ITUB20155471A1 - CONJUGATE OF NEUREGULINE 1 FOR THE TREATMENT OF INJURIES OF PERIPHERAL NERVES - Google Patents

CONJUGATE OF NEUREGULINE 1 FOR THE TREATMENT OF INJURIES OF PERIPHERAL NERVES Download PDF

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Stefano Geuna
Abraham Shahar
Ofra Ziv-Polat
Giovanna Gambarotta
Federica Fregnan
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Description

DESCRIZIONE DESCRIPTION

"CONIUGATO DELLA NEUREGULINA 1 PER IL TRATTAMENTO DELLE LESIONI DEI NERVI PERIFERICI" "NEUREGULIN 1 CONJUGATE FOR THE TREATMENT OF INJURIES OF PERIPHERAL NERVES"

La presente invenzione è relativa ad un coniugato della neuregulina 1, in particolare per il trattamento delle lesioni dei nervi periferici. The present invention relates to a neuregulin 1 conjugate, in particular for the treatment of peripheral nerve lesions.

Le lesioni dei nervi periferici, che provocano debolezza, paralisi, perdita sensoriale e percezione di dolore neuropatico, sono causa di morbidità e ridotta qualità della vita. Il 6% della popolazione anziana soffre di neuropatia periferica (Martyn and Hughes 1997) provocata da patologie come il diabete, malattie ereditarie genetiche come la malattia di Charcot-Marie-Tooth, malattie infettive e disturbi infiammatori. Peripheral nerve injuries, which cause weakness, paralysis, sensory loss and perception of neuropathic pain, cause morbidity and reduced quality of life. 6% of the elderly population suffers from peripheral neuropathy (Martyn and Hughes 1997) caused by diseases such as diabetes, genetic inherited diseases such as Charcot-Marie-Tooth disease, infectious diseases and inflammatory disorders.

Contrariamente a ciò che capita nel Sistema Nervoso Centrale (SNC), i nervi periferici possiedono una forte capacità rigenerativa intrinseca (Filbin 2003). Nonostante questo, i pazienti non raggiungono mai un recupero pienamente soddisfacente. Contrary to what occurs in the Central Nervous System (CNS), peripheral nerves possess a strong intrinsic regenerative capacity (Filbin 2003). Despite this, patients never achieve a fully satisfactory recovery.

Infatti, gli assoni rigenerano con una velocità di circa 1 mm al giorno, a seconda del sito della lesione; pertanto può verificarsi un ritardo di mesi, se non anni, prima che 1'organo bersaglio venga reinnervato, provocando un cambiamento irreversibile a quest'ultimo ed alle cellule di supporto. In fact, the axons regenerate with a speed of about 1 mm per day, depending on the site of the lesion; therefore a delay of months, if not years, may occur before the target organ is reinnervated, causing an irreversible change to the latter and to the supporting cells.

Per favorire la rigenerazione dei nervi periferici è quindi opportuno l'impiego dell'ingegneria tissutale e la costruzione di un ambiente rigenerativo ottimizzato. To promote the regeneration of peripheral nerves, it is therefore advisable to use tissue engineering and the construction of an optimized regenerative environment.

Uno degli approcci allo studio è quello di fornire al sito bersaglio molecole che siano in grado di promuovere la rigenerazione del nervo. Ad oggi, tuttavia, non esistono in commercio terapie farmacologiche che possano stimolare e velocizzare la rigenerazione assonale, aumentare la specificità nel raggiungere l'organo bersaglio e prevenire l'atrofia muscolare. One of the approaches to the study is to deliver molecules to the target site that are capable of promoting nerve regeneration. To date, however, there are no drug therapies on the market that can stimulate and speed up axonal regeneration, increase specificity in reaching the target organ and prevent muscle atrophy.

In seguito al danno periferico, il meccanismo rigenerativo viene messo in moto da una segnalazione coordinata tra la componente assonale, quella macrofagica e le cellule di Schwann (SC). Following peripheral damage, the regenerative mechanism is set in motion by coordinated signaling between the axonal, macrophage and Schwann cells (SC).

La rigenerazione assonale nel sistema nervoso periferico è sottesa da un'intensa attività di differenziazione e proliferazione delle SC (Carroll, Miller et al. 1997). In questo processo, giocano un ruolo fondamentale diverse isoforme della neuregulina 1 (NRG1); in particolare, l'espressione della NRG1 di tipo I, indotta in seguito a denervazione, è strettamente associata alle cellule SC suggerendo una comunicazione paracrina (Stassart, Fledrich et al.; Ronchi, Gambarotta et al. Axonal regeneration in the peripheral nervous system is underpinned by an intense activity of differentiation and proliferation of SCs (Carroll, Miller et al. 1997). In this process, several isoforms of neuregulin 1 (NRG1) play a fundamental role; in particular, the expression of NRG1 type I, induced following denervation, is closely associated with SC cells suggesting paracrine communication (Stassart, Fledrich et al .; Ronchi, Gambarotta et al.

2013). 2013).

Le neureguline sono una famiglia di fattori di crescita codificata da quattro geni (NRG1-4); tutte queste molecole agiscono attraverso il legame con i recettori tirosin-chinasici appartenenti alla famiglia degli ErbB e contengono il dominio EGF-simile, essenziale per la loro attività (Marchionni, Goodearl et al. 1993; Carraway, Weber et al. 1997; Zhang, Sliwkowski et al, 1997). Neuregulins are a family of growth factors encoded by four genes (NRG1-4); all these molecules act through binding with the tyrosine kinase receptors belonging to the ErbB family and contain the EGF-like domain, essential for their activity (Marchionni, Goodearl et al. 1993; Carraway, Weber et al. 1997; Zhang, Sliwkowski et al, 1997).

Sono state descritte 31 isoforme di NRG1 umana, generate in seguito ad un fenomeno di splicing alternativo e differenti siti di inizio trascrizione (Mei and Xiong 2008). Le isoforme differiscono nel motivo N-terminale e possono essere suddivise in sei tipi (I-VI). 31 human NRG1 isoforms, generated following an alternative splicing phenomenon and different transcription start sites have been described (Mei and Xiong 2008). The isoforms differ in the N-terminal motif and can be divided into six types (I-VI).

L'importanza documentata della segnalazione endogena della NRG1 nei processi rigenerativi, ha suggerito che la somministrazione della forma ricombinante di tale molecola, in seguito a danno nervoso, possa migliorare il recupero funzionale. Le strategie ad oggi applicate per esplicare il rilascio di NRG1 si possono identificare in iniezioni subcutanee (Chen, Liu et al. 1998), rilascio attraverso biomateriali (Whitworth, Dorè et al. 1995; Sterne, Brown et al. 1997; Terenghi 1999), trapianto di cellule overesprimenti NRG1 (Faroni, Mantovani et al. 2011) ed iniezioni di adenovirus codificanti per la NRG1 (Naldini, Blomer et al. 1996). The documented importance of NRG1 endogenous signaling in regenerative processes has suggested that the administration of the recombinant form of this molecule, following nerve damage, may improve functional recovery. The strategies applied to date to carry out the release of NRG1 can be identified in subcutaneous injections (Chen, Liu et al. 1998), release through biomaterials (Whitworth, Dorè et al. 1995; Sterne, Brown et al. 1997; Terenghi 1999) , transplantation of NRG1 overexpressing cells (Faroni, Mantovani et al. 2011) and injections of adenovirus coding for NRG1 (Naldini, Blomer et al. 1996).

E' stato osservato tuttavia che lo svantaggio dei sistemi di rilascio sopra descritti consiste nella breve emivita del fattore. Infatti una volta somministrata, la molecola perde in poco tempo la propria efficacia con conseguente limitata azione in seguito a somministrazione. However, it has been observed that the disadvantage of the delivery systems described above is the short half-life of the factor. In fact, once administered, the molecule loses its effectiveness in a short time with consequent limited action following administration.

Lo scopo della presente invenzione è pertanto quello di fornire un sistema di rilascio per la neuregulina che sia stabile nel tempo. The object of the present invention is therefore to provide a delivery system for neuregulin which is stable over time.

Tale scopo è raggiunto dalla presente invenzione, in quanto relativa ad un coniugato secondo la rivendicazione 1 ad una composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 7 e al loro uso secondo le rivendicazioni 8 e 9. This object is achieved by the present invention, as it relates to a conjugate according to claim 1 to a pharmaceutical composition according to claim 7 and to their use according to claims 8 and 9.

La presente invenzione verrà ora descritta in modo dettagliato con riferimento alle figure dei disegni annessi, in cui: The present invention will now be described in detail with reference to the figures of the annexed drawings, in which:

- la Figura 1 illustra i risultati del saggio di migrazione che confronta il coniugato dell'invenzione e la neuregulina non coniugata; Figure 1 illustrates the results of the migration assay comparing the conjugate of the invention and the unconjugated neuregulin;

la Figura 2 illustra immagini di microscopia elettronica delle cellule ST14A esprimenti stabilmente un'isoforma del recettore ErbB4, stimolate con 500 ng/ml del coniugato dell' invenzione e con 500 ng/ml di nanoparticelle di ossido di ferro da sole. Figure 2 illustrates electron microscopy images of ST14A cells stably expressing an isoform of the ErbB4 receptor, stimulated with 500 ng / ml of the conjugate of the invention and with 500 ng / ml of iron oxide nanoparticles alone.

Secondo un primo aspetto della presente invenzione viene fornito un coniugato di una isoforma di neuregulina 1 ricombinante con nanoparticelle di ossido di ferro. According to a first aspect of the present invention, a conjugate of a recombinant neuregulin 1 isoform with iron oxide nanoparticles is provided.

Preferibilmente 1'isoforma della NRG1 è 1'isoforma beta, più preferibilmente 1'isoforma beta 1 (NRG1 tipo I pi) che include nella sua struttura il dominio EGF-like di tipo β ed un dominio immunoglobulinico nella regione N-terminale (tipo I), Preferably the NRG1 isoform is the beta isoform, more preferably the beta 1 isoform (NRG1 type I pi) which includes in its structure the EGF-like domain of type β and an immunoglobulin domain in the N-terminal region (type I ),

La NRG1 tipo I beta 1 è stata coniugata covalentemente a nanoparticelle di ferro preferibilmente rivestite esternamente di destrano. NRG1 type I beta 1 was covalently conjugated to iron nanoparticles preferably externally coated with dextran.

Le nanoparticelle di ossido di ferro, che per le loro proprietà fisiche hanno trovato un'ampia applicazione in campo biomedico (Thorek, Chen et al. 2006; Laurent, Forge et al. 2008), possono essere realizzate in magnetite Iron oxide nanoparticles, which due to their physical properties have found wide application in the biomedical field (Thorek, Chen et al. 2006; Laurent, Forge et al. 2008), can be made of magnetite

(Fe304). (Fe304).

Esse possono essere suddivise in diverse categorie in base al loro diametro idrodinamico (Corot, Robert et al. They can be divided into several categories based on their hydrodynamic diameter (Corot, Robert et al.

2006) e particelle di ossido di ferro superparamagnetico definite "ultrasmall" (USPIOs) (da 10 a 50 nm) sono utilizzate come agenti di contrasto nella risonanza magnetica (MRI). Altre applicazioni cliniche vedono le nanoparticeIle utilizzate nel campo della cura dei tumori attraverso il targeting magnetico di farmaci attraverso la barriera emato-encefalica (Chertok, Moffat et al. 2008); nella ipertermia magnetica (MFH), procedura in cui nanoparticelle di ossido di ferro vengono iniettate nei tumori, esposte ad una alta frequenza (100 kHz) e quindi in grado di danneggiare il tumore riscaldando il tessuto tumorale (Maier-Hauff, Rothe et al. 2007) (Thiesen and Jordan 2008). 2006) and superparamagnetic iron oxide particles defined as "ultrasmall" (USPIOs) (10 to 50 nm) are used as contrast agents in magnetic resonance imaging (MRI). Other clinical applications see nanoparticles used in the field of cancer treatment through the magnetic targeting of drugs across the blood-brain barrier (Chertok, Moffat et al. 2008); in magnetic hyperthermia (MFH), a procedure in which iron oxide nanoparticles are injected into the tumors, exposed to a high frequency (100 kHz) and therefore capable of damaging the tumor by heating the tumor tissue (Maier-Hauff, Rothe et al. 2007) (Thiesen and Jordan 2008).

Le sopracitate proprietà fisiche e la biocompatibilità assoluta di queste particelle ha spianato la strada a nuovi studi nel campo della rigenerazione del nervo periferico (Ziv-Polat, Shahar et al. 2014). The aforementioned physical properties and absolute biocompatibility of these particles paved the way for new studies in the field of peripheral nerve regeneration (Ziv-Polat, Shahar et al. 2014).

Nanoparticelle di ossido di ferro sono state utilizzate in studi in vitro come metodo di veicolazione e rilascio dei fattori di crescita per stimolare la crescita assonale e la differenziazione delle cellule gliali in prospettiva del loro uso nel sito di lesione del nervo (Morano, Wrobel et al. 2014). Iron oxide nanoparticles have been used in in vitro studies as a method of delivery and release of growth factors to stimulate axonal growth and differentiation of glial cells with a view to their use at the nerve injury site (Morano, Wrobel et al . 2014).

Secondo la presente invenzione le nanoparticelle di ferro possono avere un diametro compreso tra 8 e 15 nm, ad esempio a 9.5+ 0.9 nm. According to the present invention, the iron nanoparticles can have a diameter between 8 and 15 nm, for example at 9.5 + 0.9 nm.

Secondo un secondo aspetto dell'invenzione viene inoltre fornita una composizione farmaceutica comprendente il coniugato dell'invenzione e un eccipiente farmaceuticamente accettabile. According to a second aspect of the invention there is also provided a pharmaceutical composition comprising the conjugate of the invention and a pharmaceutically acceptable excipient.

Il coniugato dell'invenzione si è dimostrato particolarmente efficace nella rigenerazione del nervo periferico e pertanto per il trattamento di un disturbo selezionato nel gruppo costituito da danni ai nervi periferici dovuti a traumi, incidenti, operazioni chirurgiche e neuropatie periferiche. The conjugate of the invention has proved particularly effective in the regeneration of the peripheral nerve and therefore for the treatment of a disorder selected from the group consisting of damage to the peripheral nerves due to trauma, accidents, surgical operations and peripheral neuropathies.

Vantaggiosamente, la coniugazione della neuregulina 1 con nanoparticelle di ossido di ferro risulta in un aumento della stabilità della proteina e quindi della sua durata d'azione dopo somministrazione. Advantageously, the conjugation of neuregulin 1 with iron oxide nanoparticles results in an increase in the stability of the protein and therefore in its duration of action after administration.

Inoltre, la molecola coniugata alle nanoparticelle di ossido di ferro può essere anche dislocata in situ applicando un campo magnetico locale nel punto preciso in cui è necessaria la sua azione. Questo sistema di rilascio, a lunga stabilità, biocompatibile, non tossico, rappresenta pertanto un significativo miglioramento rispetto alle molecole ricombinanti esistenti in commercio. Furthermore, the molecule conjugated to the iron oxide nanoparticles can also be dislocated in situ by applying a local magnetic field at the precise point where its action is required. This long-stable, biocompatible, non-toxic release system therefore represents a significant improvement over the recombinant molecules available on the market.

Ulteriori caratteristiche della presente invenzione risulteranno dalla descrizione che segue di alcuni esempi meramente illustrativi e non limitativi. Further characteristics of the present invention will emerge from the following description of some merely illustrative and non-limiting examples.

Esempio 1 Example 1

Preparazione del coniugato MRGl-Ι-βΙ con nanoparticelle di Fe Preparation of the MRGl-Ι-βΙ conjugate with Fe nanoparticles

Le nanoparticelle di ossido di ferro rivestite di destrano di un diametro compreso tra 8-15 nm sono state preparate come descritto in Molday et al (Molday et al, Immunol. Methods 1982; 52 (3);353-67), Brevemente, queste nanoparticelle sono state preparate miscelando 10 mi di destrano 50% (p/p) con un ugual volume di una soluzione acquosa contenente 1,51 g di FeCl3-6H20 e 0,64 g FeCl2-4H20. Mescolando, la miscela è stata titolata a pH 10-11 mediante aggiunta goccia a goccia di NH4OH 7,5% (v/v) e scaldata a 60 °C, con l'ausilio di un bagnetto termostatato, per 15 minuti. Gli aggregati sono poi stati rimossi con tre cicli di centrifugazione in una centrifuga a bassa velocità a 600xg per 5 min. Le nanoparticelle di ossido di ferro rivestite con destrano sono poi state lavate dal destrano non legato con un tampone di sodio bicarbonato 0,1M (pH 8,3) all'interno di colonne magnetiche. The dextran-coated iron oxide nanoparticles with a diameter of 8-15 nm were prepared as described in Molday et al (Molday et al, Immunol. Methods 1982; 52 (3); 353-67). Briefly, these nanoparticles were prepared by mixing 10 ml of 50% (w / w) dextran with an equal volume of an aqueous solution containing 1.51 g of FeCl3-6H20 and 0.64 g FeCl2-4H20. While mixing, the mixture was titrated to pH 10-11 by dropwise addition of 7.5% NH4OH (v / v) and heated to 60 ° C, with the aid of a thermostated bath, for 15 minutes. The aggregates were then removed with three centrifugation cycles in a low-speed centrifuge at 600xg for 5 min. The dextran-coated iron oxide nanoparticles were then washed from the unbound dextran with 0.1M sodium bicarbonate buffer (pH 8.3) inside magnetic columns.

Le nanoparticelle così ottenute presentano sulla loro superficie dei gruppi idrossilici. The nanoparticles thus obtained have hydroxyl groups on their surface.

La coniugazione con la neuregulina è stata ottenuta mediante l'uso di divinilsulfone (DVS) attraverso la reazione di addizione di Michael. I doppi legami non reagiti sono infine bloccati con la glieina. Le nanoparticelle coniugate con la neuregulina sono poi lavate con PBS all 'interno di colonne magnetiche . La concentrazione di neuregulina coniugata alle nanoparticelle è stata determinata tramite kit ELISA (PeproTech Asia, Israele). Conjugation with neuregulin was achieved through the use of divinylsulfone (DVS) via the Michael addition reaction. The unreacted double bonds are eventually blocked with the glyein. The neuregulin-conjugated nanoparticles are then washed with PBS inside magnetic columns. The concentration of neuregulin conjugated to the nanoparticles was determined by ELISA kit (PeproTech Asia, Israel).

Esempio 2 Example 2

Efficacia e stabilità della MRGl-l-βΙ coniugata a nanoparticelle di ossido di Ferro, a confronto con la proteina ricombinante non coniugata Efficacy and stability of MRGl-l-βΙ conjugated to iron oxide nanoparticles, in comparison with the unconjugated recombinant protein

A tal fine si è effettuata la stimolazione della linea cellulare ST14A, esprimente in modo stabile un'isoforma di ErbB4, recettore della NRG1, con la NRGl-Ι-βΙ, nella forma coniugata a nanoparticelle di Fe e nella forma nativa, fresca e "invecchiata". To this end, the ST14A cell line was stimulated, stably expressing an isoform of ErbB4, NRG1 receptor, with NRGl-Ι-βΙ, in the form conjugated to Fe nanoparticles and in the native, fresh and "form. aged ".

Materiali e Metodi Materials and methods

Saggio di migrazione tridimensionale Three-dimensional migration assay

Il saggio di migrazione denominato -Transwell- è stato utilizzato per valutare i movimenti tridimensionali delle cellule. 100.000 cellule ST14A sono state risospese in 200 μΐ di mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM), contenente il 2% di Siero bovino fetale (FBS) e piastrate nella camera superiore di un transwell, contenente una membrana porosa trasparente di poliet ilentereftalato (dimensione del poro: 8.0 μπι; 1X10<5>pori/cm<2>). The migration assay named -Transwell- was used to evaluate the three-dimensional movements of the cells. 100,000 ST14A cells were resuspended in 200 μΐ of Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), containing 2% Fetal Bovine Serum (FBS) and plated in the upper chamber of a transwell, containing a transparent porous membrane of polyethylene terephthalate (size pore: 8.0 μπι; 1X10 <5> pores / cm <2>).

La camera inferiore del transwell è stata riempita di terreno DMEM contenente 2% FBS con o senza 15 ng/ml di NRGl-Ι-βΙ ricombinante nella forma nativa o coniugata a nanoparticelle di ossido di ferro dell'esempio 1. Dopo un tempo di incubazione di 18 ore, le cellule migrate nella parte inferiore della membrana sono state fissate con 2% glutaraldeide in PBS per 15 minuti, lavate per cinque volte in acqua bi-distillata e colorate con 0.1% cristal violetto e 20% metanolo per 20 minuti. Per ogni transwell sono state acquisite ed analizzate 4 immagini attraverso il programma Image J. Per ogni immagine è stato valutato il numero di cellule migrate, poi espresso come percentuale di numero totale di cellule migrate. Per ogni condizione sperimentale è stato eseguito un triplicato tecnico e ogni esperimento è stato ripetuto tre volte per ottenere un triplicato biologico. The lower chamber of the transwell was filled with DMEM medium containing 2% FBS with or without 15 ng / ml of recombinant NRGl-Ι-βΙ in the native form or conjugated to iron oxide nanoparticles of Example 1. After an incubation time after 18 hours, the cells migrated to the lower part of the membrane were fixed with 2% glutaraldehyde in PBS for 15 minutes, washed five times in bi-distilled water and stained with 0.1% crystal violet and 20% methanol for 20 minutes. For each transwell, 4 images were acquired and analyzed through the Image J program. For each image the number of migrated cells was evaluated, then expressed as a percentage of the total number of migrated cells. A technical triplicate was performed for each experimental condition and each experiment was repeated three times to obtain a biological triplicate.

Protocollo di invecchiamento della NRGl-1-βΙ ricombinante nella forma nativa e coniugata a nanoparticelle di ossido di ferro Aging protocol of recombinant NRGl-1-βΙ in the native form and conjugated to iron oxide nanoparticles

Il coniugato dell'esempio 1 è stato pre-incubato in DMEM 2% FBS a 37°C per un tempo di 4 e 6 settimane. DMEM 2%FBS è stato pre-incubato per gli stessi tempi sperimentali e utilizzato come controllo. The conjugate of example 1 was pre-incubated in DMEM 2% FBS at 37 ° C for a time of 4 and 6 weeks. DMEM 2% FBS was pre-incubated for the same experimental times and used as a control.

Risultati Results

L'espressione stabile del recettore tirosin-chinasi ErbB4 conferisce un aumento della migrazione nella linea di cellule progenitrici neuronali ST14A in risposta alla stimolazione con NRGl-Ι-βΙ. Per questo esperimento è stato scelto un clone stabile che esprime un' isoforma del recettore ErbB4 . Stable expression of the ErbB4 receptor tyrosine kinase confers increased migration in the ST14A neuronal progenitor cell line in response to NRG1-Ι-βΙ stimulation. A stable clone expressing an isoform of the ErbB4 receptor was chosen for this experiment.

L'intento di questo esperimento è stato quello di testare la stabilità della NRGl-Ι-βΙ coniugata a nanoparticelle di ossido di ferro, confrontando il suo effetto con quello della proteina ricombinante nella forma nativa (fresca e invecchiata per un tempo di 4 e 6 settimane) sulla migrazione delle cellule ST14A. The intent of this experiment was to test the stability of NRGl-Ι-βΙ conjugated to iron oxide nanoparticles, comparing its effect with that of the recombinant protein in the native form (fresh and aged for a time of 4 and 6 weeks) on the migration of ST14A cells.

Come mostrato in figura 1, il fattore NRGl-1-βΙ ricombinante, nella forma nativa, fresco ha un maggiore effetto nell' indurre la migrazione tridimensionale tuttavia, durante il processo di invecchiamento in vitro (4 e 6 settimane) esso perde la sua bioattività, mentre l'NRGl-Ι-βΙ coniugata (np-Nrgl) mantiene la propria bioattività ed azione nel promuovere la migrazione cellulare rispetto alle condizioni di controllo (cellule migrate in terreno 2% FRS). As shown in figure 1, the recombinant NRG1-1-βΙ factor, in the native, fresh form, has a greater effect in inducing three-dimensional migration however, during the in vitro aging process (4 and 6 weeks) it loses its bioactivity. , while the conjugated NRGl-Ι-βΙ (np-Nrgl) maintains its bioactivity and action in promoting cell migration with respect to the control conditions (cells migrated in 2% FRS medium).

Somministrata a colture di precursori neuronali esprimenti il recettore specifico per la neuregulina 1 beta 1, il coniugato dell'invenzione ha dimostrato un'efficacia biologica prolungata, rispetto alla proteina ricombinante non coniugata, nell' indurre la migrazione tridimensionale. La NRG1 coniugata ha dimostrato inoltre di indurre la crescita orientata dei neuriti in espianti di gangli della radice dorsale prelevati da ratto neonato e adulto. Administered to cultures of neuronal precursors expressing the specific receptor for neuregulin 1 beta 1, the conjugate of the invention has shown a prolonged biological efficacy, compared to the unconjugated recombinant protein, in inducing three-dimensional migration. Conjugated NRG1 has also been shown to induce oriented growth of neurites in dorsal root ganglia explants from neonatal and adult rats.

Esempio 3 Example 3

Interazione e localizzazione subcellulare della NRG1-l-βΐ coniugata a nanoparticelle di Fe. Interaction and subcellular localization of NRG1-l-βΐ conjugated to Fe nanoparticles.

L'indagine di microscopia elettronica è stata condotta su cellule ST14A, clone stabile esprimente un'isoforma di ErbB4, recettore della NRG1, stimolato con NRGl-1-βΙ coniugata a nanoparticelle di ossido di ferro e con nanoparticelle di ossido di ferro da sole. The electron microscopy investigation was carried out on ST14A cells, stable clone expressing an isoform of ErbB4, NRG1 receptor, stimulated with NRGl-1-βΙ conjugated to iron oxide nanoparticles and with iron oxide nanoparticles alone.

Materiali e Metodi Materials and methods

Le cellule ST14A esprimenti stabilmente il recettore ErbB4 sono state stimolate con 500 ng/ml del coniugato dell'esempio 1 e con nanoparticelle di ossido di ferro da sole, per un tempo di 15 minuti e 24 ore. In seguito a stimolazione le cellule sono state raccolte e centrifugate per ottenere un pellet. The ST14A cells stably expressing the ErbB4 receptor were stimulated with 500 ng / ml of the conjugate of Example 1 and with iron oxide nanoparticles alone, for a time of 15 minutes and 24 hours. Following stimulation, the cells were collected and centrifuged to obtain a pellet.

Il pellet cellulare è stato fissato in paraformaldeide 1% (Merck, Darmstadt,Germany), glutaraldeide l,25%(Fluka, St Louis, MO, USA) e 0,5% saccarosio in tampone Sorensen per due ore. The cell pellet was fixed in 1% paraformaldehyde (Merck, Darmstadt, Germany), l, 25% glutaraldehyde (Fluka, St Louis, MO, USA) and 0.5% sucrose in Sorensen buffer for two hours.

In seguito si è proceduto ad un lavaggio in tampone fosfato 0,1M e saccarosio all'1,5% ed alla post-fissazione in tetrossido di osmio (OsCU al 2% in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,3) per circa 60-90 minuti a 4°C. Il materiale è stato quindi disidratato ed incluso in una miscela di resine secondo il metodo descritto da Glauerts (Pease, 1964); Araldite Harter al 50% e Araldite Cy212 al 50%. Si è infine proceduto all'allestimento delle sezioni ultra-fini (70-90 nm) per l'analisi ultrastrutturale. Then a washing was carried out in 0.1M phosphate buffer and 1.5% sucrose and post-fixation in osmium tetroxide (2% OsCU in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.3) to about 60-90 minutes at 4 ° C. The material was then dehydrated and included in a mixture of resins according to the method described by Glauerts (Pease, 1964); 50% Araldite Harter and 50% Araldite Cy212. Finally, the ultra-fine sections (70-90 nm) were set up for the ultrastructural analysis.

Le sezioni ultra-fini sono state raccolte su retini in rame, contrastate con acetato di uranile e citrato di piombo (Pease, 1964) ed infine esaminate e fotografate a 80 KV mediante un microscopio elettronico a trasmissione JEM-1010 (JEOL,Tokyo, Japan). The ultra-fine sections were collected on copper screens, contrasted with uranyl acetate and lead citrate (Pease, 1964) and finally examined and photographed at 80 KV by means of a JEM-1010 transmission electron microscope (JEOL, Tokyo, Japan ).

Risultati Results

La linea neuronaie di cellule progenitrici ST14A, esprimenti stabilmente un'isoforma del recettore ErbB4 è stata stimolata con 500 ng/ml di NRGl-Ι-βΙ coniugata a nanoparticelle di ferro o con nanoparticelle da sole, per i tempi sperimentali: 15 minuti e 24 ore. Dopo tale tempo di somministrazione è stato possibile osservare che le nanoparticelle da sole, dopo 15 minuti dalla somministrazione si trovano ancora all'esterno della cellula (fig. 2C e 2D), mentre dopo 24 ore di stimolazione non è possibile riconoscere nessuna nanoparticella (Fig. 2E e 2F). The neuronal lineage of ST14A progenitor cells, stably expressing an isoform of the ErbB4 receptor, was stimulated with 500 ng / ml of NRGl-Ι-βΙ conjugated to iron nanoparticles or with nanoparticles alone, for the experimental times: 15 minutes and 24 hours. After this time of administration it was possible to observe that the nanoparticles alone, 15 minutes after administration, are still outside the cell (fig. 2C and 2D), while after 24 hours of stimulation it is not possible to recognize any nanoparticles (Fig. . 2E and 2F).

Cellule ST14A stimolate con 500 qg/ml di NRGl-1-βΙ coniugata a nanoparticelle di ossido di ferro, mostrano 1'incorporazione delle nanoparticelle e la loro localizzazione a livello delle vescicole citoplasmatiche (fig. 2G, 2H, 21 e 2L) sede di demolizione e trasformazione del Fe. ST14A cells stimulated with 500 qg / ml of NRGl-1-βΙ conjugated to iron oxide nanoparticles, show the incorporation of the nanoparticles and their localization at the level of the cytoplasmic vesicles (fig. 2G, 2H, 21 and 2L) site of demolition and transformation of Fe.

Questi esperimenti hanno consentito di visualizzare chiaramente la rapida internalizzazione del coniugato dell'invenzione attraverso fenomeni di endocitosi e successivamente una raccolta delle nanoparticelle nei compartimenti lisosomali/endosomali delle cellule, sede di demolizione e trasformazione del Fe. These experiments made it possible to clearly visualize the rapid internalization of the conjugate of the invention through endocytosis phenomena and subsequently a collection of the nanoparticles in the lysosomal / endosomal compartments of the cells, site of demolition and transformation of Fe.

Claims (1)

RIVENDICAZIONI 1.- Coniugato di una isoforma di neuregulina 1 ricombinante con nanoparticelle di ossido di ferro. 2.- Coniugato secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che dette nanoparticelle sono rivestite con destrano. 3.- Coniugato secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che detta isoforma di neuregulina 1 è una isoforma beta della neuregulina 1. 4.- Coniugato secondo la rivendicazione 3 caratterizzato dal fatto che detta isoforma beta di neuregulina 1 è un isoforma beta 1 della neuregulina 1. 5.- Coniugato secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che detto ossido di ferro è magnetite. 6.- Coniugato secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che dette nanoparticelle hanno un diametro compreso tra 8 e 15 nm. 7.- Composizione farmaceutica comprendente un coniugato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 e almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile. 8.- Coniugato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 o composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 7 per l'uso nella rigenerazione del nervo periferico. 9.- Coniugato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 o composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 7 per l'uso nel trattamento di un disturbo selezionato nel gruppo costituito da danni ai nervi periferici dovuti a traumi, incidenti, operazioni chirurgiche e neuropatie periferiche.CLAIMS 1.- Conjugate of a recombinant neuregulin 1 isoform with iron oxide nanoparticles. 2.- Conjugate according to claim 1, characterized in that said nanoparticles are coated with dextran. 3.- Conjugate according to claim 1 characterized in that said isoform of neuregulin 1 is a beta isoform of neuregulin 1. 4.- Conjugate according to claim 3 characterized in that said beta isoform of neuregulin 1 is a beta 1 isoform of neuregulin 1. 5.- Conjugate according to claim 1 characterized in that said iron oxide is magnetite. 6.- Conjugate according to claim 1 characterized in that said nanoparticles have a diameter comprised between 8 and 15 nm. 7.- Pharmaceutical composition comprising a conjugate according to any one of claims 1 to 6 and at least one pharmaceutically acceptable excipient. 8. Conjugate according to any one of claims 1 to 6 or pharmaceutical composition according to claim 7 for use in peripheral nerve regeneration. 9. A conjugate according to any one of claims 1 to 6 or a pharmaceutical composition according to claim 7 for use in the treatment of a disorder selected from the group consisting of damage to peripheral nerves due to trauma, accidents, surgical operations and peripheral neuropathies.
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