ITUB20151828A1

ITUB20151828A1 - METHOD FOR PLASMON OPENING OF PORSES IN A CELL MEMBRANE.

Info

Publication number: ITUB20151828A1
Application number: ITUB2015A001828A
Authority: IT
Inventors: Angelis Francesco De; Luca Berdondini; Gabriele Messina; Michele Dipalo
Original assignee: Fondazione St Italiano Tecnologia
Priority date: 2015-07-02
Filing date: 2015-07-02
Publication date: 2017-01-02

Description

TITOLO: “Metodo per l'apertura plasmonica di pori in una membrana cellulare" TITLE: "Method for plasmon opening of pores in a cell membrane"

DESCRIZIONE DESCRIPTION

Settore tecnico Technical field

La presente invenzione si riferisce a un metodo per l'apertura di pori in una membrana cellulare. The present invention relates to a method for opening pores in a cell membrane.

Sfondo tecnologico Technological background

Sono noti nel settore vari metodi per l'apertura di pori in una membrana cellulare. Various methods for opening pores in a cell membrane are known in the art.

Questa tecnica, denominata anche "porazione" {traduzione del termine inglese "poration"), è tipicamente utilizzata per ottenere un accesso all'interno della cellula attraverso la membrana cellulare. Tale accesso può essere, ad esempio, finalizzato a: This technique, also called "poration" (translation of the English term "poration"), is typically used to gain access to the interior of the cell through the cell membrane. This access can be, for example, aimed at:

- fornire sostanze di diverso tipo all'interno della cellula, a seguito dell'apertura dei pori; - supplying substances of different types inside the cell, following the opening of the pores;

misurare una quantità riferita ad una proprietà nell'ambiente intracellulare; e measuring a quantity related to a property in the intracellular environment; And

ottenere una discriminazione delle informazioni intracellulari ed extracellulari. obtain discrimination of intracellular and extracellular information.

Una tipologia di metodo per l'apertura di pori in una membrana cellulare prevede l'uso di nanostrutture. Un esempio di tale tipologia è dato dalla pubblicazione "Interfacing Silicon Nanowires with Mammalian Cells" di Woong Kim, et al., 2007, Il maggior inconveniente dovuto a questo metodo consiste nel fatto che esso non consente un controllo di tipo "valvolare" sul processo di apertura di pori e nel fatto che nella cellula viene realizzata l'apertura oppure essa non viene realizzata. One type of method for opening pores in a cell membrane involves the use of nanostructures. An example of this type is given by the publication "Interfacing Silicon Nanowires with Mammalian Cells" by Woong Kim, et al., 2007, The major drawback due to this method consists in the fact that it does not allow a "valve" type control on the process. opening of pores and in the fact that the opening is made in the cell or it is not made.

Ulteriori tipologie sono basate su metodi chimici. Tra le più diffuse vi sono quelle che prevedono una strategia di tipo “cavallo di troia" {in lingua inglese nota come “ trojan borse"), ovvero in cui la molecola di interesse viene legata un altra molecola o bio-agente che di per se è capace a superare la membrana cellulare. Un tipico esempio è rappresentato dai virus. L'inconveniente principale di questo tipo di approccio è che per ogni tipo di molecola per ogni diversa linea cellulare, bisogna trovare un agente che faccia da “cavallo" e quindi studiare un protocollo chimico specifico che permetta di legare i due agenti. Inoltre questa operazione va eseguita senza alterare le capacità del “cavallo" del virus di oltrepassare la membrana. Inoltre ancora nel caso specifico dei virus, sorgono problemi di sicurezza per il loro impiego. Inoltre questo metodo è tipicamente messo in atto mediante il rilascio di sostanza nel liquido della cellula e dunque non vi è controllo o selettività sulla cellula in cui avviene l'apertura dei pori. Further types are based on chemical methods. Among the most common are those that provide a "trojan horse" type strategy (in English known as "trojan bags"), ie in which the molecule of interest is linked to another molecule or bio-agent which in itself it is able to overcome the cell membrane. A typical example is represented by viruses. The main drawback of this type of approach is that for each type of molecule for each different cell line, it is necessary to find an agent that acts as a "horse" and therefore to study a specific chemical protocol that allows to bind the two agents. it must be performed without altering the ability of the virus "horse" to cross the membrane. Furthermore, even in the specific case of viruses, security problems arise for their use. Furthermore, this method is typically implemented by releasing the substance into the liquid of the cell and therefore there is no control or selectivity on the cell in which the pores are opened.

Ancora un'altra tipologia di metodo per l'apertura di pori in una membrana cellulare utilizza energia elettrica; tale tipologia è conosciuta nel settore con il termine “elettroporazione" (traduzione dell'espressione della lingua inglese "electroporation") . Un esempio di tale tipologia è dato dal brevetto statunitense No. US 4,822,470, avente il titolo “Method and apparatus for celi poration and celi fusion using radiofrequency electrical pulses". Nel suddetto brevetto, l'apertura di pori viene ottenuta grazie ad una corrente elettrica che provoca una rottura nella membrana. In questo caso, vi sono due principali inconvenienti. Un primo inconveniente è dato dal fatto che 1'elettroporazione può essere causa di danneggiamento cellulare che è difficile da stimare, sopratutto in cellule che sono sensibili alla corrente elettrica quali ad esempio neuroni e cardiomiociti. Un secondo inconveniente è dato dal fatto che - per avere un controllo e una selettività - su una singola cellula {all'interno di un gruppo di cellule) è necessario tipicamente realizzare una circuiteria complessa e costosa. Yet another type of method for opening pores in a cell membrane uses electrical energy; this type is known in the sector by the term "electroporation" (translation of the English expression "electroporation"). An example of this type is given by the US patent No. US 4,822,470, having the title "Method and apparatus for celi poration and celi fusion using radiofrequency electrical pulses ". In the aforementioned patent, the opening of pores is obtained thanks to an electric current which causes a break in the membrane. In this case, there are two main drawbacks. A first drawback is given by the fact that electroporation can cause cell damage which is difficult to estimate, especially in cells which are sensitive to electric current such as neurons and cardiomyocytes. A second drawback is given by the fact that - to have a control and a selectivity - on a single cell (within a group of cells) it is typically necessary to realize a complex and expensive circuitry.

Una ulteriore tipologia di metodo per l'apertura di pori in una membrana cellulare prevede il taglio della membrana cellulare mediante laser oppure mediante laser accoppiato con oggetti metallici, quali nano-particelle oppure nano-aste (anche definite in lingua inglese come "nano-rod"). Un esempio di una siffatta tecnologia può essere reperito nella pubblicazione "Mechanism of femtosecond laser nano-surgery of cells and tissues", di Vogel et al., 2005, I processi ivi descritti non sono basati su effetti plasmonici, ma sulla formazione di una bolla di cavitazione che provoca - in modo indesiderabile -uno shock meccanico alla membrana. Alcuni degli svantaggi connessi a questo metodo sono dovuti al fatto che le potenze laser coinvolte sono molto elevate ed inoltre il laser deve essere focalizzato in modo molto preciso sulla membrana cellulare. Quindi, l'apertura di pori in membrane di molte cellule risulta molto difficile da attuare in breve tempo, a causa del fatto che il laser deve essere focalizzato nuovamente di volta in volta per ciascuna cellula. A further type of method for opening pores in a cell membrane involves cutting the cell membrane by laser or by laser coupled with metal objects, such as nano-particles or nano-rods (also defined in English as "nano-rod "). An example of such a technology can be found in the publication "Mechanism of femtosecond laser nano-surgery of cells and tissues", by Vogel et al., 2005, The processes described therein are not based on plasmonic effects, but on the formation of a bubble of cavitation which causes - in an undesirable way - a mechanical shock to the membrane. Some of the disadvantages associated with this method are due to the fact that the laser powers involved are very high and, moreover, the laser must be focused very precisely on the cell membrane. Therefore, the opening of pores in membranes of many cells is very difficult to carry out in a short time, due to the fact that the laser has to be focused again from time to time for each cell.

La pubblicazione brevettuale No. US 7,834,331 (Ben-Yakar et al.) riguarda una tecnica di nano-ablazione mediante laser a femtosecondi, denominata in lingua inglese anche come "Plasmonic Laser Nano-ablation " e abbreviata dall'acronimo PLN. Questa tecnica trae vantaggio dallo scattering plasmonico amplificato da superfici (in lingua inglese “surface-enhanced plasmonic scattering ") di impulsi laser ultracorti mediante nano particelle per vaporizzare strutture sub-cellulari del volume dell'attolitro. Nella suddetta nano-ablazione mediante laser a femtosecondi o PLN, ciascuna particella agisce come una “nano-lente" focalizzando la luce laser [near-field] alla particella e solo alle strutture cosiddette “foto-disgregatrici" {in lingua inglese "photo-disrupting ") che sono distanti alcuni nanometri. Questo elimina la necessità di un fascio strettamente focalizzato, ottenendo comunque una risoluzione di ablazione della scala dei nanometri. Inoltre, lo scattering amplificato intorno alle particelle riduce la quantità della fluenza richiesta del laser . Nel suddetto documento viene previsto un metodo comprendente il posizionare una nano-particella in prossimità di una superficie di un materiale; irradiare la nano-particella con un laser regolato alla frequenza plasmonica della nanoparticella; consentire una effetto "near-field " dalla nanoparticella irradiata per foto-danneggiare il materiale. Patent publication No. US 7,834,331 (Ben-Yakar et al.) Relates to a femtosecond laser nano-ablation technique, also referred to in English as "Plasmonic Laser Nano-ablation" and abbreviated from the acronym PLN. This technique takes advantage of surface-enhanced plasmonic scattering of ultrashort laser pulses using nano particles to vaporize sub-cellular structures of the actoliter volume. or PLN, each particle acts as a “nano-lens” focusing the laser light [near-field] to the particle and only to the so-called “photo-disrupting” structures which are a few nanometers away. This eliminates the need for a tightly focused beam, while still achieving an ablation resolution of the nanometer scale. Furthermore, amplified scattering around the particles reduces the amount of laser fluence required. --particle near a surface of a material; irradiate the nano-particle with a laser adjusted to the plasmon frequency of the nanoparticle; allow a "near-field" effect from the irradiated nanoparticle to photo-damage the material.

La pubblicazione di Malerba et al., "Novel 3D plasmonic nano-electrodes for cellular investigations and neural interfaces", SPIE 9166, Biosensing and Nanomedicine VII, 91660N, August 27, 2014, riguarda una piattaforma multifunzionale elettronica-plasmonica. Tale piattaforma è in grado di effettuare contemporaneamente una analisi chimica e una rilevazione elettronica da una interfaccia cellulare. Il sistema si basa sull'utilizzo di nanotubi metallici cavi, integrati in matrici multi-elettrodiche customizzate e consente lo studio di segnalazione neuronaie su diverse lunghezze che spaziano da quelle molecolari a quelle di cellule singole e interconnesse. Nella suddetta pubblicazione viene mostrato che le stesse strutture sono amplificatrici efficienti del campo elettrico, nonostante vi sia uno strato metallico continuo in corrispondenza della base, che le collega ai componenti elettrici dei circuiti integrati. La metodologia proposta, grazie alla sua semplicità ed elevata capacità di trasmissione (throughput) ha il potenziale di fornire ulteriori miglioramenti sia nel campo della plasmonica, sia nell'integrazione su vaste aree di dispositivi elettronici attivi di tipo commerciale. The publication by Malerba et al., "Novel 3D plasmonic nano-electrodes for cellular investigations and neural interfaces", SPIE 9166, Biosensing and Nanomedicine VII, 91660N, August 27, 2014, concerns an electronic-plasmon multifunctional platform. This platform is capable of simultaneously carrying out a chemical analysis and an electronic detection from a cellular interface. The system is based on the use of hollow metal nanotubes, integrated in customized multi-electrode arrays and allows the study of neuronal signaling on different lengths ranging from molecular ones to those of single and interconnected cells. In the above publication it is shown that the same structures are efficient amplifiers of the electric field, although there is a continuous metallic layer at the base, which connects them to the electrical components of the integrated circuits. The proposed methodology, thanks to its simplicity and high transmission capacity (throughput), has the potential to provide further improvements both in the field of plasmonics and in the integration of commercial active electronic devices over large areas.

La pubblicazione brevettuale WO 2011/124899 (Gunn-Moore Frank et al.) si riferisce ad un sistema ed un metodo per l'apertura di pori in membrane di cellule biologiche e tessuti in una area specifica, e l'apertura di pori in larga scala in una ampia area con microbolle eccitate da un cosiddetto "laser-induced breakdown" di singole nanoparticelle intrappolate otticamente. Patent publication WO 2011/124899 (Gunn-Moore Frank et al.) Refers to a system and method for opening pores in membranes of biological cells and tissues in a specific area, and opening pores in a large scale in a large area with microbubbles excited by a so-called "laser-induced breakdown" of single optically trapped nanoparticles.

Per completezza sono qui di seguito citate altre pubblicazioni note nel settore: For the sake of completeness, other publications known in the sector are cited below:

Ting-Hsiang Wu et al., Phototermal Nanoblade for barge Cargo Delivery into Maimnalian Cells, Analytical Chemistry 2011 83 (4), 1321-1327; Ting-Hsiang Wu et al., Phototermal Nanoblade for barge Cargo Delivery into Maimnalian Cells, Analytical Chemistry 2011 83 (4), 1321-1327;

Tirlapur et al., Targeted trasnfection by femtosecond laser, Nature, Voi. 418, 18 luglio 2002; Tirlapur et al., Targeted trasnfection by femtosecond laser, Nature, Vol. 418, July 18, 2002;

Xie, et al., Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation, Nature Nanotechnology, 2012, 7, 185-190; e Xie, et al., Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation, Nature Nanotechnology, 2012, 7, 185-190; And

Ziliang Carter al., Iridium oxide nanotube electrodes for sensitive and prolonged intracellular measurement of action potentials, Nature Communications 5, 3206. Ziliang Carter al., Iridium oxide nanotube electrodes for sensitive and prolonged intracellular measurement of action potentials, Nature Communications 5, 3206.

Sintesi dell'invenzione Summary of the invention

Uno scopo dell'invenzione è quello di consentire l'accesso all'interno delle cellule viventi evitando - o quantomeno riducendo significativamente - le perturbazioni apportate al loro stato. An object of the invention is to allow access to the interior of living cells avoiding - or at least significantly reducing - the perturbations brought to their state.

Secondo la presente invenzione, questo ed altri scopi vengono raggiunti mediante un metodo avente le caratteristiche citate nell'annessa rivendicazione indipendente 1. According to the present invention, this and other purposes are achieved by means of a method having the characteristics cited in the attached independent claim 1.

E' da intendersi che le annesse rivendicazioni costituiscono parte integrante degli insegnamenti tecnici qui forniti nella descrizione dettagliata che segue in merito alla presente invenzione. In particolare, nelle annesse rivendicazioni dipendenti sono definite alcune forme di realizzazione preferite che includono caratteristiche tecniche opzionali. It is to be understood that the appended claims form an integral part of the technical teachings provided herein in the detailed description which follows regarding the present invention. In particular, some preferred embodiments which include optional technical characteristics are defined in the appended dependent claims.

Ulteriori caratteristiche e vantaggi della presente invenzione appariranno chiari dalla descrizione dettagliata che segue, data a puro titolo esemplificativo e non limitativo, con riferimento in particolare ai disegni allegati, qui di seguito riepilogati. Further characteristics and advantages of the present invention will become clear from the detailed description that follows, given purely by way of non-limiting example, with particular reference to the attached drawings, summarized below.

Breve descrizione dei disegni Brief description of the drawings

La figura 1 illustra un nano-elemento plasmonico, in particolare una nano-antenna atta ad essere impiegata in una forma di realizzazione esemplificativa del metodo secondo la presente invenzione. Figure 1 illustrates a plasmonic nano-element, in particular a nano-antenna adapted to be used in an exemplary embodiment of the method according to the present invention.

La figura 2 è una rappresentazione schematica della distribuzione spaziale della temperatura assunta dalla nano antenna dopo 10 ps trascorso dall'eccitazione dovuta all'impulso laser. Figure 2 is a schematic representation of the spatial distribution of the temperature assumed by the nano antenna after 10 ps elapsed from the excitation due to the laser pulse.

La figura 3 rappresenta in modo schematico un passo operativo di un metodo eseguito secondo una forma di realizzazione esemplificativa della presente invenzione. Figure 3 schematically represents an operating step of a method performed according to an exemplary embodiment of the present invention.

Le figure da 4 a 8 rappresentano una sequenza di passi operativi di un metodo realizzato in accordo con una forma di realizzazione esemplificativa della presente invenzione ed in cui è altresì prevista l'immissione o il prelevamento di sostanze attraverso la membrana cellulare in cui è stata eseguita l'apertura di un poro Figures 4 to 8 represent a sequence of operating steps of a method carried out in accordance with an exemplary embodiment of the present invention and in which the introduction or withdrawal of substances through the cell membrane in which it was performed is also provided. the opening of a pore

Descrizione dettagliata dell'invenzione Detailed description of the invention

Con riferimento ai disegni allegati, è illustrato un metodo per l'apertura dei pori in una membrana cellulare. With reference to the accompanying drawings, a method for opening pores in a cell membrane is illustrated.

Come meglio visibile nella figura 3, il suddetto metodo comprende i seguenti passi operativi: As better visible in Figure 3, the above method includes the following operational steps:

a) disporre almeno un nano-elemento plasmonico metallico (10) a contatto - o in stretta prossimità - con una membrana cellulare (M) immersa in acqua o in una soluzione fisiologica e sulla cui superficie è destinato ad essere aperto almeno un poro (P); a) place at least one metallic plasmonic nano-element (10) in contact - or in close proximity - with a cell membrane (M) immersed in water or in a physiological solution and on whose surface at least one pore is intended to be opened (P );

b) focalizzare per un periodo di tempo (T) compreso fra 1 fs e 20 ps un fascio di luce (B), quale ad esempio un fascio laser, su detto nano-elemento plasmonico metallico (10), detto fascio di luce (B) avendo una frequenza regolata alla frequenza plasmonica di risonanza di detto nano-elemento plasmonico metallico (10), affinché detto fascio di luce (B) causi un'eccitazione plasmonica in elettroni appartenenti a detto nano-elemento plasmonico metallico (10) e ne promuova l'espulsione verso l'ambiente circostante aprendo almeno un poro {P) su detta membrana cellulare (M), in cui contemporaneamente b) focus for a period of time (T) between 1 fs and 20 ps a light beam (B), such as a laser beam, on said metal plasmonic nano-element (10), said light beam (B ) having a frequency adjusted to the resonant plasmon frequency of said metallic plasmonic nano-element (10), so that said beam of light (B) causes a plasmon excitation in electrons belonging to said metallic plasmonic nano-element (10) and promotes it the expulsion towards the surrounding environment by opening at least one pore {P) on said cell membrane (M), in which simultaneously

da una parte, detto fascio di luce (B) influenza mediante accelerazione ponderomotiva detti elettroni espulsi mediante detta eccitazione plamsonica e crea un'onda di pressione in detta acqua o in detta soluzione salina, e on the one hand, said beam of light (B) influences said electrons expelled by said plamsonic excitation by means of weight-motive acceleration and creates a pressure wave in said water or in said saline solution, and

dall'altra parte, detto fascio di luce (B) influenza direttamente detti elettroni espulsi mediante inverse bremsstrahlung e crea calore localizzato su detto nanoelemento plasmonico metallico (10). on the other hand, said beam of light (B) directly affects said electrons expelled by inverse bremsstrahlung and creates localized heat on said metallic plasmonic nano-element (10).

Si noti che sia 1' onda di pressione sia la generazione di calore possono contribuire all'apertura di un poro P su detta membrana cellulare M. It should be noted that both the pressure wave and the generation of heat can contribute to the opening of a pore P on said cell membrane M.

In particolare, quando l'energia dell'impulso laser necessaria a "porare" (vale a dire, ad aprire pori) la membrana è fornita al sistema plasmonico per un tempo sufficientemente breve, come ad esempio 0.1 ps, l'accelerazione degli elettroni in acqua sarà prevalentemente ponderomotiva e quindi l'effetto termico sarà di minore rilievo, compatibilmente con il mantenimento di condizioni fisiologiche cellulari normali. Diversamente, quando il tempo T è di durata maggiore, come ad esempio 1 ps, l'apertura del poro P sarà prevalentemente per effetto di interazione diretta tra laser e elettroni liberi (tecnicamente detta interazione di "inverse bremsstrahlung ") che comporta generazione di calore. In particular, when the laser pulse energy necessary to "porate" (that is, to open pores) the membrane is supplied to the plasmonic system for a sufficiently short time, such as 0.1 ps, the acceleration of the electrons in water will be predominantly ponderomotive and therefore the thermal effect will be of lesser importance, compatibly with the maintenance of normal cell physiological conditions. On the other hand, when the time T is of greater duration, such as 1 ps, the opening of the pore P will be mainly due to the direct interaction between laser and free electrons (technically called "inverse bremsstrahlung" interaction) which involves heat generation .

Nel range di un periodo di tempo T compreso fra 0,1 ps e 1 ps si ha una fase di transizione nella quale i due fenomeni, quello ponderomotivo e quello di inverse bremsstrahlung, coesistono. In the range of a time period T between 0.1 ps and 1 ps there is a transition phase in which the two phenomena, the ponderomotive one and the inverse bremsstrahlung, coexist.

In altri termini, per opportune durate del periodo di tempo T, avviene sostanzialmente una apertura di pori “fredda" (anche definibile in lingua inglese come plasmonic "cold" poration). Viceversa per tempi T di durata maggiore, si avrà una porazione calda" o termica (anche definibile in lingua inglese come "thermal plasmonic poration "). In other words, for suitable durations of the time period T, a "cold" pores opening substantially takes place (also definable in English as plasmonic "cold" poration). Vice versa for times T of longer duration, a hot portion will occur " or thermal (also defined in English as "thermal plasmonic poration").

In sintesi, secondo un aspetto preferito della presente invenzione, durante l'esecuzione del procedimento si verifica una combinazione degli effetti tecnici apertura di pori “fredda" e di apertura di pori “calda" o termica. La prevalenza dell'effetto di apertura di pori “fredda" o dell'apertura di pori "calda" o termica nella suddetta combinazione è sostanzialmente dipendente dalla durata periodo di tempo T durante il quale avviene le fecalizzazione del fascio laser B, la cui energia deve comunque essere sufficiente a causare l'apertura del poro P Nel seguito della presente descrizione saranno chiariti più dettagliatamente gli aspetti relativi agli effetti di apertura di pori "calda" o termica e di apertura di pori "fredda" In summary, according to a preferred aspect of the present invention, during the execution of the process a combination of the technical effects of "cold" pore opening and "hot" or thermal pore opening occurs. The prevalence of the "cold" or "hot" or thermal pore opening effect in the above combination is substantially dependent on the duration of the time period T during which the focus of the laser beam B takes place, the energy of which must in any case be sufficient to cause the opening of the pore P In the remainder of the present description, the aspects relating to the effects of "hot" or thermal opening of pores and of "cold" pore opening will be clarified in more detail.

Come sarà ulteriormente chiarito nel seguito della presente descrizione, la membrana cellulare M può appartenere ad una cellula C di un qualsivoglia campione biologico, in cui sia necessario o desiderato eseguire l'apertura di pori sulla sua superficie. As will be further clarified in the following of the present description, the cell membrane M can belong to a cell C of any biological sample, in which it is necessary or desired to open pores on its surface.

Con riferimento in particolare alla figura 1, è illustrato a titolo di esempio un singolo nano-elemento plasmonico, quale la nano-antenna 10. Tale nano-elemento plasmonico può essere realizzato di metallo leghe metalliche. In particolare il nano-elemento plasmonico può essere realizzato con un metallo nobile (ad esempio, oro) o sue leghe. With reference in particular to Figure 1, a single plasmonic nano-element is illustrated by way of example, such as the nano-antenna 10. This plasmonic nano-element can be made of metal metal alloys. In particular, the plasmonic nano-element can be made with a noble metal (for example, gold) or its alloys.

Vantaggiosamente ma non necessariamente, come sopra accennato, il nano-elemento plasmonico può essere una nanoantenna 10, di tipo per sé noto. Advantageously but not necessarily, as mentioned above, the plasmonic nano-element can be a nano-antenna 10, of a per se known type.

Nella forma di realizzazione illustrata, la nanoantenna 10 è atta ad essere immersa in acqua e ad essere eccitata da un singolo impulso di un fascio di luce laser. In the illustrated embodiment, the nanoantenna 10 is adapted to be immersed in water and to be excited by a single pulse of a laser light beam.

Preferibilmente, la suddetta nano-antenna 10 ha la forma di un nano-cilindro attraversato da una cavità passante, in particolare in posizione centrale. Preferably, the aforementioned nano-antenna 10 has the shape of a nano-cylinder crossed by a through cavity, in particular in a central position.

Nella forma di realizzazione illustrata, la suddetta nano-antenna 10 è realizzata di un metallo nobile, ad esempio oro. In the illustrated embodiment, the aforementioned nano-antenna 10 is made of a noble metal, for example gold.

Vantaggiosamente ma non necessariamente, come sopra accennato, il fascio di luce atto ad eccitare il nanoelemento plasmonico è un laser. Advantageously but not necessarily, as mentioned above, the light beam adapted to excite the plasmonic nanoelement is a laser.

Sarà esposta qui di seguito una forma di realizzazione esemplificativa in cui il metodo realizza una apertura di pori “calda" o termica. An exemplary embodiment will be set forth below in which the method realizes a "hot" or thermal pore opening.

Nella forma di realizzazione illustrata con particolare riferimento alla figura 1, la nano-antenna 10 è realizzata di oro e l'impulso laser emesso dalla sorgente di luce che è atto ad eccitare tale nano-antenna 10 ha durata di 8 ps, una lunghezza d'onda pari a circa 1064 mm ed una frequenza di ripetizione di 80 Mhz. In the embodiment illustrated with particular reference to Figure 1, the nano-antenna 10 is made of gold and the laser pulse emitted by the light source which is adapted to excite said nano-antenna 10 has a duration of 8 ps, a length d 'wave equal to about 1064 mm and a repetition frequency of 80 Mhz.

L'antenna è eccitata da circa 4*10<Λ>β impulsi consecutivi, con una densità di potenza di picco di circa 2*10<9>W/cm<2>. The antenna is excited by about 4 * 10 <Λ> β consecutive pulses, with a peak power density of about 2 * 10 <9> W / cm <2>.

Pertanto, nonostante la potenza di picco dell'impulso laser sia estremamente elevata, tuttavia la quantità totale di energia trasferita alla nano-antenna 10 nella durata sopra indicata di 8 ps è ridotta (vale a dire, circa 150 pj), in particolare se raffrontata all'ambiente cellulare avente una dimensione dell'ordine di grandezza dei micrometri. Infatti quando tale ridotta quantità di energia è dissipata in forma di calore attraverso la membrana cellulare M, l'aumento atteso della temperatura ambiente è circa dell'ordine di grandezza di IO<-3>Kelvin. Therefore, although the peak power of the laser pulse is extremely high, nevertheless the total amount of energy transferred to the nano-antenna 10 in the above mentioned duration of 8 ps is small (i.e., about 150 pj), particularly when compared to the cellular environment having a size of the order of magnitude of micrometers. In fact, when this reduced quantity of energy is dissipated in the form of heat through the cell membrane M, the expected increase in ambient temperature is about the order of magnitude of 10 <-3> Kelvin.

Esemplificazione di un esperimento di porazione fredda considera invece un impulso laser della durata di 80 fs, una lunghezza d'onda pari a circa 780 nm ed una frequenza di ripetizione di 76 Mhz. An example of a cold portion experiment, on the other hand, considers a laser pulse with a duration of 80 fs, a wavelength of approximately 780 nm and a repetition frequency of 76 Mhz.

L'antenna e' eccitata da circa 1.5 *10<6>impulsi consecutivi, con una densità di potenza di picco di circa 2*10<10>W/cm<2>. In questo caso, l'energia trasferita alla nanoantenna 10 durante la durata temporale di 80 fs e' di circa 15 pJ, un'ordine di grandezza inferiore rispetto a quella richiesta nel caso della porazione “calda" dal momento che durante questi regimi temporali tutta l'energia e' utilizzata per l'estrazione di elettroni dall'antenna e la generazione della bolla di pressione. In aggiunta, l'antenna può essere eccitata con un numero minore di impulsi rispetto a quello sopra indicato, eventualmente riducendone il numero fino anche a un singolo impulso. The antenna is excited by about 1.5 * 10 <6> consecutive pulses, with a peak power density of about 2 * 10 <10> W / cm <2>. In this case, the energy transferred to the nanoantenna 10 during the time duration of 80 fs is about 15 pJ, an order of magnitude lower than that required in the case of the "hot" portion since during these temporal regimes all the energy is used for the extraction of electrons from the antenna and the generation of the pressure bubble. In addition, the antenna can be excited with a smaller number of pulses than the one indicated above, possibly reducing the number up to even to a single pulse.

Come è chiaro ad un tecnico del settore, le dimensioni del nano-elemento plasmonico (in particolare, della nanoantenna 10) dipendono dalla lunghezza d'onda del fascio di luce B utilizzato per ottenere l'apertura dei pori nella membrana cellulare M. A titolo di esempio non limitativo, per ottenere un comportamento di tipo plasmonico con una luce nell'ambito del campo vicino infrarosso (NIR) visibile, l'altezza e il diametro della nano-antenna 10 può essere di circa 0,5-2 pm e 100-300 nm. As is clear to a person skilled in the art, the dimensions of the plasmonic nano-element (in particular, of the nanoantenna 10) depend on the wavelength of the light beam B used to obtain the opening of the pores in the cell membrane M. By way as a non-limiting example, to obtain a plasmonic-like behavior with a light within the visible near infrared (NIR) range, the height and diameter of the nano-antenna 10 can be approximately 0.5-2 pm and 100 -300 nm.

Tuttavia, è importante sottolineare che queste nanoantenne 10 esibiscono assorbimento ed amplificazione della radiazione elettromagnetica su vasta gamma di frequenze. Pertanto la medesima dimensione della nana-antenna sarà idonea ad un campo di lunghezze d'onda relativamente ampio. However, it is important to point out that these 10 nanoantennas exhibit absorption and amplification of electromagnetic radiation over a wide range of frequencies. Therefore the same size of the nana-antenna will be suitable for a relatively wide wavelength range.

Il tempo estremamente ridotto necessario per raggiungere una elevata temperatura dell'antenna è un fattore destramente vantaggioso per applicazioni in cui sulle membrane cellulari M di numerose cellule C deve essere aperta una pluralità di pori in modo selettivo. In effetti, è ampiamente noto dalla letteratura tecnica che le membrane cellulari M si richiudono nuovamente in pochi minuti dopo l'avvenuta realizzazione di un poro P, il che diviene quindi un problema per i metodi che prevedono una apertura di pori P che avvenga lentamente; grazie al breve periodo di riscaldamento, l'apertura di pori ottenuta in modo plasmonico può essere usata per realizzare l'apertura di pori in una pluralità di cellule all'interno della finestra temporale in cui la membrana cellulare si rigenera, chiudendosi. The extremely short time required to reach a high antenna temperature is a dexterously advantageous factor for applications in which a plurality of pores must be selectively opened on the cell membranes M of numerous C cells. In fact, it is widely known from the technical literature that the cell membranes M close again in a few minutes after the realization of a pore P, which therefore becomes a problem for the methods which provide for a slowly opening of pores P; thanks to the short heating period, the plasmonic opening of the pores can be used to create the opening of pores in a plurality of cells within the temporal window in which the cell membrane regenerates and closes.

La figura 2 mostra la distribuzione di temperatura nello spazio della nano-antenna 10 immersa in acqua. Come può essere notato, la temperatura massima di 80°C è raggiunta in corrispondenza della punta 10a della nanoantenna 10, mentre la base della nano-antenna 10 rimane sostanzialmente a temperature prossime alla temperatura iniziale di 37°C. Il che dimostra che il calore rimane confinato in scala nanometrica. Nella forma di realizzazione riferita a quanto illustrato nella figura 2, l'acqua che circonda la nano-antenna rimane ad una temperatura di 37°C nonostante l'eccitazione realizzata dall'impulso di fascio laser. Figure 2 shows the spatial temperature distribution of the nano-antenna 10 immersed in water. As can be noted, the maximum temperature of 80 ° C is reached at the tip 10a of the nano-antenna 10, while the base of the nano-antenna 10 remains substantially at temperatures close to the initial temperature of 37 ° C. Which shows that heat remains confined to the nanoscale. In the embodiment referred to what is illustrated in Figure 2, the water surrounding the nano-antenna remains at a temperature of 37 ° C despite the excitation achieved by the laser beam pulse.

Il confinamento di calore mostrato nella figura 2 è un significativo vantaggio del metodo realizzato secondo la presente invenzione rispetto ai metodo noti allo stato della tecnica. Infatti, si deve tenere conto del fatto che l'ampiezza dei pori ottenuti nella membrana cellulare è proporzionale, fra l'altro, alla grandezza del punto caldo. Da una parte, nell'apertura di pori ottenuta in moto fototermico, la grandezza minima del punto caldo è limitata dalla lunghezza d'onda della sorgente laser, che è molto più ampia della grandezza della punta dell'antenna nel caso di luce nello spettro vicino infrarosso (NIR). Dall'altra parte, l'apertura di pori indotta in modo chimico può essere la sola tecnica che potrebbe - in linea teorica realizzare fori di dimensioni inferiori rispetto a quelli ottenuti con una apertura di pori realizzata termicamente in modo plasmonico. A questo riguardo, l'apertura di pori realizzata in modo chimico si basa infatti su reazioni su scala molecolare. Tuttavia la metodologia di apertura di pori realizzata in modo chimico coinvolge l'intera membrana cellulare e dunque tutte le cellule contenute nel mezzo in cui viene rilasciato l'agente chimico atto ad indurre l'apertura dei pori. Pertanto tale metodologia non consente di applicare una selettività nelle effettive cellule - o nella parte di cellula specifica - su cui viene realizzata l'apertura di pori. The heat confinement shown in Figure 2 is a significant advantage of the method implemented according to the present invention with respect to the methods known in the state of the art. In fact, it must be taken into account that the width of the pores obtained in the cell membrane is proportional, among other things, to the size of the hot spot. On the one hand, in the opening of pores obtained in photothermal motion, the minimum size of the hot spot is limited by the wavelength of the laser source, which is much larger than the size of the antenna tip in the case of light in the near spectrum. infrared (NIR). On the other hand, chemically induced pore opening may be the only technique that could - theoretically - make holes smaller than those obtained with a thermally plasmonic pore opening. In this regard, the chemically made opening of pores is in fact based on reactions on a molecular scale. However, the methodology of opening the pores carried out in a chemical way involves the entire cell membrane and therefore all the cells contained in the medium in which the chemical agent capable of inducing the opening of the pores is released. Therefore this methodology does not allow to apply a selectivity in the actual cells - or in the specific cell part - on which the pores are opened.

Sarà esposta qui di seguito una forma di realizzazione esemplificativa in cui il metodo realizza una apertura di pori “fredda". An exemplary embodiment will be set forth below in which the method realizes a "cold" pore opening.

In linea generale, con durate inferiori del periodo di tempo T, l'ambiente non fa in tempo a riscaldarsi e gli elettroni liberati dal metallo con cui è realizzata la nano-antenna 10 e che sono immersi in acqua vengono accelerati {accelerazione ponderomotiva)dal campo elettrico di antura plasmonica e per interazione diretta con il laser stesso. In questo modo viene generata un'onda di pressione che localmente apre in modo transitorio nano-pori sulla membrana cellulare M. A questo riguardo, si desidera sottolineare che la struttura del nano-elemento plasmonico utilizzata è la medesima che è impiegabile per l'apertura di pori "calda" o termica. Come sopra accennato, l'aspetto che differenzia le due tecniche di apertura di pori consiste sostanzialmente nella durata dell' impulso laser T in cui viene focalizzato il fascio laser B. Pertanto componenti ed elementi precedentemente descritti con riferimento all'apertura di pori “calda" o termica ed applicabili anche all'apertura di pori “fredda" non saranno qui di seguito ripetuti per motivi di brevità. Generally speaking, with shorter durations of the time period T, the environment does not have time to heat up and the electrons released from the metal with which the nano-antenna 10 is made and which are immersed in water are accelerated (weight-driven acceleration) by the electric field of plasmon anura and by direct interaction with the laser itself. In this way, a pressure wave is generated which locally transiently opens nano-pores on the cell membrane M. In this regard, it should be emphasized that the structure of the plasmonic nano-element used is the same that can be used for opening of "hot" or thermal pores. As mentioned above, the aspect that differentiates the two pore opening techniques substantially consists in the duration of the laser pulse T into which the laser beam B is focused. Therefore components and elements previously described with reference to the "hot" pore opening or thermal and applicable also to the opening of "cold" pores will not be repeated hereinafter for reasons of brevity.

Qui di seguito saranno descritti alcuni dati e rilevazioni sperimentali con riferimento ad una possibile modalità di attuazione del metodo secondo l'invenzione, in cui si utilizza sostanzialmente una apertura di pori “fredda". Chiaramente tali dati e rilevazioni non devono essere intesi come limitativi dell'ambito di tutela della presente invenzione. In tal caso, l'impulso laser è in grado di eccitare polaritoni plasmonici di superficie {anche definiti in lingua inglese come "surface plasmon polaritons " ad abbreviati dall'acronimo SPPs) che sono molto efficaci nel decadere in elettroni altamente energetici e denominati come “hot electrons" che risultano essere immersi in acqua. Più in dettaglio, nei periodi di tempo T previsti per l'apertura di pori “fredda", l'acqua può essere considerata come un semiconduttore amorfo. A questo riguardo, misure sperimentali hanno evidenziato che la funzione di lavoro dell'oro (quale metallo preferito per la nano-antenna) in presenza di acqua si riduce da un valore di 4,9 eV a 3,7 eV, o anche valori inferiori, cosicché l'estrazione o liberazione degli elettroni a partire dall'oro (od anche ad un altro metallo che sia scelto per realizzare la nano-antenna) viene favorita energeticamente. Inoltre, il campo elettrico dovuto all'effetto plasmonico nell'interfaccia tra oro e acqua è amplificato di un fattore che può essere di circa 20 volte, o superiore. A causa dei valori di campo plasmonico sopra riportati, gli elettroni saranno dunque accelerati dalla forza ponderomotiva ad una energia cinetica media che può essere di circa 10 eV o superiore, questo valore di energia è sufficiente per creare una ionizzazione a cascata nelle molecole di acqua. Tale ionizzazione a cascata crea un'onda di pressione in grado di aprire localmente nano-pori nella membrana cellulare M, Some experimental data and findings will be described below with reference to a possible method of implementing the method according to the invention, in which a "cold" pore opening is substantially used. 'scope of protection of the present invention. In this case, the laser pulse is able to excite surface plasmonic polaritons (also defined in English as "surface plasmon polaritons" and abbreviated by the acronym SPPs) which are very effective in decaying in highly energetic electrons and referred to as "hot electrons" which appear to be immersed in water. More in detail, in the time periods T foreseen for the opening of "cold" pores, water can be considered as an amorphous semiconductor. In this regard, experimental measurements have shown that the working function of gold (as a metal preferred for the nano-antenna) in the presence of water is reduced from a value of 4.9 eV to 3.7 eV, or even lower values, so that the extraction or release of electrons from gold (or even to a other metal that is chosen to make the nano-antenna) is energetically favored. Furthermore, the electric field due to the plasmonic effect in the interface between gold and water is amplified by a factor that can be about 20 times, or higher. due to the plasmonic field values reported above, the electrons will therefore be accelerated by the ponderomotive force to an average kinetic energy that can be about 10 eV or higher, this energy value is sufficient to create a cascade ionization in the mol ecole of water. This cascade ionization creates a pressure wave capable of locally opening nano-pores in the cell membrane M,

Saranno invece qui di seguito riepilogati alcuni aspetti vantaggiosi del metodo della presente invenzione relativi ad applicabili ad un'apertura di pori "fredda" ed un'apertura di pori "calda" o termica. On the other hand, some advantageous aspects of the method of the present invention relating to applicable to a "cold" pore opening and a "hot" or thermal pore opening will be summarized hereinafter.

Come in parte già accennato in precedenza, nella figura 3 è rappresentato un passo operativo eseguito in una forma di realizzazione esemplificativa del metodo secondo la presente invenzione. Tale passo operativo include il focalizzare il fascio di luce B, in particolare un fascio laser pulsato, sulla nano-antenna 10. La radiazione del fascio di luce B ha una frequenza regolata alla frequenza plasmonica di risonanza della nano-antenna 10. In questo modo, il fascio di luce B viene convertito in calore localizzato sulla nano-antenna 10 ed è atto ad aprire il poro P attraverso la membrana cellulare M. As already mentioned in part previously, Figure 3 shows an operating step performed in an exemplary embodiment of the method according to the present invention. This operative step includes focusing the light beam B, in particular a pulsed laser beam, on the nano-antenna 10. The radiation of the light beam B has a frequency adjusted to the resonant plasmon frequency of the nano-antenna 10. In this way , the light beam B is converted into heat localized on the nano-antenna 10 and is able to open the pore P through the cell membrane M.

Preferibilmente il fascio di luce B è focalizzato verso una superficie di contatto situata fra la nanoantenna 10 e la membrana cellulare M. In particolare, nella forma di realizzazione illustrata, tale superficie di contatto comprende la porzione distale o punta 10a della nano-antenna 10. Preferably the light beam B is focused towards a contact surface located between the nanoantenna 10 and the cell membrane M. In particular, in the illustrated embodiment, this contact surface comprises the distal portion or tip 10a of the nano-antenna 10.

Nella forma di realizzazione illustrata con particolare riferimento alla figura 3, è prevista una sorgente di luce 12 predisposta per emettere il fascio di luce B in grado di eccitare la nano-antenna 10 presentante proprietà plasmoniche. In questo modo viene eseguita l'apertura del poro P su una membrana cellulare M appartenente ad una cellula C di un qualsivoglia campione biologico. Preferibilmente, è presente altresì un sistema ottico 14 per focalizzare il fascio di luce B emesso dalla sorgente di luce 12 sulla nano-antenna 10. In the embodiment illustrated with particular reference to Figure 3, a light source 12 is provided for emitting the beam of light B capable of exciting the nano-antenna 10 having plasmonic properties. In this way, the opening of the pore P on a cell membrane M belonging to a cell C of any biological sample is performed. Preferably, there is also an optical system 14 for focusing the light beam B emitted by the light source 12 on the nano-antenna 10.

Sempre con riferimento alla figura 3, è possibile notare come la sorgente di luce 12 e - laddove sia previsto - il sistema ottico 14 siano situati da parte opposte rispetto alla nano-antenna 10 rispetto dalla membrana cellulare M, Again with reference to Figure 3, it is possible to note how the light source 12 and - where provided - the optical system 14 are located on opposite sides with respect to the nano-antenna 10 with respect to the cell membrane M,

Nella forma di realizzazione illustrata, il fascio di luce B emesso e focalizzato attraversa la cellula C e la relativa membrana M, raggiungendo quindi la nano-antenna 10, in particolare nella superficie di contatto reciproca, ad esempio la porzione distale o punta 10a di tale nanoantenna 10. In the illustrated embodiment, the emitted and focused beam of light B passes through the cell C and the relative membrane M, thus reaching the nano-antenna 10, in particular in the reciprocal contact surface, for example the distal portion or tip 10a of this nanoantenna 10.

Nella figura 3 è illustrato un substrato 16 che porta una pluralità di nano-antenne 10 (o in alternativa anche altri nano-elementi plasmonici di diversa tipologia) in grado di aprire pori P attraverso la membrana cellulare M, in differenti e numerose posizioni di quest'ultima. Preferibilmente, tale substrato 16 è realizzato flessibile ed è in grado di essere appoggiato direttamente sulla membrana cellulare M, in modo che la membrana cellulare M e il substrato 16 siano fra di loro combacianti. Nella forma di realizzazione illustrata, il substrato 16 comprende una membrana flessibile che supporta le nano-antenne 10. Figure 3 illustrates a substrate 16 which carries a plurality of nano-antennas 10 (or alternatively also other plasmonic nano-elements of different types) capable of opening pores P through the cell membrane M, in different and numerous positions of these 'last. Preferably, this substrate 16 is made flexible and is capable of being placed directly on the cell membrane M, so that the cell membrane M and the substrate 16 mate with each other. In the illustrated embodiment, the substrate 16 comprises a flexible membrane which supports the nano-antennas 10.

In particolare, le nano-antenna 10 sono sporgenti dal substrato 16 dalla medesima parte o faccia. In particular, the nano-antennas 10 protrude from the substrate 16 on the same side or face.

Nella forma di realizzazione illustrata, l'assieme ottico 14 può comprendere un microscopio verticale o invertito. In alternative l'assieme ottico può inoltre anche essere un obiettivo di messa a fuoco oppure un collimatore. In the illustrated embodiment, the optical assembly 14 may comprise a vertical or inverted microscope. Alternatively, the optical assembly can also be a focusing objective or a collimator.

Preferibilmente, l'intimo contatto fra la membrana cellulare M e il nano-elemento plasmonico corrispondente, può essere realizzato facendo crescere in colture le cellule C direttamente sul nano-elemento. Nella forma di realizzazione illustrata, è realizzata la coltura delle cellule C direttamente sulle nano-antenne 10. Preferably, the intimate contact between the cell membrane M and the corresponding plasmonic nano-element can be achieved by culturing the C cells directly on the nano-element. In the illustrated embodiment, the culture of the C cells is carried out directly on the nano-antennas 10.

In alternativa, è possibile mettere in contatto la membrana cellulare M con il nano-elemento plasmonico corrispondente anche soltanto immediatamente prima dell'esecuzione dell'apertura dei pori P. Quest'ultimo caso, si dimostra particolarmente vantaggioso quando il nano-elemento plasmonico, in particolare le nano-antenne 10, è realizzato di un materiale che è citotossico, ad esempio l'argento. Alternatively, it is possible to put the cell membrane M in contact with the corresponding plasmonic nano-element even only immediately before the execution of the pore opening P. This last case proves particularly advantageous when the plasmonic nano-element, in particularly the nano-antennas 10, is made of a material which is cytotoxic, for example silver.

Come descritto in precedenza, quando il fascio di luce focalizzato eccita una rispettiva nano-antenna 10, esso provoca - a seconda della durata del periodo di tempo T -una combinazione di accelerazione pondermotiva e accelerazione diretta da parte del laser {inverse bremsstrahlung) con conseguente incremento della temperatura nella punta di tale nano-antenna 10 e quindi sulla membrana cellulare M viene dunque realizzata l'apertura di un poro corrispondente. As described above, when the focused light beam excites a respective nano-antenna 10, it causes - depending on the duration of the time period T - a combination of weighted and direct acceleration by the laser (inverse bremsstrahlung) with consequent increase of the temperature in the tip of such nano-antenna 10 and therefore on the cell membrane M the opening of a corresponding pore is therefore realized.

Chiaramente, il dispositivo utilizzato può includere numerose nano-antenne 10 (od anche altri nano-elementi plasmonici), anche migliaia di esse. La sorgente di luce 12 può essere fatta passare in corrispondenza di tutte le nano-antenne 10 per focalizzare un fascio di luce, di volta in volta su ciascuna di esse. Quindi, come sopra accennato, è possibile eseguire l'apertura di pori P su membrane cellulari M appartenenti anche a differenti cellule C di un medesimo campione biologico. Dunque, vi sono alcuni vantaggi di tipo significativo associati a questo aspetto. Clearly, the device used can include numerous nano-antennas 10 (or even other plasmonic nano-elements), even thousands of them. The light source 12 can be made to pass in correspondence with all the nano-antennas 10 to focus a beam of light, from time to time on each of them. Therefore, as mentioned above, it is possible to open pores P on cell membranes M belonging also to different C cells of the same biological sample. Thus, there are some significant advantages associated with this aspect.

Un vantaggio è dato dal fatto che le nano-antenne 10 possono essere disposte sul rispettivo supporto 16 in modo particolarmente denso e fitto, in modo tale da essere eccitate una ad una dal fascio di luce B emesso dalla sorgente di luce 12; tale struttura è anche di semplice fabbricazione rispetto a quanto avviene nel caso di dispositivi atti a realizzare l'apertura di pori P con eccitazione di tipo elettrico, anche detta elettroporazione (che richiedono matrici di nano-elementi indipendenti con cablature complesse e costose). Un altro vantaggio è dato dal fatto che il piano focale del fascio di luce B è fissato dalla superficie del dispositivo su cui le nano-antenne 10 sono fabbricate; in questo modo vi è un vantaggio rispetto ai metodi di apertura di pori realizzati in modo foto-termico, in cui il fascio di luce deve essere focalizzato in modo regolato e calibrato ogni volta su ciascuna cellula C allo scopo di concentrare l'energia specificamente sulla membrana M desiderata. An advantage is given by the fact that the nano-antennas 10 can be arranged on the respective support 16 in a particularly dense and dense way, in such a way as to be excited one by one by the light beam B emitted by the light source 12; this structure is also simple to manufacture with respect to what happens in the case of devices suitable for opening pores P with electric excitation, also called electroporation (which require arrays of independent nano-elements with complex and expensive wiring). Another advantage is given by the fact that the focal plane of the light beam B is fixed by the surface of the device on which the nano-antennas 10 are manufactured; in this way there is an advantage over pore opening methods realized in a photo-thermal way, in which the light beam must be focused in a regulated and calibrated way each time on each C cell in order to focus the energy specifically on the desired M membrane.

Come visibile nelle figure da 4 a 8, fra i possibili tipi di nano-elementi plasmonici, l'uso delle nano-antenne 10 è particolarmente vantaggioso in quanto ciascuna di esse può realizzare un rispettivo nano-canale 18 (numerato soltanto nella figura 7) configurato per essere percorso da sostanze S atte ad attraversare, in ingresso od in uscita, la membrana cellulare M. In particolare, tale nano-canale 18 può fungere da sistema di erogazione di sostanze S, anche in forma molecolare, all'interno della cellula, costituendo dunque una applicazione micro-fluidica (o nanofluidica). As can be seen in Figures 4 to 8, among the possible types of plasmonic nano-elements, the use of the nano-antennas 10 is particularly advantageous as each of them can realize a respective nano-channel 18 (numbered only in Figure 7) configured to be traversed by substances S capable of crossing the cell membrane M in entry or exit. In particular, this nano-channel 18 can act as a delivery system for substances S, even in molecular form, inside the cell , thus constituting a micro-fluidic (or nanofluidic) application.

Si sottolinea che le figure da 4 a 8 sono riferite in particolar modo alla contribuzione dell'apertura di pori "calda". Tuttavia, le medesime figure sono applicabili per illustrare ciò che avviene per quanto attiene al contributo relativo alla apertura di pori “fredda"<'>. La differenza fra i due effetti tecnici che si verificano durante l'esecuzione di un metodo secondo la presente invenzione è data dal fatto che l'apertura di pori “fredda" non contribuisce di per sé ad un riscaldamento plasmonico {citato nella figura 6), piuttosto tale apertura di pori “fredda" contribuisce alla formazione di “hot electrons" che causano l'onda di pressione che tende ad aprire la membrana M. It is emphasized that figures 4 to 8 refer in particular to the contribution of the "hot" pore opening. However, the same figures are applicable to illustrate what happens with regard to the contribution relating to the "cold" <'> opening of pores. The difference between the two technical effects that occur during the execution of a method according to the present invention is given by the fact that the opening of "cold" pores does not in itself contribute to a plasmonic heating (mentioned in figure 6), rather this "cold" opening of pores contributes to the formation of "hot electrons" which cause the wave pressure which tends to open the membrane M.

Nella forma di realizzazione illustrata, il nanocanale 18 attraversa la rispettiva nano-antenna 10 ed anche il substrato 16. In the illustrated embodiment, the nanochannel 18 passes through the respective nano-antenna 10 and also the substrate 16.

In particolare nelle figure da 4 a 8, è illustrata una sequenza di passi operativi per eseguire questa tecnica micro-fluidica intracellulare, ad esempio per l'erogazione di sostanze S in forma di medicamenti. In particular, in Figures 4 to 8, a sequence of operating steps is illustrated for carrying out this intracellular micro-fluidic technique, for example for the delivery of substances S in the form of medicaments.

Nella figura 4, le cellule C sono sottoposte a coltura direttamente sul substrato 16 in modo tale che esse possano circondare ed “invaginare" le nano-antenne 10. In figure 4, the C cells are cultured directly on the substrate 16 so that they can surround and "invaginate" the nano-antennae 10.

Nella figura 5, il fascio di luce B emesso dalla sorgente di luce 12 è diretto verso la punta (estremità distale) di una rispettiva nano-antenna 10, in posizione allontanata dal substrato 16. In Figure 5, the beam of light B emitted by the light source 12 is directed towards the tip (distal end) of a respective nano-antenna 10, in a position away from the substrate 16.

Nelle figure 6 e 7 è visibile l'effetto tecnico realizzato dal calore indotto in modo plasmonico realizza sulla membrana cellulare M. Tale calore genera quindi un poro P (figura 6) attraverso il quale le sostanze S, ad esempio in forma di molecole, possono fluire attraverso la nano-antenna 10 (figura 7). Con opportuni accorgimenti è possibile fare giungere direttamente all'interno della cellula C, S sostanze contenute in apposite cavità o compartimenti realizzati nel substrato 16 o comunque comunicanti con la nano-antenna 10 attraverso tale substrato 16 (in particolare, mediante il nano-canale 18 che attraversa substrato 16 e nano-antenna 10). In alternativa, è anche prevedibile un flusso di fluido in direzione inversa, dalla cellula C alle cavità eventualmente ottenute nel substrato 16. Figures 6 and 7 show the technical effect achieved by the plasmonic induced heat on the cell membrane M. This heat therefore generates a pore P (Figure 6) through which substances S, for example in the form of molecules, can flow through the nano-antenna 10 (figure 7). With suitable measures it is possible to make substances contained in suitable cavities or compartments made in the substrate 16 or in any case communicating with the nano-antenna 10 reach directly inside the cell C, S through this substrate 16 (in particular, through the nano-channel 18 which crosses substrate 16 and nano-antenna 10). Alternatively, a flow of fluid in the reverse direction is also foreseeable, from cell C to the cavities possibly obtained in the substrate 16.

Nella figura 8 è visibile che, dopo pochi minuti dall'apertura del poro P, la membrana cellulare M si chiude nuovamente, ritornando nella condizione di partenza mostrata nella figura 4, ma in cui all'interno della cellula C è stata immessa la quantità di sostanza S desiderata. In figure 8 it is visible that, after a few minutes from the opening of the pore P, the cell membrane M closes again, returning to the starting condition shown in figure 4, but in which the quantity of desired substance S.

Pertanto, come sopra descritto, le nano-antenne 10 costituiscono un eccellente canale per la diffusione molecolare in ambiente intracellulare. Il che significa che è possibile integrare queste strutture in un dispositivo microfluidico che comprende una pluralità di compartimenti separati per fluidi, in cui ciascuno di tali compartimenti è in grado di contenere sostanze di tipo differente ed è collegato fluidicamente con una corrispondente nano-antenna 10 specifica. Therefore, as described above, the nano-antennas 10 constitute an excellent channel for molecular diffusion in an intracellular environment. This means that it is possible to integrate these structures in a microfluidic device which includes a plurality of separate compartments for fluids, in which each of these compartments is capable of containing substances of different types and is connected fluidically with a corresponding specific nano-antenna 10. .

A titolo di esempio, possono essere previste differenti sostanze S per una applicazione di tipo microfluidico del metodo secondo la presente invenzione. Ad esempio, tali sostanze possono includere materiale genetico, nano-particelle o soluzioni complesse senza necessità di protocolli dedicati per il loro trasferimento, come nei metodi chimici o trasfezione virale. By way of example, different substances S can be provided for a microfluidic type application of the method according to the present invention. For example, such substances can include genetic material, nano-particles or complex solutions without the need for dedicated protocols for their transfer, such as in chemical methods or viral transfection.

Applicazioni di tipo microfluidico per il metodo secondo la presente invenzione possono consentire una automatizzazione tale anche da raggiungere numerose attuazioni in periodi di tempo brevi {ad esempio, 10<Λ>5 cellule trattate in un ora), Microfluidic applications for the method according to the present invention can allow an automation such as to achieve numerous implementations in short periods of time (for example, 10 <Λ> 5 cells treated in an hour),

Inoltre, la tenuta di fluido fra i nanotubi e la membrana M impedisce che avvenga una erogazione indesiderata di materiale appartenente alla matrice extracellulare. Più in generale, viene consentito un controllo sull'ambiente intracellulare: questo metodo può anche essere utilizzato per controllare il valore intracellulare del pH, la distribuzione di ioni (ad esempio, Ca+, K+, Na+, Cl<”>). Ancora, tale metodo può essere combinato con l'uso di matrici microelettrodiche per condurre esperimenti elettrofisiologici in una configurazione che rappresenterebbe un'unica piattaforma. Inoltre, il medesimo approccio potrebbe essere utilizzato per raccogliere fluidi intracellulari ed analizzarli con metodi particolarmente raffinati e sensibili, quali - ad esempio - spettroscopia di massa,<*>il che consente di analizzare le singole cellule. Furthermore, the fluid seal between the nanotubes and the membrane M prevents unwanted delivery of material belonging to the extracellular matrix from occurring. More generally, a check on the intracellular environment is allowed: this method can also be used to check the intracellular pH value, the distribution of ions (for example, Ca +, K +, Na +, Cl <”>). Again, this method can be combined with the use of microelectrode arrays to conduct electrophysiological experiments in a configuration that would represent a single platform. Furthermore, the same approach could be used to collect intracellular fluids and analyze them with particularly refined and sensitive methods, such as - for example - mass spectroscopy, <*> which allows to analyze single cells.

Come sopra accennato, in connessione con la forma di realizzazione illustrata, oltre all 'utilizzo delle nanoantenne 10, il metodo secondo l'invenzione può prevedere differenti alternative per il nano-elemento plasmonico. A titolo di esempio, fra l'altro, è possibile impiegare varie categorie di tali nano-elementi plasmonici, quali generiche nano-particelle, oppure struttura a nano-antenna planare o nano-antenne tridimensionali (come quelle illustrate nei disegni) . As mentioned above, in connection with the illustrated embodiment, in addition to the use of the nanoantennas 10, the method according to the invention can provide different alternatives for the plasmonic nano-element. By way of example, among other things, it is possible to use various categories of such plasmonic nano-elements, such as generic nano-particles, or planar nano-antenna structure or three-dimensional nano-antennas (such as those illustrated in the drawings).

Per quanto attiene alle nano-particelle, possono essere utilizzate particelle metalliche aventi dimensioni in scala nanometrica che sono in grado di risuonare grazie all'eccitazione dovuta ad un fascio di luce incidente di opportuna frequenza. Queste nano-particelle possono essere depositate sul substrato sostanzialmente piano (ed eventualmente flessibile) o disperse nel liquido. Lo sfruttamento e l'applicabilità di tali nano-particelle per l'apertura di pori nella membrana cellulare possono essere limitati a causa della loro citotossicità. As far as nano-particles are concerned, metallic particles having nanometric dimensions that are able to resonate thanks to the excitation due to an incident light beam of suitable frequency can be used. These nano-particles can be deposited on the substantially flat (and possibly flexible) substrate or dispersed in the liquid. The exploitation and applicability of such nano-particles for opening pores in the cell membrane can be limited due to their cytotoxicity.

Per quanto riguarda le antenne planari, possono essere usate strutture bi-dimensionali con particolari proprietà e geometrie configurate per essere in risonanza a causa dell'eccitazione provocata dal fascio di luce incidente di opportuna frequenza; la loro grandezza può variare da decine ad alcune centinaia di nanometri. Esse sono facilmente depositatili su substrati planari, quali quarzo o silicio. Il loro sfruttamento per l'apertura di pori in modo plasmonico può essere limitato a causa della distanza fra la struttura metallica piana e la membrana cellulare giacente sull'antenna. In effetti, la particolare geometria delle antenne planari rischia di non consentire un buon contatto - od una sufficiente prossimità - tra le antenne e le cellule, pertanto potrebbe limitare l'efficienza della porazione. As far as planar antennas are concerned, two-dimensional structures with particular properties and geometries configured to be in resonance due to the excitation caused by the incident light beam of suitable frequency can be used; their size can vary from tens to a few hundred nanometers. They are easily deposited on planar substrates, such as quartz or silicon. Their exploitation for plasmonic opening of pores can be limited due to the distance between the flat metal structure and the cell membrane lying on the antenna. In fact, the particular geometry of the planar antennas risks not allowing a good contact - or sufficient proximity - between the antennas and the cells, therefore it could limit the efficiency of the portion.

Infatti, per quest'ultimo motivo, vi è un ulteriore vantaggio nell'adottare il metodo proposto che si basa su strutture tridimensionali che protrudono dal piano del substrato dove le cellule vengono coltivate. Quando le cellule vengono coltivate su un comune substrato planare esse aderiscono al substrato in modo non omogeneo da punto a punto. Ogni cellula aderisce in modo diverso e anche la singola cellula presenta, nell'area di interfaccia tra la membrana cellulare e il substrato, una adesione variabile da punto a punto. In fact, for the latter reason, there is a further advantage in adopting the proposed method which is based on three-dimensional structures that protrude from the substrate plane where the cells are grown. When cells are grown on a common planar substrate they adhere to the substrate in a non-homogeneous way from point to point. Each cell adheres differently and even the single cell exhibits, in the interface area between the cell membrane and the substrate, adhesion that varies from point to point.

Diversamente, dalla letteratura tecnica, è noto che le cellule aderiscono molto bene su strutture tridimensionali, il che risulta in un accoppiamento più stretto fra la membrana e la nano-antenna (L. Hanson et al., Nano Lett., 2012, 12 (11), pagg. 5815-5820). In particolare, quando le cellule sono coltivate su substrati che presentano strutture protrudenti di opportune forme e dimensioni, quali ad esempio i detti nano-elementi plasmonici aventi altezza di qualche micron e diametro dell'ordine delle centinaia di nanometri, le dette cellule tendono ad aderire al substrato in corrispondenza delle strutture protrudenti. Un esempio di tali nano-antenne tridimensionali è quello introdotto nella pubblicazione di F. De Angelus et al., Nano Lett. 2013, 13, 3553-3558. In linea generale, le cellule tendono generalmente a circondare, “invaginando" o inglobando queste tipologie di strutture tridimensionali con la loro membrana cellulare. Unlike the technical literature, it is known that cells adhere very well to three-dimensional structures, which results in a closer coupling between the membrane and the nano-antenna (L. Hanson et al., Nano Lett., 2012, 12 ( 11), pp. 5815-5820). In particular, when the cells are grown on substrates that have protruding structures of suitable shapes and sizes, such as for example the said plasmonic nano-elements having a height of a few microns and a diameter of the order of hundreds of nanometers, the said cells tend to adhere to the substrate in correspondence with the protruding structures. An example of such three-dimensional nano-antennas is the one introduced in the publication by F. De Angelus et al., Nano Lett. 2013, 13, 3553-3558. Generally speaking, cells generally tend to surround, "invaginating" or incorporating these types of three-dimensional structures with their cell membrane.

In altre parole, invece di avere una adesione variabile da punto a punto e non prevedible, la strutura protrudente funziona da punto di adesione spontanea per la membrana cellulare. Questo comporta diversi distinti e ulteriori vantaggi. In primo luogo il punto di adesione diviene prevedibile e controllabile. Questo è di particolare importanza poiché la porazione della membrana avverrà in corrispondenza del punto di adesione tra la nanostruttura e la membrana stessa. Di conseguenza la possibilità di controllare meglio il punto di adesione offre una migliorata capacità di controllo sul processo di porazione nel suo insieme. Inoltre le membrane cellulari tendono ad aderire saldamente su dette nanostrutture protrudenti fino anche ad avvolgere o “invaginare" le strutture stesse: questa stretta adesione riduce la distanza tra la superficie di metallo su cui viene generata l'onda di pressione e la membrana cellulare che deve essere porata dall'onda stessa. Una ridotta distanza implica una porazione piu netta e precisa e tipicamente dei pori più piccoli. Quando ad esempio, il detto nano-elemento plasmonico è usato anche come elettrodo per misurare o applicare correnti o tensioni eletriche, come avviene negli esperimenti di elettrofisiologia, la ridotta distanza spaziale tra il poro P e l'elettrodo consentono un miglioramento dell'accoppiamento elettrico e capacitivo tra il liquido intracellulare e l'elettrodo stesso. In other words, instead of having a variable and unpredictable point-to-point adhesion, the protruding structure functions as a spontaneous adhesion point for the cell membrane. This has several distinct and additional benefits. First, the point of adhesion becomes predictable and controllable. This is of particular importance since the poration of the membrane will take place at the point of adhesion between the nanostructure and the membrane itself. Consequently, the ability to better control the adhesion point offers an improved ability to control the portioning process as a whole. Furthermore, cell membranes tend to adhere firmly on said protruding nanostructures up to even envelop or "invaginate" the structures themselves: this tight adhesion reduces the distance between the metal surface on which the pressure wave is generated and the cell membrane that must be carried by the wave itself. A reduced distance implies a clearer and more precise portion and typically of the smallest pores. When for example, the said plasmonic nano-element is also used as an electrode to measure or apply electrical currents or voltages, as happens in electrophysiology experiments, the reduced spatial distance between the pore P and the electrode allows an improvement in the electrical and capacitive coupling between the intracellular liquid and the electrode itself.

Ulteriori vantaggi si hanno quando come elemento plasmonico si utilizza una struttura cava atta a introdurre una detta sostanza S nel comparto intracellulare come, a titolo esemplificativo, è stato descritto nelle figure 6-7 Secondo questo schema il nanotubo plasmonico ha un'estremità saldata alla membrana cellulare e l'altra estremità che si inserisce direttamente in un canale microfluidico o altro ritrovato atto a deliverare la sostanza S. Di conseguenza, una volta aperto il poro P mediante il fascio laser, il nanotubo plasmonico realizza un accesso esclusivo al comparto intracellulare. Con ciò si intende che la sostanza S può essere introdotta direttamente nell'ambiente intracellulare senza che questa venga in contatto con il bagno extracellulare. Viceversa questo approccio impedisce alle sostanze contenute nel bagno extracellulare di entrare nell' ambiente intracellualre quando la membrana cellulare viene porata. Further advantages are obtained when a hollow structure is used as the plasmonic element to introduce a said substance S into the intracellular compartment as, by way of example, it has been described in figures 6-7 According to this scheme, the plasmonic nanotube has one end welded to the membrane cellular and the other end that is inserted directly into a microfluidic channel or other device capable of delivering the substance S. Consequently, once the pore P is opened by the laser beam, the plasmonic nanotube realizes an exclusive access to the intracellular compartment. By this it is meant that substance S can be introduced directly into the intracellular environment without this coming into contact with the extracellular bath. Conversely, this approach prevents the substances contained in the extracellular bath from entering the intracellular environment when the cell membrane is porated.

Come sopra accennato, uno dei vantaggi associato al metodo di apertura di pori in maniera plasmonica secondo la presente invenzione consiste nel fatto che esso è utilizzabile per lo studio di cellule elettricamente attive, quali neuroni e cardiomiociti . Queste cellule generano impulsi elettrici, le cui caratteristiche sono fondamentali per la comprensione del loro comportamento e della loro risposta a particolari medicamenti o condizioni. Infatti è noto che queste cellule, specialmente i neuroni, sono molto sensibili e rispondono a vari stimoli, fra i quali potenziale elettrico, calore, luce e medicamenti specifici. Pertanto tutti i metodi per l'apertura di pori che si basano su potenziale elettrico, calore, luce, o medicamenti (o, più in generale, sostanze chimiche) influenzeranno inevitabilmente il sistema e dunque non consentiranno di osservare l'attività {in particolare, quella elettrica) del sistema biologico, senza alterarlo. Al contrario, l'apertura di pori plasmonica può creare una interruzione nella membrana cellulare richiedendo una bassa quantità di energia, insufficiente a innescare una risposta elettrica stimolata. Di conseguenza, un campione biologico elettricamente attivo non sarebbe influenzato, e dunque perturbato, dall'apertura di pori plasmonica e dunque può essere studiato nelle suo stato spontaneo e non alterato. As mentioned above, one of the advantages associated with the plasmonically opening pore method according to the present invention consists in the fact that it can be used for the study of electrically active cells, such as neurons and cardiomyocytes. These cells generate electrical impulses, the characteristics of which are fundamental to understanding their behavior and their response to particular medications or conditions. In fact, it is known that these cells, especially neurons, are very sensitive and respond to various stimuli, including electrical potential, heat, light and specific medicaments. Therefore, all methods for opening pores that are based on electrical potential, heat, light, or medicaments (or, more generally, chemicals) will inevitably affect the system and therefore will not allow to observe the activity {in particular, the electrical one) of the biological system, without altering it. Conversely, opening plasmon pores can create a break in the cell membrane requiring a low amount of energy, insufficient to trigger a stimulated electrical response. Consequently, an electrically active biological sample would not be affected, and therefore perturbed, by the opening of plasmon pores and therefore can be studied in its spontaneous and unaltered state.

Un altro vantaggio significativo del metodo secondo la presente invenzione è dovuto al fatto della sua controllabilità nel tempo e nello spazio. Another significant advantage of the method according to the present invention is due to its controllability in time and space.

Un ulteriore vantaggio del metodo secondo la presente invenzione è dato dal fatto che il tempo per l'apertura di un poro in una singola cellula è molto breve, ad esempio anche al di sotto di 1 microsecondo. A further advantage of the method according to the present invention is given by the fact that the time for opening a pore in a single cell is very short, for example even below 1 microsecond.

Un altro vantaggio del metodo secondo la presente invenzione è dato dal fatto che i nano-elementi plasmonici possono essere fabbricati in matrici dense e ampie su cui le cellule possono essere direttamente assoggettate a coltura. Facendo passare la sorgente di luce al di sopra di tali matrici, migliaia di cellule possono essere sottoposte ad apertura di pori in un tempo molto breve, prima che le membrane cellulari inizino a recuperare il loro stato iniziale, chiudendosi. Another advantage of the method according to the present invention is given by the fact that the plasmonic nano-elements can be manufactured in dense and large matrices on which the cells can be directly subjected to culture. By passing the light source over these matrices, thousands of cells can be pore-opened in a very short time, before the cell membranes begin to recover their initial state, closing.

Un altro aspetto vantaggioso consiste nel fatto che il confinamento del processo di riscaldamento o di generazione di un'onda di pressione sulla punta dell'antenna è di ampiezza nanometrica; il che conduce alla generazione di fori estremamente piccoli sulla membrana cellulare, evitando una alterazione dell'ambiente circostante di tipo indesiderato. Another advantageous aspect consists in the fact that the confinement of the heating process or the generation of a pressure wave on the tip of the antenna is of nanometric width; which leads to the generation of extremely small holes on the cell membrane, avoiding an undesired alteration of the surrounding environment.

Un ulteriore vantaggio è dato dal fatto che se il nano-elemento plasmonico presenta un canale fluidico, tale nano-elemento plasmonico è in grado di costituire una valvola {in particolare se il nano-elemento plasmonico comprende una nano-antenna, esso costituisce una nanovalvola). A further advantage is given by the fact that if the plasmonic nano-element has a fluidic channel, this plasmonic nano-element is able to constitute a valve {in particular if the plasmonic nano-element includes a nano-antenna, it constitutes a nano-valve ).

Naturalmente, fermo restando il principio dell'invenzione, le forme di attuazione ed i particolari di realizzazione potranno essere ampiamente variati rispetto a quanto descritto ed illustrato a puro titolo di esempio non limitativo, senza per questo uscire dall'ambito dell'invenzione come definito nelle annesse rivendicazioni. Naturally, the principle of the invention remaining the same, the embodiments and construction details may be widely varied with respect to those described and illustrated purely by way of non-limiting example, without thereby departing from the scope of the invention as defined in the attached claims.

In particolare, come è evidente ad un tecnico del settore, gli effetti tecnici conseguiti grazie all'esecuzione del metodo secondo la presente invenzione prescindono dalla forma illustrata della nano-antenna con riferimento ai disegni allegati. In altri termini, la forma della nano-antenna può essere variata rispetto a quella illustrata - ad esempio - nella figura 1, a condizione che tale nano-antenna presenti una risonanza plasmonica alla lunghezza d'onda della radiazione desiderata. A titolo esemplificativo, la nano-antenna potrebbe anche essere non cava e potrebbe ancora presentare un effetto di riscaldamento in modo plasmonico oppure potrebbe avere una forma cava conica invece di una forma cilindrica. In particular, as is evident to a person skilled in the art, the technical effects achieved by carrying out the method according to the present invention are independent of the illustrated form of the nano-antenna with reference to the attached drawings. In other words, the shape of the nano-antenna can be varied with respect to that illustrated - for example - in Figure 1, provided that this nano-antenna has a plasmon resonance at the wavelength of the desired radiation. By way of example, the nano-antenna could also be non-hollow and could still exhibit a plasmonic heating effect or it could have a conical hollow shape instead of a cylindrical shape.

Oltre a quanto sopra, non si intende come limitativo dell'ambito di tutela della presente invenzione il fatto che il fascio di luce nella forma di realizzazione illustrata sia di tipo laser. Infatti, come è chiaro ad un tecnico del settore, il fascio di luce può provenire da numerose e differenti tipologie di sorgenti di luce, ad esempio coerente od incoerente, monocromatica o policromatica, pulsata o continua. In addition to the above, the fact that the light beam in the illustrated embodiment is of the laser type is not intended as a limitation of the scope of protection of the present invention. In fact, as is clear to a person skilled in the art, the light beam can come from numerous and different types of light sources, for example coherent or incoherent, monochromatic or polychromatic, pulsed or continuous.

RIVENDICAZIONI

1, Metodo per l'apertura dei pori in una membrana cellulare, detto metodo comprendendo i seguenti passi operativi; 1, Method for opening pores in a cell membrane, said method comprising the following operating steps;

b) focalizzare per un periodo di tempo {T) compreso fra 1 fs e 20 ps un fascio di luce (B), quale ad esempio un fascio laser, su detto nano-elemento plasmonico metallico (10), detto fascio di luce (B) avendo una frequenza regolata alla frequenza plasmonica di risonanza di detto nano-elemento plasmonico metallico (10), affinché detto fascio di luce (B) causi un'eccitazione plasmonica in elettroni appartenenti a detto nano-elemento plasmonico metallico (10) e ne promuova l'espulsione verso l'ambiente circostante aprendo almeno un poro (P) su detta membrana cellulare (M), in cui contemporaneamente b) focus for a period of time {T) between 1 fs and 20 ps a beam of light (B), such as a laser beam, on said metal plasmonic nano-element (10), said beam of light (B ) having a frequency adjusted to the resonant plasmon frequency of said metallic plasmonic nano-element (10), so that said beam of light (B) causes a plasmon excitation in electrons belonging to said metallic plasmonic nano-element (10) and promotes it expulsion towards the surrounding environment by opening at least one pore (P) on said cell membrane (M), in which simultaneously

da una parte, detto fascio di luce (B) influenza mediante accelerazione ponderomotiva detti elettroni espulsi mediante detta eccitazione plasmonica e crea un'onda di pressione in detta acqua o in detta soluzione salina, e on the one hand, said beam of light (B) influences said electrons expelled by said plasmon excitation by means of weight-motive acceleration and creates a pressure wave in said water or in said saline solution, and

2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detto periodo di tempo (T) è inferiore o uguale a circa 0.1 ps ed è prevalente il contributo di detta onda di pressione ottenuta mediante accelerazione ponderomotiva per aprire detto almeno un poro (P). Method according to claim 1, wherein said period of time (T) is less than or equal to about 0.1 ps and the contribution of said pressure wave obtained by weight-driven acceleration to open said at least one pore (P) is prevalent.

3. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui in cui detto periodo di tempo (T) è maggiore o uguale a circa 1 ps ed è prevalente il contributo di detto calore localizzato ottenuto mediante inverse bremsstrahlung per aprire detto almeno un poro <P), Method according to claim 1, wherein said period of time (T) is greater than or equal to about 1 ps and the contribution of said localized heat obtained by inverse bremsstrahlung to open said at least one pore (P) is prevalent,

4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto almeno un nano-elemento plasmonico (10) è tridimensionalmente protrudente e aderisce strettamente a detta membrana cellulare (M). Method according to any one of the preceding claims, wherein said at least one plasmonic nano-element (10) is three-dimensionally protruding and adheres tightly to said cell membrane (M).

5. Metodo secondo la rivendicazione 4, in cui detto almeno un nano-elemento plasmonico (10) presenta un'altezza dell'ordine di grandezza del micron. Method according to claim 4, wherein said at least one plasmonic nano-element (10) has a height of the order of magnitude of the micron.

6. Metodo secondo la rivendicazione 5, in cui detto almeno un nano-elemento plasmonico (10) presenta un diametro dell'ordine di grandezza di un centinaio di nanometri. Method according to claim 5, wherein said at least one plasmonic nano-element (10) has a diameter of the order of magnitude of one hundred nanometers.

7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il passo operativo a) comprende il disporre una pluralità di nano-elementi plasmonici (10) a contatto con detta membrana cellulare (M). Method according to any one of the preceding claims, wherein the operative step a) comprises arranging a plurality of plasmonic nano-elements (10) in contact with said cell membrane (M).

8. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il passo operativo a) comprende il disporre una struttura comprendente un substrato (16) supportante detto almeno un nano-elemento plasmonico (10) a contatto con detta membrana cellulare (M). Method according to any one of the preceding claims, wherein the operative step a) comprises arranging a structure comprising a substrate (16) supporting said at least one plasmonic nano-element (10) in contact with said cell membrane (M).

9. Metodo secondo la rivendicazione 8, in cui il passo operativo a) comprende l'effettuare una coltura cellulare direttamente su detto substrato (16) in modo tale che detta membrana cellulare (M) si accresca a contatto con detto almeno un nano-elemento plasmonico (10). Method according to claim 8, wherein the operative step a) comprises carrying out a cell culture directly on said substrate (16) in such a way that said cell membrane (M) grows in contact with said at least one nano-element plasmonic (10).

10. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto almeno un nano-elemento plasmonico comprende una nano-antenna (10). Method according to any one of the preceding claims, wherein said at least one plasmonic nano-element comprises a nano-antenna (10).

11. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto almeno un nano-elemento plasmonico (10) è realizzato di un metallo nobile, o sue leghe. Method according to any one of the preceding claims, wherein said at least one plasmonic nano-element (10) is made of a noble metal, or its alloys.

12. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il passo operativo b) comprende le seguenti fasi: Method according to any one of the preceding claims, wherein the operating step b) comprises the following steps:

bl) emettere detto fascio di luce (B); e bl) emitting said light beam (B); And

b2) focalizzare detto fascio di luce (B) emesso attraverso un assieme ottico (14) in direzione di detto almeno un nano-elemento plasmonico (10). b2) focusing said beam of light (B) emitted through an optical assembly (14) in the direction of said at least one plasmonic nano-element (10).

13. Metodo secondo la rivendicazione 12, in cui detta fase bl) comprende l'emettere un fascio laser (B), preferibilmente del tipo ad impulsi. Method according to claim 12, wherein said step b1) comprises emitting a laser beam (B), preferably of the pulsed type.

14. Metodo secondo la rivendicazione 12 o 13, in cui la fase b2) comprende il dirigere detto fascio di luce (B) focalizzato verso una superficie di contatto (10a) fra detto nano-elemento plasmonico (10) e detta membrana cellulare (M). Method according to claim 12 or 13, wherein step b2) comprises directing said beam of light (B) focused towards a contact surface (10a) between said plasmonic nano-element (10) and said cell membrane (M ).

15. Metodo secondo la rivendicazione 14, in cui detta superficie di contatto comprende una porzione distale (10a) di detto nano-elemento plasmonico (10). Method according to claim 14, wherein said contact surface comprises a distal portion (10a) of said plasmonic nano-element (10).

16. Metodo secondo la rivendicazione 14 o 15, in cui detto fascio di luce (B) attraversa detta cellula (C) prima di raggiungere detta superficie di contatto (10a). Method according to claim 14 or 15, wherein said light beam (B) passes through said cell (C) before reaching said contact surface (10a).

17. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, comprendente inoltre il seguente passo operativo: Method according to any one of the preceding claims, further comprising the following operating step:

c) far passare una quantità di sostanza (S), ad esempio una quantità di un medicamento, attraverso detto almeno un nano-elemento plasmonico (10) e detto almeno poro (P) aperto su detta membrana cellulare (M). c) passing a quantity of substance (S), for example a quantity of a medicament, through said at least one plasmonic nano-element (10) and said at least pore (P) open on said cell membrane (M).

18. Metodo secondo la rivendicazione 17, in cui detto passo operativo c) comprende il far passare detta quantità di sostanza (S), proveniente dall'esterno di detta cellula (C), attraverso detto nano-elemento plasmonico (10) e detto poro (P) verso l'interno della cellula (C) nello spazio individuato da detta membrana cellulare (M). 18. Method according to claim 17, wherein said operative step c) comprises passing said quantity of substance (S), coming from the outside of said cell (C), through said plasmonic nano-element (10) and said pore (P) towards the inside of the cell (C) in the space identified by said cell membrane (M).

19. Metodo secondo la rivendicazione 17, in cui detto passo operativo c) comprende il far passare detta quantità di sostanza {S), proveniente dall'interno di detta cellula <C) nello spazio individuato da detta membrana cellulare (M), attraverso detto poro (P) e detto nano-elemento plasmonico (10) verso l'esterno di detta cellula (C). 19. Method according to claim 17, wherein said operative step c) comprises passing said quantity of substance (S), coming from inside said cell <C) into the space identified by said cell membrane (M), through said pore (P) and said plasmonic nano-element (10) towards the outside of said cell (C).

RIASSUNTO SUMMARY

Il metodo comprende i seguenti passi: a) disporre un nano-elemento plasmonico metallico (10) a contatto con una membrana cellulare (M) immersa in acqua o in una soluzione fisiologica e sulla cui superficie è destinato ad essere aperto un poro (P); e b) focalizzare per un periodo di tempo (T) compreso fra 1 fs e 10 ps un fascio di luce (B), quale ad esempio un fascio laser, sul nano-elemento plasmonico metallico (10). Il fascio di luce (B) ha una frequenza regolata alla frequenza plasmonica di risonanza del nano-elemento plasmonico metallico (10), affinché il fascio di luce (B) causi un'eccitazione plasmonica in elettroni appartenenti al nano-elemento plasmonico metallico (10) e ne promuova l'espulsione verso l'ambiente circostante aprendo un poro (P) sulla membrana cellulare (M). Da una parte, il fascio di luce (B) influenza mediante accelerazione ponderomotiva gli elettroni espulsi mediante eccitazione plasmonica e crea un'onda di pressione in detta acqua o in detta soluzione salina. Dall'altra parte, il fascio di luce <B) influenza direttamente gli elettroni espulsi mediante inverse bremsstrahlung e crea calore localizzato sul nano-elemento plasmonico metallico (10). The method includes the following steps: a) place a metallic plasmonic nano-element (10) in contact with a cell membrane (M) immersed in water or in a physiological solution and on whose surface a pore is intended to be opened (P) ; and b) focusing for a period of time (T) comprised between 1 fs and 10 ps a beam of light (B), such as for example a laser beam, on the metallic plasmonic nano-element (10). The light beam (B) has a frequency adjusted to the resonant plasmon frequency of the metallic plasmonic nano-element (10), so that the light beam (B) causes a plasmon excitation in electrons belonging to the metallic plasmonic nano-element (10). ) and promotes its expulsion towards the surrounding environment by opening a pore (P) on the cell membrane (M). On the one hand, the beam of light (B) influences the electrons expelled by plasmon excitation by means of weight-motive acceleration and creates a pressure wave in said water or in said saline solution. On the other hand, the light beam <B) directly affects the electrons expelled by inverse bremsstrahlung and creates localized heat on the metallic plasmonic nano-element (10).

Claims

CLAIMS 1, Method for opening pores in a cell membrane, said method comprising the following operating steps; a) place at least one metallic plasmonic nano-element (10) in contact - or in close proximity - with a cell membrane (M) immersed in water or in a physiological solution and on whose surface at least one pore is intended to be opened (P ); b) focus for a period of time {T) between 1 fs and 20 ps a beam of light (B), such as a laser beam, on said metal plasmonic nano-element (10), said beam of light (B ) having a frequency adjusted to the resonant plasmon frequency of said metallic plasmonic nano-element (10), so that said beam of light (B) causes a plasmon excitation in electrons belonging to said metallic plasmonic nano-element (10) and promotes it the expulsion towards the surrounding environment by opening at least one pore (P) on said cell membrane (M), in which simultaneously on the one hand, said beam of light (B) influences said electrons expelled by said plasmon excitation by means of weight-motive acceleration and creates a pressure wave in said water or in said saline solution, and on the other hand, said beam of light (B) directly affects said electrons expelled by inverse bremsstrahlung and creates localized heat on said metallic plasmonic nano-element (10).

Method according to claim 1, wherein said period of time (T) is less than or equal to about 0.1 ps and the contribution of said pressure wave obtained by weight-driven acceleration to open said at least one pore (P) is prevalent.

Method according to claim 1, wherein said period of time (T) is greater than or equal to about 1 ps and the contribution of said localized heat obtained by inverse bremsstrahlung to open said at least one pore (P) is prevalent,

Method according to any one of the preceding claims, wherein said at least one plasmonic nano-element (10) is three-dimensionally protruding and adheres tightly to said cell membrane (M).

Method according to claim 4, wherein said at least one plasmonic nano-element (10) has a height of the order of magnitude of the micron.

Method according to claim 5, wherein said at least one plasmonic nano-element (10) has a diameter of the order of magnitude of one hundred nanometers.

Method according to any one of the preceding claims, wherein the operative step a) comprises arranging a plurality of plasmonic nano-elements (10) in contact with said cell membrane (M).

Method according to any one of the preceding claims, wherein the operative step a) comprises arranging a structure comprising a substrate (16) supporting said at least one plasmonic nano-element (10) in contact with said cell membrane (M).

Method according to claim 8, wherein the operative step a) comprises carrying out a cell culture directly on said substrate (16) in such a way that said cell membrane (M) grows in contact with said at least one nano-element plasmonic (10).

Method according to any one of the preceding claims, wherein said at least one plasmonic nano-element comprises a nano-antenna (10).

Method according to any one of the preceding claims, wherein said at least one plasmonic nano-element (10) is made of a noble metal, or its alloys.

Method according to any one of the preceding claims, wherein the operating step b) comprises the following steps: bl) emitting said light beam (B); And b2) focusing said beam of light (B) emitted through an optical assembly (14) in the direction of said at least one plasmonic nano-element (10).

Method according to claim 12, wherein said step b1) comprises emitting a laser beam (B), preferably of the pulsed type.

Method according to claim 12 or 13, wherein step b2) comprises directing said beam of light (B) focused towards a contact surface (10a) between said plasmonic nano-element (10) and said cell membrane (M ).

Method according to claim 14, wherein said contact surface comprises a distal portion (10a) of said plasmonic nano-element (10).

Method according to claim 14 or 15, wherein said light beam (B) passes through said cell (C) before reaching said contact surface (10a).

Method according to any one of the preceding claims, further comprising the following operating step: c) passing a quantity of substance (S), for example a quantity of a medicament, through said at least one plasmonic nano-element (10) and said at least pore (P) open on said cell membrane (M).

18. Method according to claim 17, wherein said operative step c) comprises passing said quantity of substance (S), coming from the outside of said cell (C), through said plasmonic nano-element (10) and said pore (P) towards the inside of the cell (C) in the space identified by said cell membrane (M).

19. Method according to claim 17, wherein said operative step c) comprises passing said quantity of substance (S), coming from inside said cell <C) into the space identified by said cell membrane (M), through said pore (P) and said plasmonic nano-element (10) towards the outside of said cell (C).