ITUB20159747A1 - Metodo per l?opto-iniezione di materiale esogeno in una cellula ricevente. - Google Patents

Description

Metodo per l’opto- iniezione di materiale esogeno in una cellula ricevente

L’intiOduzione di materiale genetico esogeno (transgene) o di molecole estranee in cellule vive si è rilevata nel corso degli ultimi decenni un potente strumento nell’ambito della moderna biologia molecolare. Nel caso di inserimento di molecole di DNA esogene in cellule eucariotiche, solitamente di mammiferi, si parla di trasfezione, che può essere transiente o stabile. Più in generale, l’interesse è per l’inserzione diversi materiali estranei alla cellula quali ad esempio agenti per Yirncigmg, peptidi, anticorpi, enzimi o molecole fauna eologicamente attive.

Sono state sviluppate ima pluralità di tecniche per introdurre materiale esogeno nel citoplasma o nel nucleo di una cellula eucariote, tra questi metodi chimici, metodi virali e metodi fisici. La cellula eucariote è racchiusa in una membrana cellulare (o piasmatica) che la delimita e che ha imo spessore tipico di circa 5 irai. L’introduzione di materiale esogeno mediante metodi fisici avviene tramite passaggio attraverso la membrana cellulare.

Metodi fisici spesso utilizzati sono l’elettroporazione e la mi ero iniezione. Nel elettroporazione, le cellule sono immerse in una soluzione contenente il DNA o le molecole da introdurre e sono sottoposte a brevi ed intensi impulsi elettrici che producono pori transitori nella membrana della cellula attraverso cui il materiale esogeno può entrare. La microiniezione consiste nell’introduzione del materiale direttamente nel nucleo o nel citoplasma della cellula mediante un sottile ago montato su un microiniettore.

Tecniche di inserimento efficaci e che possono essere utilizzate sulla grande maggioranza di tipologie di cellule utilizzano mi fascio laser per creare mia rottura transiente localizzata della membrana. In particolare, nell’ opto -iniezione (o iniezione ottica) impulsi laser ad elevata intensità generano pori transitori nella membrana che permettono l’afflusso di materiale extracellulare all’interno della cellula.

Una panoramica sui metodi fisici è data da Meachain J.M. et al. in “ Physical methods far intracelbdar delivery: practical aspects from laboratory use io industriai- scale processing”, pubblicato in Journal of Laboratory Automation, voi. 19 (2014), pagine 1-18.

La membrana cellulare è uno strato sottile di lipidi idrofobici imbevuto di molecole proteiche che attraversano la membrana o sono posizionate sulla superficie interna o esterna della stessa. La natura lipidica della cellula fa in modo che, in condizioni nonnali, la membrana agisca da barriera impermeabile al passaggio della maggior parte di molecole solubili in acqua. In tecniche che utilizzano Γ interazione di un fascio laser con la cellula, Γ ottenimento di un accurato allineamento e posizionamento del fuoco del fascio laser sulla sottile membrana è spesso un compito difficoltoso e che richiede tempo.

Sono noti diversi meccanismi che permettono la perforazione transitoria di cellule, tra i quali metodi che sfruttano un processo a due fotoni utilizzando un laser a ferntosecondi quale sorgente ottica. In “ Femtosecond celhdar transfection using a nondiffracting light beata ” di X. Tsampoula et al., pubblicato in Applied Physics Letters 91, 053902 (2007), gli autori utilizzano un fascio di Bessel per ovviare al bisogno di localizzare con precisione il fuoco del laser sulla membrana della cellula, permettendo Γ eccitazione a due fotoni lungo mia linea che porta alla trasfezione della cellula.

Stevenson D. et al. in “ Femtosecond optical transfection of cells: viability and efficiency ”, Optics Express, voi. 14, n. 16, pag. 7125, presentano una analisi dell’ efficienza di trasfezione ottica a ferntosecondi utilizzando un laser allo zaffiro di titanio a 800 rari.

Una metodologia di iniezione ottica utilizza una nano- o microparticella intrappolata otticamente sulla superficie di una cellula per essere iniettata all’interno della cellula. In “ Targeted optical injection of gold nanoparticles into single rnammalian cells”, C. McDougall et al., in J. Biopliotonics 2, 736-743 (2009), gli autori studiano una tecnica ottica per l’inserimento di uria nanoparticella di oro di 100 irai di diametro all’interno di mia singola cellula attraverso la combinazione deH’intrappolamento ottico e l’iniezione ottica. L’apparato ottico descritto comprende un laser a femtosecondi per l’iniezione ottica e un laser ad onda continua per 1 ’ mtr appolam ento ottico. Il posizionamento del fuoco del fascio laser è stato ottenuto mediante un sistema di traslazione xyz sul quale la scatola campione ( sarnple disk) era stata posta. Secondo gli autori, la sorgente pulsata causa una forza ottica transiente sulla nanoparticella e questo è stato ritenuto assistere l’ingresso della nanoparticella attraverso la membrana della cellula.

La domanda di brevetto WO 2011/124899 è relativa ad un metodo per la porazione della membrana di cellule biologiche in mi’ area specifica e la porazione su larga scala con microbolle eccitate dalla rottura indotta dalla luce laser di singole nanoparticelle intrappolate otticamente.

Waleed et al. in “ Smgle-cell opto-poration cmd transfection itsing femtosecond laser and optical tweezers ”, Biomedicai Optics Express Voi. 4, No. 9 (2013), descrivono una tecnica di trasfezione che prevede l’intrappolamento e l’inserimento di una microparticella di poh stirene rivestita di plasmi de in una cellula MCF-7. La membrana della cellula è prima forata e poi la microparticella è inserita nella cellula utilizzando una pinza ottica. Sono utilizzati he fasci laser: il primo fascio è im laser a femtosecondi a 800 imi per forare la membrana; il secondo è un laser a onda continua (CW) a 1064 nm, che Ira la funzione di intrappolare ed inserire la microparticella nella cellula, mentre il terzo fascio laser è un laser CW a 685 nm, che rileva l’esatta posizione della membrana in modo tale che il laser intrappolante a 1064 nm possa introdurre la micropaiticella attraverso il punto di foratura nella membrana della cellula.

Antkowiak et al. in “ Application of dynamic diffiractive optics for enhanced femtosecond laser based celi transfection ”, J. Biophotonics 3, No. 10-11, 696-705 (2010), descrive l'uti liz di un modulatore di luce spaziale (SLM) che agisce da elemento ottico diffrattivo dinamico, che fornisce un controllo laterale e assiale del fascio. Gli autori hanno studiato la fattibilità di applicare dosi radiative a varie posizioni assiali e laterali utilizzando l’SLM. In un metodo il fascio è stato focalizzato sequenzialmente in tre posizioni assiali differenti e separate di un 1 μιη con un ritardo di 700 ms tra dosi successive, che gli autori dicono essere un ritardo abbastanza lungo per evitare ogni processo di accumulazione delle energia dei fotoni. Gli autori concludono che rirraggiamento in rie posizioni assiali raddoppia il numero di cellule effettivamente opto-iniettate rispetto ad una dose singola.

La presente divulgazione descrive un metodo e ad un apparato per l’opto -iniezione di materiale esogeno in una singola cellula biologica che utilizza un fascio laser pulsato al subns.

Cellule eucariotiche hanno tipicamente uno spessore massimo tra 10 μιη e 20 pm. La membrana che racchiude la cellula Ira uno spessore di circa 5-8 imi, che è significativamente inferiore alle dimensioni della regione di fecalizzazione, nel seguito indicata con spot focale, del fascio laser sub-ns spesso utilizzato per la perforazione ottica della membrana.

La Richiedente ha osservato che un posizionamento accurato dello spot focale di im fascio laser sulla membrana della cellula è spesso complesso e richiede in molti casi un laborioso allineamento del fascio laser. Un posizionamento errato dello spot focale sulla membrana può portare ad avere una percentuale relativamente elevata di insuccesso di iniezione di materiale extracellulare oppine ad un danno irreversibile nella cellula trasfettata.

La Richiedente ha notato inoltre che, sebbene l’utilizzo di un fascio Bessel possa semplificare la fecalizzazione del fascio laser sulla membrana della cellula, la perforazione della membrana mediante fasci Bessel può richiedere una potenza ottica relativamente elevata per ottenere una fluenza energetica sufficiente nella regione centrale del fascio. Una tale potenza pori ebbe produrre indesiderati effetti tenui ci in alcune tipologie di cellule.

Il materiale esogeno da trasferirne o in generale da introdurre all’interno di una cellula biologica vivente è tipicamente contenuto in mia soluzione liquida a contatto con la superficie esterna della cellula, indicata nella descrizione che segue anche con soluzione extracellulare. In molti casi di interesse, la cellula biologica ricevente è immersa nella soluzione extracellulare. La Richiedente ha compreso che mio spostamento continuo dello spot focale del fascio laser atraverso una soluzione che contiene materiale esogeno, nella direzione di avvicinamento alla cellula ricevente, consente mia efficiente iniezione di flusso di materiale esogeno nella cellula. In particolare, la Richiedente ha compreso che, poiché mi fascio laser focalizzato e di potenza ottica relativamente elevata genera un effeto pinza ottica molto localizzato che attrae le molecole del fluido, uno spostamento continuo del laser genera mi flusso di soluzione extra- cellulare otticamente indirizzato verso la cellula, aumentando in questo modo l’efficienza di iniezione ottica.

La Richiedente ha inoltre capito che un controllo elettronico dello spostamento assiale del fascio ottico focalizzato verso la cellula presenta diversi vantaggi, tra i quali permetere di tenere il fascio acceso solo durante la discesa dello spot focale verso la cellula e di spegnere il fascio quando esso si trova in una posizione assiale all’interno della cellula, in questo modo riducendo il fotodanneggiamento indoto nella cellula dal fascio ottico.

Il metodo di opto-iniezione può essere eseguito senza il bisogno di un posizionamento assiale dello spot focale sulla membrana della cellula per garantire la perforazione (transitoria) della membrana stessa e quindi pennettere l’opto -iniezione.

In accordo con la presente divulgazione, uno spostamento assiale continuo dello spot focale è realizzato con un collimatore a convergenza/divergenza variabile. Il collimatore a convergenza/ divergenza variabile è oticamente accoppiato con una sorgente laser ad impulsi al sub-nanosecondo e comprende una lente a lunghezza focale accordabile ( tunable ), la cui variazione di lunghezza focale controlla il grado di convergenza/divergenza del fascio ottico in uscita dal collimatore.

In alcune forme di realizzazione preferite, la procedura di opto-iniezione può essere ripetuta almeno una seconda volta ed in generale un numero desiderato di volte riportando il fascio spento fino ad una posizione assiale esterna alla cellula e sopra di essa. Dopo aver liacceso il fascio, la procedura comprende muovere assialmente in modo continuo lo spot focale nella direzione della cellula fino alla penetrazione del fascio nella cellula stessa. In questo modo, è possibile aumentare la quantità di materiale esogeno iniettato e automatizzare la procedura di opto -iniezione migliorandone la sua efficienza.

E’ descritto un metodo per la opto -iniezione di materiale esogeno in una cellula biologica ricevente, nel quale la cellula comprende una membrana cellulare che la racchiude, il metodo comprendendo:

- disporre una cellula biologica su una superficie planare di un subsfiato, la cellula avendo una superficie basale appoggiata sulla superficie planare del substrato e una superficie apicale opposta alla superficie basale e a contatto con una soluzione fluida che contiene materiale esogeno;

- trasmettere un fascio laser ad impulsi sub-ns attraverso un collimatore a convergenza/divergenza variabile, il collimatore comprendendo una lente a lunghezza focale accordabile mediante un segnale elettrico di controllo ad ampiezza variabile; - dirigere il fascio laser che è passato attraverso il collimatore attraverso una lente obiettivo per focalizzare il fascio laser in uno spot focale lungo un asse ottico che definisce una direzione assiale sostanzialmente perpendicolare alla superficie planare del subsfiato, così che lo spot focale sia posizionato lungo la direzione assiale;

- impostare il segnale elettrico di controllo ad un primo valore di ampiezza che definisce una prima lunghezza focale della lente, coriispondente ad una prima posizione assiale 3⁄4 dello spot focale lungo l’asse ottico, in cui il primo valore di ampiezza del segnale di controllo è selezionato in modo che la prima posizione assiale Zi sia sopra la superficie apicale della cellula e ad una prima distanza assiale dalla superficie planare del substrato, e

- muovere lo spot focale verso la cellula lungo la direzione assiale variando in modo continuo il segnale elettrico di controllo dal primo valore di ampiezza ad un secondo valore di ampiezza, il secondo valore di ampiezza definendo una seconda lunghezza focale corrispondente ad una seconda posizione assiale Zfdello spot focale, in cui il secondo valore di ampiezza del segnale di controllo è selezionato in modo che la seconda posizione assiale sia posizionata all’interno della cellula, ad una seconda distanza assiale dalla superficie planare del substrato, minore della prima distanza assiale, così che lo spot focale attraversi la membrana della cellula durante la discesa dello spot focale verso la cellula producendo un poro nella membrana che consente l’ingresso di soluzione fluida contenente materiale esogeno nella cellula.

Il metodo secondo la presente divulgazione consente la opto-iniezione di una singola cellula con precisione sub- cellulare.

In alcune forme di realizzazione, il segnale di controllo è un segnale elettrico di tensione e il primo valore di ampiezza è un primo valore di tensione e il secondo valore di ampiezza è un secondo valore di tensione.

Nel presente contesto e in accordo con alcune forme di realizzazione, con “sostanzialmente perpendicolare” con riferimento all’asse ottico del fascio laser focalizzato si intende che l’asse ottico si può trovare ad un angolo minore di o uguale a 15°, preferibilmente enfio 10°, rispetto alla perpendicolare.

In alcune forme di realizzazione, il metodo comprende, precedentemente alla fase di muovere lo spot focale verso la cellula, posizionare lateralmente la cellula biologica nel piano della superficie del substrato in modo tale che un’area della cellula biologica ricevente intercetti il fascio ottico focalizzato lungo la direzione assiale.

Preferibilmente, la lente obiettivo è una lente obiettivo da microscopio. Preferibilmente, il fascio in uscita dal collimatore a convergenza/divergenza variabile è diretto verso la pupilla di ingresso della lente obiettivo e il fascio in uscita dalla lente è im fascio focalizzato lungo l’asse ottico della lente.

In alcune fonne di realizzazione, la distanza assiale di percorrenza dello spot focale del fascio laser è pari a ΔΖ=(ΖΓ zi) ed è compresa tra 20 pm e 100 pm.

In alcune fonne di realizzazione preferite, il segnale di controllo della lente a lunghezza focale accordabile è un segnale elettrico analogico modulato in frequenza ad una frequenza frLche determina la velocità di spostamento assiale dello spot focale, ν&, durante la sua discesa dalla prima posizione assiale alla seconda posizione assiale, secondo la relazione vt3⁄4= 2 (zf -Zi)

Preferibilmente, la velocità di spostamento assiale dello spot focale è compresa fra 10 pm/s e 500 pm/s, più preferibilmente fra 80 e 150 pm/s.

Preferibilmente, il collimatore a convergenza/divergenza variabile comprende inoltre una seconda lente convergente a lunghezza focale fissa, disposta rispetto alla lente a lunghezza focale accordabile in modo tale che il fascio laser attraversi la seconda lente e la lente a lunghezza focale accordabile.

Pr eferibilmente, la prima distanza assiale dalla superficie planare del substrato è selezionata tenendo conto dello spessore massimo della cellula biologica ricevente. In alcune forme realizzative, la prima distanza assiale è selezionata in modo tale da avere una distanza assiale dalla cellula di almeno 10 pm rispetto alla superficie apicale della cellula nel punto di altezza massima della stessa.

In alcune forme di realizzazione, la seconda distanza assiale dalla superficie planare del substrato è maggiore di zero e minore dell’altezza minima della cellula ricevente.

Preferibilmente, il substrato costituisce la base di un contenitore nel quale la cellula ricevente è disposta e nel quale è contenuta la soluzione extra- cellulare contenente materiale esogeno, la cellula essendo immersa nella soluzione.

Preferibilmente, il fascio laser è im fascio a impulsi ai femtosecondi.

Preferibilmente, il fascio laser è un fascio gaussiano.

Preferibilmente, precedentemente alla fase di trasmettere un fascio laser ad impulsi sub-ns attraverso un collimatore a convergenza/divergenza variabile, il metodo comprende emettere un fascio laser ad impulsi sub-ns da una sorgente laser ad impulsi al sub-nanosecondo, in cui il collimatore a convergenza/ divergenza variabile è otticamente accoppiato alla sorgente laser. Irr alcune forme realizzative, successivamente alla fase di muovere lo spot focale con spostamento continuo fino alla posizione assiale Zf, il metodo comprende spegnere la sorgente laser quando la seconda posizione assiale Z dello spot focale è raggiunta.

Si indica nella presente descrizione e rivendicazioni con materiale esogeno uno o più materiali estranei alla cellula quali ad esempio acidi nucleici, agenti per V imaging, peptidi, anticorpi, enzimi o molecole farmacologicamente attive. Con opto-iniezione si intende l’iniezione di materiale esogeno assistita da un fascio laser in una cellula, comprendo con tale termine Γ iniezione di acidi nucleici o DNA, ovvero la trasfezione.

Se sono campioni in vivo, la cellula o cellule sono solitamente in coltura, distribuite sulla superficie di una piastra di Petri (Retri disk) e immerse in un terreno di coltura, i.e. in una soluzione liquida. In alternativa, le cellule coltivate in vitro possono essere inserite in una piastra multipozzetto ( multrwell ). Più in generale, le cellule possono essere contenute in un recipiente, tipicamente di vetro o monouso di plastica, contenente la soluzione. Nell’ imaging del campione mediante microscopia a fluorescenza o a campo chiaro, i recipienti sono solitamente di materiale trasparente, anche se in un microscopio dritto ( upright) con illuminazione a epi- fluorescenza possono essere utilizzati recipienti in materiale non trasparente alla luce.

Le tecniche di imaging , in particolare le tecniche investigative su cellule mammarie, sono spesso condotte su cellule in vivo che sono adese (in monostrato) ad un substrato, che può essere parte di un contenitore. Ad esempio, in una piastra di Petri, che è nella sostanza un recipiente piatto chiudibile con un coperchio, il substrato sul quale aderiscono le cellule costituisce la base della piastra.

La presente invenzione vena qui di seguito descritta in maggior dettaglio facendo riferimento ai disegni allegati, in cui vengono mostrate alcune forme di realizzazione dell'invenzione. I disegni che illustrano le fonne di realizzazione sono rappresentazioni schematiche non in scala.

La figura 1 è im diagramma schematico di un appaiato di opto-iniezione di una cellula biologica per l’inserimento di materiale esogeno nella cellula, secondo una forma di realizzazione della presente invenzione.

La figura la è un ingrandimento di una porzione di figura 1 indicata con un riquadro trattopunto A, nella quale, a titolo esemplificativo, sono state messi a confronto gli spot focali corrispondenti a due diverse lunghezze focali della lente accordabile.

La figura 2 è mia rappresentazione schematica di un porta- campioni nel quale è posizionata la cellula biologica da iniettare con materiale esogeno, secondo mi esempio reali zzati vo.

La figura 3 illustra in modo schematico il flusso di molecole esogene generato otticamente dallo spot focale durante la penetrazione dello stesso attraverso la soluzione extracellulare contenente le molecole esogene.

La figura 4 è mia rappresentazione grafica schematica di una procedura di opto-iniezione, secondo una forma realizzativa.

Le figure 5a-5c mostrano: un segnale di controllo esemplificativo della lente a lunghezza focale accordabile (TL) (a), mi trigger di accensione e spegnimento del fascio laser (b) e un numero di impulsi durante l’accensione del fascio (c), in accordo con ima forma realizzati va dell’invenzione.

Le figure 6a a óf mostrano una serie di immagini di microscopia a fluorescenza prima, dinante e dopo la opto-iniezione di un fascio laser, in un esempio di realizzazione della presente invenzione.

La figura 7 è un grafico che riporta l’intensità del segnale di fluorescenza in funzione del tempo, in cui il segnale è correlato all’entrata delle molecole nella cellula dinante la procedura di opto-iniezione dell’esempio di figure 6a a 6f.

In figura 1, un apparato di opto-iniezione comprende una sorgente laser 10 configurata per emettere un fascio laser ad impulsi ultracorti, al sub- nanosecondo. L’utilizzo di una sorgente laser ad impulsi riduce la potenza ottica media incidente sulla cellula e quindi l’effetto termico nella cellula. In generale, a parità di lunghezza d’onda del fascio laser, minore è la durata dell’impulso, minore è la potenza media necessaria per realizzare la perforazione della cellula. Una durata di impulso inferiore al nanosecondo è in molte forme realizzative preferita in quanto previene la creazione di un’onda d’urto durante l’ablazione del materiale. In alcune forme realizzative, la durata dell’impulso è inferiore a 500 picosecondi. Preferibilmente, la sorgente laser è un laser ad impulsi a femtosecondi. Preferibilmente, il fascio laser è gaussiano, i.e. ha profilo di intensità di forma gaussiana.

La sorgente laser è accoppiata otticamente ad mi collimatore 13 a convergenza/divergenza variabile che comprende una lente a lunghezza focale accordabile ( tunable ). Il grado di convergenza/divergenza del collimatore varia in accordo con la variazione della lunghezza focale della lente. Nelle forme di realizzazione preferite la lunghezza focale è accordabile elettricamente attraverso un segnale elettrico di controllo.

Nella forma di realizzazione illustrata in figura 1 , il collimatore 13 comprende una prima lente a lunghezza focale fissa 11 ed una seconda lente 12 a lunghezza focale accordabile, disposta a valle della prima lente 11 rispetto alla sorgente laser 10. La lente a lunghezza focale accordabile verrà indicata nel seguito e per brevità anche con lente accordabile. Nella forma realizzativa mostrata in Fig. 1 , la piima lente 11 è una lente convergente, ad esempio mia lente convessa, e la seconda lente 12 a lunghezza focale accordabile, è una lente convergente, ad esempio mia lente convessa.

In una altra forma realizzativa (non mostrata nelle figure), il collimatore 13 comprende una lente convergente a lunghezza focale accordabile che riceve il fascio laser emesso dalla sorgente laser ed una lente convergente a distanza focale fissa, disposta a valle della lente accordabile.

Il fascio laser, dopo aver attr aversato il collimatore 13 ed in particolare la lente accordabile 12, incide su mi primo elemento ottico di deflessione 22 che deflette il fascio laser dirigendolo verso la pupilla di ingresso di una lente obiettivo 16 da microscopio. Il fascio laser è focalizzato dalla lente obiettivo 16 formando mi fascio focalizzato in uno spot di dimensioni finite.

Ad esempio, lo spot focale di mi fascio laser pulsato al sub-ns che emette radiazione a 355 mn può avere dimensione di circa 500 nm lungo l’asse ottico. Sempre a titolo di esempio, con mi laser pulsato ad infrarosso, che emette luce ad mia lunghezza d’onda di circa 1000 nm, si può ottenere mia dimensione dello spot focale di circa 1600 mn, lungo l’asse ottico del fascio. La dimensione dello spot focale dipende, oltre che dalla lunghezza d’onda del fascio laser, dalla apertura numerica della lente obiettivo utilizzata. In generale, maggiore l’apertura numerica, minore è la dimensione dello spot focale lungo l’asse ottico del fascio. Una dimensione relativamente piccola dello spot focale implica tipicamente una riduzione di potenza ottica del fascio necessaria a creare rm fenomeno di ablazione nel fuoco e quindi un minore fotodanneggiamento della cellula ricevente.

Il primo elemento ottico di deflessione 22 è preferibilmente uno specchio planare configurato per riflettere il fascio laser proveniente dal collimatore indirizzandolo verso la lente obiettivo. L’asse ottico della lente obiettivo del microscopio definisce la direzione assiale di incidenza del fascio laser sul campione ed è indicato in figura con asse z e quindi l’asse ottico del fascio incidente. Una regolazione del fuoco lungo l’asse ottico del fascio uscente dalla lente obiettivo si ottiene variando la divergenza o convergenza del fascio laser in ingresso nella lente obiettivo mediante il collimatore a convergenza/divergenza variabile. In particolare, la variazione della lunghezza focale della lente accordabile in combinazione con la focalizzazione del fascio prodotta dalla lente obiettivo risulta in ima variazione della posizione assiale, i.e. lungo l’asse ottico z, dello spot focale.

Un ingrandimento parziale della Figura 1, indicato con un riquadro tratto-punto A nella Figura 1 , viene mostrato nella Figura 1 a, nella quale, a titolo esemplificativo, sono state messi a confronto gli spot focali conispondentì a due diverse lunghezze focali della lente accordabile 12 Il primo fascio laser 23 (linea punteggiata) che entra nella lente obiettivo 16 è costruito con mia prima lunghezza focale fi della lente accordabile, mentre il secondo fascio 26 (linea tratteggiata) è relativo ad ima seconda lunghezza focale 12 della lente accordabile. In uscita dalla lente obiettivo, il piimo fascio laser è collimato in imo spot focale 25 posizionato in una piima posizione assiale, mentre lo spot focale 24 del secondo fascio laser è posizionato in mia seconda posizione assiale che dista Δζ dalla prima posizione assiale.

Con riferimento nuovamente alla figura 1, in mi piano trasversale all’asse ottico della lente obiettivo e quindi della direzione di incidenza del fe scio laser è disposto un porta-campioni 18, preferibilmente im contenitore, contenente un campione biologico ed in particolare mia o più cellule da opto -iniettare o in particolare da trasfettare. Nel presente contesto, una cellula “target” da opto-iniettare con materiale esogeno è indicata con cellula ricevente.

Preferibilmente, la lunghezza focale della seconda lente 12 è controllabile elettricamente mediante mi attuatore (elettrico, meccanico o elettromagnetico) collegato ad un regolatore di corrente o di tensione che fornisce corrente/tensione da zero ad un valore massimo. Nei modi usuali, la corrente o tensione fornita all’attuatore può essere controllata elettronicamente da un software, ad esempio integrato nel sistema di controllo elettronico dell’ apparato di optoiniezione. Sebbene non mostrato in figura 1, la lente accordabile comprende un attuatole che controlla la lunghezza focale della lente 12, in cui Patinatore è collegato ad un regolatore di corrente o tensione, a sua volta collegato ad una unità elettronica di controllo (anche essi non mostrati in figura).

Un controllo eletronico della lunghezza focale della lente a lunghezza focale accordabile e quindi della posizione assiale dello spot focale ha, in molte forme realizzative, il vantaggio di realizzare uno spostamento assiale relativamente veloce, con velocità di spostamento controllata, come descritto più in dettaglio nel seguito.

In una forma realizzativa, la lente accordabile è una lente liquida a cambiamento di forma formata da una membrana polimerica elastica che racchiude un fluido ottico. Sulla lente è integrato un attuatore elettromagnetico o meccanico che controlla mi anello che è posizionato sulla superficie della membrana polimerica e che induce una variazione della pressione esercitata sul liquido della lente cambiando quindi la curvatura della lente. In tal modo il regolatore di tensione pilota Γ attuatore controllando la deflessione della luce che passa atraverso la lente e con essa la posizione del fuoco.

La dimensione dello spot focale dipende ingenerale dalla lunghezza d’onda del fascio laser e dall’apertura numerica della lente obiettivo utilizzati. In alcune forme di realizzazione, lo spot focale del fascio laser ha diametro compreso ha 200 mn e 300 mn nel piano (x,y) perpendicolare all’asse ottico z e diametro tra 300 mn e 1000 nm lungo l’asse ottico.

Poiché in molte forme realizzative può essere vantaggioso rilevare il flusso della soluzione extracellulare all’interno della cellula ricevente, l’apparato di opto-iniezione comprende mi sistema di imaging ottico (e.g. fluorescenza o campo chiaro) causata dall’iniezione della soluzione nella cellula. Il sistema di imaging può essere un sistema di per sé noto utilizzato in microscopi ottici in campo chiaro o a fluorescenza.

Nella forma realizzati va di figura 1, il sistema di imaging ottico consente sia la microscopia in campo chiaro che la microscopia in fluorescenza. Preferibilmente, il primo elemento ottico di deflessione 22 è imo specchio dicroico configurato in modo tale da riflettere la lunghezza d’onda del fascio laser per indurre una ablazione laser sulla cellula, e allo stesso tempo lasciare passare la luce di emissione dal campione. Nell 'imaging in campo chiaro, la tecnica di imaging è in luce ria smessa e l’apparato comprende una prima sorgente di illuminazione 21, ad esempio una lampada alogena, disposta in modo tale da illuminare dal basso il campione biologico in una area del campione che intercetta il fascio laser. La luce della sorgente 21, preferibilmente ad ampio spettro, è focalizzata sul campione tramite un condensatore 20. Lo specchio dicroico 22 è configurato in modo tale da lasciare passare la luce emessa dalla lampada alogena e trasmessa attraverso il campione. Le caratteristiche ottiche dello specchio dicroico sono selezionate in funzione della lunghezza d’onda del fascio laser ad impulsi e dello spettro ottico di fluorescenza o di emissione delle molecole esogene. Se la tecnica di imaging è in fluorescenza (in figura 1, in configurazione di epiilluminazione), l’apparato comprende una seconda sorgente di illuminazione 29, preferibilmente una lampada xenon, che emette luce focalizzata da una lente convessa 28, ed un secondo elemento ottico di deflessione 27, preferibilmente imo specchio dicroico che riflette la luce di eccitazione proveniente dalla lampada xenon, e che lascia passare la luce di fluorescenza emessa dal campione.

La luce fluorescente emessa dal campione è raccolta dalla lente obiettivo da microscopio 16 che la indirizza verso lo specchio dicroico 22, che è configurato in modo tale da trasmettere il fascio diffuso dal campione e riflettere il fascio collimato proveniente dalla sorgente laser. La luce trasmessa dallo specchio dicroico 22 è indirizzata verso un dispositivo fotorivelatore 15, che preferibilmente comprende una fotocamera CMOS o una fotocamera CCD.

NeH’urilizzo dell’apparato di opto-iniezione in microscopia in campo chiaro, la lampada xenon 29 rimane spenta mentre è accesa la lampada alogena 21. La luce emessa dalla lampada alogena 21 attraversa il campione ed è raccolta dalla lente obiettivo 16 che la indirizza verso 10 specchio dicroico 22 e lo spe celilo dicroico 27, che lasciano passare una porzione di luce emessa dalla lampada alogena, che è rilevata dal dispositivo di rivelamento 15.

Preferibilmente, nel caso si utilizzi un imaging in fluorescenza, l’apparato comprende un filtro a fluorescenza 17 disposto lungo la direzione di rilevazione, in figura 1 lungo l’asse z, e disposto in modo tale da interferire con la luce proveniente dal campione e raccolta dalla lente obiettivo del microscopio 16. Come di per sé generalmente noto, il filtro a fluorescenza blocca la luce di eccitazione e consente alla luce fluorescente di passarvi attraverso sfruttando il fatto che la luce fluorescente viene solitamente emessa ad una lunghezza d'onda più lunga della luce di eccitazione.

Preferibilmente, il sistema di rilevamento comprende anche mia tube lens 14 disposta lungo la direzione di rilevamento ha la lente obiettivo e il dispositivo fotorilevatore 15. Come di per sé generalmente noto, la tube lens è configurata per focalizzare il fascio di luce parallelo (ossia sottoposto a imaging all'infinito) in uscita dalla lente dell'obiettivo in corrispondenza di un piano di immagine intermedio. La luce fluorescente o di illuminazione focalizzata viene poi rilevata dal dispositivo fotorilevatore 15.

Preferibilmente, la lente obiettivo 16 è ad alta apertura numerica (NA), in quanto una maggiore apertura numerica implica generalmente una maggiore fecalizzazione del fascio laser (i.e. spot focale di dimensione inferiore) e una più efficiente ablazione del campione rendendo non necessario l’utilizzo di intensità di fascio relativamente elevate e tali da indurre riscaldamento della cellula e quindi foto-danneggiamento. In alcune fonne di realizzazione, la lente obiettivo ha apertura numerica compresa tra 0,4 e 1,49.

11 porta-campioni 18 comprende un substrato disposto nel piano (x,y) perpendicolare all’asse ottico z della lente obiettivo 16, quindi alla direzione di incidenza del fascio. Preferibilmente, il portacampioni 18 è disposto su un sistema di traslazione 19 lungo gli assi (x,y,z) per il posizionamento laterale della cellula rispetto al fascio incidente, e per la messa a fuoco della cellula nel microscopio ottico.

In alcune forme realizzative, F apparato di opto -iniezione comprende un microscopio dritto ( upright , come nella figura 1) in fluorescenza in epi-illuminazione, che permette la visualizzazione delle cellule anche su supporti non trasparenti, quali una matrice di microelettrodi non trasparenti del tipo tipicamente utilizzato per misurare Fattività elettrofisiologica delle cellule. Tuttavia, il metodo in accordo con la presente divulgazione può essere applicato anche su un microscopio invertito, che di solito usa una lente obiettivo ad olio con NA da 1 a 1,5. Nel caso l’apparato di figura 1 venga utilizzato conia tecnica di imaging a campo chiaro, il supporto 18 è trasparente in modo da permettere la trasmissione della luce emessa dalla prima sorgente di illuminazione 21 attraverso il campione biologico.

Il microscopio ottico serve per visualizzare le cellule e posizionare una porzione desirata della cellula ricevente in modo tale che intercetti l’asse ottico del fascio laser. Nei modi usuali, il sistema di traslazione 19 ha una finestra realizzata in materiale trasparente alla luce per permettere l’ illuminazione della porzione di campione che si desidera visualizzare.

Il metodo secondo la presente divulgazione può utilizzare im microscopio a fluorescenza, ad esempio nel caso in cui molecole introdotte nella cellula emettano fotoluminescenza quando irradiate. In tal caso, gli elementi 20 e 21 per la retro-illuminazione del campione non sono necessari.

Senza voler limitare la soluzione ivi descritta, la seguente descrizione di alcune forme realizzative farà riferimento ad una soluzione che contiene molecole esogene da inserire all’interno di ima singola cellula in vivo, la cui membrana non è permeabile alle suddette molecole.

Preferibilmente, la cellula biologica è disposta su un substrato disposto in un piano (x,y) perpendicolare all’asse ottico z, e disposta in modo tale che una regione desiderata della cellula intercetti il fascio laser. La figura 2 è una rappresentazione schematica di un portacampioni nel quale è posizionata la cellula biologica da iniettare con materiale esogeno, secondo un esempio realizzativo. Il portacampioni è un recipiente 30, ad esempio una piastra di Peti, che comprende mia base 31 sulla quale aderisce una cellula biologica 32. La base 31 costituisce il substrato sul quale è posizionata la cellula ed è preferibilmente realizzata in materiale otticamente trasparente. La cellula biologica 32 è a contatto con una soluzione extracellulare liquida 33 che la ricopre e che contiene una pluralità di molecole da introdurre nella cellula. Se la membrana della cellula non è permeabile alle suddette molecole, Γ inserimento delle stesse richiede la perforazione della membrana stessa.

Un fascio laser ad impulsi ad alta intensità focalizzato attraverso una lente obiettivo può creare un poro transiente, attraverso la membrana della cellula risultando cosi in un influsso osmotico di molecole extracellulari (esogene) all’interno della cellula. La potenza ottica necessaria per perforare la membrana dipende in generale dalla sorgente laser impiegata ed in particolare dalla lunghezza d’onda del fascio laser e dalla durata degli impulsi. In alcune forme realizzative, il fascio laser ha una potenza ottica compresa ha 10 p\V e 200 mW e lunghezza d’onda compresa ha 350 nm (ultravioletto) fino e 900 ran (infrarosso).

La dimensione laterale del poro dipende, ha gli altri fatori, dalla dimensione dello spot focale perforante. In generale, nel caso di cellule eucariotiche e con spot focali di dimensione laterale di 100-200 nm nel piano (x,y) parallelo al substrato, il poro Ira una dimensione maggiore di una singola molecola e la tecnica permette pertanto l’opto-iniezione di una pluralità di molecole con una perforazione singola della membrana.

Nell’analisi di cellule viventi, le cellule sono adese ad mi substrato e immerse nella soluzione extracellulare cosicché sopra la superficie apicale della cellula c’è mio sfiato liquido. A titolo di esempio, lo spessore dello sfiato liquido che copre la cellula può tipicamente variare circa 1 min a pochi millimetri, in dipendenza anche dal contenitore porta- campioni utilizzato.

In accordo con la presente divulgazione, lo spot focale del fascio si sposta assialmente in modo continuo da una posizione assiale iniziale, 3⁄4, verso la cellula, passando attraverso la soluzione extracellulare fino ad una posizione assiale finale Zfairintemo della cellula, percon'endo mia distanza assiale pari a ΔΖ=(ΖΓ3⁄4).

Preferibilmente, la posizione assiale iniziale 3⁄4 è sopra la cellula, ad una distanza assiale dalla sua superficie. Preferibilmente, la posizione assiale iniziale, 3⁄4, è interna alla soluzione extracellulare che ricopre la cellula e lo spot focale attraversa uno spessore dello strato liquido di soluzione sopra la cellula fino ad una posizione interna alla cellula Zf.

L’asse ottico del fascio incidente lungo il quale avviene lo spostamento assiale dello spot focale è in generale trasversale rispetto alla superficie planare del substrato sul quale è disposta la cellula ricevente. In generale, Γ angolo foimato tra mi asse perpendicolare alla superficie planare del substrato e l’asse ottico del fascio non può essere superiore al massimo angolo, otmax, dettato dall’ apertura numerica della lente obbiettivo: <3⁄4mx< arcoseno(NA/n), con n l’indice di rifrazione del mezzo di immersione della lente obiettivo. La Richiedente ha osservato che più l’asse ottico del fascio incidente è inclinato rispetto alla perpendicolare, maggiore è l’escursione necessaria dello spot focale per raggiungere la posizione Zfpartendo dalla posizione iniziale 3⁄4, le posizioni assiali essendo definite rispetto ad un asse ottico perpendicolare alla superficie planare del substrato.

Nelle forme realizzative in accordo con la presente divulgazione, la direzione assiale del fascio ottico in uscita dalla lente obiettivo lungo il quale avviene lo spostamento assiale è sostanzialmente perpendicolare al substrato. In una fonna realizzativa preferita, l’asse ottico della lente obiettivo e quindi la direzione assiale del fascio laser incidente è perpendicolare alla superficie planare del substrato.

Una volta raggiunta la posizione finale, è preferibile spegnere il fascio per evitare di generare un flusso di liquido indotto otticamente che vada nella direzione opposta (dalla cellula verso la soluzione) a quello creato durante la discesa del fascio laser (verso la cellula). Inoltre, in alcune applicazioni di interesse, riportare la posizione dello spot focale a 3⁄4 a fascio spento riduce il rischio di indurre un danno termico nella struttura della cellula.

Senza voler essere limitati ad una particolare teoria o spiegazione, la figura 3 illustra in modo schematico il flusso di molecole esogene generato otticamente dallo spot focale durante il passaggio dello stesso attraverso la soluzione extra cellulare contenente le molecole esogene, quali ad esempio molecole di acidi nucleici, che sono indicate in figura con cerchi 34. L’intensità del fascio laser indicata con 35 ha una distribuzione gaussiana attorno al centro dello spot focale. Tale distribuzione di intensità ottica genera una forza gradiente, Fgrad, che attrae le molecole verso il centro dello spot, come indicato schematicamente dalle frecce 37. Il movimento dello spot focale è dall’alto verso il basso. Il centro dello spot focale è rappresentato in figura con un’ellisse di perimetro tratteggiato 38 (la forma è da intendersi essere solo mia rappresentazione grafica senza significato geometrico). Una volta che la molecola raggiunge il centro dello spot, essa è spinta in avanti dalla forza di riflessione, Fscat, lungo la direzione assiale come indicato dalle frecce 36, verso la cellula. Le molecole che enfiano all’interno dello spot focale, indicate con cerchi grigi 39, sentono le forze ottiche di gradiente e di riflessione e subiscono uno spostamento assiale otticamente indotto. Le forze ottiche create nello spot focale combinate con un movimento assiale continuo attraggono sempre più molecole dal fluido circostante verso lo spot focale del laser e all'intemo dello spot focale durante la discesa a causa della forza gradiente. Al passaggio del fascio laser attraverso la membrana cellulare si crea un poro transiente che pennette l’ingresso di molecole all’intemo della cellula, e.g., nel citoplasma o nel nucleo.

Senza voler vincolare la presente divulgazione ad una particolare teoria o spiegazione, la Richiedente crede che l’efficienza di opto-iniezione sia relativamente elevata grazie all’azione sinergica ira la creazione di un poro transiente nella membrana della cellula per inserire un flusso osmotico di soluzione extracellulare e la presenza di un flusso generato otticamente e diretto verso il poro della membrana.

La Richiedente Ira capito che stabilendo una distanza assiale percorsa dallo spot focale non è necessario un posizionamento sulla membrana della cellula per creare un poro nella stessa. La distanza assiale percorsa dallo spot focale lungo l’asse ottico del fascio laser, Δζ, è definita ira una posizione iniziale, 3⁄4, in corrispondenza della quale viene acceso il fascio laser, ed ima posizione finale, Zf, in corrispondenza della quale il fascio laser è spento, Az=(zf -zi). La posizione finale è selezionata in modo tale da trovarsi afi’intemo della cellula, i.e. oltre alla posizione assiale della membrana nell’area della cellula colpita dal fascio laser.

Ad ogni posizione assiale dello spot focale corrisponde una lunghezza focale della lente accordabile accoppiata otticamente al fascio laser in uscita dalla sorgente laser. Per una lente accordabile elettricamente, ad ogni valore di lunghezza focale corrisponde a sua volta un valore di tensione el etilica o di corrente applicata agli elettrodi della lente. Più in generale, ad ogni valore di ampiezza di segnale elettrico di controllo della lente accordabile corrisponde im valore di lunghezza focale.

Nel caso il segnale el etilico di controllo sia analogico, un’unità di controllo controlla il driver della lente accordabile in modo da variare l’ampiezza del segnale (tensione o corrente) da un primo valore di ampiezza ad un secondo valore di ampiezza a incrementi (o decrementi) infinitesimali cosi da avere una variazione continua (i.e. non discretizzata) della lunghezza focale della lente.

In alcune forme di realizzazione, il segnale di controllo della lente accordabile è un segnale elettrico periodico, non a onda quadra, per variare in modo continuo e graduale la posizione del fuoco del laser sul campione da 3⁄4 a Z e viceversa, e quindi evitare cambiamenti a scalino tra le due posizioni scelte 3⁄4 e Zf, che inducono fenomeni di ripple sul segnale di controllo prima della stabilizzazione del segnale di controllo ad un nuovo valore.

La lente accordabile associata ad un regolatore di ampiezza del segnale per il suo controllo può essere un dispositivo commerciale, tipicamente disponibile con un software di controllo da installarsi nell’unità elettronica di controllo di un apparato sperimentale.

La figura 4 è una rappresentazione grafica schematica di una procedura di opto -iniezione, secondo una forma realizzativa. In molte situazioni sperimentali, sia in vivo che non in vivo, la cellula ricevente è appoggiata su o in particolare adesa ad una superficie planare di un substrato. L’ “altezza” della cellula può essere definita dalla distanza fra la superficie apicale e la superficie basale, quest’ultima appoggiando sulla superficie del substrato. Poiché l’altezza è mia variabile lungo la superficie Ubera della cellula, si indica di solito l’altezza massima della cellula. In figura, una cellula eucariote 41, della quale viene indicato il nucleo 43, è disposta su una superficie planare 40 di mi substrato 46. La cellula è racchiusa da una membrana 42 che definisce la sua superficie esterna. La cellula è immersa in una soluzione fluida contenente materiale esogeno, non mostrata in figura per migliorare la chiarezza. Essendo appoggiata sulla superficie del substrato, la superficie inferiore della cellula può essere considerata corrispondere alla superficie superiore 40 del substrato 46, definendo cosi una posizione assiale di riferimento z0, lungo l’asse z.

In corrispondenza della posizione assiale iniziale 3⁄4 è acceso il fascio, indicato dallo spot focale 44. La posizione assiale iniziale è stabilita da mi valore di tensione iniziale, Vi, del segnale elettrico di controllo della lente accordabile selezionato in modo tale che la posizione Zi sia ad una distanza assiale rispetto alla superficie apicale della cellula.

Considerando che l’altezza massima di una cellula è di circa 20 μιη, la posizione assiale iniziale 3⁄4 è selezionata in modo tale si trovi ad mia distanza assiale dalla superficie 40 del substrato 46 sul quale appoggia la cellula. Preferibilmente, la posizione assiale iniziale z, è ad una distanza assiale rispetto alla superficie apicale della cellula di circa almeno 10 μιη.

Cellule eucariotiche hanno tìpicamente mio spessore massimo di 10-20 pm, generalmente non uniforme quando esse sono appoggiate su una superficie piana. Ad esempio, ima cellula neuronaie piastrata su im contenitore Petìi raggiunge una altezza massima di circa 10 pm. In questo caso, è preferibile impostale una posizione assiale iniziale ad almeno 40 pm rispetto al substrato. Preferibilmente la posizione assiale iniziale è ad una distanza assiale compresa tra 50 pm e 30 pm, rispetto al substrato.

Il valore di tensione finale, Vf, relativo alla posizione assiale finale Zf, è selezionato in modo tale che la posizione finale risulti all’interno della cellula. Per garantire l’integrità della cellula, specialmente se in vivo, è preferibile che lo spot focale non attraversi completamente lo spessore della cellula, in modo da evitare la perforazione della membrana nella superficie opposta a quella di ingresso del fascio. Facendo nuovamente riferimento all’esempio di un neurone, l’altezza minima della cellula tra la superficie apicale e la superficie basale è di circa 5 pm. In tale esempio, la distanza assiale dalla superficie planare del substrato per la posizione Zfè preferibilmente selezionata ad un valore maggiore di zero e minore di 5 pm. In una fonna realizzati va, la distanza assiale dalla superficie planare del substrato è di 3 pm. Prendendo come posizione di riferimento la posizione z0corrispondente alla superficie planale del substrato, la posizione assiale iniziale può essere espressa con Zi=Zo+nq, dove nq è un numero reale positivo. La posizione finale, Zf, in coirispondenza della quale il fascio laser è spento può essere espressa con Zf=z0+m2, dove m2è un numero reale positivo inferiore a ni!, m2=nq -Δζ, con Δζ>0.

In alcune forme realizzative, si determina la posizione punto Zo e si selezionano i valori delle distanze assiali nq e m2tali che nq è maggiore dello spessore massimo della cellula e m2è minore dello spessore minimo della cellula.

In una fonna realizzativa e a tìtolo esemplificativo, nq= 25 pm e m2= 3 pm, così da avere uno spostamento assiale che copre la distanza tra z0+25 pm e z0+3 pm, i.e. Δζ=21 pm.

In una felina realizzativa, il valore z0viene determinato in una fase di calibrazione, che precede la fase di opto-iniezione, nella quale si muove lo spot focale dall’alto attraverso il liquido verso la superficie del substrato privo di campione biologico. Pertanto, quando il firoco del laser raggiunge la superficie 40 del substrato 46, si crea un fiorellino sulla superficie, ablato dal firoco del laser stesso. La formazione di tale forellino è visibile mediate il sistema di imaging dell’apparato.

In figura 4 è indicata anche la posizione assiale lungo l’asse ottico z del fascio in conispondenza della membrana della cellula, zm.In accordo con le forme realizzati ve della presente divulgazione, non è necessario determinare la posizione z,n, poiché essa si trova tra una stabilita posizione di partenza ad una certa altezza rispetto alla superficie apicale della cellula ed una stabilita posizione di arrivo dello spot focale all’interno della cellula.

Nelle forme di realizzazione preferite, quando il fascio laser raggiunge la posizione Zf, esso viene spento in modo tale che durante l’allontanamento del fascio dalla cellula lungo la direzione assiale non crei un flusso di fluido nella direzione opposta, che vada a contrastare il flusso generato precedentemente diretto verso l’interno della cellula. Inoltre lo spegnimento del fascio laser riduce il foto- danneggiamento della cellula.

In alcune forme di realizzazione preferite, successivamente allo spegnimento del fascio alla posizione Zf, il segnale di controllo della lente accordabile è impostato nuovamente ad un valore di ampiezza di segnale, che corrisponde alla posizione assiale iniziale, z;. Lo spot focale del fascio si posiziona quindi ad una determinata altezza rispetto alla superficie apicale della cellula e l’operazione di opto-iniezione è ripetuta una seconda volta, comandando, mediante l’unità di controllo, la discesa dello spot focale fino alla posizione assiale Zf, in corrispondenza della quale, il fascio è spento. In generale, la procedura di opto-iniezione può essere ripetuta ima numero desiderato di volte.

La variazione di ampiezza del segnale di controllo e quindi la variazione di lunghezza focale è configurata in modo tale da realizzare ima variazione continua della posizione assiale dello spot focale. Come è in generale noto, la continuità di variazione di segnali dipende dall’ elettronica di controllo che stabilisce la variazione differenziale (incrementi o decrementi) di ampiezza del segnale di controllo della lente accordabile ha mi valore di ampiezza e il successivo. Preferibilmente il segnale di controllo della lente accordabile è un segnale elettrico analogico, in quanto permette una variazione continua (non a gradini) della sua lunghezza focale.

La presente divulgazione non esclude tuttavia l’utilizzo di im segnale di controllo digitale per la lente accordabile. Nel caso di segnale di controllo digitale, la dimensione delle variazioni discrete della lunghezza focale dipende dal ninnerò di bit del segnale digitale. Ad esempio, mi convertitore A/D con risoluzione di 8 bit codifica un segnale analogico di controllo in ingresso in 2 256 valori discreti. Ad esempio, se la lente accordabile ha 90 mm di intervallo di variazione di lunghezza focale, ad esempio, da mi minimo di 45 mm a mi massimo di 135 mm, la minima variazione di lunghezza focale è pari a 90/256, ossia di 0,35 mm. L’utilizzo di convertitoli A/D con risoluzione più elevata, ad esempio maggiore o uguale a 12 bit, riduce la possibile variazione minima di lunghezza focale.

La Richiedente ha osservato che l’utilizzo di un segnale modulato in frequenza di controllo della lente accordabile, in cui la Sequenza è variabile all’interno di un intervallo di valori, permette di selezionare la velocità di spostamento dello spot focale lungo l’asse ottico del fascio. La velocità di spostamento può essere selezionata in dipendenza dalla tipologia di cellule target e/o dal materiale da iniettare. La Richiedente ha notato che, specialmente nel caso di cellule in vivo, una velocità relativamente bassa implica un tempo relativamente grande di interazione del fascio laser con la cellula, ed in al ernie condizioni l’operazione di opto -iniezione può creare foto-danneggiamento.

In alcune forme realizzative, la Sequenza del segnale elettrico di controllo è selezionata in modo tale da realizzare una velocità di spostamento assiale dello spot focale compreso ha 10 pm/s a 500 μιη/s, preferibilmente ha 80 e 150 pm/s.

La velocità dello spostamento assiale dello spot focale, ν&, è finizione della Sequenza del segnale di conhollo della lente accordabile, e/o della distanza assiale Az=(zf -zi) percorsa dal fascio durante la sua discesa verso la cellula:

Vfs<=>2<■>(zf — Zi)<■>£TL. (1)

A distanza assiale Δζ costante, un aumento di frequenza implica un aumento della velocità di spostamento assiale.

Il fascio laser è ad impulsi sub-ns. Per un fascio con Sequenza di impulsi (pulse rate ) costante, una variazione di velocità di spostamento assiale comporta una var iazione di ninnerò di impulsi per unità di lunghezza, Ν„ηρι1ι5ί/μηι. Le posizioni 3⁄4 e Zfsono selezionate variando Pampiezza del segnale elettrico applicato agli elettrodi della lente accordabile:

Njmpuisi/pm = (frequenza di impulsi)/vfS(2)

In alcune fonile di realizzazione preferite, la lente accordabile è controllata mediante im segnale elettrico in tensione di ampiezza (massima) V0modulato in frequenza fu., ad esempio V(t)=Vosin(27ifrLt). Il valore di tensione V(t) è corrispondente ad una determinata lunghezza focale della lente accordabile e quindi ad una determinata posizione focale lungo l’asse othco del fascio incidente, mentre la Sequenza determina la velocità di spostamento assiale secondo l’Eq. (1), sopra riportata.

La figura 5a mostra un possibile segnale di conhollo in tensione della lente a lunghezza focale accordabile a forma d’onda triangolare che varia, in funzione del tempo, da un primo valore Vpo ad un secondo valore Vpl, muovendo assialmente in questo modo lo spot focale dalla posizione assiale 3⁄4 alla posizione assiale Zf. In tale forma realizzativa, la lente accordabile è impostata ad una lunghezza focale iniziale fi mediante un segnale di comando ( driving signal) ad un valore iniziale di tensione Vp0, la lunghezza focale 1, corrispondendo alla posizione assiale z; e il fascio laser viene acceso, indicato dallo spot focale 44 di figura 4. Α1Γ accensione, Punita di controllo comanda una variazione di frequenza del segnale di comando della lente accordabile dal valore iniziale di tensione Vp0ad un valore finale di tensione Vplche determina una lunghezza focale finale, lf, corrispondente alla posizione assiale finale Zfdello spot focale del fascio laser.

Nella figura 5b, è rappresentato il tempo di accensione, V=5 Volt (tensione di alimentazione), e spegnimento V=0, della sorgente laser. La sorgente laser è spenta nella rampa di segnale di controllo da Vpia Vp0, mentre è accesa nella rampa di segnale da Vp0a Vplquando il fascio è diretto verso la cellula. La figura 5c è una rappresentazione del numero di impulsi ottici Nimpuisidinante la discesa dello spot focale del fascio. I vaioli numerici indicati sono fomiti a titolo di esempio.

L’unità elettronica di controllo, collegata al regolatore di ampiezza del segnale di controllo della lente accordabile, comanda una variazione di ampiezza da un primo valore di ampiezza ad un secondo valore di ampiezza. Nei modi usuali, l’unità di controllo, che comprende im microprocessore ed un programma di computer per il controllo della lente a lunghezza focale accordabile, è collegata ad un dispositivo di ingresso, ad esempio imo schermo touch screen o una tastiera, attraverso il quale un operatore può immettere i valori iniziale e finale, V0ie V0f, di tensione del segnale di controllo e il valore di frequenza frLdel segnale.

Con riferimento all’apparato per l’opto -iniezione di figura 1, una procedura operativa del metodo di opto-iniezione secondo una forma realizzativa della presente invenzione comprende:

(i) posizionale un porta- campioni 18 sul sistema di traslazione 19 del microscopio, il porta-campioni contenendo mi campione biologico che comprende mia pluralità di cellule immerse in una soluzione extracellulare contenente materiale esogeno da opto-iniettare;

(ii) con la lampada da microscopio 21 accesa, traslare il campione lungo l’asse z, tramite il sistema di traslazione 19, per mettere a fuoco il campione, e poi traslare nel piano (x,y) il campione sempre mediante il sistema di traslazione 19 (la sorgente laser è spenta) osservando immagine del campione per individuare una cellula della pluralità da opto-iniettare, ossia una cellula ricevente;

(rii) impostare le coordinate x e y dello spot focale su una regione desiderata della cellula ricevente;

(iv) selezionare un segnale elettrico di controllo della lente accordabile di tensione modulato in frequenza selezionando: la frequenza ÌTLdel segnale così da selezionare la velocità di spostamento assiale dello spot focale (si veda Eq. (1)), mi primo valore di tensione V0, del segnale di controllo della lente accordabile ed un secondo valore di tensione V0f, in cui Voi e V0fcorrispondono rispettivamente a valori di posizione assiale z; e z£ e quindi ad mia distanza di percorrenza dello spot focale Az=(zrZi);

(v) calcolare il valore Nunpii[sl/pin da questo calcolare il numero totale di impulsi, N impili si jdel fascio laser durante una (singola) discesa dello spot focale lungo la distanza Δζ. Nel caso la frequenza di impulsi del fascio vari durante lo spostamento dello spot focale lungo Δζ, il ninnerò di impulsi è determinato dall’Eq. (2);

(vi) selezionare mi ninnerò di cicli, NC>1, nei quali viene ripetuta la discesa dello spot focale del laser sulla stessa regione della cellula, i.e. stesse coordinate (x,y) del punto (iii) e con gli stessi parametri impostati nelle fasi (iv) e (v). Con il numero di cicli si detennina il numero totale di impulsi laser che colpiscono la cellula nella procedura di opto -iniezione, N=NC-Nimpii[a. In al cime forme realizzative, il numero di cicli è un numero intero compreso tra 1 e 5 ;

(vii) impostare il segnale di controllo modulato a Sequenza fu. al valore di tensione V, Oi,

(vili) comandare l’accensione della sorgente laser;

(ix) regolare in modo continuo l’ampiezza di tensione V0del segnale di controllo della lente accordabile dal piimo valore V0ial secondo valore Vofmuovendo in questo modo lo spot focale del fascio laser lungo distanza di percorrenza Δζ;

(x) comandare lo spegnimento della sorgente laser; e

(xi) nel caso NC>1, ripetere le fasi da (vii) a (x) im numero Ncdi volte.

Il numero totale di impulsi laser N può essere calcolato mediante la seguente equazione:

N = Nc-Nimpuisi= (Sequenza impulsi)/frL(3)

Per alcuni Spi di cellula e/o di materiale esogeno, un ciclo di opto -iniezione, Nc=l, può realizzare mia effi cace opto-iniezione. Un numero di cicli maggiore di 1 può aumentare il numero delle molecole inietate Si una stessa regione della cellula e può essere preferita in alcuni casi di interesse.

Il metodo consistente con la presente divulgazione utlizza una sorgente a Snpulsi sub-ns, che non genera onde d’urto nel campione e permete Γ utilizzo di un fascio Gaussiano a piccolo spot focale, nel quale vengono generate forze otiche relativamente elevate. In al cime forme di realizzazione preferite, è possibile utilizzare un fascio laser di potenza otica non molto elevata, e.g. inferiore a 30 pW.

Sebbene la presente descrizione faccia riferimento a campioni biologici con cellule viventi, che rappresentano applicazioni di particolare interesse, il metodo in accordo con la presente divulgazione può essere applicato anche per iniezione ottica in una cellula ricevente non in vivo, ad esempio nel caso di campioni con cellule in soluzione fissate su un substrato.

Esempio

Le figure óa a 6f mostrano una serie di immagini al microscopio a fluorescenza acquisite prima, durante e dopo E opto- iniezione di una cellula neuronaie, rispettivamente. Cellule neuronali sono state incubate con una soluzione fisiologica per cellule contenente coloranti fluorescenti FM1-43 all’interno di una piastra di Perii di vetro. La piastra di Perii aveva ima base che costituiva il substrato sul quale erano appoggiate le cellule ed in particolare la cellula ricevente. Le molecole FM1-43 sono note aumentare la resa quantica quando interagiscono con gli strati fosfolipidici della membrana della cellula, ed è quindi possibile rilevare il flusso della soluzione all’interno della cellula quando la membrana viene perforata dal fascio laser, dato che le molecole enfiano e interagiscono con le membrane degli organetti intracellulari. Figura 6a è un’immagine che mostra la cellula target (ricevente) evidenziata da un contorno indicato con una freccia, prima dell’opto-iniezione. Le macchie bianche nella figura 6 a rappresentano tre cellule morte che emettono un segnale saturato di luce fluorescente dovuto all’assorbimento incontrollato da parte delle cellule morte delle molecole coloranti nella soluzione extra- cellulare. Le cellule vive presentano un basso segnale di luce fluorescente perché la loro membrana intatta non permette il flusso della soluzione extra-cellulare al loro interno.

L’esperimento Ira utilizzato un apparato di opto-iniezione del tipo rappresentato in figura 1. Una sorgente laser configurata per emettere fascio laser ad impulsi di durata di 400 picosecondi con lunghezza d’onda di 355 nm ed una frequenza di ripetizione degli impulsi 1 kHz. La potenza ottica media del fascio era di 18 pW, corrispondente ad una energia di 18 nJ per impulso. La sorgente laser era accoppiata ad un sistema ottico a lunghezza focale accordabile del tipo mostrato in figura 1, comprendente una lente a lunghezza focale accordabile EL-10-30 prodotta da Optotune, la cui lunghezza focale può essere variata da 50 mm a 125 mm. La lente a lunghezza focale accordabile era controllata da im segnale di controllo del tipo rappresentato in figura 5a, che produceva imo spostamento dello spot focale da 25 μιη rispetto al substrato (corrispondente a chea 15 μιη dalla superficie apicale della cellula target, nel punto di sua altezza massima) a 3 μιη di distanza assiale dalla superficie del substrato. La frequenza del segnale di controllo era di 6 Hz. Con queste impostazioni un rilascio di chea 4-5 impulsi per pm è stato ottenuto. Lo specchio dicroico disposto per ricevere il fascio passato attraverso il sistema ottico era uno specchio configurato per riflettere il fascio ottico fino ad una lunghezza d’onda di circa 400 mn e trasmettere luce a lunghezza d’onda maggiore. In questo modo, la luce della lampada per microscopio, che aveva lunghezza d’onda nell’ intervallo 400-500 nm, passa indisturbata atraverso lo specchio dicroico cosi come il segnale fluorescente delle molecole FM1-43, emesso a lunghezze d’onda tra 500 mn e 690 mn.

Il fascio riflesso dallo specchio dicroico entra nella lente obiettivo, un convenzionale obiettivo per microscopia ottica ad immersione ad acqua con ingrandimento 60X e NA=0.9, risultando in uno spot focale del fascio laser di diametro di chea 500 nm nel piano (x,y) e di chea 800 mn nella direzione z.

La velocità di spostamento assiale era di 125 μιη/s.

La figura 6b mostra la posizione spazio-temporale del rilascio degli impulsi otici del fascio, indicata con mia freccia.

Quando la cellula è perforata otticamente, la soluzione extra- cellulare enfia nella cellula e il colorante fluorescente interagisce con le membrane degli organelli e compartimenti contenuti all’ interno della cellula neuronaie. La resa quantica delle molecole aumenta e di conseguenza il segnale di luce fluorescente emesso all’ interno della cellula. Le figure da óc a 6f sono immagini in fluorescenza della cellula dopo il completamento del protocollo di optoiniezione, che sono state acquisite in tempi diversi con 3 secondi di intervallo da un immagine all’ altra, per visualizzare l’aumento di fluorescenza emessa dall’interno della cellula.

La figura 7 mostra l’intensità media, F, di luce fluorescente nel tempo, normalizzata al valore medio iniziale di fluorescenza FO, che è stata calcolata nell’area della cellula target in funzione del tempo. Il picco di intensità indicato con una freccia rappresenta l’accensione del laser durante una singola fase di discesa. Infatti nell’esperimento descritto nel presente esempio, è stato eseguito solo un ciclo di opto-iniezione sulla cellula ricevente.

Tuttavia, è possibile impostare una pluralità di cicli di iniezioni ottiche dinante gli spostamenti ciclici dello spot focale. Le iniezioni ottiche possono essere realizzate con un fascio laser ad energia inferiore così da utilizzare potenze medie del laser inferiori e ridurre il foto- danneggiamento .

Claims (10)

1. Rivendicazioni 1. Metodo per la opto-iniezione di materiale esogeno in una cellula biologica ricevente, nel quale la cellula comprende una membrana cellulare che la racchiude, il metodo comprendendo: (a) disporre una cellula biologica su una superficie planare di un substrato, la cellula avendo una superficie basale appoggiata sulla superficie planare del substr ato e una superficie apicale opposta alla superficie basale e a contatto con una soluzione fluida che contiene materiale esogeno; (b) trasmettere un fascio laser ad impulsi sub-ns attraverso un collimatore a convergenza/divergenza variabile, il collimatore comprendendo una lente a lunghezza focale accordabile mediante un segnale elettrico di controllo ad ampiezza variabile; (c) dirigere il fascio laser che è passato attraverso il collimatore attraverso una lente obiettivo configurata per focalizzare il fascio laser lungo un asse ottico in uno spot focale, l’asse ottico definendo una direzione assiale sostanzialmente perpendicolare alla superficie planare del substrato, cosi che lo spot focale sia posizionato lungo la direzione assiale; (d) impostare il segnale elettrico di controllo ad un primo valore di ampiezza che definisce mia prima lunghezza focale della lente, corrispondente ad una prima posizione assiale 3⁄4 dello spot focale lungo l’asse ottico, in cui il primo valore di ampiezza del segnale di controllo è selezionato in modo che la prima posizione assiale 3⁄4 sia sopra la superficie apicale della cellula ad una prima distanza assiale dalla superficie planare del substrato, e (e) muovere lo spot focale verso la cellula lungo la direzione assiale variando in modo contìnuo il segnale el etìlico di controllo dal primo valore di ampiezza ad mi secondo valore di ampiezza, il secondo valore di ampiezza definendo mia seconda lunghezza focale corrispondente ad una seconda posizione assiale zf- dello spot focale, in cui il secondo valore di ampiezza del segnale di controllo è selezionato in modo che la seconda posizione assiale sia posizionata all’interno della cellula, ad mia seconda distanza assiale dalla superficie planare del substrato, minore della prima distanza assiale, cosi che lo spot focale attraversi la membrana della cellula durante la discesa dello spot focale verso la cellula producendo mi poro nella membrana che consente l’ingresso di soluzione fluida contenente materiale esogeno nella cellula.
2. 2. Il metodo della rivendicazione 1, il collimatore a convergenza/divergenza variabile comprende inoltre una seconda lente convergente a lunghezza focale fissa, disposta rispetto alla lente a lunghezza focale accordabile in modo tale che il fascio laser attraversi la seconda lente, oltre che la lente a lunghezza focale accordabile, precedentemente alla fase (d).
3. 3. Metodo della rivendicazione 1 o 2, che comprende inoltre: (f) spegnere il fascio laser quando lo spot focale ha raggiunto la seconda posizione assiale, e (g) impostare il segnale di controllo, a fascio spento, al primo valore di ampiezza del segnale di controllo in modo tale che lo spot focale si posizioni alla prima posizione assiale 3⁄4 lungo l’asse ottico del fascio.
4. 4. Metodo secondo la rivendicazione 3, che comprende inoltre, successivamente alla fase (g), accendere il fascio laser e ripetere la fase (e).
5. 5. Metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti, in cui il segnale elettrico di controllo della lente a lunghezza focale accordabile è un segnale elettrico analogico.
6. 6. Metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti in cui il segnale di controllo della lente a lunghezza focale accordabile è un segnale elettrico analogico modulato in frequenza ad una Sequenza fTLche determina la velocità di spostamento assiale dello spot focale v&durante la sua discesa dalla prima posizione assiale alla seconda posizione assiale, secondo la relazione v&= 2<■>(Zf - ζ,)<■>frL .
7. 7. Metodo secondo la rivendicazione 6, in cui la velocità di spostamento assiale dello spot focale è compresa tra 10 pm/s e 500 μιη/s, preferibilmente tra 80 e 150 pm/s.
8. 8. Metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti, in cui lo spot focale ha dimensione lungo la direzione assiale compresa tra 300 mn e 1000 mn.
9. 9. Metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti, in cui la lente a lunghezza focale accordabile è una lente a variazione di forma controllabile eletricamente mediante un attuatore comandato dal segnale elettrico di controllo ad ampiezza variabile.
10. 10. Metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti, in cui la distanza assiale di percorrenza dello spot focale del fascio laser Az=(zfz,) è compresa ha 20 μηι e 100 pm.