ITVI20070245A1

ITVI20070245A1 - DEVELOPMENT OF METHODS FOR INDUSTRIAL DEVELOPMENT OF BIOMASS FOR THE PRODUCTION OF BIO-COMBUSTIBLE DERIVATIVES FROM THE CULTIVATION OF VEGETABLE CELL LINES

Info

Publication number: ITVI20070245A1
Authority: IT
Inventors: Giorgio Costacurta; Andrea Fabbri; Cristina Lapucci; Alessandro Sbicego
Original assignee: Geneticlab Srl
Priority date: 2007-09-07
Filing date: 2007-09-07
Publication date: 2009-03-08

Description

con un maggior contenuto lipidico e quindi un aumentato rendimento nella produzione di biocarburanti. with a higher lipid content and therefore an increased yield in the production of biofuels.

Va da se. quindi, che la messa a punto dì un metodo per lo sviluppo di biomassa su scala industriale di linee cellulari vegetali, anche ingegnerizzate e quindi caratterizzate da un maggiore rendimento specifico, è il risultato conclusivo per l'applicazione e la produzione di biocarburanti e/o biocombustibili eludendo il problema della coltivazione su campo di piante adulte. It goes without saying. therefore, that the development of a method for the development of biomass on an industrial scale of plant cell lines, also engineered and therefore characterized by a higher specific yield, is the final result for the application and production of biofuels and / or biofuels avoiding the problem of growing adult plants in the field.

La presente invenzione industriale quindi si pone l'obiettivo di descrivere il processo di crescita di biomassa derivata da cellule vegetali su scala industriale descrivendo ί principi e limiti per l'attuazione dei metodo di sviluppo stesso, The present industrial invention therefore aims to describe the growth process of biomass derived from plant cells on an industrial scale by describing the principles and limits for the implementation of the development method itself,

DESCRIZIONE DESCRIPTION

Nella produzione microbiologica a livello industriale l'lemento caratterizzante è quello biologico, cioè lo sfruttamento di un microrganismo vivente o di enzimi da esso elaborati, di cellule di tessuti per la produzione di sostanza utile. E necessario però portare a contatto le materie prime con le cellule viventi o gli enzimi e realizzare le condizioni adatte a favorire la trasformazione biochimica delle materie prime nei prodotti desiderati. In the microbiological production at an industrial level, the characterizing element is the biological one, that is the exploitation of a living microorganism or of enzymes elaborated by it, of tissue cells for the production of useful substance. However, it is necessary to bring the raw materials into contact with living cells or enzymes and create suitable conditions to favor the biochemical transformation of the raw materials into the desired products.

L'industria microbiologica, pertanto, non necessita solo di microrganismi, ma anche di un ambiente in cui gli stessi possano crescere e moltiplicarsi e di una tecnologia industriale adatta per il loro trattamento e per quello dei loro prodotti. Nel processi fermentativi discontinui viene riempito un bioreattore, con le materie prime e inoculate le cellule qualora non siano contenute nelle stesse. La conversione biologica avviene all’intern del bioreattore nell'arco di un tempo che può andare dalle poche ore ai molti giorni, nel caso di cellule eucariotiche come cellule vegetali o di mammifero. Alla fine il recipiente viene svuotato e il processo riprende con una nuova carica, mentre il prodotto viene sottoposto alle operazioni di purificazione ed estrazione. Nei processi continui l'iminissione delle materie prime e l’estrazione dei prodotti avvengono con un flusso regolare e costante, È necessario. in questo caso, che, se il processo biochimico avviene in più stadi, questi procedano simultaneamente e quindi con la stessa velocità. Nei processi semicontinui viene prelevata una frazione di coltura ricca nel prodotto e integrata con terreno fresco. La scelta fra i vari metodi viene effettuata in base a considerazioni sia tecniche che economiche, nonché adattare la tipologia di reazione in bioreattore al tipo cellulare di interesse. The microbiological industry, therefore, not only needs microorganisms, but also an environment in which they can grow and multiply and an industrial technology suitable for their treatment and for that of their products. In the discontinuous fermentation processes a bioreactor is filled with the raw materials and the cells are inoculated if they are not contained in them. The biological conversion takes place inside the bioreactor over a period of time that can range from a few hours to many days, in the case of eukaryotic cells such as plant or mammalian cells. At the end the container is emptied and the process resumes with a new charge, while the product is subjected to the purification and extraction operations. In continuous processes, the elimination of raw materials and the extraction of products take place with a regular and constant flow. It is necessary. in this case, that, if the biochemical process occurs in several stages, these proceed simultaneously and therefore with the same speed. In semi-continuous processes, a crop fraction rich in the product is taken and integrated with fresh soil. The choice between the various methods is made on the basis of both technical and economic considerations, as well as adapting the type of reaction in the bioreactor to the cell type of interest.

E comunque un dato di fatto che le cellule vegetali non possono essere trattate, dai punto di vista della tecnologia delle fementazioni industriali, ne come cellule batteriche, ne come cellule di mammifero. In any case, it is a fact that plant cells cannot be treated, from the point of view of industrial fertilization technology, either as bacterial cells or as mammalian cells.

La presente invenzione è la messa a punto di un metodo che prevede la crescita e lo sviluppo di cellule vegetali secondo approcci che permettano la crescita delle cellule vegetali stesse in sospensione liquida e che detta crescita sia applicabile a grandi volumi su scala industriale, The present invention is the development of a method that provides for the growth and development of plant cells according to approaches that allow the growth of the plant cells themselves in liquid suspension and that said growth is applicable to large volumes on an industrial scale,

Le cellule vegetali, non sopportano agitazioni elevate, le prove in bireattore rivelano che agitazioni meccaniche superiori ai 100 rpm generano lisi cellulare, e inoltre, le cellule vegetali in sospensione non possono essere sottoposte ad una forte areazione. The plant cells do not tolerate high agitation, the bi-reactor tests reveal that mechanical agitations above 100 rpm generate cell lysis, and furthermore, the plant cells in suspension cannot be subjected to strong aeration.

Fino a qualche tempo Fa. in latti, si pensava che il tipo di bioreattore airlift (tipo torre) era il bireattore ideale per le cellule vegetali in sospensione per la produzione pilota a livello industriale. Until recently, in milks, the airlift type bioreactor (tower type) was thought to be the ideal twin-reactor for plant cells in suspension for industrial pilot production.

Dal nostro studio risulta invece clic le cellule vegetali sono molto sensìbili alia presenza di bolle nel mezzo di coltura. L'ottima crescita in beuta e la scarsa crescita in bioreattore ad alta areazione dimostra che la presenza di bolle d'aria non è adatta al’areazione del vaso dì bioreazione: areazione di per se necessaria per la metabolismo glicolitico necessario per il metabolismo degli zuccheri e per l‘accumulo di lipidi cellulari a loro volta necessari per la loro conversione in biocarburanti e/o biocombustibili. On the other hand, our study shows that plant cells are very sensitive to the presence of bubbles in the culture medium. The excellent growth in the flask and the poor growth in the highly aerated bioreactor shows that the presence of air bubbles is not suitable for the aeration of the bioreaction vessel: aeration per se necessary for the glycolytic metabolism necessary for the metabolism of sugars and for the accumulation of cellular lipids which are in turn necessary for their conversion into biofuels and / or biofuels.

La crescita in beuta ne è una dimostrazione palese: non esiste areazione e il volume di aria sovrastante la coltura è sufficiente alla combustione del glucosio. In bioreattore questa problematica veniva risolta tramite l'aggiunta di aria sterile al mezzo dì coltura. Questo perché la coltura era al livello del coperchio superiore del vaso quindi l'ossigeno doveva essere insufflato nel brodo di coltura. Per le cellule vegetali la presenza di bolle è dannosa, provocando lisi cellulare: questo probabilmente è dovuto al fatto che le cellule vegetali vengono urtate dalle bolle che rompono la membrana del vacuolo generando così la morte finale della cellula. The growth in the flask is a clear demonstration of this: there is no aeration and the volume of air above the culture is sufficient for the combustion of glucose. In the bioreactor this problem was solved by adding sterile air to the culture medium. This is because the culture was at the level of the top lid of the jar so oxygen had to be blown into the culture broth. For plant cells, the presence of bubbles is harmful, causing cell lysis: this is probably due to the fact that the plant cells are struck by the bubbles that break the vacuole membrane, thus generating the final cell death.

Il connubio fra una corretta areazione ed una corretta agitazione fatta mediante nuovi sistemi di agitazione, ha permesso una alta velocità specifica di crescita in bioreattore. The combination of correct aeration and correct agitation made by means of new agitation systems, has allowed a high specific growth rate in the bioreactor.

infatti anche le prove con agitatori per colture batteriche (di tipo Rushton) hanno mostrato l'estrema fragilità delle cellule vegetali. Non solo gli alti giri per minuto dell'albero rotore sono deleteri per la coltura, ma anche il tipo dì pale che agitano il brodo dì coltura. L'inserimento di nuovi sistemi di agitazione hanno permesso di ottenere un netto passo in avanti per lo sviluppo di biomassa in fermentatore. in fact also the tests with agitators for bacterial cultures (of the Rushton type) showed the extreme fragility of the plant cells. Not only are the high revolutions per minute of the rotor shaft detrimental to the culture, but also the type of blades that agitate the culture stock. The inclusion of new stirring systems made it possible to obtain a clear step forward for the development of biomass in the fermenter.

Ad esempio, ma non solo, agitatori a pale larghe che agitano dolcemente le cellule vegetali e miscelano correttamente il brodo di coltura, con l' ari che sovrasta il brodo stesso hanno rivelato risultati sorprendenti. For example, but not limited to, wide blade agitators that gently agitate the plant cells and mix the culture broth correctly, with the air overhanging the broth itself, have revealed surprising results.

La fragilità quindi delle linee cellulari vegetali isolate secondo le procedure e i metodi descritti nella domanda di brevetto numero VI2007A000160, sempre della richiedente, è da riconsiderare: non sono cellule fragili in senso assoluto, ma sono cellule fragili se vengono applicate le condizioni di coltura finora conosciute. Therefore, the fragility of plant cell lines isolated according to the procedures and methods described in patent application number VI2007A000160, also by the applicant, must be reconsidered: they are not fragile cells in an absolute sense, but they are fragile cells if the culture conditions known so far are applied. .

La presente invenzione quindi è la riproduzione metodologica su grande scala dello stesso ambiente presente in beuta ottenendo cosi un risultato del tutto comparabile. Il problema dello scale-up quindi é stato fino ad ora un limite nella coltivazione delle linee cellulari vegetali in bioreattore. Questo problema deriva come già accennato dai sistemi di agitazione e di areazione sia convenzionali che non convenzionali. La presente invenzione ha riconsiderato questi aspetti e come già detto deve essere presente aria sopra il livello del brodo di coltura che sopperisce all' insufflazione di aria, che ade esempio ma non solo può essere anche insuflata nel vaso di reazione a portate estremamente ridotte per minuto. Di conseguenza se il volume di aria presente all'interno del vaso non è sufficiente, non si ha crescita cellulare. Questo è stato dimostrato aumentando il volume di reazione a parità di condizioni operative. The present invention is therefore the methodological reproduction on a large scale of the same environment present in the flask, thus obtaining a completely comparable result. The scale-up problem has therefore been a limitation in the cultivation of plant cell lines in bioreactors up to now. As already mentioned, this problem derives from both conventional and unconventional stirring and aeration systems. The present invention has reconsidered these aspects and as already said air must be present above the level of the culture broth which compensates for the insufflation of air, which for example but not only can also be blown into the reaction vessel at extremely low flow rates per minute. . Consequently, if the volume of air present inside the vessel is not sufficient, cell growth does not occur. This was demonstrated by increasing the reaction volume under the same operating conditions.

Di conseguenza va rivisto, nel caso delle cellule vegetali, il concetto di passaggio di scala: non si può pensare a volumi e a bioreattori di dimensioni enormi a meno che non sì consideri un appropriato volume di aria sopra il brodo di coltura. Quindi per le colture di cellule vegetali meglio considerare piccoli bioreattori modulari nel quali si arriva in 10 giorni ad ottenere circa 600 grammi di cellule per litro di coltura. La versatilità dì utilizzare bioreattori piccoli e modulari permette una corretta analisi delle procedure operative per quanto riguarda velocità di agitazione, umazione e controllo della velocità di crescita, nonché del processo di sterilizzazione. Consequently, in the case of plant cells, the concept of passage of scale must be revised: one cannot think of volumes and bioreactors of enormous dimensions unless an appropriate volume of air above the culture broth is considered. Therefore, for plant cell cultures, it is better to consider small modular bioreactors in which about 600 grams of cells per liter of culture are obtained in 10 days. The versatility of using small and modular bioreactors allows a correct analysis of the operating procedures as regards the speed of agitation, humation and control of the growth rate, as well as of the sterilization process.

La presente invenzione quindi apre uno scenario nuovo nel campo della biotecnologia industriale: si è di fronte alla possibilità di usufruire di un metodo innovativo per ottenere colture di cellule vegetali che possono poi essere utilizzate per la loro conversione in biocarburanti e/o biocombustibili Secondo poi le procedure descritte nella domanda numero VI2007A000194 sempre della richiedente, si possono utilizzare linee cellulari vegetali geneticamente ingegnerizzate e quindi arricchite nel contenuto lipidico totale. In questo modo la biomassa generata avrà un maggiore rendimento nella produzione di biocarburanti e biocombustibili. L'unione dell’invenzione della modifica genetica di lìnee cellulari vegetali isolate con la produzione su larga scala di biomassa fuori campo potrebbe essere la soluzione definitiva alla problematica dei biocarburanti quali ad esempio, ma non solo, il biodìesel. In altre parole la linea cellulare vegetale isolata, secondo le procedure di per se preferite e descritte nella domanda dì brevetto numero VI2007A000160 , sempre della richiedente, ha una produttività media di 600 granimi di biomassa per litro di coltura in 10 giorni dì lavoro, con una crescila in sospensione analoga a quella delie cellule batteriche comuni. Nelle procedure sperimentali che hanno permesso di elaborare il presente procedimento industriale sono stati utilizzati ad esempio, ma non solo, bìoreattori modulari con vasi in vetro di volume complessivo di 25 litri. Il volume di reazione totale costituito da cellule vegetali in sospensione deve essere al massimo compreso fra il 50% e li 75% del volume totale del vaso dì reazione. L’inoculo compreso fra il 2% e il 15% come esempio esplicativo ma non limitativo. L'analisi circa l'agitazione meccanica, lareazione e il controllo del pH ha trovato riscontro nel risultato della cinetica di crescita. Il valore del tempo di duplicazione di 1,84 giorni è del tutto comparabile con quello ottenuto in beuta. L’agitazione è stata risolta apportando un'agitazione meccanica orbitale dell'intero vaso di reazione in modo da garantire una agitazione compresa fra i 70 e 130 rpm di tipo orbitale dell’ intero bioreattore e quindi senza agitazione meccanica all'interno del vaso, L’areazione è stata risolta grazie al volume di aria sovrastante e può essere agevolata grazie all' insufflazione di aria esterna con portate ridotte per minuto. The present invention therefore opens up a new scenario in the field of industrial biotechnology: we are faced with the possibility of using an innovative method to obtain plant cell cultures which can then be used for their conversion into biofuels and / or biofuels. procedures described in the application number VI2007A000194 always of the applicant, it is possible to use genetically engineered plant cell lines and therefore enriched in the total lipid content. In this way the biomass generated will have a greater yield in the production of biofuels and biofuels. The combination of the invention of genetic modification of isolated plant cell lines with the large-scale production of biomass out of the field could be the definitive solution to the problem of biofuels such as, for example, but not limited to, biodiesel. In other words, the plant cell line isolated, according to the procedures per se preferred and described in patent application number VI2007A000160, also by the applicant, has an average productivity of 600 grains of biomass per liter of culture in 10 days of work, with a grow it in a suspension similar to that of common bacterial cells. In the experimental procedures that have made it possible to develop the present industrial process, for example, but not limited to, modular bioreactors with glass vessels with a total volume of 25 liters have been used. The total reaction volume consisting of plant cells in suspension must be at most between 50% and 75% of the total volume of the reaction vessel. The inoculum between 2% and 15% as an explanatory but not limiting example. The analysis of mechanical agitation, aeration and pH control found confirmation in the result of the growth kinetics. The value of the duplication time of 1.84 days is completely comparable with that obtained in the flask. The agitation was solved by making an orbital mechanical agitation of the entire reaction vessel in order to guarantee an orbital agitation of between 70 and 130 rpm of the entire bioreactor and therefore without mechanical agitation inside the vessel. ventilation has been resolved thanks to the volume of air above and can be facilitated thanks to the insufflation of external air with reduced flow rates per minute.

Tale insufflazione di aria deve essere in forte difetto rispetto alla reale necessità della coltura, questo per non provocare lisi cellulare come già descritto, ma si fa affidamento alla quantità di aria che sovrasta il brodo di reazione in modo da apportare alla coltura l’ossigeno necessario per la combustione degli zuccheri e quindi lo sviluppo di biomassa utile poi per la produzione di biocombustibili. This insufflation of air must be in strong defect compared to the real need for the culture, this in order not to cause cell lysis as already described, but relies on the amount of air that overhangs the reaction broth in order to bring the necessary oxygen to the culture. for the combustion of sugars and therefore the development of biomass useful for the production of biofuels.

Va da se che la diminuzione del volume di aria sovrastante il livello del brodo di coltura deve essere accompagnato da un aumento della portata dell' aria insùfflata causando lisi cellulare come già descritto. It goes without saying that the decrease in the volume of air above the level of the culture broth must be accompanied by an increase in the flow rate of the blown air causing cell lysis as already described.

L'agitazione orbitale, sinergica al sistema di areazione, alle condizioni di temperatura e alla programmazione dì inoculo iniziale dì cellule vegetali nell'utilizzo di bioreattori modulari è la chiave di volta per la generazione dì biomassa a livello industriale per la produzione di bìocarburantì e/o bicombustibili. Qui di seguito vengono riportate alcune realizzazioni della presente invenzione date puramente a tìtolo esemplificativo, ma non limitativo. The orbital agitation, synergistic with the ventilation system, the temperature conditions and the initial inoculation planning of plant cells in the use of modular bioreactors is the keystone for the generation of biomass at industrial level for the production of biofuels and / or dual fuel. Some embodiments of the present invention are reported hereinafter, given purely by way of example, but not limiting.

ESEMPI SPERIMENTALI EXPERIMENTAL EXAMPLES

I - Materiale vegetale I - Plant material

Per la produzione dei calli si utilizzano espianti di piante adulte come ad esempio Soia, Grano. Ulivo coltivate in camera di coltura con fotoperiodo di 12 ore di luce e 12 ore di buio, alia lem pretura di 25 °C di giorno e di 22°C di notte. Per la coltura in vitro si impiega la tecnica degli espianti midollari e della stabilizzazione della linea cellulare vegetale secondo le procedure descritte nella domanda di brevetto numero VI2007A000160 sempre della richiedente. La biomassa deve essere propagata liquido — liquido mantenendo un inoculo da 1:5 a 1 :50 in relazione al peso cellulare di inoculo e al volume di terreno finale. Sono state utilizzate anche linee cellulari vegetali ingegneri zzate geneticamente per l' accumulo dei lìpidi cellulari totali secondo le procedure descritte nella domanda di brevetto numero VI2007A000194 sempre della richiedente. For the production of corns we use explants of adult plants such as soy, wheat. Olive tree grown in a culture room with a photoperiod of 12 hours of light and 12 hours of darkness, at the lem pretura of 25 ° C during the day and 22 ° C at night. For the in vitro culture, the technique of bone marrow explants and stabilization of the plant cell line is used according to the procedures described in patent application number VI2007A000160 also by the applicant. The biomass must be propagated liquid - liquid maintaining an inoculum from 1: 5 to 1: 50 in relation to the cell weight of the inoculum and the volume of final medium. Genetically engineered plant cell lines have also been used for the accumulation of total cellular lypses according to the procedures described in patent application number VI2007A000194 also of the applicant.

2 - Terreno di coltura in Bioreattare 2 - Culture medium in Bioreactare

Per la crescita di colture, sia su terreno liquido che solido, viene utilizzato il terreno per cellule vegetali, corrispondente al terreno di Gamborg {Gamborge et al, 1968) addizionato degli opportuni ormoni. Le combinazioni ormonali e la composizione del terreno, ad esempio esemplificativo ma non limitativo, ricalca le metodiche presenti nella domanda di brevetto numero V12007A000160 sempre della richiedente. 3 - Condizioni di coltura in bioreattore di linee di cellule vegetali For the growth of cultures, both on liquid and solid medium, the medium for plant cells is used, corresponding to the medium of Gamborg (Gamborge et al, 1968) with the addition of the appropriate hormones. The hormonal combinations and the composition of the medium, for example but not limiting, follows the methods present in the patent application number V12007A000160 also by the applicant. 3 - Bioreactor culture conditions of plant cell lines

A tìtolo di esempio non limitativo inizialmente è stato usato un fermentatore BM-PPS3 delle Bioìndustrie Mantovane (Volketswil. Svìzzera) con un volume di lavoro di 10 1, sterilizzati le in situ tramite calore. Il bioreattore è munito dì filtri di areazione sterilizzanti in entrata ed in uscita, condensatore di vapore, elettrodo a pH, sonda della temperatura e manometro della pressione interna del vaso, Il pannello di controllo è provvisto degli strumenti di misura e controllo della temperatura del vaso, controllo e misura del pH, controllo e misura del livello dì schiuma e controllo e misura della velocità di agitazione (Royce et al, 1990), E' inoltre munito del controllo e della misura del flusso di aria in entrata e registratore a 6 bande; inoltre sono presenti sei pompe peristaltiche e differenti temporizzatori per il loro controllo. Il volume durante le fermentazioni è stato compreso fra 1 e 10 litri finali. La temperatura del vaso mantenuta a 26 °C ed è stato operata la misura del pH senza nessun controllo in automatico della correzione dello stesso. L' areazione come l’agitazione è variata a seconda del tipo di fermentazione. L 'inoculo, compreso fra il 5 e il 50 % volume/ volume, è stato operato tramite pompa peristaltica mentre il campionamento è avvenuto tramite l' installazione di un apposito sistema di prelievo posto sotto la base del vaso. Questo sistema prevede sia la presenza di un rubinetto che permetta di deflusso omogeneo degli aggregati cellulari dal vaso, sia un ingresso laterale per la sterilizzazione dell'apparato tramite vapore, As a non-limiting example, a BM-PPS3 fermenter from the Mantuan Bioindustries (Volketswil. Svìzzera) was initially used with a working volume of 10 1, sterilized in situ by heat. The bioreactor is equipped with inlet and outlet sterilizing aeration filters, steam condenser, pH electrode, temperature probe and pressure gauge inside the vessel.The control panel is equipped with instruments for measuring and controlling the vessel temperature , control and measurement of pH, control and measurement of foam level and control and measurement of stirring speed (Royce et al, 1990), It is also equipped with control and measurement of the incoming air flow and 6-band recorder ; there are also six peristaltic pumps and different timers for their control. The volume during fermentation was between 1 and 10 final liters. The vessel temperature was maintained at 26 ° C and the pH measurement was performed without any automatic control of the correction of the same. The aeration as well as the agitation varied according to the type of fermentation. The inoculation, comprised between 5 and 50% volume / volume, was carried out by means of a peristaltic pump while the sampling took place through the installation of a special sampling system placed under the base of the vessel. This system foresees both the presence of a tap that allows the homogeneous outflow of the cellular aggregates from the vessel, and a side inlet for the sterilization of the apparatus by steam,

Un altro sistema modulare di fermentazione ha previsto l'agitazione completa del vaso di reazione (bioreattore) con un volume di aria sovrastante la cultura compreso ira il 50 e il 75 % del volume totale del bioreattore. La velocità dì agitazione è compresa fra i 20 e i 200 rpm. 11 sistema di sterilizzazione del bioreattore è stato operato tramite calore e/o acido acetico in forma gassosa. Another modular fermentation system involved complete agitation of the reaction vessel (bioreactor) with a volume of air overlying the culture between 50 and 75% of the total volume of the bioreactor. The stirring speed is comprised between 20 and 200 rpm. The sterilization system of the bioreactor was operated by heat and / or acetic acid in gaseous form.

Claims

CLAIMS 1 Method for developing, growing and obtaining biomass derived from plant cell lines for the production of biofuels and / or biofuels of any nature 2, a procedure according to claim 1 for the production of biomass on a laboratory scale (final volumes from 0 to 100 liters) 3, a procedure in accordance with claim 1 for production on an industrial scale (final volumes greater than 100 liters) 4, a procedure according to claims 1 to 3 which provides for the use of modular bi-reactors for the liquid-liquid inoculation of larger volume bi-reactors 5, a procedure according to claims 1 to 3 which considers bioreactors in plastic, glass, steel and any solid containing material and / or its silanization with silicone derivatives 6, a procedure according to claims 1 to 3 which considers bioreactors equipped with internal mechanical agitation for mixing the plant cells with the substrate of the soil 7, a procedure that considers a stirring system, in accordance with claims 1 to 6, of the mechanical and / or pneumatic type 8. a procedure according to claim 7 which provides for the use of any type of shape and / or size and / or number of blades applied to the internal agitator 9, a procedure according to claims 1 to 6 which considers bi-reactors equipped with mechanical aeration by means of air and / or oxygen insufflation systems and / or other gaseous mixture for the ratio of oxygen itself to the crop 10. a procedure according to claims 1 to 9 in which the agitation is external to the reaction vessel and provides for the agitation of the whole bioreactor 11, a procedure according to claim 10 in which the agitation is of any type and preferably orbital type with eccentric movement 12. a procedure according to claims 1 to 11 in which air and / or oxygen and / or other gaseous mixture is present above the level of the culture broth preferably around 50% and in any case between 0% and 90% volume by volume 13, a procedure in accordance with claims 1 to 12 in which bioreactors (reaction vessels) are used in which there is external agitation and concomitant air overlying the culture broth 14. a procedure in accordance with claim 13 in which there is also ventilation by means of systems for the insufflation of air in an artificial way 15, a procedure in accordance with claims from 1 to 14 in which the blown air has a preferable flow rate around to I liter / minute and in any case between 0.000001 liters / minute and 300 liters / minute 16. a procedure in accordance with claims 1 to 15 in which a growth in liquid medium for the production of biomass is provided, characterized by the following operating steps: (i) inoculation of selected and / or genetically engineered undifferentiated plant cells, according to patent applications number VI2007A000160 and number VI2007A000194 also by the applicant, from solid medium and / or liquid medium in liquid medium for the development of at least 400% of the weight of the plant cells inoculated at time zero; (ii) transfer from the cells grown according to step (i) into new liquid liquid medium for the development of at least 400% of the weight of the plant cells inoculated at time zero: (iii) repetition of step (i) (H). 17 .. a procedure in accordance with claims 1 to 16 in which all the containers containing the plant cells in liquid medium are subjected to internal and / or external mechanical agitation 18. a procedure in accordance with claims 1 to 17 in which mechanical agitation is absent 19. a procedure in accordance with claims 1 to 18 in which aeration and / or other gases dissolved in the culture broth are absent 20. a procedure according to claims 1 to 19 in which the agitation is with an eccentric movement and the movement of which is comprised between 205 and 300 rpm 21. a procedure according to claims 1 to 20 which comprises a growth time of 2 to 45 days 22. a procedure according to claims 1 to 21 wherein the glue is at a temperature of between 8 and 14 ° C; 15 and 25 ° C; 25 and 38 ° C and higher than 38 ° C 23. a procedure in accordance with claims 1 to 22 in which the land is defined as in the patent application number VI2007A000160 always of the applicant 24. a procedure according to claims 1 to 23 in which the weight of the inoculated plant cells is between 0.1 and 4% and / or greater than 37% by weight / volume 25. a procedure according to claims 1 to 24 in which the oxygen supply is sufficient for cell growth according to the parameters of air overlying the culture broth as stated in claim 10 26. a procedure in accordance with claims 1 to 25 which takes into consideration the use of genetically modified plant cell lines to increase their total lipid content as described in application number V12007A000194 again by the applicant 27. a procedure in accordance with the claims to be 1 to 26 which provides for a sterilization system of the reaction vessel and of the culture medium 28. a procedure in accordance with 27 in which the sterilization takes place through heat and / or mechanical filtration and / or acetic acid and / or any system that guarantees the sterility of the bioreactor