroxidase-conjugated avidin (Amersham: 1 /
PBS-Tween solution (100 μl) was added, and the mixture was treated at room temperature for 1 hour, and then washed four times with PBS-Tween (150 μl). OPA-
H 2 O 2 reagent (150 μl) was added and reacted at room temperature for 30 minutes.
After the reaction, 3 M sulfuric acid (50 μl) was added to stop the reaction, and the absorbance at 492 nm was measured using a microplate reader (see FIG. 5).
【0046】HA-PE固着プレートのHAとbHABPとの反応
は、固着に用いたHA-PEのPBS溶液中のHA-PE濃度に比
例して用量依存的に増加し、HA分子量にあまり影響され
ず、どちらも高感度な反応性を示した。尚、HA-PEの代
わりに、低分子化したニワトリ鶏冠由来ヒアルロン酸
(HA、重量平均分子量27,000)や、ヒト臍帯由
来ヒアルロン酸(uHA、重量平均分子量1,000,
000)のPBS溶液を調整し、上記と同様に塗布処理
したところ、低分子量(27,000)のHAでは高濃
度(100μg/ml)の処理でも全くbHABPとの反応性を
示さず、殆どプレートに固着されていないことが示され
た。高分子量(1,000,000)のuHA(不純物
として蛋白質1%を含む)の処理では、高濃度領域であ
れば、HABPとの反応が見られた。The reaction between HA and bHABP on the HA-PE-fixed plate increases in a dose-dependent manner in proportion to the concentration of HA-PE in the PBS solution of HA-PE used for fixation, and is less affected by the HA molecular weight. , And both showed highly sensitive reactivity. It should be noted that instead of HA-PE, hyaluronic acid (HA, weight-average molecular weight 27,000) derived from low-molecular weight chicken cockscomb and hyaluronic acid (uHA, weight-average molecular weight 1,000,000) derived from human umbilical cord were used.
000) PBS solution was prepared and coated in the same manner as above. HA with low molecular weight (27,000) showed no reactivity with bHABP even at high concentration (100 μg / ml). It was shown that it was not stuck to. In the treatment of high molecular weight (1,000,000) uHA (containing 1% protein as an impurity), a reaction with HABP was observed in a high concentration region.
【0047】実施例 6.HA−PE固着化によるHA濃
度測定 重量平均分子量20,000のヒアルロン酸(HA)を
原料とし、リン脂質(ジパルミトイルホスファチジルエ
タノールアミン:PE、日本油脂(株)製)との結合体
を実施例1記載の方法で作成した。そのHA−PEを濃
度を変えてリン酸緩衝食塩水(PBS)に溶解し、0.03
μg/ml、0.1μg/ml、0.3μg/ml、1μg/ml、3μg/
ml、9μg/ml、27μg/mlのHA-PE溶液を作成し
た。Embodiment 6 FIG. Measurement of HA Concentration by Fixation of HA-PE Using hyaluronic acid (HA) having a weight average molecular weight of 20,000 as a raw material, a conjugate with a phospholipid (dipalmitoyl phosphatidylethanolamine: PE, manufactured by NOF Corporation) was prepared. It was prepared by the method described in 1. The HA-PE was dissolved at different concentrations in phosphate buffered saline (PBS), and dissolved in 0.03.
μg / ml, 0.1 μg / ml, 0.3 μg / ml, 1 μg / ml, 3 μg / ml
HA-PE solutions were prepared at ml, 9 μg / ml and 27 μg / ml.
【0048】96穴プレートに、それぞれ100μl ず
つ添加し、4℃で一晩静置した後、PBS200μl用い、
3回洗浄し、そのプレートにウシ血清アルブミン(BS
A)のPBS溶液(1%)を100μl添加し、室温で2時間ブロ
ッキング処理し、PBS200μl用い、3回洗浄してHA
−PE固着プレートを作成した。このプレートに各種濃
度のHA試料(HA:重量平均分子量10,000、PBS-
Tween で段階希釈した溶液)50μlを添加し、次い
で、ビオチン化ヒアルロン酸結合性タンパク質(PBS-Tw
een で希釈した溶液;0.4 μg/ml)50μlを添加し攪
拌後、37℃で1時間処理した後、PBS-Tween200μl
用い、3回洗浄した。パーオキシダーゼ結合アビジン
(PBS-Tween で希釈した溶液)50μlを添加し、37
℃で30分間反応させ、その後、PBS-Tween200μl用
い、3回洗浄した。次いで、OPA-H2O2試薬(150 μl )
を加え反応後、3M硫酸(50μl)を加えて反応を停止さ
せ、492nmの吸光度を測定した(図6、図7)。100 μl of each was added to a 96-well plate, allowed to stand at 4 ° C. overnight, and then 200 μl of PBS was used.
Wash three times and add bovine serum albumin (BS
100 μl of a PBS solution (1%) of A) was added thereto, and a blocking treatment was performed at room temperature for 2 hours.
-A PE fixing plate was prepared. HA samples of various concentrations (HA: weight average molecular weight 10,000, PBS-
50 μl of a solution serially diluted with Tween) is added, and then the biotinylated hyaluronic acid binding protein (PBS-Tw
solution diluted with een; 0.4 μg / ml), stirred, treated at 37 ° C. for 1 hour, and then PBS-Tween 200 μl
And washed three times. 50 μl of peroxidase-conjugated avidin (solution diluted with PBS-Tween) was added, and 37
The mixture was reacted at 30 ° C. for 30 minutes, and then washed three times using 200 μl of PBS-Tween. Then, OPA-H 2 O 2 reagent (150 μl)
After the reaction, 3 M sulfuric acid (50 μl) was added to stop the reaction, and the absorbance at 492 nm was measured (FIGS. 6 and 7).
【0049】用量反応曲線から、試料中の10〜1000ng/m
l のHA濃度範囲で測定可能であった。但し、HA−P
Eの高濃度(3μg/ml以上)溶液で処理したプレートで
は、測定感度が落ちる傾向にあり、低濃度過ぎると
(0.1μg/ml以下)測定吸光度値が低下する傾向にあ
った。 実施例 7.HA−PE固着化による測定HAの分子量に
よる変化 実施例6と同様にして処理濃度0.3μg/mlでHA−P
E(重量平均分子量20,000のHAを使用)を固着
化したプレートを用い、分子量の異なるヒアルロン酸
(4,000、10,000、27,000、53,0
00、130,000、300,000、800,00
0)の濃度を変化させた溶液を検体として、bHABP
(0.4μg/ml)との阻害法による測定を行った(図
8、図9)。From the dose-response curve, 10-1000 ng / m
1 could be measured in the HA concentration range. However, HA-P
Plates treated with a high concentration (3 μg / ml or more) solution of E tended to decrease the measurement sensitivity, and too low a concentration (0.1 μg / ml or less) tended to decrease the measured absorbance. Embodiment 7 FIG. Change in HA measured by HA-PE fixation depending on molecular weight HA-P was treated at a treatment concentration of 0.3 μg / ml in the same manner as in Example 6.
E (using HA having a weight-average molecular weight of 20,000) was immobilized on a plate on which hyaluronic acid (4,000, 10,000, 27,000, 53,000) having a different molecular weight was used.
00, 130,000, 300,000, 800,00
The solution with the changed concentration of 0) was used as a sample, and bHABP
(0.4 μg / ml) by the inhibition method (FIGS. 8 and 9).
【0050】その結果、分子量4,000の低分子量H
Aでは多少反応性が低下する傾向にあるが、それ以上の
ヒアルロン酸に対しては分子量が変化しても殆ど濃度に
対する反応に変化が無く、広い分子量範囲のHA測定が
可能であることが判明した。As a result, a low molecular weight H having a molecular weight of 4,000
In the case of A, the reactivity tends to slightly decrease, but it is clear that even for a higher molecular weight of hyaluronic acid, there is almost no change in the reaction with respect to the concentration, and it is possible to measure HA in a wide molecular weight range. did.
【0051】実施例 8.固着化HS-PE,固着化Hep-PEと抗
HS抗体 HK249との反応性 マウスEHS腫瘍由来のヘパラン硫酸(HS(EHS))、ブタ腎
臓由来ヘパラン硫酸(HS(PK))、ウシ小腸由来ヘパリン
(Hep)のそれぞれのPE結合体を実施例1と同様に合成
し、実施例1と同様な方法で、濃度を変えて96穴ELISA用
プレートに固着し、10 mg/mlのBSAでブロッキングし
た。その固着プレートに抗ヘパラン硫酸モノクローン抗
体 HK249(生化学工業(株)) 100μlを添加、室温で1
時間処理後、PBS-Tweenで洗い、次いで二次抗体として
パーオキシダーゼ結合ヒツジ抗ラット免疫グロブリン抗
体(オルガノンテクニカ社製)(100μl)を添加、室温
で1時間処理した後、PBS-Tweenで4回洗浄した。OPA-H
2O2試薬を室温20分間反応させ、3M硫酸で停止した。マ
イクロプレートリーダーで492nm の吸光度を測定し、HK
249抗体の反応性を見た(図10) HK249 はマウスEHS腫瘍由来ヘパラン硫酸プロテオグリ
カンを抗原にして作成したモノクローン抗体であり、全
体的な硫酸含量は低くグルコサミン(GlcN)のN-硫酸残
基が多いヘパラン硫酸に対し特異性を示す抗体であり、
やはり、EHS由来のHS-PEには高い反応性を示した。ブタ
腎臓由来のHS-PEやHep-PEに対する反応性は低かった。
アルツハイマーや癌化組織にHK249陽性ヘパラン硫酸が
出現・増加するとの報告もあり、本発明方法はそれらの
診断に有効となり得る。Embodiment 8 FIG. HS-PE and Hep-PE
Reactivity with HS antibody HK249 Example 1 was used for each PE conjugate of heparan sulfate (HS (EHS)) derived from mouse EHS tumor, heparan sulfate (HS (PK)) derived from pig kidney, and heparin (Hep) derived from bovine small intestine. Was synthesized in the same manner as in Example 1, and fixed to a 96-well ELISA plate at a different concentration in the same manner as in Example 1, and blocked with 10 mg / ml BSA. Add 100 μl of anti-heparan sulfate monoclonal antibody HK249 (Seikagaku Corporation) to the plate
After the time treatment, the cells were washed with PBS-Tween, and then a peroxidase-conjugated sheep anti-rat immunoglobulin antibody (manufactured by Organon Technica) (100 μl) was added as a secondary antibody, and the cells were treated at room temperature for 1 hour, and then washed four times with PBS-Tween. Washed. OPA-H
The 2 O 2 reagent was reacted at room temperature for 20 minutes and stopped with 3M sulfuric acid. Measure the absorbance at 492 nm with a microplate reader,
HK249 was a monoclonal antibody prepared using mouse EHS tumor-derived heparan sulfate proteoglycan as an antigen. The overall sulfate content was low and the N-sulfate residue of glucosamine (GlcN) was observed. Is an antibody that shows specificity for heparan sulfate,
Again, it showed high reactivity with EHS-derived HS-PE. Reactivity to HS-PE and Hep-PE derived from pig kidney was low.
It has been reported that HK249-positive heparan sulfate appears and increases in Alzheimer's and cancerous tissues, and the method of the present invention may be effective for the diagnosis thereof.
【0052】[0052]
【発明の効果】本発明は、担持体に固着したL−GAG
とGAG結合性物質を用いて、検討中の該当するGAG
の濃度測定が可能であり、人や動物の血液、尿、髄液、
創傷浸潤液などの体液中のGAG含量の測定が可能とな
る。体液中のGAG量は、関節炎、肝炎、腎炎、アルツ
ハイマー、癌、皮膚炎、炎症、分娩時などに変動するこ
とが知られており、特定のGAG濃度を測定することに
より、それら疾患などの診断に利用できる。The present invention relates to an L-GAG fixed to a carrier.
And the GAG binding substance,
Of blood, urine, cerebrospinal fluid,
GAG content in body fluids such as wound infiltration fluids can be measured. It is known that the amount of GAG in body fluids fluctuates in arthritis, hepatitis, nephritis, Alzheimer's, cancer, dermatitis, inflammation, parturition, and the like. Available to
【0053】また、本発明は、構造未知乃至特定が不十
分なGAGを脂質結合体にしたL−GAGを用いること
で、容易にプレートへの固着性が付与され、その固着化
GAGに対し、GAG結合性物質(抗GAG抗体、GAG結合蛋白質
等)を反応させることで、そのGAG構造の推定ができ
る。更に、本発明に用いられるL−GAG担持体は、プ
ローブとなり得、新規なGAG結合分子であってGAG
に結合性を有する生理活性物質の検索などに用いられ
る。In the present invention, the use of L-GAG, in which GAG of unknown or insufficient structure is used as a lipid conjugate, facilitates the adhesion to a plate and facilitates the adhesion to the plate.
By reacting GAG with a GAG-binding substance (anti-GAG antibody, GAG-binding protein, etc.), its GAG structure can be estimated. Furthermore, the L-GAG carrier used in the present invention can be a probe, and is a novel GAG-binding molecule.
It is used for searching for a physiologically active substance that has a binding property to the protein.
【図1】実施例1において、各種GAG−PEとモノク
ローン抗体MO225との反応曲線を示す。FIG. 1 shows the reaction curves of various GAG-PEs and monoclonal antibody MO225 in Example 1.
【図2】実施例2において、分子量の異なるCS−PE
とモノクローン抗体MO225との反応曲線を示す。FIG. 2 shows CS-PE having different molecular weights in Example 2.
Fig. 4 shows a reaction curve between the antibody and the monoclonal antibody MO225.
【図3】実施例3において、CS-PE固着プレートに濃度
を変化させたコンドロイチナーゼを処理した後のCSと各
種抗体との反応曲線を示す。FIG. 3 shows the reaction curves of CS and various antibodies after treating chondroitinase with varying concentrations on CS-PE-fixed plates in Example 3.
【図4】実施例4において、CS濃度測定のための用量
反応曲線を示す。FIG. 4 shows a dose response curve for CS concentration measurement in Example 4.
【図5】実施例5において、固着化HA-PE又は遊離HA
をプレートに塗布処理したものとヒアルロン酸結合蛋白
質との反応性を示す反応曲線である。FIG. 5 shows that in Example 5, immobilized HA-PE or free HA
FIG. 4 is a reaction curve showing the reactivity of a plate coated with and a hyaluronic acid binding protein.
【図6】実施例6において、各種HA−PEのコーティ
ング濃度で作成されたHA−PE固着プレートにおける
HA用量の反応曲線を示す。FIG. 6 shows the response curve of the HA dose in the HA-PE-fixed plate prepared at various HA-PE coating concentrations in Example 6.
【図7】実施例6において、各種HA−PEのコーティ
ング濃度で作成されたHA−PE固着プレートにおける
HA用量の反応曲線を示す。FIG. 7 shows the response curve of the HA dose in the HA-PE-fixed plate prepared at various HA-PE coating concentrations in Example 6.
【図8】実施例7において、分子量の異なる各種HAを
用いたHA−PE固着プレートにおけるHA用量の反応
曲線を示す。FIG. 8 shows a response curve of an HA dose in an HA-PE-fixed plate using various HAs having different molecular weights in Example 7.
【図9】実施例7において、分子量の異なる各種HAを
用いたHA−PE固着プレートにおけるHA用量の反応
曲線を示す。FIG. 9 shows a response curve of HA dose in an HA-PE-fixed plate using various HAs having different molecular weights in Example 7.
【図10】実施例8において、各種GAG−PEとモノ
クローン抗体HK249との反応曲線を示す。FIG. 10 shows the reaction curves of various GAG-PE and monoclonal antibody HK249 in Example 8.
Claims (11)
カンを固着した担持体を用いることを特徴とするグリコ
サミノグリカン又はグリコサミノグリカン結合性分子の
測定方法。1. A method for measuring glycosaminoglycan or a glycosaminoglycan-binding molecule, comprising using a carrier having lipid-bound glycosaminoglycan immobilized on the surface of the carrier.
コサミノグリカンの還元末端において脂質と共有結合し
たものであることを特徴とする請求項1記載のグリコサ
ミノグリカン又はグリコサミノグリカン結合性分子の測
定方法。2. The glycosaminoglycan or glycosaminoglycan-binding property according to claim 1, wherein the lipid-bound glycosaminoglycan is covalently bound to a lipid at the reducing end of the glycosaminoglycan. How to measure molecules.
るグリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸又はコンドロ
イチン硫酸であることを特徴とする請求項1又は2記載
のグリコサミノグリカン又はグリコサミノグリカン結合
性分子の測定方法。3. The glycosaminoglycan or glycosaminoglycan-binding property according to claim 1, wherein the glycosaminoglycan constituting the lipid-bound glycosaminoglycan is hyaluronic acid or chondroitin sulfate. How to measure molecules.
るグリコサミノグリカンが、分子量3kDa〜200k
Daのヒアルロン酸であることを特徴とする請求項1〜
3の何れか1項に記載のグリコサミノグリカン又はグリ
コサミノグリカン結合性分子の測定方法。4. The glycosaminoglycan constituting the lipid-bound glycosaminoglycan has a molecular weight of 3 kDa to 200 k.
It is a hyaluronic acid of Da, The claim 1 characterized by the above-mentioned.
4. The method for measuring glycosaminoglycan or a glycosaminoglycan-binding molecule according to any one of the above items 3.
グリカンとグリコサミノグリカン結合性分子とを反応さ
せる工程を含むことを特徴とする請求項1〜4の何れか
1項に記載のグリコサミノグリカン又はグリコサミノグ
リカン結合性分子の測定方法。5. The glycoprotein according to claim 1, further comprising a step of reacting the lipid-bound glycosaminoglycan fixed to the carrier with a glycosaminoglycan-binding molecule. A method for measuring a saminoglycan or a glycosaminoglycan-binding molecule.
グリコサミノグリカン抗体又はグリコサミノグリカン結
合蛋白質である請求項1〜4の何れか1項に記載のグリ
コサミノグリカン又はグリコサミノグリカン結合性分子
の測定方法。6. The glycosaminoglycan or glycosaminoglycan according to claim 1, wherein the glycosaminoglycan binding molecule is an anti-glycosaminoglycan antibody or a glycosaminoglycan binding protein. A method for measuring a glycan-binding molecule.
識物質で直接標識されたものであるか、又は標識物質で
間接的に標識されうるものである請求項1〜4の何れか
1項に記載のグリコサミノグリカン又はグリコサミノグ
リカン結合性分子の測定方法。7. The glycosaminoglycan-binding molecule according to claim 1, wherein the molecule is directly labeled with a labeling substance, or is indirectly labeled with a labeling substance. The method for measuring glycosaminoglycan or glycosaminoglycan binding molecule according to the above.
カンを固着した担持体を含むことを特徴とするグリコサ
ミノグリカン又はグリコサミノグリカン結合性分子の測
定用キット。8. A kit for measuring glycosaminoglycan or a glycosaminoglycan-binding molecule, comprising a carrier having lipid-bound glycosaminoglycan fixed to the surface of the carrier.
結合させるための試薬と、脂質結合グリコサミノグリカ
ンを固着させるための担持体とを少なくとも含むグリコ
サミノグリカン測定用キット。9. A glycosaminoglycan measurement kit comprising at least a reagent for binding lipid to glycosaminoglycan to be measured and a carrier for fixing lipid-bound glycosaminoglycan.
体、ケラタン硫酸、又はこれらの分解物に対する抗体を
更に含む請求項9記載のグリコサミノグリカン測定用キ
ット。10. The kit for measuring glycosaminoglycan according to claim 9, further comprising an antibody against chondroitin sulfate, heparan sulfate antibody, keratan sulfate, or a degradation product thereof.
リカンを固着した担持体からなることを特徴とするグリ
コサミノグリカン結合性分子の解析又は検索用プロー
ブ。11. A probe for analyzing or retrieving glycosaminoglycan-binding molecules, comprising a carrier having lipid-linked glycosaminoglycans fixed to the surface of the carrier.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10237738A JP2000065837A (en) | 1998-08-24 | 1998-08-24 | Measurement of glycosaminoglycan or glycosaminoglycan bonding molecule and measurement kit thereof |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10237738A JP2000065837A (en) | 1998-08-24 | 1998-08-24 | Measurement of glycosaminoglycan or glycosaminoglycan bonding molecule and measurement kit thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2000065837A true JP2000065837A (en) | 2000-03-03 |
JP2000065837A5 JP2000065837A5 (en) | 2005-10-27 |
Family
ID=17019750
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10237738A Pending JP2000065837A (en) | 1998-08-24 | 1998-08-24 | Measurement of glycosaminoglycan or glycosaminoglycan bonding molecule and measurement kit thereof |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2000065837A (en) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008018519A1 (en) * | 2006-08-08 | 2008-02-14 | Seikagaku Corporation | Method for determination of molecular weight of hyaluronic acid |
JP2008509881A (en) * | 2004-06-03 | 2008-04-03 | ザ・ナショナル・リサーチ・カウンセル・オブ・タイランド | Antibodies against chondroitin sulfate epitopes |
JP2009180673A (en) * | 2008-01-31 | 2009-08-13 | Aichi Prefecture | Detecting method of apoptosis |
JP2015502332A (en) * | 2011-10-14 | 2015-01-22 | サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィク | Method for diagnosis, prognosis prediction or treatment of neurodegenerative diseases |
JP2015514705A (en) * | 2012-03-26 | 2015-05-21 | ディラフォール・アクチボラゲットDilafor Ab | Method for the treatment of parturition |
KR101557034B1 (en) * | 2007-08-28 | 2015-10-02 | 오르토-클리니칼 다이아그노스틱스, 인코포레이티드 | Use of glycosaminoglycans to reduce non-specific binding in immunoassays |
JP2018151206A (en) * | 2017-03-10 | 2018-09-27 | 一丸ファルコス株式会社 | Method for analyzing proteoglycan |
-
1998
- 1998-08-24 JP JP10237738A patent/JP2000065837A/en active Pending
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008509881A (en) * | 2004-06-03 | 2008-04-03 | ザ・ナショナル・リサーチ・カウンセル・オブ・タイランド | Antibodies against chondroitin sulfate epitopes |
WO2008018519A1 (en) * | 2006-08-08 | 2008-02-14 | Seikagaku Corporation | Method for determination of molecular weight of hyaluronic acid |
JPWO2008018519A1 (en) * | 2006-08-08 | 2010-01-07 | 生化学工業株式会社 | Method for measuring the molecular weight of hyaluronic acid |
US8163498B2 (en) | 2006-08-08 | 2012-04-24 | Seikagaku Corporation | Method for determination of molecular weight of hyaluronic acid |
JP5466405B2 (en) * | 2006-08-08 | 2014-04-09 | 生化学工業株式会社 | Method for measuring the molecular weight of hyaluronic acid |
KR101557034B1 (en) * | 2007-08-28 | 2015-10-02 | 오르토-클리니칼 다이아그노스틱스, 인코포레이티드 | Use of glycosaminoglycans to reduce non-specific binding in immunoassays |
JP2009180673A (en) * | 2008-01-31 | 2009-08-13 | Aichi Prefecture | Detecting method of apoptosis |
JP2015502332A (en) * | 2011-10-14 | 2015-01-22 | サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィク | Method for diagnosis, prognosis prediction or treatment of neurodegenerative diseases |
US10324096B2 (en) | 2011-10-14 | 2019-06-18 | Centre National De La Recherche Scientifique | Method of diagnosis, prognostic or treatment of neurodegenerative disease |
JP2015514705A (en) * | 2012-03-26 | 2015-05-21 | ディラフォール・アクチボラゲットDilafor Ab | Method for the treatment of parturition |
JP2018151206A (en) * | 2017-03-10 | 2018-09-27 | 一丸ファルコス株式会社 | Method for analyzing proteoglycan |
JP2023003418A (en) * | 2017-03-10 | 2023-01-11 | 一丸ファルコス株式会社 | Method of analyzing proteoglycans |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Ito et al. | Structural characterization of the epitopes of the monoclonal antibodies 473HD, CS-56, and MO-225 specific for chondroitin sulfate D-type using the oligosaccharide library | |
CN104937422B (en) | composition and method for detecting vitamin D | |
JP5197535B2 (en) | Method for detecting lysosomal disease | |
JP4841546B2 (en) | Novel anti-heparan sulfate antibody, detection method of heparan sulfate, and heparan sulfate detection kit | |
US20040259142A1 (en) | Products and methods | |
JPS62501449A (en) | PEG-modified antibody and method for producing the same | |
CN104160273B (en) | Sandwich assay for immune suppressant drug | |
Chai et al. | Neoglycolipid technology: deciphering information content of glycome | |
Baydanoff et al. | Age-related changes in the level of circulating elastin-derived peptides in serum from normal and atherosclerotic subjects | |
Buckley et al. | Characterization and immunohistochemical localization of the glycoconjugates of the rabbit bladder mucosa | |
Kinoshita et al. | α-Fetoprotein antibody-lectin enzyme immunoassay to characterize sugar chains for the study of liver diseases | |
Kitajima et al. | Use of a bacteriophage-derived endo-N-acetylneuraminidase and an equine antipolysialyl antibody to characterize the polysialyl residues in salmonid fish egg polysialoglycoproteins. Substrate and immunospecificity studies. | |
Takiya et al. | Connective matrix organization in human pulmonary fibrosis: collagen polymorphism analysis in fibrotic deposits by immunohistological methods | |
JP2000065837A (en) | Measurement of glycosaminoglycan or glycosaminoglycan bonding molecule and measurement kit thereof | |
JPS6057254A (en) | Quantitative determination of glycolipid by immunological measurement method | |
JPH02503714A (en) | Method and kit for diagnosis of IgA kidney disease | |
US5972717A (en) | Method and kit for detecting heparin induced thrombocytopenia | |
JPH01237454A (en) | Method of heightening sensitivity of assay for target ligand | |
JPH06506943A (en) | Sulfated glycolipids containing galactose-3-0-sulfate moieties and their specific catchers for use in the prevention or treatment of prediabetes, diabetes and/or related complications in individuals. | |
Yamaguchi et al. | Detection of oligosaccharide ligands for Hepatocyte growth factor/Scatter factor (HGF/SF), Keratinocyte growth factor (KGF/FGF-7), RANTES and Heparin cofactor II by neoglycolipid microarrays of glycosaminoglycan-derived oligosaccharide fragments | |
JP2010156699A (en) | Method for determining responsiveness of individual to mistletoe lectin | |
US20200262940A1 (en) | Methods of Releasing Glycans from Peptides and Other Conjugates | |
Swasdison et al. | Monoclonal antibodies that distinguish avian type I and type III collagens: isolation, characterization and immunolocalization in various tissues | |
Sobue et al. | Immunohistochemical techniques for detection of dermatan sulfate proteoglycan in tissue sections | |
US4857639A (en) | A-associated H-antigens, monoclonal antibodies specific thereto and methods for employing the same in blood typing |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050801 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050801 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20060425 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20070411 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070424 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070625 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20071127 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080312 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080924 |