ITUA20164238A1 - METHOD AND APPARATUS FOR THE DECELLULARIZATION OF ORGANS - Google Patents
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Description
“Metodo e apparato per la decellularizzazione di organi” "Method and apparatus for the decellularization of organs"
La presente invenzione ha per oggetto un metodo per la decelluarizzazione di organi ed un apparato per la realizzazione di tale metodo. The present invention relates to a method for decellulating organs and an apparatus for carrying out this method.
Stato dell’arte State of the art
Uno dei maggiori problemi che si presentano a seguito del trapianto di organi è quello del rigetto dell’organo impiantato a seguito dell’introduzione nell’organismo trapiantato di materiale biologico esogeno. Per questo motivo, la moderna biomedicina è alla continua ricerca di materiali in grado di mostrare struttura e composizione biochimica che imitano le proprietà dei tessuti naturali, senza condividerne le problematiche di incompatibilità tra un individuo e l’atro. Tuttavia, è ormai noto, ad esempio, che la creazione di un polmone artificiale avente le stesse caratteristiche di un polmone umano è difficile da ottenere anche sfruttando le tecnologie più innovative di stampa 3D. One of the major problems that arise following organ transplantation is that of rejection of the implanted organ following the introduction of exogenous biological material into the transplanted organism. For this reason, modern biomedicine is constantly looking for materials that can show biochemical structure and composition that mimic the properties of natural tissues, without sharing the problems of incompatibility between one individual and the other. However, it is now known, for example, that the creation of an artificial lung with the same characteristics of a human lung is difficult to achieve even by exploiting the most innovative 3D printing technologies.
Una direzione di ricerca alternativa è rappresentata dalla bioingegneria dei tessuti. In particolare, diverse ricerche sono state intraprese negli ultimi anni volte alla creazione di tessuti biocompatibili a partire da organi isolati prelevati da animali macellati o esseri umani deceduti. An alternative research direction is represented by tissue bioengineering. In particular, several researches have been undertaken in recent years aimed at creating biocompatible tissues starting from isolated organs taken from slaughtered animals or deceased human beings.
Il processo di decellularizzazione degli organi, ovvero la rimozione delle cellule e delle biomolecole antigeniche presenti nell’organo effettuata mediante l’uso di opportuni solventi, permette di ottenere matrici extracellulari (scaffolds) a base proteica che conservano la stessa morfologia degli organi originari dai quali sono state ottenute e che, una volta ri-cellularizzate, non inducono una risposta immunogenica una volta impiantate in un organismo differente, sia sotto forma di allotrapianto che di xenotrapianto. The process of organ decellularization, i.e. the removal of cells and antigenic biomolecules present in the organ carried out through the use of suitable solvents, allows to obtain protein-based extracellular matrices (scaffolds) that retain the same morphology of the original organs from which have been obtained and which, once re-cellularized, do not induce an immunogenic response once implanted in a different organism, either in the form of allograft or xenograft.
Sebbene i processi di decellularizzazione siano stati sviluppati piuttosto di recente, sono stati descritti metodi per la decellularizzazione di interi organi isolati, in particolare del cuore, come descritto in US 2012/0183944, oppure di tessuti, come descritto in US 2016/0022408. Although the decellularization processes have been developed rather recently, methods have been described for the decellularization of entire isolated organs, in particular of the heart, as described in US 2012/0183944, or of tissues, as described in US 2016/0022408.
I metodi di decellularizzazione impiegati sono piuttosto complessi e prevedono trattamenti molto lunghi degli organi. The decellularization methods used are rather complex and involve very long treatments of the organs.
In questo contesto, resta pertanto la necessità di provvedere metodi ulteriori per la decellularizzazione di organi, di facile attuabilità anche su larga scala. In this context, therefore, there remains the need to provide additional methods for the decellularization of organs, which are easy to implement even on a large scale.
Sommario dell’invenzione Summary of the invention
In un suo primo aspetto, la presente invenzione si riferisce ad un metodo per la decellularizzazione di un organo comprendente le fasi di: In a first aspect, the present invention refers to a method for the decellularization of an organ comprising the steps of:
(1) provvedere un organo; (1) provide an organ;
(2) trattare detto organo mediante una soluzione acquosa comprendente almeno un agente detergente, preferibilmente sodio dodecil solfato, in una concentrazione attiva tale da estrarre il materiale cellulare senza recare danni alla struttura di detto organo, ottenendo un organo decellularizzato; e (2) treating said organ by means of an aqueous solution comprising at least one cleaning agent, preferably sodium dodecyl sulfate, in an active concentration such as to extract the cellular material without damaging the structure of said organ, obtaining a decellularized organ; And
(3) lavare detto organo decellularizzato con acqua, (3) wash said decellularized organ with water,
detto metodo essendo caratterizzato dal fatto che la fase (3) di lavaggio viene condotta a temperatura 12°C, preferibilmente a temperatura di 4° 12°C, più preferibilmente di 8° - 10°C, rimuovendo l’almeno un agente detergente per precipitazione. said method being characterized in that the washing step (3) is carried out at a temperature of 12 ° C, preferably at a temperature of 4 ° 12 ° C, more preferably of 8 ° - 10 ° C, removing the at least one cleaning agent to precipitation.
In un suo secondo aspetto la presente invenzione si riferisce ad un apparato per la decellularizzazione di organi comprendente: In a second aspect, the present invention refers to an apparatus for the decellularization of organs comprising:
- una camera (1) configurata per essere pressurizzata; - a chamber (1) configured to be pressurized;
- un bioreattore (3) posto all’interno di detta camera (1) essendo detto bioreattore (3) configurato per essere ermeticamente chiuso; - a bioreactor (3) placed inside said chamber (1) being said bioreactor (3) configured to be hermetically closed;
- una prima linea di flusso comprendente una prima pompa (100), un tubo (110) e un tubo (130), in cui il tubo (110) è configurato per essere connesso ad un organo (2); - a first flow line comprising a first pump (100), a tube (110) and a tube (130), in which the tube (110) is configured to be connected to a member (2);
- una seconda linea di flusso comprendente una seconda pompa (200), un tubo (210) e un tubo (230); - a second flow line comprising a second pump (200), a tube (210) and a tube (230);
- un serbatoio (400) connesso alla pompa (200) per mezzo di un tubo (220); - a tank (400) connected to the pump (200) by means of a pipe (220);
- una terza linea di flusso comprendente un tubo (310). - a third flow line comprising a tube (310).
Descrizione dettagliata dell’invenzione Detailed description of the invention
La presente invenzione verrà di seguito illustrata anche con riferimento alle allegate figure, quali esempi non limitativi, in cui: The present invention will be illustrated below also with reference to the attached figures, as non-limiting examples, in which:
Figura 1: è una rappresentazione schematica di una forma realizzativa dell’apparato per la decellularizzazione di organi secondo l’invenzione; Figura 2A: riporta la rappresentazione schematica di una prima variante di forma realizzativa dell’apparato per la decellularizzazione di organi secondo l’invenzione in cui è presente una lampada UV (500); Figure 1: is a schematic representation of an embodiment of the apparatus for the decellularization of organs according to the invention; Figure 2A: shows the schematic representation of a first variant of the embodiment of the apparatus for the decellularization of organs according to the invention in which there is a UV lamp (500);
Figura 2B: riporta la rappresentazione schematica di una seconda variante di forma realizzativa dell’apparato per la decellularizzazione di organi secondo l’invenzione in cui è presente una lampada UV (500). Figure 2B: shows the schematic representation of a second variant of the embodiment of the apparatus for the decellularization of organs according to the invention in which there is a UV lamp (500).
In un suo primo aspetto, la presente invenzione si riferisce ad un metodo per la decellularizzazione di un organo isolato comprendente le fasi di: (1) provvedere un organo; In a first aspect thereof, the present invention relates to a method for the decellularization of an isolated organ comprising the steps of: (1) providing an organ;
(2) trattare detto organo mediante una soluzione acquosa comprendente almeno un agente detergente, preferibilmente sodio dodecil solfato, in una concentrazione attiva tale da estrarre il materiale cellulare senza recare danni alla struttura di detto organo, ottenendo un organo decellularizzato; e (2) treating said organ by means of an aqueous solution comprising at least one cleaning agent, preferably sodium dodecyl sulfate, in an active concentration such as to extract the cellular material without damaging the structure of said organ, obtaining a decellularized organ; And
(3) lavare detto organo decellularizzato con acqua, (3) wash said decellularized organ with water,
detto metodo essendo caratterizzato dal fatto che la fase (3) di lavaggio viene condotta a temperatura 12°C, preferibilmente a temperatura di 4° -12°C, più preferibilmente di 8° - 10°C, rimuovendo l’almeno un agente detergente per precipitazione. said method being characterized in that the washing step (3) is carried out at a temperature of 12 ° C, preferably at a temperature of 4 ° -12 ° C, more preferably of 8 ° - 10 ° C, removing the at least one cleaning agent by precipitation.
La fase (1) del metodo prevede di provvedere un organo. Nella presente descrizione e nelle allegate rivendicazioni, il termine “organo” si riferisce ad un organo intero isolato o una porzione di organo isolata, detto organo essendo preferibilmente scelto tra polmone, cuore, rene, fegato, pancreas, milza e pelle, in particolare cute e sottocute. Più preferibilmente detto organo può essere un organo intero scelto tra polmone e rene. Step (1) of the method involves providing an organ. In the present description and in the attached claims, the term "organ" refers to an isolated whole organ or an isolated portion of an organ, said organ being preferably selected from lung, heart, kidney, liver, pancreas, spleen and skin, in particular skin and subcutis. More preferably, said organ can be a whole organ selected from lung and kidney.
Detto organo può provenire da un essere umano deceduto, da un donatore umano vivente oppure da un animale, purché l’organo possieda dimensioni e struttura compatibili con il successivo xenotrapianto su un essere umano. This organ can come from a deceased human being, from a living human donor or from an animal, as long as the organ has dimensions and structure compatible with the subsequent xenotransplantation on a human being.
La fase (2) del metodo secondo l’invenzione comprende trattare detto organo mediante una soluzione acquosa comprendente almeno un agente detergente, preferibilmente sodio dodecil solfato (CAS: 151-21-3), in una concentrazione attiva tale da estrarre il materiale cellulare senza recare danni alla struttura di detto organo, ottenendo un organo decellularizzato. Nella presente descrizione e nelle rivendicazioni allegate, il termine “materiale cellulare” si riferisce al materiale che non costituisce la matrice extracellulare dell’organo sottoposto a decellularizzazione. Step (2) of the method according to the invention comprises treating said organ by means of an aqueous solution comprising at least one cleaning agent, preferably sodium dodecyl sulfate (CAS: 151-21-3), in an active concentration such as to extract the cellular material without causing damage to the structure of said organ, obtaining a decellularized organ. In this description and in the attached claims, the term "cellular material" refers to the material that does not constitute the extracellular matrix of the organ subjected to decellularization.
Nella presente descrizione il termine “acqua” si riferisce ad acqua avente grado di purezza per preparazioni iniettabili (WFI) secondo la Pharmacopea Europea. Detta acqua viene impiegata anche per la preparazione delle soluzioni acquose utilizzate nel metodo secondo l’invenzione. In the present description the term "water" refers to water having a degree of purity for injectable preparations (WFI) according to the European Pharmacopoeia. This water is also used for the preparation of the aqueous solutions used in the method according to the invention.
La fase (2) può avere una durata variabile da 4-5 ore fino a 12-16 ore, in funzione del tipo di organo sottoposto a trattamento. Secondo una variante, quando l’organo sottoposto a decellularizzazione è un rene, la fase (2) può avere una durata complessiva di 4-8 ore. Phase (2) can last from 4-5 hours up to 12-16 hours, depending on the type of organ being treated. According to a variant, when the organ subjected to decellularization is a kidney, phase (2) can have a total duration of 4-8 hours.
La fase (2) viene interrotta quando viene raggiunta la completa decellularizzazione dell’organo, la quale può essere determinata visivamente dal raggiungimento di una colorazione bianca e omogenea dell’organo decellularizzato. Phase (2) is interrupted when the complete decellularization of the organ is reached, which can be visually determined by the achievement of a homogeneous white color of the decellularized organ.
Alternativamente, la completa decellularizzazione dell’organo può essere determinata mediante analisi note al tecnico del ramo. Alternatively, the complete decellularization of the organ can be determined by means of analyzes known to the person skilled in the art.
La fase (2) viene generalmente attuata a temperatura ambiente. Nella presente descrizione e nelle rivendicazioni allegate, il termine “temperatura ambiente” si riferisce ad una temperatura di circa 20°-25°C. Step (2) is generally carried out at room temperature. In the present description and in the attached claims, the term "ambient temperature" refers to a temperature of about 20 ° -25 ° C.
La fase (3) del metodo prevede di lavare l’organo decellularizzato ottenuto al termine della fase (2) con acqua, in modo da rimuovere l’agente detergente. Phase (3) of the method involves washing the decellularized organ obtained at the end of phase (2) with water, in order to remove the cleaning agent.
Il metodo secondo l’invenzione è caratterizzato dal fatto che la fase (3) di lavaggio viene condotta a temperatura 12°C, preferibilmente a temperatura di 4° - 12°C, più preferibilmente di 8° - 10°C, rimuovendo per precipitazione l’almeno un agente detergente. The method according to the invention is characterized in that the washing step (3) is carried out at a temperature of 12 ° C, preferably at a temperature of 4 ° - 12 ° C, more preferably of 8 ° - 10 ° C, removing by precipitation the at least one cleaning agent.
Infatti, alla temperatura sopra indicata, la solubilità in acqua degli agenti detergenti utilizzati diminuisce sensibilmente, in particolare nel caso del sodio dodecil solfato. In fact, at the temperature indicated above, the solubility in water of the detergent agents used significantly decreases, in particular in the case of sodium dodecyl sulfate.
Inoltre, la bassa temperatura presenta il vantaggio di mantenere l’organo in un ambiente freddo, rallentando il processo di proliferazione batterica e/o virale, diminuendo quindi il rischio di contaminazione dell’organo decellularizzato da parte di agenti patogeni. Furthermore, the low temperature has the advantage of keeping the organ in a cold environment, slowing down the process of bacterial and / or viral proliferation, thus decreasing the risk of contamination of the decellularized organ by pathogens.
La fase (3) può avere una durata variabile in funzione dell’organo sottoposto a decellularizzazione. Il termine della fase (3) può essere determinato visivamente, ad esempio dall’assenza di bolle nel caso in cui venga utilizzato sodio dodecil solfato come agente detergente, oppure mediante determinazione analitica della concentrazione residua di detergente nella soluzione di lavaggio, mediante metodi noti al tecnico del ramo (ad esempio: Arand M., Friedberg T. e Oesch F., Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins, Anal. Biochem.207, 73–75 (1992)). Phase (3) can have a variable duration depending on the organ subjected to decellularization. The end of step (3) can be determined visually, for example by the absence of bubbles in the case in which sodium dodecyl sulfate is used as a cleaning agent, or by analytical determination of the residual concentration of detergent in the washing solution, by methods known to the skilled in the art (for example: Arand M., Friedberg T. and Oesch F., Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins, Anal. Biochem. 207, 73–75 (1992)) .
Al termine della fase (3) di lavaggio, l’organo decellularizzato può essere posto in una soluzione acquosa comprendente una concentrazione efficace di almeno un antibiotico, preferibilmente comprendente 2,000-6,000 µg/ml di almeno un antibiotico, in cui detto almeno un antibiotico può essere preferibilmente scelto tra streptomicina, penicillina, anfotericina e loro miscele ed opzionalmente refrigerato ad una temperatura - 4°C per preservarlo fino al successivo utilizzo. At the end of washing step (3), the decellularized organ can be placed in an aqueous solution comprising an effective concentration of at least one antibiotic, preferably comprising 2,000-6,000 µg / ml of at least one antibiotic, in which said at least one antibiotic can preferably be selected from streptomycin, penicillin, amphotericin and their mixtures and optionally refrigerated at a temperature - 4 ° C to preserve it until the next use.
Secondo una prima variante, il metodo secondo l’invenzione può comprendere prima della fase (2) almeno una ulteriore fase (1.a), comprendente trattare detto organo con acqua e/o almeno una ulteriore fase (1.b) comprendente trattare detto organo con una soluzione acquosa comprendente 2,000-6,000 µg/ml di almeno un antibiotico, preferibilmente detto antibiotico essendo scelto tra streptomicina, penicillina, anfotericina e loro miscele, in cui detta almeno una fase (1.a) e/o almeno una fase (1.b) è svolta a temperatura 12°C, preferibilmente a temperatura di 4° -12°C, più preferibilmente di 8° - 10°C. According to a first variant, the method according to the invention can comprise before step (2) at least one further step (1.a), comprising treating said organ with water and / or at least one further step (1.b) comprising treating said organ with an aqueous solution comprising 2,000-6,000 µg / ml of at least one antibiotic, preferably said antibiotic being selected from streptomycin, penicillin, amphotericin and their mixtures, in which said at least one phase (1.a) and / or at least one phase ( 1.b) is carried out at a temperature of 12 ° C, preferably at a temperature of 4 ° -12 ° C, more preferably of 8 ° - 10 ° C.
Secondo una variante preferita, può essere svolta almeno una prima fase (1.a) di lavaggio dell’organo da decellularizzare con acqua e almeno una una successiva fase (1.b) di trattamento di detto organo con una soluzione acquosa comprendente almeno un antibiotico come sopra descritto. According to a preferred variant, at least a first step (1.a) for washing the organ to be decellularized with water and at least one subsequent step (1.b) for treating said organ with an aqueous solution comprising at least one antibiotic can be carried out. as described above.
La durata complessiva della fase (1.a) e/o (1.b) può variare tra 24 e 72 ore, in funzione del tipo di organo sottoposto a decellularizzazione secondo il presente metodo. Secondo una variante, quando l’organo sottoposto a decellularizzazione è un rene, la durata complessiva della fase (1.a) e/o (1.b) può essere di 36 - 60 ore, preferibilmente di circa 48 ore. Nella variante del metodo secondo l’invenzione in cui vengono svolte una prima fase (1.a) e una seconda fase (1.b) come sopra descritte, dette fasi (1.a) e (1.b) possono avere uguale durata, preferibilmente di circa 24 ore ciascuna. The overall duration of phase (1.a) and / or (1.b) can vary between 24 and 72 hours, depending on the type of organ subjected to decellularization according to this method. According to a variant, when the organ subjected to decellularization is a kidney, the overall duration of phase (1.a) and / or (1.b) can be 36 - 60 hours, preferably about 48 hours. In the variant of the method according to the invention in which a first phase (1.a) and a second phase (1.b) are carried out as described above, said phases (1.a) and (1.b) can have the same duration , preferably of about 24 hours each.
Secondo una ulteriore variante, la fase (2) del metodo di decellularizzazione secondo l’invenzione può comprendere: According to a further variant, step (2) of the decellularization method according to the invention may include:
- effettuare un primo trattamento di detto organo mediante una soluzione comprendente 1,00 – 3,00% in peso, preferibilmente circa 2% in peso, di almeno un agente detergente, preferibilmente sodio dodecil solfato, per un tempo fino a 5 ore, preferibilmente compreso tra 3 e 4 ore; - carry out a first treatment of said organ by means of a solution comprising 1.00 - 3.00% by weight, preferably about 2% by weight, of at least one cleaning agent, preferably sodium dodecyl sulfate, for a time of up to 5 hours, preferably between 3 and 4 hours;
- interrompere detto primo trattamento ed effettuare un secondo trattamento di detto organo mediante una soluzione comprendente 0,05 – 0,50 % in peso, preferibilmente 0,2% in peso, di almeno un agente detergente, preferibilmente sodio dodecil solfato, fino a completa decellularizzazione dell’organo. - interrupting said first treatment and carrying out a second treatment of said organ by means of a solution comprising 0.05 - 0.50% by weight, preferably 0.2% by weight, of at least one cleaning agent, preferably sodium dodecyl sulfate, until complete decellularization of the organ.
La fase (2) può essere svolta a temperatura ambiente. Step (2) can be carried out at room temperature.
Secondo una ulteriore variante del metodo secondo l’invenzione, la fase (3) di lavaggio, e/o l’almeno una fase (1.a) e/o (1.b) quando presenti, possono essere svolte sotto irraggiamento UV. L’irraggiamento UV è ottenuto mediante lampade note, disponibili in commercio. Il trattamento con raggi ultravioletti ha lo scopo di disinfettare sia l’ambiente in cui viene svolto il metodo, sia le soluzioni acquose impiegate. Questa variante del metodo secondo l’invenzione prevede l’utilizzo di un apparato per la decellularizzazione di organi come in seguito descritto in cui almeno il tubo (230), e opzionalmente anche almeno il tubo (220), sono realizzati in materiale trasparente alle radiazioni UV. According to a further variant of the method according to the invention, the washing phase (3), and / or at least one phase (1.a) and / or (1.b) when present, can be carried out under UV radiation. UV irradiation is obtained using known commercially available lamps. The treatment with ultraviolet rays aims to disinfect both the environment in which the method is carried out and the aqueous solutions used. This variant of the method according to the invention provides for the use of an apparatus for the decellularization of organs as described below in which at least the tube (230), and optionally also at least the tube (220), are made of a material transparent to radiation UV.
Secondo una ulteriore variante, il metodo secondo l’invenzione può essere attuato all’interno di un ambiente chiuso mantenuto ad una pressione positiva rispetto alla pressione atmosferica (camera pressurizzata), impedendo all’aria ambientale carica di agenti patogeni di penetrare all’interno dell’ambiente in cui il metodo viene attuato. La pressione presente all’interno dell’apparato di decellularizzazione può essere preferibilmente compresa tra 0,11 e 0,15 MPa. According to a further variant, the method according to the invention can be carried out inside a closed environment maintained at a positive pressure with respect to the atmospheric pressure (pressurized chamber), preventing the ambient air loaded with pathogens from penetrating inside the environment in which the method is implemented. The pressure present inside the decellularization apparatus can preferably be between 0.11 and 0.15 MPa.
Secondo una forma di attuazione particolarmente preferita, il metodo di decellularizzazione secondo l’invenzione può comprendere le fasi di: According to a particularly preferred embodiment, the decellularization method according to the invention may include the steps of:
(I) - collegare un organo (2) ad una prima pompa (100) per mezzo di un tubo (110) e posizionare detto organo all’interno di un bioreattore (3); - collegare il tubo (130) alla pompa (100) e posizionare detto tubo all’interno del bioreattore (3); (I) - connect an organ (2) to a first pump (100) by means of a tube (110) and place said organ inside a bioreactor (3); - connect the tube (130) to the pump (100) and place said tube inside the bioreactor (3);
(II) - introdurre nel bioreattore (3) una soluzione acquosa comprendente almeno un agente detergente, preferibilmente sodio dodecil solfato, in una concentrazione attiva tale da estrarre il materiale cellulare senza recare danni alla struttura di detto organo; (II) - introducing into the bioreactor (3) an aqueous solution comprising at least one detergent agent, preferably sodium dodecyl sulfate, in an active concentration such as to extract the cellular material without causing damage to the structure of said organ;
- stabilire un primo flusso mediante la pompa (100) aspirando detta soluzione acquosa dal bioreattore (3) per mezzo di un tubo (130) e immettendo detta soluzione acquosa all’interno dell’organo (2) per mezzo del tubo (110); - establish a first flow by means of the pump (100) by aspirating said aqueous solution from the bioreactor (3) by means of a tube (130) and by introducing said aqueous solution inside the organ (2) by means of the tube (110);
- stabilire un secondo flusso mediante una seconda pompa (200) aspirando detta soluzione acquosa dal bioreattore (3) per mezzo di un tubo (230) e immettendo detta soluzione acquosa nel bioreattore (3) per mezzo di un tubo (210); e - establishing a second flow by means of a second pump (200) by sucking said aqueous solution from the bioreactor (3) by means of a tube (230) and introducing said aqueous solution into the bioreactor (3) by means of a tube (210); And
- mantenere detto primo flusso e detto secondo flusso fino ad ottenere un organo completamente decellularizzato; - maintaining said first flow and said second flow until a completely decellularized organ is obtained;
(III) - sostituire la soluzione acquosa presente nel bioreattore (3) con acqua; (III) - replace the aqueous solution present in the bioreactor (3) with water;
- stabilire un primo flusso mediante la pompa (100) aspirando detta soluzione acquosa dal bioreattore (3) per mezzo di un tubo (130) e immettendo detta soluzione acquosa in detto organo (2) per mezzo del tubo (110); - establishing a first flow by means of the pump (100) by aspirating said aqueous solution from the bioreactor (3) by means of a tube (130) and introducing said aqueous solution into said organ (2) by means of the tube (110);
- stabilire un secondo flusso mediante la seconda pompa (200) aspirando acqua da un serbatoio (400) per mezzo del tubo (220) e immettendo acqua nel bioreattore (3) per mezzo del tubo (210); - establishing a second flow by means of the second pump (200) by sucking water from a tank (400) by means of the tube (220) and introducing water into the bioreactor (3) by means of the tube (210);
- stabilire un terzo flusso rimuovendo l’almeno un agente detergente dal fondo del bioreattore (3) per mezzo di un tubo (310); - establish a third flow by removing the at least one cleaning agent from the bottom of the bioreactor (3) by means of a tube (310);
- mantenere detto primo flusso, secondo e terzo flusso fino ad eliminazione dell’almeno un agente detergente dal bioreattore (3), detto metodo essendo caratterizzato dal fatto che la fase (3) viene condotta a temperatura 12°C, preferibilmente a temperatura di 4° - 12°C, più preferibilmente di 8° - 10°C, rimuovendo l’almeno un agente detergente per precipitazione. - maintaining said first flow, second and third flow until elimination of the at least one detergent agent from the bioreactor (3), said method being characterized in that step (3) is carried out at a temperature of 12 ° C, preferably at a temperature of 4 ° - 12 ° C, more preferably 8 ° - 10 ° C, removing the at least one cleaning agent by precipitation.
Detto metodo può essere attuato mediante un apparato per la decellularizzazione di organi come schematizzato in Figura 1. Said method can be implemented by means of an apparatus for the decellularization of organs as shown schematically in Figure 1.
L’organo sottoposto a decelularizzazione può essere un organo intero isolato o una porzione di organo isolato, detto organo essendo preferibilmente scelto tra polmone, cuore, rene, fegato, pancreas, milza e pelle, in particolare cute e sottocute; preferibilmente detto organo è un organo intero scelto tra polmone e rene. Secondo una variante, la fase (I) può essere attuata collegando il tubo (110) all’arteria principale dell’organo (2). The organ subjected to decelularization can be a whole isolated organ or a portion of an isolated organ, said organ being preferably selected from lung, heart, kidney, liver, pancreas, spleen and skin, in particular skin and subcutis; preferably said organ is a whole organ selected from lung and kidney. According to a variant, step (I) can be implemented by connecting the tube (110) to the main artery of the organ (2).
La fase (II) può essere attuata trattando l’organo con una soluzione acquosa comprendente 0,05 – 3,00 % in peso, più preferibilmente 0,10 – 2,50%, ancor più preferibilmente circa 2,00 % in peso dell’almeno un agente detergente. Step (II) can be carried out by treating the organ with an aqueous solution comprising 0.05 - 3.00% by weight, more preferably 0.10 - 2.50%, even more preferably about 2.00% by weight of the at least one cleaning agent.
Secondo una variante preferita, l’almeno un agente detergente può essere sodio dodecil solfato. According to a preferred variant, the at least one cleaning agent can be sodium dodecyl sulfate.
Secondo una variante della forma di attuazione particolarmente preferita, la fase (II) può comprendere: According to a variant of the particularly preferred embodiment, step (II) can comprise:
- introdurre nel bioreattore (3) 1,00 – 3,00% in peso, preferibilmente circa 2,00% in peso, di almeno un agente detergente, preferibilmente sodio dodecil solfato; - introducing 1.00 - 3.00% by weight, preferably about 2.00% by weight, of at least one cleaning agent, preferably sodium dodecyl sulfate, into the bioreactor (3);
- stabilire un primo flusso mediante la pompa (100) aspirando detta soluzione acquosa dal bioreattore (3) per mezzo di un tubo (130) e immettendo detta soluzione acquosa all’interno dell’organo (2) per mezzo del tubo (110); - establish a first flow by means of the pump (100) by aspirating said aqueous solution from the bioreactor (3) by means of a tube (130) and by introducing said aqueous solution inside the organ (2) by means of the tube (110);
- stabilire un secondo flusso mediante una seconda pompa (200) aspirando detta soluzione acquosa dal bioreattore (3) per mezzo di un tubo (230) e ri-immettendo detta soluzione acquosa nel bioreattore (3) per mezzo di un tubo (210); - establishing a second flow by means of a second pump (200) by sucking said aqueous solution from the bioreactor (3) by means of a tube (230) and re-introducing said aqueous solution into the bioreactor (3) by means of a tube (210);
- mantenere detto primo flusso e detto secondo flusso fino a parziale decellularizzazione dell’organo, preferibilmente per un tempo fino a 5 ore, più preferibilmente compreso tra 3 e 4 ore; - maintain said first flow and said second flow until the organ is partially decellularized, preferably for up to 5 hours, more preferably between 3 and 4 hours;
- sostituire la soluzione acquosa presente nel bioreattore (3) con una soluzione acquosa comprendente 0,05 – 0,50 % in peso, preferibilmente 0,20% in peso, di almeno un agente detergente, preferibilmente sodio dodecil solfato; - replacing the aqueous solution present in the bioreactor (3) with an aqueous solution comprising 0.05 - 0.50% by weight, preferably 0.20% by weight, of at least one cleaning agent, preferably sodium dodecyl sulfate;
- ristabilire il primo e il secondo flusso come sopra descritti e mantenere detto primo e detto secondo flusso fino ad ottenere un organo completamente decellularizzato. - re-establishing the first and second flows as described above and maintaining said first and second flows until a completely decellularized organ is obtained.
La fase (II) può essere svolta a temperatura ambiente. Phase (II) can be carried out at room temperature.
Secondo una ulteriore variante, la forma di attuazione particolarmente preferita del metodo di decellularizzazione può comprendere a monte della fase (II) According to a further variant, the particularly preferred embodiment of the decellularization method may comprise upstream of step (II)
almeno una ulteriore fase (I.a) comprendente: at least one further step (I.a) comprising:
- introdurre acqua nel bioreattore (3); - introducing water into the bioreactor (3);
- stabilire un primo flusso mediante la pompa (100) aspirando l’acqua dal bioreattore (3) per mezzo di un tubo (130) e immettendo l’acqua all’interno di detto organo (2) per mezzo del tubo (110); - establish a first flow by means of the pump (100) by sucking the water from the bioreactor (3) by means of a tube (130) and placing the water inside said organ (2) by means of the tube (110);
- stabilire un secondo flusso mediante una seconda pompa (200) aspirando l’acqua dal bioreattore (3) per mezzo di un tubo (230) e riimmettendo l’acqua nel bioreattore (3) per mezzo di un tubo (210); e - mantenere detto primo e detto secondo flusso per un tempo compreso tra 18 e 36 ore, preferibilmente per circa 24 ore; - establish a second flow using a second pump (200) by sucking the water from the bioreactor (3) by means of a tube (230) and reintroducing the water into the bioreactor (3) by means of a tube (210); and - maintaining said first and said second flow for a time comprised between 18 and 36 hours, preferably for about 24 hours;
e/o almeno una ulteriore fase (I.b) comprendente: and / or at least one further step (I.b) comprising:
- introdurre nel bioreattore (3) una soluzione acquosa comprendente 2,000-6,000 µg/ml di almeno un antibiotico, preferibilmente scelto tra streptomicina, penicillina, anfotericina e loro miscele; - introducing into the bioreactor (3) an aqueous solution comprising 2,000-6,000 µg / ml of at least one antibiotic, preferably selected from streptomycin, penicillin, amphotericin and their mixtures;
- stabilire un primo flusso mediante la pompa (100) aspirando la soluzione acquosa dal bioreattore (3) per mezzo di un tubo (130) e immettendo detta soluzione acquosa all’interno di detto organo (2) per mezzo del tubo (110); - establish a first flow by means of the pump (100) by aspirating the aqueous solution from the bioreactor (3) by means of a tube (130) and by introducing said aqueous solution inside said organ (2) by means of the tube (110);
- stabilire un secondo flusso mediante una seconda pompa (200) aspirando la soluzione acquosa dal bioreattore (3) per mezzo di un tubo (230) e immettendo la soluzione acquosa nel bioreattore (3) per mezzo di un tubo (210); e - establishing a second flow by means of a second pump (200) by sucking the aqueous solution from the bioreactor (3) by means of a tube (230) and introducing the aqueous solution into the bioreactor (3) by means of a tube (210); And
- mantenere detto primo e detto secondo flusso per un tempo compreso tra 18 e 36 ore, preferibilmente per circa 24 ore, - maintaining said first and said second flow for a time comprised between 18 and 36 hours, preferably for about 24 hours,
detta fase (I.a) e/o (I.b) essendo svolte a temperatura 12°C, preferibilmente a temperatura di 4° - 12°C, più preferibilmente di 8° - 10°C. Preferibilmente, nella forma di attuazione particolarmente preferita del metodo secondo l’invenzione, può essere svolta una fase (I. a) seguita da una fase (I. b). said phase (I.a) and / or (I.b) being carried out at a temperature of 12 ° C, preferably at a temperature of 4 ° - 12 ° C, more preferably of 8 ° - 10 ° C. Preferably, in the particularly preferred embodiment of the method according to the invention, a step (I. a) can be carried out followed by a step (I. b).
Preferibilmente, detto secondo flusso della fase (II) e/o delle fasi (I.a) e/o (I.b) quando presenti, può essere stabilito aspirando mediante la pompa (200) la soluzione acquosa comprendente l’almeno un agente detergente dal fondo del bioreattore (3) e immettendo detta soluzione acquosa nel cielo del bioreattore (3) oppure immediatamente sotto il livello del liquido presente nel bioreattore per mezzo del tubo (210). Preferably, said second flow of phase (II) and / or of phases (I.a) and / or (I.b) when present, can be established by sucking by the pump (200) the aqueous solution comprising the at least one detergent agent from the bottom of the bioreactor (3) and introducing said aqueous solution into the top of the bioreactor (3) or immediately below the level of the liquid present in the bioreactor by means of the tube (210).
Nella sua forma di attuazione particolarmente preferita, il metodo secondo l’invenzione può essere attuato utilizzando un apparato come schematizzato nelle Figure 2A e 2B. In its particularly preferred embodiment, the method according to the invention can be implemented using an apparatus as schematized in Figures 2A and 2B.
Secondo la forma di attuazione schematizzata in Figura 2A, il secondo flusso della fase (II), e opzionalmente anche il secondo flusso della fase (I.a) e/o (I.b) quando presenti, può essere sottoposto ad irraggiamento per mezzo di almeno una lampada UV (500), detta lampada essendo posizionata a valle oppure, preferibilmente, a monte della pompa (200) rispetto alla direzione del flusso. Quando presenti, anche il secondo flusso della fase (I.a) e/o (I.b) può essere sottoposto a irraggiamento UV per mezzo dell’almeno una lampada (500). According to the embodiment schematized in Figure 2A, the second flow of phase (II), and optionally also the second flow of phase (I.a) and / or (I.b) when present, can be subjected to irradiation by means of at least one lamp UV (500), said lamp being positioned downstream or, preferably, upstream of the pump (200) with respect to the flow direction. When present, even the second flow of the phase (I.a) and / or (I.b) can be subjected to UV irradiation by means of at least one lamp (500).
Nella forma di realizzazione schematizzata in Figura 2B, il secondo flusso della fase (II) e/o il secondo flusso della fase (III), e opzionalmente anche il secondo flusso della fase (I.a) e/o (I.b) quando presenti, può essere sottoposto ad irraggiamento per mezzo di almeno una lampada UV (500), detta lampada essendo posizionata a valle oppure, preferibilmente, a monte della pompa (200) rispetto alla direzione del flusso. Anche Secondo una variante preferita, il secondo flusso delle fasi (I.a), (I.b) e (III) può essere sottoposto ad irraggiamento UV per mezzo di almeno una lampada (500). In the embodiment schematized in Figure 2B, the second flow of phase (II) and / or the second flow of phase (III), and optionally also the second flow of phase (I.a) and / or (I.b) when present, can be subjected to irradiation by means of at least one UV lamp (500), said lamp being positioned downstream or, preferably, upstream of the pump (200) with respect to the flow direction. Also according to a preferred variant, the second flow of phases (I.a), (I.b) and (III) can be subjected to UV irradiation by means of at least one lamp (500).
Nella fase (III) il terzo flusso può essere stabilito rimuovendo l’almeno un agente detergente dal fondo del bioreattore (3) per mezzo di un tubo (310), il quale può essere collegato ad una ulteriore pompa (non rappresentata in Figura 1 e in Figura 2). Tuttavia, secondo una ulteriore variante preferita, il metodo secondo l’invenzione può essere attuato all’interno di una camera (1) configurata per essere portata ad una pressione positiva rispetto alla pressione ambientale. Secondo questa forma di attuazione, la pressione positiva presente nella camera (1) permetterà l’instaurarsi di detto terzo flusso, senza la necessità di utilizzare una ulteriore pompa. In step (III) the third flow can be established by removing the at least one cleaning agent from the bottom of the bioreactor (3) by means of a tube (310), which can be connected to a further pump (not shown in Figure 1 and in Figure 2). However, according to a further preferred variant, the method according to the invention can be implemented inside a chamber (1) configured to be brought to a positive pressure with respect to the ambient pressure. According to this embodiment, the positive pressure present in the chamber (1) will allow the establishment of said third flow, without the need to use an additional pump.
Quando l’organo sottoposto a decellularizzazione è cute o sottocute, il primo flusso delle fasi (II), (III), nonché e delle fasi (I.a) e (I.b) quando presenti non viene stabilito in quanto non necessario per il trattamento dell’organo. When the organ subjected to decellularization is skin or subcutis, the first flow of phases (II), (III), and of phases (I.a) and (I.b) when present is not established as it is not necessary for the treatment of organ.
In un suo secondo aspetto la presente invenzione si riferisce ad un apparato per la decellularizzazione di organi come illustrato in Figura 1, in cui detto apparato comprende: In a second aspect, the present invention refers to an apparatus for the decellularization of organs as illustrated in Figure 1, in which said apparatus comprises:
- una camera (1) configurata per essere pressurizzata; - a chamber (1) configured to be pressurized;
- un bioreattore (3) posto all’interno di detta camera (1) essendo detto bioreattore (3) configurato per essere ermeticamente chiuso; - a bioreactor (3) placed inside said chamber (1) being said bioreactor (3) configured to be hermetically closed;
- una prima linea di flusso comprendente una prima pompa (100), un tubo (110) e un tubo (130), in cui il tubo (110) è configurato per essere connesso ad un organo (2); - a first flow line comprising a first pump (100), a tube (110) and a tube (130), in which the tube (110) is configured to be connected to a member (2);
- una seconda linea di flusso comprendente una seconda pompa (200), un tubo (210) e un tubo (230); - a second flow line comprising a second pump (200), a tube (210) and a tube (230);
- un serbatoio (400) connesso alla pompa (200) per mezzo di un tubo (220); - a tank (400) connected to the pump (200) by means of a pipe (220);
- una terza linea di flusso comprendente un tubo (310). - a third flow line comprising a tube (310).
Secondo una variante preferita dell’apparato secondo l’invenzione, detta seconda linea di flusso può comprendere almeno una lampada UV (500), posta a monte e/o a valle della pompa (200). According to a preferred variant of the apparatus according to the invention, said second flow line may include at least one UV lamp (500), placed upstream and / or downstream of the pump (200).
In Figura 2 è illustrata una variante particolarmente preferita dell’apparato secondo l’invenzione, in cui detta almeno una lampada UV (500) è posizionata a monte della pompa (200) rispetto alla direzione del flusso stabilito nella seconda linea di flusso. Figure 2 shows a particularly preferred variant of the apparatus according to the invention, in which said at least one UV lamp (500) is positioned upstream of the pump (200) with respect to the flow direction established in the second flow line.
Secondo una ulteriore variante, l’apparato secondo l’invenzione può comprendere una pluralità di lampade UV posizionate all’interno della camera (1) in posizione tale da permettere l’irraggiamento dell’intera superficie del bioreattore. According to a further variant, the apparatus according to the invention can comprise a plurality of UV lamps positioned inside the chamber (1) in a position that allows the irradiation of the entire surface of the bioreactor.
Preferibilmente, i tubi (210), (220) e (230), e opzionalmente anche i tubi (110), (130) e (310) utilizzati nell’apparato secondo l’invenzione, possono essere tubi flessibili in materiali polimerici, preferibilmente in silicone. Detti tubi sono trasparenti ai raggi UV, così da permettere l’irraggiamento dei fluidi che scorrono all’interno. Preferably, the tubes (210), (220) and (230), and optionally also the tubes (110), (130) and (310) used in the apparatus according to the invention, can be flexible tubes made of polymeric materials, preferably silicone. These tubes are transparent to UV rays, so as to allow the irradiation of the fluids that flow inside.
Secondo una ulteriore variante, nell’apparato secondo l’invenzione possono essere utilizzate pompe peristaltiche. According to a further variant, peristaltic pumps can be used in the apparatus according to the invention.
L’invenzione è di seguito descritta mediante un esempio non limitativo di attuazione. The invention is described below by means of a non-limiting example of implementation.
Esempio 1 Example 1
La decellularizzazione completa di un rene è stata eseguita utilizzando un apparato come schematizzato in Figura 2B. La camera (1) durante l’intero processo di decellularizzazione è stata mantenuta ad una pressione di 0,12 MPa. The complete decellularization of a kidney was performed using an apparatus as schematized in Figure 2B. The chamber (1) during the entire decellularization process was maintained at a pressure of 0.12 MPa.
(I) – l’arteria principale di un rene è stata collegata alla pompa (100) mediante un tubo al silicone (110). Successivamente, l’organo è stato posizionato all’interno di un bioreattore in vetro del volume di circa 25 litri; - il tubo (130) è stato collegato alla pompa (100) e posizionato a sua volta all’interno del bioreattore; (I) - the main artery of a kidney was connected to the pump (100) by means of a silicone tube (110). Subsequently, the organ was placed inside a glass bioreactor with a volume of about 25 liters; - the tube (130) was connected to the pump (100) and positioned in turn inside the bioreactor;
(I.a) – circa 15 litri di acqua sono stati introdotti nel bioreattore e il bioreattore è stato sigillato ermeticamente; (I.a) - about 15 liters of water were introduced into the bioreactor and the bioreactor was hermetically sealed;
- un primo flusso è stato stabilito azionando la pompa (100) in modo da aspirare l’acqua mediante il tubo (130) con una portata di 80 ml/min. e pompando l’acqua aspirata nell’arteria del polmone mediante il tubo (110); - un secondo flusso è stato stabilito aspirando l’acqua dal tubo (230) avente l’estremità libera posta sul fondo del bioreattore con la seconda pompa (200) con una portata di 300 ml/min. e reimmettendo l’acqua nel bioreattore attraverso il tubo (210) avente l’estremità libera in prossimità del livello superiore del liquido; - a first flow was established by operating the pump (100) in order to suck the water through the tube (130) with a flow rate of 80 ml / min. and pumping the water sucked into the lung artery through the tube (110); - a second flow was established by sucking the water from the tube (230) having the free end placed on the bottom of the bioreactor with the second pump (200) with a flow rate of 300 ml / min. and reintroducing the water into the bioreactor through the tube (210) having the free end near the upper level of the liquid;
- i due flussi sono stati mantenuti per circa 24 ore, mantenendo l’apparato ad una temperatura di circa 8°-10°C. Durante la fase (I.a) la lampada UV (500) è stata mantenuta accesa per sterilizzare l’acqua del secondo flusso; - the two flows were maintained for about 24 hours, keeping the apparatus at a temperature of about 8 ° -10 ° C. During phase (I.a) the UV lamp (500) was kept on to sterilize the water of the second flow;
(I.b) – l’acqua presente nel bioreattore è stata sostituita con 15 litri di acqua contenente 500 ml di una soluzione acquosa contenente: (I.b) - the water present in the bioreactor was replaced with 15 liters of water containing 500 ml of an aqueous solution containing:
90 µg/ml streptomicina; 90 µg / ml streptomycin;
50 µg/ml penicillina; e 50 µg / ml penicillin; And
25 µg/ml anfotericina 25 µg / ml amphotericin
- il primo e il secondo flusso sono stati ristabiliti come descritto sopra per la fase (I.a); - the first and second flows have been re-established as described above for step (I.a);
- i due flussi sono stati mantenuti per circa 24 ore, mantenendo l’apparato ad una temperatura di circa 8°-10°C. Durante la fase (I.b) la lampada UV (500) è stata mantenuta accesa per sterilizzare l’acqua del secondo flusso; - the two flows were maintained for about 24 hours, keeping the apparatus at a temperature of about 8 ° -10 ° C. During phase (I.b) the UV lamp (500) was kept on to sterilize the water of the second flow;
(II) – la soluzione acquosa contenente gli antibiotici è stata rimossa dal bioreattore e sostituita con circa 15 litri di una soluzione acquosa contenente circa 2,00 % in peso di sodio dodecil solfato; (II) - the aqueous solution containing the antibiotics was removed from the bioreactor and replaced with about 15 liters of an aqueous solution containing about 2.00% by weight of sodium dodecyl sulfate;
- il primo ed il secondo flusso sono stati stabiliti come sopra descritto per la fase (I.a); - the first and second flows have been established as described above for step (I.a);
- i due flussi sono stati mantenuti fino a quando l’organo ha presentato una parziale decellularizzazione (circa 3-4 ore), mantenendo l’apparato ad a temperatura ambiente, in assenza di irraggiamento UV; - the two flows were maintained until the organ presented a partial decellularization (about 3-4 hours), keeping the apparatus at room temperature, in the absence of UV radiation;
- la soluzione acquosa presente nel bioreattore è stata sostituita con circa 15 litri di una soluzione acquosa contenente sodio dodecil solfato alla concentrazione di circa 0,20 % in peso; - the aqueous solution present in the bioreactor was replaced with about 15 liters of an aqueous solution containing sodium dodecyl sulfate at a concentration of about 0.20% by weight;
- il primo ed il secondo flusso sono stati stabiliti come sopra descritto per la fase (I.a); - the first and second flows have been established as described above for step (I.a);
- i due flussi sono stati mantenuti fino a completa decellularizzazione del polmone (l’organo diventa completamente bianco, la durata è di circa ulteriori 3-4 ore), mantenendo l’apparato ad a temperatura ambiente, in assenza di irraggiamento UV; - the two flows were maintained until complete decellularization of the lung (the organ becomes completely white, the duration is about a further 3-4 hours), keeping the apparatus at room temperature, in the absence of UV radiation;
(III) – la soluzione acquosa presente nel bioreattore è stata sostituita don circa 15 litri di acqua; (III) - the aqueous solution present in the bioreactor has been replaced with about 15 liters of water;
- un primo flusso di acqua attraverso l’organo è stato stabilito come descritto nella fase (I.a); - a first flow of water through the organ was established as described in step (I.a);
- un secondo flusso è stato stabilito aspirando acqua da un serbatoio (400) mediante il tubo (220) e immettendo l’acqua nel bioreattore per mezzo di un tubo (210) collegato alla pompa (200); - a second flow was established by sucking water from a tank (400) through the tube (220) and introducing the water into the bioreactor by means of a tube (210) connected to the pump (200);
- un terzo flusso è stato stabilito utilizzando il tubo (310) per allontanare il sodio dodecil solfato che precipita sul fondo del bioreattore. Non è stato necessario utilizzare alcuna pompa, poiché la sovrappressione presente all’interno della camera (1) favorisce il deflusso del fluido dall’interno della camera; - a third flow was established using the tube (310) to remove the sodium dodecyl sulfate which precipitates on the bottom of the bioreactor. It was not necessary to use any pump, since the overpressure present inside the chamber (1) favors the outflow of fluid from inside the chamber;
- i tre flussi sono stati mantenuti fino a completa rimozione del sodio dodecil solfato dal bioreattore (indicato dalla scomparsa della schiuma inizialmente presente), mantenendo l’apparato ad una temperatura di circa 8°-10°C. Durante la fase (III) la lampada UV (500) è stata mantenuta accesa per sterilizzare l’acqua del secondo flusso. - the three flows were maintained until complete removal of sodium dodecyl sulfate from the bioreactor (indicated by the disappearance of the foam initially present), keeping the apparatus at a temperature of about 8 ° -10 ° C. During phase (III) the UV lamp (500) was kept on to sterilize the water of the second flow.
Terminata la fase (III), l’organo è stato staccato dai tubi, posto in una soluzione contenente gli stessi antibiotici indicati nella fase (I.b) alle stesse concentrazioni, e posto in un refrigeratore per il successivo utilizzo. At the end of phase (III), the organ was detached from the tubes, placed in a solution containing the same antibiotics indicated in phase (I.b) at the same concentrations, and placed in a refrigerator for subsequent use.
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| ITUA2016A004238A ITUA20164238A1 (en) | 2016-06-09 | 2016-06-09 | METHOD AND APPARATUS FOR THE DECELLULARIZATION OF ORGANS |
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| US20030087428A1 (en) * | 1999-06-07 | 2003-05-08 | Lloyd Wolfinbarger | Process for decellularizing soft-tissue engineered medical implants, and decellularized soft-tissue medical implants produced |
| GB2443938A (en) * | 2006-11-16 | 2008-05-21 | Univ Leeds | Preparation of meniscal implant tissue |
| US20120183944A1 (en) * | 2009-03-31 | 2012-07-19 | Regents Of The Univeristy Of Minnesota | Decellularization and recellularization of organs and tissues |
-
2016
- 2016-06-09 IT ITUA2016A004238A patent/ITUA20164238A1/en unknown
Patent Citations (3)
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