ITTO20120331A1 - DEVICE FOR OBTAINING CELL CULTURE IN THREE DIMENSIONS, PROCEDURE FOR ITS REALIZATION AND USE OF SUCH DEVICE - Google Patents
DEVICE FOR OBTAINING CELL CULTURE IN THREE DIMENSIONS, PROCEDURE FOR ITS REALIZATION AND USE OF SUCH DEVICE Download PDFInfo
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Description
DESCRIZIONE dell’invenzione industriale dal titolo: “Dispositivo per l’ottenimento di colture cellulari in tre dimensioni, procedimento per la sua realizzazione e impiego di tale dispositivo†DESCRIPTION of the industrial invention entitled: â € œDevice for obtaining cell cultures in three dimensions, procedure for its realization and use of this deviceâ €
DESCRIZIONE DESCRIPTION
La presente invenzione si riferisce ad un dispositivo per l’ottenimento di colture cellulari in tre dimensioni, ad un procedimento per la sua realizzazione e ad un impiego di tale dispositivo per l’ottenimento di cellule sospese non adese al substrato. The present invention refers to a device for obtaining cell cultures in three dimensions, to a process for its realization and to a use of this device for obtaining suspended cells not adhered to the substrate.
La disposizione di una cellula ad aderire, crescere e differenziarsi su un substrato (o supporto) compatto o su un’intelaiatura avente funzione di sostegno à ̈ uno degli aspetti più importanti dell’ingegneria dei tessuti e della caratterizzazione di biomateriali. The disposition of a cell to adhere, grow and differentiate on a compact substrate (or support) or on a supporting framework is one of the most important aspects of tissue engineering and biomaterial characterization.
La maggior parte dei processi cellulari fisiologici e patologici come la crescita, l’adesione, la migrazione, la secrezione e la morte sono influenzati dall’organizzazione tridimensionale della matrice extra-cellulare. Le cellule rispondono alle concentrazioni locali di un grande numero di molecole che possono essere disciolte in mezzi extracellulari (gas, amminoacidi, ioni, farmaci), presenti sulla superficie di crescita e sulla membrana delle cellule adiacenti (recettori di membrana). Most of the physiological and pathological cellular processes such as growth, adhesion, migration, secretion and death are influenced by the three-dimensional organization of the extra-cellular matrix. Cells respond to local concentrations of a large number of molecules that can be dissolved in extracellular media (gases, amino acids, ions, drugs), present on the growth surface and membrane of adjacent cells (membrane receptors).
Nelle colture tridimensionali il rapporto fra le cellule e il substrato à ̈ controllato dalle caratteristiche geometriche e dalle proprietà chimiche e fisiche del supporto, allo scopo di realizzare colture cellulari in vitro con un'organizzazione ed una funzionalità il più possibile vicine a quelle dei tessuti nativi. In three-dimensional cultures the relationship between the cells and the substrate is controlled by the geometric characteristics and the chemical and physical properties of the support, in order to create in vitro cell cultures with an organization and functionality as close as possible to those of native tissues. .
È noto che il comportamento di una cellula può essere controllato e guidato attraverso cambiamenti nelle caratteristiche topografiche della superficie del supporto, su scala micro e nano-metrica. E’ proprio in questo contesto che controllare la bagnabilità può anche avere un ruolo molto importante nell’ottimizzazione delle prestazioni di substrati biocompatibili. It is known that the behavior of a cell can be controlled and guided through changes in the topographical characteristics of the surface of the support, on a micro and nano-metric scale. It is in this context that controlling wettability can also play a very important role in optimizing the performance of biocompatible substrates.
Imponendo specifiche geometrie alla superficie di un dispositivo solido biocompatibile e modificandone le caratteristiche di bagnabilità à ̈ possibile aumentarne il rapporto superficie-volume, rendendo anche compatibili, dal punto di vista dimensionale, le caratteristiche geometriche del dispositivo con le caratteristiche morfologiche del tipo di cellula usato. By imposing specific geometries on the surface of a biocompatible solid device and modifying its wettability characteristics, it is possible to increase its surface-volume ratio, also making the geometrical characteristics of the device compatible, from a dimensional point of view, with the morphological characteristics of the cell type used. .
Per questo motivo, la bagnabilità e la rugosità dei supporti di crescita sono da considerarsi tra i più importanti fattori regolanti la diffusione, l’allineamento e la migrazione delle cellule. For this reason, the wettability and roughness of the growth supports are to be considered among the most important factors regulating the diffusion, alignment and migration of cells.
Una delle teorie che giustifica questi comportamenti delle cellule à ̈ la teoria del “contact guide effect†, in cui i contatti focali mediati da integrine trasferiscono gradi variabili di tensione e/o compressione agli elementi del citoscheletro seguendo le variazioni topografiche della superficie. Tale teoria à ̈ descritta nell’articolo di Tan, J. L. et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 1484-1489, doi:10.1073/pnas.0235407100 (2003). One of the theories justifying these cell behaviors is the 'contact guide effect' theory, in which integrin-mediated focal contacts transfer varying degrees of tension and / or compression to the elements of the cytoskeleton following the topographical variations of the surface. This theory is described in the article by Tan, J. L. et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 1484-1489, doi: 10.1073 / pnas.0235407100 (2003).
La capacità di crescere rispondendo alle caratteristiche topografiche del supporto di crescita sono ben note per diversi tipi cellulari; essi mostrano interessanti risposte di crescita se piastrati su substrati caratterizzati in superficie da differenti geometrie e gradi diversi di superidrofobicità . The ability to grow by responding to the topographical characteristics of the growth medium are well known for several cell types; they show interesting growth responses when plated on substrates characterized on the surface by different geometries and different degrees of superhydrophobicity.
Esistono tuttavia tipi di cellule che normalmente crescono adese alla superficie del substrato, come le cellule neuronali. Per tali tipi di cellule non sono noti substrati in grado di consentire una loro crescita sospesa. However, there are types of cells that normally grow attached to the substrate surface, such as neuronal cells. There are no known substrates for these types of cells capable of allowing their suspended growth.
Il documento WO 2010/023635 descrive un dispositivo in cui, su un substrato, sono realizzate una pluralità di micro-strutture distanziate tra loro in maniera periodica in modo tale da rendere superidrofobico il substrato, finalizzato all’impiego per la concentrazione e la localizzazione di un soluto in una ristretta porzione di spazio. Document WO 2010/023635 describes a device in which, on a substrate, a plurality of micro-structures spaced periodically from each other are made in such a way as to make the substrate superhydrophobic, aimed at use for concentration and localization of a solute in a small portion of space.
Tra i sistemi usati più di recente per la crescita di cellule in tre dimensioni si hanno matrici di polimeri biodegradabili sintetici o naturali. In relazione alle diverse applicazioni, i polimeri possono essere realizzati, con diverse porosità , in dispositivi quali membrane, film e nano tubi, come descritto in Langer, R. & Tirrell, D. A. Designing materials for biology and medicine. Nature 428, 487-492, doi: 10.1038/nature02388 (2004). Among the most recently used systems for the growth of cells in three dimensions are arrays of synthetic or natural biodegradable polymers. In relation to the different applications, polymers can be made, with different porosities, in devices such as membranes, films and nano tubes, as described in Langer, R. & Tirrell, D. A. Designing materials for biology and medicine. Nature 428, 487-492, doi: 10.1038 / nature02388 (2004).
Ad esempio vengono utilizzati tubi di matrice di collagene per promuovere la rigenerazione del tessuto nervoso, e materiali in forma di gel sono utilizzati prevalentemente per l’isolamento o come substrati per la rigenerazione del tessuto connettivo. For example, collagen matrix tubes are used to promote the regeneration of nerve tissue, and materials in the form of gels are mainly used for isolation or as substrates for connective tissue regeneration.
Nella maggior parte dei casi si tratta di dispositivi costituiti da una matrice porosa su cui attecchiscono le cellule. All’interno dei pori, oltre alle cellule, deve trovare spazio anche il fluido che ha il compito di nutrirle. La crescita cellulare à ̈ fortemente correlata alla quantità di nutrienti presenti nel mezzo di coltura e al tipo di moto che il fluido possiede. Volendo ottenere una coltura uniforme all’interno di tutto il costrutto cellulare, sarà necessario che il fluido nutriente riesca ad invadere ogni poro della matrice. D’altro canto, la crescita cellulare, con il tempo, va a riempire i vuoti presenti nella matrice, causando una diminuzione del flusso dei nutrienti. In most cases these are devices consisting of a porous matrix on which the cells take root. Inside the pores, in addition to the cells, the fluid that has the task of nourishing them must also find space. Cell growth is strongly correlated to the quantity of nutrients present in the culture medium and to the type of motion that the fluid possesses. In order to obtain a uniform culture inside the whole cellular construct, it will be necessary for the nourishing fluid to be able to invade every pore of the matrix. On the other hand, cell growth over time fills the gaps in the matrix, causing a decrease in the flow of nutrients.
I dispositivi noti di supporto per la crescita tridimensionale di cellule sospese non sono perfettamente in grado di fornire una quantità sufficiente di nutritivi e, allo stesso tempo, rimuovere adeguatamente i prodotti di scarto. The known support devices for the three-dimensional growth of suspended cells are not perfectly capable of supplying a sufficient quantity of nutrients and, at the same time, adequately removing waste products.
Inoltre, le limitazioni dei trattamenti standard delle lesioni di nervi periferici, che richiedono l’impianto di un nervo autologo portando ad un deficit al sito del donatore e richiedendo una chirurgia addizionale, hanno motivato la ricerca di soluzioni di bioingegneria per la realizzazione di impianti artificiali che consentano di ottenere una buona rigenerazione del tessuto nervoso. Furthermore, the limitations of standard treatments of peripheral nerve injuries, which require the implantation of an autologous nerve leading to a deficit at the donor site and requiring additional surgery, have motivated the search for bioengineering solutions for the realization of implants. artificial that allow to obtain a good regeneration of the nervous tissue.
Scopo della presente invenzione à ̈ dunque quello di proporre un dispositivo per l’ottenimento di colture cellulari in tre dimensioni, che sia in grado di superare i problemi sopra citati e che permetta la crescita di cellule sospese anche per tipi di cellule che normalmente crescono adese al substrato, in particolare per applicazioni di rigenerazione di tessuto nervoso. The purpose of the present invention is therefore to propose a device for obtaining cell cultures in three dimensions, which is able to overcome the problems mentioned above and which allows the growth of suspended cells even for types of cells that normally grow adhered to the substrate, particularly for nerve tissue regeneration applications.
Ulteriore scopo della presente invenzione à ̈ quello di proporre un procedimento per la realizzazione del dispositivo sopra citato e un impiego di tale dispositivo per l’ottenimento di cellule sospese non adese al substrato. A further object of the present invention is to propose a process for manufacturing the aforementioned device and a use of this device for obtaining suspended cells not adhered to the substrate.
Questi ed altri scopi vengono raggiunti con un dispositivo le cui caratteristiche sono definite nella rivendicazione 1, con un procedimento di realizzazione di tale dispositivo le cui caratteristiche sono definite nella rivendicazione 8 e con un impiego di tale dispositivo per l’ottenimento di cellule sospese non adese al substrato come descritto nella rivendicazione 14. These and other purposes are achieved with a device whose characteristics are defined in claim 1, with a process for manufacturing such device whose characteristics are defined in claim 8 and with the use of this device for obtaining non-suspended cells. adhered to the substrate as described in claim 14.
Modi particolari di realizzazione formano oggetto delle rivendicazioni dipendenti, il cui contenuto à ̈ da intendersi come parte integrale ed integrante della presente descrizione. Particular manufacturing methods are the subject of the dependent claims, the content of which is to be understood as an integral and integral part of this description.
Ulteriori caratteristiche e vantaggi dell’invenzione appariranno dalla descrizione dettagliata che segue, effettuata a puro titolo di esempio non limitativo, con riferimento ai disegni allegati, nei quali: Further characteristics and advantages of the invention will appear from the detailed description that follows, carried out purely by way of non-limiting example, with reference to the attached drawings, in which:
- la figura 1 à ̈ una vista dall’alto di un dispositivo secondo l’invenzione, - figure 1 is a top view of a device according to the invention,
- la figura 2 Ã ̈ un ingrandimento in prospettiva di una delle nano-strutture del dispositivo di figura 1, e - figure 2 is a perspective enlargement of one of the nano-structures of the device of figure 1, e
- la figura 3 Ã ̈ una vista laterale della nanostruttura di figura 2. - figure 3 is a side view of the nanostructure of figure 2.
In sintesi, l’invenzione utilizza tecniche di micro-fabbricazione per la realizzazione di un dispositivo superidrofobico avente strutture con pareti laterali almeno parzialmente nano-sagomate (nano-patterned), usato nei procedimenti di coltura cellulare per l’ottenimento di cellule sospese, ovvero non totalmente adese al substrato, in particolare per la crescita tridimensionale di cellule neuronali ippocampali e per la crescita di cocoltura di neuroni ippocampali e cellule gliali. In summary, the invention uses micro-fabrication techniques for the realization of a superhydrophobic device having structures with at least partially nano-shaped (nano-patterned) side walls, used in cell culture procedures for obtaining suspended cells , that is not totally adherent to the substrate, in particular for the three-dimensional growth of hippocampal neuronal cells and for the growth of hippocampal neurons and glial cells coculture.
Tale dispositivo combina due tipologie di dettagli topografici, aventi rispettivamente dimensioni di diversa scala, in particolare strutture micrometriche che conferiscono alla superficie del substrato la superidrofobicità , mentre caratteristiche nano-metriche di tali strutture micrometriche rendono possibile la stratificazione in tre dimensioni delle colture cellulari. This device combines two types of topographical details, respectively having different scale dimensions, in particular micrometric structures that give the surface of the substrate superhydrophobicity, while nano-metric characteristics of these micrometric structures make it possible to stratify cell cultures in three dimensions.
La geometria della superficie dei supporti à ̈ caratterizzata da ampi spazi liberi tra una microstruttura e quella adiacente, e questo consente un miglior ricircolo delle sostanze nutritive e più agevoli scambi gassosi tra le cellule e il mezzo di coltura The geometry of the surface of the supports is characterized by large free spaces between a microstructure and the adjacent one, and this allows a better recirculation of nutrients and easier gaseous exchanges between the cells and the culture medium.
Rispetto alle tradizionali colture cellulari in vitro, il dispositivo della presente invenzione permette di raggiungere risultati qualitativamente superiori fornendo alle cellule la giusta quantità di nutrienti e stimoli meccanici appropriati per lo sviluppo di co-culture e di tessuti per applicazioni biomedicali più riproducibili ed economicamente sostenibili. Compared to traditional in vitro cell cultures, the device of the present invention allows to achieve qualitatively superior results by providing the cells with the right amount of nutrients and mechanical stimuli appropriate for the development of co-cultures and tissues for more reproducible and economically sustainable biomedical applications.
L’invenzione mira quindi alla realizzazione di dispositivi superidrofobici nano-strutturati per la crescita tridimensionale di cellule normali (anche in co-coltura), per lo studio dell’arrangiamento spaziale di colture cellulari tumorali; per test di screening farmacologici e tossicologici in vitro, finalizzati alla terapia cellulare. The invention therefore aims at the realization of nano-structured superhydrophobic devices for the three-dimensional growth of normal cells (also in co-culture), for the study of the spatial arrangement of tumor cell cultures; for in vitro pharmacological and toxicological screening tests, aimed at cell therapy.
L’invenzione permette di eseguire applicazioni di ingegneria tissutale quali la rigenerazione nervosa. The invention allows for tissue engineering applications such as nerve regeneration.
In figura 1 à ̈ illustrato il dispositivo secondo l’invenzione che comprende un substrato 1 ad esempio di silicio o di materiale polimerico biocompatibile o bioerodibile, e una pluralità di microstrutture 2, in particolare micro-cilindri, che si estendono dal substrato. Figure 1 illustrates the device according to the invention which comprises a substrate 1 for example of silicon or biocompatible or bioerodible polymeric material, and a plurality of microstructures 2, in particular micro-cylinders, which extend from the substrate.
Tali micro-strutture 2 possono vantaggiosamente avere una sezione di forma circolare, quadrata, rettangolare, esagonale o di qualsiasi altra forma. These micro-structures 2 can advantageously have a section of circular, square, rectangular, hexagonal or any other shape.
Tali micro-strutture 2 sono preferibilmente disposte ortogonalmente alla superficie del substrato 1 e sono sistemate sul substrato 1 secondo un reticolo periodico in modo tale da rendere superidrofobico il substrato 1. These micro-structures 2 are preferably arranged orthogonally to the surface of the substrate 1 and are arranged on the substrate 1 according to a periodic lattice in such a way as to make the substrate 1 superhydrophobic.
Con il termine superidrofobico nella presente descrizione si intende una superficie su cui l’angolo di contatto che una goccia di acqua (distillata) forma con la superficie stessa à ̈ maggiore di 150°. L’angolo di contatto à ̈ l’angolo formato dalla tangente all’interfaccia liquido-vapore con la tangente all’interfaccia liquido solido. L’ottenimento di superfici micro-strutturate superidrofobiche à ̈ funzione della densità areica e della dimensione trasversale delle micro-strutture. I principi di progetto per la realizzazione delle suddette superfici micro-strutturate superidrofobiche sono di per sé noti e descritti ad esempio in de Angelis, F. et al. “Breaking the diffusion limit with super-hydrophobic delivery of molecules to plasmonic nanofocusing SERS structures†, Nature Photonics, Volume 5, Issue 11, pp. 682-687 (2011), incorporato alla presente per effetto di tale citazione. The term superhydrophobic in the present description means a surface on which the contact angle that a drop of (distilled) water forms with the surface itself is greater than 150 °. The contact angle is the angle formed by the tangent to the liquid-vapor interface with the tangent to the liquid-solid interface. The obtainment of superhydrophobic micro-structured surfaces is a function of the area density and the transversal dimension of the micro-structures. The design principles for the realization of the aforementioned superhydrophobic micro-structured surfaces are per se known and described for example in de Angelis, F. et al. â € œBreaking the diffusion limit with super-hydrophobic delivery of molecules to plasmonic nanofocusing SERS structuresâ €, Nature Photonics, Volume 5, Issue 11, pp. 682-687 (2011), incorporated herein as a result of this citation.
Il substrato 1 ha vantaggiosamente una resistività di circa 5-10Ω/cm. The substrate 1 advantageously has a resistivity of about 5-10â „¦ / cm.
Le micro-strutture 2 sono ottenute mediante processi di litografia e attacco, oppure micromolding, di per sé noti, come descritto in seguito. The micro-structures 2 are obtained by lithography and etching processes, or by micromolding, per se known, as described below.
Le micro-strutture 2 sono distanziate sul substrato 1 di una distanza 4 predeterminata preferibilmente compresa nell’intervallo 15-30µm. The micro-structures 2 are spaced on the substrate 1 by a predetermined distance 4 preferably comprised in the range 15-30µm.
Le micro-strutture 2 hanno preferibilmente una larghezza di base compresa nell’intervallo 5-20µm, e un’altezza compresa nell’intervallo 5-30µm. The micro-structures 2 preferably have a base width in the 5-20µm range, and a height in the 5-30µm range.
Con il termine larghezza alla base si intende nella presente descrizione la dimensione minima tra quelle che definiscono la forma della sezione. The term width at the base in the present description means the minimum dimension among those that define the shape of the section.
La larghezza di base e la distanza 4 tra le micro-strutture 2 vengono scelte secondo un criterio di per sé noto dall’articolo sopra indicato. The base width and the distance 4 between the micro-structures 2 are chosen according to a criterion known per se from the article indicated above.
In questo modo, si ottiene una piccola frazione di materiale solido del dispositivo complessivo che, nel caso di micro-cilindri, Ã ̈ pari a: In this way, a small fraction of solid material of the overall device is obtained which, in the case of micro-cylinders, is equal to:
f= * f = *
dove l à ̈ la distanza 4 e d à ̈ il diametro dei microcilindri. where l is the distance 4 and d is the diameter of the microcylinders.
Tale frazione f permette di aumentare l’idrofobicità del substrato 1 che diventa quindi in grado di raggiungere angoli di contatto che si avvicinano ai 170°. Il parametro f à ̈ tuttavia ancora sufficientemente grande da evitare il collasso della goccia ai primi stadi dell’evaporazione. This fraction f allows to increase the hydrophobicity of the substrate 1 which therefore becomes capable of reaching contact angles approaching 170 °. However, the parameter f is still large enough to avoid the collapse of the drop in the early stages of evaporation.
Ai fini dell’utilizzo del dispositivo per le finalità oggetto dell’invenzione à ̈ preferibile l’applicazione sulla superficie del dispositivo di rivestimenti idonei a favorire la crescita di colture cellulari mantenendo le proprietà di superidrofobicità o imponendo tali proprietà . A tal fine può essere contemplata l’applicazione di un rivestimento biocompatibile (laddove il substrato non sia già esso stesso biocompatibile), ad esempio metallico, vetroso o vetroceramico, e di un eventuale strato di ancoraggio per detto rivestimento biocompatibile, applicato sulla superficie del substrato. Un sottile rivestimento polimerico idrofobico, ad esempio un polimero fluorurato quale si ottiene da polimerizzazione di octafluorociclobutano, può infine essere applicato al rivestimento biocompatibile, in spessori tali da non alterare la biocompatibilità superficiale del dispositivo. For the purposes of using the device for the purposes of the invention, it is preferable to apply coatings on the surface of the device suitable for promoting the growth of cell cultures while maintaining the properties of superhydrophobicity or imposing such properties. To this end, the application of a biocompatible coating (where the substrate itself is not already biocompatible), for example metallic, glass or glass ceramic, and of a possible anchoring layer for said biocompatible coating, applied on the surface of the substrate. A thin hydrophobic polymeric coating, for example a fluorinated polymer such as obtained from the polymerization of octafluorocyclobutane, can finally be applied to the biocompatible coating, in such thicknesses as not to alter the surface biocompatibility of the device.
Nella figura 2 Ã ̈ illustrato un ingrandimento in prospettiva di una delle micro-strutture del dispositivo di figura 1. Figure 2 shows a perspective enlargement of one of the micro-structures of the device of figure 1.
Le pareti laterali della micro-struttura 2 non sono lisce bensì sagomate, cioà ̈ presentano sporgenze 14 e incavi 16 alternati, con un predeterminato passo (o distanza spaziale) che dipende dalla durata della fase di attacco secco isotropico al plasma e della fase di deposizione di uno strato di passivazione descritte in seguito. The lateral walls of the micro-structure 2 are not smooth but shaped, that is, they have alternating protrusions 14 and recesses 16, with a predetermined pitch (or spatial distance) that depends on the duration of the isotropic dry etching phase on the plasma and of the phase of deposition of a passivation layer described below.
L’altezza delle sporgenze 14 o incavi 16 può essere costante lungo tutta la parete di una microstruttura, oppure può variare, così come l’altezza tra sporgenze 14 e incavi 16 adiacenti può essere uguale o differente. The height of the projections 14 or hollows 16 can be constant along the entire wall of a microstructure, or it can vary, just as the height between projections 14 and adjacent hollows 16 can be the same or different.
Nella presente descrizione con il termine liscia si intende che la parete laterale di una micro-struttura, vista in sezione di un piano parallelo all’asse principale di estensione della microstruttura, ha un profilo rettilineo r non presenta sporgenze e incavi. In the present description, the term smooth means that the side wall of a micro-structure, seen in section of a plane parallel to the main extension axis of the microstructure, has a rectilinear profile r does not have projections and hollows.
In figura 3 à ̈ mostrata una vista laterale della micro-struttura 2 di figura 2 in cui sono evidenziate rispettivamente l’altezza h della microstruttura 2 e l’altezza h1che separa due sporgenze 14 adiacenti. Figure 3 shows a side view of the micro-structure 2 of figure 2 in which the height h of the microstructure 2 and the height h1 which separates two adjacent projections 14 are highlighted, respectively.
In una variante dell’invenzione, le microstrutture 2 non hanno pareti laterali interamente sagomate ma presentano un’alternanza di zone (fasce) sagomate e zone (fasce) lisce prive delle sporgenze 14 e degli incavi 16. In a variant of the invention, the microstructures 2 do not have entirely shaped side walls but have an alternation of shaped areas (bands) and smooth areas (bands) without the projections 14 and the recesses 16.
Preferibilmente, il dispositivo della presente invenzione comprende anche una pluralità di elettrodi, ciascuno associato ad una micro-struttura 2 (sia essa del tipo a pareti laterali interamente sagomate o del tipo a pareti laterali con alternanza di zone lisce e zone sagomate), collegati a delle tracce conduttive realizzate in modo per sé noto nel substrato 1. In tal modo, à ̈ possibile applicare delle tensioni a tali elettrodi, e quindi a tali micro-strutture 2, realizzando un dispositivo elettrico. Preferably, the device of the present invention also comprises a plurality of electrodes, each associated with a micro-structure 2 (be it of the type with fully shaped side walls or of the type with side walls with alternation of smooth and shaped areas), connected to of the conductive traces made in a per se known way in the substrate 1. In this way, it is possible to apply voltages to these electrodes, and therefore to these micro-structures 2, creating an electrical device.
Vantaggiosamente, il dispositivo della presente invenzione comprende anche una pluralità di micro-canali, realizzabili in modo per sé noto, che consentono cambi controllati di terreno o test di cito-tossicità . Advantageously, the device of the present invention also comprises a plurality of micro-channels, which can be manufactured in a per se known manner, which allow controlled soil changes or cytotoxicity tests.
Vantaggiosamente, il dispositivo della presente invenzione comprende una griglia alfanumerica posizionata nella zona periferica del substrato 1, in modo da permettere facilmente di contare le cellule e localizzarle, per consentire un’analisi con differenti tecniche quali microscopio ottico confocale o microscopio a forza atomica, spettroscopia Raman o anche SEM. Advantageously, the device of the present invention comprises an alphanumeric grid positioned in the peripheral area of the substrate 1, so as to easily allow the cells to be counted and localized, to allow analysis with different techniques such as confocal optical microscope or atomic force microscope, Raman spectroscopy or even SEM.
Verranno ora descritti i procedimenti di realizzazione del dispositivo sopra descritto, rispettivamente per il caso in cui il substrato sia di silicio o di materiale polimerico biocompatibile e bioerodibile. The manufacturing processes of the device described above will now be described, respectively for the case in which the substrate is of silicon or of biocompatible and bioerodible polymeric material.
Nel caso in cui il substrato 1 sia di silicio, esso viene inizialmente pulito in modo per sé noto. If the substrate 1 is of silicon, it is initially cleaned in a per se known manner.
Successivamente, si esegue una fase di litografia ottica di per sé nota, utilizzando una maschera ottica realizzata con un processo di scrittura laser. Subsequently, a known optical lithography phase is performed, using an optical mask made with a laser writing process.
In particolare, si ottiene uno schema (pattern) regolare di dischi (o altri poligoni) all’interno di uno strato di copertura che era stato precedentemente depositato con spin coating sul substrato 1 pulito. In particular, a regular pattern of disks (or other polygons) is obtained inside a covering layer which had previously been deposited with spin coating on the clean substrate 1.
Si realizza quindi una maschera di copertura comprendente una pluralità di dischi o poligoni eseguendo una litografia ottica su uno strato di copertura uniforme depositato sul substrato 1, ad esempio resist, utilizzando in modo noto un fascio di luce avente una predeterminata lunghezza d’onda λ compresa nell’intervallo tra 350 e 450nm. A cover mask is then made comprising a plurality of discs or polygons by performing an optical lithography on a uniform covering layer deposited on the substrate 1, for example resist, using in a known way a beam of light having a predetermined wavelength Î »Included in the range between 350 and 450nm.
Successivamente si elimina, in modo noto, lo strato di copertura all’esterno dei dischi (o poligoni) e al passo seguente si esegue una fase di attacco secco, di tipo DRIE, del substrato 1, utilizzando la maschera di copertura precedentemente preparata. Subsequently, in a known way, the covering layer on the outside of the discs (or polygons) is eliminated and in the following step a dry etching step, of the DRIE type, of the substrate 1 is carried out, using the previously prepared covering mask.
Dopo l’attacco si ottengono le micro-strutture 2 sopra descritte (aventi dunque tutte le caratteristiche di disposizione spaziale sopra illustrate) e aventi un rapporto di forma (aspect ratio), cioà ̈ il rapporto tra l'altezza della micro-struttura 2 e l’area della sua base, maggiore di 2. After the etching, the micro-structures 2 described above are obtained (thus having all the characteristics of spatial arrangement illustrated above) and having an aspect ratio, i.e. the ratio between the height of the micro-structure 2 and the area of its base, greater than 2.
Il processo DRIE utilizzato alterna ripetutamente tre fasi: The DRIE process used repeatedly alternates three phases:
- una deposizione di uno strato di passivazione chimicamente inerte; - a deposition of a chemically inert passivation layer;
- un attacco secco al plasma isotropico; - a dry attack on isotropic plasma;
- una pulizia del substrato 1 e della camera dove si esegue l’attacco. - a cleaning of the substrate 1 and of the chamber where the etching is carried out.
Grazie a questa alternanza di fasi, si ottengono micro-strutture 2 aventi pareti laterali nanosagomate come mostrato in figura 2. Thanks to this alternation of phases, micro-structures 2 are obtained having nanoshaped side walls as shown in figure 2.
Le fasi di passivazione, attacco secco e pulizia hanno rispettive durate di tempo t1, t2e t3; il rapporto r=t1/t2ha un valore predeterminato, ad esempio compreso tra 0.5 e 1.5, ed à ̈ da tale valore che deriva la possibilità di ottenere microstrutture 2 con pareti sostanzialmente verticali. The passivation, dry etching and cleaning phases have respective time durations t1, t2 and t3; the ratio r = t1 / t2 has a predetermined value, for example between 0.5 and 1.5, and it is from this value that the possibility of obtaining microstructures 2 with substantially vertical walls derives.
Qualsiasi deviazione da r sbilancerebbe il processo: se t1/t2fosse maggiore di r, la fase di passivazione dominerebbe sull’attacco secco e così le micro-strutture 2 avrebbero la forma di tronchi di cono; se t1/t2fosse minore di r, l’attacco secco dominerebbe sulla fase di passivazione e le microstrutture 2 avrebbero la forma di tronchi di cono capovolti. Any deviation from r would unbalance the process: if t1 / t2 were greater than r, the passivation phase would dominate the dry etching and thus the micro-structures 2 would have the shape of truncated cones; if t1 / t2 were less than r, the dry etching would dominate the passivation phase and the microstructures 2 would have the shape of upturned truncated cones.
Il tempo totale t= t1+t2+t3definisce la lunghezza totale di un ciclo; ricordando che t1/t2deve essere mantenuto costante al valore predeterminato come sopra definito, il tempo totale t può essere scelto a piacere. Più lungo à ̈ t, più lunghi saranno gli incavi 16 delle pareti laterali. The total time t = t1 + t2 + t3 defines the total length of a cycle; remembering that t1 / t2 must be kept constant at the predetermined value as defined above, the total time t can be chosen at will. The longer it is, the longer the side wall recesses 16 will be.
Successivamente, lo strato di copertura viene rimosso in modo per sé noto con una soluzione di rimozione. Subsequently, the cover layer is removed in a known way with a removal solution.
Infine, si depositano sul substrato i rivestimenti sopra descritti. Finally, the coatings described above are deposited on the substrate.
Nel caso in cui il substrato 1 del dispositivo dell’invenzione sia di materiale polimerico biocompatibile e bioerodibile, inizialmente si realizza uno stampo (master) di un materiale rigido e indeformabile quale ad esempio silicio. Lo stampo viene fabbricato, partendo da un substrato di partenza, in maniera analoga a quanto sopra descritto in riferimento alle fasi di realizzazione delle microstrutture 2. I parametri d, l ed f rimangono invariati ed ispirati agli stessi criteri di design. If the substrate 1 of the device of the invention is of biocompatible and bioerodible polymeric material, initially a mold (master) of a rigid and non-deformable material such as silicon is made. The mold is manufactured, starting from a starting substrate, in a similar way to what is described above with reference to the phases of realization of the microstructures 2. The parameters d, l and f remain unchanged and inspired by the same design criteria.
Il processo di realizzazione dello stampo prevede l’impiego delle stesse tecniche di microlitografia ottica descritte in precedenza. In particolare, si utilizza lo stesso strato di copertura per ottenere una maschera di copertura complementare a quella descritta in precedenza. The mold making process involves the use of the same optical microlithography techniques described above. In particular, the same covering layer is used to obtain a covering mask complementary to the one described above.
Sul substrato di partenza per la realizzazione dello stampo si deposita, mediante spin coating, uno strato uniforme di copertura sul quale si realizza, in modo per sé noto mediante un processo litografico, uno schema (pattern) regolare di dischi (o altri poligoni). On the starting substrate for the realization of the mold, a uniform covering layer is deposited, by spin coating, on which a regular pattern of discs (or other polygons) is created in a per se known way by means of a lithographic process. .
Si ottiene quindi una maschera di copertura. Successivamente si elimina, in modo noto, lo strato di copertura all’interno dei dischi (o altri poligoni) e al passo seguente si esegue una fase di attacco secco, di tipo DRIE, come sopra descritto, grazie alla quale si erode il substrato di partenza in corrispondenza dei dischi ottenendo uno stampo comprendente una pluralità di buchi aventi le stesse caratteristiche delle micro-strutture 2 descritte in precedenza. A cover mask is then obtained. Subsequently, in a known way, the covering layer inside the disks (or other polygons) is eliminated and in the following step a dry etching phase is carried out, of the DRIE type, as described above, thanks to which the substrate is eroded. starting at the disks, obtaining a mold comprising a plurality of holes having the same characteristics of the micro-structures 2 described above.
In particolare tali buchi, grazie all’alternanza di fasi del processo DRIE, hanno pareti laterali nano-sagomate. In particular, these holes, thanks to the alternation of phases of the DRIE process, have nano-shaped side walls.
Dopo la fase di attacco secco la maschera di copertura viene rimossa in modo noto e lo stampo viene poi ulteriormente pulito. After the dry etching step, the cover mask is removed in a known way and the mold is then further cleaned.
Preferibilmente, lo stampo così ottenuto viene silanizzato in una campana di reazione in vuoto e successivamente viene “cotto†a temperature comprese tra 100°C e 120°C. Preferably, the mold thus obtained is silanized in a reaction chamber under vacuum and is subsequently â € œcookedâ € at temperatures between 100 ° C and 120 ° C.
A questo punto del materiale polimerico biocompatibile e bioerodibile viene portato a fusione in modo noto su un supporto. At this point, the biocompatible and bioerodible polymeric material is melted in a known way on a support.
In seguito lo stampo viene adagiato a contatto con detto materiale polimerico biocompatibile e bioerodibile fuso, evitando la formazione di bolle d’aria all’interfaccia tra lo stampo e il materiale biocompatibile, in modo da eseguire un processo di micromolding come qui descritto. The mold is then placed in contact with said molten biocompatible and bioerodible polymeric material, avoiding the formation of air bubbles at the interface between the mold and the biocompatible material, in order to perform a micromolding process as described here.
Si esegue in modo noto una fase di formatura o stampaggio dello strato di materiale polimerico biocompatibile e bioerodibile. A step of forming or molding the layer of biocompatible and bioerodible polymeric material is carried out in a known manner.
Il processo di formatura o stampaggio comprende due fasi: The forming or molding process includes two stages:
1) formatura o stampaggio a pressione costante; 1) constant pressure forming or molding;
2) solidificazione a pressione costante fino al raggiungimento della temperatura ambiente. 2) solidification at constant pressure until room temperature is reached.
Infine, si stacca il materiale polimerico biocompatibile e bioerodibile dallo stampo prima rimuovendo il supporto ed in seguito separando lo stampo e il substrato di materiale biocompatibile con una leggera trazione. Finally, the biocompatible and bioerodible polymeric material is detached from the mold by first removing the support and then separating the mold and the substrate of biocompatible material with a slight traction.
Nel seguito vengono descritti due esempi di realizzazione dei procedimenti sopra descritti, tali esempi essendo forniti solo a titolo illustrativo e non limitativo della portata dell’invenzione. Esempio di attuazione n°1 Two examples of embodiment of the processes described above are described below, these examples being provided only by way of illustration and not limiting the scope of the invention. Example of implementation n ° 1
Un primo esempio di attuazione della presente invenzione comprende l’utilizzo di un substrato 1 di silicio drogato di tipo P e le micro-strutture 2 sono disposte sul substrato 1 secondo un reticolo periodico esagonale e sono distanziate di una distanza 4 pari a 20µm. Le micro-strutture 2 hanno una larghezza di base pari a 10µm e un’altezza pari a 10µm. A first example of embodiment of the present invention comprises the use of a P-type doped silicon substrate 1 and the micro-structures 2 are arranged on the substrate 1 according to a hexagonal periodic lattice and are spaced at a distance 4 equal to 20µm. The micro-structures 2 have a base width of 10µm and a height of 10µm.
Le micro-struttura 2, aventi un nucleo 6 di silicio drogato P, sono rivestite con un primo strato 8 di titanio, che ricopre interamente il nucleo 6, un secondo strato 10 di oro, che ricopre il primo strato 8 ed un terzo strato 12, che ricopre il secondo strato 10, di un polimero idrofobico ottenuto eseguendo una polimerizzazione di octafluorociclobutano (C4F8). The micro-structures 2, having a P-doped silicon core 6, are coated with a first layer 8 of titanium, which completely covers the core 6, a second layer 10 of gold, which covers the first layer 8 and a third layer 12 , which covers the second layer 10, with a hydrophobic polymer obtained by carrying out a polymerization of octafluorocyclobutane (C4F8).
Per ottenere tale dispositivo il substrato di silicio viene inizialmente pulito con acetone e isopropanolo, e dopo immersione in una soluzione di acido fluoridrico al 4%, viene pulito con acqua deionizzata e asciugato con azoto. To obtain this device, the silicon substrate is initially cleaned with acetone and isopropanol, and after immersion in a 4% hydrofluoric acid solution, it is cleaned with deionized water and dried with nitrogen.
Per la litografia ottica si utilizza un Mask Aligner del tipo MA6/BA6, SUSS MICROTEC e si ottiene uno schema (pattern) regolare di dischi (o altri poligoni) all’interno di uno strato di copertura di resist negativo del tipo AZ5214. For the optical lithography a Mask Aligner of the type MA6 / BA6, SUSS MICROTEC is used and a regular pattern of disks (or other polygons) is obtained inside a negative resist covering layer of the AZ5214 type.
Il Mask Aligner realizza quindi una maschera di resist, eseguendo una litografia ottica su uno strato di resist uniforme depositato sul substrato 1, utilizzando in modo noto un fascio di luce avente una lunghezza d’onda λ compresa tra 350 e 450nm. The Mask Aligner then produces a resist mask, by carrying out an optical lithography on a uniform resist layer deposited on the substrate 1, using in a known way a beam of light having a wavelength Î ”comprised between 350 and 450nm.
La fase di attacco secco viene eseguita con uno strumento ICP-RIE, SI 500, Sentech Instrument GmbH e il processo DRIE utilizzato alterna ripetutamente tre fasi: The dry etching step is performed with an ICP-RIE instrument, SI 500, Sentech Instrument GmbH and the DRIE process used repeatedly alternates three steps:
- una deposizione di uno strato uno strato di un polimero ottenuto da polimerizzazione di octafluorociclobutano (C4F8); - a deposition of a layer a layer of a polymer obtained from the polymerization of octafluorocyclobutane (C4F8);
- un attacco secco al plasma isotropico con esafluoruro di zolfo (SF6); - a dry attack on isotropic plasma with sulfur hexafluoride (SF6);
- una pulizia del substrato 1 e della camera dove si esegue l’attacco. - a cleaning of the substrate 1 and of the chamber where the etching is carried out.
Il valore r=t1/t2ha un valore compreso tra 0.5 e 1.5 e con t1=8s, t2=7s e t3=4s si ottengono incavi 16 aventi una periodicità spaziale di 500nm. The value r = t1 / t2 has a value between 0.5 and 1.5 and with t1 = 8s, t2 = 7s and t3 = 4s, hollows 16 having a spatial periodicity of 500nm are obtained.
Infine, lo strato di copertura viene rimosso con H2SO4:H2O2=3:1 v/v. Finally, the cover layer is removed with H2SO4: H2O2 = 3: 1 v / v.
A questo punto si deposita sul substrato 1, mediante sputtering, un primo strato titanio avente uno spessore di 5nm e un secondo strato di oro avente uno spessore di 100nm. Lo strato di titanio migliora l’adesione dello strato di oro. At this point, a first titanium layer having a thickness of 5nm and a second layer of gold having a thickness of 100nm are deposited on the substrate 1 by sputtering. The titanium layer improves the adhesion of the gold layer.
Infine, si copre il secondo strato con un terzo strato pari a 5nm di un polimero idrofobico ottenuto eseguendo una polimerizzazione di octafluorociclobutano (C4F8). Finally, the second layer is covered with a third layer equal to 5nm of a hydrophobic polymer obtained by carrying out a polymerization of octafluorocyclobutane (C4F8).
Esempio di attuazione n°2 Example of implementation n ° 2
Un secondo esempio di attuazione della presente invenzione comprende l’utilizzo di un substrato 1 di Policaprolattone (PLC), e le micro-strutture 2 sono disposte sul substrato 1 secondo un reticolo periodico esagonale e sono distanziate di una distanza 4 pari a 20µm. Le micro-strutture 2 hanno una larghezza di base pari a 10µm e un’altezza pari a 10µm. A second example of embodiment of the present invention comprises the use of a substrate 1 of Polycaprolactone (PLC), and the micro-structures 2 are arranged on the substrate 1 according to a periodic hexagonal grid and are spaced at a distance 4 equal to 20µm. The micro-structures 2 have a base width of 10µm and a height of 10µm.
In questo caso, non sono previsti rivestimenti. In this case, no coatings are expected.
Si realizza un master di silicio impiegando le stesse tecniche di micro-litografia ottica descritte in precedenza. In particolare, si utilizza uno strato di resist negativo del tipo AZ5214 per ottenere una maschera di copertura complementare a quella descritta in precedenza. A silicon master is made using the same optical micro-lithography techniques described above. In particular, a negative resist layer of the AZ5214 type is used to obtain a covering mask complementary to that described above.
Dopo l’attacco DRIE e l’ottenimento di uno stampo comprendente una pluralità di buchi aventi le stesse caratteristiche delle micro-strutture 2 come descritto in precedenza, si rimuove la maschera di copertura mediante sonicazione in acetone a 55°C, e si pulisce lo stampo mediante una soluzione piranha. After DRIE etching and obtaining a mold comprising a plurality of holes having the same characteristics of the micro-structures 2 as described above, the cover mask is removed by sonication in acetone at 55 ° C, and cleans the mold with a piranha solution.
Lo stampo così ottenuto viene silanizzato in una campana di reazione in vuoto e successivamente viene “cotto†a 112°C. The mold thus obtained is silanized in a reaction chamber under vacuum and is subsequently â € œcookedâ € at 112 ° C.
Si porta a fusione su un vetrino silanizzato disposto su una piastra a 133° del policaprolattone del tipo Sigma, con Mw=77000 e Tmelt= 65°C in pellet. It is brought to fusion on a silanized slide placed on a plate at 133 ° of the polycaprolactone of the Sigma type, with Mw = 77000 and Tmelt = 65 ° C in pellets.
In seguito lo stampo viene adagiato a contatto con il policaprolattone come descritto in precedenza e si esegue la fase di formatura o stampaggio mediante pressa tipo Nanoimprinter, Obducat. The mold is then placed in contact with the polycaprolactone as described above and the forming or molding phase is carried out using a Nanoimprinter, Obducat type press.
Il processo di formatura o stampaggio comprende le fasi di: The forming or molding process includes the steps of:
1) formatura o stampaggio a pressione costante a 5 bar a 68°C; 1) constant pressure forming or molding at 5 bar at 68 ° C;
2) solidificazione a pressione costante a 5 bar fino al raggiungimento della temperatura ambiente. 2) solidification at constant pressure at 5 bar until room temperature is reached.
Infine, si stacca policaprolattone dallo stampo prima rimuovendo il vetrino ed in seguito separando in acqua lo stampo e il substrato di policaprolattone con una leggera trazione. Finally, polycaprolactone is detached from the mold by first removing the slide and then separating the mold and the polycaprolactone substrate in water with a slight traction.
Il processo così descritto à ̈ ottimizzato per piccole superfici di stampaggio (ad esempio, circa 1 cm<2>) e spessori finali dello strato di materiale polimerico biocompatibile e bioerodibile elevati (ad esempio, ciarca 500 µm), ma ulteriormente ottimizzabile per superfici di stampaggio e spessori differenti. The process thus described is optimized for small molding surfaces (for example, about 1 cm <2>) and high final thicknesses of the biocompatible and bioerodible polymeric material layer (for example, ciarca 500 µm), but can be further optimized for surfaces of molding and different thicknesses.
Verrà ora descritto un procedimento per ottenere colture cellulari in tre dimensioni di cellule sospese. A procedure for obtaining cell cultures in three dimensions of suspended cells will now be described.
Se si posiziona una goccia di terreno di coltura, del tipo descritto in seguito, sulla superficie del dispositivo della presente invenzione, essa mantiene una forma quasi sferica con un angolo di contatto all’interfaccia aria-acqua che può essere predetto teoricamente in modo per sé noto, utilizzando il modello di Cassie e Baxter. Secondo tale modello, il comportamento di bagnabilità della superficie del dispositivo à ̈ raggruppato nel solo parametro f. Quando f tende a zero, all’interfaccia con il substrato 1 del dispositivo il liquido “sente†di più l’aria e la goccia assomiglia di più a una sfera perfetta. If a drop of culture medium, of the type described below, is placed on the surface of the device of the present invention, it maintains an almost spherical shape with a contact angle at the air-water interface which can be theoretically predicted in order to well known, using the Cassie and Baxter model. According to this model, the wettability behavior of the surface of the device is grouped only in the parameter f. When f tends to zero, at the interface with the substrate 1 of the device the liquid "feels" more air and the drop looks more like a perfect sphere.
Grazie a ciò, il dispositivo può convenientemente essere usato per manipolare differenti campioni di interesse biomedico. Thanks to this, the device can conveniently be used to manipulate different samples of biomedical interest.
È generalmente noto che le proprietà idrorepellenti dei materiali superidrofobici riducono l’area di contatto dell’acqua sulla loro superficie, minimizzando in tal modo l’assorbimento di particelle o molecole. La superficie superidrofobica nano-sagomata del dispositivo dell’invenzione viene usata come substrato per colture cellulari. Per far in modo che sul dispositivo sopra descritto si riescano ad ottenere colture cellulari tridimensionali à ̈ indispensabile provvedere alla semina delle cellule in condizione di superidrofobicità . It is generally known that the water-repellent properties of superhydrophobic materials reduce the contact area of water on their surface, thus minimizing the absorption of particles or molecules. The nano-shaped superhydrophobic surface of the device of the invention is used as a substrate for cell cultures. To ensure that three-dimensional cell cultures can be obtained on the device described above, it is essential to seeding the cells in superhydrophobic conditions.
Come prima operazione del procedimento di uso del dispositivo superidrofobico nano-sagomato (DSN) della presente invenzione, si riveste tale dispositivo con un materiale promotore di adesione per le cellule da crescere, quale ad esempio poli-D-lisina. As a first step in the process of using the nano-shaped superhydrophobic device (DSN) of the present invention, this device is coated with an adhesion promoter material for the cells to be grown, such as for example poly-D-lysine.
Successivamente, si depositano sul dispositivo delle cellule da crescere, preferibilmente si deposita un predeterminato numero di tali cellule in una singola goccia di un predeterminato terreno di coltura (Plating Medium -PM). Subsequently, cells to be grown are deposited on the device, preferably a predetermined number of such cells is deposited in a single drop of a predetermined culture medium (Plating Medium -PM).
La goccia posizionata sulla superficie del DSN adotta una forma quasi sferica con angolo di contatto maggiore di 160°, che viene mantenuto dall’umidità relativa presente nell’incubatore della coltura cellulare. L’alto tasso di umidità relativa impedisce la veloce evaporazione del PM e la riduzione del diametro della goccia di terreno in cui sono disperse le cellule. The drop positioned on the surface of the DSN adopts an almost spherical shape with a contact angle greater than 160 °, which is maintained by the relative humidity present in the cell culture incubator. The high rate of relative humidity prevents the rapid evaporation of the PM and the reduction of the diameter of the drop of soil in which the cells are dispersed.
A questo punto, si lasciano le cellule in incubazione in superidrofobicità per un intervallo di tempo predeterminato compreso tra 4 e 6 ore e successivamente si elimina il PM e lo si sostituisce con del terreno di mantenimento. At this point, the cells are left to incubate in superhydrophobicity for a predetermined time interval between 4 and 6 hours and subsequently the PM is eliminated and replaced with maintenance medium.
Le cellule prima disperse nel PM, durante l’incubazione in superidrofobicità , migrano verso l’interfaccia liquido-aria-superficie del dispositivo. Le cellule si accumulano in una regione molto localizzata, aumentando la loro densità , rafforzando l’adesione cellulare e la loro capacità di formare estensioni che formano ponti che si estendono da una micro-struttura 2 ad una adiacente. The cells first dispersed in the PM, during the incubation in superhydrophobicity, migrate towards the liquid-air-surface interface of the device. The cells accumulate in a very localized region, increasing their density, strengthening cell adhesion and their ability to form extensions that form bridges that extend from a micro-structure 2 to an adjacent one.
Nel seguito viene descritto un esempio di procedimento per ottenere colture cellulari in tre dimensioni di cellule sospese, tale esempio essendo fornito a titolo illustrativo e non limitativo della portata dell’invenzione. An example of a process for obtaining cell cultures in three dimensions of suspended cells is described below, this example being provided for illustrative and not limiting purposes of the scope of the invention.
Esempio di attuazione Example of implementation
Si riveste un dispositivo avente un’area di 1cm<2>con della poli-D-lisina (in concentrazione da 1-100µg/ml). A device having an area of 1cm <2> is coated with poly-D-lysine (in a concentration of 1-100µg / ml).
Successivamente, si depositano sul dispositivo 50.000 cellule ippocampali in una singola goccia di 100µl di PM contenente il 10% di siero di cavallo e 2mM di glutammina e antibiotici. Subsequently, 50,000 hippocampal cells are deposited on the device in a single drop of 100µl of PM containing 10% horse serum and 2mM of glutamine and antibiotics.
La goccia adotta una forma quasi sferica con angolo di contatto maggiore di 160° mantenuto dall’umidità relativa maggiore dell’80% presente nell’incubatore della coltura cellulare a 37°C. The drop adopts an almost spherical shape with a contact angle greater than 160 ° maintained by the relative humidity greater than 80% present in the cell culture incubator at 37 ° C.
A questo punto, si lasciano le cellule in incubazione. At this point, the cells are left to incubate.
Trascorse 4 ore di coltura in superidrofobicità , si elimina il terreno di coltura e lo si sostituisce con 2ml di terreno di mantenimento del tipo Neurobasal contenente 2% B27 2mM glutamina e antibiotici. After 4 hours of culture in superhydrophobicity, the culture medium is eliminated and replaced with 2ml of Neurobasal type maintenance medium containing 2% B27 2mM glutamine and antibiotics.
Eseguendo un’analisi al microscopio confocale e al SEM si osserva che a partire dalle prime 4 ore di crescita i neuriti aderiscono alle microstrutture 2 sagomate e con la crescita spingono i neuroni in una posizione di ponte sospeso. By performing a confocal microscope and SEM analysis it is observed that starting from the first 4 hours of growth the neurites adhere to the shaped microstructures 2 and with the growth push the neurons into a suspension bridge position.
Il dispositivo della presente invenzione à ̈ quindi particolarmente adatto per applicazioni di rigenerazione dei nervi, se realizzato con materiali biocompatibili e biodegradabili. In particolare, può fornire un aiuto integrando i principi di: The device of the present invention is therefore particularly suitable for nerve regeneration applications, if made with biocompatible and biodegradable materials. In particular, it can provide help by integrating the principles of:
- co-impianto di linee cellulari di nervi o cellule gliali che svolgono un ruolo vitale nel supportare la rigenerazione degli axoni dopo ferite ai nervi periferici; - co-implantation of nerve cell lines or glial cells that play a vital role in supporting the regeneration of axons after injury to peripheral nerves;
- realizzazione di larghi canali (10-20µm) orientati verso il tessuto organico per aumentare l’infiltrazione di cellule, la migrazione e l’interruzione tessutale. - creation of large channels (10-20µm) oriented towards the organic tissue to increase cell infiltration, migration and tissue disruption.
Il tipo di crescita cellulare sopra descritto ha permesso di enfatizzare le implicazioni di queste osservazioni per il design di futuri biomateriali applicabili, oltre che nel contesto della rigenerazione nervosa, anche in altri settori di ingegneria tissutale, oppure per applicazioni legate ai test di tossicità e di invasività cellulare, nonché per studi di optogenetica in cui l’integrazione tra cellule e fibre ottiche risulta facilitata dalla loro disposizione lungo l’asse z. The type of cell growth described above has allowed us to emphasize the implications of these observations for the design of future biomaterials applicable, as well as in the context of nerve regeneration, also in other areas of tissue engineering, or for applications related to toxicity and toxicity tests. cellular invasiveness, as well as for optogenetic studies in which the integration between cells and optical fibers is facilitated by their arrangement along the z axis.
Un’ultima applicazione à ̈ legata alla manipolazione di DNA su intelaiature superidrofobiche, per la manipolazione di acidi nucleici e l’implementazione di sistemi trasfezione. A final application is related to the manipulation of DNA on superhydrophobic frames, for the manipulation of nucleic acids and the implementation of transfection systems.
Riepilogando, un dispositivo di silicio sagomato verticalmente con micro-strutture 2 allineate e distanziati in maniera periodica à ̈ in grado di controllare la bagnabilità e avere un ruolo distintivo nella coltura tridimensionale di cellule. In summary, a vertically shaped silicon device with periodically aligned and spaced 2 micro-structures is able to control wettability and play a distinctive role in three-dimensional cell culture.
Aggiungendo la terza dimensione alle tecniche di coltura bidimensionali classiche si ottengono differenze significative nelle caratteristiche delle cellule così coltivate, che mostrano comportamenti molto simili a quelli delle cellule dei tessuti originali. By adding the third dimension to the classic two-dimensional culture techniques, significant differences are obtained in the characteristics of the cells thus cultured, which show behaviors very similar to those of the cells of the original tissues.
Questo nuovo tipo si dispositivo per la crescita tridimensionale può essere facilmente seminato attraverso un processo automatizzato, rendendo possibile la messa in high-throughput di qualsiasi laboratorio. This new type of three-dimensional growth device can be easily seeded through an automated process, making it possible to put any laboratory into high-throughput.
Naturalmente, fermo restando il principio dell'invenzione, le forme di attuazione ed i particolari di realizzazione potranno essere ampiamente variati rispetto a quanto à ̈ stato descritto ed illustrato a puro titolo di esempio non limitativo, senza per questo uscire dall'ambito dell'invenzione come definito nelle annesse rivendicazioni. Naturally, the principle of the invention remaining the same, the embodiments and construction details may be widely varied with respect to what has been described and illustrated purely by way of non-limiting example, without thereby departing from the scope of the invention. as defined in the attached claims.
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