ITUD20130111A1 - METHOD FOR DETECTION OF THE PROTEIN AGGREGATION AND ITS RELEVANT APPARATUS - Google Patents
METHOD FOR DETECTION OF THE PROTEIN AGGREGATION AND ITS RELEVANT APPARATUSInfo
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Description
Descrizione del trovato avente per titolo: Description of the invention having as title:
"METODO PER LA RILEVAZIONE DELL’AGGREGAZIONE PROTEICA E RELATIVO APPARATO DI RILEVAZIONE" "METHOD FOR DETECTION OF THE PROTEIN AGGREGATION AND RELATED DETECTION APPARATUS"
CAMPO DI APPLICAZIONE FIELD OF APPLICATION
II presente trovato si riferisce ad un metodo per la rilevazione dell’aggregazione proteica, in particolare della fibrillazione proteica, ed al relativo apparato di rilevazione. The present invention refers to a method for detecting protein aggregation, in particular protein fibrillation, and to the related detection apparatus.
In particolare, il presente trovato si riferisce ad una metodologia per la rilevazione della formazione di aggregati di fibrille proteiche responsabili di gravi patologie dell’uomo, quali il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la Sclerosi Laterale Amiotrofica, il morbo di Huntington. In particular, the present invention refers to a methodology for detecting the formation of aggregates of protein fibrils responsible for serious human pathologies, such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Amyotrophic Lateral Sclerosis, Huntington's disease.
STATO DELLA TECNICA STATE OF THE TECHNIQUE
È noto che l’aggregazione proteica porta alla fibrillazione amiloide che è responsabile di gravi malattie. Ad esempio, l’Alzheimer, il Parkinson, il morbo di Huntington, la Sclerosi Laterale Amiotrofica sono alcune delle malattie neurodegenerative correlate alla presenza di depositi di aggregati di proteine amiloidi. It is known that protein aggregation leads to amyloid fibrillation which is responsible for serious diseases. For example, Alzheimer's, Parkinson's, Huntington's disease, Amyotrophic Lateral Sclerosis are some of the neurodegenerative diseases related to the presence of deposits of amyloid protein aggregates.
I depositi di proteine amiliodi, anche detti aggregati amiloidi, comprendono fibre contenenti proteine ripiegate con conformazione beta-sheet, disposte in una cosiddetta struttura cross-beta. Le complessità e le dinamiche delle proteine ripiegate sono attualmente oggetto di studio per chiarire il meccanismo molecolare che coinvolge l’aggregazione proteica e per permettere di comprendere l’efficacia degli inibitori amiloidi. The deposits of amyloid proteins, also called amyloid aggregates, comprise fibers containing folded proteins with a beta-sheet conformation, arranged in a so-called cross-beta structure. The complexities and dynamics of folded proteins are currently being studied to clarify the molecular mechanism involving protein aggregation and to allow understanding the effectiveness of amyloid inhibitors.
In ambito biofarmaceutico e clinico/patologico sono in corso continui studi volti ad identificare un processo di controllo dell’aggregazione delle proteine amiloidi. In the biopharmaceutical and clinical / pathological fields, ongoing studies are underway aimed at identifying a process for controlling the aggregation of amyloid proteins.
È stato dimostrato recentemente che una delle proteine analizzabili per la valutazione del processo aggregativo delle proteine è la K-caseina carbossimetilato la quale può essere utilizzata come primo test per composti schermo con inibitori convenzionali e per attività di inibizione dell’aggregazione [Carver, J. A., Duggan, P. J., Ecroyd, H., Liu, Y., Meyer, A. G. & Tranberg, C. E. “Carboxymethylated-k-casein: A convenient tool for thè Identification of polyphenolic inhibitors of amyloid fibril formation”, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 18 (1), 2010, 222-228]. It has recently been shown that one of the proteins that can be analyzed for the evaluation of the aggregation process of proteins is carboxymethylated K-casein which can be used as a first test for screen compounds with conventional inhibitors and for aggregation inhibition activity [Carver, J. A., Duggan, P. J., Ecroyd, H., Liu, Y., Meyer, A. G. & Tranberg, C. E. "Carboxymethylated-k-casein: A convenient tool for the Identification of polyphenolic inhibitors of amyloid fibril formation", Bioorganic & Medicinal Chemistry, 18 ( 1), 2010, 222-228].
Attualmente, la K-caseina è probabilmente la proteina del latte che è stata meglio caratterizzata e che costituisce più del 70%-80% del totale delle proteine del latte bovino. Currently, K-casein is probably the milk protein that has been best characterized and constitutes more than 70% -80% of the total bovine milk protein.
La K-caseina carbossimetilato è una proteina amiloidogenica che subisce facilmente la nucleazione di aggregazione dipendente e che forma fibrilla amiloide allo stesso modo di peptidi amiloidogenici che sono causa delle malattie sopra identificate, ad esempio dell’ amiloide β (Αβ) che è causa del morbo di Alzheimer [Ecroyd, H., Koudelka, T., Thom, D. C., Williams, D. M., Devlin, G., Hoffmann, P. & Carver, J. A. “Dissociation from thè oligomeric state is thè ratelimiting step in amyloid fibril formation by k-casein.”, J. Biol. Chem. 283, 2008, 9012-9022]. Carboxymethyl K-casein is an amyloidogenic protein which easily undergoes nucleation by dependent aggregation and which forms amyloid fibril in the same way as amyloidogenic peptides which cause the diseases identified above, for example amyloid β (Αβ) which causes the disease of Alzheimer [Ecroyd, H., Koudelka, T., Thom, D. C., Williams, D. M., Devlin, G., Hoffmann, P. & Carver, J. A. "Dissociation from the oligomeric state is the ratelimiting step in amyloid fibril formation by k -casein. ”, J. Biol. Chem. 283, 2008, 9012-9022].
Attualmente, la rilevazione dell’aggregazione fibrillare della K-caseina carbossimetilato viene effettuata mediante tecniche di fluorescenza ottica. Le tecniche di fluorescenza ottica prevedono l’utilizzo di un saggio legante, o fluoroforo, che può essere a base di tioflavina-T fluorescente. Currently, the detection of the fibrillar aggregation of carboxymethyl K-casein is carried out using optical fluorescence techniques. Optical fluorescence techniques involve the use of a binding assay, or fluorophore, which can be based on fluorescent thioflavin-T.
Quando la tioflavina-T si lega agli aggregati di amiloide, se eccitata con una lunghezza d’onda di 440nm, riemette fluorescenza a 485nm. Mediante monitoraggio nel tempo della fluorescenza della tioflavina-T si può valutare la cinetica di formazione della fibrilla [H. LeVine III, “Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer's disease-amyloid peptides: Detection of amyloid aggregation in solution”, Protein Science 2 (3), 1993, 404-410]. When thioflavin-T binds to amyloid aggregates, if excited with a wavelength of 440nm, it re-emits fluorescence at 485nm. The kinetics of fibril formation [H. LeVine III, “Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer's disease-amyloid peptides: Detection of amyloid aggregation in solution”, Protein Science 2 (3), 1993, 404-410].
Le suddette prove possono prevedere anche l’introduzione di farmaci, per valutare la loro azione inibitrice della formazione di fibrilla amiloide. The aforementioned tests may also include the introduction of drugs, to evaluate their inhibitory action on the formation of amyloid fibril.
Il processo di monitoraggio dell’ amiloide viene tipicamente effettuato con prove di elevata durata temporale, anche diversi giorni, durante la quale la tioflavina-T, in soluzione, si intercala alla formazione della fibrilla, permettendo di misurare le dimensioni, i tempi di formazione e le cinetiche delle fibrille proteiche. The amyloid monitoring process is typically carried out with tests of high temporal duration, even several days, during which the thioflavin-T, in solution, intervenes with the formation of the fibril, allowing to measure the dimensions, the times of formation and the kinetics of protein fibrils.
Le rilevazione dell’aggregazione proteica viene effettuata con apparecchiature fluorimetriche che risultano particolarmente costose e complicate da utilizzare. The detection of protein aggregation is carried out with fluorimetric equipment which are particularly expensive and complicated to use.
Inoltre, come sopra descritto, per effettuare le prove è necessario l’utilizzo di sostanze fluorofore le quali devono essere inserite in soluzione con la dovuta accuratezza assieme alle proteine da analizzare. Ciò richiede particolare perizia da parte dell’operatore per ottenere risultati accurati. Furthermore, as described above, to carry out the tests it is necessary to use fluorophores which must be inserted into the solution with the due accuracy together with the proteins to be analyzed. This requires special expertise on the part of the operator to obtain accurate results.
Le sostanze fluorofore inserite in soluzione, inoltre, possono in alcuni casi falsare la bontà delle rilevazioni, in quanto queste si possono legare anche con altre strutture non direttamente correlate ad aggregati amiloidi. Furthermore, the fluorophoric substances inserted in solution can in some cases distort the goodness of the detections, as these can also bind with other structures not directly related to amyloid aggregates.
Nel caso in cui le prove vengano eseguite con lo scopo di valutare l’azione inibitrice di farmaci, le sostanze fluorofore presenti possono, in alcuni casi, intervenire sull’azione del farmaco non permettendo di valutare l’efficacia dello stesso. In the event that the tests are performed with the aim of evaluating the inhibitory action of drugs, the fluorophoric substances present may, in some cases, intervene on the action of the drug, not allowing to evaluate the effectiveness of the same.
Inoltre, nel caso in cui sia necessario valutare il tempo di risposta da parte di un farmaco, l’utilizzo di sostanze fluorofore, come rilevatore dell’aggregazione proteica, non permette di individuare con accuratezza gli istanti di intervento del farmaco. Furthermore, in the event that it is necessary to evaluate the response time of a drug, the use of fluorophores, as a detector of protein aggregation, does not allow to accurately identify the moments of intervention of the drug.
Uno scopo del presente trovato è quello di mettere a punto un metodo per la rilevazione dell’aggregazione proteica che sia semplice e non richieda l’impiego di apparati complessi e costosi. An object of the present invention is to develop a method for detecting protein aggregation that is simple and does not require the use of complex and expensive equipment.
Un ulteriore scopo del presente trovato è quello di mettere a punto un metodo per la rilevazione dell’aggregazione proteica i cui dati rilevati non siano falsati dall’introduzione di sostanze funzionali. A further object of the present invention is to develop a method for detecting protein aggregation whose detected data are not distorted by the introduction of functional substances.
È anche scopo del presente trovato mettere a punto un processo di analisi di farmaci al fine di valutare con accuratezza l’efficacia di inibizione all’aggregazione proteica di un farmaco. It is also an aim of the present invention to develop a drug analysis process in order to accurately evaluate the efficacy of inhibiting the protein aggregation of a drug.
È anche uno scopo del presente trovato quello di realizzare un apparato per la rilevazione dell’aggregazione proteica che sia semplice, poco costoso, e di facile realizzazione. It is also an object of the present invention to provide an apparatus for detecting protein aggregation that is simple, inexpensive, and easy to make.
Per ovviare agli inconvenienti della tecnica nota e per ottenere questi ed ulteriori scopi e vantaggi, la Richiedente ha studiato, sperimentato e realizzato il presente trovato. In order to obviate the drawbacks of the known art and to obtain these and further objects and advantages, the Applicant has studied, tested and implemented the present invention.
ESPOSIZIONE DEL TROVATO EXPOSURE OF THE FOUND
Il presente trovato è espresso e caratterizzato nelle rivendicazioni indipendenti. Le rivendicazioni dipendenti espongono altre caratteristiche del presente trovato o varianti dell’idea di soluzione principale. The present invention is expressed and characterized in the independent claims. The dependent claims disclose other features of the present invention or variants of the main solution idea.
In accordo con i suddetti scopi, forme di realizzazione del presente trovato sono relative ad un metodo per la rilevazione dell’aggregazione proteica che prevede di effettuare una analisi che include misurazioni di spettroscopia ad impedenza elettrica di un campione di una soluzione tamponata di proteine e correlare segnali elettrici rilevati con una dinamica di formazione di aggregati di fibrille proteiche. In accordance with the aforementioned purposes, embodiments of the present invention relate to a method for detecting protein aggregation which provides for carrying out an analysis that includes electrical impedance spectroscopy measurements of a sample of a buffered protein solution and correlating electrical signals detected with a dynamics of formation of aggregates of protein fibrils.
In accordo con la presente descrizione, il metodo del presente trovato non prevede l’utilizzo di misurazioni ottiche, né in particolare di sostanze fluorofore da mescolare con la soluzione proteica da analizzare. In accordance with the present description, the method of the present invention does not provide for the use of optical measurements, nor in particular of fluorophoric substances to be mixed with the protein solution to be analyzed.
Con il presente trovato è possibile effettuare un monitoraggio nel tempo dell’aggregazione delle proteine nelle fibrille basato su tecniche di spettroscopia ad impedenza elettrica le quali permettono di valutare l’andamento nel tempo del processo di aggregazione proteica che è causa di gravi patologie. With the present invention it is possible to monitor the aggregation of proteins in fibrils over time based on electrical impedance spectroscopy techniques which allow to evaluate the trend over time of the protein aggregation process which causes serious pathologies.
Il presente trovato si riferisce anche ad un apparato per la rilevazione dell’aggregazione proteica che comprende: The present invention also refers to an apparatus for detecting protein aggregation which includes:
- un dispositivo di misura comprendente almeno un corpo di contenimento provvisto di un serbatoio nel quale è inseribile almeno un campione di una soluzione proteica tamponata ed elettrodi interdigitati previsti almeno in corrispondenza di una parete interna del serbatoio, per effettuare rilevazioni di impedenza elettrica del campione contenuto nel serbatoio, - a measuring device comprising at least one containment body provided with a tank in which at least one sample of a buffered protein solution can be inserted and interdigitated electrodes provided at least in correspondence with an internal wall of the tank, to carry out electrical impedance measurements of the contained sample in the tank,
un rilevatore di impedenza collegato agli elettrodi interdigitati per riceverne relativi segnali elettrici ed effettuare misurazioni di spettroscopia ad impedenza elettrica, an impedance detector connected to the interdigitated electrodes to receive related electrical signals and perform electrical impedance spectroscopy measurements,
- un’unità di controllo ed elaborazione elettronica collegata al rilevatore di impedenza e configurata per correlare segnali elettrici rilevati con una dinamica di formazione di aggregati di fibrille proteiche. - an electronic control and processing unit connected to the impedance detector and configured to correlate detected electrical signals with a dynamics of formation of aggregates of protein fibrils.
Con l’apparato del presente trovato, poiché le proteine sono disciolte in una soluzione tampone le cui proprietà elettriche sono normalmente di carattere conduttivo, quando le fibrille delle proteine si formano in soluzione e ricadono sulla superfìcie dell’elettrodo, c’è una variazione locale della carica che modifica la risposta spettroscopica di impedenza elettrica e permette di ottenere informazioni relative al processo aggregativo delle proteine. With the apparatus of the present invention, since the proteins are dissolved in a buffer solution whose electrical properties are normally conductive, when the protein fibrils are formed in solution and fall on the surface of the electrode, there is a local variation of the charge that modifies the spectroscopic response of electrical impedance and allows to obtain information relating to the aggregation process of proteins.
Il metodo e l’apparato di rilevazione dell’aggregazione proteica permettono una valutazione del processo senza la presenza di molecole fluorofore, quali la tioflavina-T, come marcatore. The method and the apparatus for detecting protein aggregation allow an evaluation of the process without the presence of fluorophoric molecules, such as thioflavin-T, as a marker.
Rientra nel presente trovato anche un metodo per la valutazione dell’ efficacia di un farmaco inibitore dell’aggregazione proteica che prevede di aggiungere all’anzidetta soluzione proteica tamponata, un quantitativo di farmaco e, in base alla dinamica di formazione di aggregati proteici che viene rilevata in presenza del farmaco, derivare l’efficacia del farmaco. The present invention also includes a method for evaluating the efficacy of a protein aggregation inhibitor drug which provides for the addition of a quantity of drug to the aforementioned buffered protein solution and, on the basis of the dynamics of the formation of protein aggregates that is detected in the presence of the drug, derive the effectiveness of the drug.
Fa parte del presente trovato anche un kit per l’analisi dell’efficacia di inibizione dell’aggregazione proteica da parte di un farmaco inibitore comprendente un apparato come sopra espresso ed una soluzione tampone da miscelare con una quantità di proteina da analizzare e con un farmaco inibitore dell’ aggregazione proteica. The present invention also includes a kit for analyzing the efficacy of inhibition of protein aggregation by an inhibitor drug comprising an apparatus as described above and a buffer solution to be mixed with a quantity of protein to be analyzed and with a drug. protein aggregation inhibitor.
ILLUSTRAZIONE DEI DISEGNI ILLUSTRATION OF DRAWINGS
Queste ed altre caratteristiche del presente trovato appariranno chiare dalla seguente descrizione di forme di realizzazione, fornite a titolo esemplificativo, non limitativo, con riferimento agli annessi disegni in cui: These and other characteristics of the present invention will become clear from the following description of embodiments, provided by way of non-limiting example, with reference to the attached drawings in which:
- la fig. 1 è una rappresentazione schematica di un apparato per la rilevazione dell’aggregazione proteica in accordo con una prima forma di realizzazione del presente trovato; - fig. 1 is a schematic representation of an apparatus for detecting protein aggregation in accordance with a first embodiment of the present invention;
- la fig. 2 è una vista prospettica in esploso di alcuni componenti dell’apparato di fig. 1; - fig. 2 is an exploded perspective view of some components of the apparatus of fig. 1;
- la fig. 3 è un particolare in gradito di fig. 2 in accordo con una possibile forma di realizzazione; - fig. 3 is an appreciated detail of fig. 2 according to a possible embodiment;
- la fig. 4 è una rappresentazione schematica del processo di aggregazione proteica; - fig. 4 is a schematic representation of the protein aggregation process;
- la fig. 5 è una rappresentazione di un equivalente elettrico del processo di aggregazione proteico ; - fig. 5 is a representation of an electrical equivalent of the protein aggregation process;
- le figg. 6a e 6b sono grafici rispettivamente del modulo e della fase dell’impedenza rilevate in frequenza durante prove sperimentali di validazione della rilevazione del processo di aggregazione proteica; - figs. 6a and 6b are graphs respectively of the module and phase of the impedance detected in frequency during experimental validation tests of the detection of the protein aggregation process;
- la fig. 7 è un grafico che riporta dati rilevati durante prove sperimentali per la valutazione del processo di aggregazione proteica con e senza l’aggiunta di un farmaco inibitore. - fig. 7 is a graph showing data collected during experimental tests for the evaluation of the protein aggregation process with and without the addition of an inhibitor drug.
Per facilitare la comprensione, numeri di riferimento identici sono stati utilizzati, ove possibile, per identificare elementi comuni identici nelle figure. Va inteso che elementi e caratteristiche di una forma di realizzazione possono essere convenientemente incorporati in altre forme di realizzazione senza ulteriori precisazioni. To facilitate understanding, identical reference numbers have been used wherever possible to identify identical common elements in the figures. It should be understood that elements and features of one embodiment can be conveniently incorporated into other embodiments without further specification.
DESCRIZIONE DI FORME DI REALIZZAZIONE DESCRIPTION OF EMBODIMENTS
Con riferimento alla fig. 1 viene descritta una possibile forma di realizzazione di un apparato di rilevazione 10 secondo il presente trovato, che può essere combinata con ulteriori forme di realizzazione qui descritte. With reference to fig. 1 describes a possible embodiment of a detection apparatus 10 according to the present invention, which can be combined with further embodiments described here.
L’apparato di rilevazione 10, che può essere vantaggiosamente miniaturizzato e compatto, comprende un dispositivo di misura provvisto di corpo di contenimento 11 provvisto, a sua volta, di un serbatoio 12 nel quale è inseribile almeno una soluzione di analisi. The detection apparatus 10, which can advantageously be miniaturized and compact, comprises a measuring device equipped with a containment body 11 provided, in turn, with a tank 12 in which at least one analysis solution can be inserted.
In possibili soluzioni realizzative del presente trovato, il serbatoio 12 presenta una forma sostanzialmente cilindrica anche se non si esclude che, in altre forme di realizzazione, il serbatoio 12 possa avere una forma diversa, ad esempio prismatica. In possible embodiments of the present invention, the tank 12 has a substantially cylindrical shape even if it is not excluded that, in other embodiments, the tank 12 may have a different shape, for example prismatic.
Una possibile implementazione realizzativa del presente trovato prevede che il serbatoio 12 abbia una capacità volumetrica compresa fra 50μ1 e 70μ1, preferibilmente di circa 60μ1. A possible embodiment of the present invention provides that the tank 12 has a volumetric capacity comprised between 50μ1 and 70μ1, preferably of about 60μ1.
A solo titolo esemplificativo, nel caso in cui il serbatoio 12 abbia forma sostanzialmente cilindrica, quest’ultimo presenta un diametro di circa 3mm, ed un’altezza di circa 8mm. By way of example only, if the tank 12 has a substantially cylindrical shape, the latter has a diameter of about 3mm, and a height of about 8mm.
II dispositivo di misura prevede, ad esempio su almeno una delle pareti interne del serbatoio 12, elettrodi 13 selettivamente aumentabili elettricamente con le modalità sotto descritte per la rilevazione di grandezze elettriche. The measuring device provides, for example on at least one of the internal walls of the tank 12, electrodes 13 which can be selectively increased electrically with the methods described below for the detection of electrical quantities.
In accordo con una possibile implementazione realizzativa del presente trovato, una delle quali ad esempio rappresentata nelle figg. 2 e 3, gli elettrodi 13 possono presentare una configurazione interdigitata ovvero aventi struttura dove la lunghezza della regione tra due elettrodi 13 è aumentata foggiando gli elettrodi, o le metallizzazioni che li realizzano, a strisce parallele, o estensioni, come le dita di una mano. In accordance with a possible embodiment of the present invention, one of which is represented for example in figs. 2 and 3, the electrodes 13 can have an interdigitated configuration or have a structure where the length of the region between two electrodes 13 is increased by shaping the electrodes, or the metallizations that make them, in parallel strips, or extensions, such as the fingers of a hand .
Possibili soluzioni realizzative del presente trovato possono prevedere che gli elettrodi 13 comprendano una pluralità di coppie di estensioni 22, a solo titolo esemplificativo si può prevedere che gli elettrodi 13 comprendano da 50 a 70 coppie di estensioni 22, preferibilmente da 55 a 65 coppie di estensioni 22. A solo titolo esemplificativo e non limitativo del presente trovato ciascuna estensione 22 può avere una larghezza di ΙΟμηι ed una lunghezza di 2mm. In possibili soluzioni realizzative del presente trovato, le estensioni 22 sono disposte parallele fra loro e distanziate reciprocamente di circa 5μηι. Possible embodiments of the present invention can provide that the electrodes 13 comprise a plurality of pairs of extensions 22, by way of example only it can be provided that the electrodes 13 comprise from 50 to 70 pairs of extensions 22, preferably from 55 to 65 pairs of extensions 22. By way of non-limiting example of the present invention each extension 22 can have a width of ΙΟμηι and a length of 2mm. In possible embodiments of the present invention, the extensions 22 are arranged parallel to each other and mutually spaced by about 5μη.
Implementazioni realizzative del presente trovato possono prevedere che gli elettrodi 13 siano depositati, su almeno una delle pareti interne del serbatoio 12, con tecniche di deposizione chimica o fìsica di vapore anche note come tecniche di “Chemical Vapour Deposition” o “CVD”, tecniche di “Phisical Vapour Deposition” o “PVD”, o tecniche “Plasma-Enhanced Chemical Vapor Deposition” o PECVD. Implementations of the present invention can provide that the electrodes 13 are deposited, on at least one of the internal walls of the tank 12, with chemical or physical vapor deposition techniques also known as "Chemical Vapor Deposition" or "CVD" techniques, "Phisical Vapor Deposition" or "PVD", or "Plasma-Enhanced Chemical Vapor Deposition" or PECVD techniques.
Alcune soluzioni realizzative del presente trovato possono prevedere che gli elettrodi 13 siano realizzati con una delle tecniche PVD, nota come deposizione a polimerizzazione catodica, o deposizione sputtering. Some embodiments of the present invention may provide that the electrodes 13 are made with one of the PVD techniques, known as cathodic polymerization deposition, or sputtering deposition.
Possibili implementazioni realizzative del presente trovato prevedono che gli elettrodi 13 siano realizzati in oro anche se non si esclude che, in altre soluzioni realizzative siano realizzati in platino o in ossido di indio-stagno anche noto con Γ acronimo ITO. Possible embodiments of the present invention provide that the electrodes 13 are made of gold even if it is not excluded that, in other embodiments they are made of platinum or indium-tin oxide, also known by the acronym ITO.
Una possibile forma realizzativa del presente trovato, ad esempio rappresentata nelle figg. 1 e 2 prevede che il corpo di contenimento 11 comprenda un primo componente 14 ed un secondo componente 16. A possible embodiment of the present invention, represented for example in figs. 1 and 2 provides that the containment body 11 comprises a first component 14 and a second component 16.
Il primo componente 14 è configurato a piastrina ed è provvisto di una prima superficie 15 sulla quale sono ricavati gli elettrodi 13. The first component 14 is shaped like a plate and is provided with a first surface 15 on which the electrodes 13 are formed.
II primo componente 14 può essere realizzato in vetro o in materiali polimerici. The first component 14 can be made of glass or polymeric materials.
Una prima forma di realizzazione del trovato prevede che il primo componente 14 sia realizzato con vetro al quarzo. Altre possibili forme di realizzazione prevedono che il primo componente 14 sia realizzato in policarbonato. A first embodiment of the invention provides that the first component 14 is made of quartz glass. Other possible embodiments provide that the first component 14 is made of polycarbonate.
Il secondo componente 16 è provvisto di una sede di contenimento 17 aperta verso l’esterno almeno da un lato e nella quale, in uso, viene posto un campione di una soluzione proteica tamponata da analizzare. Il primo componente 14 è posizionabile con la sua prima superficie 15 a chiusura della sede di contenimento 17 del secondo componente 16 per definire il serbatoio 12. The second component 16 is provided with a containment seat 17 open to the outside at least on one side and in which, in use, a sample of a buffered protein solution to be analyzed is placed. The first component 14 can be positioned with its first surface 15 closing the containment seat 17 of the second component 16 to define the tank 12.
In accordo con possibili soluzioni realizzative del presente trovato, il secondo componente 16 comprende un primo strato 18 provvisto di un’apertura passante 19 ed un secondo strato 20 configurato a piastrina e posizionabile a chiusura di un lato dell’ apertura passante 19 per definire la sede di contenimento 17. In particolare, si prevede che l’apertura passante 19 del primo strato 18 venga chiusa ermeticamente da un lato e dall’altro mediante rispettivamente il primo componente 14 ed il secondo strato 20. In accordance with possible embodiments of the present invention, the second component 16 comprises a first layer 18 provided with a through opening 19 and a second layer 20 configured as a plate and positioned to close one side of the through opening 19 to define the seat containment 17. In particular, provision is made for the through opening 19 of the first layer 18 to be hermetically sealed on one side and on the other by respectively the first component 14 and the second layer 20.
Possibili soluzioni realizzative del presente trovato possono prevedere che il secondo componente 16 sia realizzato con un materiale polimerico o vetro. Possible embodiments of the present invention can provide that the second component 16 is made of a polymeric material or glass.
Una possibile implementazione realizzativa prevede che il secondo componente 16 sia realizzato in polidimetilsilossano. A possible embodiment provides that the second component 16 is made of polydimethylsiloxane.
In accordo con possibili implementazioni realizzative il primo componente 14 ed il secondo componente 16 possono essere mantenuti collegati reciprocamente mediante organi di fissaggio 21 per chiudere ermeticamente il serbatoio 12. In accordance with possible embodiments, the first component 14 and the second component 16 can be kept mutually connected by means of fastening members 21 to hermetically close the tank 12.
In accordo con possibili soluzioni realizzative, gli organi di fissaggio 21 possono comprendere una pinza, un morsetto, viti, elementi magnetici, o elementi simili ed assimilabili idonei allo scopo. In accordance with possible embodiments, the fastening members 21 can comprise a gripper, a clamp, screws, magnetic elements, or similar and similar elements suitable for the purpose.
L’apparato di rilevazione 10 comprende un rilevatore di impedenza 23 controllato automaticamente da un’unità di controllo ed elaborazione elettronica 24. The detection apparatus 10 includes an impedance detector 23 automatically controlled by a control and electronic processing unit 24.
Il rilevatore di impedenza 23 è collegabile agli elettrodi 13 mediante organi di collegamento elettrico 26, quali cablaggio elettrici, fili conduttori, o loro possibili combinazioni. The impedance detector 23 can be connected to the electrodes 13 by means of electrical connection members 26, such as electrical wiring, conducting wires, or possible combinations thereof.
Il rilevatore di impedenza 23, o rilevatore LCR, è configurato per rilevare nella soluzione di analisi, ed attraverso gli elettrodi 13 l’induttanza, la capacità e la resistenza ovvero, più in generale, modulo e fase dell’impedenza elettrica. Un esempio di rilevatore di impedenza 23 utilizzabile è quello prodotto dalla Agilent Technology, con il codice di riferimento Agilent E4980A LCR. L’unità di controllo ed elaborazione elettronica 24, del tipo completamente programmabile, è stata sviluppata per acquisire automaticamente i dati di impedenza dal rilevatore di impedenza 23, ed estrapolare da essi delle informazioni relative alla formazione di aggregati amiloidi. The impedance detector 23, or LCR detector, is configured to detect in the analysis solution, and through the electrodes 13, the inductance, the capacitance and the resistance or, more generally, the module and phase of the electrical impedance. An example of a usable impedance detector 23 is the one manufactured by Agilent Technology, with the Agilent reference number E4980A LCR. The control and electronic processing unit 24, of the fully programmable type, was developed to automatically acquire the impedance data from the impedance detector 23, and extrapolate from them information relating to the formation of amyloid aggregates.
In possibili soluzioni realizzative, l’unità di controllo ed elaborazione elettronica 24 è configurata per implementare un programma idoneo ad interpolare i dati rilevati dal rilevatore di impedenza 23 ed a fornire indicazioni sul processo di aggregazione. In possible embodiments, the control and electronic processing unit 24 is configured to implement a suitable program to interpolate the data detected by the impedance detector 23 and to provide information on the aggregation process.
Una possibile soluzione realizzativa prevede che l’unità di controllo ed elaborazione elettronica 24 sia configurata per implementare un modello ad elementi concentrati o “lumped element model” il cui andamento nel tempo degli elementi fornisce indicazioni sull’ aggregazione. A possible implementation solution provides that the control and electronic processing unit 24 is configured to implement a model with concentrated elements or "lumped element model" whose trend over time of the elements provides indications on the aggregation.
In accordo con possibili forme di realizzazione, si può prevedere che l’apparato di rilevazione 10 comprenda una camera termostatica 25 nella quale inserire almeno il corpo di contenimento 11. In accordance with possible embodiments, it can be envisaged that the detection apparatus 10 comprises a thermostatic chamber 25 in which to insert at least the containment body 11.
La camera termostatica 25 può essere configurata per mantenere almeno la soluzione di analisi ad una temperatura compresa fra 34°C e 39°C, preferibilmente a circa 37°C. The thermostatic chamber 25 can be configured to maintain at least the analysis solution at a temperature between 34 ° C and 39 ° C, preferably at about 37 ° C.
Il metodo di rilevazione dell’aggregazione, secondo il presente trovato prevede di preparare o mettere a disposizione una soluzione proteica tamponata miscelando opportunamente un voluto quantitativo delle proteine, o di una soluzione proteica, da analizzare con una soluzione tampone e l’introduzione nel serbatoio 12 di un campione dell’anzidetta soluzione proteica tamponata. In accordo con soluzioni realizzative del presente trovato, la soluzione tampone utilizzata per preparare la soluzione proteica tamponata presenta proprietà di conducibilità elettrica al fine di permettere rilevazioni impedenziometriche . The method of detecting the aggregation, according to the present invention, provides for the preparation or making available of a buffered protein solution by suitably mixing a desired quantity of the proteins, or of a protein solution, to be analyzed with a buffer solution and introducing it into the tank 12 of a sample of the aforementioned buffered protein solution. In accordance with embodiments of the present invention, the buffer solution used to prepare the buffered protein solution has electrical conductivity properties in order to allow impedance measurements.
Una possibile forma di realizzazione del presente trovato prevede che la soluzione tampone comprenda una soluzione di fosfato di sodio. Altre forme realizzative del presente trovato possono prevedere che la soluzione tampone sia scelta in un gruppo costituito da un tampone fosfato PBS, agenti denaturanti e loro possibili combinazioni. A possible embodiment of the present invention provides that the buffer solution comprises a sodium phosphate solution. Other embodiments of the present invention can provide that the buffer solution is selected from a group consisting of a phosphate buffer PBS, denaturing agents and their possible combinations.
La soluzione tampone fosfato PBS salino comprende una soluzione salina acquosa contenente cloruro di sodio, fosfato di sodio e, in alcune formulazioni, cloruro di potassio. PBS Phosphate Buffered Saline comprises an aqueous saline solution containing sodium chloride, sodium phosphate and, in some formulations, potassium chloride.
Possibili implementazioni realizzative prevedono che la soluzione tampone fosfato PBS presenti un titolo lx. Possible embodiments envisage that the PBS phosphate buffer solution has a lx titer.
Gli agenti denaturanti possono comprendere guanidinio cloruro e/o urea. In accordo con possibili soluzioni realizzative del presente trovato relative ad un metodo di valutazione deH’efficacia di inibizione dell’aggregazione proteica da parte di un farmaco, si può prevedere che alla soluzione proteica tamponata venga aggiunto anche un farmaco inibitore dell’aggregazione proteica, ciò al fine di valutarne l’azione inibitrice. Denaturing agents may include guanidinium chloride and / or urea. In accordance with possible embodiments of the present invention relating to a method for evaluating the efficacy of inhibiting protein aggregation by a drug, it can be envisaged that a drug inhibiting protein aggregation is also added to the buffered protein solution. in order to evaluate its inhibitory action.
Il metodo di analisi dell’aggregazione proteica prevede poi la rilevazione di grandezze impedenziometriche nella soluzione di analisi comprendente almeno la soluzione tampone, la soluzione proteica ed eventualmente il farmaco da valutare. The protein aggregation analysis method then provides for the detection of impedance quantities in the analysis solution including at least the buffer solution, the protein solution and possibly the drug to be evaluated.
La rilevazione delle grandezze impedenziometriche può essere effettuata nel tempo ad intervalli regolari per un determinato tempo di prova. The detection of the impedance quantities can be carried out over time at regular intervals for a given test time.
A titolo d’esempio, il tempo di prova può essere variabile fra 10 e 30 ore e le rilevazioni possono essere effettuate con una cadenza di 1-10 minuti, preferibilmente ogni 5 minuti. By way of example, the test time can vary between 10 and 30 hours and the measurements can be carried out with a frequency of 1-10 minutes, preferably every 5 minutes.
Possibili forme di realizzazione possono prevedere che le misurazioni di spettroscopia ad impedenza elettrica vengano effettuate valutando un intervallo di frequenze per un tempo ciclo, o cadenza, compreso tra 4 e 6 minuti, ripetendo la valutazione dell’intervallo di frequenze per un tempo prova complessivo compreso tra 16 ore e 20 ore. Possible embodiments can provide that the electrical impedance spectroscopy measurements are carried out by evaluating a frequency interval for a cycle time, or cadence, between 4 and 6 minutes, repeating the evaluation of the frequency interval for an overall test time including between 16 hours and 20 hours.
Il metodo può comprendere una fase di elaborazione delle grandezze impedenziometriche durante la quale l’unità di controllo ed elaborazione elettronica 24 estrapola informazioni relative all’andamento del processo aggregativo proteico nel tempo. The method may include a phase of processing the impedance quantities during which the control and electronic processing unit 24 extrapolates information relating to the progress of the protein aggregation process over time.
In accordo con possibili implementazioni del metodo secondo il presente trovato, si prevede che almeno la soluzione di analisi venga mantenuta, per l’intera durata della prova, o per almeno parte di essa, ad una temperatura controllata. A solo titolo esemplificativo, la soluzione di analisi può essere mantenuta ad una temperatura costante nel tempo. In accordance with possible implementations of the method according to the present invention, it is expected that at least the analysis solution is kept, for the entire duration of the test, or for at least part of it, at a controlled temperature. By way of example only, the analysis solution can be kept at a constant temperature over time.
Prove sperimentali Experimental tests
La Richiedente ha effettuato prove sulle soluzioni di analisi ottenendo risultati soddisfacenti sulla K-caseina, una proteina del latte. Le prove sono state eseguite con o senza l’aggiunta di un farmaco inibitore dell’aggregazione proteica. The Applicant has carried out tests on the analysis solutions obtaining satisfactory results on K-casein, a milk protein. The tests were performed with or without the addition of a protein aggregation inhibitor drug.
Come farmaco inibitore dell’aggregazione proteica è stata utilizzata la doxiciclina. Doxycycline was used as an inhibitor of protein aggregation.
Un primo test è stato effettuato con una soluzione proteica di K-caseina carbossimetilato dissolta in una soluzione tampone di fosfato di sodio 50mM con pH 7.2 e una quantità di ΙΟμΜ di tioflavina-T. La tioflavina-T è stata aggiunta alla soluzione tampone unicamente per una validazione anche ottica tradizionale dell’effettiva cinetica di aggregazione proteica. La sua aggiunta risulta tuttavia opzionale, in quanto non necessaria la presenza di sostanze fluorofore al fine della rilevazione del processo aggregativo delle proteine. A first test was carried out with a protein solution of carboxymethylated K-casein dissolved in a 50mM sodium phosphate buffer solution with pH 7.2 and a quantity of ΙΟμΜ of thioflavin-T. Thioflavin-T was added to the buffer solution solely for a traditional optical validation of the actual kinetics of protein aggregation. However, its addition is optional, since the presence of fluorophores is not necessary for the purpose of detecting the aggregation process of proteins.
La soluzione proteica era ad una concentrazione finale di 0.5 mg/ml (27μΜ). The protein solution was at a final concentration of 0.5 mg / ml (27μΜ).
La soluzione proteica e la soluzione tampone sono state miscelate fra loro per ottenere una soluzione di analisi introdotta poi nel serbatoio 12. The protein solution and the buffer solution were mixed together to obtain an analysis solution which was then introduced into tank 12.
In generale, secondo forme di realizzazione qui descritte, per ciascuna analisi di spettroscopia ad impedenza elettrica, si prevede di utilizzare una quantità di proteina in soluzione tamponata compresa tra 0,025 mg e 0,035 mg. In general, according to embodiments described here, for each analysis of electrical impedance spectroscopy, it is envisaged to use an amount of protein in a buffered solution comprised between 0.025 mg and 0.035 mg.
La Richiedente ha riscontrato che la quantità di campione di proteina presente nella soluzione tamponata e necessaria per effettuare le misurazioni con spettroscopia impedenziometrica sia molto più ridotta rispetto a quella necessaria per le analisi in fluorescenza. The Applicant has found that the quantity of protein sample present in the buffered solution and necessary to carry out the measurements with impedance spectroscopy is much smaller than that necessary for the fluorescence analyzes.
Forme di realizzazione del presente trovato prevedono che gli elettrodi 13 vengano alimentati in tensione con una frequenza variabile da 20Hz a 2 IO<6>Hz spaziata logaritmicamente. Embodiments of the present invention provide that the electrodes 13 are supplied in voltage with a frequency ranging from 20Hz to 2 10 <6> Hz spaced logarithmically.
Implementazioni realizzative prevedono che l’unità di controllo ed elaborazione elettronica 24 ed il rilevatore di impedenza 23 siano state impostate per realizzare misure di impedenza con una tensione di alimentazione di lOOmV (per evitare le reazioni di ossidoriduzione) con 24 punti di frequenza nel campo da 20Hz a 2 IO<6>Hz equispaziate logaritmicamente. Le rilevazioni sono state realizzate ogni 5 minuti, per una durata totale di circa 18 ore. Implementations foresee that the control and electronic processing unit 24 and the impedance detector 23 have been set to carry out impedance measurements with a power supply voltage of 100mV (to avoid redox reactions) with 24 frequency points in the range to be 20Hz to 2 IO <6> Hz equally spaced logarithmically. The surveys were carried out every 5 minutes, for a total duration of about 18 hours.
L’unità di controllo ed elaborazione elettronica 24, che implementa il lumped element model, ha estrapolato dai dati rilevati informazioni relative all’aggregazione. The control and electronic processing unit 24, which implements the lumped element model, has extrapolated information relating to the aggregation from the data collected.
La fig. 4 viene utilizzata per rappresentare schematicamente una possibile forma di precipitazione delle fibrille proteiche sugli elettrodi 13. Fig. 4 is used to schematically represent a possible form of precipitation of the protein fibrils on the electrodes 13.
La fig. 5 viene utilizzata per fornire una rappresentazione equivalente elettrica del processo aggregativo per valutare la deposizione di fibrilla in funzione delle grandezze impedenziometriche rilevate. Fig. 5 is used to provide an electrical equivalent representation of the aggregation process to evaluate fibril deposition as a function of the detected impedance quantities.
In particolare, con riferimento alla fig. 5 gli elementi C0e L0sono rispettivamente una capacità ed un’induttanza legate alla non idealità dei cavi di connessione. Tali grandezze vengono neutralizzate realizzando le compensazioni “circuito aperto” e “cortocircuito” prima delle misurazioni sulle proprietà del campione. In particular, with reference to fig. 5 elements C0 and L0 are respectively a capacitance and an inductance related to the non-ideality of the connection cables. These quantities are neutralized by making the “open circuit” and “short circuit” compensations before the measurements on the sample properties.
L’elemento CPE, o elemento a fase costante tiene conto dell’effetto di doppio strato che si viene a creare fra le fibrille depositate e le estensioni 20 degli elettrodi 13. The CPE element, or constant phase element takes into account the double layer effect that is created between the deposited fibrils and the extensions 20 of the electrodes 13.
Il doppio strato si forma ogniqualvolta una soluzione ionica salina, a contatto con elettrodi metallici, si trova a scambiare con essi una quantità di carica. The double layer is formed whenever an ionic saline solution, in contact with metal electrodes, is found to exchange a quantity of charge with them.
L’impedenza dell’elemento a fase costante è esprimibile dalla formula: The impedance of the constant phase element can be expressed by the formula:
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<Zc>'‘~u<»rc DL <Zc> '' ~ u <»rc DL
Essendo CDLla capacità del doppio strato e a è lo scostamento di fase che è compreso fra 0 e 1. Since CDL is the capacitance of the double layer and a is the phase shift which is between 0 and 1.
Lo spessore del doppio strato, tipicamente dell’ordine di qualche nanometro, è legato alla lunghezza di Debye e dipende quindi dalla concentrazione dei sali in soluzione. In questo sottilissimo strato, il passaggio di carica non avviene né per via capacitiva, caso in cui a = 1, né per via resistiva, caso in cui a = 0, bensì in modo intermedio; all’aumentare della concentrazione di sali in soluzione la lunghezza di Debye diminuisce e anche a diminuisce. The thickness of the double layer, typically of the order of a few nanometers, is related to the Debye length and therefore depends on the concentration of the salts in solution. In this very thin layer, the charge passage does not take place either by capacitive way, in the case where a = 1, or by resistive way, in case a = 0, but rather in an intermediate way; as the concentration of salts in solution increases, the Debye length decreases and also a decreases.
La quantità CDL è la capacità a facce piane e parallele calcolata all’interno di questo strato, avente quindi superficie pari alla superficie dell’elettrodo e distanza fra le armature pari alla lunghezza di Debye. The CDL quantity is the flat and parallel face capacitance calculated within this layer, therefore having a surface equal to the electrode surface and a distance between the reinforcements equal to the Debye length.
Le grandezze RSOL e CSOL rappresentano il comportamento dell’ impedenza della soluzione. The RSOL and CSOL quantities represent the impedance behavior of the solution.
La rilevazione effettuata, che tiene conto della precipitazione della fibrilla sugli elettrodi, è rappresentata dall’evoluzione nel tempo della capacità CFIB-Risultati ottenuti The detection carried out, which takes into account the precipitation of the fibril on the electrodes, is represented by the evolution over time of the CFIB capacity-Results obtained
Le fìgg. 6a e 6b, sono una rappresentazione grafica, rispettivamente, del valore assoluto e della fase dell’impedenza misurata (dopo la compensazione circuito aperto e cortocircuito) nel corso delle 18 ore di prova per la saggiatura sperimentale della precipitazione di fibrilla sugli elettrodi. L’accuratezza dei dati dell’impedenza acquisita dopo compensazione aperta e di corto è del 0.1%. In prima battuta è chiaro che il doppio strato, identificato dal parametro CPE riveste un ruolo significativo e maschera fortemente le variazioni dell’impedenza nel tempo, ciò si può osservare in fig. 6a, alle basse frequenze, laddove il valore dell’ impedenza misurata è di gran lunga superiore alla sua variabilità. The figs. 6a and 6b, are a graphical representation, respectively, of the absolute value and the phase of the impedance measured (after compensation of the open circuit and short circuit) during the 18 hours of testing for the experimental assay of the precipitation of fibril on the electrodes. The accuracy of the acquired impedance data after open and short compensation is 0.1%. At first it is clear that the double layer, identified by the CPE parameter plays a significant role and strongly masks the changes in impedance over time. This can be seen in fig. 6a, at low frequencies, where the measured impedance value is far greater than its variability.
È anche possibile apprezzare che la grandezza CSOL è troppo piccola e non interviene nel campo di frequenze di indagine in quanto, se CSOL intervenisse, si osserverebbe in fig. 6a, alle alte frequenze un andamento di nuovo decrescente del modulo di impedenza e in fig. 6b un ritorno della fase a valori prossimi a -90°. It is also possible to appreciate that the CSOL size is too small and does not intervene in the investigation frequency range since, if CSOL intervened, it would be observed in fig. 6a, at high frequencies a decreasing trend of the impedance module again and in fig. 6b a return of the phase to values close to -90 °.
Allo scopo di meglio distinguere i parametri del modello che sono variabili nel tempo, i dati dell’impedenza rilevata con spettroscopia impedenziometrica sono stati interpolati dall’unità di controllo ed elaborazione elettronica 24 mediante l’ implementazione di un programma iterativo. In order to better distinguish the model parameters that are variable over time, the impedance data detected with impedance spectroscopy have been interpolated by the control and electronic processing unit 24 by implementing an iterative program.
I dati interpolati forniscono come risultato RSOL»10Q, CDi®70nF, a«0.9 e la loro accuratezza è di circa 5%. The interpolated data results in RSOL »10Q, CDi®70nF, at« 0.9 and their accuracy is about 5%.
La quantità CFIB non può essere stimata direttamente dal programma dato che nel modello equivalente di fig. 5 il parametro CFIB è posto in serie al CPE il quale presenta un elevato valore di fase a. Per questa ragione sono state eseguite le misurazioni di impedenza della sola soluzione tampone, senza l’aggiunta di soluzione proteica, alle stesse condizioni, con dati acquisiti ogni 5 minuti e per 18 ore. The CFIB quantity cannot be estimated directly from the program since in the equivalent model of fig. 5 the CFIB parameter is placed in series with the CPE which has a high phase value a. For this reason, impedance measurements were performed on the buffer solution alone, without the addition of protein solution, under the same conditions, with data acquired every 5 minutes and for 18 hours.
II valore del parametro CFIB può essere stimato con la relazione sotto riportata, valutando l’evoluzione del doppio strato, ovvero del parametro CPE, nel tempo delle proteine rispetto all’evoluzione del doppio strato nella soluzione tampone: The value of the CFIB parameter can be estimated with the relationship below, evaluating the evolution of the bilayer, or of the CPE parameter, over time of the proteins with respect to the evolution of the bilayer in the buffer solution:
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Nella relazione si valuta Γ impedenza del doppio strato per le proteine come la somma del contributo del doppio strato CPE e del contributo CFIB a cui è sottratto il contributo del solo doppio strato CPE nella soluzione tampone. Per la verifica dei dati ottenuti sono state ripetute tre volte le prove alle stesse condizioni. In the relation we evaluate Γ impedance of the bilayer for proteins as the sum of the contribution of the CPE bilayer and the CFIB contribution to which the contribution of only the CPE bilayer in the buffer solution is subtracted. To verify the data obtained, the tests were repeated three times under the same conditions.
Allo scopo di validare l’approccio utilizzato e studiare il comportamento aggregativo anche con l’aggiunta di farmaci inibitori, alla soluzione tampone pura ed alla soluzione di proteine è stato aggiunto il farmaco dossiciclina con una concentrazione di 81μΜ. Questa concentrazione di doxiciclina è noto inibisca la formazione di fibrilla Αβ. In order to validate the approach used and study the aggregative behavior even with the addition of inhibitory drugs, the drug doxycycline with a concentration of 81μΜ was added to the pure buffer solution and the protein solution. This concentration of doxycycline is known to inhibit the formation of Αβ fibril.
Analogamente alla relazione sopra riportata è stata valutata la quantità: Similarly to the above relationship, the quantity was evaluated:
Le prove con e senza l’aggiunta del farmaco sono state ripetute tre volte alle stesse condizioni. The tests with and without the addition of the drug were repeated three times under the same conditions.
La fig. 7 è una rappresentazione grafica del parametro CFIB con soluzione proteica in fibrillazione (linea continua indicata dalla freccia A) e con soluzione proteica a cui è stato aggiunto il farmaco inibitore, nel caso di specie la dossicilina (linea continua indicata dalla freccia B). Le linee continue indicate dalle frecce A e B rappresentano il valor medio sulle tre prove effettuate, i punti circostanti le linee A e B rappresentano invece la deviazione standard valutata sulle tre prove. Fig. 7 is a graphical representation of the CFIB parameter with protein solution in fibrillation (solid line indicated by arrow A) and with protein solution to which the inhibitor drug has been added, in this case doxycilin (solid line indicated by arrow B). The solid lines indicated by the arrows A and B represent the average value on the three tests carried out, the points surrounding the lines A and B represent the standard deviation evaluated on the three tests.
Dalla fig. 5 è possibile comprendere come i comportamenti delle proteine con o senza l’aggiunta di farmaci siano piuttosto differenti, in particolare nelle prime otto ore delle prove, in cui gli intervalli di confidenza sono fra loro lontani. From fig. 5 it is possible to understand how the behaviors of proteins with or without the addition of drugs are quite different, especially in the first eight hours of the tests, in which the confidence intervals are far from each other.
È chiaro che al metodo per la rilevazione dell’aggregazione proteica e relativo apparato di rilevazione 10 fin qui descritto possono essere apportate modifiche e/o aggiunte di parti, senza per questo uscire dall’ambito del presente trovato. It is clear that modifications and / or additions of parts may be made to the method for detecting protein aggregation and the related detection apparatus 10 described so far, without thereby departing from the scope of the present invention.
È anche chiaro che, sebbene il presente trovato sia stato descritto con riferimento ad alcuni esempi specifici, una persona esperta del ramo potrà senz’altro realizzare molte altre forme equivalenti di metodo per la rilevazione dell’aggregazione proteica e relativo apparato di rilevazione 10, aventi le caratteristiche espresse nelle rivendicazioni e quindi tutte rientranti nell’ambito di protezione da esse definito. It is also clear that, although the present invention has been described with reference to some specific examples, a person skilled in the art will certainly be able to implement many other equivalent forms of method for detecting protein aggregation and related detection apparatus 10, having the characteristics expressed in the claims and therefore all falling within the scope of protection defined by them.
Claims (15)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT000111A ITUD20130111A1 (en) | 2013-08-30 | 2013-08-30 | METHOD FOR DETECTION OF THE PROTEIN AGGREGATION AND ITS RELEVANT APPARATUS |
Applications Claiming Priority (1)
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| IT000111A ITUD20130111A1 (en) | 2013-08-30 | 2013-08-30 | METHOD FOR DETECTION OF THE PROTEIN AGGREGATION AND ITS RELEVANT APPARATUS |
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| ITUD20130111A1 true ITUD20130111A1 (en) | 2015-03-01 |
Family
ID=49354860
Family Applications (1)
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| IT000111A ITUD20130111A1 (en) | 2013-08-30 | 2013-08-30 | METHOD FOR DETECTION OF THE PROTEIN AGGREGATION AND ITS RELEVANT APPARATUS |
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|---|---|
| IT (1) | ITUD20130111A1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003031958A2 (en) * | 2001-10-12 | 2003-04-17 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Microwave dielectric spectroscopy method and apparatus for assays of proteins and other biological molecules |
| WO2011047314A2 (en) * | 2009-10-16 | 2011-04-21 | Brigham Young University | Cell for broadband dielectric spectroscopy |
| WO2013034688A1 (en) * | 2011-09-09 | 2013-03-14 | Danmarks Tekniske Universitet | Biosensor for point-of-care diagnostic and on-site measurements |
-
2013
- 2013-08-30 IT IT000111A patent/ITUD20130111A1/en unknown
Patent Citations (3)
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| YATHRIB AJAJ: "Dynamics and Thermodynamics of Protein Folding and Interactions in Water-Cosolvent Systems", RUHR UNIVERSITÄT BOCHUM, 2011, XP055099561 * |
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