ITTO20120673A1 - Metodo per l'ottenimento di nanoemulsioni ultrastabili - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

del brevetto per invenzione industriale dal titolo:

“METODO PER L'OTTENIMENTO DI NANOEMULSIONI ULTRASTABILIâ€

La presente invenzione à ̈ relativa ad un metodo che permette di ottenere in modo semplice nanoemulsioni, tipicamente di olio, grasso e lipidi in genere, in acqua, che rimangono stabili per tempi dell’ordine dell’anno e più.

Con il termine “nanoemulsioni†qui e di seguito si intendono emulsioni nelle quali le goccioline di olio/grasso che risultano disperse nella fase acquosa presentano dimensioni sub micrometriche, che variano da 50 a 1000 nm, tipicamente tra 100 e 500 nm ed in cui l’emulsione risultante presenta un indice di polidispersità (indice di dispersione - nel seguito PDI) che, sebbene non venga tipicamente specificato e dipenda dalla qualità del prodotto, à ̈ generalmente basso e può arrivare al limite superiore fino ad un valore pari a circa 0.3 .

Oggi, lo sviluppo di nano-sistemi in grado di trasportare e rilasciare sostanze bioattive sta suscitando un grande interesse e sta diventando uno degli obiettivi più importanti in numerose industrie, principalmente industria alimentare, cosmetica e farmaceutica. Per esempio, la capacità di incapsulare materiali (ad esempio liposolubili) può essere sfruttata nell'industria alimentare per produrre cibo al contempo sano e gustoso oppure, nell'industria cosmetica, per migliorare la stabilità di vari ingredienti cosmetici (come acidi grassi insaturi, vitamine) e migliorare la penetrazione di alcuni di questi ingredienti, come le vitamine, aumentare l'efficacia e la tollerabilità di filtri UV sulla superficie della pelle e rendere il prodotto esteticamente più gradevole. Inoltre, à ̈ noto che le dimensioni ideali di veicoli di somministrazione di farmaci anti-tumorali sono pure quelle nanometriche, in particolare sotto 200 nm.

Un altro requisito fondamentale per ottenere sospensioni stabili à ̈ quello della monodispersità, essenziale per poter ottenere una somministrazione affidabile e precisa di farmaci.

In definitiva, nano-emulsioni consistenti in piccole goccioline lipidiche disperse in un mezzo acquoso, possono essere già di per sé adatte come base di molti tipi di alimenti (ad esempio latte, panna, bevande, condimenti, aromi), così come di cosmetici (creme, latte, gel) e di prodotti farmaceutici (iniettabili sia a scopo nutritivo che terapeutico o anche preventivo quali coadiuvanti di vaccini, inalabili previa nebulizzazione, applicabili per via transdermica, oftalmici, ecc..), purché si consegua una stabilità accettabile dell’emulsione.

Infatti, dopo l’ottenimento della emulsione, le goccioline lipidiche tendono a ri-aggregarsi per varie cause, formando goccioline più grosse a danno di quelle più piccole (fenomeno noto come “maturazione†di Ostwald) o aggregati più grandi (flocculazione) oppure possono tendere a raccogliersi sulla superficie dell’emulsione (fenomeno noto con il termine di “creaming†). Uno dei metodi più usati per prevenire la destabilizzazione à ̈ l'uso di un tensioattivo o surfattante (emulsionante), il quale viene adsorbito sulla superficie delle goccioline appena formate riducendone la tensione interfacciale e formando, nel caso in cui il surfattante sia di tipo anionico o cationico, intorno alle stesse uno strato protettivo elettricamente carico, che può aiutare a prevenirne l’aggregazione. Una recente strategia per migliorare la stabilità delle emulsioni à ̈ quella di rivestire le gocce lipidiche con uno strato polimerico, cosa che può essere ottenuta formando una emulsione “secondaria†, cioà ̈ rimescolando l’emulsione “primaria†ottenuta in precedenza aggiungendo alla stessa un polielettrolita avente polarità opposta a quella del surfattanteusato in precedenza [David Julian McClements. Theoretical Analysis of Factors Affecting the Formation and Stability of Multilayered Colloidal Dispersions. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids, 2005; Vol. 21, Issue 21; pp 9777-9785]. Il giusto dosaggio di polielettrolita à ̈ ritenuto di fondamentale importanza: infatti, se il polielettrolita à ̈ presente in quantità insufficiente esso non riveste completamente le singole gocce lipidiche e/o non riveste tutte le gocce, promuovendo ancora più facilmente i fenomeni di coalescenza; analogamente se la quantità di polielettrolita à ̈ eccessiva si possono verificare fenomeni di flocculazione che destabilizzano comunque il sistema. La “giusta†quantità di polielettrolita à ̈ in linea teorica quella che produce un completo rivestimento della superficie delle gocce di olio senza rilevante eccesso di polimero in soluzione. Tale concentrazione viene rilevata, nello stato dell’arte, in modo empirico, misurando il cosiddetto “potenziale Z†in quanto si à ̈ osservato che questo parametro sale, in valore assoluto, con l’aumentare della concentrazione di polielettrolita, per poi raggiungere un massimo in corrispondenza della concentrazione che, in teoria, permetterebbe di rivestire con un monostrato polimerico l’intera superficie di tutte le gocce lipidiche presenti nell’emulsione; tale concentrazione à ̈ nota come “concentrazione di saturazione†. Tuttavia, si à ̈ anche riscontrato che raggiungere la concentrazione di saturazione non implica il raggiungimento di una stabilità adeguata e, soprattutto, permanente nel tempo in quanto, per motivi cinetici, prima che tutto il polimero si depositi, gocce parzialmente rivestite possono coalescere. Per ovviare a questo problema si opera normalmente in regime di sovra saturazione di polieletrolita. L’emulsione secondaria ottenuta in questo modo ha basso PDI ma risulta comunque instabile per lunghi periodi perché il polielettrolita non à ̈ omogeneamente distribuito e depositato sulla fase dispersa in fase di miscelazione.

Scopo del trovato à ̈ quello di superare i limiti dell’arte nota permettendo di ottenere emulsioni stabili nel tempo ed in cui le goccioline lipidiche presentano dimensioni nanometriche e tra loro comparabili e, quindi, presentanti un indice di polidispersità relativamente basso, preferibilmente non superiore a 0,1.

L’invenzione à ̈ dunque relativa ad un metodo per ottenere nano emulsioni ultrastabili secondo quanto specificato nella rivendicazione 1.

In particolare il metodo secondo l’invenzione comprende le fasi di:

i)- disperdere una prima quantità di una prima sostanza fluida in una seconda quantità, superiore alla prima quantità, di una seconda sostanza fluida non miscibile con la prima sostanza fluida, in presenza di almeno un emulsionante ionico avente preferibilmente affinità chimico-fisica con la prima sostanza fluida, in modo da formare una emulsione primaria di gocce di dimensioni nanometriche della prima sostanza fluida in una fase omogenea definita dalla seconda sostanza fluida e sulle quali gocce à ̈ adsorbito almeno parte di detto almeno un emulsionante ionico; e

ii)- miscelare l’emulsione primaria così formata con una soluzione di un polielettrolita nella seconda sostanza fluida, il polielettrolita essendo scelto in modo da avere una polarità opposta a quella dell’almeno un emulsionante ionico, in modo da formare una emulsione secondaria in cui le gocce della prima sostanza fluida sono rivestite almeno in parte da uno strato polimerico di polielettrolita.

Secondo il trovato, inoltre, il metodo dell’invenzione comprende le fasi di:

iii)- lasciare riposare la emulsione secondaria precedentemente ottenuta; e

iv)- processare l’emulsione secondaria in modo da ridisperdere la prima sostanza fluida nella seconda sostanza fluida sotto l’effetto di un elevato sforzo di taglio.

Qui e di seguito per “elevato sforzo di taglio†si deve intendere la sollecitazione meccanica che viene normalmente applicata ad una sostanza fluida durante il passaggio in un omogeneizzatore ad alta pressione, operante a pressioni di poco inferiori a 1000 bar.

Inoltre, secondo un aspetto non secondario del trovato, ed in combinazione con quanto sopra esposto, nella fase ii) la concentrazione in peso in polielettrolità nella seconda sostanza fluida à ̈ scelta in modo da essere sensibilmente maggiore della concentrazione teorica di polielettrolita necessaria a saturare l’emulsione primaria (nota nel campo tecnico come “concentrazione di saturazione†); tale “concentrazione di saturazione†viene rilevata sperimentalmente in precedenza, in base ad una misura del “potenziale Z†effettuata in modo noto su una pluralità di campioni di emulsione secondaria preparati con concentrazioni crescenti di polielettrolita. In particolare, per “sensibilmente maggiore†si deve intendere qui e nel seguito una concentrazione almeno doppia o tripla della “concentrazione di saturazione†e, preferibilmente, più grande di un ordine di grandezza alla concentrazione di saturazione calcolata in precedenza in base ad una misura di potenziale Z.

L’invenzione à ̈ infine relativa anche ad una nanoemulsione ultrastabile che à ̈ stata ottenuta secondo il metodo dell’invenzione e che comprende una prima quantità di una prima sostanza fluida dispersa in una seconda quantità, superiore alla prima quantità, di una seconda sostanza fluida non miscibile con la prima sostanza fluida; la nanoemulsione contenendo inoltre almeno un emulsionante ionico adsorbito su rispettive gocce della prima sostanza fluida disperse nella seconda sostanza fluida ed almeno un polielettrolita avente polarità opposta a quella dell’emulsionante ionico e che forma un rivestimento polimerico intorno alle gocce della prima sostanza fluida; la nano emulsione dell’invenzione presentando, in combinazione, le seguenti caratteristiche fisico-chimiche misurabili: una dimensione delle gocce della prima sostanza fluida rivestite dall’emulsionante ionico e dal polielettrolita compresa tra 50 e 300 nm; una distribuzione dimensionale delle gocce tale che la nano emulsione presenta un indice di polidispersità inferiore a 0,1; ed una stabilità nel tempo dei valori dimensionali delle gocce della prima sostanza fluida superiore a 1 anno.

In particolare, secondo un aspetto del trovato, si possono ottenere nano emulsione del tipo suddetto, in cui le gocce della prima sostanza fluida disperse nella seconda sostanza fluida presentano almeno tre strati di rivestimento (e fino ad oltre dieci strati) includenti, a partire dall’interno verso l’esterno, un primo strato che forma un rivestimento polimerico intorno alle gocce sulle quali à ̈ adsorbito l’emulsionate ionico, costituito da un polielettrolita avente polarità opposta a quella dell’emulsionante ionico; almeno un secondo strato costituito da un polisaccaride avente polarità opposta a quella del polielettrolita che forma il secondo strato; ed almeno un terzo strato costituito preferibilmente dal medesimo polielettrolita che forma il primo strato.

Ulteriori caratteristiche e vantaggi della presente invenzione appariranno chiari dalla descrizione che segue di suoi esempi di realizzazione non limitativi fornita a puro titolo esemplificativo ed effettuata con riferimento alle figure dei disegni annessi, nei quali:

- La figura 1 illustra con uno schema a blocchi le fasi principali del metodo secondo il trovato; e

- La figura 2 à ̈ un diagramma che illustra le proprietà di elevata stabilità nel tempo della nano emulsione secondo il trovato a differenti concentrazioni di un componente.

Con riferimento alla figura 1, il metodo secondo il trovato comprende una prima fase, rappresentata da un blocco 100, in cui viene effettuata, mediante un omogeneizzatore ad alta pressione, operante ad esempio a circa 2000 bar, di tipo sostanzialmente noto, la dispersione di una prima quantità di un prima sostanza fluida, tipicamente una sostanza lipidica, in una seconda quantità, superiore alla prima quantità, di una seconda sostanza fluida non miscibile con la prima, ad esempio acqua od una soluzione acquosa, in presenza di almeno un emulsionante ionico di qualsiasi tipo noto avente preferibilmente affinità chimico-fisica con la prima sostanza fluida.

Nell’esempio non limitativo illustrato la prima sostanza fluida à ̈ un olio e la seconda sostanza fluida à ̈ acqua; in questo modo, all’uscita dal blocco 100 si ottiene una emulsione primaria 101 (rappresentata dalla freccia ed illustrata schematicamente e fuori scala sotto al blocco 100) di gocce 102 di dimensioni nanometriche della prima sostanza fluida in una fase omogenea 103 definita dalla seconda sostanza fluida e sulle quali gocce 102 à ̈ adsorbito almeno parte dell’emulsionante ionico (surfattante), non illustrato per semplicità. Per conseguire tale risultato, l’emulsione primaria 101 viene riciclata più volte, secondo la freccia 104, nel blocco 100, in modo che la prima sostanza fluida viene ri-dispersa più volte nella seconda Successivamente, l’emulsione primaria 101 viene miscelata, in una seconda fase del metodo, rappresentata da un blocco 200, con una soluzione di un polielettrolita nella seconda sostanza fluida; il poliettrolita à ̈ scelto in modo da avere una polarità opposta a quella dell’emulsionante ionico, in modo che si forma all’uscita del blocco 200 una emulsione secondaria 201 in cui le gocce 102 della prima sostanza fluida sono rivestite almeno in parte da uno strato polimerico di polielettrolita, non illustrato per semplicità. Tale fase viene eseguita con un agitatore magnetico.

Secondo un aspetto del trovato, la fase eseguita al blocco 100 à ̈ preceduta da una fase di pre-emulsione, illustrata da un blocco 300 in cui l’emulsionante ionico (surfattante) viene preventivamente sciolto nella prima sostanza fluida e questa soluzione viene poi aggiunta lentamente alla seconda sostanza fluida. Questa miscela viene sottoposta a sonicazione; nella miscela (preemulsione 301) così ottenuta vi sono forti differenze dimensionali nella fase dispersa. La pre-emulsione 301 viene passata più volte nell’omogenizzatore ad alta pressione per ottenere l’emulsione primaria 101.

La nano emulsione 201 uscente dal blocco 200 non à ̈ ancora stabile nel tempo e potrebbe essere soggetta a rapido deterioramento delle caratteristiche di costanza dimensionale delle gocce 102, rendendola di fatto inutilizzabile.

Secondo il trovato, pertanto, in un successivo blocco 400, la nano emulsione secondaria 201, dopo essere stata lasciata riposare per un periodo di tempo prefissato, viene processata mediante impiego di un omogenizzatore ad alta pressione operante ad esempio a circa 700 bar, in modo da ri-disperdere più volte la prima sostanza fluida nella seconda sostanza fluida sotto l’effetto di un elevato sforzo di taglio, eseguendo in 400 una pluralità di passaggi successivi 401. Alla fine si ottiene una nano emulsione secondaria “processata†201b che, a differenza della precedente nano emulsione 201, à ̈ ora sorprendentemente stabile nel tempo in quanto, come schematicamente rappresentato in figura 1, le gocce 102 di fase dispersa (olio) sono uniformemente distribuite nella matrice 103 anche per tempi lunghi. La nano emulsione secondaria 201b à ̈ dunque una nano emulsione secondaria stabilizzata.

Si à ̈ riscontrato che tale stabilità nel tempo migliora ulteriormente se le fasi di riposo e di ri-dispersione con riciclo in 400 e 401 vengono ripetute, dopo la prima esecuzione, almeno una volta e, preferibilmente, almeno due volte.

Secondo una ulteriore caratteristica dell’invenzione, per ottenere il sorprendente risultato sopra descritto la concentrazione in peso in polielettrolità nella seconda sostanza fluida al momento della miscelazione in 200 à ̈ scelta in modo da essere sensibilmente maggiore di una concentrazione teorica di polielettrolita nota come “concentrazione di saturazione†, corrispondente alla concentrazione di polielettrolita necessaria a teoricamente saturare l’emulsione primaria, cioà ̈ a rivestire tutte le gocce 102.

Tale “concentrazione di saturazione†, che dipende ovviamente dalla natura chimico-fisica delle prima e seconda sostanza, del polielettrolita e dell’emulsionante ionico, viene rilevata sperimentalmente, in precedenza, secondo una metodologia nota ai tecnici del ramo, in base ad una misura di potenziale Z effettuata su una pluralità di campioni di emulsione secondaria 201 preparati con concentrazioni crescenti di polielettrolita.

Di preferenza, la concentrazione in peso in polielettrolita nella seconda sostanza fluida à ̈ scelta intorno ad un ordine di grandezza superiore alla concentrazione di saturazione calcolata in precedenza in base ad una misura di potenziale Z.

Per ottenere le nano emulsioni 101 e 201b si utilizza un omogeneizzatore ad alta pressione operante ad una prima pressione, che viene scelta in base alla natura chimicofisica delle prima e seconda sostanza fluida e che à ̈ comunque compresa tra 1000 e 3000 bar, preferibilmente tra 1500 e 2000 bar, per l’ottenimento della nano emulsione 101; ed operante ad una seconda pressione, che viene scelta in base alla natura chimico-fisica delle prima e seconda sostanza fluida, ma che à ̈ comunque minore della prima pressione, compresa tra 200 e 1500 bar, preferibilmente tra 500 e 1200 bar e, ancora più preferibilmente, tra 700 e 1000 bar per l’ottenimento della nano emulsione 201b; inoltre, la prima e la seconda sostanza fluida vengono fatte passare nell’omogeneizzatore più volte di seguito, in modo da eseguire da 3 a 15 cicli completi di omogeneizzazione per ottenere la nano emulsione 101 e in modo da eseguire almeno 10 cicli completi di omogeneizzazione per ottenere la nano emulsione 201b.

Per “ciclo completo†si deve intendere il passaggio attraverso l’omogeneizzatore della intera quantità presente di sostanze in lavorazione. Nel caso in cui si lavorino, come ad esempio in laboratorio, quantitativi ridotti di sostanze, per tener conto della quantità di emulsione che rimarrebbe intrappolata nell’omogeneizzatore, si eseguono le operazioni di ricircolo in 104 e 401 in modo “continuo†, alimentando il flusso in uscita dall’omogeneizzatore direttamente al “reservoir†in ingresso dell’omogeneizzatore stesso. In questo caso, i 10-15 cicli completi prima menzionati possono corrispondere a 50-200 passaggi o “step†di ricircolo in continuo delle sostanza in lavorazione attraverso l’omogeneizzatore, come il tecnico del ramo può facilmente ricavare avendo a disposizione i dati tecnici dell’omogeneizzatore utilizzato e conoscendo i quantitativi di sostanze in lavorazione..

Ovviamente cambiando il volume di partenza il numero di step necessari deve essere individuato di nuovo verificando il numero di step che minimizzano dimensioni e PDI. Al contrario per i cicli completi questi rimangono indipendenti dal volume in quanto il liquido passa interamente senza rimiscelare quello che sta uscendo con quello che ancora non à ̈ stato processato e sta nel reservoir. Non si esclude di utilizzare eventualmente combinazioni dei due tipi di ciclo: cicli completi e in continuo.

La fase di riposo che avviene tra i blocchi 200 e 400 può coprire un intervallo temporale compreso tra alcune ore ed 1 mese.

Nella pratica, la nano emulsione 201 viene lasciata riposare, prima di eseguirne il processamento in 400, per 1 giorno; mentre, i successivi ri-processamenti dopo il primo vengono eseguiti dopo fasi di riposo che possono durare da una settimana ad un mese.

Secondo la preferita forma di attuazione del trovato, la prima sostanza fluida à ̈ una sostanza lipidica (ad esempio olio di soia) e la seconda sostanza fluida à ̈ una sostanza acquosa (ad esempio acqua distillata od una soluzione acquosa); in questo caso l’emulsionante ionico à ̈ scelto nel gruppo consistente in: lecitina di soia, lecitina arricchita con fosfatidilcolina (PC) e/o fosfatidiletanolammina (PE); e loro miscele; eventualmente la seconda sostanza fluida può essere addizionata con glicerolo, pectina o altri addensanti. Inoltre, il polielettrolita à ̈ scelto tra i polielettroliti biodegradabili, quali polisaccaridi e proteine. Alcuni esempi sono il chitosano, la polilisina, l’eparina, gli alginati, ad esempio alginato di sodio.

In definitiva, si à ̈ riscontrato che, con le sostanze sopra specificate, i parametri del metodo sopra descritto di cui occorre tenere conto per ottenere nano emulsioni stabili di buona qualità sono i seguenti:

- Pressione dell’omogeneizzatore in 400: la pressione ottimale dipende dall’interazione tra il polimero e la superficie dell’emulsione (su cui c’à ̈ in questo caso lecitina). Tanto più à ̈ forte l’interazione tanto più à ̈ possibile spingersi in alto con la pressione senza rischio che del polimero vada a distaccarsi dalla superficie producendo un peggioramento, piuttosto che un miglioramento nella monodispersione. Nel nostro caso la pressione ottimale à ̈ risultata quella compresa tra 700 e 1000 bar. Pressioni più basse non riescono a garantire un’efficace disgregazione degli aggregati deboli. Pressioni più alte portano invece addirittura a un peggioramento. Non à ̈ escluso che per altre formulazioni con interazioni diverse sia possibile estendere l’intervallo di pressioni utili anche tra 200 e 1500 bar.

- Numero di cicli di ridispersione (in 401): anche in questo caso à ̈ possibile individuare un numero ottimale di cicli. Per esempio si à ̈ sperimentalmente osservato in laboratorio che un numero di cicli in continuo o “step†pari a 100 può essere ottimale, atteso che un numero inferiore ha prodotto i benefici voluti, mentre un numero superiore poteva produrre un effetto simile a quello di pressioni troppo elevate ovvero di peggioramento nella dispersione. In generale, si può affermare che un numero di cicli in continuo o “step†adatto à ̈ compreso tra 50 e 200 e, più preferibilmente, tra 75 e 150, ma non si possono escludere intervalli ottimali più ampi nel caso di formulazioni diverse. In definitiva, il numero di cicli dipende dal tipo di cicli e dal tipo di macchinario (ad esempio dal volume del reservoir). Si determina pertanto andando a verificare il numero di cicli per cui si ottiene il PDI minimo. Inoltre, à ̈ possibile, come già indicato, combinare cicli completi e “in continuo†, come prima definiti.

- Numero di ridispersioni e distanza temporale tra le ridispersioni: si à ̈ visto che con un doppio processo di ridispersione a distanza di qualche giorno/settimana à ̈ stato possibile migliorare ulteriormente la stabilità del prodotto. Il numero di ripetizioni delle fasi di riposo e ridispersione può dunque considerarsi compreso tra 1 e 5, con distanza temporale tra una ridispersione e l’altra da poche ore ad 1 mese. Un intervallo temporale di qualche ora non sempre à ̈ ottimale, in quanto, probabilmente, le cinetiche non hanno garantito ancora il raggiungimento di una configurazione di parziale stabilità su cui operare. Troppo tempo (>1 mese) potrebbe nel frattempo portare ad aggregati stabili che non si possono più recuperare neppure con il riprocessamento.

Con il metodo descritto, grazie al riprocessamento, si ottiene una emulsione secondaria stabilizzata che diventa un’ottima base per eseguire in modo analogo una deposizione di multistrato di polielettrolita di carica opposta, ad esempio per specifici settori tecnologici, quale quello farmaceutico. In questo caso, le gocce della prima sostanza fluida disperse nella seconda sostanze fluida presentano alla fine, oltre allo strato di surfattante, almeno tre strati di rivestimento includenti, a partire dall’interno verso l’esterno, un primo strato che forma un rivestimento polimerico e costituito dal polielettrolita avente polarità opposta a quella dell’emulsionante ionico; almeno un secondo strato costituito da un polisaccaride avente polarità opposta a quella del polielettrolita che forma il secondo strato; ed almeno un terzo strato costituito da un polisaccaride avente polarità opposta a quella del polielettrolita che forma il secondo strato

Si sono ottenute in via preliminare, per esempio, nano emulsioni in cui il primo strato polimerico à ̈ formato da chitosano il secondo strato polimerico à ̈ formato da alginato di sodio oppure eparina ed in cui un terzo strato à ̈ formato da chitosano.

L’invenzione verrà ora ulteriormente descritta tramite una serie di esempi pratici di attuazione.

ESEMPI

Si preparano una serie di emulsioni O/W (oil in water) utilizzando olio di soia (densità a 20 °C di 0,922 g / ml) e tensioattivo Lipoid E80 (lecitina di uova in polvere all’80-85% in peso arricchito con fosfatidilcolina (PC) e 7-9,5% in peso di contenuto in fosfatidiletanolammina (PE ) come indicato nella specifica di fabbricazione) acquistati dalla ditta Lipoid e usati senza ulteriore purificazione. Acqua distillata Millipore® “Milli-Q†à ̈ stata utilizzata per la preparazione di tutte le emulsioni e soluzioni. Come polielettroliti si utilizza Chitosano (CT, LMW 90-150 kDa, DDA 84% determinato mediante 1H-NMR), il quale à ̈ un copolimero lineare casuale di D-glucosamina e N-acetil-D-glucosammina (pKa circa 6,7)

Per prima à ̈ stata preparata una fase oleosa con l'aggiunta di una certa quantità di Lipoid E 80, precedentemente pesato con una bilancia di precisione, ad un volume di olio di soia. La fase oleosa à ̈ stata miscelata (per 10 minuti a una temperatura di 60° C e ad una velocità di 500 rpm) utilizzando un miscelatore ad alta velocità (RZR 2102 control, Heidolph), e poi, dopo aver raggiunto la temperatura ambiente, à ̈ stata sonicata per 1,5 min (ampiezza sonicazione del 60%, e miscelata con il sonicatore impulsi in on-off di 10 s) con un sonicatore ad immersione (processore ultrasuoni VCX 500 o 750). Per ottenere la pre-emulsione, la fase oleosa à ̈ stata aggiunta progressivamente ad una quantità pesata di fase acquosa (acqua Milli-Q) sotto sonicazione durante i primi 3 minuti (sonicazione ampiezza del 70%; impulsi-on e un impulso -off rispettivamente di 10 e 5 s) e poi per altri 5 minuti alle stesse condizioni. Per evitare il surriscaldamento della pre-emulsione durante la sonicazione, la preparazione à ̈ stata eseguita in un grande beker intorno a cui à ̈ stata creata una camicia di ghiaccio.

La medesima procedura à ̈ stata eseguita per verifica con tecniche alternative (Turrax, Silverson), che permettono di trattare volumi superiori rispetto al sonicatore ad immersione, ottenendo risultati simili.

La pre-emulsione à ̈ stata infine passata a 2000 bar attraverso un omogeneizzatore a valvola ad alta pressione (Microfluidics M110PS) per primi tre singoli cicli per ridurre fortemente la dimensione iniziale e quindi l’operazione à ̈ stata ripetuta ri-riempiendo in modo continuo il serbatoio per diversi passaggi, così da riciclare il prodotto senza alcuna perdita di volume; recuperando piccoli volumi di emulsione dopo 50, 100, 150 e 200 ricircoli o step successivi. Questi volumi sono stati prelevati per monitorare la migliore condizione di processo e alla fine il migliore risultato à ̈ stato quello a 200 step. Questo numero à ̈ arbitrario visto che dipende dal volume che si ri-processa. Il criterio guida à ̈ dunque quello di verificare la minima dimensione ed il minimo PDI raggiunti con il prelievo dei volumetti individuando una volta per tutte il numero di step ottimali.

Questo metodo à ̈ stato utilizzato per la preparazione di tutte le emulsioni olio-in-acqua a diverse concentrazioni di fase olio (10% in peso, 20% in peso, 30% in peso). Le emulsioni con olio a differente concentrazione di lecitina sono classificate in base al rapporto “Lipoid fase E80/oil†che rimane costante a tutte le concentrazioni di olio, come riportato in Tabella 1.

TABELLA 1

Emulsione Lipoid E80 /Fase Oleosa

(g/ml)

nome

L1 0.06

L2 0.12

L3 0.18

L4 0.24

L5 0.3

Una soluzione all’1% in peso di chitosano (CT) in una soluzione di acido acetico e acqua a pH 2,5 (0,5 M acido acetico) viene preparata sciogliendo 500 mg di chitosano purificato ed essiccato in 50 ml di soluzione acquosa di acido acetico (0,10 M).

Emulsione Secondaria: Per valutare la concentrazione ottimale di chitosano da depositare, secondo il “metodo di saturazione†soluzioni 0,5M di acido acetico a concentrazioni diverse di chitosano (0,0025%, 0,005%, 0,00,875 mila%, 0,0125%, 0,025%, 0,05%, 0,0875% , 0,125% 0,250%, 0,5%, 0,875%, 1,25% in peso) sono state preparate e portate a pH 4 con NaOH 24M. Volumi di 9 ml di queste soluzioni sono stati diluiti 1:4 con una soluzione a pH 4 di acido acetico, portandoli a 36 ml. Quindi 9 ml di emulsione primaria diluita al 5% in fase olio sono stati aggiunti rapidamente ai 36 ml di soluzione sotto vigorosa agitazione, mantenendo il tutto sotto agitazione per 15 minuti per consentire la deposizione uniforme di chitosano. Il pH delle emulsioni finali secondarie à ̈ uguale a 4. Le emulsioni così ottenute sono state passate attraverso l’omogeneizzatore ad alta pressione a valvola usato in precedenza, ma a 700 bar di pressione per 100 cicli o step di ricircolo in continuo, e quindi dopo un mese ritrattate alle stesse condizioni.

Il “potenziale Z†delle nano capsule (gocce rivestite) formanti l’emulsione à ̈ stata determinata utilizzando uno strumento di elettroforesi delle particelle (ZetaDim.r zs nano series ZEN 3600, Malvern Instruments Ltd., Malvern, Regno Unito). Il potenziale Z viene determinato misurando la direzione e la velocità di movimento delle goccioline in un campo elettrico ben definito. I potenziali Z misurati sono riportati come media e deviazione standard di 3 misurazioni ciascuna di 50 corse). Prima delle misurazione le emulsioni vengono diluite ad una concentrazione in gocce dello circa 0,025% in peso usando acqua Milli-Q come pure soluzioni di acido acetico in Milli-Q (ph 4, 6,5x10-4M). La distribuzione dimensionale delle emulsioni e relative nanocapsule à ̈ stata misurata usando uno strumento laser a dispersione dinamica della luce(DLS) (λ = 632.8 nm). Questo strumento correla le fluttuazioni di intensità I(t) di luce dispersa nel tempo con il moto browniano delle particelle colloidali e poi con il coefficiente di diffusione D legato al raggio idrodinamico Rh delle particelle. Per evitare effetti di diffusione à ̈ stato utilizzato un angolo di rilevamento di 173°. Un indice di rifrazione a rapporto predefinito (1,52) à ̈ stato utilizzato nei calcoli della distribuzione granulometrica. Per ogni misurazione la dimensione delle particelle à ̈ riportata come dimensione media e l'indice di polidispersità (PDI) à ̈ su 3 misure ciascuna su 5 piste (1 corsa per pista per 100 s).

Le diverse concentrazioni indicate sono state testate su emulsioni di cinque dimensioni diverse, che sono state

riprocessate la prima volta dopo un giorno di riposo; poi

parte di questo volume à ̈ stato riprocessato per una seconda

volta dopo un mese.

I risultati ottenuti sono riportati nelle sottostanti

tabelle 2 e 3.

Tabella 2. emulsioni al 20% in fase olio.

L1 L2 L3 L4 L5 Condizioni di

Processo Oil Di Z-pot. Di Z-pot. Di Z-pot. Di Z-pot. Di Z-pot.

m. PDI [mV] m. PDI [mV] m. PDI [mV] m. PDI [mV] m. PDI [mV] [nm [nm [nm [nm [nm

] ] ] ] ]

Ciclo 0 437 0.44 -42.7 317 0.38 -43.8 299 0.41 -42.9 261 0.37 -46.3 265 0.39-42.9Ciclo 1 239 0.14 -48.9 201 0.17 -43.8 181 0.13 -40.9 156 0.14 -40.1 151 0.15-43 Ciclo 2212 0.09 -40 180 0.12 -43.1 167 0.09 -40.9 143 0.13 -43.6 141 0.14-45.6<Ciclo 3>206 0.08 -40.3 172 0.09 -41.9 161 0.1 -34.1 134 0.11 -43.4 134 0.13-43.1Ciclo 3 50 steps20% 181 0.06 -43.9 150 0.07 -41.4 132 0.08 -40.2 109 0.12 -43.4 107 0.12-37.9Ciclo 3 100 steps 168 0.04 -42.5 133 0.07 -39.5 115 0.07 -37.4 97 0.11 -44.2 94 0.13-28.5Ciclo 3 150 steps 164 0.05 -40.3 127 0.06 -35.9 107 0.06 -37.2 88 0.1 -52.1 83 0.11-42.9Ciclo3 200 steps1590.03 -42.11190.06 -37.61000.06 -36.2820.09 -36.3770.1-38

Tabella 3

L1 rivestito di chitosano passato 1 volta attraverso l’omogenizzatore(A) Concentrazione

Chitosano [%] 0.005 0.01 0.0175 0.025 0.05 0.1 0.175 0.25

TEMPO Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI

TEMPO 0 188.4 0.07 172.4 0.06 180.7 0.05 174.2 0.04 173.2 0.05 182.9 0.1 199.3 0.11 197.6 0.11

1 giorni 215.9 0.12 195.6 0.08 192.7 0.08 185.8 0.09 186.7 0.10 191.2 0.13 220.4 0.12 249.1 0.16 3 giorni 199.2 0.09 193.1 0.1 210.8 0.20 190.8 0.08 191.1 0.09 200 0.1 237.2 0.13 250 0.14 7 giorni 208.6 0.08 197.1 0.09 200.2 0.08 189.4 0.07 191.3 0.09 195.2 0.12 249.2 0.17 14 giorni 209.5 0.11 205.6 0.08 207.1 0.1 203.8 0.09 196.7 0.1 202.5 0.15 242.2 0.11 28 giorni (t0) 215.1 0.10 204.1 0.06 206.8 0.07 204.6 0.07 202.1 0.09 199.5 0.10 247.2 0.12 75 giorni (t1) 638.8 0.41 198.6 0.08 211 0.08 214.8 0.08 254.2 0.08 90 giorni (t2) 338.7 0.35 205.5 0.04 224.8 0.06 248.3 0.07 160 giorni (t3) 208.9 0.12 214 0.09 229 0.12 190 giorni (t4) 286.4 0.32 197.1 0.1 201.7 0.1 270 giorni (t5) 211.6 0.04 219.3 0.06 1 Anno (t6) 214.3 0.1 214.2 0.07

L1 rivestito di chitosano riprocessato nell’omogenizzatore dopo 1 mese (B)) Concentrazione

Chitosano [%] 0.005 0.01 0.0175 0.025 0.05 0.1 0.175 0.25

TEMPO Dim. im.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI D [nm] PDI 28 giorni (t0) 214.4 0.1 195.6 0.08 183.9 0.06 187 0.06 185.7 0.08 186.5 0.07 206.4 0.07 31 giorni 247.4 0.11 189.4 0.09 194.1 0.08 190.1 0.08 181.9 0.07 184.4 0.07 200.7 0.06 L5 rivestito di chitosano passato 1 volta attraverso l’omogenizzatore (I) Concentrazione

Chitosano [%] 0.005 0.01 0.0175 0.025 0.05 0.1 0.175 0.25

TEMPO Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI

TEMPO 0 84.58 0.1 83.19 0.12 83.61 0.13 82.27 0.12 81.87 0.12 88.42 0.17 95.38 0.18 108.2 0.21

1 giorni 85.38 0.12 84.79 0.11 83.17 0.11 85.01 0.11 86.27 0.13 96.97 0.19 107.4 0.22 122.8 0.21 3 giorni 103.4 0.18 91.28 0.14 90.15 0.14 84.76 0.11 93.41 0.15 101 0.19 117.8 0.21 147 0.22 7 giorni 160.5 0.14 98.6 0.1 89.19 0.1 92.52 0.1 92.85 0.13 92.18 0.15 112.5 0.2 127.9 0.2 14 giorni 107.7 0.07 96.07 0.11 97.67 0.1 99.6 0.13 106.6 0.15 137.1 0.23 133.9 0.17 28 giorni (t0) 101.3 0.07 97.54 0.1 97.19 0.09 100.9 0.13 104.2 0.14 131.6 0.16 72 giorni (t1) 142.4 0.09 116 0.13 125.8 0.12 132.2 0.12 87 giorni (t2) 114.2 0.14 126.1 0.15 129 0.11 146 giorni (t3) 138.9 0.14 115.3 0.09 117.5 0.1 190 giorni (t4) 219.7 0.25 124.7 0.1 124.4 0.15 270 giorni (t5) 133.3 0.08 123.5 0.06 1 Anno (t6) 155.4 0.1

L5 rivestito di chitosano riprocessato nell’omogenizzatore dopo 1 mese (L)

Concentrazione

Chitosano [%] 0.005 0.01 0.0175 0.025 0.05 0.1 0.175 0.25

TEMPO Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI 28 giorni (t0) 96.98 0.1 90.44 0.09 88.33 0.11 92.05 0.13 98.16 0.13 107.6 0.15 31 giorni 98.5 0.12 92.05 0.13 91.28 0.09 92.97 0.13 98.49 0.13 112.7 0.16 42 giorni 125 0.06 87.07 0.08 85.53 0.1 93.93 0.11 101.1 0.14 56 giorni (t1) 86.53 0.08 88.08 0.09 90.94 0.11 101.8 0.13 84 giorni (t2) 82.65 0.11 83.52 0.12 89.13 0.13 94.01 0.11 146 giorni (t3) 79.13 0.09 81.07 0.07 84.59 0.09 190 giorni (t4) 82.13 0.11 89.04 0.19 84.88 0.09 270 giorni (t5) 92.59 0.15 88.05 0.12 85.89 0.09 1 Anno (t6) 104.7 0.19 96.62 0.18 91.64 0.12

Come si può osservare, grazie al ri-processamento singolo o

ed in particolare a quello doppio, si ottengono nano

emulsioni sorprendentemente stabili nel tempo per oltre 1

anno. La figura 2 riporta l’andamento della stabilità

(giorni di mantenimento delle condizioni di nano emulsione)

in funzione delle % di chitosano utilizzato raffrontate con

l’andamento del potenziale Z delle medesime emulsioni, evidenziando come il massimo della stabilità venga raggiunto ben oltre la concentrazione di saturazione indicata dall’andamento dei potenziali Z.

Con il metodo descritto, grazie al riprocessamento, si riesce ad ottenere pertanto un’ottima base (l’emulsione secondaria stabilizzata) per un suo successivo uso per l’esecuzione di deposizioni multistrato di polielettrolita di carica opposta, ad esempio per specifici settori tecnologici, quale quello farmaceutico. Si ottengono pertanto emulsioni secondarie multi-strato (in cui le gocce di sostanza in dispersione presentano da tre, fino a cinque, sei e perfino dieci strati di rivestimento sovrapposti includenti composti scelti nel gruppo consistente in chitosano, alginato di sodio, eparina, polilisina e altri polimeri di comparabile peso molecolare e biodegradabili.

Per dimostrare in modo evidente l’efficacia del processo di riprocessamento delle emulsioni secondarie si sono inoltre effettuate delle prove di stabilità eseguite come esempio su due sole emulsioni e cioà ̈ quelle corrispondenti a L1 e L3.

Sono state testate direttamente le medesime concentrazioni riportate in Tabella 3, una volta e due volte. I dati, sia per L1 che per L3 sono riportati in Tabella 4. Ad ogni concentrazione di polimero il volume à ̈ stato diviso in due parti e una di queste due parti il giorno dopo à ̈ stata processata con semplice sonicazione in un bagnetto ad ultrasuoni (come a volte à ̈ riportato in letteratura).

I risultati riportati in Tabella 4 indicano la presenza di un doppio picco dimensionale (indice di aggregazioni) mentre i dati in corsivo indicano che, oltre al secondo picco dimensionale, il campione presenta visivamente delle evidenti segregazioni, anche se risulta ancora misurabile come dispersione.

Tabella 4

L1

Concentrazione

Chitosano [%] 0.005 0.01 0.0175 0.025 0.05 0.1 0.175 0.25 TEMPO Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Tempo 0 192 0.22 182.7 0.08 184.5 0.11 179.3 0.08 187.7 0.12 190.9 0.13 203 0.15 236.1 0.22 1 giorno 210.9 0.26 188.6 0.12 197.2 0.11 184.4 0.1 181.3 0.11 187.3 0.12 253.9 0.2 296.5 0.4 3 giorni 178.4 0.05 183.2 0.09 176.2 0.07 185.5 0.1 188.2 0.1 232.6 0.19 324.9 0.29 7 giorni 197.5 0.13 191.1 0.15 186.2 0.11 203.8 0.11 203.3 0.11 254.2 0.23 324.8 0.4 14 giorni

30 giorni

L1 dopo sonicazione a 75%

Concentrazione

Chitosano [%] 0.005 0.01 0.0175 0.025 0.05 0.1 0.175 0.25 TEMPO Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Tempo 0 402.4 0.4 187.4 0.12 190.8 0.15 174.9 0.07 202 0.15 197.8 0.14 242.1 0.2 299.5 0.36 1 giorno 294.6 0.36 180.6 0.11 183.5 0.07 187 0.09 203.2 0.14 252.4 0.18 348.8 0.28 3 giorni 181.2 0.07 179.2 0.07 178.6 0.06 185.3 0.1 187 0.09 236.5 0.2 372.3 0.3 7 giorni 179.8 0.06 184.8 0.12 176.1 0.04 188.6 0.11 216.3 0.13 256.4 0.19 325.5 0.27 14 giorni

30 giorni

L3

Concentrazione

Chitosano [%] 0.005 0.01 0.0175 0.025 0.05 0.1 0.175 0.25 TEMPO Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Tempo 0 107.2 0.2 118.4 0.2 97.8 0.15 99.3 0.17 96.7 0.17 100.3 0.19 116.5 0.18 130.2 0.25 1 giorno 119.1 0.18 112.8 0.17 114.9 0.19 111.1 0.15 114.1 0.17 124.2 0.2 145.8 0.2 183.3 0.25 3 giorni 117.1 0.4 115.8 0.16 118.1 0.16 111.6 0.14 121.1 0.18 130 0.19 159.7 0.22 203.8 0.23 7 giorni 133.8 0.24 111.9 0.17 108.4 0.15 107 0.17 112.2 0.16 11.4 0.18 149.6 0.2 188.3 0.25 14 giorni 142.4 0.27 125.5 0.15 131.5 0.18 147.9 0.17 175.1 0.27 182.4 0.18 219 0.18 30 giorni

L3 dopo sonicazione a 75%

Concentrazione

Chitosano [%] 0.005 0.01 0.0175 0.025 0.05 0.1 0.175 0.25 TEMPO Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Dim.

[nm] PDI Tempo 0 120.1 0.19 107.8 0.15 112.2 0.15 107.7 0.18 118.1 0.19 122 0.2 140.3 0.23 183 0.24 1 giorno 122.3 0.22 117.7 0.21 114.6 0.17 114.1 0.16 117.9 0.18 127.2 0.19 161.6 0.21 188.9 0.23 3 giorni 121.9 0.18 114.8 0.14 113.9 0.14 115.5 0.14 122.2 0.17 136.8 0.2 168.4 0.22 204.7 0.22 7 giorni 113.1 0.15 112.8 0.14 113.3 0.15 129.5 0.19 140.3 0.18 263.6 0.22 203 0.2 14 giorni

30 giorni

Come si vede dalla Tabella 4, già solo dopo prove di stabilità ad una settimana, effettivamente la sonicazione migliora il comportamento nella regione intermedia delle concentrazioni, ma alle più alte concentrazioni, che sono poi risultate (in base ai dati di Tabella 3) quelle che sul lungo periodo consentono di ottenere una vera stabilità, la sonicazione non riesce ad essere efficace, come dimostrano dimensioni delle gocce ed il PDI elevati.

Claims (13)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per ottenere nanoemulsioni ultrastabili, comprendente le fasi di: i)- disperdere una prima quantità di una prima sostanza fluida in una seconda quantità, superiore alla prima quantità, di una seconda sostanza fluida non miscibile con la prima sostanza fluida, in presenza di almeno un emulsionante ionico avente preferibilmente affinità chimico-fisica con la prima sostanza fluida, in modo da formare una emulsione primaria di gocce di dimensioni nanometriche della prima sostanza fluida in una fase omogenea definita dalla seconda sostanza fluida e sulle quali gocce à ̈ adsorbito almeno parte di detto almeno un emulsionante ionico; ii)- miscelare l’emulsione primaria così formata in una soluzione di un polielettrolita nella seconda sostanza fluida, il poliettrolita essendo scelto in modo da avere una polarità opposta a quella dell’almeno un emulsionante ionico, in modo da formare una emulsione secondaria in cui le gocce della prima sostanza fluida sono rivestite almeno in parte da uno strato polimerico di polielettrolita; caratterizzato dal fatto di comprendere inoltre le fasi di: iii)- lasciare riposare la emulsione secondaria così ottenuta; e iv)- processare l’emulsione secondaria in modo da ri disperdere la prima sostanza fluida nella seconda sostanza fluida sotto l’effetto di un elevato sforzo di taglio.
2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che nella fase ii) la concentrazione in peso in polielettrolità nella seconda sostanza fluida à ̈ scelta in modo da essere sensibilmente maggiore di una concentrazione teorica di polielettrolita necessaria a saturare l’emulsione primaria (concentrazione di saturazione) rilevata sperimentalmente in precedenza in base ad una misura di potenziale Z effettuata su una pluralità di campioni di emulsione secondaria preparati con concentrazioni crescenti di polielettrolita.
3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che nella fase ii) la concentrazione in peso in polielettrolita nella seconda sostanza fluida à ̈ scelta attorno ad un ordine di grandezza superiore alla concentrazione di saturazione calcolata in precedenza in base ad una misura di potenziale Z.
4. 4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che la fase i) viene eseguita mediante un omogeneizzatore ad alta pressione operante ad una prima pressione, che viene scelta in base alla natura chimico-fisica delle prima e seconda sostanza fluida e che à ̈ comunque compresa tra 1000 e 3000 bar e, preferibilmente, tra 1500 e 2000 bar; la prima e la seconda sostanza fluida venendo fatte passare nell’omogeneizzatore più volte di seguito, in modo da eseguire da 3 a 15 cicli completi di omogeneizzazione o, alternativamente, una pluralità di cicli in continuo o anche combinando cicli completi (discreti) con cicli in continuo, misurando di volta in volta la dimensione media ottenuta, fino a misurare un minimo di dimensione media.
5. 5. Metodo secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che la fase iv) viene eseguita mediante un omogeneizzatore ad alta pressione operante ad una seconda pressione, che viene scelta in base alla natura chimicofisica delle prima e seconda sostanza fluida, ma che à ̈ comunque minore della prima pressione alla quale viene eseguita la fase i) e che rimane comunque compresa tra 200 e 1500 bar, ed à ̈ preferibilmente compresa tra 500 e 1200 bar e, ancora più preferibilmente, compresa tra 700 e 1000 bar; la prima e la seconda sostanza fluida venendo fatte passare nell’omogeneizzatore più volte di seguito, in modo da eseguire almeno 10 cicli completi di omogeneizzazione o, alternativamente, una pluralità di cicli in continuo o anche combinando cicli completi (discreti) con cicli in continuo, misurando di volta in volta l’indice di polidispersità, fino a riscontrare un minimo nell’indice di polidispersità (o polidispersione).
6. 6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detta fase iii) durante la quale la emulsione secondaria viene lasciata riposare si estende per un intervallo di tempo compreso tra alcune ore ed 1 mese.
7. 7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che dette fasi iii) e iv) vengono ripetute almeno una volta e, preferibilmente, almeno due volte; la durata della fase iii), prima dell’esecuzione per la prima volta della fase iv) essendo preferibilmente pari ad 1 giorno; e la durata della fase iii) prima della esecuzione per la seconda volta della fase iv) essendo compresa tra una settimana ed un mese.
8. 8. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che la prima sostanza fluida à ̈ una sostanza lipidica e la seconda sostanza fluida à ̈ una sostanza acquosa; detto emulsionante ionico essendo scelto nel gruppo consistente in: lecitina di soia, lecitina arricchita con fosfatidilcolina (PC) e/o fosfatidiletanolammina (PE); e loro miscele; eventualmente, la seconda sostanza fluida essendo addizionata con glicerolo, pectina o altri addensanti.
9. 9. Metodo secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che detto polielettrolita à ̈ scelto nel gruppo dei polimeri biodegradabili.
10. 10. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto la fase i) à ̈ preceduta da una fase di pre-emulsione in cui la prima sostanza fluida viene aggiunta progressivamente di detto emulsionante ionico operando sotto miscelazione meccanica continua ed in cui la miscela così ottenuta viene sonicata; la successiva fase ii) venendo eseguita aggiungendo progressivamente la prima sostanza fluida addizionata dell’emulsionante ionico ad una soluzione di polielettrolita nella seconda sostanza fluida operando sotto miscelazione meccanica continua.
11. 11. Nano emulsione ultrastabile comprendente una prima quantità di una prima sostanza fluida dispersa in una seconda quantità, superiore alla prima quantità, di una seconda sostanza fluida non miscibile con la prima sostanza fluida; la nano emulsione contenendo inoltre almeno un emulsionante ionico adsorbito su rispettive gocce della prima sostanza fluida disperse nella seconda sostanza fluida ed almeno un polielettrolita avente polarità opposta a quella dell’emulsionante ionico e che forma un rivestimento polimerico intorno alle gocce della prima sostanza fluida; caratterizzata dal fatto che à ̈ stata ottenuta secondo il metodo di una delle rivendicazioni da 1 a 10, in modo da presentare una dimensione delle gocce della prima sostanza fluida rivestite dall’emulsionante ionico e dal polielettrolita compresa tra 50 e 300 nm; una distribuzione dimensionale delle gocce tale che la nano emulsione presenta un indice di polidispersità inferiore a 0,1; ed una stabilità nel tempo dei detti valori dimensionali delle gocce della prima sostanza fluida superiore a 1 anno.
12. 12. Nano emulsione secondo la rivendicazione 11, caratterizzata dal fatto che dette gocce della prima sostanza fluida disperse nella seconda sostanze fluida presentano almeno tre strati di rivestimento includenti, a partire dall’interno verso l’esterno, un primo strato che forma un rivestimento polimerico intorno alle gocce sulle quali à ̈ adsorbito l’emulsionate ionico, costituito da un polielettrolita avente polarità opposta a quella dell’emulsionante ionico; almeno un secondo strato costituito da un polielettrolita avente polarità opposta a quella del polielettrolita che forma il primo strato; ed almeno un terzo strato costituito preferibilmente dal medesimo polielettrolita che forma il primo strato .
13. 13. Nano emulsione secondo la rivendicazione 12, caratterizzata dal fatto che dette gocce presentano da cinque, sei e fino a dieci strati di rivestimento sovrapposti includenti composti scelti nel gruppo consistente in: chitosano, alginato di sodio, eparina, polilisina e altri polimeri di comparabile peso molecolare e biodegradabili.